DE60123063T2

DE60123063T2 - Peptid-fruktose und ein komplex davon mit bindendem protein

Info

Publication number: DE60123063T2
Application number: DE60123063T
Authority: DE
Inventors: Nobuyuki Kyotanabe-shi SHIGETOU; Hiroshi Hirakata-shi Nakayama; Keiko Nara-shi Yugawa; Fumihisa Kadoma-shi Kitawaki
Original assignee: Matsushita Electric Industrial Co Ltd
Current assignee: Panasonic Corp
Priority date: 2000-07-14
Filing date: 2001-07-13
Publication date: 2007-03-01
Anticipated expiration: 2021-07-14
Also published as: EP1302477A4; JP3801133B2; US20030175996A1; US7109309B2; WO2002006310A1; EP1302477A1; EP1302477B1; DE60123063D1

Description

Technisches Gebiet
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine Peptidfruktoseverbindung, welche als ein Immunogen für die Produktion von Antikörpern für Hämoglobin A1c (hiernach abgekürzt als HbA1c) verwendet werden kann. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Proteinkonjugat der Verbindung und auf ein Protein und ein Antiserum und einen Antikörper, der unter Verwendung des Peptidfruktose-Proteinkonjugates erhalten wird.
Hintergrund der Technik
Üblicherweise wurde als ein für die Produktion von Anti-HbA1c-Antikörpern erforderliches Immunogen HbA1c selbst allgemein verwendet. HbA1c hat eine Struktur, die ähnlich ist wie jene von Hämoglobin A0 (hiernach abgekürzt als HbA0), welche 90 % der Gesamthämoglobinmenge ausmacht. Während HbA0 keine Zuckerkette an dem Endterminus seiner β-Kette hat, hat HbA1c eine Fruktosebindung an dem Endterminus seiner β-Kette. Dies ist der einzige Unterschied zwischen HbA0 und HbA1c. Deshalb können die meisten Antikörper, welche unter Verwendung von HbA1c selbst als ein Immunogen erzeugt werden, auch HbA0 erkennen. Unter den Antikörpern für Hämoglobin gibt es nur eine kleine Anzahl an Antikörpern, die in der Lage ist, nur HbA1c zu erkennen. Üblicherweise wurde solch eine Antikörpergruppe für jene durchsucht, die an HbA1c binden.
Solch eine Screeningarbeit ist arbeitsintensiv und kostenaufwändig. Deshalb kann man sich vorstellen, ein Epitop zu verwenden, das in der Lage ist, nur HbA1c zu erkennen. In den meisten Fällen hat jedoch ein Epitop alleine nicht ausreichend Antigenität oder Immunogenität bei der Produktion eines Antiserums oder von Antikörpern. Deshalb wird ein Tier mit einem Epitop in Verbindung mit einem Adjuvanz oder einem Träger immunisiert. Immunisierung eines Tieres mit einem Träger und einem Epitop ist jedoch üblicherweise arbeitsintensiv und nicht notwendigerweise effizient, um ein gewünschtes Antiserum oder Antikörper zu erhalten, und ist ebenfalls kostspielig. Die Gewinnung eines gewünschten Antikörpers hängt ferner von Wahrscheinlichkeitsfaktoren ab und von dem oben beschriebenen Verfahren kann nicht gesagt werden, dass es zuverlässig ist. Es wurde kein monoklonaler Antikörper ohne Kreuzreaktivität für HbA0 erhalten und gewöhnlich gab es kein etabliertes Verfahren, mit welchem solch ein monoklonaler Antikörper zuverlässig und einfach produziert werden kann.
Um die oben beschriebenen Probleme zu lösen, ist ein Ziel der vorliegenden Erfindung, eine Peptidfruktoseverbindung und ein Proteinkonjugat bereitzustellen, die Immunogene sind, welche in der Lage sind, Anti-HbA1c-Antikörper zu produzieren, vorzugsweise nur Anti-HbA1c-Antikörper, wobei die Wahrscheinlichkeitsfaktoren eliminiert sind und die Antikörper keine Kreuzreaktivität für HbA0 haben. Ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Antiserum oder Antikörper bereitzustellen, die unter Verwendung solch einer Peptidfruktoseverbindung oder eines Proteinkonjugates erzeugt worden sind. Immer noch ein anderes Ziel der vorliegenden Erfindung ist, ein Verfahren zum Produzieren einer antikörperproduzierenden Zelle bereitzustellen, die in der Lage ist, einen Antikörper, der für HbA1c spezifisch ist und keine Kreuzreaktivität für HbA0 hat, zu liefern und die in der Lage ist, solch einen Antikörper für die zukünftige Verwendung stabil zu liefern, wobei die Wahrscheinlichkeitsfaktoren entfernt worden sind.
WO-A-96/39518 offenbart Polypeptide in der Form von monoklonalen Antikörpern, welche an Schwermetalle wie Blei binden und sie neutralisieren können und offenbart die Verwendung von CGG als ein mögliches Trägerprotein.
EP-A-0 547 029 und EP-A-0 185 870 offenbaren die Produktion von Anti-HbA1c-Antikörpern, hergestellt unter Verwendung von an Fruktose-Peptide konjugierten Trägerproteinen, aber offenbaren nicht CGG als Trägerprotein.
JP-A-4 089 487 offenbart ein Cannabinolderivat und sein Konjugat mit einem Trägerprotein und offenbart die Verwendung von BSA, KLH und CGG als mögliche Trägerproteine.
EP-A-0 201 187 offenbart monoklonale Antikörper, die für die glykosylierte Region von Hämoglobin spezifisch sind, aber diese Antikörper werden nicht durch die Verwendung von immunogenen Konjugaten zubereitet, statt dessen wird das gesamte HbA1c-Protein verwendet.
WO-A-91/02978 ist auf die Entwicklung von Immuntests für glykosylierte Proteine im Allgemeinen gerichtet, einschließlich HbA1c, offenbart aber nicht CGG als ein Trägerprotein.
Offenbarung der Erfindung
Um die oben beschriebenen Ziele zu erreichen, stellt die vorliegende Erfindung das Folgende bereit.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Proteinkonjugat bereit, worin eine Peptidfruktoseverbindung mit einem Protein gekoppelt ist und die Peptidfruktoseverbindung durch die Formel I unten repräsentiert wird:
worin R1 jedes Molekül mit einer -SH-Gruppe darstellt, R1 an den Carboxyterminus von R2 bei (b) mit einer kovalenten Bindung gebunden ist, R2 eine oder mehrere Aminosäuren enthält, die aus der Aminosäuresequenz von HbA1 oder jenem Aminosäureanalogon, das zu den Aminosäuren funktionell äquivalent ist, abgeleitet worden sind, und R2 mit der Fruktose an seinem Aminoterminus verknüpft ist, und das Protein CGG ist.
Hier kann das Molekül mit einem -SH jedes in der Technik bekannte Molekül sein. Beispiele solcher Moleküle schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Cystein und Homocystein. Die Verknüpfung (b) wird gewöhnlich durch eine kovalente Verbindung erzeugt und kann durch jeden anderen Bindungstyp (z. B. eine Wasserstoffbindung) als eine kovalente Bindung erzeugt werden, solange die Bindung eine Fähigkeit hat, einen Antikörper oder ein Antiserum zu induzieren. Die kovalente Bindung kann jeder Typ an kovalenter Bindung sein und ist vorzugsweise eine Peptidbindung (Amidbindung). Weiterhin kann anstelle der oben beschriebenen Fruktose jedes Molekül (z. B. andere Zucker), die dazu funktionell äquivalent sind, verwendet werden.
In einer anderen Ausführung kann das R2 wenigstens ein Peptid enthalten, das durch die Formel II unten repräsentiert wird:
In einer Ausführung kann das R2 wenigstens ein Peptid enthalten, repräsentiert durch Formel III unten:
In einer anderen Ausführung kann das R1 wenigstens einen Cysteinrest enthalten. In einer anderen Ausführung kann das R1 ein Peptid oder ein Peptidanalogon umfassen. In einer anderen Ausführung kann das R1 ein Peptid umfassen. In einer anderen Ausführung kann R1 ein Cysteinrest sein.
In einer anderen Ausführung ist die kovalente Bindung bei (b) eine Peptidbindung.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Antiserum bereit, das in dem Blut eines Tiers durch Injizieren eines Proteinkonjugates der vorliegenden Erfindung erzeugt wird.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen Antikörper bereit, der aus einem Antiserum der vorliegenden Erfindung isoliert worden ist.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine monoklonale Antikörper produzierende Zelle bereit, worin die den monoklonalen Antikörper produzierende Zelle durch Verschmelzen einer Milzzelle einer Maus, die mit einem Proteinkonjugat der vorliegenden Erfindung sensitiviert worden ist, mit einer von Myelom abgeleiteten Zelle und Klonieren einer fusionierten Zelle erhalten wird, und die monoklonale Antikörper produzierende Zelle produziert einen monoklonalen Antikörper, der in der Lage ist, an humanes Hämoglobin A1c spezifisch zu binden. In einer Ausführung stellt die vorliegende Erfindung eine monoklonale Antikörper produzierende Zelle bereit, die als Hinterlegungsnummer FERM BP-7637 oder FERM BP-7636 bezeichnet wird.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Herstellen einer monoklonalen Antikörper produzierenden Zelle bereit, die in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper zu produzieren, der in der Lage ist, spezifisch an humanes Hämoglobin A1c zu binden. Das Verfahren umfasst die folgenden Schritte:

a) Sensitivieren einer Maus mit einem Proteinkonjugat der vorliegenden Erfindung; und
b) Isolieren einer Milzzelle aus der sensitivierten Maus und Verschmelzen der Milzzelle mit einer von Myelom stammenden Zelle.

In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung einen monoklonalen Antikörper bereit, der durch eine monoklonale Antikörper produzierende Zelle der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, welcher spezifisch an humanes Hämoglobin A1c bindet.
In einer Ausführung kann seine Bindungskonstante an humanes Hämoglobin A1c 10⁴ oder mehr sein. Vorzugsweise kann die Bindungskonstante 10⁵ oder mehr, 10⁶ oder mehr, 10⁷ oder mehr, 10⁸ oder mehr, 10⁹ oder mehr oder 10¹⁰ oder mehr sein.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt ein Immunisierungsschema, das in einer Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet worden ist.
2 ist ein Diagramm, das die Wirksamkeitsbewertung eines Antiserums für eine Ausführung (F-CGG) der vorliegenden Erfindung zeigt.
3 ist ein Diagramm, das die Wirksamkeitsbewertung eines Antiserums (F-KLH), das nicht Teil der vorliegenden Erfindung bildet, zeigt.
4 ist ein Diagramm, das den Antikörpertiter eines Antiserums 77 Tage nach Immunisierung gemäß einer Ausführung der vorliegenden Erfindung zeigt.
5 ist ein Diagramm, das den Antikörpertiter eines monoklonalen Antikörpers (4F) gemäß einer Ausführung der vorliegenden Erfindung zeigt.
6 ist ein Diagramm, das den Antikörpertiter eines monoklonalen Antikörpers (8E) gemäß einer Ausführung der vorliegenden Erfindung zeigt.
