DE3151738C2

DE3151738C2 -

Info

Publication number: DE3151738C2
Application number: DE3151738A
Authority: DE
Inventors: Nobuaki Nakagawa; Shigeo Katsuragi; Kaoru Morita; Kunio Ohyama; Masahiko Shizuoka Jp Taniuchi; Toshiharu Houston Tex. Us Noda; Sadami Mishima Shizuoka Jp Kobari; Susumu Shizuoka Jp Watanabe
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1980-12-29
Filing date: 1981-12-29
Publication date: 1990-12-13
Also published as: CH661735A5; USRE33188E; FR2497198B1; DE3151738A1; GB2092160A; SE453510B; SE8107687L; FR2497198A1; GB2092160B; US4409141A

Description

Die Erfindung betrifft h-PTH (46-84), Cys⁴⁵-h-PTH (45-84) und Tyr⁴⁵-h-PTH (45-84) der allgemeinen Formel:

R-Ala⁴⁶-Gly-Ser-Gln-Arg⁵⁰-Pro-Arg- Lys-Lys-Glu⁵⁵-Asp-Asn-Val- Leu-Val⁶⁰-Glu-Ser-His-Glu-
Lys⁶⁵-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala⁷⁰- Asp-Lys-Ala-Asp-Val⁷⁵-Asp- Val-Leu-Thr-Lys⁸⁰-Ala-Lys- Ser-Gln⁸⁴-OH

worin R H, eine H-Cys⁴⁵-Gruppe oder eine H-Tyr⁴⁵-Gruppe bedeutet, und seine Salze.

Diese Peptide sind für die Analyse des menschlichen Nebenschilddrüsenhormons (h-PTH) geeignet.

Das menschliche Nebenschilddrüsenhormon (h-PTH) ist ein Hormon, welches aus 84 Aminosäuren besteht, und seine biologische Aktivität wird durch 34 Aminosäurereste seines N-endständigen Restes bestimmt [G.W. Tregear et al., Hoppe- Seyler′s Z. Physiol. Chem. 355, 415 (1974)].

Die Anmelderin hat den C-endständigen 39-Rest h-PTH [46-84] synthetisiert und dieses Peptid Kaninchen zur Sensibili sierung injiziert und dann mit Erfolg einen spezifischen Antikörper für das C-Terminal (C-endständig) erhalten.

Eine Markierung mit ¹²⁵J bei h-PTH ist bei der Radioimmuno analyse bzw. Radioimmunoassay (RIA) recht schwierig. Das h-PTH [46-84] enthält kein Tyrosin, welches leicht mit ¹²⁵J markiert werden kann, jedoch kann [Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] leicht mit einer radioisotopen Markie rungssubstanz markiert werden, und es ist schwierig, es in dem Immunreaktionsrohr zu adsorbieren. Es wurde festgestellt, daß die erfindungsgemäßen h-PTH-Fragmente nützlich für markierte Verbindungen für die h-PTH Analyse sind, bedingt durch ihre geringere nicht-spezifische Adsorption und ihre genaue quantitative Analyse im RIA.

h-PTH [46-84] enthält die Aminosäure Cystein nicht, die mit einem SH-Bindungsenzym mar kiert werden kann, es wurde jedoch gefunden, daß dieses Peptid quantitativ analysiert werden kann auf der Grundlage von EIA unter Verwendung von Antikörpern gegen h-PTH C-ter minales Fragment unter Verwendung eines Peptids der Formel:

R′-Ala⁴⁶-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro⁵¹- Arg-Lys⁵³-Lys-Glu⁵⁵-Asp-Asn-Val- Leu-Val⁶⁰-Glu-Ser-His-Glu-Lys⁶⁵-
Ser-Leu-Gly-Glu-Ala⁷⁰-Asp-Lys- Ala-Asp-Val⁷⁵-Asp-Val-Leu-Thr- Lys⁸⁰-Ala-Lys-Ser-Gln⁸⁴-OH [Ia]

worin R′ H oder die H-Cys⁴⁵-Gruppe bedeutet, unter der allge meinen Formel (I), d. h. h-PTH [46-84] und [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84]. Besonders bevorzugt kann h-PTH oder das C-terminale Fragment für h-PTH bevorzugt unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers analysiert werden, den man durch Immunreaktion von [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] oder seines Komplexes mit einem Protein, wie dem Immunkomplex von Rinderserumalbumin (BSA) als Antigen und unter Verwendung einer enzymmar kierten Verbindung der Formel:

R′′-Ala⁴⁶-Gly-Ser-Gln-Arg⁵⁰-Pro-Arg- Lys-Lys-Glu⁵⁵-Asp-Asn-Val- Leu-Val⁶⁰-Glu-Ser-His-Glu-
Lys⁶⁵-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala⁷⁰- Asp-Lys-Ala-Asp-Val⁷⁵-Asp- Val-Leu-Thr-Lys⁸⁰-Ala-Lys- Ser-Gln⁸⁴-OH

erhält, wobei in der Formel R′′ H oder eine H-Cys⁴⁵-Gruppe bedeutet, unter dem Peptid der Formel (I), d. h. h-PTH [46-84] und [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] als enzymmarkierte Ver bindung bei EIA.

Die Synthese des erfindungsgemäßen Peptids (I) kann wie folgt durchgeführt werden.

Eine Aminosäure und/oder ein niedriges Peptid werden durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel (I) umgesetzt, und die Schutzgruppe für die reaktive Gruppe wird bei der Endstufe der Reaktion freigesetzt. Die Kondensationsreaktion kann nach an sich bekannten Peptid syntheseverfahren durch erneutes Anbringen und Entfernen der Schutzgruppen und Kondensation durchgeführt werden. Die Schutzgruppen für die Synthese der Ausgangsmaterialien und der Zwischenprodukte sind an sich bekannte Schutzgruppen für die Peptidsynthese, und sie können leicht durch Hydro lyse, Säurezersetzung, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazino lyse entfernt werden.

Beispielsweise kann die Aminogruppe in an sich bekannter Weise durch eine Acylgruppe, wie eine Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, p-Toluolsulfonyl- oder o-Nitrophenylsul fonylgruppe, eine Benzyloxycarbonylgruppe, wie eine Benzyl oxycarbonyl-, o-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxy carbonyl-, o- (oder p-) Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitro benzyloxycarbonyl- oder p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, eine aliphatische Oxycarbonylgruppe, wie eine Trichlor äthyloxycarbonyl-, t-Amyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyl- oder Diisopropylmethoxycarbonylgruppe, oder eine Aralkyl oxycarbonylgruppe, wie eine 2-Phenylisopropoxycarbonyl-, 2-Tolylisopropoxycarbonyl- oder 2-p-Diphenylisopropoxy carbonylgruppe, geschützt sein. Diese Aminogruppen können durch Umsetzung mit einem 1,3-Diketon, wie Benzoylaceton oder Acetylaceton, unter Bildung eines Enamins geschützt werden.

Die Carboxylgruppe kann durch Amidbildung, Hydrazidbildung oder Veresterung geschützt werden. Die Amidgruppe ist mit einer 3,4-Dimethoxybenzyl- oder Bis-(p-methoxyphenyl)- methylgruppe substituiert. Die Hydrazidgruppe ist mit einer Benzyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, Trifluor acetyl, t-Butoxycarbonyl-, Trityl- oder 2-p-Diphenyliso propoxycarbonylgruppe substituiert. Die Estergruppe ist mit einem Alkanol, wie Methanol, Äthanol, t-Butanol oder Cyano methylalkohol, einem Aralkanol, wie Benzylalkohol, p-Brom benzylalkohol, p-Chlorbenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, 2,6-Dichlorbenzylalkohol, Benzhydryl alkohol, Benzoylmethylalkohol, p-Brombenzoylmethylalkohol oder p-Chlorbenzoylmethylalkohol, einem Phenol, wie 2,4,6- Trichlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol oder 2,4-Dinitrophenol, oder einem Thiophenol, wie Thiophenol oder p-Nitrothiophenol, substituiert. Die Hydroxygruppe im Serin oder Tyrosin kann gegebenenfalls durch Veresterung oder Verätherung geschützt sein. Eine durch Veresterung geschützte Gruppe ist beispielsweise eine Acetylgruppe, eine Benzoylgruppe, eine Benzyloxycarbonyl gruppe oder Äthyloxycarbonylgruppe. Eine durch Verätherung geschützte Gruppe ist beispielsweise eine Benzyl-, Tetra hydropyranyl- oder t-Butylgruppe. Der Schutz der Hydroxy gruppe kann durch eine 2,2,2-Trifluor-1-t-butyloxycarbonyl aminoäthyl- oder 2,2,2-trifluor-1-benzyloxycarbonylamino äthylgruppe erfolgen. Es ist im allgemeinen nicht immer erforderlich, diese Hydroxygruppen zu schützen.

Die Aminogruppe in der Guanidinogruppe im Arginin kann durch Nitro-, Tosyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Methylen-2- sulfonylgruppen geschützt sein. Es ist jedoch nicht immer erforderlich, die Guanidinogruppe zu schützen.

Die Iminogruppe im Histidin kann durch Benzyl-, Trityl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl-, 2,2,2-Trifluor-1-t-butyloxy carbonylaminoäthyl- oder 2,2,2-Trifluor-1-benzyloxycarbo nylaminoäthylgruppen geschützt sein, obgleich es nicht immer erforderlich ist, die Iminogruppe zu schützen.

Die Mercaptogruppe im Cystein kann durch eine Benzyl-, p-Methoxybenzyl-, p-Nitrobenzyl-, Trityl-, Benzylthiomethyl-, Äthylcarbamoyl- oder Acetamidmethylgruppe geschützt sein.

Das Peptid (I) wird durch Kondensation von Aminosäuren oder niedrigen Peptiden synthetisiert. Beispielsweise kann man eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer geschützten α-Aminogruppe und einer aktivierten endständigen Carboxyl gruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien α-Aminogruppe und einer geschützten endständigen Carboxylgruppe umsetzen. Andererseits kann man eine Amino säure oder ein Peptid mit aktivierter α-Aminogruppe und geschützter endständiger Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien endständigen Carboxyl gruppe und einer geschützten α-Aminogruppe umsetzen.

Die Carboxylgruppe kann aktiviert werden beispielsweise durch ein Säureazid, Säureanhydrid, Säureimidazolid oder einen aktiven Ester, wie durch Umwandlung in den Cyano methylester, Thiophenylester, p-Nitrophenylester, p-Nitro thiophenylester, p-Methansulfonylphenylester, Thiodylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, 2,4,6- Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxy succinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychino linester oder N-Hydroxypiperidinester, mit einem Carbodi imid, N,N′-Carbonyldiimidazol oder einem Isoxazoliumsalz, wie Woodward-Reagenz.

Die bevorzugten Kondensationsreaktionen sind das Carbodi imid-, Azid-, aktive Ester- und Säureanhydridverfahren. Bei der Kondensationsreaktion sollte die Razemisierung sorgfältig vermieden werden, und die bevorzugten Verfahren sind das Azid-, aktive Ester-, Wünsch- [Z. Naturforsch., 216, 426 (1966)] oder das Geiger-Verfahren [Chem. Ber., 103, 788 (1970)], insbesondere unter Verwendung von N-Äthyl-N′-3-di methylaminopropylcarbodiimid (WSCI) als Kondensationsmittel.

Dem erfindungsgemäßen Verfahren geht eine Kondensationsreak tion in der Aminosäuresequenz der Formel (I) voraus, und es ist bevorzugt, von dem endständigen C aus zu synthetisieren.

Das geschützte h-PTH [46-84] wird bevorzugt gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI unter Kondensation des C-terminalen Fragments 55-84 und des N-terminalen Fragments 46-54 synthetisiert. Das C-terminale Fragment 55-84 wird bevorzugt unter Kondensation des Frag ments 61-84 und des Fragments 57-60 gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI und anschließende Kondensation von 56. und 55. Aminosäure gemäß dem aktiven Esterverfahren damit und dann Kondensation des Fragments 51-54 gemäß dem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI synthetisiert. Das Fragment 61-84 wird bevorzugt durch aufeinanderfolgende Kondensation des Fragments 72-84 und der 71., 70. und 69. Aminosäure und des Fragments 62-68 und der 61. Aminosäure gemäß dem aktiven Esterverfahren oder dem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI synthetisiert.

Das Fragment 62-68 wird bevorzugt gemäß dem Azidverfahren unter Kondensation des Fragments 64-68 und des Fragments 62-63 synthetisiert. Das Fragment 72-84 wird bevorzugt gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI unter Kondensation des Fragments 77-84 und der 76., 75. und 74. Aminosäure und des Fragments 72-73 synthetisiert. Das Fragment 77-84 wird bevorzugt nach dem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI unter Kondensation des Fragments 82-84 und des Fragments 77-81 synthetisiert.

Geschütztes [Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] und geschütztes [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] werden bevorzugt durch Kondensation von geschütztem h-PTH [46-84], wie zuvor angegeben, und der ent sprechenden 45. Aminosäure nach dem modifizierten Geiger- Verfahren unter Verwendung von WSCI synthetisiert.

Bei den oben aufgeführten Peptidsynthesen ist die C-terminale Carboxylgruppe nicht immer geschützt. Beispielsweise ist es bei der Kondensationsreaktion gemäß dem Azid- oder aktiven Esterverfahren nicht erforderlich, diese Gruppen zu schützen. Die Carboxylgruppe kann durch Veresterung, wie eines Methyl-, Äthyl- oder Benzylesters, geschützt sein. Die Estergruppe, wie die Methylestergruppe, kann mittels verdünnter Natriumhydroxidlösung oder durch Umwandlung in das Hydrazid entfernt werden, und die Benzylestergruppe kann mit wasserfreiem Fluorwasserstoff oder durch katalytische Hydrierung entfernt werden. Die α-Aminogruppe des Peptids wird mit einer an sich bekannten Schutzgruppe, wie einer Benzyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyl- oder t-Amyloxy carbonylgruppe, geschützt. Die Benzyloxycarbonylgruppe wird durch katalytische Hydrierung entfernt, und die t-Butoxy carbonyl- und die t-Amyloxycarbonylgruppe werden mit Trifluoressigsäure entfernt. Bevorzugte Schutzgruppen sind die Hydroxylgruppe von Serin und Threonin durch eine Benzyl gruppe, die Hydroxylgruppe von Tyrosin durch eine 2,6-Di chlorbenzylgruppe, die ε-Aminogruppe von Lysin durch eine o-Chlorbenzyloxycarbonylgruppe, die Aminogruppe in der Guanidinogruppe von Arginin durch eine Tosylgruppe und die Mercaptogruppe von Cystein durch eine p-Methoxybenzylgruppe. Diese Schutzgruppen können mit wasserfreiem Fluorwasserstoff entfernt werden. Die Acetamidmethylgruppe kann als Schutz gruppe für die Mercaptogruppe von Cystein verwendet werden. Da diese Gruppe gegenüber wasserfreiem Fluorwasserstoff stabil ist, kann sie mittels Quecksilber-(II)-acetat bei einem pH von 4 zum Zeitpunkt der Entfernung der anderen Gruppen entfernt werden.

