FI84107B - Hba1c:s immunologiska bestaemningsfoerfarande som innefattar denaturering. - Google Patents

Description

j 84107

Denaturoinnin käsittävä HbAlc:n immunologinen määritys menetelmä

Keksintö koskee immunologista määritysmenetelmää 5 hemoglobiinin glykosyloidun muodon, HbAlc:n määrittämiseksi. Keksinnössä käytetään hyväksi vasta-aineiden tai niiden fragmenttien sitomista tämän proteiinin spesifiseen, lineaariseen peptidiepitooppiin. Yksilön veressä olevan hemoglobiinin glykosyloitumisasteen määritys on käyttö-10 kelpoinen indeksi glukoositason tarkkailulle sokeritaudissa. Keksinnössä käytetään edullisesti monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat erityisesti glykosyloidut N-terminaaliset peptiditähteen HbAlc:ssä.

On olemassa jatkuva tarve parantaa vasta-ainesitou-15 tumisen spesifisyyttä proteiineihin, erityisesti proteiineihin, joilla on analyyttistä merkitystä. Tiettyjen proteiinien spesifistä toteamista biologisissa näytteissä rajoittaa sellaisten vasta-ainereagenssien saatavuus, jotka kohdistuvat proteiinien tavoitettavissa osissa oleviin 20 ainutlaatuisiin sitoutumispaikkoihin tai epitooppeihin. On olemassa tapauksia, joissa toivottavin epitooppi tietyn proteiinin spesifistä määritystä varten on luoksepääsemä-tön tai vain rajoitetusti tavoitettavissa vasta-ainerea-genssin kanssa sitoutumista varten.

25 Eräs esimerkki on HbAlc:nä tunnetun hemoglobiinin glykosyloidun muodon määrittäminen sokeritautipotilaiden verestä. Hemoglobiini on proteiinitetrameeri, joka muodostuu neljästä aminohappoketjusta (alayksiköstä), jossa kussakin on noin 143 osaa ja jonka kokonaismolekyylipaino on 30 noin 64 000. Molekyylin toisessa päässä (β-alayksikön NH2-pääte) on valiiniyksikkö, joka voi reagoida glukoosin kanssa. Hemoglobiinin glykosyloituminen tapahtuu ei-ent-symaattisella reaktiolla, jossa on mukana glukoosi ja va-liinin α-aminoryhmä. Reagenssien välille syntyy Sohiffin 35 emäsmuodostus ja glukoosille tapahtuu Amadori-uudelleen- 2 84107 järjestäytyminen, jolloin muodostuu 1-deoksifruktovaliini. Tämä kompleksi on kovalenttinen ja pääosin palautumaton. Glykosylointireaktiota säätelevät reagenssien, siis hemoglobiinin ja glukoosin, konsentraatiot. Normaalilla (ei 5 sokeritautia sairastavalla) yksilöllä noin 3 % kokonaishemoglobiinista on glykosyloitunut. Hemoglobiinitetrameerit, joissa on 1-deoksifruktovaliini β-ketjun N-päätteessä, identifioidaan glykosyloiduksi eli Alc-hemoglobiiniksi.

Sokeritautisilla glukoositasot ovat riittävän kor-10 keitä kasvattamaan glykosylaation nopeutta suoraan verrannollisena veren glukoositasoon, joka kuvastaa sokeritauti-tilan vakavuutta. Hemoglobiinissa Alc-taso on noussut noin 5-12 %:iin. Koska kiertävän hemoglobiinin elinaika on noin 120 päivää, antaa glykosyloidun hemoglobiinin mittaus 15 arvon, joka heijastaa tämän ajanjakson keskimääräistä glukoosi tasoa. Erikoisesti paljon glukoosia sisältävä ateria ei heijastu korkeassa glykosyloidun hemoglobiinin tai see-rumialbumiinin tasossa. Täten glykosyloidun hemoglobiinin pitoisuuden määrittämisellä saadaan totuudenmukaisempi 20 kuva kiertävästä glukoositasosta ja siten totuudenmukaisempi kuva potilaan tilasta pitkällä aikavälillä.

US-patentissa 4 247 533 esitetään analyyttinen menetelmä, jossa HbAlc:n vasta-aineet saatiin tietystä lampaasta ruiskuttamalla HbAlc:tä ja absorboimalla ei-glykosy- 25 loidulla hemoglobiinilla, jolloin saatiin polyklonaalisia vasta-aineita, jotka erottivat HbAlc:n ja ei-glykosyloidun Hb:n. Tällaiset vasta-aineet muodostavat sitten perustan kokeelle, jossa määritetään näytteessä olevan glykosyloidun hemoglobiinin osuus. Kokeessa tarvitaan kuitenkin so-30 pivasti immunisoitu lammas ja vasta-aineabsorptiot, jotta saadaan sopiva spesifisyys. Siten on kallista ja vaikeaa tuottaa spesifisiä polyklonaalisia vasta-aineita. Tällä absorptiomenetelmällä valmistettujen valmisteiden on raportoitu olevan matalia tiittereiltään ja affiniteetil-35 taan. Tämän menetelmän toistettavuus on myös avoin, koska 3 84107 ei ole olemassa selostuksia sen käytöstä ihmisen hemoglobiinia sisältävien kliinisten näytteiden analysoinnissa.

Toinen menetelmä löytää HbAlc:lle spesifisiä vasta-aineita on esitetty US-patentissa 4 478 744. Nämä tutkijat 5 korvasivat immunisoivana aineena tavallisen hemoglobiini-molekyylin synteettisellä peptidi-immunogeenillä. Tämä aine injektoitiin eläimeen, jolla tavallisesti ei ole veressä HbAlc:,tä, esimerkiksi lampaaseen. Synteettisessä peptidi -immunogeenissä oli glykosyloitu peptiditähde, jossa 10 oli aminohapposekvenssi, joka vastaa ensimmäisiä 4-10 aminohappoa hemoglobiinisekvenssissä N-päätteissä. Seuraa-vana esitettävät tutkimukset esittävät, että lampaan poly-klonaalisilla vasta-aineilla, jotka on saatu synteettistä peptidi-immunogeeniä vastaan, ei ole merkittävää spesifi-15 syyttä glykosyloidulle muodolle, Hb Alc:lle.

Tämän takia on olemassa tyydyttämätön tarve kehittää menetelmä vasta-ainereagenssien valmistamiseksi ja sellaisten sitoutumisolosuhteiden luomiseksi, joilla saadaan spesifinen vasta-ainereagenssien sitoutuminen kiin-20 nostuksen kohteena oleviin proteiineihin. Tämä käy erityisen selvästi ilmi aikaisempien tutkijoiden kyvyttömyydestä kehittää immunologisia määritysmenetelmiä tiettyjen proteiinien, kuten glykosyloitujen proteiinien, esim. HbAlc:n, määrittämiseen.

25 Määritelmiä

Aminohappo Lyhenne

Arginiini Arg

Asparagiinihappo Asp

Glutamiinihappo Glu 30 Lysiini Lys

Seriini Ser

Asparagiini Asn

Glutamiini Gin

Glysiini Gly 35 Proliini Pro 4 84107

Treoniini Thr

Alaniini Ala

Histidilni His

Kysteiini Cys 5 Metioniini Met Väliini Vai

Isoleusiini Ile

Leusiini Leu

Tyrosiini Tyr 10 Fenyylialaniini Phe

Tryptofaani Trp

Esillä oleva keksintö koskee immunologista määritysmenetelmää hemoglobiini Alc (HbAlc) -glykoproteiiniana-15 lyytin määrittämiseksi koenäytteestä. Tässä menetelmässä koenäyte saatetaan kosketukseen vasta-ainereagenssin kanssa, joka spesifisesti sitoo tämän ihmisen hemoglobiinin hiilihydraatilla modifioituneen lineaarisen peptidiepitoo-pin, ja vasta-ainereagenssin sitoutuminen määritetään. 20 Tälle menetelmälle on tunnusomaista, että koenäyte ensin käsitellään näytteessä mahdollisesti olevasta HbAlc:sta huomattavan määrän denaturoimiseksi lineaarisen peptidi-epitoopin saattamiseksi esille tai sen esillä olemisen lisäämiseksi, jotta epitooppi voi sitoutua vasta-ainerea-25 genssiin.

Yleisesti on havaittu, että erittäin spesifinen im-munositoutuminen tiettyyn proteiiniin voidaan saavuttaa muodostamalla vasta-ainereagenssi proteiinissa olevaa lineaarista peptidiepitooppia vastaan ja saattamalla tällai-30 nen vasta-ainereagenssi kosketukseen proteiinin kanssa sen jälkeen, kun proteiini on denaturoitu riittävästi siinä olevan lineaarisen peptidiepitoopin saattamiseksi esille tai sen esillä olemisen lisäämiseksi. Kohteena oleva lineaarinen peptidiepitooppi koostuu periaatteessa vähintään 35 kahdesta ja tavallisesti alle 15 aminohappoyksiköstä. Epi-

II

s 84107 tooppi voi olla peptidiketjun N- tai C-päätteessä tai se voi olla pitkin peptidiketjua proteiinissa ja se voi olla muunneltuna ei-peptidiryhmillä ja sivuketjuilla, kuten hiilihydraateilla, esim. mono-, oligo- ja polysakkaridi-5 ryhmällä, fosfaatilla, lipidillä, sulfaatilla, karbamyy-lillä, sulfoksidilla ja vastaavalla ryhmällä mukaan lukien muut kemialliset ryhmät, jotka voivat olla kovalent-tisesti sitoutuneina proteiinirunkoon. Tällaisia ryhmiä ovat ryhmät, jotka on lisätty translaationjälkeisillä 10 modifikaatioilla, jotka voivat olla entsyymivälitteisiä tai ei-entsymaattisten kemiallisten reaktioiden tuloksena saatuja, jolloin niihin kuuluvat muunnelmat, joita tapahtuu luonnostaan proteiinissa tai jotka ovat ympäristövaikutuksen aiheuttamia. Vasta-ainereagenssi muodostetaan 15 tavallisesti synteettistä peptidiä vastaan, joka sisältää lineaarisen peptidiepitoopin liittyneenä immunogeeniseen kantaja-aineeseen, joka tavallisesti on muu kuin kiinnostuksen kohteena oleva proteiini. Erityisen edullista on käyttää somaattisin soluhybridisaatiomenetelmin saatuja 20 vasta-aineita, jotka ovat monoklonaalisia ja erittäin spe sifisiä lineaariselle peptidiepitoopille.

Proteiinin denaturointi voidaan suorittaa oleellisesti millä menetelmällä tahansa siten, että valittu pep-tidiepitooppi saatetaan esille tai sen esillä olemista 25 lisätään vasta-aineeseen sitoutumiselle samalla säilyttäen merkittävä määrä proteiinia liuoksessa. Optimaalisten de-naturointiolosuhteiden valitsemista varten on käytettävissä fysikaalisia ja kemiallisia käsittelyjä, joista jälkimmäiseen kuuluu proteiinin hajottaminen. Tarvittava de-30 naturointiaste määritetään oleellisesti kokeellisesti kul lekin proteiinille ja saatavan immunositoutumisen aiotun käyttötarkoituksen mukaan, esim. halutun immunoanalyysin olosuhteiden mukaan. Denaturoinnin vaikutus on oleellisesti linearisoida ainakin se proteiinialue, jolla valittu 35 peptidiepitooppi on, ja altistaa se ympäröivälle vesipi- 6 84107 toiselle väliaineelle riittävästi vasta-ainereagenssin sitoutumista varten.

