DE2363281A1

DE2363281A1 - Peptid und verfahren zu seiner herstellung

Info

Publication number: DE2363281A1
Application number: DE2363281A
Authority: DE
Inventors: Claude Donald Arnaud; Hollis Bryan Brewer
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 1972-12-21
Filing date: 1973-12-19
Publication date: 1974-06-27
Also published as: BE808914A; JPS504073A; ES421641A1; CA1008846A

Description

Peptid undVerfahren zu seiner Herstellung Die Erfindung betrifft ein Peptid der Formel H2N-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-LeurAsn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Lys -Gln-Leu-Val-His -Asn-Phe-R sowie ein Verfahren zu seiner Herstellung.
Während der letzten Jahre ist einige Information über die Chde, die Biosynthese und die Sekretion des ebenschilddrüsenhormons (PTH) zusammengetragen worden. Die Ergehnisse der Forschung haben gezeigte dass daß menschliche Nebenschilddrüsenhormon zunächst als Prohormon, nämlich als das Pronebenschilddrüsenhormon, gebildet wird. Dieses Pronebanschilddrüsenhormon enthält etwa 106 Aminosäuren und bat ein effektives Molekulargewicht von 12500. Dieses Prohormon wird schnell zu einer Speicherform oder Drüsenform des Hormone umgebildet, die 84 Aminosäuren enthält und ein Molekulargewicht von 9500 hat. Die vollständige Aminosäuresequenz dieser 84 Aminosäuren dieser Form des Nebenschilddrüsenhormons ist für das entsprechende Rinderhormon und Schweinehormon bekannt.
Nach entsprechender physiologischer Anregung wird diese orm des Nebenschilddrüsenhormons mit einem Molekulargewicht von 9500 in den Kreislauf ausgeschieden. Nach Eintritt dieser Drüsenform des Hormons in den äusseren Kreislauf wird das Hormon in kleinere Fragmente gespalten. Durch Gelfiltration.
eines menschlichen Hypernebenschilddrüsenserums konnte festgestellt werden, dass der Hauptanteil der immunoreaktiven Fragmente im Molekulargewichtsbereich von 5000-8000 liegt.
Bei der Spaltung wurden daneben eine Reihe anderer Komponente beobachtet.
Von dem menschlichen Nebenschilddrüsenhormon in der Kreis laufform ist bekannt, dass e aufgrund unterschiedlicher molekularer Formen des Nebenschilddrüsanhormons immunchemisch heterogen isjt (J. Clin. Endo. Met. 28 1037-1047 (1968)).
Die ganauen Stallen der Spaltung in dem aus 84 Aminosäuren bastchenden Polypsptid des Wobenschilddrüsenhormons im Kreislauf eind nicht bekannt. Gled charwaiss sind die biologischen Aktivitäten der duxch diens spaltungen gebildeten Fragmente, die don Hauptantoil des immunchemisch airkulierenden Hormons aummachen, unbakaunt.
Biologisch aktivo Poptidfrgmente des Nobsnschilddrüsenrinder hormons, die durch Spaltung mit vordlinnter Säuire erhalten wurden, haben gazeigt, dass zur Erzielung der hiologischen Aktivität nicht das vollständige und unverlatate, aus 84 Aminosäuren bestchonde Folypsptid erfordeclich ist. Im Fall des Rinderhermons wurde als biologisch aktives Spaltfragment ein mit der emdständigen Aminogruppe verschenes Psptid des Hormone erkunt, das aus den eroten 30 Glieedern der Aminosäureasquens basteht (Diochen. 11. 1973-1979 (1972)).
Synthetisch sind die Peptide der ersten 34 Sequenzglieder des Rinderhormons und der ersten 30 Sequenzglieder des Schweinehormons hergestellt worden. Beide Peptid sind miologisch aktiv. Einerseits konnte dadurch zwar der biologisch aktive Bereich des Wenenschilddrüsenhormons in etwa das erste Drittel des Aminoendes der aus 84 Aminosäuren bestehenden Polypeptidkette gelet rden, jedoch konnte £ür das entsprechende Humanhormon diese Identifizierung nach wie vor nicht erbracht werden, nicht zuletzt auch deshalb, weil die Aminosäuresequenz unbekannt war.
Der Erfindung liegt daher die Aufgabe zugrunde, die Sequenz des Beginns des menschlichen Nebenschilddrüsenhormons von der endständigen Aminogruppe her zu bestimmen, das biologisch und immunchemisch aktive Spaltfragment zu identifizieren und dieses Fragment zu synthetisieren.
Erfindungsgemäss wird diese Aufgabe durch das eingangs genannte Peptid und durch das nachstehend näher beschriebene Verfahren gelöst.
Das verwendete Humannebenschilddrüsenhormon wurde aus Nebenschilddrüsenadenomata von chirurgisch auf Hyperparathyroidismus behandelten Patienten gewonnen. Das getrocknete und entfettete Nebenschilddrüsengewebe wurde zunächst mit 8 m Harnstoff in 0,2 n Salzsäure extrahiert und dann nach Rasmussen (J. Biol.
Chem. 239, 2852-2857 (1964)) mit äther Essigsäure, Natriumchlorid und Trichloressigsäure fraktioniert. Das so erhaltene Produkt (TcA-Pulver) wurde durch Gelfiltration und anschliessende Ionenaustauschchromatographie auf einer CM-Sephadex-Säule mit einem Ammoniumacetatgradienten weiter gereinigt.
Der Isolierungsprozess des Hormons wurde radioimmunologisch und gelplattenelektrophoretisch überwacht.
Die Elektrophorese wurde mit 8 m Harnstoff bei einem pH von 4,4 durchgeführt. Die immunologischen Prüfungen wurden nach Arnaud (J. Clin. Invest. 50, 21-34 (1971)) durchgeführt.