Es werden so geschütztes h-PTH [46-84], geschütztes [Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] und geschütztes [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] erhalten. Diese Schutzgruppen werden bevorzugt durch Säurezersetzung, wie eine einstufige Entfernung mittels wasserfreiem Fluorwasserstoff, abgespalten, wobei man die Verbindung der Formel (I) erhält.

Wenn die Mercaptogruppe des 45. Cysteins mittels einer Acetamidmethylgruppe geschützt ist, kann sie mit Quecksilber- (II)-acetat bei einem pH von 4 nach Entfernung der anderen Schutzgruppen mittels wasserfreiem Fluorwasserstoff entfernt werden.

Die obige Verbindung (I) kann nach an sich bekannten Reinigungs verfahren für Peptide gereinigt werden. Beispielsweise kann sie durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Warenzeichen), Sephadex G-50 (Waren zeichen), Dowex 1 (Warenzeichen) und Carboxymethylcellulose gereinigt werden.

Das Peptid (I) kann in Form der Base oder des Salzes erhalten werden. Allgemein kann es mittels einer organischen Säure, wie Essigsäure, in ein Salz überführt werden.

Die erfindungsgemäßen Peptide (I), d. h. h-PTH [46-84] und [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84], sind für die Antikörperherstellung und für enzymmarkierte Peptide nützlich. Das h-PTH [46-84] und [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] besitzen den Vorteil für die Herstellung des Antikörpers. Insbesondere ist h-PTH [46-84] besonders nützlich als Mittel für die Kontrolle der Antikörper herstellung. Ein Peptid mit N-terminalem Tyrosin, d. h. [Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84], ist besonders nützlich als Markierungsmittel für RIA. Beispielsweise wurden [Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] und Chloramin T zu aliquoten Teilen von radioaktivem ¹²⁵J im Phosphatpuffer (pH 7,4) gegeben, dann wurde gerührt, es wurde Natriumbisulfid zugegeben, dann wurden geringe Mengen an Kaliumjodid und Serumalbumin zugegeben. ¹²⁵J-markierte Fraktionen wurden durch Chromato graphie gesammelt, wobei man ¹²⁵J-konjugierte Verbindungen zu dem Tyrosinrest, d. h. die markierte Verbindung ¹²⁵J- [Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84], welche für RIA-Reagentien nützlich sind, erhält.

Die Markierung von ¹²⁵J und seine Adsorption an Materialien des Immunreaktionsrohrs unter Verwendung von [Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84], die den Beispielen gemäß hergestellt wurden, wird im folgenden näher erläutert.

(1) Markierung mit ¹²⁵J

Eine Lösung (10 µl) von [Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] (2 µg) und eine Lösung (20 µg) von Chloramin T (3,4 mg/ml) werden zu 0,5 M-Phosphatpuffer (pH 7,5, 50 µl), welche ¹²⁵J-NaJ (Radioaktivität 2 mCi) ent hält, zugegeben. Dann wird 30 sec gerührt, und dann wird Natriumbisulfid (4,5 mg/ml)-Lösung (50 µl) zur Beendigung der Reaktion zugegeben. 0,1 N-Essigsäurelösung (0,5 ml), die 5% menschliches Serumalbumin enthält, wird zugegeben, und dann wird das Reaktionsgemisch auf eine Säule (1×50 cm) von Sephadex® G-25 für die Gelfiltration zur Entfernung von nichtumgesetztem ¹²⁵J-NaJ und unter Erhalt der markierten Verbindung ¹²⁵J-[Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] (Entwickler: 0,1 N-Essig säurelösung, die 0,5% menschliche Serumalbumin enthält) geleitet.

Die spezifische Aktivität des so erhaltenen ¹²⁵J-[Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] ist 545 µCi/µg, und die Ausbeute beträgt 76,7%. Es wird eine um das Zweifache bessere spezifische Aktivität erhalten, und die Ausbeute ist um das Drei- bis Vierfache größer, verglichen mit der Markierung von h-PTH [1-84] oder Rinder-PTH [1-84] (extrahiertes Produkt).

(2) Adsorption von ¹²⁵J-markierter Verbindung an dem Immunreaktionsrohr

Eine aliquote Menge (10,5 ml) von 0,01 M-Ammoniumacetat lösung (300 000 cpm), enthaltend ¹²⁵J-[Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84], wird in das Immunreaktions rohr gegeben und während konstanter Zeit stehen gelassen, dann wird der Inhalt entfernt, mit einer überschüssigen Menge an destilliertem Wasser gewaschen, und die verbleibende Radioaktivität in dem Rohr wird gezählt, um die Adsorption in dem Reaktionsrohr zu bestimmen.

Die Adsorptionsverhältnisse von ¹²⁵J-[Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] betragen 30,8% für Pyrex-Glasrohr, 8,1% für Eiken-Rohr Nr. 1, 5,5% für Maruemu-Rohr und 0,4% für Technicon-Rohr.

Das Adsorptionsverhältnis der Kontrolle ¹²⁵J-Rinder-PTH [1-84] beträgt 58,4% für Pyrex-Glasrohr, 15,7% für Eiken- Rohr Nr. 1, 12,2% für Maruemu-Rohr und 4,5% für Technicon- Rohr.

Das Adsorptionsverhältnis wird nach der folgenden Gleichung berechnet:

(3) Stabilität

(a) ¹²⁵J-[Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] wurde bei -20°C, 2, 18, 31 oder 60 Tage lang gelagert, und dann wird eine Gelfiltration an Sephadex® G-50 (Säule 1×30 cm, Entwickler: 0,1 M-Ammoniumacetatpuffer) durchgeführt. Die Radioaktivitäten werden an den Stellungen entsprechend [Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] gemessen, und man stellt fest, daß sie sehr stabil sind.
(b) Die Adsorptionsaktivität von ¹²⁵J-[Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] auf Talkpulver beträgt 92 bis 98% unmittelbar nach der Adsorption, bei -20°C während 2, 18, 31 und 61 Tagen. Man beobachtet keine Abnahme in den Adsorptionsaktivitäten.

Menschliches PTH oder sein C-endständiges Fragment können durch EIA unter Verwendung des Peptids der Formel (Ia) oder des Peptids der Formel (Ib) (die im folgenden als Peptid [Ia] und Peptid [Ib] bezeichnet werden) analysiert werden.

Die Reagentien, die für die Analyse von PTH durch EIA erforderlich sind, wie Antiserum, Antikörper oder enzymmar kierte Verbindung, werden wie folgt hergestellt.

Für die Herstellung eines spezifischen Antikörpers unter Ver wendung von Peptid (Ia), wird Peptid (Ia) selbst oder Peptid (Ia), konjugiert mit Protein, wie BSA oder BSA, das mit Alkali- oder Natriumlaurylsulfat und Mercaptoäthanol zur Aufspaltung der inneren molekularen Disulfidgruppe behandelt worden ist, Säugetieren, wie Kaninchen, Ratten, Meer schweinchen und Mäusen, für die Sensibilisierung verabreicht. Beispielsweise wird das obige Peptid (Ia) oder seine protein-konjugierte Verbindung mit Freund′s voll ständigem Adjuvans vermischt und subkutan 4- bis 7mal in Intervallen von zwei Wochen zur Sensibilisierung der Säuge tiere injiziert. Serum wird aus den sensibilisierten Tieren gesammelt und in an sich bekannter Weise behandelt, bei spielsweise zur Herstellung des Antiserums zentrifugiert. Das Antiserum, das eine hohe Konzentration an spezifischem Antikörper enthält, kann so, wie es ist, gelagert werden, und es kann in aliquoten Verdünnungen verwendet werden. Der spezifische Antikörper kann nach an sich bekannten Verfahren, wie Aussalzung, isoelektrische Präzipitation, Dialyse, Chromatographie oder Gelfiltration, gereinigt werden.

Das proteinkonjugierte Peptid (Ia) kann unter Verwendung von polyfunktionellen Reagentien, bei beispielsweise einer Aldehydverbindung, wie Succinaldehyd, Glutaraldehyd oder Adipoaldehyd, einem Diisocyanat, wie Hexamethylendiisocyanat oder 2,4-Toluoldiisocyanat, eines 3-(2′-Benzothiazolyl dithio)-propionatsuccinimidesters (JA-OS 55-17 302), von 6-N[3-(2′-Benzothiazolyldithio)propionyl]capronsäuresuccin imidester und N-[2-(2′-Pyridyldithio)äthyl]-3-(2′-benzo thiazolyldithio)propionamid (JA-OS 55-94 367, 55-1 33 382, 55-1 36 261), Maleimidbenzoatsuccinimidester, N,N′-Äthylenbis maleimid, Bisdiazobenzidin und Diäthylmalonimidat erhalten werden. Diese polyfunktionellen Reagentien können unter Beachtung der funktionellen Gruppen im (Ia) oder Protein, wie Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppe, ausgewählt werden. Ein bevorzugtes Beispiel für die peptid-(Ia)-proteinkonjugierte Verbindung wird aus [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] des Peptids (Ia) und dem polyfunktionellen Reagenz von 3-(2′-Benzothiazolyl dithio)propionatsuccinimidester zur Bindung der Thiolgruppe in Cys⁴⁵ hergestellt.

Das bevorzugte Verhältnis für die Konjugation beträgt 1 Mol Protein, wie BSA, für 1 bis 20 Mol Peptid (Ia). Bei der Reaktion wird zu dem Peptid (Ia) in wäßrigem Medium mit pH 7 bis 8 das polyfunktionelle Reagenz zugegeben, und dann wird unter Kühlen bei Raumtemperatur 1 bis 5 Stunden umgesetzt, und dann wird durch Gelfiltration gereinigt. BSA wird zuge geben, dann wird bei Raumtemperatur während 1 bis 5 Stunden umgesetzt, und dann wird gemäß der an sich bekannten Gel filtration und Dialyse unter Herstellung des Peptids (Ia), welches mit BSA konjugiert ist, gereinigt.

Der obige spezifische Antikörper kann an einen immobilisierten Träger, beispielsweise einen immobilisierten Protein träger, wie Albumin oder Gelatine, ein immobilisiertes semisynthetisches Polymerisat, wie Agarose, Cellulose oder Dextrin, mit Epichlorhydrin oder Bromcyanat behandelt, und ein Polymerisat oder Copolymerisat von Acrylonitril, Acryl säure, Acrylsäureester, Methacrylat, Methacrylatester, Vinylalkohol, Vinylacetat, Aminostyrol, Acrylamid oder Äthylen unter Verwendung des obigen polyfunktionellen Reagenz gebunden sein.

Beispiele von Enzymen für die Herstellung von enzymmarkiertem Peptid (Ib) in EIA sind Oxidoreduktase, Hydrolase, Transferase, Lyase, Isomerase oder Ligase, zum Beispiel Lactatdehydrogenase, Malatdehydrogenase, Apfelsäuredehydrogenase, Maltosedehydrogenase, Lactatoxidase, Malatoxidase, Glucoseoxidase, Cholinoxidase, Xanthinoxidase, Aminosäure oxidase, Sarcosinoxidase, Catalase, α-Amilase, β-Galactosi dase, Lysozym, Lipase, alkalische Phosphatase, Aminopeptidase, Tripsin, Papain, α-Chymotrypsin, Amidase, Hexokinase und Glycerokinase. Bevorzugte Abstandshalter (Spacer) können zuvor in diese Enzyme einverleibt werden. Beispiele sind Dialdehyde, wie Glutaraldehyd, reaktive Derivate, wie ω-Aminoessigsäurechlorid, Diamin, wie bei der Bindung des Dialdehyds oder Dicarbonsäure und Hexamethylendiamin oder Decamethylenamin, S-Acetylmercaptobernsteinsäureanhydrid und die Bindung des Dialdehyds und 2-Aminoäthanthiol. Eine Aldehyd-, Amino- oder Thiolgruppe kann unter Verwendung der oben aufgeführten Abstands- bzw. Spacer-Reagenzien einge führt werden.

Das Peptid-(Ib)-Enzym-Konjugat kann erhalten werden, indem man das Peptid (Ib) und eine Amino-, Hydroxy-, Carboxyl- oder Thiolgruppe in dem Enzym konjugiert, oder indem man in das Enzym eine Aldehyd-, Amino- oder Thiolgruppe ein führt, oder indem man eine Aldehyd-, Amino-, Thiol- oder Carboxylgruppe unter Verwendung von polyfunktionellen Reagenzien einführt.

Die Herstellung der enzymmarkierten Verbindung des Peptid- (Ib)-Enzymkonjugats erfolgt wie folgt. Beispielsweise wird das Peptid (Ib) mit dem polyfunktionellen Reagenz bei 0 bis 40°C in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels, wie Methanol, Äthanol, Aceton, Dioxan, Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid oder Tetrahydrofuran, in Pufferlösung (pH 6 bis 8) oder direkt in diesem organischen Lösungsmittel umgesetzt. Das Verhältnis von Peptid (Ib) und polyfunktio nellem Reagenz ist bevorzugt das äquimolare Verhältnis. Nach der Reaktion wird das Reaktionsprodukt gegebenenfalls gereinigt, und das Enzym wird damit umgesetzt, bevorzugt in dem Puffer mit stabilem pH für das Enzym. Die Menge an Enzym ist bevorzugt äquimolar oder eine etwas überschüssige molare Menge. Das so hergestellte Peptid-(Ib)-Enzymkonjugat kann durch Adsorptionschromatographie oder Gelfiltration gereinigt werden.