Keksinnön mukaisesti voidaan suorittaa immunologisia määritysmenetelmiä ja valmistaa reagenssisysteemejä 5 HbAlc-glykoproteiinianalyytin määrittämiseksi sitomalla vasta-ainereagenssi lineaariseen peptidiepitooppiin, joka ovat oleellisesti luoksepääsemätön tai joka on rajoitetusti saavutettavissa immunositoutumiseen, kun proteiini on natiivissa tilassaan. Erityisesti keksintö tekee mahdolli-10 seksi määrittää erittäin spesifisesti HbAlc:tä biologisis sa nesteissä, kuten veressä. Monoklonaalisten vasta-aineiden, jotka on saatu synteettisiä, glykosyloituja, HbAlc:ssä esiintyviä N-terminaalisia peptiditähteitä vastaan, on havaittu sitoutuvan spesifisesti tällaisiin tähteisiin gly-15 kosyloiduissa hemoglobiinin β-alayksiköissä. Vasta-aineet voidaan valmistaa erilaisilla tavanomaisilla monoklonaalisten vasta-aineiden valmistusmenetelmillä. Käytetään vasta-aineita, jotka on valmistettu synteettisesti johdettua immunogeeniä vastaan, jossa on haluttu glykosyloitu 20 N-terminaalinen peptiditähde kemiallisesti liittyneenä immunogeeniseen kantajaan siten, että glykosyloidussa peptidissä on vähintään 2 ja edullisesti 5-15 aminohappo-yksikköä, jotka vastaavat HbAlc:ta. Tällaiset vasta-aineet ovat spesifisiä glykosyloidulle synteettiselle peptidille 25 ja vastaavalle esillä olevalle epitoopille hemoglobiini Alc -molekyylissä.

Piirrokset ovat graafisia esityksiä esimerkeissä kuvatuista kokeista HbAlc:n immunomäärityksestä.

Kuvio 1 on kuva, joka esittää glykopeptidi l:n ai-30 heuttamaa (PEPTIDI 1) Ab-3:n sitoutumisen Alc:hen inhibi-tiota. Vasta-ainetta inkuboitiin etukäteen glykopeptidin kanssa, ennen kuin se siirrettiin Alc:llä päällystetylle mikrotiitterilevylle. Monoklonaalinen vasta-aine, joka sitoo Alc:n, määritettiin käyttämällä toista vasta-aine-35 entsyymikonjugaattia. Tulokset on piirretty kuvioon 1 in- tl 7 84107 hibitio-%:na, jossa 0 %:n inhibitio on arvo, joka on saatu ilman kilpailevaa ainetta. 0-0 -viiva kuvaa identtistä peptidiä, jossa ei ole hiilihydraattia, ja tämä osoittaa sitä, että hiilihydraatti on oleellinen vasta-aineen si-5 toutumiselle. Kaikki pisteet ovat kolmen kokeen keskiarvoja*

Kuviossa 2 on piirros, joka esittää glykopeptidin 3 (PEPTIDI 3) aiheuttamaa Ab-3:n sitoutumisen Alc:hen inhi-bitiota. Kilpaileva koe suoritettiin kuviossa 1 esitetyllä 10 tavalla.

Kuvio 3 on piirros, joka esittää glykopeptidin 4 (PEPTIDI 4) aiheuttamaa Ab-3:n ja Ab-4:n Alc:hen sitoutumisen inhibitiota. Kilpaileva koe suoritettiin kuviossa 1 esitetyllä tavalla.

15 Kuvio 4 on tyypillinen vakiokuvaaja käytettäessä optimaalisia analyysiolosuhteita. Kokoverivakio valmistettiin käyttämällä erilaisissa suhteissa denaturoitua soke-ritautipotilaan kokoverta, jossa oli 12,66 % Alc:tä mitattuna HPLC-ioninvaihdolla, ja tavallisen luovuttajan koko-20 verta (3,83 % Alc). Kaikki kolmoismittausten pisteet on piirretty.

Kuvio 5 on vakiokuvaaja käytettäessä synteettistä peptidivakiota. Analyysi suoritettiin kuviossa 4 esitetyllä tavalla sillä poikkeuksella, että kokoveren tilalla 25 käytettiin erilaisia määriä synteettistä glykopeptidiä kilpailijana. Kaikki kolmoismääritysten arvot piirrettiin.

Kuvio 6 on piirros, joka kuvaa immunoanalyysimene-telmän vertailua boronaattiaffiniteettimenetelmään dono-. . reillä. Kolmoismääritysten tulokset on piirretty immuno- 30 analyysikoordinaattiin.

Kuvio 7 on piirros, joka kuvaa HbAlc-epitoopin esille saattamista erilaisissa denaturointiolosuhteissa.

Kuvio 8 on piirros, jossa esitetään lampaan immunisoinnin tuloksia esimerkin 1 (b) mukaisella synteetti-35 sellä glykopeptidillä.

8 84107

Kuvio 9 on piirros, joka esittää sen, että hiiren monoklonaaliset vasta-aineet ovat spesifisiä Alc-hemoglo-biinille.

Polypeptidi tai proteiini on aminohappojen lineaa-5 rinen sekvenssi, joka liuoksessa muodostaa kolmiulotteisen rakenteen. Tekijöitä, jotka kontrolloivat tätä proteiinin kolmiulotteisen rakenteen spontaania saavuttamista, ovat seuraavat: 1. Peptidisidoksen tasomainen rakenne, joka on 10 kiertyy rajoitetusti Ca- ja C'-hiiliatomien ympäri (Ψ-si-dosrotaatio) ja N-Ca-typpi-hiilisidoksen ympäri (φ-sidos-rotaatio ). Tämä rajoittunut kierto rajoittaa liikettä peptidisidoksen ympäri ja pienentää mahdollisten konformaati-oiden kokonaismäärää.

15 2. Aminohapposivuketjuilla (R-ryhmillä) on trans- orientaatio, koska kokonaan cis-polypeptidissä sivuketju-atomeille olisi lukuisia rajoituksia käytettävissä olevassa konformaatiotilassa.

3. Peptidirungon ja sivuketjun erilaisten funktio-20 naalisten ryhmien vuorovaikutukset aiheuttavat kolmiulotteisen polypeptidin kiertymisen ja näiden vuorovaikutusten summa antaa energian, jolla proteiini säilyttää tämän konformaation.

Näitä vuorovaikutuksia ovat seuraavat: .25 a) dispersiovoimat - kun oskilloivat dipolit liit tyvät viereisiin atomeihin ja aiheuttavat vetävän voiman kahden atomin välille. Näitä voimia tasoittaa elektronikuoren repulsio (se on: kaksi atomia ei voi miehittää samaa tilaa); 30 b) vetysidos - kun vetyatomin elektronikuori liik kuu kohti atomia, johon vety on sitoutunut (vedyn vastaanottaja); c) sähköstaattiset voimat - kun erityyppisillä atomeilla on asymmetrinen elektronijakauma ja niillä on siten 35 osittainen varaus, joka voi olla vuorovaikutuksessa ato-

II

9 84107 mien kanssa, joilla on vastakkainen varaus. Tämä vuorovaikutus voi olla yksinkertainen dipolivaikutus tai se voi esiintyä suolasiltana; d) disulfidisidokset - jotka kysteiiniaminohappojen 5 SH-ryhmien välillä stabiloivat proteiinikonformaatiota.

Disulfidisidoksen muodostuminen on seurausta proteiinin kolmiulotteisesta rakenteesta, joka aiheutuu edellä esitetyistä dispersiovoimista, vetysidoksista ja sähköstaattisista voimista.

10 4. Proteiinin vuorovaikutuksella vesipitoisen ympä ristön kanssa on voimakas vaikutus organisoitaessa vesiliukoisten proteiinien itsestään järjestäytymistä. Polaariset vesimolekyylit solvatoivat hydrofobisia ryhmiä proteiinin pinnalle ja suosivat termodynaamisesta hydrofobis-15 ten aminohapposivuketjujen järjestäytymistä molekyylin sisäosiin (niin, että ne ovat samanlaisessa hydrofobisessa ympäristössä). Tunnettujen proteiinien uuden tutkimuksen mukaan hydrofobisten aminohappojen Phe, Leu, Ile, Vai, Trp ja Tyr pinta-alasta suurempi osa on piilossa kuin 20 neutraaleilla tai polaarisilla aminohapoilla (Science 229 (1985) 834 - 838).

Tulisi ottaa huomioon myös se, että monet proteii-nipinnan tähteistä ovat hydrofobisia ja että piilossa olevat tähteet voivat olla polaarisia tai jopa varaukselli-25 siä. Piilossa olevat polaariset ryhmät tavallisesti tyydyttävät proteiinin sisäosien vetysidosvaatimukset ja niinkin paljon kuin 90 % kaikista sisäisistä polaarisista ryhmistä on sitoutunut vetysidoksin. Samalla tavalla varaukselliset, proteiinin sisäosissa olevat aminohapot ovat 30 yhtä todennäköisesti sitoutuneet suolasilloilla.

Proteiinin konformaatio voidaan jakaa rakenneosiin seuraavasti: 1. Primaarinen rakenne on polypeptidin lineaarinen aminohapposekvenssi.

10 84107 2. Sekundaarinen rakenne riippuu siitä, kuinka po-lypeptidiketju on stabiloitu vetysidoksilla.

3. Tertiaarinen rakenne on polypeptidiketjun kiertyminen kolmiulotteeseen rakenteeseensa. Tämä rakenne sta- 5 biloidaan vetysidoksilla, sähköstaattisilla vuorovaikutuksilla, hydrofobisilla vuorovaikutuksilla ja disulfidisi-doksilla.

4. Kvaternaarinen rakenne viittaa rakenteeseen, joka syntyy, kun kaksi polypeptidiketjua vaikuttaa toi- 10 siinsa. Vuorovaikutustyypit ovat samat kuin tertiaarisella rakenteella.

Esitetyt polypeptidin vuorovaikutukset polypeptidin ja vesipitoisen ympäristön kanssa ovat vastuussa monimutkaisesta kiertymisestä ja siitä seuraavasta natiivien pro-15 teiinimolekyylien kolmiulotteisesta rakenteesta. Informaa tio tälle kiertymiselle on tallennettuna polypeptidin aminohapposekvenssissä (primaarinen rakenne). Monissa tapauksissa natiivit proteiinit voidaan kokonaan denaturoida (mitä osoittaa sekundaarisen, tertiaarisen ja kvaternaari-20 sen rakenteen puuttuminen) käsittelemällä fysikaalisilla tai kemiallisilla denaturoivalla aineella ja kun denaturoiva aine poistetaan, ne järjestäytyvät molekyyliksi, joka ei ole erotettavissa rakenteeltaan tai toiminnaltaan natiivista proteiinista [Adv. Prot. Chem. 29 (1975) 205 -25 299; Journal of Biol. Chem. 251 (1976) 3154 - 3157].

Kiertymisprosessi on energeettisesti edullinen ja saatava natiivi kolmiulotteinen konformaatio on (tai on ainakin lähes) sen pienimmän vapaan energian tilassa. Seurauksena polypeptidin kiertymisestä kolmiuloitteeseen kon-30 formaatioon osa aminohapoista on molekyylin pinnalla vapaasti suspendoivan liuottimen tavoitettavissa, kun taas toiset aminohapot ovat piilossa ja liuottimen saavuttamattomissa. Tätä käsitystä tukee suuri määrä biofysikaalista tietoa ja myös proteiinin pinnalla olevien aminohappojen

II

u 84107 ja proteiinin sisällä olevien aminohappojen kemiallisten reaktiivisuuksien erot.