Die Sequenzbestimmungen wurden in 1 m Pufferlösung nach dem Edman-Abhau -vorgenommen Die Phenylthiohydantoinaminosäuren (PTH) wurden durch Abbau zu den Aminosäurebestandteilen durch salzsaure Hydrolyse (20 h bei 130 °C), Zweiphasenchrornatographie (Gas/Flüssigkeit)- und massenspektrometrisch vorgenommen.
Die massenspektrometrischen Messungen wurden bei einer Quellentemperatur von 200 °C unter Verwendung von Isobutan als Trägergas und einer Erwärmung von 30 auf 25O °C über 90 5 durchgeführt Neben dieser chemischen Ionisationsspektroskopie wurde eine Elektronenstoasspektroskopie (70 eV) vorgenommen Das gereinigte Humannebenschilddrüsenhormon wanderte bei der-Plattenelektrophorese als Einzelkomponente mit einer Beweg lichkeit, die derjenigen des entsprechenden Rinderhormons entsprach Gleichzeitig ergab die Analyse der aminoseitigen Endgruppe (nach Edman) Serin 350 n mol des gereinigten Horinons wurden dem stufenweisen Abbau mit Heptafluorbuttersäure im Beckman-Sequencer unterzogen. Die quasimolakularen gröseren Fragmentkationen wurden der chemischen Ionisationsmassenspoktrometrie zugeführt. Auf Platz 12 dex Sequenz wurde ein quasimolekulares Ion für Glycin (m/e 192) und für Lsucin (m/e 249) beobachtet. Unerwarteterweise konnte hier jedoch eine gaschromatographische Quantisierung von Glycin (0,28 µ mol) und Leucin (0.09 µ mol) die eindeutige Stellung des Glycins auf dem 12. Platz der Sequenzkette und des Leucins auf dem 11. Platz der Sequenzkette sichergestellt werden. so dass dadurch die in der Massenspektrometrie nicht auflösbare Überlappung aufgehoben werden konnte Weiterhin haben sich der Bestimmung der Aminosäuresequenz des biologisch aktiven Fragmentes des Humannebenschilddrüsenhormons die gleichen Massen m/e von 264 für Leucin/Isoleucin und Lysin/Glutamin bisher entgegengestellt. Zu ihrer Trennung wurde im Fall Lysin/Glutamin das Fragmention m/e 306 herangezogen. Ausserdem wurden zur Trennung der beiden Überlappungspaare gaschromatographische Daten und spektrometrische Daten der Elektronenstossionisation herangezogen. Durch diese kombinierte Auswertung gelang überraschenderweise mit den genannten Mitteln die fehlerfreie und sichere Festlegung der Sequenz der ersten 34 Aminosäuren des menschlichen Nebenschilddrüsenhormons. Die Sequenz dieses Peptids ist in der Fig. 1 wiedergegeben.
Die Bedeutung der Ermittlung dieses Sequenzbereiches des menschlichen Nebenschilddrüsenhormons beruht darauf, dass in diesem Bereich die biologische Aktivität der Spaltprodukte liegt. Eine Übertraung der bekannten Ergebnisse für die entsprechenden Rinderhormonfragment e bzw. Schweinehormonfragmente auf die Humanhormonfragemente, die bislang immer wieder versucht worden ist. musste daran scheitern, da.
wie sich jetzt gezeigt ht. diese Hormonfragmente überraschenderweise in 6 Stellen für den Fall des Rinderhormonfragmentes und in 5 Stellen für den Fall des Schweinehormonfragmentes von dem entsprachenden Humanhormonfragment abweichen. Diese Abweichungen sind in der Fig. 2 kenntlich gemacht.
Im einzelnen sind die Sequenzen der ersten 15 Säuren des Humanpetpids und des Schweinepeptids identisch, während die Sequenz des entsprechenden Rinderpeptide in der ersten und siebten Stelle in der Weise abweicht, dass das Serin durch Alanin und das Leucin durch Phenylalanin ersetzt sind (ig 2). In den Plätzen 16 - 34 der Sequenz weicht das Humanpeptid vom Schweinepeptid durch 5 und von Rinderpeptid durch 4 Vertauschungen ab Während das Humanpeptid entsprechend dem Rinderpeptid zwei methioninreste enthält, weist das Schweinepeptid lediglich einen einzigen Methioninrest auf Platz 8 auf.
Darüber hinaus ist die Humacsequenz dadurch ausserordentlich ungewöhnlich, dass sie 4 aufeinanderfolgende basische Gruppen enthält, nämlich auf den Plätzen 25 - 28 einen Argininrest und drei Lysinreste. Die für die Humansequenz auf den ersten aminoseitigen 34 Plätzen spezifischen Besetzungen sind Asparagin auf Platz 16, Glutamin auf Platz 22, -Lysin auf Platz 28 und Leucin auf Platz 30.
Eine der Hauptschwierigkeiten bei der klinischen Beurteilung von Patienten mit Störungen des mineralischen Stoffwechsels iaq in der kaum zuverlässig durchführbaren radioirmunologischen Bestimmung des Nebanschilddrüsenhormons. Die Durchführung dieser Bestimmung stösst auf zwei grundlegende Schwierigkeiten.
Die eine dieser beiden Dchwierigkeiten wurde bereits zuvor erörterte nämlich der Zerfall des 84-gliedrigen Polypeptids im peripheren kreislauf in eine Reihe kleinerer unbekannter Peptidfragmente, wobai die Antioeren aus den verschiedenen Laboratorien fraglow immunologisch auf verachiedene bereiche des intakten Moleküils einwirken, wodurch uneinheitliche und stark achwankends Warte bsi dem Versuch erhalten werden, das im Blut zirkulierende Nebenschilddrüsenhormon zu bestimmen.
