DK165327C - Monoklonale antistoffer for Hb Alc og hybridomaer til brug ved fremstilling af antistofferne - Google Patents

Description

i

DK 165327 C

Den foreliggende opfindelse angår monoklonale antistoffer mod Hb Alc, og hybridomaer til brug ved fremstilling af antistofferne. Den foreliggende opfindelse er nyttig ved bestemmelse af den glycosylerede form af hæmoglobin, der er kendt som Hb Alc. Bestemmelsen af graden af glycosylering af hæmoglobin i en persons blod giver et nyttigt indeks for glucoseniveaukontrollen hos diabetikere. Ifølge opfindelsen tilvejebringes der monoklonale antistoffer, der specifikt bindes til den glycosylerede N-terminale peptidrest i Hb Alc.

Hæmoglobin er en proteintetramer dannet af fire kæder (underenheder) af aminosyrer, hver på ca. 143 enheder, og med en samlet molekylvægt på ca. 64.000. Ved den ene ende af molekylet (NH2-enden af £-underenheden) er der en valin-enhed, der kan reagere med glucose. Glycosylringen af hæmoglobin sker ved en ikke-enzymatisk reaktion, der involverer glucose og α-aminogruppen i valin. Efter en Schiff-basedan-nelse mellem reaktanterne undergår glucosen en Amadori-om-lejring, hvorved der dannes 1-deoxyfructo-valin. Dette kompleks er covalent og i det væsentlige irreversibelt. Glyco-syleringen styres af koncentrationen af reaktanterne, f.eks. hæmoglobin og glucose. Hos en normal (ikke-diabetisk) person er ca. 3% af alt hæmoglobin glycosyleret. Hæmoglobin-tetra-mere med en 1-deoxyfructo-valin ved N-terminussen af en β--kæde identificeres som værende glycosylerede eller Aic--hæmoglobin.

Glucoseniveauerne hos diabetikere er tilstrækkelig høje til at forøge hastigheden af glycosyleringen i direkte afhængighed af glucoseniveauet i blodet, hvilket afspejler sværhedsgraden af den diabetiske tilstand. Med hæmoglobin hæves niveauet af Alc til ca. 5 til 12%. Da hæmoglobins levetid i kredsløbet er ca. 120 dage, vil en måling af gluco-cosyleret hæmoglobin give en værdi, der afspejler et gennemsnitligt glucoseniveau i denne periode. Især vil et glu-serigt måltid ikke afspejle sig i et højt niveau af glycosyleret hæmoglobin eller serumalbumin. En måling af ind-

2 O

5 10 15 20 25 30

DK 165327 C

holdet af glycosyleret hæmoglobin giver således et sandere billede af de gennemsnitlige glucoseniveauer i kredsløbet og dermed et sandere billede af patientens tilstand o-ver et længere tidsrum. I US-patentskrift nr. 4.247.533 beskrives en analysemetode, hvorved antistoffer mod Hb A^c angiveligt dannes hos et særligt får ved injektion af Hb Alc og absorberes med ikke-glycosyleret hæmoglobin til dannelse af poly-klonale antistoffer, som skelner mellem Hb A^c og ikke-glycosyleret Hb. Sådanne antistoffer danner derefter basis for en prøve til bestemmelse af andelen af glycosyleret hæmoglobin i en prøve. Prøven kræver imidlertid et passende immuniseret får og antistofabsorptioner til opnåelse af den rette specificitet. Det er derfor kostbart og vanskeligt at producere specifikke polyklonale antistoffer. Antistofpræparaterne fremstillet ved denne absorptionsmetode angives at have lav titer og affinitet. Reproducerbarheden af denne metode er også et åbent spørgsmål, da der ikke er nye rapporter, der beskriver dens anvendelse til analyse af kliniske prøver af humant hæmoglobin. Et andet forsøg på at tilvejebringe antistoffer, der er specifikke for Hb Alc er beskrevet i US patentskrift nr. 4.478.744. Ifølge dette anvendes der som immuniserende middel et syntetisk peptid-immunogen i stedet for det normale hæmoglobinmolekyle. Dette materiale injiceres i et dyr, der normalt ikke har Hb Alc 1 blodbanen, f.eks. får. Det syntetiske peptid-immunogen indeholder en glycosyleret peptidrest, der har en aminosyresekvens svarende til mellem de første 4 til 10 aminosyrer i den N--terminale hæmoglobinsekvens. Senere undersøgelser, der er omtalt nedenfor, har vist, at det polyklonale antise-rum fra får mod det syntetiske peptid-immunogen ikke har nogen påviselig specificitet for den glycosylerede form 35 3 Definitioner

DK 165327 C

Forkortelse Arg Asp Glu Lys Ser Asn Gin Gly Pro Thr Ala His Cys Met Val Ile Leu Tyr Phe Trp

Aminosyre

Arginin

Asparaginsyre

Glutaminsyre

Lysin

Serin

Asparagin

Glutamin

Glycin

Prolin

Threonin

Alanin

Histidin

Cystein

Methlonin

Valin

Isoleucin

Leucin

Tyrosin

Phenylalanin

Tryptophan

Det har nu vist sig, at der kan opnås en særdeles specifik immunbinding til Hb Alc ved dannelse af et antistofreagens mod en lineær peptid-epitop i Hb Alc og kontakte-ring af et sådant antistofreagens med Hb Alc efter tilstrækkelig denaturering af Hb Alc til, at den lineære peptidepitop deri bliver tilgængelig eller mere tilgængelig.

Opfindelsen angår således et monoklonalt antistof eller fragment deraf omfattende et antistofkombineringssted, hvilket antistof eller fragment er ejendommeligt ved, at det bindes specifikt til den glycosylerede N-terminale peptidsekvens i β-underenheden af humant hæmoglobin efter tilstrækkelig frilæggelse af sekvensen ved fysisk eller kemisk denaturering eller nedbrydning til, at der tilvejebringes 4

4DK 165327 C

sterisk adgang dertil.

Opfindelsen angår også et hybridoraa til brug ved en fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof ifølge opfindelsen.

Den foreliggende opfindelse gør det muligt at gennemføre en særdeles specifik bestemmelse af Hb Αχσ i biologiske væsker, såsom blod. Monoklonale antistoffer dannet mod de syntetiske glycosylerede N-terminale peptidrester, der forekommer i Hb Aic, har vist sig at blive bundet specifikt til sådanne rester i den glycosylerede /?-underenhed i hæmoglobin. Antistofferne kan fremstilles på forskellige måder ifølge konventionelle monoklonale metoder. I det væsentlige fremstilles antistofferne mod et syntetisk tilvejebragt immunogen omfattende den ønskede glycosylerede N--terminale peptidrest bundet kemisk til en immunogen bærer, hvor det glycosylerede peptid har mindst 2, og fortrinsvis fra ca. 5 til 15, aminosyreenheder svarende til Hb Aj,c. De resulterende antistoffer er specifikke for det glycosylerede syntetiske peptid og den tilsvarende frilagte epitop i hæmo-globin-Aic-molekylet.

Figurerne på tegningen viser grafisk resultater af forsøg beskrevet i eksemplerne nedenfor vedrørende im-munopåvisning af Hb Alc·

Fig. 1 er en grafisk afbildning, der viser inhibe-ringen af Ab-3-binding til Alc med glycopeptid 1 (peptid 1). Antistoffet præinkuberes med glycopeptid før overføring til en A1(,-overtrukket mikrotiterplade. Det monoklonale antistof, der binder til Alc, påvises ved anvendelse et sekundært antistof-enzym. Resultaterne er vist i fig. 1 som inhibering i procent, hvor 0% inhibering er den værdi, der fås uden kompetitor. 0 - O-linien er for et identisk peptid, der mangler kulhydratet, hvilket viser, at kulhy-dratet er væsentligt for antistofbindingen. Alle punkter er middelværdier af tre målinger.

Fig. 2 er en grafisk afbildning, der viser inhi-beringen af Ab-3-binding til A^c med glycopeptid 3 (pep- 5

DK 165327 C

tid 3>. Det kompetitive forsøg gennemføres som beskrevet ved fig. 1.

Fig. 3 er en grafisk afbildning, der viser inhi-beringen af Ab-3 og Ab-4 til A^c-binding med glycopeptid 4 (peptid 4). Det kompetitive forsøg gennemføres som beskrevet ved fig. 1.