Kolmiulotteinen konformaatio ei millään tavoin ole jäykkä rakenne. Useimmat edellä esitetyistä vuorovaikutuk-5 sista ovat suhteellisen heikkoja ja ne jatkuvasti katkeavat ja muodostuvat uudelleen (kuitenkin kullakin ajanhet-kellä vain pieni prosenttimäärä sidosten kokonaismäärästä on poikki). Voisi odottaa, että peptidisegmentit, joissa on vähiten vuorovaikutuksia, olisivat liikkuvaisempia kuin 10 peptidisegmentit, joissa on enemmän vuorovaikutuksia. Suuremman liikkuvuuden omaavilla segmenteillä voisi olettaa olevan useampia konformaatioita, joista joku voisi pystyä vuorovaikutukseen vasta-aineen kanssa. On ehdotettu, että nämä natiivien proteiinien liikkuvat osat ovat niitä, jot-15 ka ovat eniten antigeenisiä [Nature 312 (1984) 127 - 134].

Antigeenin ja vasta-aineen väliset vuorovaikutukset ovat samoja kuin vuorovaikutukset, jotka stabiloivat proteiinin rakennetta (se on, vetysidokset, sähköstaattiset sidokset, hydrofobiset sidokset). Jotta vuorovaikutus oli-20 si spesifinen ja affiniteetiltaan riittävä, on tarpeellista säilyttää kahden vuorovaikutuksessa olevan pinnan komp-lementaarisuus ja sopiva rinnakkaisasema vastakkaisesti varautuneilla ryhmillä, jotka muodostavat suolasiltoja, vetysidoksen donoreilla ja akseptoreilla ja hydrofobisilla 25 taskuilla (Ann. Rev. Immunol. 1 (1983) 87 - 117. Mikäli komplementaarisuus muuttuu (esim. aminohapposubstituutio), voi vasta-aineen affiniteetti antigeeniin muuttua merkittävästi .

Antigeenin kontaktipaikat voidaan jakaa kahteen 30 ryhmään: (1) lineaarinen tai peräkkäinen ja (2) konforma-tionaalinen [Ann. Rev. Immunol. 2 (1984) 67 - 101].

Lineaarisia tai peräkkäisiä determinantteja ovat ne, joissa kokonainen antigeeninen determinantti esiintyy 84107 12 yhdessä lineaarisessa, noin 2-15 aminohappoa ja tavallisesti vähemmän kuin 10 aminohappoa sisältävän proteiini-sekvenssin segmentissä.

Konformationaalisia determinantteja ovat ne, joissa 5 peptidin osat, jotka sekvenssissä ovat kaukana toisistaan, on tuotu läheiseen kontaktiin proteiiniantigeenin kolmiulotteisen rakenteen vaikutuksesta. Näin antigeenideter-minantti tai -epitooppi muodostuu useammasta kuin yhdestä proteiiniantigeenin osasta. Esimerkiksi röntgensädetutki-10 mukset lysotsyymillä ja lysotsyymin monoklonaalisella vasta-aineella ovat osoittaneet, että vasta-aine liittyy ly-sotsyymiin asemissa 29 - 37 ja 116 - 129. Vaikkakin nämä aminohapot ovat toisistaan erillään sekvenssissä, ne muodostavat jatkuvan alueen noin 20 x 25 A lysotsyymimole-15 kyylin pinnalla ja ovat vuorovaikutuksessa vasta-aineen sitoutumispaikan lukuisten atomien kanssa [Nature 313 (1985) 156 - 158]. Tästä seuraa myös, että vasta-aineet, jotka tunnistavat konformationaalisia determinantteja, eivät tunnista proteiinin denaturoitua muotoa.

20 Tavanomaisessa immunisointimenetelmässä muodostet taessa antiproteiinivasta-ainetta injektoidaan natiivia tai puolinatiivia proteiinia eläimeen, joka ajan mittaan tuottaa immunoglobuliineja immunogeeniä vastaan. Polyklo-naalinen antiseerumi mitä todennäköisimmin sisältää vasta-25 aineita, jotka tunnistavat sekä peräkkäisiä että konformationaalisia antigeenideterminantteja. Nämä determinantit ovat tavallisesti alkuperäisen proteiinin pinnalla. Esimerkiksi influenssaviruksen hemagglutiniini-membraanigly-koproteiinilla on neljä pääasiallista antigeenidetermi-30 nanttia, joista kolme sijaitsee glykoproteiinin pinnalla [Nature 289 (1981) 366 - 373 ja 373 - 378].

Mikäli immunogeeninä käytetään synteettistä peptidiä tai natiivin molekyylin pientä peptidiä, saatava vaste voi olla vain peräkkäisiä determinantteja vastaan (ja ra-35 joittunutta konformaatiojoukkoa vastaan, jonka peptidi voi

II

13 841 07 saada). Yrityksissä käyttää synteettisiä peptidejä immuno-geeneinä, jotta saataisiin vasta-ainevaste, joka sitoutuu natiiviin proteiiniin (jolla on sama sekvenssi kuin synteettisellä peptidillä), tutkijat alussa suunnittelivat 5 immunogeenejä tutkimalla natiivin proteiinin sekvenssejä, jotta löydettäisiin alueita, joissa olisi useita polaarisia aminohappoja [Rev-Science 229 (1985) 932 - 940].

Näillä sekvensseillä tulisi tilastollisesti olla suurempi todennäköisyys olla natiivin proteiinin pinnalla ja ne 10 voisivat olla vapaita reagoimaan vasta-ainemolekyylien kanssa. Ajateltiin kuitenkin myös, että nämä hydrofiiliset tähteet olisivat vähemmän immunogeenisiä kuin hydrofobinen peptidi, joten toiset syntetisoivat immunogeenejä, jotka perustuivat hydrofobisuuteen, ja toivoivat, että nämä hyd-15 rofobiset sekvenssit olisivat esillä pinta-antigeeneilla. Molemmissa tapauksissa suuri osa näillä strategioilla tuotetuista vasta-aineista reagoi selvästi natiivin antigeenin kanssa, mikä viittaa siihen, että niin kauan kuin synteettinen peptidi vastasi sekvenssiä, joka voitiin löytää 20 natiivin proteiinin pinnalta, synteettistä peptidiä vastaan muodostettu vasta-aine olisi reaktiivinen natiivin antigeenin kanssa [Nature 299 (1982) 592 - 596. On esitetty raportteja vasta-aineista, jotka on tuotettu tiettyille synteettisille peptideille, jotka vastaavat peptidejä, 25 joiden uskotaan olevan proteiinin sisäosassa ja jotka reagoivat näennäisesti natiivin proteiinin kanssa [PNAS 80 (1983) 4949 - 4953]. Epäselvää on se, mikä mekanismi on vastuussa tästä havainnosta.

Esillä olevan keksinnön mukaisesti natiivi proteii-30 ni denaturoidaan tarkoituksellisesti, jotta mahdollisimman hyvin saatetaan esille peräkkäiset tai lineaariset determinantit, jotta ne reagoivat vasta-aineiden kanssa, jotka oli tuotettu tällaisia determinantteja vastaan. Erityisesti määritysmenetelmässä, jossa tarvitaan tuore näyte, 35 joka sisältää tosiaan natiivia antigeeniä, olisi antigee- i4 841 07 nin denaturoiminen absoluuttinen vaatimus. Mikäli natiivin proteiinin epitooppi on pinnalla tai sen lähellä ja on siten osittain esillä vasta-ainevuorovaikutukselle, dena-turointi voi suurentaa sen liikkuvuutta ja aiheuttaa kas-5 vua mahdollisten konformaatioiden lukumäärässä, jotka se voi saavuttaa, ja siten edistää vasta-aine-antigeenivuoro-vaikutusta.

Monissa olemassa olevissa immunoanalyysisysteemeis-sä käytetään matalia pitoisuuksia detergenttejä, esim. 10 Tritonin ja Tween 20:tä, estämään reagoivien aineiden epäspesifistä adsorptiota klassisessa vasta-aine-antigeeni-reaktiossa, dissosioimaan proteiineja biologisista memb-raaneista tai dissosioimaan lipidejä lipoproteiineista, jotta saadaan lipidejä sisältämätön, homogeeninen proteii-15 ninäyte [Biochem. Biophys. Acta 620 (1980) 447 - 453;

Clin. Chem. 28 (1981) 199 - 204). Esillä olevan keksinnön nimenomaisena tarkoituksena on saattaa esille proteiinian-tigeenin proteiini- tai glykoproteiinideterminantti denaturoimalla natiivin proteiinin sekundaarinen, tertiaarinen 20 ja kvaternaarinen rakenne käyttämällä fysikaalisia ja/tai kemiallisia denaturoivia aineita. Sitten esille saatettu peptidiepitooppi vapautetaan ja se voi ottaa sen synteettisen peptidin konformaatiot, jota vastaan vasta-aineet tuotettiin.

25 Vasta-ainereagenssin steerinen pääsy epitooppiin voidaan saada aikaan millä tahansa tehokkaalla tavalla. Epitoopin esille saamisen koskemattomassa proteiinissa ymmärretään tapahtuvan fysikaalisella tai kemiallisella denaturoinnilla tai hajottamisella vähintään epitoopin 30 alueella. Tällainen denaturoiminen tai hajottaminen voidaan paikallistaa epitoopin alueelle tai se voi vaatia yleisempää tai oleellisesti täydellistä tertiaarisen ja lisäksi sekundaarisen proteiinirakenteen denaturoimista tai osittaista tai täydellistä proteiinin hajottamista.

is 84107

Denaturoiminen voidaan suorittaa erilaisilla tavoilla mukaan lukien proteiinien tavanomaiset käsittelymenetelmät fysikaalisilla menetelmillä, kuten lämmöllä, ultraäänellä, korkealla tai matalalla pH:11a, ja, kuten on 5 edullista, kemiallisella denaturoinnilla hajottamalla tai saattamalla vuorovaikutukseen liuoksessa olevan kaotroop-pisen aineen eli kaotroopin kanssa. Käyttökelpoisia kao-trooppisia aineita niihin rajoittumatta ovat guanidiini, urea ja erilaiset detergentit, kuten natriumdodekyylisul-10 faatti (SDS) ja muut niihin rajoittumatta, esim. deoksiko-laatti ja tietyt sappihappojen suolat, 3-(3-kolamidopro-pyyli)dimetyyli-ammonio-l-propaanisulfonaatti, orgaaniset liuottimet, kuten metanoli, propanoli ja asetonitriili, ja tietyt suolat, kuten kaliumtiosyanaatti. Ionittomat deter-15 gentit, kuten Triton X, Tween, Nonidet NP-40 ja oktyyli-glukosidit, voivat myös toimia proteiinin denaturoivina aineina. Reagenssit, jotka pelkistävät disulfidisidoksia, (esim. merkaptoetanoli tai ditiotreitoli) voivat olla tehokkaita denaturointiprosessin edistäjiä. Proteiinin dena-20 turointi voi olla tehokkainta, mikäli käytetään kemiallisten ja/tai kemiallisten ja fysikaalisten menetelmien yhdistelmiä (esim. guanidiini ja lämpö, guanidiini ja SDS tai guanidiini ja ditiotreitoli). Erityisesti voimakkaat kaotroopit, kuten guanidiini, ovat edullisimpia. Tietenkin 25 vältetään denaturointiolosuhteita, jotka saavat aikaan huomattavaa aggregaatiota, liukenemattomuutta tai proteiinin saostumista siten, että riittämätön määrä esille saatettua epitooppia on saatavissa liuoksessa vasta-aineeseen sitoutumista varten. Riittävä määrä denaturoitua proteii-30 nia täytyy jäädä liuokseen tai suspensioon, jotta saavutetaan käyttökelpoinen immunositoutuminen. Tarvittavan liukoisuuden määrä riippuu aiotun tai halutun sitoutumisen olosuhteista.