Verschiedene bekannte EIA-Verfahren können bei der vorliegenden Erfindung für die Analyse von h-PTH angewandt werden. Beispiele sind das Konkurrenzverfahren oder das Sand wich-Verfahren.

Einzelheiten des Konkurrenzverfahrens werden im folgenden näher erläutert.

Eine Probe, die das zu analysierende h-PTH, enzymmarkiertes Peptid (Ib) und Antiserum oder Antikörper des Peptids (Ia) enthält, wird in einem Immunoreaktionsmedium, wie einem Phosphatpuffer oder einem Veronalpuffer, bei 4 bis 5°C während 1 bis 3 Tagen inkubiert. Dann werden der immunologisch gebundene Teil (gebundenes B) und der nichtgebundene, freie Teil (freies F) getrennt (B-F-Trennung). Die B-F-Trennung erfolgt bevorzugt durch Zugabe von normalem Serum des gleichen Säugetiers, wie es für die Antiserumherstellung und das Antiserum dafür verwendet wurde, Inkubieren über Nacht, Zentrifugieren bei 3000 r.p.m. während 20 bis 30 Minuten für die B-F-Trennung. Danach wird die enzymatische Aktivität der ausgefallenen enzymmarkierten Verbindung (B) oder der überstehenden Lösung (F) analysiert. In dem Festen- Phasen-Verfahren wird immobilisierter Antikörper für die Konkurrenzreaktion anstelle von Antiserum oder Antikörper des Peptids (Ia) bei dem obigen Konkurrenzverfahren ver wendet. Dann erfolgt nach der Reaktion die B-F-Trennung, und die Enzymaktivität wird auf gleiche Weise, wie oben be schrieben, analysiert.

Andere, an sich bekannte Sandwich-Verfahren können mit bevorzugten Reagenzien angewandt werden.

Das h-PTH oder sein C-terminales Fragment können unter Ver wendung von Antikörper von Peptid (Ia) und enzymmarkiertem Peptid (Ib) mit guter Genauigkeit und Einfachheit analysiert werden. Bevorzugt wird β-galactosidase-markiertes [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] für die Analyse verwendet.

Die Antikörperbildung von h-PTH (53-84), h-PTH (51-84) und h-PTH (46-84) wird im folgenden erläutert.

Herstellung eines Antikörpers

Die Lösung von h-PTH (53-84), h-PTH (51-84) oder h-PTH (46-84) (je 300 µg) gelöst in 0,1 N-Essigsäure (250 µl) wird mit einer gleichen Menge an Freunds kompletten Adjuvants unter Herstellung einer gemischten Emulsion gelöst. Die gemischte Emulsion wird zum Inokulieren von Meer schweinchen, 5 männliche Tiere in einer Gruppe, Körper gewicht 280-340 g für die Immunisierung verwendet. Eine erste Immunisierung erfolgt durch subkutane Injektion der Emulsion in vier Fußsohlen und einen Schenkel. Nach drei Wochen erfolgt eine zweite Immunisierung durch Injektion in den Schenkel. Danach wird die Injektion in dreiwöchigen Intervallen wiederholt. Eine Woche nach der fünften Immuni sierung wird das Blut durch Herzpunktion entnommen.

Markiertes Antigen

(Tyr⁴⁵)-h-PTH (46-84) (5 µg) und Chloramin T (50 µg, Waren zeichen) werden in eine Lösung von J¹²⁵/mCi in 0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,4) gegeben und 30 Sekunden gerührt. Dann wird dazu Natriumpyrosulfit (120 µg) gegeben. Nach der Zugabe einer geringen Menge an Kaliumjodid und Rinder serumalbumin (BSA, 5 mg) wird das Gemisch Säulenchromato graphie an Sephadex® G-25 (1,0×20 cm) unterworfen. Frak tionen (7-10 ml) werden gesammelt. 0,05 M Veronalpuffer lösung, pH 8,6, welche 0,5% BSA enthält, wird für die Ver dünnung einer Probe auf etwa 0,1 µCi in einer Analyse ver wendet.

Analyseverfahren

Antikörper (100 µl) wird zu einer Probenlösung (100 µl) gegeben. Anschließend wird markiertes Peptid (100 µl) dazu gegeben und das Gemisch wird bei 4°C 3 Tage inkubiert. Normales Serum von Meerschweinchen (100 µl) und Antimeer schweinchen IgG Kaninchenserum (100 µl) werden zugegeben und das Gemisch wird bei 25°C 30 Minuten inkubiert, dann bei 3000 rpm während 30 Minuten zentrifugiert. Die überstehende Lösung wird abgesaugt und die Radioaktivität des Niederschlags wird gemessen.

Antikörper mit 500-8000-Verdünnung wird gemäß dem obigen Verfahren analysiert und das Verdünnungsverhältnis mit einem Bindungsverhältnis von 30-40% wird bestimmt.

Ergebnisse des Assays

Verdünnung
h-PTH (53-84)
3000
h-PTH (51-84)	500
h-PTH (46-84)	8000

Hieraus folgt, daß die Antikörperbildung von h-PTH (46-84) gemäß der vorliegenden Erfindung besser ist als die von h-PTH (51-84) und dem bekannten h-PTH (53-84 (Endocrinology, 103 (1978) 978-984).

Die in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Abkürzungen besitzen die folgenden Bedeutungen:

BOC:
t-Butoxycarbonyl
BAC:	Phenaoylester
Bzl:	Benzyl
Val:	L-Valin
OEt:	Äthylester
OBzl:	Benzylester
AOC:	t-Amyloxycarbonyl
Z-Cl:	o-Chlorbenzyloxycarbonyl
Tos:	Tosyl
OMe:	Methylester
ONP:	p-Nitrophenylester
Cys:	L-Cystein
OSU:	N-Hydroxysuccinimidester
Ser:	L-Serin
Asn:	L-Asparaginsäure
Leu:	L-Leucin
MeOH:	Methanol
Arg:	L-Arginin
Ala:	L-Alanin
Lys:	L-Lysin
BuOH:	Butanol
Tyr:	L-Tyrosin
TosoH:	p-Toluolsulfonsäure
TFA:	Trifluoressigsäure
THF:	Tetrahydrofuran
NMM:	N′-Methylmorpholin
WSCI:	N-Äthyl-N′-dimethylaminopropylcarbodiimid
Thr:	L-Threonin
Glu:	L-Glutaminsäure
Pro:	L-Prolin
Asp:	L-Asparaginsäure
Gly:	Glycin
Gln:	L-Glutamin
His:	L-Histidin
EtOH:	Äthanol
NMP:	N-Methyl-2-pyrrolidon
Et₃N:	Triäthylamin
Äther:	Diäthyläther
DMF:	Dimethylformamid
TBA:	Tribenzylamin
HOBT:	1-Hydroxybenzotriazol

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen werden die folgenden Träger und Entwicklungsmittel für die Dünnschichtchromatographie (TLC) verwendet.

Träger: Silicagel G
Entwickler:
1. Chloroform - Methanol - Essigsäure (95 : 5 : 3)
2. Chloroform - Methanol - Essigsäure (85 : 15 : 5)
3. Chloroform - Methanol - Essigsäure (85 : 10 : 5)
4. Chloroform - Methanol - Essigsäure (80 : 25 : 2)
5. Benzol - Äthylacetat (1 : 1)
6. Benzol - Äthylacetat (2 : 1)
7. Chloroform - Äthanol - Äthylacetat (5 : 2 : 5)
8. Chloroform - Äthanol - Äthylacetat (10 : 1 : 5)

Träger: Merck-Cellulose
Entwickler:
9. Butanol - Pyrridin - Essigsäure - Wasser (2 : 2 : 2 : 3)
10. Butanol - Pyrridin - Essigsäure - Wasser (1 : 1 : 1 : 2)

Die Aminosäureanalyse erfolgt wie folgt.
Die Probe wird in 6 N-HCl (Anisol wird bei geschütztem Peptid gegebenenfalls zugegeben) bei 110°C während 24 bis 45 Stunden in einem abgedichteten Rohr hydrolysiert, und das Hydrolysat wird im Vakuum getrocknet.

Beispiel 1 h-PTH [46-84]: H-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Se-r-His-Glu- Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala--Lys-Ser-Gln-OH (1) P(83-84): BOC-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [1]

BOC-Gln-OBzl (181,4 g, 0,242 M) wird in TFA (270 ml) gelöst und bei Raumtemperatur während 45 Minuten gerührt. Nachdem das TFA im Vakuum abdestilliert wurde, wird Äther zu dem Rückstand gegeben, und der Niederschlag wird gesammelt. Der Niederschlag wird in DMF (270 ml) gelöst, und HOBT (32,67 g, 0,242 M), BOC-Ser(Bzl)-OH (67,35 g, 0,242 M) und WSCI (44,29 ml, 0,242 M) werden zugegeben, und dann wird über Nacht gerührt. DMF wird abdestilliert, und der Rückstand wird in Äthylacetat (440 ml) gelöst, dann mit 1 N HCl, 5% Natrium bicarbonat und Wasser gewaschen. Die Lösung wird durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert und dann im Vakuum getrocknet. Die Umkristallisation erfolgt aus Äthylacetat-Hexan und man erhält die Substanz [1] (101,43 g, Ausbeute: 81,6%).
Schmelzpunkt: 121-123°C.
TLC: Rf₇=0,75.[α]=-14,12 (c=1,0, DMF).

Elementaranalyse [C₂₇H₃₅O₇N₉]:
gefunden: C 62,98, H 7,03, N 8,01%;
berechnet: C 63,14, H 6,87, N 8,18%.

(2) P(82-84): BOC-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [2]

TFA (440 ml) wird zu der Substanz [1] (98,87 g, 192,5 mM) zugegeben, und dann wird bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert. Der Rück stand wird in DMF (330 ml) gelöst. HOBT (28,6 g) und DMF- Lösung von BOC-Lys(Z-Cl)-OH [BOC-Lys(Z-Cl)-OH · TBA (103,33 g, 1,1molarer Überschuß)] wird mit Äthylacetat - 1 N-HCl behandelt. Die Äthylacetatschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft, und WSCI [38,72 ml (1,1molarer Überschuß)] wird zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 2 Tagen gerührt. DMF wird im Vakuum abdestilliert, und Eiswasser wird zu dem Rückstand zugegeben, und dann wird der so gebildete Nieder schlag gesammelt. Die Umkristallisation erfolgt dreimal aus Äthanol-Hexan, wobei man die Substanz [2] (111,06 g, Aus beute: 71,2%) erhält.
TLC: Rf₁=0,32, Rf₇=0,76.
Schmelzpunkt: 145-147°C.[α]=-13,1° (c=1,0, DMF).

Elementaranalyse [C₄₁H₅₂O₁₀N₅Cl]:
gefunden: C 61,02, H 6,65, N 8,74%;
berechnet: C 60,77, H 6,47, N 8,65%.

(3) P(80-81): BOC-Lys(Z-Cl)-Ala-OMe [3]

BOC-Lys(Z-Cl)-OH · TBA (234,24 g) wird in Äthylacetat suspen diert und mit 1 N-HCl und Wasser gewaschen und über wasser freiem Natriumsulfat getrocknet. Die Suspension wird im Vakuum eingedampft und in DMF (400 ml) gelöst. H-Ala-OMe · HCl (67,0 g), HOBT (64,8 g) und WSCI (87,84 ml) werden zugegeben, und dann wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. DMF wird im Vakuum abdestilliert, und der Rückstand wird in Äthylacetat (2 l) gelöst und dann mit 5% Natriumbicar bonat, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Die Umkristallisation erfolgt aus Äthylacetat-Hexan, und man erhält die Substanz [3] (231,8 g, Ausbeute: 96,6%).
Schmelzpunkt: 58-60°C.
TLC: Rf₁=0,77.[α]=-17,16 (c=1,0, DMF).

Elementaranalyse [C₂₃H₃₄O₇N₃Cl]:
gefunden: C 54,96, H 6,78, N 8,56%;
berechnet: C 55, 25, H 6,85, N 8,40%.

(4) P(79-81): BOC-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-OMe [4]

Die Substanz [3] (174,99 g, 0,35 M) wird zu TFA (500 ml) gegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 50 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert. Der Rück stand wird in Äthylacetat gelöst und mit 5% Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rück stand wird in DMF (400 ml) gelöst. HOBT (49,95 g, 1,05molarer Überschuß), BOC-Thr(Bzl)-OH (114,33 g, 1,05molarer Überschuß) und WSCI (67,7 ml, 1,05molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt, und dann wird Eiswasser zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und von heißem Äthanol umkristallisiert, und man erhält die Substanz [4] (99,31 g).

Die Mutterlauge wird im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst, viermal mit 5% Natriumbicarbonat, zweimal mit 1 N-HCl und zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird durch Silicagel säulenchromatographie [Entwickler: Chloroform - Äthanol - Essigsäure (5 : 1 : 5)] gereinigt, und man erhält die Substanz [4] (35,09 g). Die Fraktionen, die die Verunreinigungen enthalten, werden bei der nächsten Säulenchromatogra phiereinigungsstufe verwendet.

Die Substanz [3] (22,5 g, 45 mM) wird zu TFA (70 ml) zuge geben und bei Zimmertemperatur während 45 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in DMF (50 ml) gelöst, und dann wird durch Zugabe von NMM auf pH 7 eingestellt. HOBT (6,68 g, 1,1molarer Überschuß), BOC-THr (Bzl)-OH (15,31 g, 1,1molarer Überschuß) und WSCI (9,06 ml), 1,1molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird über Nacht gerührt. Nach dem Abdestillieren von DMF im Vakuum wird der Rückstand in Chloroform (200 ml) gelöst und mit 5% Natriumbicarbonat, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit den zuvor erwähnten Fraktionen, welche die Verunreinigungen enthalten, vermischt und durch Silicagelsäulenchromatographie gerei nigt. Die entsprechenden Fraktionen werden im Vakuum ge trocknet, zweimal mit Chloroform-Hexan wieder ausgefällt, wobei man die Substanz [4] (48,80 g) erhält. Gesamtaus beute: 183,2 g.
Schmelzpunkt: 132-134°C.
TLC: Rf₇=0,85.