Fig. 4 viser en typisk standardkurve ved anvendelse af optimale bestemmelsesbetingelser. Helblods-standarden fremstilles ved anvendelse af forskellige forhold mellem denatureret helblod fra en diabetiker med 12,66%

Alc som målt ved HPLC-ionbytning og helblod fra en normal donor (3,83% Alc). Alle punkter med tredobbelte målinger er anført.

Fig. 5 viser en standardkurve ved anvendelse af en syntetisk peptidstandard. Bestemmelsen gennemføres som beskrevet ved fig. 4 bortset fra, at der i stedet for anvendelse af helblod anvendes forskellige mængder af syntetisk glycopeptid som kompetitor. Alle værdier af tredobbelte bestemmelser er afsat.

Fig. 6 viser grafisk en sammenligning af immuno-bestemmelsesmetoden med boronataffinitetsmetoden for donorer. Middelværdierne af tredobbelte bestemmelser er afsat for immunobestemmelseskoordinaten.

Fig. 7 er en grafisk afbildning, der viser tilgængeligheden af Hb A^c-epitopen under varierende denatureringsbetingelser.

Fig. 8 er en grafisk afbildning, der viser resultaterne af at immunisere et får med det syntetiske glycopeptid ifølge eksempel 1 b).

Fig. 9 er en grafisk afbildning, der viser, at mo-noklonale antistoffer fra mus er specifikke for A^c-hæmo-globin.

Immunobestemmelsen af Hb Alc ved anvendelse af det her omhandlede antistofreagens kan gennemføres ifølge i det væsentlige enhver konventionel metode. Sådanne metoder omfatter de mere klassiske, såsom immunodiffusion, immunelek- 6

DK 165327 C

troforese, agglutinationsmetoder og komplementfiksering, og de mere aktuelle metoder, der involverer anvendelse af specifikt påviselige mærkninger, såsom radioimmunobestemmelser og ikke-radiolsotop-metoder. Gennemførelsen af en immuno-bestemmelse af en proteinanalyt under anvendelse af et antistof ifølge opfindelsen omfatter de væsentlige trin, at den anvendte vandige testprøve behandles således, at ethvert sådant protein deri denatureres effektivt i væsentlig grad, således at den ønskede lineære peptidepitop frilægges, at den denaturerede prøve bringes i kontakt med antistofreagenset, og at bindingen af antistofreagenset til Hb Alc bestemmes. Bestemmelsestrinnet vil naturligvis variere afhængigt af den grundlæggende imrounbestemmelsesteknik, der anvendes.

En almindelig metode til udførelse af denne bestemmelse omfatter anvendelse af et mærket reagens, som vekselvirker med enten analyten eller antistofreagenset og anvendes til at indicere dannelse af et immunkompleks mellem analyten og antistofreagenset eller til at konkurrere med en sådan dannelse.

De sidstnævnte metoder kan anvendes på mange forskellige måder, idet der f.eks. kan anvendes kompetitiv binding, hvorved et mærket reagens bringes til at konkurrere med proteinanalyten om binding til antistofreagenset. Mængden af mærket reagens, som er bundet til antistofreagenset, eller den frie form, som består af mærket reagens, der ikke er bundet på denne måde, måles på passende måde og kan relateres funktionelt til mængden af proteinanalyt i prøven. Da antistofreagenset ifølge den foreliggende opfindelse er rettet mod en lineær epitop i proteinanalyten, kan det mærkede reagens være en mærket form af det denaturerede protein eller et denatureret fragment deraf eller som det vil foretrækkes, en mærket form af en peptidrest, der indeholder den lineære epitopsekvens af aminosyrer. Det sidstnævnte foretrukne reagens kan fremstilles ved hjælp af tilgængelige metoder og apparatur til fremstilling af syntetiske peptider og kræver ikke isolering, rensning og denaturering af proteinmolekylet selv.

7 O

5 10 15 20 25 30

DK 16532TC

En anden nyttig immunobestemmelsesmetode til påvisning af proteinanalyter er den, der er kendt som sandwich-metoden. Ved denne metode anvender man to sæt af antistofreagenser, hvoraf det ene er mærket, og det andet er tilpasset til at bevirke adskillelse af det første mærkede antistofreagens, som er bundet til proteinanalyten, fra det, der ikke er bundet. Det ikke-mærkede andet antistofreagens er typisk en immobiliseret eller immobiliser-bar form, således som det er kendt inden for teknikken. Ved radioimmunobestemmelser skal den frie form og den bundne form kunne skelnes eller separeres fysisk til måling af mærkestoffet, da signalet, som gives af mærkningen er kvalitativt det samme i begge former. En sådan teknik er kendt som heterogen på grund af nødvendigheden af en faseadskillelse. Der kendes andre heterogene immuno-bestemmelsesmetoder, herunder enzymmærkede immunobestem-melser, der undertiden betegnes ELISA-metoder (se US patentskrift nr. 3.654.090), og fluorescens-immunobestem-melser (se US patentskrift nr. 4.201.763, 4.133.639 og 3.992.631). I de senere år er der blevet udviklet talrige im-munobestemmelsesmetoder, hvorved adskillelsestrinnet undgås ved anvendelse af en mærkning, hvis påviselige signal moduleres ved binding af det mærkede reagens til en bindingspartner, f.eks. antistof, sådanne metoder er blevet kendt som homogene metoder, og når de står til rådighed foretrækkes de til anvendelse ved den foreliggende opfindelse, fordi adskillelser ikke er nødvendige, og der ikke anvendes radioisotoper. Nogle af sådanne metoder er fluorescensundertrykkelse og -forstærkning (se US patentskrift nr. 4.160.016), energioverførings-immunobe-stemmelse (se US patentskrift nr. 3.996.345) og dobbelt an-tistof-sterisk hindring-immunobestemmelse (se US patentskrift nr. 3.935.074 og 3.998.943). Særlig foretrukne homogene immunobestemmelsesmetoder er sådanne, hvorved der anvendes et mærkestof, som deltager i en enzymkatalyseret 35 8

8DK 165327 C

reaktion. Eksempler herpå er substratmærket immunobestem-melse (se US patentskrift nr. 4.279.992 og GB patentskrift nr. 1.552.607), prostetisk gruppe-(FAD)-mærket im-munobestemmelse (se US patentskrift nr. 4.238.565), enzym--modulator-mærket immunobestemmelse, f.eks. under anvendelse af inhibitor-mærkninger (se US-patentskrift nr. 4.134.972 og 4.273.866) og enzymmærket immunobestemmelse (se US-patentskrift nr. 3.817.837).

Antistofreagenset ifølge den foreliggende opfindelse er karakteriseret ved dets specifikke bindingsaffinitet til den lineære peptidepitop i Hb Alc. Derfor vil udtrykket "antistofreagens" som anvendt i den foreliggende beskrivelse referere til ethvert materiale fremkommet på en hvilken som helst måde, der indeholder et antistof-kombinationssted, som er specifikt for en sådan peptidepitop. Udtrykket omfatter derfor både hele antistoffer og passende fragmenter eller polyfunktionaliserede former deraf. Når der er tale om et helt antistof, kan det tilhøre enhver af klasserne eller underklasserne af kendte immunoglobuliner, f.eks. IgG, IgM osv. Ethvert fragment af ethvert sådant immunoglobulin, som bibeholder specifik bindingsaffinitet til peptidepitopen, kan også anvendes, f.eks. fragmenterne af IgG, der er almindeligt kendte som Fab, Fab' og F(ab')2· Desuden kan der anvendes aggregater, polymere, derivater, konjugater og hybrider af immunoglobuliner eller fragmenter deraf, hvor det er hensigtsmæssigt.

Immunoglobulin-kilden til antistofreagenset fås ved somatisk cellehybridisering, hvilket resulterer i, hvad der almindeligvis betegnes monoklonale antistoffer.

Hybridomcellelinier kan bringes til at producere antistoffer mod kun den lineære peptidepitopdel af proteinmolekylet snarere end mod hele proteinet, og sådanne cellelinier og deres antistoffer screenes til identificering og isolering af de monoklonale antistoffer, der reagerer selektivt med den ønskede epitop.

9

DK 165327 C

o

Ved én metode til dannelse af sådanne antistoffer kobles et fragment af proteinkæden, svarende til og omfattende den naturligt forekommende lineære peptidepitopsekvens, til en proteinbærer og injiceres i et laboratorie-5 dyr til fremkaldelse af en immunreaktion. Alternativt kan immunogenet omfatte en lineariseret eller denatureret form af proteinet eller et fragment deraf. Lymfocyter, såsom miltceller, fra det immuniserede dyr fusioneres med myelom-celler til dannelse af hybridomer, som dyrkes og screenes to for produktion af monoklonale antistoffer. De monoklonale antistoffer screenes for sådanne, der er selektive for pep-tidepitopen, og den pågældende cellelinie klones til anvendelse ved fremstilling af yderligere mængder af det monoklonale antistof.

