SE453510B - Peptid for analys av humant paratyroidhormon - Google Patents

Peptid for analys av humant paratyroidhormon

Info

Publication number
SE453510B
SE453510B SE8107687A SE8107687A SE453510B SE 453510 B SE453510 B SE 453510B SE 8107687 A SE8107687 A SE 8107687A SE 8107687 A SE8107687 A SE 8107687A SE 453510 B SE453510 B SE 453510B
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
added
lys
ser
asp
leu
Prior art date
Application number
SE8107687A
Other languages
English (en)
Other versions
SE8107687L (sv
Inventor
N Nakagawa
S Katsuragi
K Morita
K Ohyama
M Taniochi
T Noda
S Kobari
S Watanabe
Original Assignee
Toyo Jozo Kk
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from JP55187686A external-priority patent/JPS57126456A/ja
Priority claimed from JP5769181A external-priority patent/JPS57184969A/ja
Priority claimed from JP56152377A external-priority patent/JPS5855449A/ja
Application filed by Toyo Jozo Kk filed Critical Toyo Jozo Kk
Publication of SE8107687L publication Critical patent/SE8107687L/sv
Publication of SE453510B publication Critical patent/SE453510B/sv

Links

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K14/00Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575Hormones
    • C07K14/635Parathyroid hormone, i.e. parathormone; Parathyroid hormone-related peptides
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06008Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06034Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 2 to 4 carbon atoms
    • C07K5/06052Val-amino acid
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06008Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/0606Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing heteroatoms not provided for by C07K5/06086 - C07K5/06139, e.g. Ser, Met, Cys, Thr
    • C07K5/06069Ser-amino acid
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C07ORGANIC CHEMISTRY
    • C07KPEPTIDES
    • C07K5/00Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06Dipeptides
    • C07K5/06086Dipeptides with the first amino acid being basic
    • AHUMAN NECESSITIES
    • A61MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61KPREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00Medicinal preparations containing peptides
    • YGENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10STECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/806Antigenic peptides or proteins