Elementaranalyse [C₃₄H₄₇O₉N₄Cl]:
gefunden: C 59,06, H 7,05, N 7,41%;
berechnet: C 59,08, H 6,85, N 8,11%.

(5) P(77-78): BOC-Val-Leu-OEt [5]

BOC-Val-OH (101,99 g, 0,47 M), H-Leu-OEt · HCl (91,98 g, 0,47 M), HOBT (63,45 g) und WSCI (86,01 ml, 0,47 M) werden in THF (400 ml) gelöst und über Nacht gerührt. THF wird im Vakuum abdestilliert, in Äthylacetat (400 ml) gelöst und mit 5% Natriumbicarbonat, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird im Vakuum eingedampft. Umkristallisation erfolgt aus Äthylacetat- Hexan. Man erhält die Substanz [5] (153,7 g, Ausbeute: 91,2%).
Schmelzpunkt: 108-110°C.
TLC: Rf₁=0,63.[α]=-25,78 (c=1,0, DMF).

Elementaranalyse [C₁₈H₃₄O₅N₂]:
gefunden: C 60,35, H 9,42, N 8,39%;
berechnet: C 60,31, H 9,56, N 7,82%.

(6) P(77-78): BOC-Val-Leu-OH [6]

Zu der Substanz [5] (134,43 g, 0,375 M), die in Äthanol (400 ml) gelöst ist, gibt man 1 N-NaOH (412,5 ml, 1,1molarer Überschuß) unter Eiskühlung, und man rührt 1,5 Stunden. 1 N-NaOH (37,5 g, 0,1molarer Überschuß) wird zugegeben, und dann wird weiter 1 Stunde gerührt. 1 N-HCl (75 ml) wird zur Einstellung des pH-Wertes auf 5 zugegeben. Die Lösung wird mit Äther gewaschen. 1 N-HCl (400 ml) wird zu der wäßrigen Lösung zugegeben, und dann wird mit Äthylacetat extrahiert. Nach dem Trocknen der Äthylacetatschicht wird sie zur Trockene eingedampft, und dann wird aus Äthylacetat- Hexan umkristallisiert, und man erhält die Substanz [6] (119,66 g, Ausbeute: 96,6%).
TLC: Rf₁=0,35, Rf₇=0,58.

Elemetaranalyse [C₁₆H₃₀O₅N₂]:
gefunden: C 57,83, H 9,40, N 8,78%;
berechnet: C 58,16, H 9,15, N 8,48%.

(7) P(77-81): BOC-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-OMe [7]

Die Substanz [4] (182 g, 0,263 M) wird zu TFA (500 ml) gegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 50 Minuten gerührt. TFA wird abdestilliert, und Hexan wird zu dem Rückstand zugegeben. Die ausgefallene ölige Substanz wird durch Abdekantierung abgetrennt und in DMF (350 ml) gelöst, und dann wird der pH-Wert durch Zugabe von NMM auf 6,5 ein gestellt. HOBT (42,61 g, 1,2molarer Überschuß), die Sub stanz [6] (104,28 g, 1,2molarer Überschuß) wird WSCI (57,8 g, 1,2molarer Überschuß) werden zugegeben und bei Zimmer temperatur 1,5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wird fest, und es ist unmöglich, zu rühren; daher wird weiteres DMF (200 ml) zugegeben, und dann wird über Nacht bei Zimmertemperatur und bei 30°C während 4 Stunden stehengelassen. Eiswasser wird zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, und dann wird der Niederschlag abgetrennt und in Chloroform (2,5 l) gelöst und mit 5% Natriumbicarbonat, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Das Chloroform wird im Vakuum abdestilliert, und der Rückstand wird aus Chloroform - Äther - Hexan umkristal lisiert, und man erhält die Substanz [7] (224,68 g, Ausbeute: 94,9%).
Schmelzpunkt: 219-221°C.
TLC: Rf₁=0,15, Rf₈=0,68.[α]=-11,72 (c=1,0, DMF).

Elementaranalyse [C₄₅H₆₇O₁₁N₆Cl]:
gefunden: C 59,80, H 7,56, N 9,83%;
berechnet: C 59,82, H 7,48, N 9,30%.

(8) P(77-81): BOC-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-OH [8]

Eine 90%ige Äthanollösung (800 ml) von 1 N-KOH wird unter Eiskühlung zu der Substanz [7] (72,3 g, 80 mM), gelöst in Chloroform (720 ml), zugegeben, und dann wird bei 0-5°C während 40 Minuten gerührt. 1 N-HCl (800 ml) wird unter Eiskühlung zugegeben, und dann wird mit Chloroform (500 ml) extrahiert, und dann wird nochmals Chloroform (500 ml) zugegeben. Die Chloroformschicht wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird durch Silicagelsäulen chromatographie [Entwickler: Chloroform - Äthanol - Äthyl acetat (5 : 1 : 5)] gereinigt. Die entsprechende Fraktion wird im Vakuum getrocknet und dreimal aus Chloroform - Methanol - Äther - Hexan umkristallisiert, wobei man die Substanz [8] erhält.

Der obige Vorgang wird dreimal zur Hydrolyse der Substanz [7] (216,9 g) wiederholt, wobei man die Substanz [8] (156,07 g, Ausbeute: 73,1%) erhält.
Schmelzpunkt: 180-183°C.
TLC: Rf₃=0,69.[α]=-7,54 (c=1,0, DMF).

Elementaranalyse [C₄₄H₆₅O₁₁N₆Cl · ½H₂O]:
gefunden: C 58,94, H 7,67, N 9,64%;
berechnet: C 58,82, H 7,40, N 9,35%.

Aminosäureanalyse [Probe 3,1 mg/1 ml 6 N-HCl+0,1 ml Anisol, 45 Stunden bei 110°C hydrolysiert]:
Thr 0,96 (1), Ala 1, Val 0,93 (1), Leu 0,94 (1), Lys 1,01 (1).

(9) P(77-84): BOC-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [9]

Die Substanz [2] (104,5 g, 129 mM) in TFA (400 ml) wird bei Zimmertemperatur während 40 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert, und Äther wird zu dem Rückstand zuge geben. Der Niederschlag wird gesammelt und in DMF (500 ml) gelöst. HOBT (20,9 g, 1,2molarer Überschuß), Substanz [8] (137,7 g, 1,2molarer Überschuß) und WSCI (28,3 ml, 1,2molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird der pH-Wert auf 7 durch Zugabe von NMM eingestellt, und es wird über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird ein Gel, dann werden weiter DMF (150 ml) und WSCI (12,8 ml) zugegeben, und dann wird über Nacht gerührt. Eiswasser wird zu dem Reak tionsgemisch zugegeben, dann wird der Niederschlag gesammelt und fünfmal mit heißem Methanol gewaschen, wobei man die Substanz [9] (185,36 g, Ausbeute: 90,68%) erhält.
TLC: Rf₂=0,85.
[α]=-12,84 (c=1,0, DMF).

Elementaranalyse [C₈₀H₁₀₇O₁₈N₁₁Cl₂]:
gefunden: C 60,61, H 7,04, N 10,38%;
berechnet: C 60,75, H 6,82, N 9,74%.

Aminosäureanalyse [Probe 3,1 mg/1 ml 6 N-HCl+0,1 ml Anisol, hydrolysiert bei 110°C während 45 Stunden]:
Thr 0,93 (1), Ser 0,91 (1), Glu 1,01 (1), Ala 1, Val 0,74 (1), Leu 0,75 (1), Lys 2,01 (2).

(10) P(76-84): BOC-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln--OBzl [10]

Die Substanz [9] (183,5 g, 116 mM) wird zu TFA (500 ml) gegeben und bei Zimmertemperatur während 65 Minuten gerührt, und dann wird das TFA abdestilliert. Äther wird zu dem Rück stand zugegeben, dann wird der Niederschlag gesammelt und in DMF (900 ml) gelöst. HOBT (18,8 g, 1,2molarer Überschuß), BOC-Asp(OBzl)-OH (45,0 g, 1,2molarer Überschuß) und WSCI (25,5 ml, 1,2molarer Überschuß) werden zugegeben, der pH- Wert wird durch Zugabe von NMM auf 7 eingestellt, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum abdestilliert, und Eiswasser wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und zweimal mit heißem Methanol gewaschen. Die unlöslichen Verbindungen werden in heißem DMF gelöst, und Äthanol wird zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt, suspendiert und filtriert, wobei man die Substanz [10] (205,5 g, Ausbeute: 99,14%) erhält.
Schmelzpunkt: 259-262°C.
TLC: Rf₂=0,81.[α]=-13,7 (c=1,0, DMF).

Elementaranalyse [C₉₁H₁₁₈O₂₁N₁₂Cl₂]:
gefunden: C 61,01, H 6,84, N 9,54%;
berechnet: C 61,16, H 6,66, N 9,41%.

(11) P(75-84): BOC-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)--Gln-OBzl [11]

Die Substanz [10] (196,55 g, 0,11 M) wird zu TFA (500 ml) gegeben, bei Zimmertemperatur wird während 60 Minuten gerührt, und TFA wird im Vakuum entfernt. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, und der Niederschlag wird gesammelt und dann in DMF (1,3 l) gelöst. HOBT (19,3 g, 1,3molarer Überschuß), BOC-Val-OH (31,1 g, 1,3molarer Überschuß) und WSCI (26,2 ml, 1,3molarer Überschuß) werden unter Rühren zugegeben, der pH-Wert wird durch Zugabe von NMM auf 7 ein gestellt, und dann wird bei Zimmertemperatur gerührt. Eine Stunde später bildet das Reaktionsgemisch ein Gel und wird über Nacht stehengelassen. NMP (400 ml), 2,4-Dinitrophenol (20,2 g) und WSCI (26,2 ml, 1,3molarer Überschuß) werden zugegeben. Eine Gelbildung tritt während etwa 10 Minuten auf, dann läßt man über Nacht stehen. Eis und 5%ige Natrium bicarbonatlösung werden zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt, dreimal mit Wasser und viermal mit heißem Methanol gewaschen, und man erhält die Substanz [11] (203,74 g, Ausbeute: 98,2%).
Schmelzpunkt: 267-270°C.
TLC: Rf₃=0,56.

Elementaranalyse [C₉₆H₁₂₇O₂₂N₁₃Cl₂ · H₂O]:
gefunden: C 60,25, H 6,78, N 9,82%;
berechnet: C 60,55, H 6,83, N 9,56%:

Aminosäureanalyse: [Probe 3,1 mg/1 ml 6 N-HCl+0,1 ml Anisol, Hydrolyse bei 110°C während 48 Stunden]:
Asp 1,04 (1), Thr 0,83 (1), Ser 0,78 (1), Glu 1,03 (1), Ala 1,08 (1), Leu 1, Val 1,87 (2), Lys 2,19 (2).

(12) P(74-84): BOC-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)--Ser(Bzl)-Gln- OBzl [12]

Die Substanz [11] (151,2 g, 0,08 M) wird in Methylenchlorid (100 ml) und TFA (450 ml) gelöst, während 40 Minuten wird bei Zimmertemperatur gerührt, und dann wird TFA im Vakuum entfernt. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. DMF (500 ml) und NMP (1 l) werden zu dem Niederschlag zugegeben, um ihn aufzulösen. Eis und 5%iges Natriumbicarbonat werden zugegeben. Der so gebildete Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ein Gemisch aus DMF (500 ml) und NMP (1 l) wird zum Auflösen des Materials zugegeben, und BOC-Asp(OBzl)-OSU (44,0 g, 1,3molarer Überschuß), HOBT (1,4 g, 0,13molarer Überschuß) und NMM (11,4 ml, 1,3molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eiswasser gegossen, der so gebildete Niederschlag wird gesammelt, und dann wird Methanol zugegeben und eine Wärme behandlung durchgeführt. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt, und man erhält die Substanz [12] (157,6 g, Ausbeute: 94,2%).
TLC: Rf₃=0,56.

Elementaranalyse [C₁₀₇H₁₃₅O₂₅N₁₄Cl₂]:
gefunden: C 61,35, H 6,66, N 9,90%;
berechnet: C 61,45, H 6,65, N 9,38%

Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110°C, 48 Stunden]:
Asp 1,86 (2), Thr 0,87 (1), Ser 0,71 (1), Glu 1,01 (1), Ala 1,00 (1), Val 1,91 (2), Leu 1, Lys 2,01 (2).

(13) P(72-73): BOC-Lys(Z-Cl)-Ala-OH [13]

1 N-NaOH (115,2 ml, 1,2molarer Überschuß) wird bei 0°C zur Substanz [3] (48,0 g, 96 ml) zugegeben, die in Äthanol (100 ml) gelöst ist, und während 50 Minuten wird gerührt. 1 N-HCl (19 ml) wird zu Einstellung des pH-Werts auf 6 zugegeben, und das Äthanol wird bei 35°C abdestilliert. Äthylacetat, Eiswasser und 1 N-HCl (96 ml) werden zu dem Rückstand für die Extraktion zugegeben. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen, unter Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Hexan umkristallisiert, und man erhält die Substanz [13] (45,90 g, Ausbeute: 98,4%).
Schmelzpunkt: 116-119°C.
TLC: Rf₇=0,44.

Elementaranalyse [C₂₂H₃₂O₇N₃Cl]:
gefunden: C 54,57, H 6,91, N 8,95%;
berechnet: C 54,37, H 6,64, N 8,65%.

(14) P(72-84): BOC-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)--Ala- Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [14]

Methylenchlorid (60 ml) und TFA (360 ml) werden zu der Substanz [12] (125,46 g, 60 mM) zugegeben, bei Zimmertemperatur wird 55 Minuten gerührt, und dann wird das TFA abdestilliert. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, und der Nieder schlag wird gesammelt. DMF (600 ml) und NMP (600 ml) werden zum Auflösen zugegeben. Eis und 5%iges Natriumbicarbonat werden zugegeben. Das so ausgefallene Material wird gesammelt, dreimal mit Wasser und erneut mit Methanol und Äther gewaschen und getrocknet. NMP (1200 ml) und DMF (600 ml) werden zugegeben, um das Material aufzulösen. HOBT (10,56 g, 1,3molarer Überschuß), die Substanz [13] (37,92 g, 1,3molarer Überschuß) und WSCI (14,28 g, 1,3molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 3 Tage lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eiswasser gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, dreimal mit Wasser und dann zweimal mit heißem Methanol gewaschen. Weiteres Material wird mit Äther gewaschen, und dann wird getrocknet, um die Substanz [14] zu erhalten (142,74 g, Ausbeute: 96,7%).