Schliesslich ist es in diesem Zusammenhng auch noch nicht möglich gewesen, durch eine immunologische Bestimmung der aminoseitigen biologisch aktiven Fragmants die unaktiven Fragmente sicher zu diskriminieren. Die zweito Schwierigkeit bai der immunologischen Beotimmung des Nebenzchilddrüsenbormons im Blutkreislauf lag, wie mit der vorliegenden Erfindung deutlich wird. darin, dass man durch die Verwendung radioaktiv markierter Rinderhormons als Tracer und gegen das Rinderhormon oder das Schweinehormon erzeugte Antikörper einsetate, so dass eine heterologe Bestimmang erhalten wurde. die Empfindlichkeit dieser Bestimmungen schwankt daher und hängt von der jeweiligen Querreaktivität des speziellen Antiserums mit dem Humanhormon ab. Wie vorstehend jedoch ausführlich dargelegt wurde, weicht die Humansequenz des Nebenschilddrüsenhormons jedoch im ersten Dritte auf sechs Plätzen vom entsprechenden Rinderhormon und auf fünf Plätzen vom entsprechenden Schweinehormon ab.
Habener et al. (Nature New Biology 238, 152-154 (1972)) haben versucht, einige dieser Schwierigkeiten dadurch zu umgehen, dass sie für die immunologische Bestimmung aminospezifische und carboxylspezifische Antisera entwickelten. Sie verwendeten dabei einen Antikörper, der gegen das Rinderhormon entwickelt wurde und absorbierten ihr Antiserum entweder mit einem synthetischen 1 - 34-Rinderfragment oder einem durch chemische Spaltung aus dem natürlichen Rinderhormon erhaltenen 53 - 84-Fragment. Durch Verschiebung des aminoseitig spezifischen Antiserums konnten die genannten Autoren zeigen, dass der Schlüsselplatz des absorbierten Antiserum im Bereich 14 - 19 der Rindersequenz lag. Aufgrund dieser Ergebnisse waren die Autoren der Ansicht1 dass das Hauptfragment im menschlichen Kreislauf carboxylseitig und biologisch inaktiv sei. Es gelang ihnen jedoch nicht0 das aminoseitige Fragment im menschlichen Kreislauf aufzufinden Hierfür mag es eine Reihe verschiedener Gründe geben , die bislang nicht bekannt sind, jedoch sei in diesem Zusammenhang darauf verwiesen, dass die Rindersequenz in eben diesem Bereich 14 - 19, nämlich auf Platz 16, durch Substitution eines Serins für das humane Asparagin von der humanen Sequenz abweicht (Fig. 2>.
Von den vorstehend beschriebenen Befunden von Habener et al.
abweichende Ergebnisse veröffentlichten Canterbury und Reiss über die Natur der Kreislauffragmente des menschlichen nebenschilddrüsenhormons. Unter Verwendung eines gegen das Rinderhormon entwickelten Antiserums wurden drei immunochemisch verschiedene Formen des nebenschilddrüsenhormons im peripheren Xreislauf hyperparathyroider Patienten ermittelt (J. Clin. Invest. (1973)).
Das Molekulargewicht dieser drei Komponenten wurde durch Geltiltration zu 9500, 7000-7500 und 4500-5000 bestimnt, wobei die schwerste Fraktion vermutlich der Drüsenforrn des lIormons zuzuschreiben ist. Während die schwerste und die leichteste Fraktion das Adenylcyclasesystem stimulierten, erwies sich die mittlere Fraktion als inaktiv. Diese Ergebnisse lassen den Schluss zu, dass das aktive fragment des humanen Nebenschilddrüsenhormons ein aminoseitiges Fragment der etwa halben Grösse der Drüsenform ist.
Die beschriebenen widersprüchlichen Ergebnisse zeigen deutlich die nach dem Stand der Technik ungelösten Probleme im Zusammenhang mit dem humanen Nebenschilddrüsenhormon.
Durch das neue, erfindungsgemäss vorgeschlagene 34-gliedrige Peptid, dessen Sequenz mit der aminoseitigen Anfangs sequenz des Humanhormons übereinstimmt, können die beschriebenen klinischen Schwierigkeiten der immunologischen Bestimmungen des Hormons im peripheren Kreislauf beseitigt werden. Weiterhin wird der Forschung durch die Zurverfügungstellung dieses Peptids die weitere Arbeit wesentlich erleichtert.
Insbesondere können die heterologen Antisera der immunologischen Bestimmungen leichter charakterisiert werden und können spezifische, auf den aminoseitigen Bereich des Humanhormons gerichtete Antiseren entwickelt werden. Mit solchen spezifischen Antiseren, die auf der Humansequenz basieren, können insbesondere die Calciumhomöostasis und Störungen des Knochenmetabolismus behandelt werden.
Klinisch kann *aß synthetische Peptid als Ersatz für eine Therapie mit dem natürlichen humanen Nebenschilddrüsenhormon dienen. Das Peptid wird in Mikrogrartinengen intravenös oder intramuskulär injiziert. Die aktuelle Dosis bestizunt sich nach der Toleranzgrenze Res Patienten, den Nebeneffekten und anderen l?aXtoren und kann vom Fachmann in einfacher Weise beatimmt werden. Als Verdünnungsmittel für dAs Hormon kommt praktisch Jeder beliebiger physiologisch tolerierbare Träger mit etwa neutralem pH in Frage, beispielsweise eine physiologische Kochsalzlösung Weiterhin kann as synthetische Peptid auch zu diagnostischen Zwecken verwendet werden, und zwar- aufgrund der Tatsache, dass das Nebenschilddrüsenhormon Hypercalcämie, Hypocalcämie, Hyperphosphaturie und eine erhöhte Urinausscheidung von cyclischem AMP beim gesunden Menschen erzeugt. Bei derartigen Diagnoseverfahren kann das Verhalten des Patienten auf eine intravenöse oder intramuskuläre Verabreichung des Peptids untersucht werden, wobei das Seruncalcium, Urincalcium, Urinphosphat und die cyclische AMP im Urin gemessen werden.