Merkittävä määrä haluttua proteiinia tietyssä koe-35 näytteessä voidaan denaturoida peptidiepitoopin saattami- 84107 16 seksi esille vasta-aineeseen sitoutumista varten yhdistämällä näyte kaotroopin vesiliuokseen, jossa kaotrooppia on läsnä riittävä pitoisuus denaturoimaan merkittävä määrä proteiinia saatavassa vesiliuoksessa. Silloin kun näyte on 5 kokoverta, kuten määritettäessä HbAlc:tä, kaotrooppi toimii myös punaisten verisolujen hajottajana, jolloin Hb vapautuu, sekä proteaasin inaktivoijana. Guanidiinin tapauksessa liuoksen pitoisuus on edullisesti suurempi kuin 1-mo-laarinen ja 3-molaarinen liuos on erityisen käyttökelpoi-10 nen. Denaturointiprosessia edistää merkittävästi seoksen lyhytaikainen lämmittäminen. On havaittu, että lämpötiloissa alle 37 °C denaturoiminen kaotroopilla voi kestää yhdestä useaan tuntiin, kun taas 50 °C:n yläpuolella olevissa lämpötiloissa riittävä denaturoituminen voidaan saa-15 vuttaa minuutissa tai sitä nopeammin. Jotta estettäisiin vasta-aineen ja muiden myöhemmin lisättävien proteiinirea-genssien merkittävä denaturoituminen, laimennetaan näyte-kaotrooppiseos tavallisesti erillisenä vaiheena tai lisätään reagenssiliuoksia tasolle, jolla kaotrooppi ei oleel-20 lisesti pysty denaturoimaan näitä reagensseja ja joka kuitenkin pitää epitoopin saatavilla estämällä mielenkiinnon kohteena olevan proteiinin merkittävä renaturoituminen. Guanidiinin tapauksessa tämä edullisesti vaatii laimentamisen alle noin 1,0-molaariseen pitoisuuteen, erityises-25 ti alle 0,3-molaariseen pitoisuuteen.

Keksinnössä hajotuksessa käytettävistä proteolyyt-tisistä entsyymeistä ei-rajoittavia esimerkkejä ovat tryp-siini, kymotrypsiini, proliini-spesifinen endoproteaasi, pepsiini ja papaiini. Suoritettaessa immunoanalyysiä ana-30 lyysiseokseen lisätään proteolyyttisten entsyymien inhi-biittoreita, kuten tunnettua, riittävästi estämään pro-teiinianalyysiaineiden hajoamista.

Esillä olevaa keksintöä voitaisiin käyttää oleellisesti mihin tahansa proteiiniin mukaan lukien pienimole-35 kyylipainoiset proteiinit, Mp. esim. 5 000 daltonia tai

II

i7 841 07 vähemmän (tässä käytettynä termi proteiini sisältää myös yhdisteet, joita voitaisiin kutsua polypeptideiksi niiden molekyylipainon takia), kuten myös proteiinit, joiden mo-lekyylipainot ovat useita satojatuhansia tai suurempia.

5 Esimerkkejä proteiiniluokista ovat protamiinit, mukopro-teiinit, glukoproteiinit, globuliinit, albumiinit, fosfo-proteiinit, histonit, lipoproteiinit, kromoproteiinit ja nukleoproteiinit. Erityisen edullinen esillä olevan keksinnön ominaisuus on se, että se voisi tarjota yleisen me-10 netelmän parantaa sitoutumisen spesifisyyttä ja analyyttistä mielenkiintoa omaavien proteiinien havaitsemista lääketieteen ja eläinlääketieteen diagnostiikan alueilla. Esillä oleva keksintö voisi tarjota mahdollisuuden valikoida muutoin tavoittamattomia tai suojatusti lineaarisia 15 peptidifragmentteja tai alueita proteiinissa epitoopeiksi, jotka voivat olla erittäin immunogeenisiä ja myös spesifisiä ja saatavissa vasta-ainesitoutumiseen. Esillä olevan keksinnön sovellutuksia voisivat olla kaikki tilanteet, joissa halutaan sitoa tietty proteiini vasta-ainereagens-20 silla ja jossa proteiini altistetaan denaturoiville olosuhteille.

Esillä oleva keksintö koskee erityisesti immuno-analyysejä ja reagenssisysteemejä tietyn proteiinianalyy-tin spesifistä määrittämistä varten. Esillä olevan keksin-25 nön avulla voitaisiin myös saada mahdollisuus löytää uusia ja käyttökelpoisia lineaarisia peptidiepitooppeja ja lisätä sellaisten epitooppien esillä olemista kiinnostavissa proteiineissa. Keksintöä voitaisiin erityisesti soveltaa toteamaan proteiineja, jotka ovat tunnettuja biologisen 30 tai analyyttisen merkityksen omaavissa ei-peptidimodifi-kaatioissa. Esillä oleva menetelmä tarjoaa sitoutumis-olosuhteet, jotka tekevät mahdolliseksi menestyksellisen tai parantuneen proteiinin spesifisen havaitsemisen tapauksissa, joissa karakterisoiva epitooppi on tavoitta-35 mattomissa tai vain rajoitetusti tavoitettavissa vasta- ia 84107 ainesitoutumiselle natiivissa proteiinissa. Eräs tässä keksinnössä käytetyn denaturoinnin sovellutus voisi olla sellaisten epitooppien löytäminen proteiineissa, jotka epitoopit ovat spesifisempiä ja/tai joilla on suurempi 5 sitoutumisaffiniteetti kuin on niillä, jotka ovat käytet tävissä vasta-ainemuodostumiseen ja -sitoutumiseen tavallisesti altistuvissa proteiinin osissa. Immunisoimalla haluttu isäntäeläin sopivalla proteiinin denaturoidulla muodolla tai sen fragmentilla, voitaisiin tutkia saatavaa 10 immunovastetta vasta-aineille, joilla on haluttu parempi spesifisyys ja/tai saatavuus. Tällaisen sovellutuksen laajennuksena olisi soluanalyyttien, kuten verisolujen, ja mikro-organismien, mukaan lukien bakteerit ja virukset ja vastaavat, spesifinen havaitseminen. Tapauksissa, joissa 15 on toivottavaa parantaa havaitsemisen spesifisyyttä vasta-ainesitoutumisella pintaproteiiniantigeeneihin saatuun verrattuna, voitaisiin tutkia sisäepitooppeja denaturoimalla pintaproteiineja ja/tai solun sisällä olevia proteiineja, jotta saadaan parempi vasta-ainevaste.

20 Keksinnön mukainen HbAlc:n immunologinen määritys menetelmä, jossa käytetään edellä kuvattua vasta-ainerea-genssia, joka on spesifinen lineaariselle peptidiepitoo-pille, ja jossa denaturoidaan koenäytteessä tai määritysmenetelmän väliaineessa oleva proteiinianalyytti, voi ta-25 pahtua oleellisesti millä tahansa tavallisella menetelmällä. Tällaisia ovat klassisemmat menetelmät, kuten im-munodiffuusio, immunoelektroforeesi, agglutinointimenetel-mät ja komplementin sitominen, samoin kuin uudemmat menetelmät, joissa on käytettävä spesifisesti havaittavia lei-30 ma-aineita, kuten radioimmunoanalyysi ja ei-radioisotoop-piset menetelmät. Immunoanalyysin suorittaminen HbAlc:lle keksinnön mukaisesti käsittää oleelliset vaiheet, joissa käsitellään vesipitoinen koenäyte, jotta tehokkaasti denaturoidaan siinä mahdollisesti olevasta tästä proteiinista 35 huomattava määrä halutun lineaarisen peptidiepitoopin • l 19 841 07 saattamiseksi esille, ja saatetaan denaturoitu näyte kosketukseen vasta-ainereagenssin kanssa, ja joissa määritetään vasta-ainereagenssin sitoutuminen tähän proteiiniin. Määritysvaihe vaihtelee tietenkin käytetyn perusimmunoana-5 lyysimenetelmän mukaisesti. Tavallisessa tähän määrityk seen käytetyssä menetelmässä käytetään leimattua reagens-sia, joka reagoi joko analyytin tai vasta-ainereagenssin kanssa ja jota käytetään tavalla, joka osoittaa immuno-kompleksin muodostumisen analyytin ja vasta-ainereagenssin 10 välille tai kilpailee tällaisen muodostumisen kanssa.

Jälkimmäinen menetelmä voidaan suorittaa lukuisilla tavoilla, kuten kilpailevalla sitoutumisella, jossa leimattu reagenssi saatetaan kilpailemaan proteiinianalyytin kanssa vasta-ainereagenssiin sitoutumisesta. Vasta-aine-15 reagenssiin sitoutuneen leimatun reagenssin määrä tai vapaan, vasta-ainereagenssiin sitoutumattoman leimatun reagenssin määrä mitataan sopivasti ja nämä voidaan funktionaalisesta suhteuttaa näytteessä olevaan proteiinianalyytin määrään. Koska tämä vasta-ainereagenssi on suunnattu 20 proteiinianalyytissä olevaan lineaariseen epitooppiin, leimattu reagenssi voi olla denaturoidun proteiinin tai sen denaturoidun fragmentin leimattu muoto tai edullisesti lineaarisen epitoopin aminohapposekvenssin sisältävän pep-tiditähteen leimattu muoto. Jälkimmäinen edullinen rea-25 genssi voidaan valmistaa käytössä olevilla synteettisillä peptidimenetelmillä ja laitteistoilla, eikä itse proteii-nimolekyyliä tarvitse eristää, puhdistaa eikä denaturoida.

Toinen käyttökelpoinen immunoanalyysimenetelmä pro-teiinianalyyttien havaitsemiseksi on sandwich-menetelmänä 30 tunnettu menetelmä. Tässä menetelmässä käytetään kahta vasta-ainereagenssia, joista toinen on leimattu ja toista käytetään alkuperin leimatun, proteiinianalyyttiin sitoutuneen vasta-ainereagenssin erottamiseen sitoutumattomasta vasta-ainereagenssista. Leimaamaton toinen vasta-aine- 20 84107 reagenssi on tyypillisesti imraobilisoitu tai immobilisoi-tavissa oleva muoto, kuten alalla on tunnettua.

Radioimmunoanalyyseissä vapaat molekyylit ja sidotut molekyylit on voitava erottaa toisistaan fysikaali-5 sesti, jotta leima voidaan mitata, sillä syntyvä signaali on kvalitatiivisesti sama molemmissa molekyyleissä. Tällainen menetelmä tunnetaan alalla heterogeenisenä, koska tarvitaan faasierotus. Tunnetaan muitakin heterogeenisiä immunoanalyysimenetelmiä, kuten entsyymileimatut immuno-10 analyysit, joihin joskus viitataan ELISA-menetelminä (ks. US-patentti 3 654 090), ja fluoresenssi-immunoanalyysit (ks. US-patentit 4 201 763, 4 133 639 ja 3 992 631).