Beste Weise zum Durchführen der Erfindung
Hiernach werden gewisse hierin verwendete Begriffe beschrieben werden. Es sollte festgestellt werden, dass solange nicht anderweitig definiert, sämtliche technischen und wissenschaftlichen Begriffe, die hierin verwendet werden, dieselbe Bedeutung haben, wie sie gewöhnlich von einem Durchschnittsfachmann in der Technik, zu welcher diese Erfindung gehört, verstanden werden.
Der Begriff „Peptidfruktoseverbindung" bezieht sich auf eine Verbindung, die ein Peptid und Fruktose umfasst. Eine typische Peptidfruktoseverbindung hat die folgende Struktur:
worin R1 jedes Molekül mit einer -SH-Gruppe darstellt; R1 an dem Carboxyterminus von R2 durch eine kovalente Bindung bei (b) verknüpft ist; und R2 eine oder mehrere Aminosäuren einschließt, die von HbA1 abgeleitet sind, oder mit den Aminosäuren funktionell äquivalente Aminosäureanaloga, und R2 ist mit Fruktose an seinem Endterminus verknüpft.
Die Begriffe „Peptid", „Oligopeptid", „Polypeptid" und „Protein" werden austauschbar verwendet, um sich auf ein Polymer aus zwei oder mehr Aminosäuren (natürlich vorkommend oder nicht natürlich vorkommend) mit Peptidbindungen zu beziehen.
Der Begriff „Aminosäure" bezieht sich auf eine organische Verbindung mit einer Aminogruppe (-NH₂) und einer Carboxygruppe (-COOH) in demselben Molekül und schließt, wie es in der Technik verwendet wird, auch Iminosäuren mit einer Iminogruppe ein, wie zum Beispiel Prolin und Hydroxyprolin. Hierin verwendete Aminosäuren können natürlich vorkommende Aminosäuren (Asparagin (hiernach abgekürzt als Asn), Asparaginsäure (hiernach abgekürzt als Asp), Alanin (hiernach abgekürzt als Ala), Arginin (hiernach abgekürzt als Arg), Isoleucin (hiernach abgekürzt als Ile), Glycin (hiernach abgekürzt als Gly), Glutamin (hiernach abgekürzt als Gln), Glutaminsäure (hiernach abgekürzt als Glu), Cystein (hiernach abgekürzt als Cys), Serin (hiernach abgekürzt als Ser), Tyrosin (hiernach abgekürzt als Tyr), Tryptophan (hiernach abgekürzt als Trp), Threonin (hiernach abgekürzt als Thr), Valin (hiernach abgekürzt als Val), Histidin (hiernach abgekürzt als His), Phenylalanin (hiernach abgekürzt als Phe), Prolin (hiernach abgekürzt als Pro), Methionin (hiernach abgekürzt als Met), Lysin (hiernach abgekürzt als Lys) und Leucin (hiernach abgekürzt als Leu)) oder nicht natürlich vorkommende Aminosäuren sein. Die Aminosäure kann eine α-Aminosäure, β-Aminosäure, γ-Aminosäure, δ-Aminosäure, ω-Aminosäure oder Ähnliches sein. Die Aminosäure kann vom L-Typ oder D-Typ sein und ist bevorzugt vom L-Typ.
Der Begriff „nicht natürlich vorkommende Aminosäure" bezieht sich auf eine Aminosäure, welche in einem natürlich vorkommenden Protein nicht gefunden wird. Beispiele der nicht natürlich vorkommenden Aminosäuren schließen Norleucin, Para-Nitrophenylalanin, Homophenylalanin, Para-Fluorphenylalanin, 3-Amino-2-benzylpropionsäure, D- oder L-Homoarginin und D-Phenylalanin ein. Die nicht natürlich vorkommende Aminosäure schließt auch solche mit einer -SH-Gruppe ein, wie zum Beispiel Homocystein.
Der Begriff „Aminosäureanalogon" bezieht sich auf ein Molekül mit einer physikalischen Eigenschaft oder Funktion, ähnlich wie jene einer Aminosäure, aber ist selbst keine Aminosäure. Beispiele von Aminosäureanaloga schließen Ethionin, Canavanin und 2-Methylglutamin ein. Die Ähnlichkeit solch einer physikalischen Eigenschaft oder Funktion eines Aminosäureanalogons kann bestimmt werden, basierend darauf, ob die Verknüpfung des Analogons mit einer anderen Verbindung im Wesentlichen dieselbe ist wie jene der Aminosäure, wie sie hierin beschrieben ist, oder nicht.
Für eine Peptidfruktoseverbindung wird Aminosäuresubstitution und Ähnliches ohne wesentliche Änderung in der Funktionalität durch chemische Synthese oder durch Ändern einer Codonkodierung einer Aminosäure in einer DNA-Sequenz unter Verwendung von Gentechnik durchgeführt. Die vorliegende Erfindung ist dahingehend nicht beschränkt.
Eine gewisse Aminosäure kann mit einer anderen Aminosäure in einer Proteinstruktur, zum Beispiel eine kationische Region oder eine Bindungsstelle für ein Substratmolekül, ohne signifikante Reduktion oder Verlust der interaktiven Bindungsfähigkeit ersetzt werden. Die biologische Funktion eines bestimmten Proteins wird durch die Wechselwirkungsfähigkeit und Eigenschaften des Proteins bestimmt. Deshalb kann, sogar wenn Substitution einer bestimmten Aminosäure in einer Aminosäuresequenz (oder auf dem DNA-Code-Sequenzniveau) durchgeführt wird, ein Protein seine ursprünglichen Eigenschaften nach der Substitution beibehalten. Deshalb können hierin offenbarte Peptide oder die Peptide kodierende DNA in verschiedenen Weisen modifiziert sein, ohne ihre biologische Nützlichkeit deutlich zu beeinträchtigen.
Wenn die oben beschriebenen Modifikationen geplant werden, kann der Hydrophobieindex von Aminosäuren in Betracht gezogen werden. Der hydrophobe Aminosäureindex spielt eine wichtige Rolle beim Bereitstellen eines Proteins mit einer interaktiven biologischen Funktion, was allgemein in der Technik anerkannt ist (Kyte J. and Doolittle, R. F., J. Mol. Biol. 157 (1): 105-132, 1982). Die hydrophobe Eigenschaft einer Aminosäure trägt zu der Sekundärstruktur eines erzeugten Proteins bei und reguliert dann die Wechselwirkungen zwischen dem Protein und anderen Molekülen (z. B. Enzyme, Substrate, Rezeptoren, DNA, Antikörper, Antigene, etc.). Jeder Aminosäure wird ein Hydrophobieindex gegeben, basierend auf seiner Hydrophobie und seinen Ladungseigenschaften, wie folgt: Isoleucin (+4,5); Valin (+4,2); Leucin (+3,8); Phenylalanin (+2,8); Cystein/Cystin (+2,5); Methionin (+1,9); Alanin (+1,8); Glycin ( –0,4); Threonin (–0,7); Serin (–0,8); Tryptophan (–0,9); Tyrosin (–1,3); Prolin (–1,6); Histidin (–3,2); Glutaminsäure (–3,5); Glutamin (–3,5); Asparaginsäure (–3,5); Asparagin (–3,5); Lysin (–3,9); und Arginin (–4,5).
Es ist wohl bekannt, dass falls eine gewisse Aminosäure durch eine andere Aminosäure mit einem ähnlichen Hydrophobieindex ersetzt wird, ein resultierendes Protein immer noch eine biologische Funktion haben kann, ähnlich wie jene des ursprünglichen Proteins (z. B. ein Protein mit einer äquivalenten enzymatischen Aktivität). Für solch eine Aminosäuresubstitution liegt der Hydrophobieindex vorzugsweise innerhalb von ± 2, bevorzugter innerhalb von ± 1 und sogar noch bevorzugter innerhalb von ± 0,5. Es wird in der Technik verstanden, dass solch eine Aminosäuresubstitution, basierend auf dem Hydrophobieindex, effizient ist. Wie im US-Patent Nr. 4,554,101 beschrieben, werden Aminosäureresten die folgende Hydrophilieindizes gegeben: Arginin (+3,0); Lysin (+3,0); Asparaginsäure (+3,0 ± 1); Glutaminsäure (+3,0 ± 1); Serin (+3,0); Asparagin (+0,2); Glutamin (+0,2); Glycin (0); Threonin (–0,4); Prolin (–0,5 ± 1); Alanin (–0,5); Histidin (–0,5); Cystein (–1,0); Methionin (–1,3); Valin (–1,5); Leucin (–1,8); Isoleucin ( –1,8); Tyrosin (–2,3); Phenylalanin (–2,5); und Tryptophan (–3,4). Es wird verstanden, dass eine Aminosäure durch eine andere Aminosäure ersetzt werden kann, welche einen ähnlichen Hydrophilieindex hat und immer noch biologisches Äquivalent bereitstellen kann. Für solch eine Aminosäuresubstitution ist der Hydrophilieindex vorzugsweise innerhalb von ± 2, bevorzugter innerhalb von ± 1 und sogar noch bevorzugter innerhalb von ± 0,5.
Der Begriff „konservative Substitution", wie er hierin verwendet ist, bezieht sich auf Aminosäuresubstitution, in welcher eine substituierte Aminosäure und eine substituierende Aminosäure ähnliche Hydrophilieindizes oder/und Hydrophobieindizes haben. Beispiele von konservativen Substitutionen, die Fachleuten wohl bekannt sind, schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf Substitutionen innerhalb jeder der folgenden Gruppen: Arginin und Lysin; Glutaminsäure und Asparaginsäure; Serin und Threonin; Glutamin und Asparagin; und Valin, Leucin und Isoleucin.
Um funktionell äquivalente Peptidfruktoseverbindungen zu produzieren, können hierin Aminosäureaddition, -deletion, -substitution oder -modifikation durchgeführt werden. Aminosäuresubstitution bezieht sich auf die Substitution einer oder mehrerer Aminosäuren in einem Ausgangspeptid, zum Beispiel 1 bis 10 Aminosäuren, vorzugsweise 1 bis 5 und bevorzugter 1 bis 3. Aminosäureaddition bezieht sich auf die Addition von einer oder mehreren Aminosäuren zu einer Ausgangspeptidkette, zum Beispiel 1 bis 10 Aminosäuren, vorzugsweise 1 bis 5 und bevorzugter 1 bis 3. Aminosäuredeletion bezieht sich auf die Deletion einer oder mehrerer Aminosäuren von einem Ausgangspeptid, zum Beispiel 1 bis 10 Aminosäuren, vorzugsweise 1 bis 5 und bevorzugter 1 bis 3. Aminosäuremodifikation schließt ein, ist aber nicht beschränkt auf Amidierung, Carboxylierung, Sulfatierung, Halogenierung, Alkylierung, Glycosylierung, Phosphorylierung, Hydrierung, Acylierung (z. B. Acetylierung) und Ähnliche. Eine Aminosäure für die Substitution und Addition kann eine natürlich vorkommende Aminosäure oder alternativ eine nicht natürlich vorkommende Aminosäure sein. Eine natürlich vorkommende Aminosäure ist zu bevorzugen.