Elementaranalyse [C₁₂₄H₁₆₁O₂₉N₂₇Cl₃]:
gefunden: C 60,30, H 6,79, N 9,70%;
berechnet: C 60,54, H 6,60, N 9,68%.

Aminosäureanalyse (6 N-HCl/Anisol, 110°C, 48 Stunden]:
Asp 1,86 (2), Thr 0,85 (1), Ser 0,67 (1), Glu 1,02 (1), Ala 1,90 (2), Val 1,93 (2), Leu 1, Lys 2,93 (3).

(15) P(71-84): BOC-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu- Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [15]

Die Substanz [14] wird zu TFA (420 ml) zugegeben, bei Zimmertemperatur 55 Minuten lang gerührt, und TFA wird im Vakuum abdestilliert. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt, und dann werden NMP (720 ml) und DMF (720 ml) zum Auflösen zugegeben. Das Gemisch wird in Eis und 5%ige Natriumbicarbonatlösung gegossen, der so gebildete Niederschlag wird gesammelt und dreimal mit Wasser und einmal mit Methanol und Äther gewaschen. NMP (840 ml) und DMF (840 ml) werden zugegeben, um das Material aufzulösen. HOBT (0,732 g, 0,14molarer Überschuß), 2,4-Dinitrophenol (11,93 g, 1,2molarer Überschuß), BOC- Asp(OBzl)-OSU (3,18 g, 1,2molarer Überschuß) und NMM (5,94 ml, 1,4molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur zwei Tage lang gerührt. NMP (120 ml) und DMF (60 ml) werden nochmals zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, um das Material aufzulösen. BOC-Asp(OBzl)-OSU (4,56 g, 0,2molarer Überschuß) und NMM (1,19 ml, 0,2molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmer temperatur zwei Tage lang weitergerührt. Das Reaktions gemisch wird in Eiswasser gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser gewaschen und in heißem Methanol suspendiert. Nach dem Kühlen wird der Niederschlag abfiltriert. Dieser Vorgang wird dreimal wiederholt, und man erhält die Substanz [15] (136,72 g, Ausbeute: 95,0%).

Elementaranalyse [C₁₃₅H₁₇₂O₃₂N₁₈Cl₃]:
gefunden: C 60,33, H 6,55, N 9,76%;
berechnet: C 60,83, H 6,51, N 9,46%.

Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110°C, 48 Stunden]:
Asp 2,60 (3), Thr 0,83 (1), Ser 0,65 (1), Glu 1,00 (1), Ala 1,81 (2), Val 1,92 (2), Leu 1, Lys 2,85 (3).

(16) P(70-84): BOC-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala- Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [16]

Die Substanz [15] wird zu TFA (325 ml) zugegeben, bei Zimmertemperatur wird während 70 Minuten gerührt, und TFA wird im Vakuum abdestilliert. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt, und NMP (600 ml) und DMF (600 ml) werden zugegeben, um das Material aufzulösen, und dann wird 5%iges Natriumbicarbonat zugegeben. Der Nieder schlag wird gesammelt und dreimal mit Wasser und einmal mit Methanol gewaschen. Der Niederschlag wird in NMP (720 ml) und DMF (720 ml) gelöst. 2,4-Dinitrophenol (9,0 g), HOBT (0,55 g, 0,1molarer Überschuß), BOC-Als-OSU (17,52 g, 1,5molarer Überschuß) und NMM (6,72 ml, 1,5molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Weiteres BOC-Ala-OSU (2,34 g) und NMM (0,9 ml) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmer temperatur 5 Tage lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eiswasser gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, drei mal mit Wasser und zweimal mit Methanol gewaschen, und man erhält die Substanz [16] (109,78 g, Ausbeute: 98,3%).
Schmelzpunkt: über 280°C (zers.).

Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110°C, 48 Stunden]:
Asp 2,57 (3), Thr 0,84 (1), Ser 0,67 (1), Glu 1,00 (1), Ala 2,53 (3), Val 1,98 (2), Leu 1, Lys 2,79 (3).

(17) P(69-84): BOC-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Va-l-Leu- Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [17]

Die Substanz [16] (85,38 g, 31,2 mM) wird zu TFA (280 ml) gegeben, bei Zimmertemperatur 60 Minuten lang gerührt, und das TFA wird abdestilliert. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt, dann wird durch Zugabe von DMF (540 ml) und NMP (540 ml) gelöst, und die Lösung wird zu einem Gemisch aus 5%igem Natriumbicarbonat und Eis gegeben. Der Niederschlag wird dreimal mit Wasser und einmal mit Methanol gewaschen. Dies wird in DMF (600 ml) und NMP (780 ml) gelöst. 2,4-Dinitrophenol (6,89 g, 1,2molarer Überschuß), HOBT (0,59 g, 0,14molarer Überschuß), BOC-Glu(OBzl)-OSU (18,97 g, 1,4molarer Überschuß) und NMM (4,8 ml, 1,4molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 3 Tagen gerührt. BOC-Glu (OBzl)-OSU (2,71 g, 0,2molarer Überschuß), gelöst in DMF (60 ml), und NMP (50 ml) und NMM (0,64 ml, 1,4molarer Über schuß) werden zugegeben, und dann wird weiter bei Zimmer temperatur 3 Tage lang gerührt. Die gleiche Menge an BOC-Glu (OBzl)-OSU und NMM wie oben wird zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktions gemisch wird in Eiswasser gegossen, der so gebildete Nieder schlag wird gesammelt und dreimal mit Wasser gewaschen. Der Niederschlag wird in heißem Methanol suspendiert, gekühlt und filtriert. Dieser Vorgang wird dreimal wiederholt, und man erhält die Substanz [17] (88,97 g, Ausbeute: 96,5%).

Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110°C, 24 Stunden]:
Asp 2,66 (3), Thr 0,91 (1), Ser 0,78 (1), Glu 1,76 (2), Ala 2,65 (3), Val 1,97 (2), Leu 1, Lys 2,88 (3).

(18) P(66-68): BOC-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OBzl [18]

WSCI (33,69 ml) wird tropfenweise zu BOC-Leu-OH · H₂O (45,64 g), H-Gly-OBzl · TosOH (61,87 g) und HOBT (24,87 g), gelöst in THF (200 ml), unter Kühlen gegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum konzentriert, und man erhält ein öliges Material, das in Äthylacetat (600 ml) gelöst wird, und man wäscht dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat, 1 N-HCl und Wasser. Die organische Schicht wird durch Zugabe von wasser freiem Natriumsulfat getrocknet, und dann wird im Vakuum ein gedampft, und man erhält eine ölige Substanz (69,0 g, Aus beute: 99%). Diese wird in Methylenchlorid (10 ml) gelöst, TFA (250 ml) wird bei 5°C zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 20 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert, DMF (200 ml) wird zu dem Rückstand zugegeben und dann durch Zugabe von NMM bei 0°C neutralisiert. HOBT (20,7 g, 0,19 M), BOC-Ser(Bzl)-OH (56 g, 0,19 M) und WSCI (34,8 ml, 0,19 M) werden zugegeben, dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt, Äthyl acetat wird zu dem Rückstand zugegeben, dann wird mit 5%igem Natriumbicarbonat, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird das Gemisch im Vakuum konzentriert. Hexan wird zu dem Rückstand zugegeben, und der Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt. Die Umkristallisation erfolgt von Äthylacetat-Hexan und Äthyl acetatäther-Hexan, und man erhält die Substanz [18] (72,47 g, Ausbeute: 72,0%).
Schmelzpunkt: 112-113°C.
TLC: Rf₅=0,55.

Elementaranalyse [C₃₀H₄₁O₇N₃]:
gefunden: C 65,06, H 7,75, N 7,36%;
berechnet: C 64,84, H 7,44, N 7,56%.

(19) P(65-68): BOC-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OBzl [19]

TFA (250 ml) wird bei 5°C zur Substanz [18] (72,47 g, 0,13 M), gelöst in Methylenchlorid (20 ml) zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 20 Minuten lang gerührt. TFA wird im Vakuum entfernt, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt, und DMF wird zugegeben. Bei 5°C wird NMM zugegeben, um die Lösung zu neutrali sieren.

Äthylacetat (200 ml) wird zu BOC-Lys(Z-Cl)-OH · TBA (70 g, 0,143 M) zugegeben, und dann wird zweimal mit 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Die Äthylacetatschicht wird über wasser freiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. DMF (100 ml) wird zum erhaltenen öligen Material zugegeben, um eine DMF-Lösung aus BOC-Lys(Z-Cl)-OH zu ergeben.

Zu der obigen neutralisierten DMF-Lösung gibt man HOBT (19,3 g), DMF-Lösung von BOC-Lys(Z-Cl)-OH und WSCI (26,2 ml, 0,143 M) zu und rührt bei Zimmertemperatur über Nacht. DMF wird im Vakuum abdestilliert, dann wird Äthylacetat (400 ml) zu dem Rückstand zugegeben und dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat gewaschen, zweimal mit 1 N-HCl und zwei mal mit Wasser. Die organische Schicht wird über wasser freiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzen triert. Äther und Hexan werden zu dem Rückstand zugegeben, das so ausgefallene Material wird gesammelt und aus Äthyl acetat-Methanol-Hexan umkristallisiert. Man erhält die Sub stanz [19] (104 g, Ausbeute: 94,6%).
Schmelzpunkt: 128-130°C.
TLC: Rf₁=0,51, Rf₂=0,88.

Elementaranalyse [C₄₄H₅₈O₁₀N₅Cl]:
gefunden: C 61,96, H 7,02, N 7,91%;
berechnet: C 62,00, H 6,86, N 8,22%.

Aminosäureanalyse [1 µM/6 N-HCl 0,3 ml, 105°C, 20 Stunden]:
Ser 0,92 (1), Gly 0,98 (1), Leu 1, Lys 0,99 (1).

(20) P(65-68): BOC-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OH [20]

Methanol (600 ml) wird zur Substanz [19] (85,3 g) zugegeben, unter Rühren bei 5°C wird 1 N-NaOH (120 ml) zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 3 Stunden lang gerührt. Nach der Zugabe von 1 N-HCl (20 ml) bei 5°C wird das Methanol im Vakuum abdestilliert. 1 N-HCl (100 ml) wird zu der wäßrigen Lösung des Rückstands bei 5°C zugegeben, und dann wird mit Chloroform (500 ml) extrahiert. Die Chloroformschicht wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Hexan wird zu dem Rückstand zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt und aus Äthylacetat umkristallisiert, und man erhält die Sub stanz [20] (66,21 g, Ausbeute: 87%).
Schmelzpunkt: 156-158°C.
TLC: Rf₂=0,63.

Elementaranalyse [C₃₇H₅₂O₁₀N₅Cl]:
gefunden: C 58,49, H 6,95, N 9,09%;
berechnet: C 58,30, H 6,88, N 9,19%.

Aminosäureanalyse [1 µM/0,3 ml, 6 N-HCl, 105°C, 20 Stunden]:
Ser 0,92 (1), Gly 0,97 (1), Leu 1, Lys 0,99 (1).

(21) P(64-68): BOC-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OH [21]

Methylenchlorid (300 ml) wird zur Substanz [20] (66,2 g, 87 mM) zugegeben, TFA (250 ml) wird bei 5°C zugegeben, dann wird bei Zimmertemperatur 45 Stunden gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert, und Äther wird zu dem Rückstand zuge geben. Der Niederschlag wird gesammelt und in DMF (100 ml) gelöst, dann wird durch Zugabe von NMM bei 5°C neutrali siert. DMF (500 ml) wird erneut zur Bildung eines Nieder schlags zugegeben. BOC-Glu(OBzl)-OSU (50 g, 113 mM) und HOBT (1,53 g, 11,3 mM) werden zugegeben, dann wird mit NMM neutralisiert und bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in Wasser gegossen. Der so erhaltene Niederschlag wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Umkristallisation erfolgt zweimal aus Acetonmethanol, und man erhält die Substanz [21] (63,85 g, Ausbeute: 73,5%).
Schmelzpunkt: 165-167°C (zers.).
TLC: Rf₄=0,72.

Elementaranalyse [C₄₉H₆₅O₁₄N₆Cl]:
gefunden: C 59,61, H 6,76, N 8,31%;
berechnet: C 59,00, H 6,57, N 8,42%.

Aminosäureanalyse [0,927 mg/0,3 ml 6 N-HCl, 105°C, 24 h]:
Ser 0,92 (1), Glu 0,99 (1), Gly 0,97 (1), Leu 1, Lys 0,99 (1).

(22) P(62-63): BOC-Ser(Bzl)-His-NHNH₂ [22]

THF (150 ml), H-His-OMe · 2HCl (31,5 g, 0,13 M) und HOBT (17,6 g, 0,13 M) werden zu BOC-Ser(Bzl)-OH (37 g, 0,125 M) zugegeben. WSCI (23,8 ml, 0,13 M) wird zugegeben, DMF (150 ml) wird zugegeben, und es wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. HOBT (4,4 g) und WSCI (6 ml) werden erneut zugegeben, dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Die Lösungsmittel werden im Vakuum abdestilliert. Das zurückbleibende ölige Material wird in Äthylacetat gelöst und dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesium sulfat wird konzentriert. Hexan wird zu dem Rückstand zuge geben, der Niederschlag wird gesammelt und aus Äthylacetat äther-Hexan umkristallisiert, wobei man rohes BOC-Ser(Bzl)- His-OMe erhält (TLC: Rf₃=0,56) (46,1 g).