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

453 510 2 innehåller icke tyrosin, vilken lätt kan märkas med 1251 medan [Tyrfiz] h-PTH faaan, [rytm] hmm [so-sn och Tyr45] h-PTH [45-84] lätt kan märkas med radioaktiva isotoper och är svår att absorbera på immunreaktionsröret. Det har därför visat sig att dessa h-PTH-fragment ör användbara för märkta föreningar för h-PTH-analys beroende på mindre icke-specifik adsorptian och god kvantitativ analys vid RIA. h-PTH (51-BH) och h:PTH (H6-BH) _innehåller icke amino- syracystein vilken kan mörkas med SH-bindande enzymer. Det har emeller- tid visat sig att dessa peptider kan kvantitativt analyseras baserat på EIA med användning av antikroppar mot h-PTH C-terminala fragment med användning av en peptíd med formeln Rê-Ala4:šGly-Ser~gšn-Arg-Pros1- Arg-Lys -Lys-Glu -Asp-Asn-Val- Leu-Valóo-Glu-Ser-His-Glu-Lys65- Ser-Leu~Gly-Glu-Ala7o-Asp-Lys- Ala-Asp-Val75-Asp-Val-Leu~Thr- Lysso-Ala-Lys-Ser-Gln84~0H [Ia] där Rå betecknar H eller H-Câš -, ingående i den allmänna formeln [I]; dvs. h-PTH [46-84] och [cys45] h-PTH [45-84]. Ållramest föredraget ör att h-PTH eller C-terminala fragment av h-PTH framgångsrikt kan analy- seras med anvöndning av en specifik antikropp erhållen genom 'immun- reaktion mot [Cys45] h-PTH [45-85] eller dess komplex med proteiner, såsom immunkomplex med bovint serumalbumin (BSA) som ett antigen och med användning av enzymmörkta föreningar med formeln 453 510 Rl- Lytaß- Lye -- Glfib- Asp -~ Aon -- Val -- Leu. - Vego-_ Glu -- Ser _i- His -- Glu "- ' 55 90 Lys -- Ser - Len '_ Gly -- G11!- _ Ala '- Asp - Lys ~._A1a '_ Ae? ---Va'l5- AGP_"' vn - Lau - I-crhr --Lyå°- An - Lys -f ser - Gršï- OH. . 2 där* R' betecknar R'1-Pr~o5l-Arg52-, där R'1 betecknar' H eller Rå-Ala46-Gly47-Ser47-Gln49;Arg5O- och där Rê betecknar H eller H-Cys45- inom ramen för peptiderna med formeln [I], dvs h-PTH [51-841, h-PTH [46-84] och [cyås] ner-TH [4s_s4] som en enzymmarkf förening vid EIA.
Synteserno av peptiden [II] enligt föreliggande uppfinning kan utföras på följande sött.
En aminosyra och/eller lägre peptid reageras genom kondensotion för erhållande av aminosyrasekvensen enligt formeln [I] och den skyd- donde gruppen för den reoktíva gruppen frigöres i slutsteget av reak- tionen. Kondensotionsreaktionen kan genomföras genom konventionell peptidsyntes med upprepad anslutning och avlägsnande av skyddande grupper och kondensation. Skyddande grupper för syntesen av utgångsmo- terialet eller mellanprodukterna är konventionella skyddande grupper för peptidsynteser, vilka lött kan avlägsnas genom hydrolys, syro- sänderdelning, reduktion, aminolys eller hydrazinolys.
Exempelvis kan ominogruppen skyddas konventionellt genom en acylgrupp, såsom formyl, trifluoracetyl, ftaloyl, p-toluensulfonyl eller 0- nítrofenyl-sulfonyl, en bensyloxikorbonylgrupp, såsom bensyloxikarbo- 453 510 nyl, o-bromobensyloxikarbonyl, p-bromobensylokíkarbonyl, o- (eller p-) -klorobensyloxíkarbonyl, p-nítrobensyloxikarbonyl eller p-metoxí- bensyloxíkarbonyl, en alífotísk oxíkarbonylgrupp, såsom tríkloroetyl- oxíkarbonyl, t-amyloxíkarbonyl, t-butoxíkarbonyl eller díísopropyl- metoxíkarbonyl eller en oralkyloxíkarbonylgrupp som 2-fenylísopropoxí- karbonyl, 2-tolylísopropoxíkarbonyl eller 2-p-difenyl-ísopropoxíkarbo- nyl. Dessa amínogrupper kan skyddas genom bildningen av enamín rea- gerande med 1,3-díketon , som benzoylaceton eller acetylaceton.
Dessa karboxylgrupper kan skyddas genom amidbíldning, hydrazídbíld- ning eller förestríng. Amídgrupperna substitueras med en 3,4-dimetoxí- bensyl- eller bis-(p-metoxífenyl)-metylgrupp. Hydrazídgruppen substi- tueras med en bensyloxikorbonyl, tríkloretyloxíkarbonyl, trifluoro- acetyl, t-butaxíkarbonyl, trítyl eller en 2-p-difenyl-ísopropoxíkar- bonylgrupp. Estergruppen substítuerades med en alkanol, såsom metanol, etanol, t-butanol eller cyanometylalkohol, en arulkanol, såsom bensyl- alkohol, p-bromobensylalkohol, p-klorobensylalkohol, p-metoxíbensyl- alkohol, p-nítrobensylalkohol, 2,6-díklorobensylalkohol, benshydryl- alkohol, bensoylmetylalkohol, p-bromobensoylmetylolkohol eller p- _klorobensoylmetylalkohol; en fenol, såsom 2,4,6-triklorofenyl, 2,4,5- tríklorofenol, pentaklorofenol, p-nítrofenol eller 