Das synthetische Peptid gemäss der Erfindung mit der humanen Sequenz kann nach zwei an sich bekannten Verfahren hergestellt werden. Zum einen kann es durch Reaktion in fester Phase (US-PS 3 531 258), zum anderen nach den Verfahren der klassischen Synthese hergestellt werden.
Das Herstellungsverfahren in fester Phase beruht auf der an sich bekannnten Erkenntnis, dass man eine Peptidkette schrittweise aufbauen kann, wenn man eines ihrer Enden kovalent an einen unlöslichen festen Träger bindet. Während der folgenden synthetischen Zwischenstufen bleibt das aufzubauende Peptid in fester Phase und kann daher ohne nennenswerte Verluste an Substanz in einfacher Weise gehandhabt werden.
Die Automation des Verfahrens kann mit Hilfe des von Merrifield et al. (Advances in Enzymology 32, 221 (1969)) beschriebenen Apparates durchgeführt werden, und zwar unter Einschluss der Reinigung der Zwischenprodukte1 wobei alle Reaktionen z;n einem einzigen Reaktor durchgeführt werden.
Als fester Träger dient eine Perle aus Chlormethylstyrol-Divinylbenzol-Copolymerisat. Die C-seitige Aminosäure wird als Benzylester an das Substrat gekoppelt, während die Peptidkette auf dem Substrat durch aminoseitige Kondensation der N-acylierten Aminosäuren aufgebaut wind. Als Schutz gruppe wurde tert-Butyloxycarbonyl verwendet. Aktiviert wurde in der Regel mit einem Carbodiimid oder einem aktiven Ester.
In der genannten Vorrichtung zur Durchführung des Verfahrens werden die Reagenzien und Lösungsniittel an den Ventilen für die Lösungsmittelzufuhr und die Aminosäurewahl eingestellt und von der Dosierpumpe aus den Reservoirs in den Reaktor mit der Peptidkette überführt. Nach Ablauf der vorgegebenen Reaktionsdauer werden überschüssiges Reagenz und Nebenprodukte durch Vakuumfiltration in die Ablaugenflasche gesaugt. Diese Art gleicher Grundoperationen wird bis zum Abschluss des Aufbaus der Sequenz unter elektronischer Steuerung durchgeführt. Sämtliche Teile der Vorrichtung, die mit den Lösungsmitteln oder Reagenzien in Berührung kommen, bestehen aus Glas oder chemisch beständigen Polymerisaten.
Vor dem Beginn der eigentlichen Peptidsynttnese müssen eine Reihe vorbereitender Schritte durchgeführt werden. Zunächst muss das Substrat, das die Aminosäure des C-seitigen Endes des Peptids trägt, hergestellt und analysiert werden. Das wird dadurch erreicht, dass man ein chlormethyliertes Copolymerisat von Styrol und Divinylbenzol mit tert-Butyloxyzarbonylaminosäure verestert. Durch Flotation in Methylenchlorid wird das so erhaltene Produkt von feinsten Teilchen des Harzes befreit, um eine Verstopfung der mitten des Reaktionsgefässes zu vermeiden.
Eine Probe des im Vakuum getrockneten Produktes wird in einem 1 : Gemisch von Dioxan und 12 n eC1 hydrolysiert, wobei die in Freiheit gesetzte Aminosäure quntitativ mit einem Aminosäureanalysator bestimmt wird. Der Aminosäuregehalt dient der Berechnung der für die Synthese erforderlichen Mengen nachfolgender Aminosäurederivate und des Dicyclohexylcarbodiimids. Als optimaler Substitutionsbereich wurden 0,1 - 0,3 mm/g bestimmt. Vorteilhatterweise werden dabei die tert-Butyloxylcarbonylaminosäure-Harze zuvor hercestel lt und bis zum aktuellen Einsatz gelagert.
Die Lösungsmittelreservoirs der Synthesevorrichtung werden mit Eisessig, Methylenchlorid und im Handel erhältlichen absolutem äthanol (99,5 %) gefüllt. Das N-N-Dimethylformamid wird durch Schütteln mit Bariumoxid und Destillation unter vermindertem Druck von Dimethylamin und Ameisensäure befreit.
Die 1 n HCl-Essigsäurelösung wird durch Zugabe von 700 ml Eisessig zum Speichertrenntrichter und Durchleiten von trockenem Salzsäuregas in langsamem Strom hergestellt. Proben werden am Boden abgezogen und nach Volhard auf Chlorid titriert. Diese Lösung ist wochenlang ohne eine ins Gewicht fallende Abnahme der Konzentration haltbar, wenn sie durch eine lange Kapillarspirale und eine Trockenröhre geschützt ist.
Das verwendete Triäthylamin-Reagenz wird durch Mischen von 50 ml Triäthylamin mit 450 ml gereinigtem Dimethylformamid hergestellt.
Das Reaktionsgefäss wird mit einer abgewogenen Menge des tert-Butyloxycarbonylaminosäure-Harzes beschickt (2 - 4 g für einen kleinen, etwa 45 i fassenden Reaktor). Der Stopfen wird mit Siliconhochvaknumfett-gefettet und durch Federn gesichert. Anschliessend werden die Einlassleitung und die Auslassleitung angeschlossen. Je Äquivalent der ersten Aminosäure auf dem Harz werden bei der Synthese 3 Äquivalente jedes tert-Butyloxycarbonylaminosäurederivates zugegeben. Die berechnete enge jeder der ersten sechs Aminosäuren wird in 7 ml Methylenchlorid gelöst und gegebenenfalls filtriert und in die Aminosäurer5eservoirs in der gewünschten Folge gegeben. Da das tert-Butyloxycarbonyl-nitro-L-arginin in Methylenchlorid schlecht löslich ist, wird es zunächst in 2 ml Dimethyl1;ormamid aelöst und anschliessend mit 5 ml Methylenchlorid verdünnt. Das tert-Butyloxycarbonyl-im-benzyl-L-histidin wird in 7 ml reinem Dimethylforrnamid gelöst. Die tert-Butyloxycarbonylm9inosäure-p-nitrophenylester