Das obige Produkt (44,6 g) wird in DMF (300 ml) gelöst. Hydrazinhydrat (100%) (100 ml) wird zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird achtmal mit Äthylacetat extrahiert, und der Extrakt wird mit einer geringen Menge an Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesium sulfat getrocknet. Die Lösung wird im Vakuum konzentriert, Hexan wird zu dem Rückstand zugegeben, und der Niederschlag wird gesammelt, welcher durch Silicagelchromatographie [Ent wickler: Chloroform - Methanol - Äthylacetat (5 : 0-1 : 5)] gereinigt wird. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt, im Vakuum getrocknet und aus Benzol-Hexan (geringe Menge) umkristallisiert. Nach dem Stehenlassen in einem Kühlschrank werden die ausgefallenen Kristalle zweimal aus Äthylacetat - Methanol - Hexan umkristallisiert, und man erhält die Substanz [22].
Schmelzpunkt: 125-129°C.
TLC: Rf₄=0,70, Rf₇=0,14.

Elementaranalyse [C₂₁H₃₀O₅N₆]:
gefunden: C 56,30, H 6,98, N 18,54%;
berechnet: C 56,49, H 6,77, N 18,82%.

(23) P(62-68): BOC-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OH [23]

Eine Dioxanlösung (52 ml) von 4,32 N-HCl und Isoamylnitril (20 ml) wird zu der Substanz [22] (33,5 g), gelöst in DMF (200 ml) bei -50°C zugegeben, und bei -20°C 10 Minuten lang gerührt. Et₃N (31,6 ml) werden bei -50°C zugegeben.

Methylenchlorid (20 ml) wird zur Substanz [21] (63,85 g, 64 mM) zugegeben. TFA (200 ml) wird bei 5°C zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 50 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert, Äther wird zu der ver bleibenden öligen Substanz zugegeben, und der so gebildete Niederschlag wird gesammelt, welcher in DMF (200 ml) gelöst und dann mit NMM bei 5°C neutralisiert wird.

Neutralisierte DMF-Lösung wird zu der obigen mit Triäthyl amin behandelten Lösung zugegeben, und dann wird in einem Kühlschrank über Nacht und bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in Methanol gelöst. Die Lösung wird in Wasser gegossen, dann wird der gebildete Niederschlag mit Wasser gewaschen und getrocknet. Umkristallisation aus DMF-Äther und zweimaliges Waschen mit Methanol ergibt die Substanz [23] (59,16 g, Ausbeute: 60,1%).
Schmelzpunkt: 209-213°C (zers.).
TLC: Rf₄=0,66.

Elementaranalyse [C₆₅H₈₃O₁₇N₁₀Cl]:
gefunden: C 59,43, H 6,58, N 10,67%;
berechnet: C 59,51, H 6,38, N 10,68%.

Aminosäureanalyse [1,549 mg/0,5 ml 6 N-HCl, 105°C, 21 h]:
Ser 1,82 (2), Glu 1,01 (1), Gly 0,98 (1), Leu 1, Lys 1,01 (1), His 0,94 (1).

(24) P(62-84): BOC-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-- Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys-(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [24]

TFA (250 ml) werden zu der Substanz [17] (75,35 g, 25,5 mM) zugegeben, und bei Zimmertemperatur wird 60 Minuten lang gerührt. TFA wird im Vakuum entfernt, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und in NMP (500 ml) und DMF (500 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wird in Eis/5%iges Natriumbicarbonat gegossen, der Nieder schlag wird gesammelt und mit Wasser und Methanol gewaschen. Der Niederschlag wird in NMP (1 l) und DMF (1 l) gelöst. 2,4-Dinitrophenol (5,61 g, 1,2molarer Überschuß), HOBT (4,08 g, 1,2molarer Überschuß), die Substanz [23] (40,16 g, 1,2molarer Überschuß) und WSCI (5,6 ml, 1,2molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmer temperatur 4 Tage lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in 5%iges Natriumbicarbonat-Eis gegossen, und der Niederschlag wird gesammelt, welcher mit Wasser, heißem Methanol und zwei mal mit Methanol gewaschen wird, und man erhält die Substanz [24] (93,53 g, Ausbeute: 88,4%).

Aminosäureanalyse: Asp 2,67 (3), Thr 0,81 (1), Ser 1,37 (3), Glu 2,59 (3), Gly 0,76 (1), Ala 2,68 (3), Val 2, Leu 1,74 (2), Lys 3,66 (4), His 0,66 (1).

(25) P(61-84): BOC-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(-OBzl)-Ala- Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys-(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [25]

TFA (150 ml) wird zu der Substanz [24] (41,5 g, 10 mM) zuge geben, bei Raumtemperatur wird 60 Minuten lang gerührt, und das TFA wird entfernt. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt, welcher in DMF (300 ml) und NMP (500 ml) gelöst wird. Die Lösung wird in 5%iges Natriumbicarbonat-Eis gegossen, der Niederschlag wird gesammelt und mit Wasser und Methanol gewaschen. DMF (700 ml) und NMP (600 ml) werden zum Auflösen zugegeben. 2,4-Dini trophenol (2,2 g, 1,2molarer Überschuß), BOC-Glu(OBzl)- OSU (6,08 g, 1,4molarer Überschuß), HOBT (0,23 g, 0,14molarer Überschuß) und NMM (1,52 ml, 1,4molarer Überschuß) werden hinzugefügt, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. BOC-Glu(OBzl)-OSU (0,87 g, 9,2molarer Über schuß) und NMM (0,22 ml, 0,2molarer Überschuß) werden zuge geben, und dann wird weiter über Nacht gerührt. Das Reaktions gemisch wird in Eis/5%iges Natriumbicarbonat gegossen, der Niederschlag wird gesammelt und mit Wasser und Methanol gewaschen. DMF (700 ml) und NMP (600 ml) werden zum Auflösen des Niederschlags zugegeben. 2,4-Dinitrophenol (2,2 g, 1,2molarer Überschuß), BOC-Glu(OBzl)-OSU (6,08 g, 1,4molarer Überschuß), HOBT (0,23 g, 0,14molarer Überschuß) und NMM (1,52 ml, 1,4molarer Überschuß) werden hinzugegeben, und bei Zimmertemperatur wird über Nacht gerührt. BOC-Glu(OBzl)- OSU (0,87 g, 0,2molarer Überschuß) und NMM (0,22 ml, 0,2molarer Überschuß) werden weiter zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, und über Nacht wird gerührt. Das Reaktions gemisch wird in Eis/5%ige Natriumbicarbonatlösung gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, vollständig mit Wasser gewaschen und dann dreimal mit heißem Methanol gewaschen, wobei man die Substanz [25] (40,7 g, Ausbeute: 93,2%) erhält.

Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110°C, 48 Stunden]:
Asp 2,66 (3), Thr 0,85 (1), Ser 1,56 (3), Glu 3,14 (4), Gly 0,71 (1), Ala 2,65 (3), Val 2, Leu 1,73 (2), Lys 3,67 (4), His 0,63 (1).

(26) P(59-60): BOC-Leu-Val-OBzl [26]

Äthylacetat (100 ml) wurde zu H-Val-OBzl · TosoH (17,8 g, 47 mM) zugegeben, es wird mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Äthylacetat entfernt. Der Rückstand wird in DMF (100 ml) gelöst. BOC-Leu-OH · H₂O (11,7 g, 56,4 mM), HOBT (9,3 g, 1,2molarer Überschuß) und WSCI (10,3 ml, 1,3molarer Überschuß) werden hinzugegeben, und bei Zimmer temperatur wird über Nacht gerührt. Das DMF wird entfernt, der Rückstand wird in Äthylacetat (300 ml) gelöst und mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat- Hexan umkristallisiert, und man erhält die Substanz [26] (17,55 g, Ausbeute: 88,8%).
TLC: Rf₆=0,85.

(27) P(58-60): BOC-Val-Leu-Val-OBzl [27]

TFA (50 ml) wird zu der Substanz [26] (17,2 g, 41 mM) zuge geben, und dann wird bei Zimmertemperatur gerührt und das TFA entfernt. Äther wird zu dem Rückstand gegeben, der Niederschlag wird gesammelt und in DMF (60 ml) gelöst. HOBT (7,7 g, 1,2molarer Überschuß), BOC-Val-OH (1,07 g, 1,2molarer Überschuß) und WSCI (9,0 ml, 1,2molarer Überschuß) werden zugegeben, dann wird der pH-Wert durch Zugabe von NMM auf 7 eingestellt, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird entfernt, der Rückstand wird in Äthylacetat (300 ml) gelöst und mit 5%iger Natriumbicar bonatlösung, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird zweimal aus Äthylacetat- Hexan umkristallisiert, und man erhält die Substanz [27] (17,38 g, Ausbeute: 81,6%).
Schmelzpunkt: 149-152°C.
TLC: Rf₅=0,82.[α]=-32,36 (c=1,0, DMF).

Elementaranalyse [C₂₈H₄₅O₆N₃]:
gefunden: C 64,80, H 8,81, N 8,20%;
berechnet: C 64,71, H 8,73, N 8,09%.

(28) P(57-60): BOC-Asn-Val-Leu-Val-Obzl [28]

TFA (50 ml) wird zu der Substanz [27] (17,15 g, 33 mM) zugegeben, bei Zimmertemperatur 25 Minuten lang gerührt, und das TFA wird entfernt. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt und in DMF (100 ml) gelöst. HOBT (0,62 g, 0,14molarer Überschuß) und BOC-Asn-ONP (16,32 g, 1,4molarer Überschuß) werden zugegeben, der pH- Wert wird durch Zugabe von NMM auf 7 eingestellt, und dann wird 2 Tage lang bei Zimmertemperatur gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in 5%iges Natrium bicarbonat-Eis gegossen. Der Niederschlag wird in Chloroform gelöst und mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird zweimal aus Äthanoläther umkristallisiert, und man erhält die Substanz [28] (13,82 g, Ausbeute: 79,5%).
TLC: Rf₂=0,70.

Elementaranalyse [C₃₂H₅₁O₈N₅]:
gefunden: C 60,83, H 8,19, N 11,09%;
berechnet: C 60,64, H 8,11, N 11,05%.

(29) P(57-60): BOC-Asn-Val-Leu-Val-OH [29]

Die Substanz [28] (13,2 g, 25 mM) wird in Äthanol (50 ml) und DMF (60 ml) gelöst. 5% Pd/C (1 g) wird zugegeben, und dann wird drei Stunden hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird zweimal aus Äthanol-Äther umkristallisiert, wobei man die Substanz [29] (9,70 g, Ausbeute: 71,4%) erhält.
TLC: Rf₂=0,56.
Aminosäureanalyse: Asp 1,02 (1), Val 1,95 (2), Leu 1 (1).

Elementaranalyse [C₂₅H₄₅O₈N₅]:
gefunden: C 55,02, H 8,13, N 13,06%;
berechnet: C 55,23, H 8,34, N 12,88%.

(30) P(57-84): BOC-Asn-Val-Leu-Val-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(B-zl)-Leu- Gly(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Le-u-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala- Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [30]

TFA (150 ml) wird zu der Substanz [25] (39,75 g, 9,1 mM) zu gegeben, und bei Zimmertemperatur wird während 60 Minuten gerührt. TFA wird entfernt, und zu dem Rückstand wird Äther zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt und in DMF (600 ml) und NMP (600 ml) gelöst. Die Lösung wird in Eis-5%ige- Natriumbicarbonatlösung gegossen, und der Niederschlag wird filtriert und dreimal mit Wasser und einmal mit Methanol gewaschen. NMP (1,2 l) und DMF (1,2 l) werden zum Auflösen des Niederschlags zugegeben. HOBT (1,60 g, 1,3molarer Überschuß), 2,4-Dinitrophenol (2,18 g, 1,3molarer Über schuß), die Substanz [29] (6,43 g, 1,3molarer Überschuß) und WSCI (4,32 ml, 2,6molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 2 Tage gerührt. Weitere Substanz [29] (0,99 g, 0,2molarer Überschuß), gelöst in DMF (100 ml), wird zugegeben, und bei Zimmertemperatur wird über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in 5%ige Natriumbicarbonatlösung/Eis gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, in DMF (100 ml) suspendiert und erhitzt. Nach dem Kühlen des Gemisches werden die unlöslichen Stoffe abfiltriert. Die unlöslichen Stoffe werden mit Methanol und Äthanol unter Erhitzen gleich wie oben behandelt, wobei man die Substanz [30] erhält (42,25 g, Ausbeute: 97,2%).

Aminosäureanalyse: Asp 3,34 (4), Thr 0,93 (1), Ser 1,60 (3), Glu 3,24 (4), Gly 0,85 (1), Ala 3, Val 3,39 (4), Leu 2,58 (3), Lys 4,24 (4), His 0,79 (1).

(31) P(56-84): BOC-Asp(OBzl)-Asn-Val-Leu-Val-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His- Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-C-l)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu- Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [31]

TFA (150 ml) wird zu der Substanz [30] (28,7 g, 6 mM) gegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 50 Minuten lang gerührt. TFA wird entfernt, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und über NaOH über Nacht getrocknet. Der Niederschlag wird in DMF (300 ml) und HMP (500 ml) gelöst. HOBT (0,16 g, 0,2molarer Über schuß) und BOC-Asp(OBzl)-OSU (5,04 g, 2molarer Überschuß) werden zugegeben, und der pH-Wert wird durch Zugabe von NMM auf 7,0 eingestellt, und es wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Weiteres BOC-Asp(OBzl)-OSU (2,50 g, äquimolar) wird zugegeben, und es wird über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eiswasser gegossen, der Nieder schlag wird gesammelt, in Wasser gewaschen, und dann wird Methanol zugegeben und unter Hitze behandelt. Nach dem Kühlen werden die unlöslichen Stoffe abfiltriert. Das obige Erhitzen wird dreimal wiederholt, wobei man die Substanz [31] (27,75 g, Ausbeute: 92,5%) erhält.

Aminosäureanalyse: Asp 4,00 (5), Thr 0,92 (1), Ser 1,69 (3), Glu 3,57 (4), Gly 0,81 (1), Ala 3, Val 3,22 (4), Leu 2,62 (3), Lys 4,12 (4), His 0,62 (1).