Der Begriff „Peptidanalogon" bezieht sich auf eine Verbindung, die mit einem Peptid in Bezug auf wenigstens eine chemische oder biologische Funktion äquivalent ist, aber nicht mit dem Peptid selbst. Deshalb schließt ein Peptidanalogon ein Peptid ein, in welchem eine oder mehrere Aminosäureanaloga zu dem ursprünglichen Peptid hinzugefügt worden sind oder eine oder mehrere Aminosäuren mit einem Aminosäureanalogon ersetzt worden sind. Ein Peptidanalogon hat solche Additionen oder Substitutionen, in welchen eine Funktion des Peptids im Wesentlichen dieselbe ist wie jene des ursprünglichen Peptids (z. B. eine Ähnlichkeit in pKa-Werten, eine Ähnlichkeit von funktionellen Gruppen, eine Ähnlichkeit von Verknüpfung mit anderen Molekülen, eine Ähnlichkeit in der Wasserlöslichkeit und Ähnliches. Solch ein Peptidanalogon kann unter Verwendung von in der Technik wohl bekannten Techniken erzeugt werden.
In einem Aspekt ist ein Proteinkonjugat der vorliegenden Erfindung ein Proteinkonjugat, worin eine Peptidfruktoseverbindung mit einem Protein gekoppelt ist, und die Peptidfruktoseverbindung wird durch die folgende Formel (I) unten repräsentiert:
Eine Peptidfruktoseverbindung umfasst typischerweise eine eingeführte Einheit mit einer -SH-Gruppe (z. B. ein Cysteinrest) zusätzlich zu Fruktose-Valin-Histidin, was eine charakteristische Struktur von HbA1c ist, was es leicht macht an ein Protein zu binden. Deshalb kann ein Proteinkonjugat durch Bindung einer Peptidfruktoseverbindung an ein Protein hergestellt werden.
Ein Proteinkonjugat der vorliegenden Erfindung ist gekennzeichnet dahingehend, dass eine durch Formel (I) repräsentierte Peptidfruktoseverbindung mit Hühner-γ-Globulin (engl. chicken-γ-globulin; hiernach abgekürzt als CGG) als das Protein verknüpft ist. Das Proteinkonjugat hat typischerweise Fruktose-Valin-Histidin, was eine charakteristische Struktur von HbA1c ist, und ein Protein unter Ausschluss von Hämoglobin und hat folglich keine Struktur mit Hämoglobin HbA0 gemeinsam. Deshalb kann das Proteinkonjugat als ein Immunogen verwendet werden, um zuverlässig einen Anti-HbA1c-Antikörper ohne Kreuzreaktivität mit Hämoglobin HbA0 und vorzugsweise ohne Kreuzreaktivität mit anderen Hämoglobinen als HbA1c zu erzeugen.
In einem Peptid-Fruktose-Proteinkonjugat wird eine durch Formel (I) repräsentierte Peptidfruktoseverbindung mit einem Protein verknüpft, mit Ausnahme von Hämoglobin, über eine -SH-Gruppe, vorzugsweise über eine Disulfidbindung. Die Peptidfruktoseverbindung kann einfach an ein Protein über eine Thiolgruppe (funktionelle Gruppe) wie Cystein geknüpft werden, um einfach ein Proteinkonjugat zu erzeugen. Weiterhin kann die Menge der mit einem Protein reagierenden Peptidfruktoseverbindung kontrolliert werden und die Menge der in ein Protein eingeführten Peptidfruktoseverbindung kann gemessen werden. Ein anderer Vorteil des Einführens einer -SH-Gruppe ist zum Beispiel die Bildung einer verhältnismäßig stabilen Disulfid-(S-S)-Bindung.
In Formel (I) schließt R2 vorzugsweise einen Rest ein, der durch die folgenden Formeln (II) oder (III) repräsentiert wird.
Die Peptidfruktoseverbindung hat eine eingeführte Struktur, Leucin-Threonin, welche eine charakteristische Struktur von HbA1c ist, zusätzlich zu Fruktose-Valin-Histidin.
Diese Peptidfruktoseverbindung kann verwendet werden, um einen Anti-HbA1c-Antikörper zu erzeugen, der ein höheres Maß an Fähigkeit hat, an HbA1c zu binden, und/oder ein hohes Maß an Selektivität für HbA1c hat.
In Formel (I) kann, wenn R2 eine Anzahl an Aminosäuren enthält, welche eine charakteristische Struktur von HbA1c ausmachen, oder Multimere der Aminosäuren enthält, ein Anti-HbA1c-Antikörper vorzugsweise mit einer höheren Bindungsstärke an HbA1c erzeugt werden. Bemerke, dass wenn die Anzahl der Aminosäuremultimere, welche die charakteristische Struktur von HbA1c sind, übermäßig groß ist, ist die Kreuzreaktivität des gewonnenen Anti-HbA1c-Antikörper mit anderen Hämoglobinen als HbA1c wahrscheinlich hoch. Deshalb wird die Anzahl an Aminosäuremultimeren, welche die charakteristische Struktur von HbA1c in R1 und R2 sind, des erhaltenen Anti-HbA1c-Antikörpers unter Gesichtspunkten der Bindungsstärke und der Kreuzreaktivität mit anderen Hämoglobinen als HbA1c angepasst.
Hierin wird CGG als das Protein für die Erzeugung des Proteinkonjugates der vorliegenden Erfindung verwendet. CGG ist ein Protein, das keine Ähnlichkeit mit Mausprotein hat und ein hohes Maß an Fähigkeit hat, Immunität zu induzieren. CGG hat auch ein hohes Maß an Löslichkeit, was ein anderer Grund ist, dass CGG für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet ist. Eine Peptidfruktoseverbindung der vorliegenden Erfindung kann in solch ein Protein mit einer Rate von wenigstens zehn Peptidfruktoseverbindungen pro Protein eingeführt werden, vorzugsweise wenigstens 20 Peptidfruktoseverbindungen pro Protein, bevorzugter wenigstens 25 Peptidfruktoseverbindungen pro Protein und sogar noch bevorzugter wenigstens 30 pro Protein. Durch Einführen einer Anzahl von Peptidfruktoseverbindungen pro Protein auf diese Weise ist es möglich, Antiserum oder Antikörper effizienter zu produzieren.
Als ein für das Verknüpfen einer Peptidfruktoseverbindung mit einem Protein verwendetes Reagenz kann jede Verbindung mit einer funktionellen Gruppe, die in der Lage ist, mit einer Thiolgruppe eines Restes, wie zum Beispiel Cystein mit einer Thiolgruppe, zu reagieren, und mit einer funktionellen Gruppe, die in der Lage ist, mit einer Aminogruppe oder Carboxygruppe in dem Protein zu reagieren, verwendet werden.
Beispiele solch einer Verbindung schließen N-γ-Maleimidbutyryloxysuccinimidester (hiernach abgekürzt als GMBS), Succinimidyl-4-(N-Maleimidmethyl)cyclohexan-1-carboxylat (hiernach abgekürzt als SMCC), Succinimidyl-4-(p-maleimidphenyl)butylat (hiernach abgekürzt als SMPB), 4-Succinimidyloxycarbonylmethyl-α-(2-pyridyldithio)toluol (hiernach abgekürzt als SMPT) und O-Succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)-1-propionat (hiernach abgekürzt als SPDP) ein. Unter diesen ist eines zu bevorzugen, das leicht erhältlich ist und das verwendet werden kann, um die Anzahl an Peptid-Fruktosen, die in ein Protein eingeführt worden ist, zu messen. Solch ein Reagenz ist zum Beispiel SPDP.
Ein Antiserum der vorliegenden Erfindung ist dadurch gekennzeichnet, dass das Antiserum in dem Blut eines Tieres produziert wird, in welches das oben beschriebene Peptid-Fruktose-Proteinkonjugat appliziert worden ist. Das Antiserum hat weniger Kreuzreaktivität mit anderen Hämoglobinen als HbA1c und kann die charakteristische Struktur von HbA1c erkennen.
Als ein Tier für die Produktion eines Antiserums kann jedes übliche Tier für die Immunisierung verwendet werden, ohne besondere Beschränkung. Beispiele solch eines Tiers schließen Mäuse, Ratten, Kaninchen, Ziegen, Schafe und Pferde ein. Auch kann durch Erzeugen von Hybridome unter Verwendung von Milzzellen aus einer Maus, die mit einem Peptid-Fruktose-Proteinkonjugat der vorliegenden Erfindung immunisiert worden ist, ein monoklonaler HbA1c-Antikörper produziert werden. Ein Antikörper der vorliegenden Erfindung kann humanisiert werden. Ein Verfahren zum Humanisieren eines Antikörpers ist in der Technik wohl bekannt.
Um die oben beschriebenen Ziele zu erreichen, wird ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung produziert durch Verschmelzen einer Milzzelle, welche aus einer Maus gewonnen worden ist, die mit einem Immunogen, umfassend ein Konjugat aus einer Peptidfruktoseverbindung mit einer durch Formel (I) repräsentierten Struktur und einem Protein, sensitiviert worden ist, mit einer von Myelom abgeleiteten Zelllinie, gefolgt von Klonieren und Erlauben einer durch Klonieren gewonnenen monoklonalen Antikörper produzierenden Zelle, den monoklonalen Antikörper in einem Überstand eines Zellkulturmediums zu produzieren.
Eine monoklonale Antikörper produzierende Zelle der vorliegenden Erfindung kann durch Verschmelzen einer Milzzelle, welche von einer Maus abgeleitet ist, die mit einem Immunogen, umfassend ein Peptid-Fruktose und ein Protein, sensitiviert worden ist, mit einer von Myelom abgeleiteten Zelllinie, gefolgt von Klonieren, erhalten werden.
Ein monoklonaler Antikörper der vorliegenden Erfindung wird erzeugt durch eine Fusionszelle (Hybridom) aus einer Milzzelle, welche von einer Maus abgeleitet ist, die mit einem Proteinkonjugat der vorliegenden Erfindung als ein Immunogen immunisiert worden ist, mit einer von Myelom abgeleiteten Zelle. Es kann jedoch ein Überstand aus einer Kultur, in welcher Fusionszellen (Hybridome) wuchsen, unter Verwendung einer Antikörperaufreinigungssäule, gefüllt mit Protein-A-Sepharosegel oder Ähnlichem, aufgereinigt werden, um einen Antikörper von Interesse zu erhalten.
Eine Peptidfruktoseverbindung hat Fruktose-Valium-Histidin, was eine charakteristische Struktur von HbA1c ist. Die mit einem Protein gekoppelte Peptidfruktoseverbindung ist ein effektives Immunogen zum Gewinnen eines Anti-HbA1c-Antikörpers.
Eine monoklonalen Antikörper produzierende Zelle der vorliegenden Erfindung kann wie folgt erhalten werden: Eine Milzzelle, welche aus einer Maus abgeleitet ist, die wie oben beschrieben immunisiert worden ist, wird zum Beispiel mit einer von Myelom abgeleiteten Zelle wie p3x63·Ag8·653 unter Verwendung eines die Fusion beschleunigenden Reagenz wie Polyethylenglycol verschmolzen und eine Anzahl der resultierenden Fusionszellen werden für eine gescreent, welche nur einen Antikörper produziert, der mit HbA1c aber nicht mit HbA0 reagiert, unter Verwendung eines Bewertungsverfahrens, wie zum Beispiel enzymgekoppelte Adsorptionsbestimmung (hierin abgekürzt als ELISA).
Beispiele
Hiernach wird die vorliegende Erfindung detaillierter im Wege von Beispielen beschrieben werden. Es sollte verstanden werden, dass die Beispiele unten, worin CGG als das Protein verwendet worden ist, beispielhafte Ausführungen der vorliegenden Erfindung angeben und dass von ihnen nicht beabsichtigt ist, dass sie die vorliegende Erfindung beschränkten.