Viime aikoina on kehitetty lukuisia immunoanalyysimenetelmiä, joissa vältetään erotusvaihe käyttämällä lei-15 maa, jonka havaittavaan signaaliin vaikuttaa leimatun rea-genssin sitoutuminen sitoutuvan aineen, esim. vasta-aineen, kanssa. Tällaiset menetelmät ovat tulleet tunnetuiksi homogeenisinä menetelminä ja silloin kuin niitä on käytettävissä, ne ovat edullisia keksinnössä, koska erotus-20 vaihetta eikä radioisotooppeja ei tarvita. Eräitä tällaisia menetelmiä ovat fluoresenssisammutus ja -lisäys (ks. US-patentti 4 160 016), energiansiirtoimmunoanalyysi (ks. US-patentti 3 996 345) ja kaksoisvasta-aine - eteerinen esto - immunoanalyysi (ks. US-patentit 3 935 074 ja 3 998 25 943). Erityisen edullisia homogeenisiä immunoanalyysimene telmiä ovat sellaiset menetelmät, joissa käytetään entsyymillä katalysoituun reaktioon osallistuvaa leimaa. Esimerkkejä ovat substraattileimattu immunoanalyysi (ks. US-patentti 4 279 992 ja GB-patenttihakemusjulkaisu 1 552 30 607), prosteettinen ryhmä (FAD)-leimattu immunoanalyysi (ks. US-patentti 4 238 565), entsyymimodulaattorileimattu immunoanalyysi, esimerkiksi inhibiittorileimoja käyttäen (ks. US-patentit 4 134 972 ja 4 273 866) ja entsyymilei-mattu immunoanalyysi (ks. US-patentti 3 817 837).

tl n 84107

Keksinnössä käytetylle vasta-ainereagenssille on tunnusomaista, että se sitoutuu spesifisesti HbAlc:n lineaariseen peptidiepitooppiin. Täten tässä käytetyllä termillä "vasta-ainereagenssi" viitataan mihin tahansa ainee-5 seen, jossa on vasta-aineen sitoutumispaikka, joka on spesifinen tällaiselle peptidiepitoopille. Tämä termi käsittää siten kokonaiset vasta-aineet samoin kuin niiden sopivat fragmentit ja polyfunktionaaliset muodot. Kokonaisena vasta-aineena se voi kuulua mihin tahansa tunnettujen im-10 munoglobuliinien luokkaan tai alaluokkaan, esim. IgG, IgM jne. Mitä tahansa jonkin tällaisen immunoglobuliinin fragmenttia, jolla on spesifinen sitoutumiskyky peptidiepitooppiin, voidaan myös käyttää, esimerkiksi tavallisesti Fab:na, Fab':na ja F(ab')2:na tunnettuja IgG:n frag-15 mentteja. Lisäksi voidaan käyttää immunoglobuliinien tai niiden fragmenttien aggregaatteja, polymeerejä, johdannaisia, konjugaatteja ja hybridejä, silloin kun se sopii.

Vasta-ainereagenssin immunoglobuliinilähde voidaan saada millä tahansa käytettävissä olevalla menetelmällä, 20 kuten tavanomaisilla antiseerumi- ja monoklonaalimenetel-millä. Antiseerumi voidaan saada hyvin määritellyillä menetelmillä, joissa eläin, kuten hiiri, kani, marsu tai vastaava eläin, immunisoidaan sopivalla immunogeenillä. Immunoglobuliineja saadaan myös somaattisella soluhybridi-25 säätiöllä, jolla saadaan tavallisesti monoklonaalisiksi vasta-aineiksi kutsuttuja vasta-aineita.

Monoklonaaliset vasta-ainereagenssit ovat erityisen edullisia. Hybridoomasolulinjat saadaan tuottamaan vasta-aineita vain proteiinimolekyylin lineaarista peptidiepi-30 tooppiosaa vastaan pikemmin kuin kokonaista proteiinia vastaan ja tällaiset solulinjat ja niiden vasta-aineet seulotaan selektiivisesti halutun epitoopin kanssa reagoivien monoklonaalisten vasta-aineiden identifioimiseksi ja eristämiseksi.

22 841 07

Eräässä menetelmässä tällaisten vasta-aineiden valmistamiseksi, proteiiniketjun fragmentti, joka vastaa ja sisältää luonnostaan esiintyvän lineaarisen peptidiepi-tooppisekvenssin, liitetään proteiinikantajaan ja injek-5 toidaan laboratorioeläimeen immuunivasteen aikaansaamiseksi. Vaihtoehtoisesti immunogeeni voi sisältää proteiinin tai sen fragmentin linearisoitua tai denaturoitua muotoa. Immunisoidun eläimen lymfosyytit, kuten pernasolut, yhdistetään myeloomasolujen kanssa, jotta saadaan hybridoomia, 10 joita viljellään ja jotka seulotaan monoklonaalisten vasta-aineiden tuottamista varten. Monoklonaaliset vasta-aineet seulotaan niiden vasta-aineiden suhteen, jotka ovat selektiivisiä peptidiepitoopille, ja tämä tietty solulinja kloonataan käytettäväksi tuotettaessa lisää monoklonaalis-15 ta vasta-ainetta.

Vasta-aineiden tuottamiseksi synteettistä peptidi-immunogeeniä vastaan laboratorioeläimessä, esim. BALB/c-hiirissä, rotissa tai vastaavissa eläimissä, tuotetaan ja eritetään peptidi, joka sisältää halutun epitoopin, luon-20 nostaan esiintyvästä proteiinista tai syntetisoidaan se kemiallisesti ja puhdistetaan. Tällainen proteiinifrag-mentti sisältää halutun epitoopin kaikki kriittiset amino-happoyksiköt ja voi sisältää muita aminohappoyksiköitä, joista joku tai kaikki mahdollisesti vastaavat mielenkiin-25 non kohteena olevan proteiinin aminohapposekvenssiä.

Sen varmistamiseksi, että epitoopin sisältävä pep-tidifragmentti on optimaalisesti antigeeninen, se voidaan edullisesti liittää moninkertaisesti immunogeeniseen kantaja-aineeseen. Immunogeeninen kantaja-aine voi olla jokin 30 yleisesti tunnetuista kantaja-aineista, jotka sisältävät funktionaalisia ryhmiä, jotka ovat käytettävissä peptidi-tähteeseen sitoutumiseen. Useimmissa tapauksissa kantaja on proteiini tai polypeptidi, vaikka muita aineita, kuten hiilihydraatteja, polysakkarideja, lipopolysakkarideja, 35 nukleiinihappoja ja vastaavia aineita, joilla on riittävä ti 23 841 07 koko ja immunogeenisyys, voidaan myös käyttää. Useimmiten immunogeenisten proteiinien ja polypeptidien molekyylipai-not ovat luokkaa 4 000 - 10 000 000, edullisesti suurempia kuin 15 000 ja yleisemmin suurempia kuin 50 000. Yleensä 5 yhdestä eläinlajista otetut proteiinit ovat immunogeeni-siä, kun ne viedään toisen eläinlajin verenkiertoon. Erityisen käyttökelpoisia proteiineja ovat albumiinit, globu-liinit, hemosyaniinit, gluteliinit ja vastaavat proteiinit. Muita viitejulkaisuja tämänhetkisistä tavanomaisista 10 immunogeenisistä kantaja-aineista ja hapteenien liittämisestä niihin on esitetty seuraavassa: Parker, Radioimmunoassay of Biologically Active Compounds, Prentice-Hall (Englewood Cliffs, New Jersey, USA, 1976); Butler, J. Immunol. Meth. 7 (1974) 1 - 24; Weinryb ja Shroff, Drug 15 Metab. Rev. 10 (1974) 271 - 283; Broughton ja Strong, Clin. Chem. 22 (1976) 726 - 732; ja Playfair et al., Br. Med. Bull. 30 (1974) 24 - 31.

Tiettyyn immunogeeniseen kantaja-aineeseen kytkettyjen epitooppien lukumäärää rajoittaa vain käytettävissä 20 olevien sitoutumispaikkojen lukumäärä kantajassa, ja lukumäärä voi olla useita tuhansia tietyillä suurimolekyyli-painoisilla synteettisillä peptideillä, kuten polylysii-nillä. Tietyn kantajan epitooppitiheys riippuu kantajan molekyylipainosta ja käytettävissä olevien sitoutumispaik-25 kojen tiheydestä. Optimaaliset epitooppitiheydet, joilla saavutetaan immunogeenin synteesin optimaalinen helppous ja toistettavuus sekä optimaalinen vasta-ainevaste, ovat noin 10 - 50 % käytettävissä olevista sitoutumisryhmistä kantaja-aineessa.

30 Peptidifragmentit liitetään kantaja-aineeseen jol lakin sopivalla kytkentämenetelmällä. Fragmentissa olevien natiivien aminohappojen funktionaalisia ryhmiä tai fragmentin kemiallisella muuntamisella saatuja funktionaalisia ryhmiä käytetään tavallisesti kytkettäessä suoraan tai 35 bifunktionaalisten kytkentäaineiden välityksellä kantajan 24 841 07 funktionaalisiin ryhmiin. Edullista on suunnitella pepti-difragmentti, jossa on yksi ainutlaatuinen reaktiivinen funktionaalinen ryhmä, jotta saadaan yksiselitteinen sitoutuminen kantaja-aineeseen.

5 Esillä oleva keksintö antaa käyttöön erittäin spe sifisen immunologisen määritysmenetelmän glykosyloidun hemoglobiinin määrittämiseksi biologisista nesteistä, kuten kokoverestä. Monoklonaalisten vasta-aineiden, jotka on saatu synteettisiä, glykosyloituja, N-terminaalisia 10 HbAlc:ssä esiintyviä peptiditähteitä vastaan, on havaittu sitoutuvan spesifisesti tällaisiin tähteisiin hemoglobiinin glykosyloidussa β-alayksikössä. Vasta-aineet voidaan valmistaa erilaisilla menetelmillä tavallisten monoklonaa-litekniikoiden mukaisesti. Periaatteessa vasta-aineet val-15 mistetaan synteettisesti johdettua immunogeeniä vastaan, joka sisältää halutun glykosyloidun N-terminaalisen pepti-ditähteen kemiallisesti sitoutuneena immunogeeniseen kantajaan, jolloin glykosyloitu peptidi sisältää vähintään 2 ja edullisesti noin 5-15 aminohappoyksikköä, jotka vas-20 taavat HbAlc:ta. Saadut monoklonaaliset vasta-aineet ovat spesifisiä glykosyloiduille synteettisille peptideille ja vastaavalle esille saatetulle epitoopille HbAlc-molekyylis-sä.

HbAlc:lle spesifisten monoklonaalisten vasta-ainei-25 den valmistusta ja käyttöä koskevia yksityiskohtaisia tietoja esitetään tästä hakemuksesta jakamalla erotetussa FI-patenttihakemuksessa 904 226.

Seuraavilla esimerkeillä valaistaan esillä olevaa keksintöä, mutta niitä ei pidä tulkita keksintöä rajoitta-30 viksi.

Esimerkki 1

Vasta-aineiden valmistaminen ja karakterisointi

HbA^tn glykopeptidiepitoopille a) Syntetisoitiin 11 aminohappoa sisältävä peptidi, 35 jossa oli β-hemoglobiinin kahdeksan N-terminaalista yksik-

II

25 841 07 köä ja kaksi tyrosiiniyksikköä sekä kysteiiniyksikkö, menetelmällä, jonka ovat esittäneet Gutte, B. ja Merrifield, R.B., J. Am. Chem. Soc., 91 (1969) 2 501, jolloin saatiin seuraavat peptidit: 5 NH2-valiini-histidiini-leusiini-treoniini-proliini- glutamiinihappo-glutamiinihappo-lysiini-tyrosiini-tyrosiini-kysteiini-COOH.

Tämän peptidin glykosyloimiseksi 200 mg tätä puhdistettua peptidiä saatetaan reagoimaan 0,25 molaarisen 10 glukoosin kanssa 20 ml:ssa vedetöntä pyridiiniä 48 tunnin ajan huoneenlämpötilassa pimeässä. Seos kuivataan vakuu-missa. Saatava siirappi suspendoidaan uudelleen 20 milli-molaariseen kaliumfosfaattiin, pH 2,95, ja puhdistetaan HPLC:11a.