(32) P(55-84): BOC-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Asn-Val-Leu-Val-Glu(OBzl)-Ser(Bzl)-His- Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-C-l)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu- Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [32]

TFA (150 ml) wird zu Substanz [31] (27,50 g, 5,5 mM) gegeben, und bei Zimmertemperatur wird während 55 Minuten gerührt. TFA wird entfernt, Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, und der Niederschlag wird gesammelt und über NaOH während 2 Tagen getrocknet. Der Niederschlag wird in DMF (300 ml) und NMP (500 ml) gelöst. 2,4-Dinitrophenol (1,01 g, äquimolare Menge), HOBT (0,11 g, 0,15molarer Überschuß) und BOC-Glu(OBzl)-OSU (3,10 g, 1,3molarer Überschuß) werden hinzugefügt, und bei Zimmertemperatur wird über Nacht gerührt. Weiteres BOC-Glu(OBzl)-OSU (3,10 g, 1,3molarer Überschuß) wird zugegeben, und es wird 2 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eis-5%iges Natriumbicarbonat gegossen. Der Niederschlag wird zweimal mit 5%igem Natrium bicarbonat und dreimal mit Wasser gewaschen. Methanol wird zu dem Niederschlag zugegeben, dann wird erhitzt, und die unlöslichen Stoffe werden nach dem Abkühlen abfiltriert. Die obige Erwärmungsbehandlung wird dreimal wiederholt, und man erhält die Substanz [32] (26,77 g, Ausbeute: 93,3%).

Aminosäureanalyse: Asp 4,11 (5), Thr 0,92 (1), Ser 1,59 (3), Glu 3,99 (5), Gly 0,83 (1), Ala 3, Val 3,28 (4), Leu 2,49 (3), Lys 4,08 (4), His 0,71 (1).

(33) P(46-84): BOC-Ala-Gly-Ser(Bzl)-Gln-Arg(Tos)-Pro- Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Asn-Val-Leu-Val-Glu-(OBzl)-Ser(Bzl)-His- Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-C-l)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu- Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [46]

TFA (80 ml) wird zu der Substanz [32] (10,44 g, 2 mM) gegeben, und bei Zimmertemperatur wird 60 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum entfernt, und Äther wird zu dem Rückstand unter Bildung eines Präzipitats zugegeben, welches in DMF (160 ml) und NMP (160 ml) gelöst wird. Die Substanz [45] (4,28 g, 1,15molarer Überschuß) der Formel BOC-Ala- Gly-Ser(Bzl)-Gln-Arg(Tos)-Pro-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)- OH, HOBT (0,32 g, 1,2molarer Überschuß) und WSCI (0,44 ml, 1,2molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 2 Tagen gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt. Eiswasser wird zu dem Rückstand zugegeben, und dann wird der Niederschlag filtriert, welcher nach der Zugabe von Methanol (200 ml) erhitzt wird. Nach dem Kühlen werden die unlöslichen Stoffe gesammelt. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt, wobei man die Substanz [46] (12,17 g, Ausbeute: 87,4%) erhält.

(34) h-PTH [46-84]

Die Substanz [46] (4,18 g, 0,6 mM und Anisol (10 ml) werden in HF (60 ml) bei 0°C zugegeben, und während 60 Minuten wird gerührt. Nach der Reaktion wird HF im Vakuum abdestilliert, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt, in 10%iger Essigsäure (50 ml) gelöst, und dann wird er durch eine Säule von Dowex® X1 (Acetatform, 2,5×24 cm) geleitet. Das Eluat wird lyophilisiert, wobei man das Rohprodukt (2,82 g) erhält, welches in 8 M Harnstoff lösung (pH 9,0, 50 ml) gelöst wird und bei Zimmertemperatur während 60 Minuten stehen gelassen wird. Die Lösung wird auf eine Säule (2,0×33 cm) von CM-Cellulose gegeben, die mit 8 M Harnstofflösung gepackt ist, und dann wird gemäß der linearen Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) bis 0,3 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 7,5-ml-Fraktionen fraktioniert, welche gemäß dem Folin-Lowry-Verfahren (500 nm) geprüft werden, wobei man die Fraktionen Nr. 1 bis 22 (Fraktion C₁), die Fraktionen Nr. 23 bis 45 (Fraktion C₂), die Fraktionen Nr. 46 bis 80 (Fraktion C₃) und die Fraktionen Nr. 81 bis 120 (Fraktion C₄) erhält. Alle Fraktionen werden durch eine Säule aus Sephadex® LH-20 zum Entsalzen geleitet. Die Fraktion C₁ wird durch eine Säule (3,0×120 cm) geleitet, wobei man je 7,5-ml-Fraktionen entnimmt und die Fraktionen Nr. 28 bis 42 (Fraktion C₁L) erhält. Die Fraktion C₂ wird durch eine Säule (3,4×120 cm) geleitet, wobei man je 7,6-ml-Fraktionen entnimmt und die Fraktionen Nr. 33 bis 40 (Fraktion C₂L₁) und Nr. 41 bis 62 (Fraktion C₂L₂) erhält. Die Fraktion C₃ wird durch eine Säule (3,0×120 cm) geleitet, je 6,0-ml-Fraktionen werden entnommen, und man erhält die Fraktionen Nr. 31 bis 40 (Fraktion C₃L₁) und Nr. 41 bis 51 (Fraktion C₃L₂). Die Fraktion C₄ wird durch eine Säule (3,4×120 cm) geleitet, und es werden je 7,5-ml- Fraktionen entnommen, wobei man die Fraktionen Nr. 35 bis 48 (Fraktion C₄L) erhält. Jeder Teil wird lyophilisiert, und man erhält die Fraktionen C₁L (312 mg), C₂L₁ (142,3 mg), C₂L₂ (1380 mg), C₃L₁ (104 mg), C₃L₂ (510 mg) und C₄L (130 mg).

Die obige Fraktion C₂L₂ (1380 mg) wird in 0,1 N Essigsäure (13 ml) gelöst und auf eine Säule (4,3×6,0 cm) von CM- Cellulose gegeben und gemäß der linearen Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) bis 0,3 M Ammo niumacetat (pH 4,5, 500 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 7,6-ml-Fraktionen fraktioniert, wobei man die Fraktionen Nr. 40 bis 50 (Fraktion C₂L₂-C₁) und Nr. 53 bis 77 (Frak tion C₂L₂-C₂) erhält. Jede Fraktion wird durch Sephadex® LH- 20 zum Entsalzen geleitet. Die Fraktion C₂L₂-C₁ wird auf eine Säule (2,9×120 cm) gegeben, und das Eluat wird in je 8,0-ml-Fraktionen fraktioniert, wobei man die Fraktionen Nr. 26 bis 30 (Fraktion C₂L₂-C₁L₁) und Nr. 31 bis 39 (Fraktion C₂L₂-C₁L₂) erhält. Die Fraktion C₂L₂-C₂ wird durch eine Säule (3,4×120 cm) geleitet, und es werden je 8-ml-Frak tionen entnommen, wobei man die Fraktionen Nr. 34 bis 44 (Fraktionen C₂L₂-C₂L₁) und Nr. 45 bis 53 (Fraktion C₂L₂-C₂L₂) erhält. Alle Fraktionen werden lyophilisiert, und man erhält die Fraktionen C₂L₂-C₁L₁ (79,0 mg), C₂L₂-C₁L₂ (455 mg), C₂L₂-C₂L₁ (157,3 mg) und C₂L₂-C₂L₂ (551,7 mg).

Aminosäureanalyse der Fraktion C₂L₂-C₂L₂: Asp 4,65 (5), Thr 0,97 (1), Ser 3,47 (4), Glu 5,99 (6), Pro 0,93 (1), Gly 1,96 (2), Ala 4 (4), Val 3,97 (4), Leu 3,01 (3), Lys 6,13 (6), His 0,93 (1), Arg 1,96 (2).

Die Fraktion C₂L₂-C₂L₂ wird in 0,1 N Essigsäure (5 ml) gelöst und auf eine Säule (4,2×7,0 cm) aus CM-Cellulose gegeben und gemäß der linearen Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) bis 0,3 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 8,0-ml-Frak tionen fraktioniert, wobei man die Fraktionen Nr. 39 bis 45 (Fraktion C₂L₂-C₂L₂-C) erhält, welche durch eine Säule (2,9×120 cm) von Sephadex® LH-20 zum Entsalzen geleitet wird. Das Eluat wird in je 8-ml-Fraktionen fraktioniert, und man erhält die Fraktionen Nr. 24 bis 30 (Fraktion C₂L₂-C₂L₂-CL₁), die Fraktionen Nr. 31 bis 35 (Fraktion C₂L₂-C₂L₂-CL₂) und die Fraktionen Nr. 36 bis 39 (Fraktion C₂L₂-C₂L₂-CL₃). Jede Fraktion wird lyophilisiert, und man erhält die Frak tionen C₂L₂-C₂L₂-CL₂ (200 mg) und C₂L₂-C₂L₂-CL₁) (h-PTH [46-84], 94,9 mg).
TLC: Rf₉=0,76.

Aminosäureanalyse: Asp 4,86 (5), Thr 0,99 (1), Ser 3,58 (4), Glu 6,17 (6), Pro 0,96 (1), Gly 1,97 (2), Ala 4 (4), Val 4,02 (4), Leu 2,93 (3), Lys 6,05 (6), His 0,90 (1), Arg 1,87 (2).

Beispiel 2 [Tyr⁴⁵] h-PTH (45-84]. H-Tyr-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Gl-u- Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu--Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH (1) P(45-84): BOC-Tyr(Bzl-Cl₂)-Ala-Gly-Ser(Bzl)-Gln-Arg(Tos)-Pro- Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Asn-Val-Leu-Val-Glu-(OBzl)-Ser(Bzl)-His- Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-C-l)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)Val-Leu- Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [47]

TFA (60 ml) wird zu der Substanz [46] (6,27 g, 0,9 mM) in Beispiel 1 zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 60 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum entfernt, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird filtriert, und man erhält die de-BOC-Verbindung (6,30 g).

Die obige de-BOC-Verbindung (2,10 g, 0,3 mM) wird in DMF (35 ml) und NMP (35 ml) gelöst. BOC-Tyr(Bzl-Cl₂)-OH (0,16 g, 1,2molarer Überschuß), HOBT (0,05 g, 1,2molarer Über schuß) und WSCI (0,07 ml, 1,2molarer Überschuß) werden bei 0°C zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird entfernt, und Eiswasser wird zu dem Rück stand zugegeben. Der Niederschlag wird filtriert, und man erhält die Substanz [47] (2,00 g).

(2) [Tyr⁴⁵]-h-PTH [45-84]

Die Substanz [47] (2,00 g, 0,27 mM) und Anisol (1,0 ml) werden zu HF (20 ml) bei 0°C gegeben, und dann wird 60 Minuten lang gerührt. HF wird im Vakuum abdestilliert, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der so gebildete Nieder schlag wird gesammelt, in 0,1 N Essigsäure (20 ml) gelöst und auf eine Säule aus Dowex® X1 (Acetatform, 2,5×15 cm) gegeben. Das Eluat wird lyophilisiert, und man erhält das Rohprodukt (1,37 g).

Das Rohprodukt wird in 8 M Harnstofflösung (pH 9,5, 50 ml) gelöst und bei Zimmertemperatur während 60 Minuten stehen gelassen. Die Lösung wird auf eine Säule (4,3×8,0 cm) von CM-Cellulose, die mit 8 M Harnstofflösung gepackt ist, gegeben, und dann wird mittels linearer Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 400 ml) bis 0,3 M Ammonium acetat (pH 4,5, 400 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 6,5- ml-Fraktionen fraktioniert. Alle Fraktionen werden gemäß dem Folin-Lowry-Verfahren (500 nm) geprüft, wobei man die Fraktionen Nr. 30 bis 43 (Fraktion C₁), die Fraktionen Nr. 51 bis 68 (Fraktion C₂), die Fraktionen Nr. 69 bis 83 (Frak tion C₃) und die Fraktionen Nr. 84 bis 100 (Fraktion C₄) erhält. Alle Fraktionen werden zum Entsalzen durch Sephadex® LH-20 geleitet. Die Fraktion C₁ wird auf eine Säule (3,4×120 cm) gegeben, wobei je 7,5-ml-Fraktionen entnommen werden, und man erhält die Fraktionen Nr. 25 bis 41 (Fraktion C₁L). Die Fraktion C₂ wird auf eine Säule (3,0×120 cm) gegeben, wobei je 7,5-ml-Fraktionen entnommen werden, und man erhält die Fraktionen Nr. 25 bis 36 (Fraktion C₂L). Die Fraktion C₃ wird auf eine Säule (2,9×120 cm) gegeben, wobei je 8,0-ml-Fraktionen entnommen werden, und man erhält die Fraktionen Nr. 24 bis 27 (Fraktion C₃L₁) und Nr. 28 bis 38 (Fraktion C₃L₂). Die Fraktion C₄ wird auf eine Säule (2,9×95 cm) gegeben, wobei je 7,6-ml-Fraktionen entnommen werden, und man erhält die Fraktionen Nr. 20 bis 25 (Fraktion C₄L₁) und Nr. 26 bis 30 (Fraktion C₄L₂). Alle Fraktionen werden lyophilisiert, und man erhält die Fraktionen C₁L (521,6 mg), C₂L (230,2 mg), C₃L₁ (41,8 mg), C₃L₂ (222,4 mg), C₄L₁ (74,3 mg) und C₄L₂ (48,9 mg).

Die obige Fraktion C₂L wird in 0,1 N Essigsäure (3 ml) gelöst und auf eine Säule (2,1×25 cm) aus CM-Cellulose gegeben und gemäß linearer Gradientenelution mittels 0,01 M Ammoniumacetatlösung (pH 4,5, 300 ml) bis 0,3 M Ammonium acetat (4,5, 300 ml) eluiert. Die Eluate werden in je 8,0- ml-Fraktionen fraktioniert, wobei man die Fraktionen Nr. 30 bis 36 (Fraktion C₂L-C) erhält, welche durch eine Säule (2,9×90 cm) aus Sephadex® LH-20 zum Entsalzen gegeben wird. Das Eluat wird in je 8,0-ml-Fraktionen fraktioniert, und die Fraktionen Nr. 20 bis 29 werden lyophilisiert, wobei man [Tyr⁴⁵]-h-PHT [46-84] (163,3 mg) erhält.
TLC: Rf₉=0,75.