werden in 16 ml reinem Dimethylformamid gelöst. Willrend der automatischen Synthese werden die Aminosäurelösungen vollständig in den-Reaktor gepumpt, so dass eine genaue Konzentration dieser Lösungen nicht erforderlich ist Die Dicyclohexyl carbodiimidlösung wird dagegen über eine Dosierpumpe abgegebene so dass die Konzentration dieses Reagenzes für jeden Durchgang genau bestimmt wurden muss. Da das Rückhaltevolumen und das Gesamtvolumen der Pumpe bekannt sind kann das tatsächliche Volumen der in das Reaktionsgefäss abgegebenen Diimidlösung genau berechnet werden. Die erforderliche Menge Dicyclobexylcarbodiimid wird in dieser Volumen Methylenchlorid gelöst Das Gesamtvolumen der Lösung, das in einer Charge hergestellt wird , hängt von der Anzahl der zuzugebenden Aminosäuren ab In einem typischen Diimidzyklus wird das Harz zunächst dreimal automatisch mit Essigsäure gewaschen, wobei jeder dieser waschschritte drei Pumpenläufe, Schüttelläufe und Auslassstufen umfasst. Die Dosierpumpe ist dabei so geschaltet, dass sie jeweils im oberen Totpunkt des Auslasstaktes angehalten wird, so dass der Grad der Lösungsmitteldurchmischung auf ein Minimum herabgedrückt werden kann. In gleicher Weise bleibt die Schüttelvorrichtung so stehend dass das Gefäss aufrecht steht, um den Auslass für die Filtraticn durchf2hren zu können. Während der dritten Auslassstute wird das Lösungsmittelventil fortgeschaltet, se dass die salzsaure Essigsäure in das Gefäss gepumpt werden kann. Die für eine vollständige Entfernung der tert-Butyloxycarbonylschutzgruppe erforderliche Reaktionszeit von 30 min wird in drei aufeinanderfolgende 10 min-Schüttelstufen aufgeteilt.
Nach dem Abnehmen der Schutzgruppe wird das farz dreimal mit Essigsäure zur Entfernung der Salzsäure, dreimal mit Äthanol zur Entfernung der bessigsäure und dreimal mi Dimethylformamid gewaschen. Ein anschliessendes 10 min langes Schütteln mit Triäthylamin in Dimethylforaraid dient der Neutralisierung des Aminosäurehydrochlorids auf derr Iarz und setzt so das für die nächste Kopplung mit der näcnsten geschützten Aminosäure benötigte Amin frei.
Das Triäthylammoniumchlorid und überschüssiges Triäthylamin werden durch drei Waschungen mit Dimethylformamid entfernt. Dadurch werden die Harze für die nächste Kopplungsstufe vorbereitet. Dann wird die Lösung der tert-Butyloxycarbonylaminosäure in einem 30 s währenden Pumpgang in das Gefass gepumpt. Während der nächsten Stufe, der Spülstufe, führt die Pumpe einen Leertakt unter Luftförderung und anschliessend drei Fördertakte mit Methylenchlorid zur Spülung der Aminosäureleitung aus.
Anschliessend wird 10 min lang geschüttelt, um ein Eindringen der Aminosäure in die Harzperlen zu ermöglichen. Während dieser Stufe wird das Lösungsmittelventil auf die Diimidleitung fortgeschaltet. In der nächsten Stufe wird dann die Diimidlösung 30 5 lang eingepumpt und wird anschliessend in der Spülstufe ein weiterer Pumpentakt Diimidlösung und 3 Pumpentakte Methylenchlorid gefördert. Die Kopplungsreaktion verläuft dann während eines zweistündigen Schüttelzyklus. Nach Abschluss der Kopplungsreaktion werden die Nebenprodukte und überschüssiges Reagenz durch drei Waschungen in Methylenchlorid und zwei Waschungen in äthanol entfernt.
Bei Einstellung des Synthesegerätes auf eine Ilalteelnstellung nach Abschluss eines Synthesezyklus wird das Harz nan der dritten äthanolischen Waschung in Äthanol suspendicrt gehalten.
Von diesem Punkt aus kann dann der nächste Zyklus gestartet werden. Nach etwa 24 h ist die sechste Aminosäure angekoppelt.
Für den nächsten Turnus werden dann die Aminosäurereservoirs ausgewaschen, mit den entsprechenden Lösungen neu aufgefüllt und die Lösungsmittelreservoirs ebenfalls nachgefüllt. Der nächste Zyklus kann durchgeführt werden.
Statt des diimidazyklus kann in analoger Weise ein Esterzyklus durchgeführt werden, wobei lediglich in an sich bekannter Weise einige Parameter, insbesondere die veränderten Lösungsmittel und die Reaktionszeiten, abgeändert zu werden brauchen.
Nach Abschluss der gewünschten Synthese wird das Peptidharz mit Äthanol aus dem Reaktionsgefäss genommen, filtriert und getrocknet. Die Gewichtsdifferenz des Harzes vor und nach der Synthese ermöglicht die Bestimmung der erhaltenen Peptidmenge. Das Peptid wird mit einem Gemisch aus Bromwasserstoff und Trifluoressigsäure vom Harz genommen und in geeigneter Weise gereinigt.
Das Peptid gemäss der Erfindung wurde in der vorstehend beschriebenen Weise hergestellt, wobei als Substrat 1 %ige quervernetzte chlormethylierte Polystyrolperlen verwendet wurden. Die Kopplung des Harzes wurde mit Hilfe von tert-Sutyloxycarbonylaminosäure in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid durchgeführt. Das Aminosäureharz wurde mit Trifluoressigsäure in Methylenchlorid aktiviert und mit Triäthylamin neutralisiert, Nach der Zugabe der vierunddreissigsten Baugruppe bzw. der vierunddreissigsten Aminosäure der Kette wurde das Peptid mit flüssiger Fluorwasserstoffsäure vom Harz genommen.