Beispiel 1: Zubereitung von Peptid-Fruktose
In Beispiel 1 wurde eine Peptid-Fruktose, repräsentiert durch Formel (V) unten, durch die folgende Vorgehensweise zubereitet:
1. Einführen einer Cys-Gruppe in Wang-Harz (Festphase)
12,95 g (30 mmol) N-Fluorenylmethoxycarbonyl-S-t-butylthiocystein (hiernach abgekürzt als Fmoc-Cys (StBu)) wurden in 50 ml Chloroform gelöst, gefolgt von der Zugabe von 3,095 g (15 mmol) Dicyclohexylcarbodiimid (hiernach abgekürzt als DCC) und Rühren bei Raumtemperatur für zehn Minuten. Das resultierende Präzipitat (Dicyclohexylharnstoff) wurde herausgefiltert und ein Filtrat wurde unter reduziertem Druck getrocknet. Das getrocknete Filtrat wurde in 50 ml Dimethylformamid (hiernach abgekürzt als DMF) gelöst, gefolgt von der Zugabe von 10 g Wang-Harz (bindende OH-Gruppe: 1 mmol/g), um eine Suspension zu erhalten. 0,733 g (6 mmol) Dimethylaminopyridin (hiernach abgekürzt als DMAP) wurden zu der Suspension hinzugefügt und bei Raumtemperatur für 60 Minuten gerührt. Die Reaktionslösung wurde an Filtration ausgesetzt und das Harz wurde zweimal mit DMF und dann zweimal mit Chloroform gewaschen, gefolgt von Trocknen unter Vakuum über Nacht, um 11,8 g getrocknetes Harz zu erhalten (hiernach abgekürzt als Fmoc-Cys(StBu)-Harz).
Danach wurde der Grad der Einführung einer Cys-Gruppe in das Harz auf die folgende Weise gemessen. 5 ml einer 50 % Piperidin/DMF-Mischlösung wurden zu 100 mg des getrockneten Harzes hinzugefügt und bei Raumtemperatur für fünf Minuten gerührt. Das Harz wurde ausfiltriert und die Extinktion des resultierenden Filtrates wurde bei 301 nm gemessen. Die Extinktion war 66,4. Die Extinktion bei 301 nm wurde abgeleitet von Fluorenylmethylpiperidin (hiernach abgekürzt als Fmp), erzeugt dadurch, dass Piperidin die Fmoc-Cys-Gruppe, die in das Harz eingeführt worden ist, deprotektioniert. Deshalb gibt die Menge an freigesetztem Fmp die Menge einer Cys-Gruppe an. Die Fmp-Konzentration [Fmp] kann durch die Formel (1) berechnet werden, wo der molare Extinktionskoeffizient von Fmp bei 301 nm 7800 ist. [Fmp] = 66,4/7800 = 8,513 × 10–3 (M) (Formel 1)
Da die reaktive OH-Gruppe des Harzes 1 mmol/g ist, ist die Konzentration der reaktiven OH-Gruppe grob berechnet 0,02 M. Deshalb kann die Einführungsrate der Cys-Gruppe in das Harz durch die Formel (2) berechnet werden. (Verhältnis der Einführung von Cys-Gruppen) = 8,513 × 10–3/0,02 = 0,43 (43 %)(Formel 2)
2. Einführen einer His-Gruppe in Fmoc-Cys(StBu)-Harz
10 g (4,3 mmol auf einer Cys-Basis) Fmoc-Cys(StBu)-Harz wurden in 50 ml 20 % Piperidin/DMF dispergiert und bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Filtration entfernt und danach wurde die Reaktion mit 20 % Piperidin/DMF wiederholt. Das Harz wurde mit 50 ml DMF dreimal gewaschen und eine kleine Harzmenge wurde einem Ninhydrintest in einer Methanollösung ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass sich eine Aminogruppe in einem freien Zustand befand. Das Harz wurde in 20 ml DMF dispergiert. Zu dieser Lösung wurden 8,447 g (10,75 mmol) Fluorenylmethoxycarbonyltritylhistidinpentafluorphenylester (hiernach abgekürzt als Fmoc-His(Trt)-Opfp) hinzugefügt und bei Raumtemperatur für zwei Stunden gerührt. Das Harz wurde mit 50 ml DMF dreimal gewaschen. Danach wurde eine kleine Harzmenge einem Ninhydrintest in einer Methanollösung ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass keine freie Aminogruppe existierte. Danach wurde das Harz mit Chloroform dreimal gewaschen, gefolgt von Trocknen unter Vakuum über Nacht, um 11,2 g des getrockneten Harzes zu gewinnen (hiernach abgekürzt als Fmoc-His(Trt)-Cys(StBu)-Harz).
Das Verhältnis der Einführung einer His-Gruppe in das Harz wurde in einer oben beschriebenen Weise gemessen. Das Verhältnis der Einführung einer His-Gruppe war 3 8 %.
3. Einführen einer Valin-Gruppe (hiernach abgekürzt als Val) in Fmoc-His(Trt)-Cys(StBu)-Harz
11 g (4,2 mmol auf einer His-Basis) Fmoc-His(Trt)-Cys(StBu)-Harz wurden in 100 ml 20 % Piperidin/DMF dispergiert und bei Raumtemperatur für zehn Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Filtration entfernt und danach wurde die Reaktion mit 20 % Piperidin/DMF wiederholt. Das Harz wurde mit 50 ml DMF dreimal gewaschen und eine kleine Harzmenge wurde einem Ninhydrintest in einer Methanollösung ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass sich die Aminogruppe in einem freien Zustand befand. Das Harz wurde in 20 ml DMF dispergiert. Zu dieser Lösung wurden 5,234 g (10,53 mmol) Fluorenylmethoxycarbonyltritylvalinpentafluorphenylester (hiernach abgekürzt als Fmoc-Val-Opfp) hinzugefügt und bei Raumtemperatur für zwei Stunden gerührt. Das Harz wurde mit 50 ml DMF dreimal gewaschen. Danach wurde eine kleine Harzmenge einem Ninhydrintest in einer Methanollösung ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass keine freie Aminogruppe existierte. Danach wurde das Harz mit Chloroform dreimal gewaschen, gefolgt von Trocknen unter Vakuum über Nacht, um 10,0 g des getrockneten Harzes zu gewinnen (hiernach abgekürzt als Fmoc-Val-His(Trt)-Cys(StBu)-Harz).
Das Verhältnis des Einführens einer Val-Gruppe in das Harz wurde in einer oben beschriebenen Weise gemessen. Das Verhältnis der Einführung einer Val-Gruppe war 21 %.
4. Entfernen einer Peptidkette von dem Harz
9 g Fmoc-Val-His(Trt)-Cys(StBu)-Harz wurde in 100 ml 20 % Piperidin/DMF dispergiert und bei Raumtemperatur für zehn Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Filtration entfernt. Danach wurde das Harz mit 20 % Piperidin/DMF wiederum zur Reaktion gebracht. Das Harz wurde mit 100 ml DMF dreimal gewaschen. Eine kleine Harzmenge wurde einem Ninhydrintest in einer Methanollösung ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass die Aminogruppe sich in einem freien Zustand befand. Das Harz wurde mit Chloroform dreimal gewaschen und danach wurde es in einem Mischlösungsmittel mit 50 % Chloroform/Trifluoressigsäure (hiernach abgekürzt als TFA) dispergiert und bei Raumtemperatur für zwei Stunden gerührt. Das Harz wurde ausfiltriert und mit 100 ml Chloroform/TFA-(=4/1)-Mischlösung zweimal gewaschen. Das ganze Filtrat und die Waschlösung wurden gesammelt und unter reduziertem Druck konzentriert. Der Rückstand wurde in einer kleinen Menge TFA gelöst und in ungefähr 300 ml Ether dispergiert, gefolgt von Zentrifugation. Der Überstand wurde entfernt und das Präzipitat wurde mit Ether zweimal gewaschen, gefolgt von Trocknen unter Vakuum über Nacht. Als ein Ergebnis wurden 0,63 g des Rohproduktes (Val-His-Cys) erhalten.
5. Einführen von Fruktose in eine Peptidkette aufgrund der Amadori-Umordnungsreaktion
500 mg (1,126 mmol) synthetisches Peptid (Val-His-Cys) und 270 mg (1,5 mmol) Glucose wurden in 25 ml eines gemischten Lösungsmittels aus Pyridin/Essigsäure (=1/1) gelöst und an einem dunklen Ort bei Raumtemperatur für fünf Tage gerührt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt und danach wurde der Rückstand in 25 ml Wasser gelöst, gefolgt von Konzentration unter Vakuum. Das Konzentrat wurde in einer kleinen Menge Wasser gelöst und auf eine Dowex50WX8-Säule (hergestellt von Sigma, Durchmesser 3,5 cm × Länge 25 cm) geladen, welche ein stark saures Ionenaustauschharz war. Die Säule wurde mit ungefähr 21 Wasser gewaschen, um die Glukose zu entfernen. Danach wurde das Produkt mit 1 M Ammoniakwasser eluiert und das Eluat wurde lyophilisiert. Das resultierende Produkt wurde in 0,1 M Triethylammoniumpuffer (pH = 8,2) gelöst und auf eine Affigel-601-Säule (hergestellt von Pharmacia, Durchmesser 1,7 cm × Länge 20 cm) geladen. Die Säule wurde mit 1 l 0,1 M Triethylammoniumpuffer (pH 8,2) und dann 1 l Wasser gewaschen. Schließlich wurde das Produkt mit 0,1 % Ameisensäure eluiert und das Eluat wurde lyophilisiert. 50 mg eines roh gereinigten Produktes an Peptid-Fruktose (Fruktose-Val-His-Cys) wurden erhalten. Tabelle 1 zeigt chemische Verschiebungen und Peakpositionen von NMR für das Produkt, gemessen in deuterisiertem Methanol. (Tabelle 1)
Zubereitung eines Peptid-Fruktose-Proteinkonjugates
Bei diesem Beispiel wurde CGG als ein Protein verwendet.
1. Zubereitung von pyridyldithiopropionyliertem CGG (CGG-SPDP)
200 mg (1,33 × 10^–3 mmol) CGG wurden in 50 ml phosphatgepufferter Salzlösung (hiernach abgekürzt als PBS) gelöst. 5 ml SPDP/Ethanol-Lösung (SPDP = 40 mg, 0,13 mmol, ein äquivalentes Gewicht von 100) wurden in die Mischung unter Rühren getropft. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 30 Minuten wurde das resultierende Präzipitat durch Zentrifugation entfernt (10 Minuten, 20.000 rpm). Der resultierende Überstand wurde Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex-G25M-Säule (hergestellt von Pharmacia, Durchmesser 2 cm × Länge 80 cm) ausgesetzt, um 80 ml einer CGG-SPDP/PBS-Lösung zu erhalten.
Die Anzahl an SPDPs, die an ein CGG-Molekül bindet, wurde wie folgt bestimmt. 1 ml der resultierenden CGG-SPDP/PBS-Lösung wurde verwendet und ihre Extinktion wurde bei 280 nm gemessen. Die Extinktion war 3,73.