15 Til dannelse af antistoffer mod et syntetisk pep- tidimmunogen i et laboratoriedyr, f.eks. BALB/c-mus, rotter og lignende, bliver et peptid indeholdende den ønskede epitop fremstillet og isoleret fra det naturligt forekommende protein eller syntetiseret kemisk og renset. Et sådant 20 proteinfragment vil indeholde alle de kritiske amlnosyreen-heder af den ønskede epitop og kan indeholde yderligere a-minosyreenheder, hvoraf nogle eller alle vil svare til sekvensen af aminosyrer i proteinet, som har interesse.

For at sikre, at peptidfragmentet indeholdende 25 epitopen er optimalt antigent, kan det fordelagtigt kobles multipelt til et immunogent bæremateriale. Det lmmuno-gene bæremateriale kan vælges blandt de konventionelt anvendte, der har funktionelle grupper, som står til rådighed til kobling til peptidresten. I de fleste tilfælde vil 30 bæreren være et protein eller polypeptid, selv om andre materialer, såsom kulhydrater, polysaccharider, lipopoly-saccharider, nucleinsyrer og lignende, med tilstrækkelig størrelse og immunogenitet ligeledes kan anvendes. For det meste vil immunogene proteiner og polypeptider have molekyl-35 vægte mellem 4.000 og 10.000.000, fortrinsvis over 15.000, og mere sædvanligt over 50.000. Generelt vil proteiner taget fra én dyreart være immunogene, når de indføres i blod- 10

DK 165327 C

banen hos en anden art. Særlig anvendelige proteiner er albuminer, globuliner, hæmocyaniner, gluteliner og lignende. Med hensyn til teknikkens stade vedrørende konventionelle immunogene bærematerialer og metoder til kobling af hap-tener dertil kan der henvises til følgende: Parker, "Radlo-immunoassay of Biologically Active Compunds", Prentice--Hall (Englewood Cliffs, New Jersey, USA, 1976), Butler, J. Immunol. Meth. 7, 1-24 (1974), Weinryb og Shroff, Drug Metab. Rev. 10, 271-283 (1974) , Broughton og Strong, Clin. Chem. 22, 726-732 (1976), og Playfair et al., Br. Med. Buil. 30, 24-31 (1974).

Antallet af epitoper, som kobles til et givet im-munogent bæremateriale, vil kun være begrænset af antallet af til rådighed stående koblingssteder på bæreren og kan være så højt som flere tusinde, når der er tale om visse syntetiske polypeptider med høj molekylvægt, såsom po-lylysin. Tætheden af epitoper på en bestemt bærer vil afhænge af molekylvægten af bæreren og tætheden af til rådighed stående koblingssteder. Optimale epitop-tætheder, med hensyn til letheden og reproducerbarheden af syntesen af immunogenet og antistofreaktionen, ligger mellem ca. 10 og ca. 50% af de til rådighed stående koblingsgrupper på den anvendte bærer.

Peptidfragmenterne kobles til bærematerialet ved en hvilken som helst bekvem koblingsmetode. Funktionelle grupper på de naturlige aminosyrer i fragmentet eller funktionelle grupper Indført ved kemisk modificering af fragmentet vil normalt blive anvendt til direkte kobling eller kobling via bifunktionelle grupper til funktionelle grupper på bæreren. Det vil være foretrukket at udforme peptidfragmentet til at have en enkelt funktionel gruppe, der er reaktiv på en særlig måde, således at der fås en entydig kobling til bæreren.

Monoklonale antistoffer dannet mod de syntetiske glycosylerede N-terminale peptidrester, der forekommer i HB Alc, har vist sig at blive bundet specifikt til sådanne res- 11

DK 165327 C

ter i den glycosylerede /3-underenhed i hæmoglobin. Antistof-i den glycosylerede β-underenhed i hæmoglobin. Antistofferne kan fremstilles på forskellige måder ifølge konventionelle monoklonale metoder. I det væsentlige fremstilles antistofferne mod et syntetisk fremkommet immunogen indeholdende den ønskede glycosylerede N-terminale peptidrest kemisk bundet til en immunogen bærer, idet det glycosylerede peptid har mindst 2 og fortrinsvis fra ca. 5 til 15 aminosyreenheder svarende til Hb Alc. De resulterende monoklonale antistoffer er specifikke for det glycosylerede syntetiske peptid og den tilsvarende frilagte epitop for Hb Alc-molekylet.

Monoklonale antistoffer, som er specifikke for Hb Alc i humant blod, udskilles af hybridomer, der er fremkommet ved fusion af myelomceller og lymfocyter taget fra et dyr, der er blevet immuniseret med en syntetisk peptid--immunogen. Det syntetiske peptid-immunogen vil fortrinsvis have formlen: TGlyco- (NH)Val-His-AA-Rf^-Bærer hvori Glyco-(NH)Val betyder en ikke-enzymatisk glycosyleret valinrest, His betyder den anden aminosyre i sekvensen af den naturlige β-underenhed af Hb, AA betyder en binding eller en eller flere aminosyrerester, R betyder en passende forbindelsesgruppe, "Bærer" betyder et immuno-gent bæremateriale, og n (epitop-tætheden) gennemsnitligt er fra 1 til antallet af til rådighed stående koblingssteder på bæreren. Forbindelsesgruppen R kan hidrøre fra ethvert ønsket koblingsmiddel, og AA kan indeholde en eller flere yderligere aminosyrerester svarende til den kulhydratbærende N-terminus i β-underenheden af humant hæmoglobin. For eksempel kan -AA- vælges fra følgende amino-syresekvens eller ethvert kontinuert fragment deraf, som begynder med leucinenheden: -Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys- 12

DK 165327 C

Desuden kan forbindelsesgruppen R bestå af yderligere aminosyrer, som ikke findes i normalt humant hæmoglobin, men som bekvemt kan tilføjes ved peptidsyntesemetoder og kan tjene som nyttige funktionelle grupper til kobling til bærematerialet. En særlig anvendelig forbindelsesgruppe er -Tyr--Tyr-Cys, som giver en særlig thiolgruppe til kontrollerbar kobling af den glycosylerede peptidenhed til bærematerialer.

Det monoklonale Hb Alc-antistof ifølge den foreliggende opfindelse er i det væsentlige karakteriseret ved sin specificitet til binding af den glycosylerede form af den N-terminale peptidsekvens af β-underenheden af humant hæmoglobin. Denne glycosylerede rest er det afgørende strukturelle træk ved Hb Alc. Et antistof ifølge den foreliggende opfindelse kræver en epitop eller et determinant-sted, der i det mindste omfatter 1-deoxyfructosyl--kulhydratenheden, som er dannet ved Amadori-omlejring af reaktionsproduktet mellem glucose og den terminale amin, og en peptidsekvens, som strækker sig derfra og omfatter mindst én af aminosyreenhederne i den Hb Alc-N-terminale sekvens i positionen svarende til den naturlige Hb Alc-se-kvens. De andre aminosyreenheder i peptidsekvensen, som karakteriserer epitopen, kan være de samme som eller forskellige fra de, der forekommer i den naturlige Hb Alc-se-kvens. På denne måde er epitopen karakteriseret ved mindst to kontakt- eller bindingssteder med antistoffet, og disse steder er enestående for den glycosylerede N-terminale Hb Alc-sekvens. Fortrinsvis vil antistoffet specifikt binde en glycosyleret peptidrest med formlen:

Glyco-(NH)Val-His-AA- hvori Glyco-(NH)Val og AA har den ovenfor angivne betydning. Særlig foretrukne monoklonale antistoffer har vist sig at være specifikke for den glycosylerede dipeptidrest uafhængigt af naturen af AA. Antistoffer med en specifici- 13

DK 165327 C

tet, som kræver glycosylerede peptidsekvenser med større længde kan også opnås, når AA er en sekvens med fra 1 til 12, fortrinsvis 1 til 6, aminosyrer svarende til N-terminus-sen af fJ-unde renheden af humant hæmoglobin. En sådan specificitet af det monoklonale antistof muliggør specifik påvisning af den tilgængelige glycosylerede N-terminale peptidrest i Hb Alc, hvorved andre glycosylerede peptidepitoper på hæmoglobin og andre proteiner og peptider, som er naturligt forekommende i humant blod, i alt væsentligt udelukkes .