Die im Rahmen dieser Beschreibung und in den Zeichnungen sowie in den Ansprüchen verwendeten bkürzungen für die Aminosäuren bzw. Aminosäuregruppen entsprechen den international üblichen -und auch in Deutschland durchgesetzten Bezeichnungen: Ser Serin Val Valin Glu Glutaminsäure Ile Isoleucin Gln Glutamin Leu Leucin Met Methionin His Histidin Gly Glycin Asn Asparagin Lys Lysin Arg Arginin Trp Tryptophan Phe Phenylalanin Weiterhin werden verwendet: Boc t-Butyloxyeabonyl Bpoc 2- (p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl But t-Butyl DCCI Dicyclohexylcarbodiimid Hobt 1-Hydroxybenzotriazol Trt Trityl Z Benzyloxycarbonyl Das Peptid gemäss der Erfindung wurde auch nach dem klassischen Verfahren nach Bodansky et al. ("Peptide Synthesis", Interscience (N.Y. 1966)) hergestellt. Die Zwischenprodukte III, IV, VI, VIII, X und XII wurden nach Standardverfahren hergestellt. Die Zwischenprodukte sind in der nacnstehenden Tabelle I mit den Zahlen III bis XII durchnumeriert. Tabelle I

Formeln der geschützten Zwischenprodukte III - XII

Nr. Sequenz Formel

.