50 μl einer wässrigen Lösung von 100 mmol Dithiothreitol (hiernach abgekürzt als DTT) wurden zu der CGG-SPDP/PBS-Lösung hinzugefügt und es wurde ihr erlaubt für fünf Minuten zu stehen. Danach wurde die Extinktion bei 343 nm gemessen, mit einem Ergebnis von 2,80.
Unter der Annahme, dass der molekulare Extinktionskoeffizient von Pyridin-2-thion, freigesetzt durch DTT-Reduktion, bei 343 nm 8,08 × 10³ war, wurde die Konzentration [Pyridin-2-thion] durch Formel (3) bestimmt. [Pyridin-2-thion] = 2,80/(8,08 × 103) = 3,47 × 10–4 (M) (Formel 3)
Diese Konzentration ist äquivalent mit der Konzentration von in CGG eingeführtem SPDP. Da die 2-Pyridyldisulfidgruppe von SPDP zu der Extinktion bei 280 nm beiträgt, bedarf die Berechnung der CGG-Konzentration ebenfalls der folgenden Korrektur. Die CGG zugeschriebene Extinktion bei 280 nm (A280, CGG) kann durch die Formel (4) unten berechnet werden, wo der molekulare Extinktionskoeffizient von einer 2-Pyridyldisulfidgruppe bei 280 nm 5,1 × 10³ ist. (A280, CGG) = 3,73 – (3,47 × 10–4 × 5,1 × 103) = 1,96 (Formel 4)
Deshalb kann die CGG-Konzentration [CGG] und die Anzahl an SPDP-Molekülen, die in ein CGG-Molekül eingeführt worden sind, [SPDP]/[CGG] durch Formel (5) unten berechnet werden, wo der molare Extinktionskoeffizient von CGG bei 280 nm 1,99 × 10⁵ ist. [CGG] = 1,96/(1,99 × 105) = 9,85 × 10–6 (M) [SPDP]/[CGG] = 3,47 × 10/(9,85 × 10–6) = 35,2 (Formel 5)
2. Zubereitung eines Konjugates aus Peptid-Fruktose und CGG
40 mg (7,18 × 10^–2 mmol) eines Pyridyldithio-Derivates wurden zu 50 ml CGG-SPDP/PBS-Lösung hinzugefügt und bei 4 °C über Nacht gerührt. Das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugation (10 Minuten, 20.000 rpm) entfernt und danach wurde die Extinktion (A343) bei 343 nm gemessen, mit einem Ergebnis von 3,52. Der resultierende Überstand wurde an Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex-G25-Säule (hergestellt von Pharmacia, Durchmesser 2 cm × Länge 80 cm) ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurden 48 ml eines Konjugates aus Peptid-Fruktose und CGG erhalten.
Die Anzahl an Peptid-Fruktosen, die an ein CGG-Molekül, bindet, wurde wie folgt bestimmt. Unter der Annahme, dass der molekulare Extinktionskoeffizient von freigesetztem Pyridin-2-thion bei 343 nm 8,08 × 10³ liegt, basierend auf dem oben beschriebenen Ergebnis, das A343 3,52 unmittelbar nach der Reaktion war, kann die Konzentration [Pyridin-2-thion] durch Formel (6) unten berechnet werden. [Pyridin-2-thion] = 3,52/(8,08 × 103) = 4,35 × 10–4 (M) (Formel 6)
Diese Konzentration ist äquivalent mit der Konzentration an in CGG eingeführter Peptid-Fruktose. Da die CGG-Konzentration 1,40 × 10^–5 M war, kann die Anzahl an Peptid-Fruktose-Molekülen, die in ein CGG-Molekül eingeführt worden ist, [Peptid-Fruktose]/[CGG] durch Formel (7) berechnet werden. [Peptid-Fruktose]/[CGG]= 4,35 × 10–4/(1,40 × 10–5) = 31,1 (Formel 7)
Beispiel 2: Zubereitung von Peptid-Fruktose
Bei diesem Beispiel wurde durch Formel (VI) unten repräsentierte Peptid-Fruktose durch das folgende Vorgehen zubereitet.
1. Einführen einer Cys-Gruppe in Wang-Harz (Festphase)
Fmoc-Cys(StBu)-Harz wurde auf eine Weise wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitet.
2. Einführen einer Thr-Gruppe in Fmoc-Cys(StBu)-Harz
19,2 g (7,668 mmol auf einer Cys-Basis) Fmoc-Cys(StBu)-Harz wurden in 50 ml 20 % Piperidin/DMF dispergiert und bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Filtration entfernt und danach wurde die Reaktion mit 20 % Piperidin/DMF wiederholt. Das Harz wurde mit 50 ml DMF dreimal gewaschen und eine kleine Menge des Harzes wurde einem Ninhydrintest in einer Methanollösung ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass sich die Aminogruppe in einem freien Zustand befand. Das Harz wurde in 20 ml DMF dispergiert. Zu dieser Lösung wurden 9,719 g (19,17 mmol) Fluorenylmethoxycarbonylthreoninpentafluorphenylester (hiernach abgekürzt als Fmoc-Thr-Opfp) hinzugefügt und bei Raumtemperatur für zwei Stunden gerührt. Das Harz wurde mit 50 ml DMF dreimal gewaschen. Danach wurde eine kleine Harzmenge einem Ninhydrintest in einer Methanollösung ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass keine freie Aminogruppe existierte. Danach wurde das Harz mit Chloroform dreimal gewaschen, gefolgt von Trocknen unter Vakuum über Nacht, um 17,2 g des getrockneten Harzes zu erhalten (hiernach abgekürzt als Fmoc-Thr-Cys(StBu)-Harz).
Das Verhältnis des Einführens einer Thr-Gruppe in das Harz wurde auf eine wie in Beispiel 1 beschriebene Weise gemessen. Das Verhältnis des Einführens einer Thr-Gruppe war 42 %.
3. Einführen einer Leu-Gruppe in Fmoc-Thr-Cys(StBu)-Harz
15,2 g (6,444 mmol auf einer Cys-Basis) Fmoc-Thr-Cys(StBu)-Harz wurden in 50 ml 20 % Piperidin/DMF dispergiert und bei Raumtemperatur für 10 Minuten gerührt. Das Lösungsmittel wurde durch Filtration entfernt und danach wurde die Reaktion mit 20 % Piperidin/DMF wiederholt. Das Harz wurde mit 50 ml DMF dreimal gewaschen und eine kleine Harzmenge wurde einem Ninhydrintest in einer Methanollösung ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass sich die Aminogruppe in einem freien Zustand befand. Das Harz wurde in 20 ml DMF dispergiert. Zu dieser Lösung wurden 8,361 g (16,11 mmol) Fluorenylmethoxycarbonylleucinpentafluorphenylester (hiernach abgekürzt als Fmoc-Leu-Opfp) hinzugefügt und bei Raumtemperatur für zwei Stunden gerührt. Das Harz wurde mit 50 ml DMF dreimal gewaschen. Danach wurde eine kleine Menge des Harzes einem Ninhydrintest in einer Methanollösung ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurde bestätigt, dass keine freie Aminogruppe existierte. Danach wurde das Harz mit Chloroform dreimal gewaschen, gefolgt von Trocknen unter Vakuum über Nacht, um 13,4 g des getrockneten Harzes zu erhalten (hiernach abgekürzt als Fmoc-Leu-Thr-Cys(StBu)-Harz).
Das Verhältnis des Einführens einer Leu-Gruppe in das Harz wurde auf eine oben beschriebene Weise gemessen. Das Verhältnis der Einführung einer Leu-Gruppe war 26 %.
4. Einführen einer His-Gruppe in Fmoc-Leu-Thr-Cys(StBu)-Harz
Fmoc-His(Trt)-Leu-Thr-Cys(StBu)-Harz wurde auf eine Weise wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitet.
5. Einführen einer Val-Gruppe in Fmoc-His(Trt)-Leu-Thr-Cys(StBu)-Harz
Fmoc-Val-His(Trt)-Leu-Thr-Cys(StBu)-Harz wurde auf eine Weise wie in Beispiel 1 beschrieben zubereitet.
6. Entfernen der Peptidkette vom Harz
Val-His-Leu-Thr-Cys wurde auf eine Weise zubereitet, wie in Beispiel 1 beschrieben.
7. Einführen von Fruktose in die Peptidkette aufgrund der Amadori-Umordnungsreaktion
Fruktose-Val-His-Leu-Thr-Cys wurde auf eine wie in Beispiel 1 beschriebene Weise zubereitet.
Zubereitung eines Peptid-Fruktose-Proteinkonjugates
Bei diesem Beispiel wurden BSA (Rinderserumalbumin) und KLH (Schlüssellochnapfschneckenhämocyanin) als Vergleichsproteine verwendet.
1. Zubereitung von CGG-Cys-Thr-Leu-His-Val-Fruktose
200 mg (1,33 × 10^–3 mmol) CGG wurden in ungefähr 10 ml PBS gelöst. Zu dieser Mischung wurde eine Lösung, in welcher 20,9 mg (0,0667 mmol, 50 eq.) SPDP in 1 ml Ethanol gelöst waren, schrittweise bei Raumtemperatur unter Rühren hinzugefügt. Nach Rühren für 30 Minuten wurde die Mischung einer Reinigung unter Verwendung einer Sephadex-G25M-Säule ausgesetzt, um 24 ml (2,07 mg/ml) einer CGG-SPDP-Lösung zu erhalten. Die Anzahl an in CGG eingeführten SPDPs wurde auf die folgende Weise gemessen.
0,5 ml CGG-SPDP-Lösung wurden gesammelt und die Extinktion bei 280 nm (A280) wurde gemessen, mit einem Ergebnis von 6,03. Danach wurden 25 μl einer 100 mM Dithiotreitollösung zu der CGG-SPDP-Lösung hinzugefügt und die Mischung wurde für drei Minuten stehen gelassen. Danach wurde die Extinktion bei 343 nm (A343) gemessen, mit einem Ergebnis von 4,67. Die Extinktion bei 343 nm wurde dem aufgrund der DTT-Reduktion freigesetzten Pyridin-2-thion zugeschrieben. Die Menge an Pyridin-2-thion ist zu der Menge an eingeführtem SPDP äquivalent. Deshalb kann die SPDP-Konzentration [SPDP] durch Formel (8) unten berechnet werden, wobei der molare Extinktionskoeffizient von Pyridin-2-thion bei 343 nm 8080 ist. [SPDP] = 4,67/8080 = 5,780 × 10–4 (M) (Formel 8)
Die Extinktion bei 280 nm wird dem Protein zugeschrieben. Das eingeführte SPDP absorbiert Licht mit 280 nm. Deshalb erfordert die Berechnung der CGG-Konzentration [CGG] eine durch Formel (9) unten repräsentierte Korrektur, wobei der molare Extinktionskoeffizient von SPDP bei 280 nm 5100, der molare Extinktionskoeffizient von CGG bei 280 nm 1,99 × 10⁵ sind, (A280, SPDP) repräsentiert die Extinktion bei 280 nm, die SPDP zugeschrieben wird, und (A280, CGG) repräsentiert die Extinktion bei 280 nm, die CGG zugeschrieben wird. (A280, SPDP) = 5,780 × 10–4 × 5100 = 2,95 (A280, CGG) = 6,03 – 2,95 = 3,08 [CGG] = 3,08/(1,99 × 105) = 1,55 × 10–5 (M) (Formel 9)
Deshalb wird die Anzahl an in ein CGG-Molekül eingeführten SPDP-Molekülen [SPDP]/[CGG] durch Formel (10) unten angegeben. [SPDP]/[CGG] = 37,3 (Formel 10)
In eine PBS-Lösung des resultierenden CGG-SPDP (2,32 mg/ml, 13,5 ml) wurden 11,7 ml (0,016 mmol, 2 eq. SPDP) von Fruktose-Val-His-Leu-Thr-Cys, gelöst in 0,1 ml PBS, bei Raumtemperatur unter Rühren eingetropft. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für drei Stunden sanft gerührt. Die Reaktion wurde durch Messen der Extinktion der Reaktionslösung bei 343 nm nachverfolgt. Die Reaktionslösung wurde an Aufreinigung unter Verwendung einer Sephadex-G25M-Säule ausgesetzt, um 32 ml (0,885 mg/ml) CGG-Cys-Thr-Leu-His-Val-Fruktose zu erhalten. Danach wird das Peptid-Fruktose-Proteinkonjugat gemäß der vorliegenden Erfindung abgekürzt als F-CGG.