Aminosäureanalyse: Asp 4,86 (5), Thr 1,02 (1), Ser 3,51 (4), Glu 6,05 (6), Pro 0,93 (1), Gly 1,90 (2), Ala 4 (4), Val 4,00 (4), Leu 2,93 (3), Tyr 0,88 (1), Lys 6,02 (6), His 0,86 (1), Arg 1,81 (2).

Beispiel 3 [Cys(Acm)⁴⁵]-h-PTH (45-84): H-Cys(Acm)-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu- Val-Glu-Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp--Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln- OH (1) P(45-84): BOC-Cys(Acm)-Ala-Gly-Ser(Bzl)-Gln-Arg(Tos)-Pro- Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-Glu(OBzl)-Asp(OBzl)-Asn-Val-Leu-Val-Glu-(OBzl)-Ser(Bzl)-His- Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-Glu(OBzl)-Ala-Asp(OBzl)-Lys(Z-C-l)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu- Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OBzl [48]

Die verbleibende de-BOC-Verbindung (4,20 mg, 0,6 mM) von Beispiel 2 wird in einem Gemisch aus DMF (70 ml) und NMP (70 ml) gelöst. HOBT (0,10 g, 1,2molarer Überschuß), BOC- Cys(Acm)-OH (0,20 g, 1,2molarer Überschuß) und WSCI (0,13 ml, 1,2molarer Überschuß) werden bei 0°C zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum abdestilliert, Eis-Wasser wird zu dem Rück stand zugegeben, und der Niederschlag wird gesammelt. Der Niederschlag wird in Äthanol suspendiert, erhitzt, anschließend abgekühlt, und das unlösliche Material wird ab filtriert. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt, wobei man die Substanz [48] (4,07 g, Ausbeute: 95,0%) erhält.

(2) [Cys(Acm)⁴⁵] h-PTH [45-84]

Die Substanz [48] (4,00 g, 0,57 mM) und Anisol (10 ml) werden bei 0°C zu wasserfreiem HF (60 ml) zugegeben, und dann wird 60 Minuten lang gerührt. HF wird im Vakuum abdestilliert, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Nieder schlag wird in 20%iger Essigsäure (40 ml) gelöst und durch eine Säule aus Dowex® X1 (Acetatform, 2,8×35 cm) gegeben. Das lyophilisierte Eluat wird in 8 M Harnstofflösung gelöst, dann wird der pH-Wert durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf 9,0 eingestellt, und dann wird 30 Minuten stehen gelassen. Die Lösung wird auf eine Säule (3,4×35 cm) aus CM-Cellulose, die mit 8 M Harnstofflösung gepackt ist, gegeben, und dann wird mittels linearer Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) bis 0,3 M Ammonium acetat (pH 4,5, 700 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 8-ml- Fraktionen fraktioniert, und dann wird gemäß dem Folin- Lowry-Verfahren (500 nm) geprüft, wobei man die Fraktionen Nr. 25 bis 35 (Fraktion C₁), die Fraktionen Nr. 36 bis 45 (Fraktion C₂) und die Fraktionen Nr. 46 bis 84 (Fraktion C₃) erhält. Alle Fraktionen werden durch Sephadex® LH-20 zum Ent salzen geleitet. Die Fraktion C₂ wird durch eine Säule (3,0×120 cm) geleitet, und dann werden je 8,0-ml-Fraktionen entnommen, wobei man die Fraktionen Nr. 27 bis 33 (Fraktion C₂L₁) und Nr. 34 bis 40 (Fraktion C₂L₂) erhält. Die Frak tion C₃ wird durch eine Säule (3,4×120 cm) geleitet, und es werden je 8,0-ml-Fraktionen entnommen, wobei man die Fraktionen Nr. 35 bis 47 (Fraktion C₃L₁) und Nr. 48 bis 53 (Fraktion C₃L₂) erhält. Alle Fraktionen werden lyophilisiert, und man erhält die Fraktionen C₂L₁ (148 mg), C₂L₂ (620 mg), C₃L₁ (212 mg) und C₃L₂ (605 mg).

Die obige Fraktion C₂L₂ wird in 0,1 N Essigsäure (6 ml) gelöst und auf eine Säule (5,0×12 cm) von CM-Cellulose gegeben, und dann wird gemäß der linearen Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 400 ml) bis 0,3 M Ammo niumacetat (pH 4,5, 400 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 6,0-ml-Fraktionen fraktioniert, wobei man die Fraktionen Nr. 110 bis 126 (Fraktion C₂L₂-C) erhält, die durch eine Säule (4,0×120 cm) aus Sephadex® LH-20 zum Entsalzen gegeben wird. Das Eluat wird in je 8,0-ml-Fraktionen fraktioniert. Die Fraktionen Nr. 38 bis 54 (Fraktion C₂L₂-CL) werden lyophilisiert, und man erhält [Cys(Acm)⁴⁵] h-PTH [45-84] (246,8 mg).
TLC: Rf₉=0,74.

Aminosäureanalyse: Asp 4,91 (5), Thr 0,98 (1), Ser 3,50 (4), Glu 6,11 (6), Pro 0,98 (1), Gly 1,98 (2), Ala 4 (4), Val 4,04 (4), Cys 0,42 (0,5), Leu 2,90 (3), Lys 5,99 (6), His 0,87 (1), Arg 1,87 (2).

Beispiel 4 [Cys⁴⁵] h-PTH (45-84): H-Cys-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Gl-u- Ser-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu--Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH

[Cys(Acm)⁴⁵] h-PTH [45-84] (88 mg, 0,02 mM), erhalten in Beispiel 3, wird in 50%iger Essigsäure (2 ml) gelöst. Quecksilber-(II)-Acetat (52,24 mg, 0,18 mM) wird zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 70 Minuten gerührt. Weiteres β-Mercaptoäthanol (3,4 ml) wird zugegeben, und es wird 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert, und die überstehende Lösung wird auf eine Säule (3,2×42 cm) aus Sephadex® LH-20 gegeben, dann wird mit 0,1 M Essigsäure eluiert. Das Eluat wird in je 5-ml-Fraktionen fraktioniert, und dann werden die ninhydrin-positiven Fraktionen Nr. 9 bis 14 gesammelt und lyophilisiert, und man erhält [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] (76,1 mg).
TLC: Rf₉=0,73.

Beispiel 5 (1) Antigene

Die h-PTH [53-84], h-PTH [51-84], h-PTH [46-84] und BSA- [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84], die nach dem folgenden Verfahren er halten werden, werden als Antigene verwendet.

BSA-[Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] wird wie folgt hergestellt.

Tetranatrium-EDTA (4 mg) wird zu BSA (50 mg), gelöst in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0, 1 ml), gegeben. Eine Dimethylform amidlösung (150 µl) von 3-(2′-Benzothiazolyl-dithio)propio natsuccinimidester (500 µg) wird zugegeben, und dann wird unter Eis-Kühlen während 60 Minuten gerührt. Nach der Reak tion wird [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] (50 mg) zugegeben, und dann wird unter Eis-Kühlen während 30 Minuten gerührt, der pH- Wert wird auf 7,0 eingestellt, und dann wird durch eine Säule (1×50 cm) aus Sephadex® G-75, die mit 0,01 M Phosphat puffer (pH 7,2) gepackt ist und 0,15 M NaCl enthält, für die Gelfiltration geleitet. Eluate mit 15 ml bis 20 ml werden gesammelt, und man erhält die Fraktionen, welche BSA- [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] enthalten. [Durchschnittlich 11 Mol [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] pro 1 Mol BSA werden konjugiert.]

(2) Antikörper

Eine Lösung (500 µg/ml) des obigen Antigens in 0,01 M Phosphat puffer (pH 7,0), enthaltend 0,15 M NaCl, wird herge stellt. Je 2,5 ml dieser Lösung werden mit Freund′s komplettem Adjuvans (2,5 ml) vermischt, und dann werden Meer schweinchen, männlich, je fünf in einer Gruppe, durch subkutane Injektion immunisiert (subkutane Injektion fünfmal in je Zwei-Wochen-Intervallen). Zwei Wochen nach der End immunisierung wird aus dem Herzen Blut gesammelt, und man erhält das Antiserum nach üblichen Verfahren.

Im folgenden werden das Antiserum von h-PTH [53-84] als (A), das Antiserum von h-PTH [51-84] als (B), das Antiserum von h-PTH [46-84] als (C) und das Antiserum von BSA-[Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] als (D) abgekürzt.

(3) Enzymmarkierung

1) [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] (4 mg) wird in 0,1 M Phosphat puffer (pH 7,0, 1 ml) gelöst. N-[2-(2′-Pyridyldithio)äthyl]- 3-(2′-benzothiazolyl-dithio)propionamid (0,6 mg) in Dimethyl formamid (0,9 ml) wird zugegeben, und dann wird bei 0°C während 60 Minuten gerührt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl auf 6,0 eingestellt. Die Lösung wird durch eine Sephadex®-G-25-Säule (1×50 cm) mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) geleitet, wobei man die Fraktionen 15 bis 19 ml erhält (660 γ/ml [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84]. Die obige Frak tion (20 µl) wird zu 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0, 1,5 ml) gegeben, welche β-Galactosidase (1,2 mg) enthält, und dann wird bei 0°C 60 Minuten gerührt. Das Inkubationsgemisch wird durch eine Sephadex®-G-100-Säule (1×50 cm) mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2), welcher 0,15 M NaCl enthält, zur Gelfiltration geleitet, und man erhält Fraktionen mit 13 bis 17 ml. In diesen Fraktionen ist das Verhältnis von β-galactosidase-markiertem Konjugat [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84]: β-Galactosidase etwa 1 : 1 (im folgenden als Charge A abge kürzt).

2) h-PTH [53-84] (2 mg) wird in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0, 1 ml) gelöst. Eine Dimethylformamidlösung (0,2 ml) von 3-(2′-Benzothiazolyl-dithio)propionatsuccinimidester (0,2 mg) wird zugegeben, und dann wird bei 0°C 60 Minuten gerührt. Nach der Reaktion werden 20 µl davon zu 0,1 M Phos phatpuffer (pH 7,0, 1 ml) zugegeben, welcher β-Galactosidase (1 mg) enthält, und dann wird bei 0°C 60 Minuten lang umgerührt. Das Reaktionsgemisch wird durch eine Sephadex®- G-100-Säule (1×50 cm) für die Gelfiltration geleitet, wobei man die Fraktionen mit 14 bis 17 ml erhält.

Das Verhältnis von β-Galactosidase-Konjugat beträgt h-PTH [53-84]: β-Galactosidase=1 : 1 (im folgenden als Charge B abgekürzt).

(4) Analyse- bzw. Assay-Verfahren

Die Probenlösung (100 µl), enzymmarkiertes Konjugat (100 µl), ein aliquoter Teil an verdünntem Antiserum (100 µl) und normales Serum von Meerschweinchen (100fache Verdünnung) (100 µl) werden bei 5°C während 24 Stunden inkubiert. Anti-Meer schweinchen-γ-Globulin-Kaninchen-Serum (10fache Verdünnung, 100 µl) wird zugegeben, und dann wird bei 5°C während 24 Stunden inkubiert. 0,5 M NaCl (3 ml) wird zugegeben, und dann wird bei 3000 r.p.m. 15 Minuten lang zum Sammeln des sedimentierten Materials zentrifugiert. Das sedimentierte Material wird zu 0,1 M Phosphatpuffer (welcher 0,1% Natrium azid, 0,1% BSA, 20 mM Mercaptoäthanol und 10% Äthanol ent hält, pH 6,7), der o-Nitrophenyl-β-galactosidase (5 mg/ml) (200 µl) enthält, gegeben, und dann wird bei 37°C 90 Minuten lang umgesetzt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,2 M Glycinpuffer (pH 10,4, 2,5 ml) beendet, und dann wird die optische Absorption bei 420 nm bestimmt.

0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2), der 0,1% Natriumazid, 0,25% BSA, 0,15 M NaCl und 5 mM EDTA enthält, wird als Verdünnungs mittel verwendet.

1) Die Charge A wird als enzymmarkiertes Konjugat verwendet. Der Antikörpertiter (Bo/T) von jedem zuvor erwähnten Antiserum wird analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt. Jedes Antiserum wird in 1000facher Verdünnung verwendet.

Tabelle I

2) Das enzymmarkierte Konjugat Cha 01374 00070 552 001000280000000200012000285910126300040 0002003151738 00004 01255rge B wird verwendet, und der Anti körpertiter (Bo/T) wird wie oben beschrieben für das Antiserum C und das Antiserum D bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II

Jedes Antiserum wird in 2000facher Verdünnung verwendet.

3) Standardkurven werden unter Verwendung der oben beschriebenen Antisera hergestellt.
Verwendete Antisera: A-2, 600fache Verdünnung; B-2, 500fache Verdünnung; C-2, 1500fache Verdünnung; D-2, 2000fache Verdünnung.
Enzymmarkiertes Konjugat: Charge B.
Standardkurve von h-PTH [53-84] wird unter Verwendung der obigen Angaben hergestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 für A-2, in Fig. 2 für B-2, in Fig. 3 für C-2 und in Fig. 4 für D-2 angegeben.

Aus den obigen Ausführungen folgt, daß Antisera, die unter Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide [I] hergestellt werden, sehr günstige Standardkurven ergeben, und somit kann h-PTH oder seine C-endständigen Fragmente durch EIA mit guter Genauigkeit analysiert werden.

In den beigefügten Zeichnungen zeigen die Fig. 1, 2, 3 und 4 die Standardkurven.

Claims

h-PTH (46-84), Cys⁴⁵-h-PTH (45-84) und Tyr⁴⁵-h-PTH (45-84) der allgemeinen Formel (I): R-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro-Arg-Lys-Lys-Glu-Asp-Asn-Val-Leu-Val-Glu-Se-r-His-Glu-Lys-Ser-Leu-Gly-
Glu-Ala-Asp-Lys-Ala-Asp-Val-Asp-Val-Leu-Thr-Lys-Ala-Lys-Ser-Gln-OH (I)worin R H, eine H-Cys-Gruppe oder eine H-Tyr-Gruppe bedeutet, und seine Salze.