15 Glykopeptidin sisältävät fraktiot liuotetaan 0,1 M

trietyyliammoniumasetaattiin, pH 8,5, ja kromatografoidaan Affigel-601 -boronaattiaffiniteettihartsilla (Biorad), jolloin glykopeptidi adsorboituu selektiivisesti. Hartsi pestään 0,1 M trietyyliammoniumasetaatilla, pH 8,5, ja 20 glykopeptidi eluoidaan 0,1 M trietyyliammoniumasetaatilla, pH 5,0. Eluaatti kylmäkuivataan.

Tuote suspendoidaan uudelleen 1 ml:aan vettä, saatetaan reagoimaan 500-kertaisen moolaarisen ylimäärän kanssa ditiotreitolia (SH-ryhmän säilyttämiseksi kys-25 teiinissä) ja pelkistetty peptidi puhdistetaan uudelleen HPLC:11a ja kylmäkuivataan. Tätä glykopeptidiä säilytetään -20 eC:ssa typen alla ennen jatkokäyttöä.

b) KLH-MBS konjugaatti, kuten aikaisemmin on esitetty julkaisussa Lerner, R. et ai., Proc. Natl. Acad. 30 Sei. 78 (1981) 3403, saatetaan reagoimaan kohdan a) tuotteen kanssa siten, että glykopeptidiä on kaksinkertainen moolisuhde maleimidiin verrattuna kantajassa, 50 millimo-laarisessa (mM) kaliumfosfaatissa, pH 7,2, yhden tunnin ajan huoneenlämpötilassa.

26 841 07 c) kohdan b) liuos sekoitetaan yhtä suureen tilavuuteen Freundin täydellistä adjuvanttia, jolloin muodostuu vesi-öljyssä-emulsio, ja 200 pg konjugaattia injektoidaan BALB/cBy-hiiriin. Hiirille annetaan tehosteannos 5 30. ja 60. päivinä, ne tapetaan ja niiden pernat käytetään fuusioon Kohlerin ja Milsteinin, Nature 256 (1975) 495, mukaisesti, jolloin saadaan lukuisia hybridoomia. Hybri-doomat seulotaan, jotta voidaan identifioida ne, jotka tuottavat monoklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat spesi-10 fisiä glykosyloidulle peptidiepitoopille.

Alc:lle spesifisten monoklonaalisten vasta-aineiden seulonta suoritetaan käyttäen ELISA-menetelmää, jossa vasta-aine absorboidaan polystyreenimikrotiitterilevyjen (Linbro) pinnoille. Antigeenit ovat puhdistettuja ihmisen 15 Alc- ja ei-glykolysoituja Ao-hemoglobiineja. Alc puhdiste taan ihmisen punasoluhemolysaatista käyttäen kahta erilaista kromatografista menetelmää. Ensimmäisessä puhdistuksessa glykosyloitu hemoglobiini sidotaan boronaattiaf-finiteettihartsin (Pierce Chemical Co., Rockford, Illi-20 nois, USA, tuote nro 42 000) pinnalle valmistajan kuvaamalla tavalla. Tyypillisesti käytetään 1 - 5 g hemoglobiinia 100 ml kohti boronaattihartsia ja sitoutunut (glykohe-moglobiini) fraktio eluoidaan, kuten Pierce Chemical Co., GlycoTest Bulletin -julkaisussa esitetään, tuote nro 42 25 000. Eluoitu glykohemoglobiinifraktio tasapainotetaan io- nivahvuudeltaan matalaan puskuriin ja kromatografoidaan ioninvaihtohartsilla, kuten McDonald, M. et ai., J. Biol. Chem., 253 (1978) 2327 - 2332, ovat esittäneet. Alc-"piikki" analysoidaan isoelektrisellä fokusoinnilla ja hiili-30 hydraattianalyysillä käyttäen tiobarbituurihappoanalyysiä ja tulokset osoittavat, että tämä puhdistusmenetelmä tuotti ultrapuhdasta Alc-hemoglobiinia, koska puhdistettu materiaali sisältää hiilihydraattia ja sillä on tavallisesta Ao-hemoglobiinista poikkeava isoelektrinen piste. Samalla 35 tavalla Ao-hemoglobiini puhdistettiin sen ominaisuuden pe-

II

84107 27 rusteella, ettei se sitoudu boronaattiaffiniteettihart-siin, ja sitten se kromatografoitiin ioninvaihdolla Ao-"piikkinä" ioninvaihtokromatografisessa puhdistuksessa. Puhtaat Alc- ja Ao-hemoglobiinit adsorboidaan erillisille 5 mikrotiitterilevyille (2 pg/100 μΐ PBS/kuoppa) yön yli 4 °C:ssa. Levyjen vapaat sitoutumispaikat täytetään 1-%:lla BSA:lla PBS:ssa 60 minuutin ajan huoneenlämpötilassa ja levyt pestään sitten neljä kertaa PBS:lla. Supernatant-ti kustakin hybridoomasolulinjasta lisätään Alc- ja Ao-le-10 vylle ja levyjä inkuboidaan huoneenlämpötilassa 60 minuuttia. Levyt pestään neljä kertaa PBSrllä ja toinen vasta-aine (kanin anti-hiiri-IgG-peroksidaasi, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA, laimennuksena 1:5 000 l-%:ssa BSArssa PBS:ssa) lisätään ja levyjä inkuboidaan 60 15 minuuttia huoneenlämpötilassa. Levyt pestään neljä kertaa PBSrllä ja 200 μΐ substraattiliuosta (24,3 mM sitruunahappo, 51,4 M natriumfosfaatti, pH 5,3, joka sisältää 2,2 mM o-fenyleenidiamiinia ja 5,2 mM vetyperoksidia) lisätään. Reaktio lopetetaan 20 minuutin kuluttua lisäämällä 50 μΐ 8 20 M H2S04:ta ja peroksidaasireaktion tuote luetaan aallonpituudella 492 nm.

200 lähtöhybridoomasta, jotka tuottavat vasta-aineita hemoglobiinia vastaan, yhdeksän (9) identifioidaan spesifisiksi Alc-epitoopille, kun taas 191 reagoi sekä Alc:n 25 ja ei-glykosyloidun hemoglobiinin kanssa. Koska ennen immunisointia otetulla hiiren seerumilla ei esiinny havaittavaa vasta-ainevastetta ihmisen Ao- tai Alc-hemoglobii-nille ELISA-menetelmässä, pääasiallinen immuunivaste on kahdeksaa peptidisekvenssiä vastaan, jotka ovat yhtä yh-30 teisiä Alc:lle ja Ao:lle. Koska synteettinen peptidi-immu-nogeeni koostuu hemoglobiinisekvenssin kahdeksasta aminohappotähteestä, hiirien immuunivaste kohdistuu pääasiassa peptidiä eikä hiilihydraattia vastaan (191 200:sta hybri-doomasta reagoi sekä Ao:n että Alc:n kanssa). Kuten on odo-35 tettua, immunisoidun hiiren seerumissa on myös laajasti i 28 84107 ristiin reagoivia vasta-aineita, jotka reagoivat sekä Ao:n että Alc:n kanssa, mikä viittaa siihen, ettei spesifisyyttä Alc:lle saavuteta, ellei hybridoomia seulota Alc- eikä Ao-hemoglobiinille reaktiivisuuden suhteen. Edullisia hyb-5 ridoomia, jotka tuottavat vasta-aineita Alc-hemoglobiinia vastaan mutta eivät Ao-hemoglobiinia vastaan, talletettiin ATCCthen identifioituina talletustunnuksin ATCC HB 8639 ja j ATCC HB 8869 11. lokakuuta 1984 ja 10. heinäkuuta 1985, vastaavasti. j 10 d) Alc:n kanssa vasta-aineen sitomisesta kilpaile vien peptidien identifiointi.

Seuraavat peptidit valmistetaan entsyymihajotuksella glykosyloidusta, 11 aminohappoa sisältävästä lähtö-peptidistä Glyko-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-15 Cys (Glykopeptidi 1). Kaikki peptidifragmentit puhdistetaan HPLC:lla ja kvantitoidaan aminohapposekvenssillä. Lähtöpeptidin tryptisellä hajottamisella tuotettiin peptidi Glyko-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys (Glykopeptidi 2). Proliinispesifinen endoproteaasi tuottaa peptidin 20 Glyko-Val-His-Leu-Thr-Pro (Glykopeptidi 3). Peptidi Glyko-Val-His-FAD (Glykopeptidi 4), jossa dipeptidi on yhdistetty N6-aminoheksyyli-FAD: iin ja sitten glykosyloitu, valmistetaan menetelmällä, jonka ovat esittäneet Carrico ja Johnson, US-patentti nro 4 255 566, ja joka on saatu tri.

25 Kin Yip'ltä ja tri. R. Buckler'ltä, Ames Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana USA.

Tyypillisessä kilpailuanalyysissä kutakin peptidiä,

8 nmol - 8 pmol 100 pl:ssa PBSrää, jossa on 7,2 mM

Na2HP04:a, 2,8 mM NaH2P04:a ja 127 mM NaCl:a, pH 7,4, in-30 kuboidaan 100 μ1:η kanssa monoklonaalista soluviljelysu-pernatanttia 60 minuuttia huoneenlämpötilassa. Tämä seos lisätään polystyreenimikrotiitterilevylle, joka on päällystetty 1 pgilla Alc-hemoglobiinia/kuoppa. Mikäli peptidi kilpailee vasta-aineen kanssa, ei vasta-aine ole vapaa 35 sitomaan immobilisoitua Aic:ta. Levy pestään neljä kertaa 29 841 07 PBS:11a. Toinen vasta-aine (kanin anti-hiiri-IgG kytkettynä piparjuuriperoksidaasiin) lisätään 30 minuutin ajaksi ja levy pestään PBSrlla. Substraatti (2,2 mM o-fenyleeni-diamiini) ja vetyperoksidi (0,012 %) lisätään ja syntynyt 5 väri mitataan aallonpituudella 492 nm. Tuotteen määrä viittaa kilpailun asteeseen: esim. jos tuotetta ei ole yhtään, se merkitsee sitä, että kilpaileva peptidi kokonaan esti vasta-aineen sitoutumisen immobilisoituun Alc:n. Tulokset osoittavat, että kaikki neljä aikaisemmin esitet-10 tyä glukopeptidiä mukaan lukien Gluko-Val-His-FAD, ovat tehokkaita kilpailijoita. Glykopeptidit 1-4 estävät täysin yhden vasta-aineista, Ab-4:n, sitoutumisen Alc:hen (ks. kuviot 1 - 3). Glykopeptidit 1-3 mutta ei Glykopeptidi 4, estävät toisen vasta-aineen, Ab-3:n (ks. kuviot 1-4). 15 Peptidit, joista puuttuu hiilihydraatti, eivät in hiboi kilpailevasti, mikä osoittaa, että hiilihydraatti on oleellinen epitoopin komponentti ja tuottaa spesifisyyden vasta-aineiden Alc-hemoglobiinin tunnistamiselle (ks. kuvio 1).