2. Zubereitung von KLH-Cys-Thr-Leu-His-Val-Fruktose
57,8 mg (5,78 × 10^–4 mmol) KLH wurden in ungefähr 10 ml PBS gelöst. Zu dieser Mischung wurde eine Lösung, bei welcher 2,7 mg (0,00865 mmol, 15 eq.) SPDP in 1 ml Ethanol gelöst waren, schrittweise bei Raumtemperatur unter Rühren hinzugefügt. Nach Rühren für 30 Minuten wurde die Mischung an Aufreinigung unter Verwendung einer Sephadex-G25M-Säule ausgesetzt, um 28 ml (1,47 mg/ml) einer KLH-SPDP-Lösung zu erhalten. Die Anzahl an in KLH eingeführten SPDPs wurde auf die folgende Weise gemessen.
0,5 ml einer KLH-SPDP-Lösung wurden gesammelt und die Extinktion bei 280 nm (A280) wurde gemessen, mit einem Ergebnis von 1,88. Danach wurden 25 μl einer 100 mM Dithiotreitollösung zu der CGG-SPDP-Lösung hinzugefügt und die Mischung wurde für drei Minuten stehen gelassen. Danach wurde die Extinktion bei 343 nm (A343) gemessen, mit einem Ergebnis von 0,365. Die Extinktion bei 343 nm wurde dem aufgrund der DTT-Reduktion freigesetzten Pyridin-2-thion zugeschrieben. Die Menge an Pyridin-2-thion ist äquivalent mit der Menge an dem eingeführten SPDP. Deshalb kann die SPDP-Konzentration [SPDP] durch Formel (11) unten berechnet werden, wobei der molare Extinktionskoeffizient von Pyridin-2-thion bei 343 nm 8080 ist. [SPDP] = 0,365/8080 = 4,517 × 10–5 (M) (Formel 11)
Extinktion bei 280 nm wird dem Protein zugeschrieben. Das eingeführte SPDP absorbiert Licht mit 280 nm. Deshalb erfordert die Berechnung der KLH-Konzentration [KLH] eine durch Formel (12) unten repräsentierte Korrektur, wo der molare Extinktionskoeffizient von SPDP bei 280 nm 5100, der molare Extinktionskoeffizient von KLH bei 280 nm 1,12 × 10⁵ sind und (280, KLH) für die Extinktion bei 280 nm steht, die KLH zugeschrieben wird. (A280, SPDP) = 4,517 × 10–5 × 5100 = 0,230 (A280, KLH) = 1,88 – 0,230 = 1,65 [KLH] = 1,65/(1,12 × 105) = 1,47 × 10–5 (M) (Formel 12)
Deshalb ist die Anzahl an SPDP-Molekülen, die in ein KLH-Molekül eingeführt wird [SPDP]/[KLH], durch Formel (13) unten angegeben. [SPDP]/[KLH] = 3,07 (Formel 13)
In eine PBS-Lösung des resultierenden KLH-SPDP (2,65 mg/ml, 15,5 ml) wurden 8,81 mg (0,012 mmol, 10 eq. SPDP) Fruktose-Val-His-Leu-Thr-Cys, gelöst in 0,1 ml PBS, bei Raumtemperatur unter Rühren getropft. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für drei Stunden leicht gerührt. Die Reaktion wurde durch Messen der Extinktion der Reaktionslösung bei 343 nm nachverfolgt. Die Reaktionslösung wurde Aufreinigung unter Verwendung einer Sephadex-G25M-Säule ausgesetzt, um 32 ml (1,13 mg/ml) KLH-Cys-Thr-Leu-His-Val-Fruktose zu erhalten. Hiernach wird dieses Vergleichspeptidfruktose-Proteinkonjugat als F-KLH abgekürzt.
3. Zubereitung von BSA-Cys-Thr-Leu-His-Val-Fruktose
200 mg (0,00303 mmol) BSA wurden in ungefähr 10 ml PBS gelöst. Zu dieser Mischung wurde eine Lösung, in welcher 4,73 mg (0,0152 mmol, 5 eq.) SPDP in 1 ml Ethanol gelöst worden sind, schrittweise bei Raumtemperatur unter Rühren hinzugefügt. Nach Rühren für 30 Minuten wurde die Mischung an Aufreinigung unter Verwendung einer Sephadex-G25M-Säule ausgesetzt, um 16 ml (10,4 mg/ml) einer BSA-SPDP-Lösung zu erhalten. Die Anzahl an in BSA eingeführten SPDPs wurde auf die folgende Weise gemessen.
0,5 ml BSA-SPDP-Lösung wurden gesammelt und die Extinktion bei 280 nm (A280) wurde gemessen, mit einem Ergebnis von 9,18. Danach wurden 25 μl einer 100 mM Dithiotreitollösung zu der BSA-SPDP-Lösung hinzugefügt und die Mischung wurde für drei Minuten stehen gelassen. Danach wurde die Extinktion bei 343 nm (A343) gemessen, mit einem Ergebnis von 3,63. Die Extinktion bei 343 nm wurde dem aufgrund der DTT-Reduktion freigesetzten Pyridin-2-thion zugeschrieben. Die Menge an Pyridin-2-thion ist äquivalent zu der Menge an eingeführtem SPDP. Deshalb kann die SPDP-Konzentration [SPDP] durch Formel (14) unten berechnet werden, wo der molare Extinktionskoeffizient von Pyridin-2-thion bei 343 nm 8080 ist. [SPDP] = 3,63/8080 = 4,493 × 10–4 (M) (Formel 14)
Extinktion bei 280 nm wird dem Protein zugeschrieben. Das eingeführte SPDP absorbiert Licht bei 280 nm. Deshalb erfordert die Berechnung der BSA-Konzentration [BSA] Korrektur, repräsentiert durch Formel (15) unten, wobei der molare Extinktionskoeffizient von SPDP bei 280 nm 5100 ist, der molare Extinktionskoeffizient von BSA bei 280 nm 4,36 × 10⁴ ist und (A280, BSA) die BSA zugeschriebene Extinktion bei 280 nm repräsentiert. (A280, SPDP)= 4,493 × 10–4 × 5100 = 2,29 (A280, BSA) = 9,18 – 2,29 = 6,89 [BSA] = 6,89/(4,36 × 104) = 1,58 × 10–4 (M) (Formel 15)
Deshalb ist die Anzahl an SPDP-Molekülen, die in ein BSA-Molekül eingeführt ist [SPDP]/[BSA], durch Formel (16) unten angegeben. [SPDP]/[BSA] = 2,8 (Formel 16)
In eine PBS-Lösung des resultierenden BSA-SPDP (10,4 mg/ml, 16 ml) wurden 10,3 mg (0,014 mmol, 2 eq. SPDP) Fruktose-Val-His-Leu-Thr-Cys, gelöst in 0,1 ml PBS, bei Raumtemperatur unter Rühren eingetropft. Die Mischung wurde bei Raumtemperatur für drei Stunden leicht gerührt. Die Reaktion wurde durch Messen der Extinktion der Reaktionslösung bei 343 nm verfolgt. Die Reaktionslösung wurde an Reinigung unter Verwendung einer Sephadex-G25M-Säule ausgesetzt, um 24 ml (6,51 mg/ml) BSA-Cys-Thr-Leu-His-Val-Fruktose zu erhalten. Hiernach wird dieses Vergleichspeptidfruktose-Proteinkonjugat als F-BSA abgekürzt.
Zubereitung von Antiserum und Bewertung seiner Wirksamkeit
Unter den zubereiteten Peptid-Fruktose-Proteinkonjugaten wurden F-CGG und zum Vergleich F-KLH als Immunogene verwendet, um ein Antiserum durch das Verfahren unten zuzubereiten. Kombinationen aus Immunogenen und zu immunisierenden Tieren, verwendet bei der Zubereitung von Antiseren, sind in Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2: Immunisierungsverfahren
Bei der Immunisierung wurden F-CGG oder zum Vergleich F-KLH mit vollständigem Freunds Adjuvanz (CFA) oder unvollständigem Freunds Adjuvanz (IFA) unter Verwendung eines Homogenisators vermischt. Die Mischung wurde in zu immunisierende Tiere injiziert. Die Endproteinkonzentration der Mischung war 1 mg/ml. Es wurden zwei Immunogene verwendet, um Immunisierung in Übereinstimmung mit dem in 1 gezeigten Immunisierungsschema durchzuführen. Sieben Wochen nach der ersten Immunisierung gesammelte Antiseren wurden für ihre Wirksamkeit unter Verwendung von ELISA bewertet. ELISA-Bedingungen sind in Tabelle 3 gezeigt. Die Ergebnisse der Bewertung, wenn das Immunogen F-CGG war, sind in 2 gezeigt. Die Ergebnisse der Bewertung, wenn das Immunogen zum Vergleich F-KLH war, sind in 3 gezeigt. In den 2 und 3 stellt die horizontale Achse die Verdünnung des Serums dar und die vertikale Achse stellt die Extinktion bei einer Messwellenlänge von 492 nm dar. Bemerke, dass in den 2 und 3 ein Messpunkt bei der Unendlichkeit der Serumverdünnung das Messergebnis einer Probe zeigt, welche gar kein Serum enthielt.
Tabelle 3
Bedingungen für ELISA

Antigenbeschichtung: F-BSA, 0,1 mg/ml, 100 μl/Vertiefung, r.t., über Nacht
Blocken: 1 % BSA·PBS·Az, 200 μl/Vertiefung, r.t., 30 Minuten
Primärer Antikörper: eine Verdünnungsreihe jedes Antiserums (1 % BSA·PBS·Az), r.t., drei Stunden
Sekundärer Antikörper: Anti-Maus-IgG-POD oder Anti-Maus-IgM-POD, 0,2 μg/ml, 1 % BSA·PBS, r.t., 30 Minuten
Enzymatische Reaktion: o-Phenylendiamin, 4 mg/ml PCB + 30 % H₂O₂, r.t., drei Minuten
Beenden der Reaktion: 4NH₂SO₄, 25 μl/Vertiefung

Die aus F-CGG als ein Immunogen erhaltenen Titer des Antiserums und das Antiserum, das aus F-KLH zum Vergleich als ein Immunogen erhalten worden ist, wurden beide bei einer Serumverdünnung von 10⁵ bis 10⁶ beobachtet. Da die Menge an produziertem IgG größer war als jene an produziertem IgM, haben F-CGG und zum Vergleich F-KLH eine gute Wirksamkeit.