2,4-dínítrofenol, eller en tíofenol, såsom tiofenol eller p-nitrotíofenol. Hydroxigruppen i serín eller tyrosin kan om så önskas skyddas genom förestríng eller företríng. En grupp skyddad genom företríng är exempelvis försedd med en acetylgrupp, en bensoylgrupp, en benzyloxikarbonylgrupp eller en etyloxíkorbonylgrupp. En grupp skyddad genom företríng innefattar en bensyl, en tetrahydropyranyl eller en t-butylgrupp. Skyddande av hydroxígruppen kan ske genom en 2,2,2-trífluoro-1-t-butyloxíkar- bonylamínoetyl-grupp eller 2,2,2-trífluoro-1-bensyloxíkarbonylamíno- etylgrupp. Det är emellertid inte alltid nödvändigt att skydda dessa hydroxigrupper. 453 510 Aminogruppen i guanidino-gruppen i arginin kan skyddas med nitro, tosyl, bensyloxikarbonyl eller metylen-2-sulfonyl-grupper. Det är emel- lertid inte alltid nödvändigt att skydda guanidinogruppen.
Iminogruppen i hístidin kan skyddas med bensyl, trítyl, bensyloxi- karbonyl, tasyl, 2,2,2-trifluoro-1-t-butyloxikarbonylaminoetyl eller 2,2,2-trífluoro-1-bensyloxikarbonylaminoetylgrupper, fastän iminagrup- pen inte alltid måste skyddas.
Merkaptogrupper i cystein kan skyddas med bensyl, p-metoxibensyl, p-nitrobensyl, trityl, bensyltíometyl, etylkarbamoyl eller acetamid- metylgrupper.
Peptiden [I] syntetiseras genom kondensation av aminosyror eller lägre peptid. Exempelvis kan en aminosyra eller peptid med en skyddande a- aminogrupp och en aktiverad terminal karbaxylgrupp reagera med en amino- syra eller peptid med en fri a-aminogrupp och en skyddad terminal kar- boxylgrupp. Å andra sidan kan en aminasyra eller peptid med en aktive- rad u-aminogrupp och en skyddad terminal karboxylgrupp reagera med aminosyra eller peptíd med en fri terminal karboxylgrupp och en skyddad a-aminogrupp.
Karboxylgruppen kan aktiveras genom exempelvis en syraazid, en syra- anhydrid, en syraimidazolid eller en aktiv ester, såsom genom omvand- ling till cyanometylester, tiofenylester, p-nítrofenylester, p-nitro- tiofenylester, p-metansulfonylfenylester, tiodylester, en 2,4-dinítro- fenylester, en 2,4,5-tríklorofenylester, en 2,4,6-triklorofenylester, en pentaklorofenylester, en N-hydroxísuccinímídester, en N-hydroxi- ftalimidoester, 8-hydroxikinolinester eller en N-hydroxipiperidín- ester, karbodiimíd, N,N'-karbonyl-díimídazal eller ett isoxazolíum- salt, såsom Woodwards reagens. 455 510 Den föredragna kondensationsreaktionen är metoden innefattande an- vänining av karbodiimid, azid, aktiv ester eller syraanhydrid. Vid kon- densationsreaktionen skall rocemísering noggrannt undvikas och det föredragna förfarandet är aid, aktivester-förfarandet, Wünsch-metod [Z. Naturforsch., 216, 426 (1966Y] eller Geigers metod [Chem. Ber., 103, 788 (1970)], speciellt N~ety1-N'-3-dimetylaminapropyl-karbodiimid (WSCI) som kondensationsmedel.
Förfarandet enligt föreliggande uppfinning sker genom en kondensations- reaktion i aminosyrafrekvensen med formeln [I] och föredrages för syn- tes från C-terminalen.
Den skyddade h-PTH [51-84] syntetiseras företrädesvis genom en modifie- rad Geiger-metod med användning av WSCI med kondensation av C-terminala fragment 55-84 och N-terminala fragment .52-54. C-terminala fragment 55 - 84 syntetiseras företrädesvis med kondensation av fragment 61 - 84 och fragment 57 - 60 med en modifierad Geíger-metod med användning av WSCI, följt av kondensation av 56-te och 55-te aminosyran genom aktiv estermetod, varefter fragmentet 51 - 54 kondenseras med en modi- fierad Geíger-metod med användning av WSCI. Fragmenten 61 - 84 synteti- seras företrädesvis genom sekvenskondensation av fragmenten 72-84 och 71, 70 och 79 aminosyran och fragmenten 62 - 68 och 61-sta aminosyran genom aktiva estermetoder eller modifierade Geiger-metoder med använd- ning av WSCI.
Fragmenten 62 - 68 syntetíseras företrädesvis med azid-metoden med kondensation av fragmenten 647- 68 och fragmenten 62 - 63. Fragmenten 72 - 84 syntetiseras företrädesvis med den modifierade Geiger-metoden med användning av WSCI med kondensatíon av fragmenten 77 - 84 och 76-te, 75-te och 74-e aminosyrorna samt fragmenten 72 - 73. Fragmen- ten 77 - 84 syntetiseras företrädesvis med en modifierad Geíger-metod 453 510 under användning av WSCI med kondensation av fragmenten 82 - 84 och fragmenten 77 - 81.