III 29-34 : H-Gln-Leu-Val-His-Asn-phe-OBut

:

: H# Boc Boc Boc

: # # # #

IV 25-28 : Z-Arg-Lys-Lys-Lys-O#

:

: H# Boc Boc Boc H#

: # # # # #

V 25-34 : H2#-Arg-Lys-Lys-Lys-Gln-Leu-Val-His-Asn-phe-OBut.3Cl#

:

: OBut H#

: # #

VI 18-24 : Bpoc-Met-Glu# Arg-Val-Gln-Trp-Leu-O#

:

: OBut H# H# Boc Boc Boc H#

: # # # # # # #

VII 18-34 : H2#-Met-Glu-Arg-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Lys-Gln-Leu-Val-His-Asn-phe-OBut-4Cl#

:

: Boc But

: # #

VIII 13-17 : Bpoc-Lys-His-Leu-Asn-Ser-NHNH2

:

: Boc H# But OBut H# H# Boc Boc Boc

: # # # # # # # # #

IX 13-34 : H2#-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Lys-Gln-

:

: H#

: #

: Leu-Val-His-Asn-phe-Obut.5Cl#

Tabelle I (Fortset@un@)

Nr. Sequenz Formel

: OBut

: #

X 4-12 : Trt-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-OH

:

: OBut H# Boc H# But OBut H#

: # # # # # # #

XI 4-34 : H2#-Glu-Ile-Gln-Leu-Met-His-Asn-Leu-Gly-Lys-His-Leu-Asn-Ser-Met-Glu-Arg-

:

: H# Boc Boc Boc

: # # # #

: Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Lys-Gln-Leu-Val-His-Asn-phe-OBut.6Cl#

:

: But But

: # #

XII 1-3 : Boc-Ser-Val-SerNHNH2

:

Aus diesen Zwischenprodukten III - XII wurde die Endsequenz 1 - 34 (II) hergestellt. Die Sequenz II ist die geschützte Sequenz 1 - 34 mit den Schutzgruppen Boc und But auf Platz 1, But auf Platz 3 und 17, ODut auf den Plätzen 4, 19 und 34 und Boc auf den Plätzen 13, 26, 27 und 28. Die Sequenz II wurde dabei nach dem folgenden Schema erhalten: Die im nachfolgenden angegebenen Rf-Werte wurden dünnschichtchromatographisch ermi-ttelt, wobei S Silicagel und C Cellulose als Material für die Laufschicht der Platte bezeichnet.

Sequenz 25 - 34 (V): Die Fragmente III und IV wurden mit Hilfe von DCCI-IIOBt miteinander kombiniert (Chem. Ber. 103, 788 (1970)). Das Rohprodukt wurde aus einem Acetonitrilwassergemisch ausgefällt und auf Silicagel der Dünnschichtchromatographie unterzogen. Dazu wurde ein Lösungsmittelsystem (System 100) aus Essigester, Pyridin, Essigsäure und Wasser (62 : 21 : 6 : 11) verwendet; Rf (5) = 0,32. Die Z-Gruppe wurde durch katalytische Hydrierung über Pd/C entfernt. Gleichzeitig wurden drei Aquivalente HC1 zugegeben.
Dabei wurde V als Trihydrochlorid erhalten.
Sequenz 18 - 34 (VII): V wurde mit dem Fragment 18 - 24 (V1) mit Hilfe von DCCI-HOSt zum Bpoc-Derivat von VII gekoppelt. Das erhaltene Produkt wurde durch Gegenstromverteilung in einem System aus Methanol, 0,1 m wässrigem Ammoniumacetat (pH 7,0), Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff im Verhältnis 10:4:7:3 (K = 0,33) gereinigt. Rf (S) = 0,16 im System 100. Das Tetrahydrochlorid von VII wurde durch Abnehmen der Bpoc-Gruppe mit HC1 erhalten.
Sequenz 13 - 34 (IX): VII wurde mit dem Azid von VIII kondensiert (Coll. Czechoslov. Chem. Commun. 26, 2333 (1961)) und anschliessend gereinigt. Das so erhaltene Bpoc-Derivat von IX wurde durch Gegenstromverteilung in dem beschriebenen System Methanol/Ammoniumacetat/Chloroform/Tetrachlorkohlenstoff (K = 0.65) gereinigt. Rf (S-) = 0,40 in einem System (System 96) aus 2-Butanol, Essigsäure und Wasser im Verhältnis 67:10:23. Im System 100 betrug der Rf (S)-Wert 0,30. Nach Entfernen der Bpoc-Gruppe mit HC1 in Trifluoräthanol wurde IX als Pentahydrochlorid (Rf (S) = 0,23 im System 96 erhalten.
Sequenz 4 - 34 (XI) : IX wurde mit X unter Verwendung von DCCI-HOBt zum Trityl-Derivat von XI gekoppelt. Das erhaltene Produkt wurde durch Gegenstromverteilung in dem auch zur Herstellung von IX verwendeten System gereinigt (K = 0,35).
Rf (S) = 0,28 im System 100. Anschliessend wurde die Trityl-Gruppe in Trifluoräthanol mit HC1 entfernt, wobei das Hexahydrochlorid von XI erhalten wurde (Rf (S) = 0,36 im System 96).
Die eschützte Sequenz 1 - 34 (II): XI wurde in der gleichen Weise,ie bei IX beschriebene mit dem Azid von XII gekoppelt.
Das Rohprodukt wurde durch Gegenstromverteilung in einem System aus Methanol, 0.2 m w$ssrigen ammoniumacetat (pH 4.75).
Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff im Verhältnis 10:3:8:4 gereinigt (R = 0,21). Rf (S) = 0,43 im System 96 und 0,30 im System 100.
Das freie Humanvorschilddrüsenhormon (1): Die Schutzgruppen wurden von II mit konzentrierter Salzsäure (10 min bei O C) abgenommen. Das so erhaltene Hydrochlorid des Peptids (I) wurde im Ionenaustauscher behandelt. Das so erhaltene Peptid enthielt nur geringe Mengen Nebenprodukte, vor allem ein Gemisch eines Methionin-S-oxid-Derivats.
Das Peptid hat einen Rf (C)-Wert von 0,36 in l-Butanol/ Pyridin/Essigsäure/Wasser im Verhältnis 38:20:5:24 (System 151) und einen entsprechenden Wert von 0,54 im System 54.
Bei der Dünnschichtelektrophorese in HCl in Trifluoräthanol bei pH 1,9, 90 min lang bei 16 V/cm betrug der Laufabstand 6 cm zur Kathode Der Verteilungskoeffizient betrug im System n-Butanol/0,2 m wässriger Ammoniumacetatlösung (pH 4,75)/Methanol im Verhältnis 4:4:1 K = 0,12.
Die Aminosäureanalyse (Hydrolyse in 6 n HC1 15 h lang bei 118 °C) lieferte folgende Werte : Trp 0,51 (1) (Anzahl der Trp-Reste in nichthydrolysiertem I im UV-Spektrum ; # max = 280,288 nm); Lys 3,85 (4); His 2,75 (3); Asp 3,05 (3); Arg 1,88 (2); Ser 2,47 (3); Glu 5,06 (5); Gly 1,07 (1); Val 3,16 (3), Met 1,96 (2); Ile 1,03 (1); Leu 4,75 (5); Phe (Bezugswert) 1,00.
Methionin-S-Oxid-Derivat: a) Gemisch von Met8- und Metj18-mono-S-oxid (I in 0,6 %iger wässriger H202-Lösungt 3 min, 25 °C) Rf (C) = 0,29 im System 151 und 0,45 in einem System aus l-Butanol, Pyridin, Essigsäure und Wasser im Verhältnis 38;24:8:30 (System 101). Der gleiche Rf-Wert betrug 0,48 im System 54, das aus 2-2utanol, 2-Propanol und 9 zeiger Chloressigsäure im Volumenverhältnis 58:8:34 bestand.
b) Met8,18-di-S-Oxid (I in 0,6 %iger wässriger H2O2-Lösung 45 min, 25 °C): Rf (C) = 0,21 im System 151; = 0,39 im System 100 und = 0,43 im System 54.
Biologische Aktivität: 2 h nach der intravenösen Injektion in Dosen von 100 und 500 µg zeigte I in dem Schilddrüsen-Nebenschilddrüsen-Wirkungssystem der Ratte eine deutliche Zunahme der Calciumkonzentration im Serum.