Den glycosylerede N-terminale peptidrest på det naturlige Hb Alc-molekyle gøes tilgængelig for det monoklonale antistof eller et fragment deraf ifølge den foreliggende opfindelse ved passende denaturering eller nedbrydning af proteinet i prøven, der skal underkastes en bestemmelse. En hypotese, som lægges til grund for det held, hvormed der ifølge opfindelsen opnås specifikke antistoffer, hvor forsøg ifølge den kendte teknik har slået fejl, vil blive diskuteret i det følgende, men dens korrekthed skal ikke opfattes som kritisk for det opfinderiske ved den her omhandlede fremgangsmåde.

Den N-terminale sekvens af 3-underenheden af humant hæmoglobin er ganske lig den tilsvarende sekvens af musehæmoglobin, idet de første fire aminosyrer er identiske. For det andet glycosyleres musehæmoglobin i omtrent samme omfang som humant hæmoglobin. Derfor vil den N-ter-minale sekvens af 3-underenheden i det naturlige humane hæmoglobinmolekyle ikke blive opfattet som fremmed af musens organisme, og en immunreaktion vil ikke forventes. Dette har været det logiske grundlag for forskere indtil nu, som i overensstemmelse hermed har valgt et dyr (får) , som har en ganske anderledes hæmoglobin-proteinsekvens og ikke glycosyleres, i håbet om at opnå en immunreaktion. Den foreliggende opfindelse har imidlertid afsløret, at når den glycosylerede N-terminale rest udsættes for immunsystemet hos mus i form af et syntetisk peptidimmunogen, fore- 14

DK 165327 C

O

lægges epitopen i en konfiguration, som musen kan reagere immunologisk på. Ved somatiske cellekloningsmetoder kan der isoleres hybridomer, der udskiller højspecifikke antistoffer. De udskilte antistoffer vil bindes til den gly-5 cosylerede N-terminale peptidrest i det naturlige hæmo-globinmolekyle, hvis den er blevet frilagt tilstrækkeligt til vekselvirkning med kombineringsstedet på antistoffet. Måden, hvorpå epitopen frilægges, diskuteres mere detaljeret i det følgende.

10 Sterisk adgang af antistofreagenset til epitopen kan opnås på enhver effektiv måde. Frilæggelsen af epitopen i det intakte protein antages at ske ved en fysisk eller kemisk denaturering eller nedbrydning i i det mindste epitopens område. En sådan denaturering eller nedbryd-15 ning kan lokaliseres til epitopens område eller kan involvere en mere generel eller endog i det væsentlige fuldstændig denaturering af den tertiære, og desuden den sekundære, struktur af proteinet eller en delvis eller fuldstændig nedbrydning af proteinet.

20 Denaturering kan gennemføres på mange forskelli ge måder, herunder konventionel behandling af proteinet med fysiske midler, såsom varme, ultralyd, høj eller lav pH--værdi, og, som det foretrækkes, ved kemisk denaturering ved nedbrydning eller vekselvirkning med et chaotropt mid-25 del eller en chaotrop i opløsning. Anvendelige chaotrope midler omfatter f.eks. guanidin, urinstof og forskellige detergenter, såsom natriumdodecylsulfat (SDS) og andre, herunder deoxycholat og visse galdesalte, 3-(3-cholamido-propyl)-dimethyl-ammonio-l-propansulfonat, organiske op-30 løsningsmidler, såsom methanol, propanol, acetonitril og visse salte, såsom kaliumthiocyanat. Ikke-ioniske detergenter, såsom "Triton X", "Tween", Nonidet NP-40" og octyl--glucosider kan også fungere som protein-denatureringsmidler. Tilsætning af reagenser (f.eks. mercaptoethanol 35 eller dithiothreitol), der reducerer disulfidbindinger, kan fremme denatureringsprocessen effektivt. Proteindena- 15

DK 165327 C

tureringen kan gennemføres på den mest effektive måde, uvis der anvendes kombinationer af kemiske og/eller kemiske og fysiske midler (f.eks. guanidin og varme, guanidin og SDS, eller guanidin og dithiothreitol). Særlig stærke chaotro-per, såsom guanidin, er mest foretrukne. Naturligvis undgås denatureringsbetingelser, der medfører, at proteinet aggregeres væsentligt, gøres uopløseligt eller udfældes, således at kun en ubetydelig mængde af den frilagte epi-top er tilgængelig for opløsningen til antistofbinding. En tilstrækkelig mængde af det denaturerede protein skal forblive i opløsning eller suspension for at der kan opnås en anvendelig immunbinding. Det nødvendige omfang af solubi-lisering vil afhænge af omstændighederne ved den tilsigtede eller ønskede binding.

En væsentlig mængde af Hb Alc i en bestemt testprøve kan denatureres til frilæggelse af peptidepitopen til antistofbinding ved at kombinere prøven med en vandig opløsning af det tilstedeværende chaotrope middel i en tilstrækkelig koncentration til at denaturere en væsentlig mængde af Hb Alc i den resulterende vandige blanding. Ved bestemmelsen tjener det chaotrope middel også til at lysere røde blodlegemer, frigøre Hb og inaktivere proteaser. Når der anvendes guanidin, vil koncentrationen i blandingen fortrinsvis være mere end ca. 1-molær, og en ca. 3-molær koncentration er særlig nyttig. Denatureringsprocessen fremskyndes væsentligt ved opvarmning af blandingen i et kort tidsrum. Det har vist sig, at denatureringen ved hjælp af det chaotrope middel kan tage fra en til flere timer ved temperaturer under 37"C, medens der kan opnås en tilstrækkelig denaturering på et minut eller mindre ved temperaturer over 50'C.

For at forhindre en væsentlig denaturering af antistoffet og andre protein-reagenser, som skal sættes til blandingen bagefter, bliver blandingen af prøve og chaotropt middel normalt fortyndet som et særskilt trin eller ved tilsætning af reagensopløsninger til et niveau, hvor det chaotrope middel i det væsentlige er uvirksomt til denaturering af 16

DK 165327 C

sådanne reagenser, men vil opretholde frilæggelsen af epi-topen ved, at forhindre en væsentlig renaturering af proteinet, der har interesse. Ved anvendelse af guanidin kræver dette fortrinsvis fortynding til en koncentration, der er under ca. 1,O-molær, idet en ca. 0,3-molær koncentration er særlig foretrukket.

Ikke-begrænsende eksempler på proteolytiske enzymer til anvendelse til nedbrydning ved den foreliggende opfindelse er trypsin, chymotrypsin, prolin-specifik endo-protease, pepsin og papain. Ved gennemførelsen af en immun-bestemmeIse sættes der, således som det er kendt, inhibitorer for de proteolytiske enzymer til prøveblandingen i tilstrækkelig mængde til at forhindre nedbrydning af proteinf ormige midler, der anvendes ved bestemmelsen.

Nærmere bestemt dannes der hybridomcellelinier, der kun producerer antistoffer mod den glycosylerede del af hæmoglobinmolekylet og ikke mod hele proteinet, og sådanne cellelinier og deres antistoffer screenes til identificering og isolering af de monoklonale antistoffer, som derefter vil reagere selektivt med den glycosylerede Hb Alc-epitop.

Til fremstilling af sådanne antistoffer kobles et fragment af proteinkæden svarende til den naturligt forekommende glycolsylerede peptidsekvens til en proteinbærer og injiceres i et laboratoriedyr til fremkaldelse af en immunreaktion. Lymfocyter, såsom miltceller, fra det immuniserede dyr fusioneres med myelomceller til dannelse af hybridomer, der dyrkes og screenes for produktion af monoklonale antistoffer. De monoklonale antistoffer screenes for sådanne, der er selektive for den glycosylerede pep-tidepitop, og den pågældende cellelinie klones til anvendelse ved produktion af yderligere mængder af det monoklonale antistof.

Til dannelse af antistoffer i laboratoriedyret, f.eks. BALB/c-mus, rotter eller lignende, skal et glyco-syleret hæmoglobinfragment enten produceres og isoleres 17

DK 165327 C

fra naturligt forekommende humant hæmoglobin eller syntetiseres kemisk og renses. Hæmoglobinfragmentet skal indeholde 1-deoxyfructoseresten og mindst 2 aminosyreenheder, fortrinsvis 3, 4,5 eller flere endnu, svarende til N-termi-nussen af (5-underenheden af hæmoglobin (valin-histidin) .