20 Esimerkki 2

Kilpaileva immunoanalyysi HbA1f.:lle Tämä kilpaileva immunoanalyysi perustuu siihen, että käytetään tiettyä määrää hapteenileimaa (kuten esitetään esimerkissä 5), joka kilpailee hajotetun kokoveren 25 Alc:n kanssa immobilisoidun vasta-aineen sitomisesta. Koska vasta-aine tunnistaa sekä Alc:n että hapteenin, näytteessä oleva Alc:n määrä määrää sen hapteenileiman määrän, joka sitoutuu vasta-aineeseen. Koska vasta-aine on immobilisoi-tu, voidaan kaikki sitoutumaton reagenssi poistaa yksin- 30 kertaisella pesuvaiheella. Sitoutunut leima voidaan sitten määrittää ja verrata standardiin alkuperäisissä verinäytteissä olevan Alc:n määrittämistä varten.

Analyysi on kehitetty käyttäen kokoverta näytteenä ja menetelmä voidaan jakaa seuraavassa esitettäviin vai-35 heisiin: i 30 841 07 (1) Solujen hajotus - hemoglobiinin denaturointl Koska lopullisessa analyysissä tarvitaan kokoverta alle 0,3 μΐ, laimennetaan tarkasti pipetoitavissa oleva määrä verta (5 - 50 μΐ sormenpäästä tai kokoverta) denatu-5 roivaan liuokseen (3 M guanidiini-HCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,5) ja liuosta kuumennetaan 56 °C:ssa 2-15 minuuttia.

Alempia lämpötiloja voidaan myös käyttää, mutta silloin tarvitaan enemmän aikaa näytteen denaturoimiseksi täydellisesti. Denaturointi (a) inaktivoi koaguloitumismekanis-10 min, mikäli näytteitä ei ole valmistettu antikoagulanteis-sa; (b) hajottaa punasolut; (c) denaturoi proteaasit, entsyymit jne, ja optimaalisesti saattaa esille hemoglobiinin Alc-epitoopin; (d) vaikuttaa joko steriloivasti tai estävästi mikro-organismien kasvuun denaturoidussa verinäyt-15 teessä, vaikka näytettä ei olisi valmistettu ja käsitelty aseptisesti (esim. veri sormenpäästä) ja (e) saa aikaan stabiilin kliinisen näytteen, jota voidaan säilyttää päiviä huoneenlämpötilassa, ilman että sillä on vaikutusta lopulliseen analyysiin.

20 (2) Laimennus ja kilpailu

Pieni määrä denaturoitua kokoverta pipetoidaan tilavuudeltaan kymmenkertaiseen määrään puskuria, joka sisältää hapteenileiman. Tämä tehokkaasti laimentaa hemoglobiinin analyysiin sopivaan pitoisuuteen ja laimentaa 25 denaturoivan aineen alhaiseen pitoisuuteen, joka ei häiritse vasta-ainetta tai entsyymiaktiivisuutta. Vasta-aineella päällystetty helmi lisätään sitten tietyksi ajaksi, jona aikana vasta-aine sitoutuu joko Alc-hemoglobiiniin tai hapteeni-HRP:hen.

30 (3) Pesu ja lukeminen

Kilpailevan inkuboinnin jälkeen helmi pestään ja leima luetaan sopivan substraatin lisäämisen jälkeen. Tämän jälkeen signaalia verrataan standardiin ja määritetään alkuperäisessä kokoverinäytteessä olevan Alc:n määrä.

3i 84107

Yhteenveto analyysin yksityiskohdista esitetään seuraavassa:

Helmen päällystysmenetelmä:

Polystyreenihelmet (halkaisija 0,63 cm, peilimäinen 5 pintakäsittely) valmistaa Precision Ball Company, Chicago, Illinois, USA. Erät seulotaan, jotta saadaan helmiä, joilla esiintyy vähiten vaihtelua saman näytteen useissa im-munoanalyysimäärityksissä. Ennen päällystämistä helmet pestään absoluuttisella metanolilla ja sen jälkeen vedel-10 lä. Metanolipesu näytti merkittävästi alentavan saman näytteen useiden määritysten variaatiokerrointa. Tämän jälkeen vasta-aineliuos (5 pg vasta-ainetta/100 μΐ 0,2 M natriumboraattia, pH 8,5, jossa on 0,02 % natriumatsidia) lisätään kosteisiin helmiin ja helmiä pyöritetään yön yli 15 4 °C:ssa. Tämän jälkeen helmet pestään, tyhjät sitoutumis kohdat täytetään l-%:lla BSA:lla PBSissa, jossa on 0,02 % natriumatsidia. Tyypillisesti päällystetään 500 - 1 000 helmeä samalla kerralla ja niitä käytetään viikkoja ilman todisteita vasta-aineaktiivisuuden pienenemisestä. Pääl-20 lystyskokeet, joissa käytettiin radioaktiivista vasta-ainetta, osoittivat, että 0,5 pg vasta-ainetta sitoutuu helmeä kohti.

Helmiä käytetään tässä immunoanalyysissä, koska ne pystyvät sitomaan suhteellisen suuria proteiinimääriä. 25 Proteiinin hydrofobinen absorptio polystyreenin pinnalle on käytännöllistä, mutta se voitaisiin tietysti korvata jollakin monista menetelmistä, joissa proteiinit kiinnitetään kovalenttisesti polystyreeniin, funktionalisoi-tuihin hartseihin tai piioksidiin. Polystyreeni voi olla 30 malliltaan myös putki tai kyvetti.

Työskentelymenetelmä on seuraavananlainen: (a) Laimenna 50 pl kokoverta 1,0 ml:aan denaturoin-tiliuosta (3 M guanidiini-HCl, 10 mM Tris, pH 7,5), kuumenna 56 °C:ssa 15 minuuttia, laimenna edelleen 100 pl 1,0 35 ml:aan denaturointiliuosta.

32 8 4107 i (b) Lisää 50 μΐ edellä saatua liuosta 0,5 mitään fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS), pH 7,5, joka sisältää hapteeni-HPRtää. Inkuboinnit, pesut ja entsymaat-tiset reaktiot suoritetaan kätevästi 48-kuoppaisilla poly- 5 styreenikudosviljelylevyillä.

(c) Lisää vasta-aineella päällystetty helmi ja in-kuboi 30 minuuttia huoneenlämpötilassa samalla ravistaen.

(d) Pese helmet puskurilla (PBS) (tavallisesti 3 pesua 1 ml tn annoksilla).

10 (e) Lisää o-fenyleenidiamiinisubstraatti ja vety peroksidi .

(f) Pysäytä reaktio ja lue tuote 20 minuutin kulut- j tua.

i

Edellä esitettyä analyysiä käytetään seuraavana 15 esitettyjen kliinisten tulosten määrittämisessä. Vakioku-vaaja on esitetty kuviossa 4. Kilpailu käyttäen Glykopep-tidi lttä esitetään kuviossa 5. Normaalien ja diabeettis-ten luovuttajien arviointi esitetään kuviossa 6. Boronaat-tiaffiniteettimääritykset on suoritettu täsmälleen valmis-20 tajän. Pierce Chemical Co:n (GlycoTest, tuote nro 42 000) kuvaamalla tavalla.

Esimerkki 3 A1r.-epitoopin optimaalinen esille saattaminen

Ihmisen Alc-epitoopin optimaalinen reaktiivisuus 25 saadaan käsittelemällä natiivia hemoglobiinia (kokoveressä tai hemolysaatissa) menetelmillä tai reagensseilla, jotka saattavat epitoopin esille vasta-aineen sitoutumispaikal-le. Epitoopin optimaalinen esille saattaminen voidaan saada aikaan fysikaalisella denaturoinnilla (lämpö, ultra-30 ääni, jne.), kemiallisella menetelmällä, jossa käytetään klassisia denaturoivia aineita (urea, guanidiini, SDS, proteaasi) tai fysikaalisten ja kemiallisten menetelmien yhdistelmällä. Tehokkain on menetelmä, jossa kokoveri (50 μΐ) lisätään 1 ml:aan liuosta, jossa on 3 M guanidiini-35 HCl:a ja 10 mM Tris-HCl:a, pH 7,4 ja liuosta kuumennetaan n 33 84107 56 °C:ssa yli yhden minuutin ajan. Saatava näyte toimii optimaalisesti seuraavissa Alc-epitoopin immunoanalyyseis-sä. Liuos voidaan laimentaa kymmenenteen osaan puskurilla, jolloin guanidiini laimenee 0,3 M:n pitoisuuteen, jolla on 5 vähän tai ei ollenkaan vaikutusta normaaleihin vasta-aine-antigeeni-vuorovaikutuksiin ja entsyymiaktiivisuuksiin ja on sopiva väliaine seuraavissa immunoanalyyseissä.

Käytetään esimerkin 2 mukaista kilpailevaa immuno-analyysiä. Kilpailija on sokeritautipotilaan kokoveressä 10 oleva Alc. Kokoverinäyte viedään 3,0 M guanidiiniin 20 °C:ssa, 37 °C:ssa tai 56 °C:ssa 0 - 320 minuutin ajanjaksoiksi. Tulokset (kuvio 7) osoittavat, että ajan kuluessa 20 eC:ssa tai 37 °C:ssa epitooppi tulee esille ja siten tehokkaasti kilpailee hapteeni-HRP-konjugaatin kanssa. 15 56 °C:ssa epitooppi tulee esille maksimaalisesti viiden minuutin kuluttua, joka on aikaisin piste, joka on määritetty tässä analyysissä. Tulokset osoittavat, että natii-vissa hemoglobiini Alc -tetrameerissa epitooppi on sisäänpäin ja saavuttamattomissa eikä kilpaile lineaarisen syn-20 teettisen glukopeptidi-HPR-konjugaatin kanssa. Kuitenkin mikäli hemoglobiini Alc denaturoidaan, tulee juuri esille saatetusta epitoopista tehokas kilpailija lineaariselle glykopeptidi-entsyymikonj ugaatille.

25 Esimerkki 4

Vasta-ainespesifisyyden vertailu: Lampaan polyklo-naalinen vasta-aine verrattuna hiiren monoklonaali-seen vasteeseen

Lammas immunisoidaan (viiteen paikkaan, IM Freun-30 din täydellisessä adjuvantissa) esimerkin 1 (b) mukaisella glykopeptidi-KHL-konjugaatilla (4 mg). Tehosteinjektiot suoritetaan samalla tavalla 30 ja 60 päivän kuluttua. 60. päivän tehosteannos on Freundin epätäydellisessä apuaineessa. Ennen immunisointia otettu seerumi ja immuunisee-35 rumi määritetään niiden Alc- ja Ao-spesifisyyden suhteen 34 84107 ELISA-analyysissä, kuten esimerkissä 1 (c) esitetään. Tulokset (ks. kuvio 7) osoittavat, että synteettinen glyko-peptidi stimuloi immuunivasteen ihmisen hemoglobiinia vastaan, mutta immunoglobuliinit eivät ole spesifisiä Alc-5 hemoglobiinia vastaan. Tätä vastoin hiiren monoklonaaliset vasta-aineet Alc:lle ovat aivan spesifisiä Alc:lle mitattuna samalla analyysillä (esimerkin 1 (c) ELISA-analyysi; ks. kuvio 8). Yritykset puhdistaa lampaan antiseerumista im-munoaffinisesti vasta-ainetta, joka on spesifinen Alc:lle, 10 eivät onnistuneet.

Esimerkki 5

Hapteeni-leima-konjugaattien valmistus

Valmistettiin Glykopeptidi l:n HPR-konjugaatti. Hapteeni-HPR-konjugaatti valmistettiin saattamalla 15 mg 15 piparjuuriperoksidaasia (HPR) reagoimaan 10-kertaisen molaarisen ylimäärän kanssa MBS:ää (ks. esimerkki 1 b) 50 ml:ssa natriumfosfaattia, 1 mM EDTA, pH 7,0. MBS-HRP-kon-jugaatti puhdistettiin geelisuodatuksella (käyttäen edellä esitettyä puskuria) ja 0,34 mg glykopeptidihapteenia (Pep-20 tidi 1) lisättiin. Lopullinen hapteeni-HPR-konjugaatti puhdistettiin geelisuodatuksella HPLC:lla ja käytettiin laimennuksena 1:1 000 - 1:100 000 esimerkin 3 mukaisessa kilpailevassa immunoanalyysissä.