Claims

Patentansprüche

1. Peptid der allgemeinen Formel H2a-Ser-Val-Ser-Glu-Ile-Gln- Leu-Iet-Hi s-Asn-Leu-Gly-Lys-iii s-Leu-Asn-S er-Met-Glu-Arg-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Lys-Lys-Lys-Gln-Leu-Val-His -Asn-Phe-R, wobei R eine Carboxylgruppe und die Kürzel die üblichen Aminosäurebezeichnungen sind.

2. Verfahren zur Herstellung des Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man am Stickstoffatom mit einer Schutzgruppe versehenes Phe kovalent an einen unlöslichen festen Träger bindet, dass man dann die Schutzgruppe vom Phe entfernt, dass man dann Asn mit geschütztem Stickstoff mit dem Phe-kondensiert, anschliessend die Schutzgruppe vom Asn entfernt, dass man dann nacheinander die einzelnen Aminosäuren mit geschützter Aminogruppe in der dem Peptid entsprechenden Reihenfolge an den auf den Träger gebundenen Peptidrest kondensiert und das man schliesslich das so erhaltene Peptid vom Träger löst.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Träger aus 1 % quervernetzten chlormethylierten Polystyrolperlen besteht und dass das synthetisierte Peptid mit Hilfe von flüssigem Fluorwasserstoff vom Träger genommen wird.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, dass man die Kondensation in Gegenwart von Dicyclohexylcarbodiimid in Methylenchlorid durchführt, dass man als Stickstoffschutzgruppe tert-Butyloxycarboxyl verwendet und dass man diese Schutzgruppen unter Verwendung von Trifluoressigsäure in Methylenchlorid entfernt.

5. Verfahren zur Herstellung des Peptids nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man ein die Sequenzplätze 25 - 34 umfassendes Peptidfragment durch lvondensation der die Plätze 29 - 34 und 25 - 28 umfassenden Fragmente herstellt, dass man das so hergestellte Fragment mit einem den Sequenzplätzen 18 - 24 entsprechenden Peptidfragment kondensiert, dass man das so erhaltene Zwischenprodukt, das den Seguenzplätzen 18 - 34 entspricht, mit einem den Sequenzplätzen 13 - 17 entsprechenden Fragment kondensiert, dass man das so erhaltene, den Sequenzplätzen 13 - 34 entsprechende Fragment mit einem den Sequenzplätzen -4 - 12 entsprechenden Fragment ]rondensiert und dass man das so erhaltene Zwischenprodukt schliesslich mit einem Fragment kondensiert, das den Sequenzplätzen 1 - 3 entspricht, wobei man die geschützte Form der Sequenz 1 - 34 des Peptids erhält, und dass man diese geschützte Form durch Entfernen der Schutzgruppen in das gewünschte Peptid überführt.

L e e r s e i t e