Beispiel 3: Zubereitung von monoklonalem Antikörper
Bei diesem Beispiel wurden CGG und zum Vergleich KLH als Proteine für die Zubereitung von Konjugaten verwendet, die als Immunogene genutzt wurden. Als eine von Myelom abgeleitete Zelle wurde p3x63·Ag8·653 verwendet. ELISA wurde als ein Bewertungsverfahren für das Zellscreening angenommen. Ein BSA als ein Protein enthaltendes Konjugat wurde zubereitet und als eine Kontrolle für ELISA verwendet.
Zubereitung von Konjugat das als ein Immunogen zu verwenden ist
1. Zubereitung von pyridyldithiopropionyliertem CGG (Zubereitung von CGG-SPDP)
200 mg (1,33 × 10^–3 mmol) CGG wurden in 50 ml phosphatgepufferter Salzlösung (hiernach abgekürzt als PBS) gelöst. 5 ml SPDP/Ethanol-Lösung (SPDP = 40 mg, 0,13 mmol, ein äquivalentes Gewicht von 100) wurden in die Mischung unter Rührung getropft. Nach Rühren bei Raumtemperatur für 30 Minuten wurde das resultierende Präzipitat durch Zentrifugation (10 Minuten, 20.000 rpm) entfernt. Der resultierende Überstand wurde Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex-G25M-Säule (hergestellt von Pharmacia, Durchmesser 2 cm × Länge 80 cm) ausgesetzt, um 80 ml einer CGG-SPDP/PBS-Lösung zu erhalten.
Die Anzahl an SPDPs, die an ein CGG-Molekül bindet, wurde wie folgt bestimmt. 1 ml der resultierenden CGG-SPDP-PBS-Lösung wurde verwendet und ihre Extinktion wurde bei 280 nm gemessen. Die Extinktion war 3,73.
50 μl einer wässrigen 100 mM Dithithreitollösung (hiernach abgekürzt als DTT) wurden zu der CGG-SPDP/PBS-Lösung hinzugefügt und wurden für fünf Minuten stehen gelassen. Danach wurde die Extinktion bei 343 nm gemessen, mit einem Ergebnis von 2,80.
Unter der Annahme, dass der molekulare Extinktionskoeffizient von Pyridin-2-thion, freigesetzt durch DTT-Reduktion, bei 343 nm 8,08 × 10³ war, wurde die Konzentration [Pyridin-2-thion] durch Formel (A) bestimmt. [Pyridin-2-thion] = 2,80/(8,08 × 103) = 3,47 × 10–4 (M) (Formel A)
Diese Konzentration ist äquivalent zu der Konzentration an SPDP, eingeführt in CGG. Auch da die 2-Pyridyldisulfidgruppe von SPDP zu der Extinktion bei 280 nm beiträgt, erfordert die Berechnung der CGG-Konzentration die folgende Korrektur. Die Extinktion bei 280 nm, die CGG zugeschrieben werden kann (A_280,CGG) kann durch die Formel (B) unten berechnet werden, wo der molekulare Extinktionskoeffizient einer 2-Pyridyldisulfidgruppe bei 280 nm 5,1 × 10³ ist. A280,CGG = 3,73 – (3,47 × 10–4 × 5,1 × 103) = 1,96 (Formel B)
Deshalb können die CGG-Konzentration [CGG] und die Anzahl an SPDP-Molekülen, die in ein CGG-Molekül eingeführt worden sind [SPDP]/[CGG], durch Formel (C) unten berechnet werden, wo der molare Extinktionskoeffizient von CGG bei 280 nm 1,99 × 10⁵ ist. [CGG] = 1,96/(1,99 × 105) = 9,85 × 10–6 (M) [SPDP]/[CGG] = 3,47 × 10–4/(9,85 × 10–6) = 35,2 (Formel C)
2. Zubereitung eines Konjugats aus Peptid-Fruktose und CGG
40 mg (7,18 × 10^–2 mmol) eines Pyridyldithio-Derivates wurden zu 50 ml CGG-SPDP/PBS-Lösung hinzugefügt und bei 4 °C über Nacht gerührt. Das resultierende Präzipitat wurde durch Zentrifugation (10 Minuten, 20.000 rpm) entfernt und danach wurde die Extinktion (A₃₄₃) bei 343 nm gemessen, mit einem Ergebnis von A₃₄₃ = 3,52. Der resultierende Überstand wurde an Gelfiltration unter Verwendung einer Sephadex-G25M-Säule (hergestellt von Pharmacia, Durchmesser 2 cm × Länge 80 cm) ausgesetzt. Als ein Ergebnis wurden 48 ml eines Konjugates von Peptid-Fruktose und CGG erhalten.
Die Anzahl an Peptid-Fruktosen, die an ein CGG-Molekül binden, wurde wie folgt bestimmt. Unter der Annahme, dass der molekulare Extinktionskoeffizient von freigesetztem Pyridin-2-thion bei 343 nm 8,08 × 10³ ist, basierend auf dem oben beschriebenen Ergebnis, dass A₃₄₃ unmittelbar nach der Reaktion 3,52 war, kann die Konzentration [Pyridin-2-thion] durch Formel (D) unten berechnet werden. [Pyridin-2-thion] = 3,52/(8,08 × 103) = 4,35 × 10–4 (M) (Formel D)
Diese Konzentration ist äquivalent zu der Konzentration an in CGG eingeführter Peptid-Fruktose. Da die CGG-Konzentration 1,40 × 10^–5 M war, kann die Anzahl an Peptid-Fruktose-Molekülen, die in ein CGG-Molekül eingeführt worden sind [Peptid-Fruktose]/[CGG] durch Formel E berechnet werden. [Peptid-Fruktose]/[CGG] = 4,35 × 10–4/1,40 × 10–5 = 31,1 (Formel E)
3. Zubereitung eines Vergleichskonjugates aus KLH und Peptid-Fruktose
54 mg KLH und 5,42 mg (30 eq.) SPDP wurden verwendet, um pyridyldithiopropionyliertes KLH (KLH-SPDP) in einer wie oben in Bezug auf CGG beschriebenen Weise zuzubereiten, mit einem Ergebnis von 28 ml KLH-SPDP/PBS-Lösung (Konzentration: 1,47 mg/ml). Die in ein KLH-Molekül eingeführte Anzahl an SPDPs war 3,0.
15,5 ml (41,1 mg) der resultierenden KLH-SPDP-Lösung wurden verwendet, um mit Peptid-Fruktose (6,4 mg) wie oben beschrieben zu reagieren, mit einem Ergebnis von 33,3 mg (3,33 mg/ml, 10 ml) eines Konjugates aus KLH und Peptid-Fruktose. Die Anzahl an in ein KLH-Molekül eingeführten Peptid-Fruktosen war 2,7.
4. Zubereitung eines Vergleichskonjugates aus BSA und Peptid-Fruktose
Ein Konjugat aus Peptid-Fruktose und BSA wurde als eine Kontrolle für ELISA zubereitet. 200 mg BSA und 4,73 mg (5 eq.) SPDP wurden verwendet, um pyridyldithiopropionyliertes BSA (BSA-SPDP) in einer wie oben betreffend CGG und KLH beschriebenen Weise zuzubereiten, mit einem Ergebnis von 16 ml einer BSA-SPDP/PBS-Lösung (Konzentration: 10,4 mg/ml). Die Anzahl an in ein PBS-Molekül eingeführten SPDPs war 2,8.
16 ml der resultierenden BSA-SPDP-Lösung wurden verwendet, um sie mit Peptid-Fruktose (7,4 mg) in einer wie oben beschriebenen Weise reagieren zu lassen, mit einem Ergebnis von 156,2 mg (6,51 mg/ml, 24 ml) eines Konjugates aus Peptid-Fruktose und BSA. Die Anzahl an in ein BSA-Molekül eingeführten Peptid-Fruktosen war 2,5.
Verfahren zur Zubereitung von monoklonalen Antikörper produzierenden Zellen und monoklonalem Antikörper
1. Immunisierung von Mäusen
Zehn ungefähr acht Wochen alte Mäuse (Balb/c) wurden in zwei Gruppen (jeweils fünf) aufgeteilt. Zwei Immunogene (CGG-Konjugat und zum Vergleich KLH-Konjugat), wie oben zubereitet, wurden intraperitoneal in die jeweiligen Gruppen mit einer Dosis von 100 μl injiziert.
2. Überprüfung der Antikörperproduktion
50 bis 100 μl Blut wurden in einem Zentrifugenröhrchen aus der Augenvene von Mäusen gesammelt, welchen 77 Tage nach der Injektion für die Immunisierung Blut entnommen wurde. Die Seren wurden zentrifugiert, gefolgt von Bewertung des Antikörpertiters unter Verwendung von ELISA (unten beschrieben). Als ein Ergebnis wurde die Produktion von Anti-HbA1c-Antikörpern in allen Mäusen bestätigt.
3. Boostern von Mäusen
Eine Boosterinjektion eines schwachen Immunogens wurde für Mäuse durchgeführt, die einen besonders hohen Titer bei der oben beschriebenen Antikörpertiterbewertung hatten, um die Milzen der Mäuse zu vergrößern (die Gruppe an Mäusen, denen die CGG-Konjugate als ein Immunogen gegeben worden ist). Das Immunogen war 1 mg/ml Lösung, in welcher das CGG-Konjugat mit Fruktose in PBS verdünnt worden war, ohne jedes Adjuvanz.
4. Zellfusion
Drei Tage nach dem Boostern wurden Milzzellen aus den Mäusen isoliert. Die Milzzellen wurden mit einer von Mausmyelom abgeleiteten Zelllinie (P3X63-Ag8.653) durch ein üblicherweise verwendetes Verfahren unter Verwendung von Polyethylenglycol mit einem durchschnittlichen Molekulargewicht von 1.500 verschmolzen. Milzzellen aus denselben Mäusen wurden als Zellschicht als Wachstumsunterlage in der Zellkultur (Feeder-Zellen) (Zellen, die einen Wachstumsfaktor liefern) verwendet. Die fusionierten Zellen wurden in HAT-Medium, enthaltend 15 % fötales Kälberserum (hiernach abgekürzt als FCS), auf zwei 96-Well-Platten kultiviert. Nach einer Woche wurde das Medium mit HAT-Medium, enthaltend 15 % FCS, ausgetauscht.
5. Klonieren
Antikörpertiter wurden unter Verwendung von ELISA gemessen. Die fünf Vertiefungen mit den höchsten Titern wurden ausgewählt.
Die Medien in den fünf Vertiefungen wurden verdünnt und auf fünf 96-Well-Platten mit einer Dichte von einer Zelle pro Vertiefung (begrenzende Verdünnung) verteilt. Thymuszellen aus fünf Wochen alten Mäusen (Balb/c) wurden als Zellschicht als Wachstumsunterlage in der Zellkultur verwendet, um das anfängliche Wachstum zu fördern. Die Zellen wurden weiter kultiviert, während die Größe der Platte gesteigert wurde. Der Überstand wurde an ELISA ausgesetzt, um Antikörpertiter zu geeigneten Zeitpunkten zu messen. Eine Gruppe aus Zellen, welche einen hohen Titer an HbA1c und ein gutes Wachstum zeigte, wurde schließlich ausgewählt und wurde auf eine Konzentration von 5 × 10⁵ Zellen/ml in 200 ml kultiviert.