Det indeholder fordelagtigt ca. 5 til 15 og fortrinsvis ca. 7 til 10 enheder.

For at sikre, at det glycosylerede peptidfragment er optimalt antigent, kan det fordelagtigt kobles til et bæremateriale indeholdende et stort immunogent molekyle, såsom kvægserumalbumin, BSA, eller hæmocyanin fra nøglehuls--albueskæl (keyhole limpet), KLH. Fragmentet skal også bære det naturligt omlejrede addukt af glucose-valinreaktionen, der kan være til stede fra begyndelsen, som når der er tale om det isolerede, naturligt forekommende hæmoglobinfragment, eller - fortrinsvis - kan dannes på det syntetiske peptid under dets syntese eller før kobling af pep-tidet til den store proteinbærer. Bæreren kan tilsættes på enhver måde, der ikke ødelægger antigeniteten af fragmentet. Det glycosylerede fragment kan produceres ved kemisk eller enzymatisk nedbrydning af naturligt forekommende Hb, f.eks. Alc. Dette fragment kan kobles til en bærer ved anvendelse af klassiske koblingsprocedurer, f.eks. glutaraldehyd eller carbodiimid, og konjugatet anvendes som immunogen.

En foretrukken metode til kemisk syntetisering af en del af den kendte hæmoglobinsekvens involverer tilføjelse af en eller flere aminosyreenheder (som ikke findes i den normale sekvens) til optimering af dens antigenitet og koblingsegenskaber. I dette tilfælde bærer den færdige enhed en thiolgruppe (SH), ved hjælp af hvilken den kan kobles til liganden på konventionel måde, f.eks. ved reaktion med et bifunktionelt forbindelsesleddannende reagens, såsom m-maleimidobenzoyl-N-sulfosuccinimid-ester (MBS).

Ifølge en foretrukken udførelsesform tilføjes der tyrosin, tyrosin og cystein til lysin-enden af et synte- 18

DK 165327 C

O

tisk Hb-fragment, der bærer de otte enheder: NH2-valin-hi-stidin-leucin-threonin-prolin-glutaminsyre-glutaminsyre-ly-sin-COOH, hvilket giver et cysteintermineret peptid med 11 enheder.

5 Dette kan glycosyleres på konventionel måde ved en ikke-enzymatisk reaktion med glucose. Glycopeptidet kobles derefter til en stor bærer til dannelse af antigenet, som indgives til dannelse af antistofferne. Lymfocyter fra dyret, som producerer antistof mod den glycoserede peptid-10 epitop, fusioneres derefter på konventionel måde til dannelse af hybridomer, som klones, og de, der producerer mo-noklonale antistoffer med den ønskede specifikation, bliver desuden subklonet. Cellelinien/cellelinierne, hvis mo- noklonale antistoffer udviser den største selektivitet for 15 den glycosylerede epitop i modsætning til ikke-glycosyleret Hb, formeres derefter, og antistofferne høstes. En gennemgang af sådanne monoklonale antistofmetoder findes i Lympho-cyte Hybridomas, ed. Melchers et al., Springer-Verlag (New York 1978), Nature 266, 495 (1977), Science 208, 692 (1980), 20 og Methods of Enzymology 74 (Part B), 3-46 (1981).

Antistofferne kan derefter anvendes på konventionel måde til at reagere med blodprøver indeholdende ukendte mængder af glycosyleret Hb, og omfanget af reaktionen kan sammenlignes med kalibrerede standarder til bestemmelse af gra-25 den af glycosylering. Påvisningen kan ske ved fluorescens, ved immunobestemmeIse eller lignende, ved tilføjelse af passende påviselige grupper til de monoklonale antistoffer på kendt måde uden tab af deres evne til at bindes til den glycosylerede epitop i Hb Alc.

30 Alternativt kan der gennemføres en bestemmelse ba seret på en reagensprøvestrimmel, hvorved et carboxylgrup-pebærende materiale, såsom carboxymethylcellulose, påføres som et overtræk på en strimmel af træ eller plast. Strimlen dyppes derefter i den lyserede og denaturerede ukendte blodprøve, hvorved hæmoglobinet adsorberes, hvadenten det er glycosyleret eller ej. Strimlen dyppes derefter i en 35 19

DK 165327 C

opløsning af de monoklonale antistoffer, som er mærket på passende måde (f.eks. med enzym, fluorescens, cofaktorer etc.) på et sted, der ikke interfererer med bindingen til Hb Alc-epitopen. Mængden af bundet antistof bestemmes ved hjælp af mængden af mærkestof på strimlen og er en indikation af mængden af glycosyleret Hb i den ukendte prøve. Tilføjelsen af mærkestoffet og påvisningen af dette gennemføres på konventionel måde.

Forbindelsesled-gruppen R i den ovenfor anførte formel kan i det væsentlige være enhver hensigtsmæssig og stabil struktur. Forbindelsesled-gruppen R vil sædvanligvis have form af en aliphatisk kæde indeholdende mellem 1 og ca. 20 carbonatomer, med undtagelse af hydrogen, og indeholdende heteroatomer, såsom nitrogen, oxygen og svovl. Den glycosylerede rest kan bindes til forbindelseskæden R via forskellige grupper, herunder methylen, ether, thioether, imino og lignende. En fagmand vil have et bredt udvalg af forbindelsesled-grupper at vælge blandt ved fremstillingen af immunogenet. Normalt vil det glycosylerede peptid blive fremstillet således, at det ender i en funktionel gruppe, såsom amino, carboxyl, thiol, hy-droxyl eller maleimido, som er aktiv ved en koblingsreaktion til en passende gruppe i bæremolekylet.

Den foreliggende opfindelse illustreres ved de følgende eksempler.

Eksempel 1.

Fremstilling og karakterisering af antistoffer mod glyco-peptidepltopen 1 Hb Alc.

a) Et 11-aminosyrers peptid indeholdende de 8 N--terminale enheder af β-hæmoglobin plus to enheder af tyrosin plus en enhed af cystein syntetiseres ifølge B. Gutte og R.B. Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 91 (2), 501 (1969), hvorved der fås følgende peptid: N^-valin-histidin-leucin-threonin-prolin-gluta- minsyre-glutaminsyre-lysin-tyrosin-tyrosin-cystein-

-COOH

20 O

5 10 15 20 25 30

DK 165327 C

Til glycosylering af dette peptid omsættes 200 mg af dette rensede peptid med 0f25M glucose i 20 ml vandfri pyridin i 48 timer ved stuetemperatur i mørke. Blandingen tørres i vakuum. Den fremkomne sirup resuspenderes i 20 πιΜ kaliumphosphat med en ρΗ-værdi på 2,95 og renses ved høj-tryksvæskechromatografi (HPLC). De glycopeptidbærende fraktioner opløses i 0,1M triethylammoniumacetat med en pH-værdi på 8,5 og chroma-tograferes på "Affigel 601"-boronat-affinitetsharpiks (Biorad) , hvorved glycopeptidet adsorberes selektivt. Harpiksen vaskes med 0,1M triethylammoniumacetat med pH-værdi 8,5, og glycopeptidet elueres med 0,1M triethylammoniumacetat med pH-værdi 5,0. Eluatet frysetørres. Produktet resuspenderes i 1 ml vand og omsættes med et 500 ganges molært overskud af dithiothreitol (til gendannelse af cysteinets SH-gruppe), og det reducerede peptid renses igen ved HPLC og frysetørres. Dette gly-copeptid oplagres ved -20°C under N2 indtil videre anvendelse. b) Et KLH-MBS-konjugat som ovenfor beskrevet ifølge R. Lerner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 7j}, 3403 (1981), omsættes med produktet fra a) i et 2 ganges molært forhold mellem glycopeptid og maleimid på bæreren i 50 mM kaliumphosphat med pH-værdi 7,2 i 1 time ved stuetemperatur. c) Opløsningen fra b) blandes med et lige så stort volumen Freund's komplette adjuvans til dannelse af en vand--i olie-emulsion, og 200^,ug konjugat injiceres i BALB/cBy--mus. Musene boostes efter 30 og 60 dage, aflives, og deres milt anvendes til fusion ifølge Kohier og Milstein, Nature 256, 495 (1975), hvorved der dannes talrige hybridomer. Hybrid-ornerne screenes til identificering af sådanne, der producerer monoklonale antistoffer, som er specifikke for den glycosylerede peptidepitop. Screeningen for Alc~specifikke monoklonale antistoffer gennemføres under anvendelse af en ELISA-metode, hvorved antigenet adsorberes på polystyren-mikrotiterplader 35 21