25 Esimerkki 6

Testiliuskaimmunoanalyysi HbA1t.: Ile a) 1 mg esimerkin 1 (c) mukaista monoklonaalista vasta-ainetta 0,1 M natriumboraattipuskurissa, pH 8,5, voidaan sekoittaa 200-kertaiseen molaariseen ylimäärään 30 fluoreseiini-isotiosyanaattia (FITC) ja antaa reagoida 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Fluoreseiinilla leimattu monoklonaalinen vasta-aine voidaan puhdistaa geelisuoda- j tuksella.

b) Testiliuska (polystyreeni, selluloosa jne), jos-35 sa on COOH-ryhmiä, upotetaan 0,5 ml:aan tuntematonta, de- 35 841 07 naturoitua hemolysaattia, pH 7,5. Liuska huuhdotaan puskurilla, pH 7,5, ja upotetaan puskuroituun liuokseen, jossa on kohdan a) mukaista fluoreseiinileimattua monoklonaa-lista vasta-ainetta, viideksi minuutiksi huoneeniämpöti-5 lassa. Liuska huuhdellaan uudelleen ja liuskan fluoresenssin määrä kuvaa tuntemattoman näytteen HbAlc:n määrää.

Esimerkki 7

Monoklonaalisen vasta-aineen liittäminen reagenssi-liuskaan ja sen käyttö immunoanalyysissä 10 Whatman 1 -suodatinpaperi (7 cm) viedään 20 ml:aan jääkylmää d-H20:ta ja liuoksen pH säädetään välille 10,5 - 11,5 5 M NaOHrlla. Liuosta tarkkaillaan koko aktivoinnin ajan ja pH pidetään välillä 10,5 - 11,5 lisäämällä tipoit-tain 5 M NaOHrta. Pieni sekoitussauva viedään dekantteri-15 lasin pohjalle, jossa suodatuspaperi on. Tämän jälkeen dekantterilasi viedään jäällä täytettyyn petrimaljaan, joka laitetaan magneettisekoittajan päälle. Dekantterila-siin lisätään 1 g kiinteää BrCNta ja tätä inkuboidaan samalla sekoittaen 20 minuuttia (jäissä). Suodatinpaperi 20 poistetaan liuoksesta ja pestään 100 ml:11a jääkylmää tislattua vettä (d-H20). Tämän jälkeen se pestään jääkylmässä 0,2 M Na2HP04-sitruunahappopuskurissa, pH 6,8. Vasta-aine (1 mg/ml 0,2M Na2HP04-sitruunahappopuskurissa, pH 6,8) lisätään ja vasta-aineen kytkeytymisen annetaan tapahtua 25 yhden tunnin ajan. Etanoliamiinia (10 ml 1 mM:sta liuosta) lisätään täyttämään reagoimattomat paikat (15 min) ja paperi pestään fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (PBS, 10 mM NaH2P04, 140 mM NaCl, pH 7,5) reagoimattomien komponenttien poistamiseksi.

30 Tämä reagenssiliuska upotetaan standardoituun mää rään tuntematonta, denaturoitua hemolysaattia, jossa on vasta-ainesitoutumisen leimattu kilpailija Alc-hemoglobii-nille. Sopiva kilpailija on glykopeptidi (Glykopeptidi 1), joka on kovalenttisesti kiinnitetty piparjuuriperoksi-35 daasiin (hapteeni-HRP). Liuska poistetaan ja huuhdotaan 36 841 07 PBS:11a. Liuskaan sitoutuneen hemoglobiinin määrä mitataan (määrä on kääntäen verrannollinen näytteen Alc:han) ja Alc-hemoglobiini voidaan kvantitoida vertaamalla standardi-näytteisiin.

5 Esimerkki 8 A,„:n ELISA-määritys

Tietty tilavuus denaturoitua verihemolysaattia (100 μΐ) lisätään polystyreenimikrotiitterilevyille ja annetaan sitoutua huoneenlämpötilassa 60 minuuttia. Levy 10 pestään neljä kertaa PBS:lla, jossa on 0,05 % Tween-20:tä (PBST). Monoklonaalista vasta-ainetta (kytkettynä pipar-juuriperoksidaasiin) lisätään (100 μΐ, 1 μg/ml) PBSTissa ja annetaan reagoida 30 minuuttia huoneenlämpötilassa. Ylimääräinen vasta-aine poistetaan pesemällä neljä kertaa 15 PBST:11a. Lisätään substraatti (o-fenyleenidiamiini, 2,2 mM) ja H202 (0,012 %) PBS:ssa ja reaktiotuote mitataan aallonpituudella 492. Värin voimakkuus kuvaa hemolysaatissa olevaa Alc:n määrää verrattaessa standardiarvoihin. Esimerkki 9 20 Αη„:η radioimmunoanalyysi 100 μΐ denaturoitua verihemolysaattia (200 nanomoo-lia hemoglobiinia) sekoitetaan seitsemään nanomooliin jo-dattua peptidiä Glyko-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Cys (500 000 pulssia minuutissa/7 nmol). Monoklo-25 naalista vasta-ainetta lisätään määrä, joka on riittävä sitomaan 50 % glykosyloidusta peptidistä, jos verihemo-lysaatissa on tavallinen (noin 3 %) määrä Alc-hemoglobii-nia. Suuremmat HbAlc-arvot kilpailevat peptidin kanssa samalla pienentäen vasta-aineen sitomien pulssien kokonais-30 määrää. Vasta-aine voidaan ottaa talteen immunosaostamal-la toisella vasta-aineella (kanin anti-hiiri-IgG) tai absorptiolla proteiini A -päällystetyille hiukkasille. Vasta-aineeseen sitoutuneen jodatun peptidin määrä voidaan määrittää gammaisotooppilaskimessa ja se antaa verihemo-35 lysaatissa olevan Alc:n määrän verrattaessa standardeihin.

il 37 841 07

Tulee ymmärtää, että selitys ja esimerkit ovat valaisevia mutta eivät kyseistä keksintöä rajoittavia, ja muita suoritusmuotoja, jotka ovat keksinnön hengen ja suo-japiirin mukaisia, on alan ammattilaisten löydettävissä.

5

Claims (15)

1. 38 841 07
2. 1. Immunologinen määritysmenetelmä hemoglobiini Alc (HbAlc) -glykoproteiinianalyytin määrittämiseksi vesipitoi-5 sesta koenäytteestä, jossa menetelmässä koenäyte saatetaan kosketukseen vasta-ainereagenssin kanssa, joka spesifisesti sitoo tämän ihmisen hemoglobiinin hiilihydraatilla mo-difioituneen lineaarisen peptidiepitoopin, ja vasta-ainereagenssin sitoutuminen määritetään, tunnettu sii- 10 tä, että koenäyte ensin käsitellään näytteessä mahdollisesti olevasta HbAlc:sta huomattavan määrän denaturoimisek-si lineaarisen peptidiepitoopin saattamiseksi esille tai sen esillä olemisen lisäämiseksi, jotta epitooppi voi sitoutua vasta-ainereagenssiin.
3. 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tun nettu siitä, että koenäyte käsitellään denaturoivissa olosuhteissa, joissa proteiinianalyytti ei oleellisesti aggregoidu tai saostu.
4. 3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, 20 tunnettu siitä, että koenäyte käsitellään kao- trooppisella aineella epitoopin saattamiseksi esille tai sen esillä olemisen lisäämiseksi.
5. 4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koenäyte käsitellään proteo- 25 lyyttisellä entsyymillä epitoopin saattamiseksi esille tai sen esillä olemisen lisäämiseksi.
6. 5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koenäyte käsitellään tiosya-naattisuolalla epitoopin saattamiseksi esille tai sen 30 esillä olemisen lisäämiseksi.
7. 6. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että proteiinianalyytti adsorboidaan kiinteälle pinnalle epitoopin saattamiseksi esille tai sen esillä olemisen lisäämiseksi.
8. 7. Jonkin patenttivaatimuksista 1-6 mukainen me- II 39 84107 netelmä, tunnettu siitä, että vasta-ainereagenssi on monoklonaalinen vasta-aine ja on saatu immunisoimalla eläin (a) synteettisellä peptidi-immunogeenillä, joka sisältää hiilihydraatilla modifioituneen lineaarisen pep-5 tidiepitoopin kytkettynä immunogeeniseen kantaja-ainee seen, tai (b) glykoproteiinin denaturoidulla tai hajotetulla muodolla.
9. 8. Jonkin patenttivaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että koenäyte on veri ja 10 vasra-ainereagenssi on monoklonaalinen vasta-aine tai sen vasta-aineen sitomiskohdan sisältävä fragmentti, joka sitoutuu spesifisesti ihmisen hemoglobiinin beeta-alayksikön glykosyloituun N-terminaaliseen peptidisekvenssiin.
10. 9. Reagenssisysteemi hemoglobiini Alc:n (HbAlc) -gly- 15 koproteiinianalyytin määrittämiseksi vesipitoisesta koe- näytteestä immunologista määritysmenetelmää käyttäen, joka systeemi sisältää vasta-ainereagenssia, joka spesifisesti sitoo HbAlc:n hiilihydraatilla modifioituneen lineaarisen peptidiepitoopin, tunnettu siitä, että se lisäksi 20 sisältää kemiallista ainetta, joka, kun se saatetaan kosketukseen koenäytteen kanssa, pystyy denaturoimaan näytteessä mahdollisesti olevasta HBAlc:stä huomattavan määrän lineaarisen peptidiepitoopin saattamiseksi esille tai sen esillä olemisen lisäämiseksi, jotta epitooppi voi sitoutua 25 vasta-ainereagenssiin.
11. 10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen reagenssisysteemi, tunnettu siitä, että kemiallinen denaturoiva aine ei oleellisesti aggregoi tai saosta proteiiniana-lyyttiä. .30 11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen reagens sisysteemi, tunnettu siitä, että kemiallinen denaturoiva aine on kaotrooppinen aine.
12. 12. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen reagenssisysteemi, tunnettu siitä, että kemiallinen de-35 naturoiva aine on tiosyanaattisuola. 40 841 07
13. 13. Jonkin patenttivaatimuksista 9-12 mukainen reagenssisysteemi, tunnettu siitä, että vasta-ai-nereagenssi on saatu immunisoimalla eläin (a) synteettisellä peptidi-immunogeenillä, joka sisältää hiilihydraa- 5 tiliä modifioituneen lineaarisen peptidiepitoopin kytkettynä immunogeeniseen kantaja-aineeseen, tai (b) glykopro-teiinin denaturoidulla tai hajotetulla muodolla.
14. 14. Jonkin patenttivaatimuksista 9-13 mukainen reagenssisysteemi, tunnettu siitä, että se lisäksi 10 sisältää hiilihydraatilla modifioituneen lineaarisen peptidiepitoopin leimattua muotoa.
15. 15. Jonkin patenttivaatimuksista 9-14 mukainen reagenssisysteemi, tunnettu siitä, että koenäyte on veri ja vasta-ainereagenssi on monoklonaalinen vasta- 15 aine tai sen vasta-aineen sitomiskohdan sisältävä fragmentti, joka sitoutuu spesifisesti tämän ihmisen hemoglobiinin beeta-alayksikön glykosyloituun N-terminaaliseen peptidisekvenssiin. Il 41 84107