6. Der Überstand der letztlich ausgewählten Zellen wurde zentrifugiert. Die Zellen wurden in 1 ml Lösung, enthaltend FCS und Dimethylsulfoxid (9:1), in einer Konzentration von 5 × 10⁶ Zellen/ml suspendiert. Die Suspension wurde bei –80 °C eingefroren und in flüssigem Stickstoff für die Langzeitkonservierung überführt.
7. Ein monoklonaler Antikörper wurde aus dem Überstand des Kulturmediums durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von 2-Mercaptopyridinbindungsgel (HiTrap IgM Purification, hergestellt von Pharmacia) aufgereinigt. Der monoklonale Antikörper wurde als IgM seiend gemäß dem Test unter Verwendung eines Mouse Monoclonal Typing Kit (hergestellt von Binding Site) bestätigt.
Messung von Antikörpertiter durch ELISA
Die Antiseren und Kulturüberstände, erhalten bei der Zubereitung des oben beschriebenen Antikörpers, wurden durch ELISA bewertet. Bedingungen und Verfahren für die Messung sind unten beschrieben.
1. Antikörperbeschichtung
Ein Konjugat aus Peptid-Fruktose und BSA wurde mit PBS, enthaltend 0,1 mg/ml und 0,04 % Natriumazid (BSA·PBS·Az), verdünnt, um eine Antigenlösung mit einer BSA-Konzentration von 0,1 mg/ml zuzubereiten. 100 μl der Antigenlösung wurden pro Vertiefung in Mikrotiterplatten (Vinylchlorid-96-Well-Platten, hergestellt von Costar) ausplattiert und wurden bei 20 °C über Nacht stehen gelassen. Ein Aspirator wurde verwendet, um die Antigenlösung zu entfernen und danach wurden die Mikroplatten mit PBS dreimal gewaschen. Das verbleibende PBS wurde durch einen Aspirator entfernt.
Gereinigter HbA1c und gereinigter HbA0 wurden wahlweise als Antigene für das Beschichten in Abhängigkeit von der Messung verwendet. In diesem Fall war die Antigenkonzentration 0,02 mg/ml und nach dem Plattieren in Vertiefungen wurde die Antigenlösung bei 4 °C über Nacht stehen gelassen.
2. Blocken
200 μl 1 % BSA·PBS·Az wurden pro Vertiefung ausplattiert und für 30 Minuten bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurden BSA·PBS·Az unter Verwendung eines Aspirators entfernt und die Platten wurden mit PBS dreimal gewaschen. Falls die anschließenden Vorgänge nicht am selben Tag durchgeführt wurden, wurden die in diesem Zustand verbleibenden Platten bei 4 °C zusammen mit einem mit Wasser befeuchteten Filter konserviert.
3. Reaktion des Antikörpers
100 μl Antikörperlösung (ein Serum, ein Kulturüberstand, ein gereinigter Antikörper oder Ähnliches), verdünnt auf verschiedene Verdünnungen mit 1 % BSA·PBS·Az, wurden pro Vertiefung der mit den oben beschriebenen Vorgehensweisen zubereiteten Platten ausplattiert. Die Platten wurden bei Raumtemperatur für drei Stunden stehen gelassen. Danach wurde die Antikörperlösung unter Verwendung eines Aspirators entfernt. Die Platten wurden mit PBS dreimal gewaschen. Das verbleibende PBS wurde unter Verwendung eines Aspirators entfernt.
4. Reaktion von sekundärem Antikörper
0,2 μg/ml peroxidasemarkierter Ziegen-Anti-Maus-IgG- oder -IgM-Antikörper (hergestellt durch KPL) wurden in 1 % BSA/PBS-Lösung gelöst (sekundäre Antikörperlösung). 100 μl der sekundären Antikörperlösung wurden pro Vertiefung von Platten ausplattiert und bei Raumtemperatur für 30 Minuten stehen gelassen. Ein Aspirator wurde verwendet, um die sekundäre Antikörperlösung zu entfernen. Die Platten wurden mit PBS dreimal gewaschen. Die verbleibende PBS wurde unter Verwendung eines Aspirators entfernt.
5. Reaktion von Substrat und ihre Termination
40 mg o-Phenylendiamin (für Biochemie) wurden in 10 ml Citrat-Phosphatpuffer (pH 5) gelöst. 4 μl 30 % Wasserstoffperoxid wurden zu der Mischung unmittelbar vor der Verwendung hinzugefügt (Substratlösung). 100 μl der Substratlösung wurden pro Vertiefung ausplattiert und bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach drei bis fünf Minuten wurden 25 μl 4N Schwefelsäure pro Vertiefung hinzugefügt, um die Reaktion zu beenden.
6. Messung
Extinktion wurde bei 492 nm unter Verwendung eines Mikroplattenlesegerätes (hergestellt durch Tosoh Corporation) gemessen.
Ergebnisse der Messung des Antikörpertiters
Die Ergebnisse der Messung des Antikörpertiters eines unmittelbar vor Zellfusion gemäß den oben beschriebenen Verfahren gesammelten Antiserums (77 Tage nach Immunisierung) sind in 4 gezeigt. Die Ergebnisse der Messung der Antikörpertiter von monoklonalen Antikörpern, erhalten durch Aufreinigung der Kulturüberstände von zwei Klonen (4F und 8E), selektiert durch Klonieren, sind in 5 (4F) und 6 (8E) gezeigt.
Das Ergebnis von 4 zeigt, dass 77 Tage nach Immunisierung das Antiserum die Fähigkeit hatte, ähnlich an BSA-Peptid-Fruktose und HbA1c zu binden, und es im Wesentlichen keine Fähigkeit, an HbA0 zu binden. Deshalb wird angenommen, dass dieses Antiserum die Fruktosebindungsstelle von HbA1c als ursprünglich beabsichtigt erkennt.
Weiter wird gezeigt, dass die zwei durch Klonieren nach Zellfusion ausgewählten Klone (4F und 8E) eine Bindungsfähigkeit von 1 × 10^–9 M bzw. 3 × 10^–9 M bei der Hälfte des Wertes der Bindungsfähigkeit haben.
Hinterlegung
Zwei bei der vorliegenden Erfindung erhaltenen Hybridome wurden bei der International Patent Orgnism Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Adresse: AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi, 1-Chome Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japan) am 22. Juni 2001 unter der Bezeichnung FERM BP-7637 und FERM BP-7636 hinterlegt.
Industrielle Anwendbarkeit
Wie oben beschrieben wird eine -SH-Gruppe in eine Peptid-Fruktose zusätzlich zu Fruktose-Valin-Histidin eingeführt, was eine charakteristische Struktur von HbA1c ist. Deshalb ist es für die Peptid-Fruktose einfach, an ein Protein gekoppelt zu werden. Durch Verknüpfen der Peptid-Fruktose mit einem Protein kann ein Proteinkonjugat produziert werden.
Das Peptid-Fruktose-Proteinkonjugat der vorliegenden Erfindung hat Fruktose-Valin-Histidin, was eine charakteristische Struktur von HbA1c ist, und CGG als das Protein. Deshalb hat dieses Proteinkonjugat mit anderen Hämoglobinen als HbA1c keine Struktur gemeinsam. Deshalb können unter Verwendung dieses Proteinkonjugates als ein Immunogen Anti-HbA1c-Antikörper, die keine Kreuzreaktivität mit HbA0 haben und vorzugsweise keine Kreuzreaktivität mit anderen Hämoglobinen als HbA1c haben, zuverlässig produziert werden.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf eine monoklonale Antikörper produzierende Zelle, erhalten durch Verschmelzen einer Mausmilzzelle, welche mit einem Konjugat einer Peptid-Fruktose, einschließend eine Formel (I) und ein Protein, sensitiviert worden ist, mit einer von Myelom abgeleiteten Zelllinie, gefolgt von Klonieren, und bezieht sich auf einen monoklonalen Antikörper, der durch die monoklonale Antikörper produzierende Zelle produziert worden ist. Deshalb ist es möglich, einen für HbA1c in humanem Hämoglobin spezifischen monoklonalen Antikörper und eine Antikörper produzierende Zelle, die den monoklonalen Antikörper produziert, bereitzustellen.

Claims

Proteinkonjugat, worin eine Peptidfruktoseverbindung mit einem Protein gekoppelt ist und die Peptidfruktoseverbindung durch die Formel (I) unten repräsentiert wird:
worin R1 jedes Molekül mit einer -SH-Gruppe darstellt, R1 an den Carboxyterminus von R2 bei (b) mit einer kovalenten Bindung gebunden ist, R2 eine oder mehrere Aminosäuren, abgeleitet von der Aminosäuresequenz von HbA1, oder ein Aminosäureanalogon, das zu den Aminosäuren funktionell äquivalent ist, enthält und R2 an die Fruktose an seinem Aminoterminus gebunden ist und das Protein CGG ist.
Proteinkonjugat nach Anspruch 1, worin R2 wenigstens ein Peptid enthält, das durch Formel (II) unten repräsentiert wird:
Proteinkonjugat nach Anspruch 1, worin R2 wenigstens ein Peptid enthält, das durch Formel (III) unten repräsentiert wird:
Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin R1 wenigstens einen Cysteinrest enthält.
Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin R1 ein Peptid oder ein Peptidanalogon umfasst.
Proteinkonjugat nach Anspruch 5, worin R1 ein Peptid umfasst.
Proteinkonjugat nach Anspruch 6, worin R1 ein Cysteinrest ist.
Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 7, worin die kovalente Bindung bei (b) eine Peptidbindung ist.
Antiserum, erzeugt in dem Blut eines Tieres durch Injizieren eines Proteinkonjugates nach einem der Ansprüche 1 bis 8.
Antikörper, isoliert aus einem Antiserum nach Anspruch 9.
Monoklonale antikörpererzeugende Zelle, worin die monoklonale antikörpererzeugende Zelle durch Fusionieren einer Milzzelle einer mit einem Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8 sensibilisierten Maus mit einer aus Myelom stammenden Zelle und durch Klonieren einer fusionierten Zelle erhalten wird, und worin die monoklonale antikörpererzeugende Zelle einen monoklonalen Antikörper erzeugt, der zur spezifischen Bindung an menschliches Hämoglobin A1c in der Lage ist.
Monoklonale antikörpererzeugende Zelle nach Anspruch 11, bezeichnet als Hinterlegungsnummer FERM BP-7637 oder FERM BP-7636.
Verfahren zur Erzeugung einer monoklonalen antikörpererzeugenden Zelle, die in der Lage ist, einen monoklonalen Antikörper zu erzeugen, der in der Lage ist, spezifisch an menschliches Hämoglobin A1c zu binden, wobei das Verfahren die folgenden Schritte umfasst: a) Sensibilisieren einer Maus mit einem Proteinkonjugat nach einem der Ansprüche 1 bis 8; und b) Isolieren einer Milzzelle aus der sensibilisierten Maus und Fusionieren der Milzzelle mit einer aus Myelom stammenden Zelle.
Monoklonaler Antikörper, erzeugt durch eine monoklonale antikörpererzeugende Zelle nach Anspruch 11 oder 12, welcher spezifisch an menschliches Hämoglobin A1c bindet.
Monoklonaler Antikörper nach Anspruch 14, worin dessen Bindungskonstante an menschliches Hämoglobin A1c 10⁴ oder mehr ist.