DK 165327 C

(Linbro). Antigenerne er renset humant Alc og ikke-gly-cosyleret Ao-hæmoglobin. A^c'et renses fra et hæmo-lysat af røde blodlegemer ved anvendelse af to forskellige chromatografiske procedurer. Den første rensning består af binding af glycosyleret hæmoglobin til en boronat--affinitetsharpiks som beskrevet af Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA, produkt nr. 42.000. Typisk anbringes 1-5 g hæmoglobin på 100 ml boronatharpiks, og den bundne fraktion (glycohæmoglobinfraktion) elueres som beskrevet af Pierce Chemical Co., GlycoTest bulletin, produkt nr. 42.000. Den eluerede glycohæmoglobinfraktion ækvili-breres i en puffer med lav ionstyrke og chromatograferes på en ionbytterharpiks som beskrevet af M. MacDonald et al., J. Biol. Chem. 253, 2327-2332 (1978). Alc-"toppen" analyseres ved isoelektrisk fokusering og ved kulhydratanalyse under anvendelse af thiobarbitursyre-bestemmelsen, og resultaterne bekræfter, at denne rensning giver ultra-rent A^c-hæmoglobin, idet det rensede materiale både indeholder kulhydrat og adskiller sig fra normalt Ao-hæmoglobin med hensyn til isolelektrisk punkt. På lignende måde renses Ao-hæmoglobin ved hjælp af den egenskab, at det ikke bindes til boronat-affinitetsharpiksen og chromatograferes som Ao-"toppen" ved den ionbytningschromatografiske rensning. De rene A^c- og Ao-hæmoglobiner adsorberes på separate mikrotiterplader (2^,ug pr. 100^-uliter PBS pr. hul) natten over ved 4°C. Pladerne blokeres i 1% BSA i PBS i 60 minutter ved stuetemperatur og vaskes derefter 4 gange i PBS.

Den ovenstående væske fra hver hybridomcellelinie sættes til A^c~ og Ao-pladen og inkuberes ved stuetemperatur i 60 minutter. Pladerne vaskes 4 gange i PBS, og et sekundært antistof (kanin-anti-muse-IgG-peroxidase, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA, i en 1:5000-fortyn-ding i 1% BSA i PBS) påføres og underkastes inkubering i 60 minutter ved stuetemperatur. Pladen vaskes 4 gange i PBS, og der tilsættes 200^uliter af en substratopløsning (24,3 mM citronsyre, 51,4 M natriumphosphat, pH-værdi 5,3, 22

DK 165327 C

O

indeholdende 2,2 mM o-phenylendiamin og 5,2 mM hydrogen-peroxid). Reaktionen afsluttes efter 20 minutter ved tilsætning af 50^uliter 8M svovlsyre, og produktet af peroxi-dasereaktionen aflæses ved 492 mM.

5 Blandt 200 udgangshybridomer, der producerer anti stoffer mod hæmoglobin, identificeres ni (9) som værende specifikke for Alc-epitopen, medens 191 reagerer med både A^c og ikke-glycosyleret hæmoglobin. Da præimmuniseret museserum ikke har nogen påviselig antistofreaktion mod hu-10 mant Ao- eller Alc-hæmoglobin ved ELISA-proceduren, er den væsentligste immunreaktion mod sekvensen af 8 peptider, som er fælles for Alc og Ao. Da det syntetiske pep-tidimmunogen består af 8 aroinosyrerester i hæmoglobinsekvensen, er den væsentligste muse-immunreaktion rettet mod pep-15 tidet og ikke kulhydratet (191 af de 200 hybridomer reagerer både med Ao og Α^β). Som forventet har det immuniserede museserum også bredt krydsreagerende antistoffer, der kan reagere med både Ao og A^c, hvilket tyder på, at der ikke fås nogen specificitet for Alc, medmindre hybridomerne 20 screenes for reaktivitet mod A^c og ikke Ao-hæmoglobin. De foretrukne hybridomer, der producerer antistoffer mod A^c~ -hæmoglobin og ikke mod Ao-hæmoglobin, er deponeret hos ATCC med deponeringsbetegnelserne ATCC HB 8639 og ATCC HB 8869 henholdsvis den 11. oktober 1984 og den 10. juli 1985. 25 d) Identifikation af peptiderne, der konkurrerer med A^c om binding til antistof: Følgende peptider dannes ved enzymnedbrydning af det oprindelige glycosylerede peptid med 11 aminosyrer: 30 Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Cys (glycopeptid 1)

Alle peptidfragmenter renses ved HPLC og kvantificeres ved aminosyresekvens. Tryptisk nedbrydning af det oprlnde-35 lige peptid giver: 23

23DK 165327 C

Glyco-Val-His-Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-j-.ys (glycopeptid 2)

En prolln-specifik endoprotease giver

Glyco-Va1-H is-Leu-Thr-Pro {glycopeptid 3)

Peptidet Glyco-Val-His-FAD (glycopeptid 4), hvori dipep-tidet er koblet til N®-aminocyclohexyl-FAD og derefter gly-cosyleret, fremstilles ved metoden ifølge US patentskrift nr. 4.255.566 og fås fra Dr. Kin Yip og Dr. R. Buckler,

Ames Division, Miles Laboratories, Inc., Elkhart, Indiana, USA.

Ved en typisk kompetitiv bestemmelse inkuberes hvert peptid i en mængde på 8 nanomol til 8 picomol i lOO^uliter PBS, 7,2 mM Na2HP04, 288 mM NaH2P04, 127 mM NaCl, pH-værdi 7,4, med lOO^uliter ovenstående væske fra monoklonal celledyrkning i 60 minutter ved stuetemperatur. Denne blanding sættes til en polystyren-mikrotiter-plade overtrukket med l^ug Alc-hæmoglobin pr. hul. Hvis peptidet konkurrerer med antistoffet, er antistoffet ikke frit til at blive bundet til det immobil i serede A^c* ^a” den vaskes 4 gange med PBS. Et andet antistof (kanin-anti--muse-IgG koblet med peberrods-peroxidase) tilsættes i 30 minutter, og pladen vaskes med PBS. Substratet (o-phe-nylendiamin, 2,2 mM) og hydrogenperoxid (0,012%) tilsættes, og den fremkomne farve måles ved 492 nm. Kvantificeringen af produktet afspejler graden af konkurrence, idet f.eks. intet produkt indicerer, at det konkurrerende peptid totalt blokerer bindingen af antistoffet til det im-mobiliserede Alc· Resultaterne viser, at alle de fire o-venfor beskrevne glycopeptider inklusive Glyco-Val-His-FAD er effektive konkurrenter. Bindingen af et af antistofferne, Ab-4, til A^c blokeres totalt af glycopeptiderne 1 til 4. Et andet antistof, Ab-3, blokeres af glycopeptid 1 24

DK 165327 C

til 3, men ikke af glycopeptid 4.

Fig. 1 viser, at Ab-3 blokeres totalt af glycopeptid 1, fig. 2 viser, at Ab-3 blokeres totalt af glycopeptid 3, og fig. 3 viser, at Ab-4 blokeres totalt af glycopeptid 4, men at Ab-3 ikke blokeres.

Peptider, som mangler kulhydratet, udviser ingen kom-petitiv inhibering, hvilket tyder på, at kulhydratet er en afgørende komponent af epitopen og tilvejebringer specificiteten af antistoffernes genkendelse af A^c-hæmoglobin (se fig. 1).

Eksempel 2.

Kompetltiv lmmunobestemmelse af Hb Alc.

Denne kompetitive lmmunobestemmelse er baseret på anvendelsen af en fast mængde hapten-mærkestof (som beskrevet i eksempel 5), der konkurrerer med A^c i lyseret helblod om binding til det immobiliserede antistof. Da antistoffet genkender både A^c og hapten, bestemmer mængden af A^c i prøven mængden af hapten-mærkestof, der bindes til antistoffet. Da antistoffet er immobiliseret, kan alle ikke--bundne reaktanter fjernes ved et simpelt vaskningstrin.

Det bundne mærkestof kan derefter måles og sammenlignes med en standard til mængdebestemmelse af Alc i de oprindelige blodprøver.

Bestemmelsen gennemføres med anvendelse af helblod som prøve og kan opdeles i de nedenfor anførte trins (1) Lyse af celler - denaturering af hæmoglobin.

Da bestemmelsen til slut kræver mindre end 0,3^,uli-ter helblod, fortyndes et nøjagtigt pipetterbart volumen blod (5-50^uliter fra et fingerstik eller fra helblod) i en denaturerende opløsning (3M guanldin-HCl, 10 mM tris-HCl, pH-værdi 7,5) og opvarmes til 56°C i 2-15 minutter. Lavere temperaturer fungerer også, men kræver yderligere tid til komplet denaturering af prøven. Denatureringen a) inaktiverer koaguleringsmekanismerne, hvis prøverne ikke er præpareret med antikoagulationsmidler, 25

DK 165327 C

b) lyserer de røde blodlegemer, c) denaturerer proteaser, enzymer etc. og frilægger A^c-epitopen på haanoglobin optimalt, d) synes at sterilisere prøven eller inhibere væksten af mikroorganismer i den denaturerede blodprøve, selv hvis prøven ikke er præpareret aseptisk (f.eks. blod fra et fingerstik), og e) fører til en stabil klinisk prøve, der kan opbevares i flere dage ved stuetemperatur, uden at det påvirker den sluttelige bestemmelse.

(2) Fortynding og "konkurrence".

En portion af det denaturerede helblod pipetteres i det 1O-dobbelte volumen puffer indeholdende hapten-mærke-stof. Dette fortynder effektivt hæmoglobinet til den rette koncentration til bestemmelsen og fortynder denatureringsmidlet til en lav koncentration, således at antistof- eller enzymaktiviteten ikke forstyrres. De antistofovertruk-ne perler tilsættes derefter i et bestemt tidsrum, hvorunder antistoffet enten binder A^-hæmoglobin eller hapten--HRP.

(3) Vasknlng og aflæsning.

Efter den kompetitive inkubering vasker perlerne, og mærkestoffet måles efter tilsætning af et passende substrat. Signalet sammenlignes med en standard, og mængden af Alc' soxn er ste<^e * den oprindelige prøve af helblod, bestemmes..

Detaljerne ved bestemmelserne er sammenfattet i det følgende:

Perle-overtrækningsprocedure:

Polystyrenperler (diameter 6,4 mm, spejlblank o-verflade) fås fra Precision Ball Company, Chicago, Illinois, USA. Der udvælges sådanne perler fra partierne, der giver den laveste variation ved flere immunobestemmelser af den samme prøve. Før overtrækningen vaskes perlerne med absolut methanol og derefter med vand. Methanolvask-ningen synes at sænke variationskorrelationen for flerdob-belte bestemmelser af den samme prøve. En antistofopløsning (5^ug antistof/lOO^ulter i 0,2m natriumborat, pH-værdi 8,5, 26

DK 165327 C

0,02% natrlumazid) sættes til de fugtige perxer, og perlerne roteres natten over ved 4°C. Derefter vaskes perlerne og blokeres med 1% BSA i PBS indeholdende 0,02% natrium-azid.

Typisk overtrækkes 500-1000 perler på én gang og anvendes i et tidsrum på flere uger uden tegn på tab af antistofaktivitet. Overtrækningsforsøg med radioaktivt antistof viser, at der bindes 0,5^ug antistof pr. perle.

Perlerne anvendes kun ved denne immunobestemmelse på grund af deres evne til at binde relativt høje mængder protein. Den hydrofobe absorption af protein på polystyren er bekvem, men kan bestemt erstattes ved enhver af flere procedurer, hvor proteiner bindes covalent til polystyren, funk-tionaliserede harpikser eller siliciumdioxid. Polystyrenet kan også have form af et rør eller en kuvette.

Arbejdsplanen kan sammenfattes som følger: a) 50^,uliter helblod fortyndes i 1,0 ml denaturerende opløsning (3M guanidin-HCl, 10 mM tris, pH-værdi 7,5), der opvarmes til 56°C i 15 minutter, og igen fortyndes 100 yuliter i 1,0 ml denatureringsmiddel.

b) 50^uliter af den ovenfor anførte opløsning sættes til 0,5 ml phosphatpufret saltopløsning (PBS) med en pH-værdi på 7,5 indeholdende hapten-HRP. Inkubationerne, vaskningerne og de enzymatiske reaktioner gennemføres bekvemt i 48-huls polystyren-vævskulturplader.

c) Der tilsættes antlstofovertrukne perler og inkuberes i 30 minutter ved omgivelsestemperatur under vug-ning.

d) Perlerne vaskes med puffer (PBS) (sædvanligvis 3-1 ml's portioner).

e) Der tilsættes o-phenylendiamin-substrat og hy-drogenperoxid.

f) Reaktionen standses, og produktet aflæses efter 20 minutter.

Den ovenfor beskrevne bestemmelse anvendes til tilvejebringelse af de nedenfor beskrevne kliniske data. Stand- 27

DK 165327 C

ardkurven er vist i fig. 4. Anvendelsen af glycopeptid 1 som kompetitor er vist i fig. 5. Vurderingen af normale og diabetiske donorer er vist i fig. 6. Boronat-affinitetsbe-stenunelsen gennemføres nøjagtigt som beskrevet af Pierce Chemical Co. (GlycoTest, produkt nr. 42.000).

Eksempel 3.

optimal frilæggelse af Alc-epitopen.

Optimal reaktivitet af den humane Alc~epitop ses efter behandling af det naturlige hæmoglobin (i helblod eller hæmolysat) ved procedurer eller med reagenser# der gør epitopen tilgængelig for antistoffets kombinerende sted. Den optimale tilgængelighed af epitopen kan opnås ved en fysisk denaturering (varme, ultralydsbehandling etc.), ved en kemisk procedure, der involverer klassiske denatureringsmidler (urinstof, guanidin, SDS, protease), eller ved en kombination af fysiske og kemiske procedurer. Mest effektiv er en procedure, ved hvilken helblod (50^uliter) sættes til 1 ml opløsning af 3M guanidin-HCl, 10 mM tris--HC1, pH-værdi 7,4, og opvarmes til 56°C i mere end 1 minut. Den dannede prøve fungerer optimalt ved efterfølgende immunobestemmelser af A^c~epitopen. Opløsningen kan fortyndes 10 gange i puffer, hvilket fortynder guanidinet effektivt til en koncentration på 0,3M, der har ringe eller ingen effekt på normale antistof-antigen-aktiviteter, hvorved der fås et egnet medium til efterfølgende immunobestemmelser.

Der anvendes den kompetitive immunobestemmeIse i-følge eksempel 2. Kompetitoren er det Alc, som er til stede i helblod fra en diabetiker. Helblodsprøven placeres i 3,OM guanidin ved 20, 37 eller 56°C i tidsrum på 0-320 minutter. Resultaterne (fig. 7) viser, at epitopen gøres tilgængelig med tiden ved 20 eller 37°C og således effektivt konkurrerer med hapten-HRP-konjugatet. Ved 56°C er epitopen maksimalt tilgængelig efter 5 minutter, hvilket er det tidligste tidspunkt, som er konstateret ved denne bestemmelse.

DK 165327 C

Resultaterne viser, at i den naturlige hæmoglobin Alc-te-tramer er epitopen skjult og utilgængelig og konkurrerer ikke med konjugatet af lineært syntetisk glycopeptid og HRP. Hvis hæmoglobinet imidlertid denatureres, bliver den frilagte epitop en effektiv kompetitor for konjugatet af lineært glycopeptid og enzym.

Eksempel 4.

Sammenligning af specificiteten af polyklonale antistoffer fra får og monoklonale antistoffer fra mus.

Et får immuniseres intramuskulært på 5 steder med glycopeptid-KLH-konjugat (4 mg) ifølge eksempel 1 b) i Freund's komplette adjuvans. På lignende måde foretages der boost-injektioner efter 30 og 60 dage. Boostningen efter 60 dage sker i Freund's ukomplette adjuvans. Præim-mun-serum og immun-serum undersøges for A^c~ og Ao-speci-ficitet ved en ELISA-bestemmelse som beskrevet i eksempel 1 c). Resultaterne (se fig. 7) viser, at det syntetiske glycopeptid stimulerer en immunreaktion mod humant hæmoglobin, men at immunoglobulinerne ikke er specifikke for Alc-hæmoglobin. I modsætning hertil er muse-monoklonale antistoffer for Alc ganske specifikke for A^c, når de undersøges ved den samme bestemmelse (ELISA-bestemmelsen ifølge eksempel 1 c), se fig. 8). Forsøg på immunoaffinitets-rensning af antistof, som er specifikt for Alc, fra fåre--antiserum falder ikke heldigt ud.

Eksempel 5.

Fremstilling af hapten-mærkestof-konjugater.

Der fremstilles et konjugat af glycopeptid 1 (HRP). Hapten-HRP-konjugatet fremstilles ved at omsætte 15 mg pe-berrodsperoxidase (HRP) med et 10 ganges molært overskud af MBS (se eksempel lb)) i 50 mM natriumphosphat, 1 mM EDTA, pH-værdi 7,0. MBS-HRP-konjugatet renses ved gelfiltrering (under anvendelse af den ovenfor anførte puffer) , og der tilsættes 0,34 mg af glycopeptid-haptenet 35 29

DK 165327 C

O

(peptid 1). Det færdige hapten-HRP-konjugat renses ved gelfiltrering på HPLC og anvendes i en fortynding på 1:1000 -1:100.000 ved den kompetitive immunobestemmeIse ifølge eksempel 3.

5

Eksempel 6.

Strlmmel-immunobestemroelse af Hb Alc.

a) 1 mg af det monoklonale antistof ifølge eksempel 1 c) i 0,1M natriumboratpuffer, pH-værdi 8,5, kan blan- 10 des med et 200 ganges molært overskud af fluorescein-iso-thiocyanat (FITC) og omsættes i 30 minutter ved stuetemperatur. Det fluorescein-mærkede monoklonale antistof kan renses ved gelfiltrering.

b) En strimmel (polystyren, cellulose etc.), som 15 bærer COOH-grupper, dyppes i 0,5 ml af et ukendt denatureret hæmolysat, pH-værdi 7,5. Strimlen skylles med puffer med pH-værdi 7,5 og nedsænkes i det fluorescerende monoklonale antistof fra a) i pufret opløsning i 5 minutter ved stuetemperatur. Strimlen skylles igen, og graden 20 af fluorescens på strimlen angiver andelen af Alc-Hb i den ukendte prøve.

Eksempel 7.

Kobling af monoklonalt antistof til reagensstrimmel og an-25 vendelse til en lmmunobestemmelse.

Whatman nr. 1-filtrerpapir (7 cm) anbringes i 20 ml iskoldt destilleret vand, og opløsningens pH-værdi indstilles til mellem 10,5 og 11,5 med 5M natriumhydroxidopløsning. Opløsningen overvåges kontinuerligt under hele akti-30 veringen, og pH-værdien holdes mellem 10,5 og 11,5 ved dråbevis tilsætning af 5M natriumhdroxidopløsning. En lille omrørerstang anbringes i bunden af bægerglasset indeholdende filtrerpapiret. Bægerglasset anbringes derefter i en isfyldt petriskål, som placeres på en magnetomrører.

1 g fast BrCN sættes til bægerglasset, og der inkuberes i 20 minutter under omrøring (på is). Filtrerpapiret fjernes 35 30

DK 165327 C

o fra opløsningen og vaskesmed 10 ml iskoldt destilleret vand. Det vaskes derefter med iskold 0,2M Na2HP04-citron-syre-puffer, pH-værdi 6,8. Der tilsættes antistof (1 mg/-ml i 0,2M Na2HP04-citronsyre-puffer, pH-værdi 6,8), og kob-5 lingen af antistoffet får lov at forløbe i 1 time. Der tilsættes ethanolamin (10 ml af en 1 mM opløsning) til blokering af ikke-reagerede steder (15 minutter), og papiret vaskes med phosphatpufret saltopløsning (PBS, 10 mM Na2HP04, 140 mM NaCl, pH-værdi 7,5) til fjernelse af uomsatte kom-10 ponenter.

Denne reagenstrimmel dyppes i en standardiseret mængde af ukendt denatureret hæmolysat indeholdende en mærket kompetitor for antistofbindingen til Alc-hæmoglo-bin. En hensigtsmæssig kompetitor er glycopeptidet (gly-15 copeptid 1) covalent koblet til peberrodsperoxidase (hap-ten-HRP). Strimlen fjernes og skylles med PBS. Mængden af hæmoglobin bundet til strimlen måles (mængden er omvendt proportional med Alc i prøven, og Alc-hæmoglobinet kan kvantificeres ved sammenligning med standardprøver.

20

Eksempel 8.

Enzymbundet immunosorbens-bestemmelse af Alc.

Et fast volumen denatureret blodhæmolysat (lOO^uli-ter) sættes til polystyren-mikrotiterplader og får lov at 25 bindes ved stuetemperatur i 60 minutter. Pladen vaskes 4 gange med PBS indeholdende 0,05% "Tween-20" (PBST). Det monoklonale antistof (koblet til peberrodsperoxidase) tilsættes (100yuliter, l^ug/ml) i PBST og omsættes i 30 minutter ved stuetemperatur. Overskuddet af antistof fjer-30 nes ved 4 vaskninger med PBST. Substratet (o-phenylendia-min, 2,2 mM) og hydrogenperoxid (0,012%) i PBS tilsættes, og reaktionsproduktet måles ved 492 nm. Farveintensiteten afspejler den tilstedeværende mængde Alc i hæmolysatet, når den sammenlignes med standardværdier.

35 31

DK 165327 C

O

Eksempel 9.

Radioimmunobestemmelse af Alc.

lOO^uliter denatureret blodhæmolysat (220 nano-mol hæmoglobin) blandes med 7 nanomol ioderet Glyco-Val-His-5 -Leu-Thr-Pro-Glu-Glu-Lys-Tyr-Tyr-Cys (500.000 cpm/7 nanomol) . Et monoklonalt antistof tilsættes i tilstrækkelig mængde til at binde 50% af det glycosylerede peptid, hvis blodhærolysatet indeholder det normale (ca. 3%) Åle-hæmoglobin. Højere haaro-blobin-Alc-værdier konkurrerer med peptidet og nedsætter 10 derved det totale antal tællinger, som bindes af antistoffet. Antistoffet kan genvindes ved immuno-udfældning med et andet antistof (kanin-anti-muse-IgG) eller ved adsorption på protein-A-overtrukne partikler. Det ioderede peptid bundet til antistoffet kan kvantificeres i en gammaisotoptæl-15 ler og afspejler mængden af tilstedeværende Alc i blod-hæmolysatet, når der sammenlignes med standarder.

20 25 30 35

Claims (8)

1. Monoklonalt antistof eller fragment deraf omfattende et antistofkombineringssted, kendetegnet ved, at det bindes specifikt til den glycosylerede N-terminale peptidsekvens i beta-underenheden af humant hæmoglobin efter tilstrækkelig frilæggelse af sekvensen ved fysisk eller kemisk denaturering eller nedbrydning til, at der tilvejebringes sterisk adgang dertil.

2. Monoklonalt antistof eller fragment deraf ifølge krav l, kendetegnet ved, at det bindes specifikt til en glycosyleret peptidrest med formlen: Glyco-(NH)Val-His-AA- hvori Glyco-(NH)Val betyder en ikke-enzymatisk glycosyleret valinrest, og AA betyder en binding eller en eller flere yderligere aminosyrerester.

3. Monoklonalt antistof eller fragment deraf ifølge krav 2, kendetegnet ved, at AA betyder en sekvens med fra 1 til 12 aminosyrer svarende til N-terminussen af beta-underenheden af humant hæmoglobin.

4. Monoklonalt antistof eller fragment deraf ifølge ethvert af kravene 1-3, kendetegnet ved, at det er frembragt mod et immunogen omfattende et glycosyleret peptid, som er kemisk bundet til et immunogent bæremateriale, hvor det glycosylerede peptid har mindst 2 aminosyreenheder svarende til N-terminussen af beta-underenheden af hæmoglobin, eller en denatureret eller nedbrudt form af proteinet.

5. Monoklonalt antistof eller fragment ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at den glycosylerede peptidsekvens er frilagt for antistoffet ved kemisk denaturering ved kontakt med et chaotropt middel, fortrinsvis guanidin, urinstof, thiocyanat eller et detergent.

6. Monoklonalt antistof eller fragment ifølge ethvert af kravene 1-4, kendetegnet ved, at det bindes specifikt til den glycosylerede N-terminale peptidsekvens DK 165327 C i Ø-underenheden af humant hæmoglobin, der er adsorberet til en fast overflade, fortrinsvis fremstillet af polystyren eller cellulose.

7. Monoklonalt antistof ifølge krav 1, kende-5 tegnet ved, at det er produceret af hybridomaerne ATCC HB 8639 eller ATCC HB 8869.

8. Hybridoma til brug ved en fremgangsmåde til fremstilling af et monoklonalt antistof ifølge krav 7.