Skyddad h-PTH [46 - 84] syntetiseras företrädesvis med kondensatíon av C-terminala fragment 55 - 84 enligt ovan och N-terminala fragment 46 - 54 med den modifierade Geíger-metoden med användning av WSCI.
N-terminala fragment 46 - 54 kondenseras företrädesvis gewom azid- metoden med fragmenten 51 - 54 och fragmenten 46 - 50.
Skyddad [Tyrsz] h-PTH [52-84] är företrädesvis ansluten genom den modi- fierade Geiger-metoden med användning av WSCI och skyddad h-PTH [53-84] ovan och den 52-ra tyrosinaminosyron.
Skyddad [Tyräo] h-PTH [50-84] syntetiseras företrädesvis genom konden- sation av skyddad h-PTH [50-84] enligt ovan och den 50-de Tyrosinen med hjälp av den modifierade Geíger-metoden med användning av WSCI. skydddd [Tyäß] hmm [45:84] och skydddd (cyås) hmm [4s-s4] sym- tiseras företrädesvis genom kondensation av skyddad h-PTH [46-84] ovan och motsvarande 45-te amínosyra genom den modifierade Geiger-metoden med användning av WSCI.
Vid peptidsynteserna ovan är den C-terminala karboxylgruppen inte alltid skyddad. Det är genom kondensationsreaktionen genom azid eller aktiv- estermetoden exempelvis inte nödvändigt att skydda den. Karboxylgrup- pen kan skyddas genom förestring, såsom metyl, etyl eller bensylester.
Estergruppen, såsom metylestern kan avlägsnas med utspädd natrium- 455 510 8 _ hydroxídlösníng eller genom omvandling till hydrazíd och bensylester- grgpper kan avlägsnas med vattenfri vätefluoríd eller katalytísk hydro- genering. a-amínogruppen i peptíden skyddas med en konventionellt skyd- dande grupp såsam en bensyloxíkarbonyl-grupp, en t-butoxíkarbonylgrupp eller en t-amylaxíkarbanylgrupp. Bensyloxíkarbonylgruppen avlägsnas ge- nom katalytísk hydrageneríng och t-butoxíkarbonylgruppen och t-amyloxí- karbonylgruppen avlägsnas med trífluorättíksyra. Färedragna skyddande grupper är hydroxylgruppen av serín och treonín med en bensylgrupp, hydroxylgruppen i tyrosín av en 2,6-díklorobensylgrupp; g-amínogruppen í lysín ge nom en o-klorobensyloxíkarbonylgrupp; amínogruppen i guaní- dina-gruppen í argínín med en tasylgrupp, och merkaptogruppen í cysteín- med en p-metoxíbensylgrupp. Dessa skyddande grupper kan avlägsnas med vattenfri vätefluaríd. Acetamídmetylgrupper kan användas som skyddande grupper fär merkaptogruppen i cysteín. Emedan denna grupp är stabil gentemot vattenfrítt fluarväte måste den avlägsnas med kvicksilver- (II)acetat vid pH-värdet 4 vid avlägsnandet av de andra grupperna.
Sålunda erhålles den skyddade h-PTH . (51-84), den skyddade h-PTH (46-84), den skyddade [Tyrsz] h-PTH (52- 84), den ekyddede [Tyrso] h-PTH (so-sei), den ekyddede [ Tyfs] hmm (45-84) och den skyddade [Cys45] h-PTH (45-84). Dessa skyddade grupper kan lämpligen avlägsnas genom sur sänderdelníng, såsom enstegsavlägs- nande av genom vattenfrítt vätefluaríd för erhållande av en färeníng med formeln [I].
När merkaptogruppen í den 45-te amínosyran cysteín är skyddad med acet- amídmetylgruppen, kan denna avlägsnas genom att kvísksilver(II)acetat vid pH -värdet 4 efter avlägsnande av andra skyddade grupper med vat- tenfri vätefluoríd.
Ovanstående förening [I] kan renas med kända reníngsfärfaranden för 453 510 peptider. Den kan exempelvis renas genom kolonnkromatografi med an- vändning av Sephadex LH-20 (varumärke), Sephadex G-50 (varumärke), Dowex 1 ( varumärke) och carboximetylcellulasa.
Peptiden [I] kan erhållas i form av basen eller dess salt. Allmänt kan den skyddas genom saltbildning med organiska syror, såsom ättiksy- ICC Peptiden [I] enligt föreliggande uppfinning, dvs. h-PTH [51 _ 841, hmm [46 _ 841 Qehnzys 45] hmm [4s_s4] ar anvand- bara för antikroppsbíldning och enzymmärkta peptíder. h-PTH [46-84] och [Cys45] h-PTH [45-84] har fördel för framställning av antikroppar.
Speciellt h-PTH_(s1-e_u> är fönaélákfièa för användning ' vid reglering av antikroppsbildningen. En peptid med en N-terminal tyrosin, t.ex. [Tyr52] h-PTH [52-84], [Tyrso] h-PTH [50-84] och {Tyr45] h-PTH [45-84] är speciellt användbara för märkningsmedel på RIÅ. Exempelvis [Tyr52] h-PTH [52-84] eller [Tyrso] h-PTH [50-84] och kloromin T sattes till lämplig mängd radioaktiv 251 i fasfatbuffert (pH-värde 7,4), -omrördes, varefter natriumvätesulfit tillsattes och ytterligare en liten mängd kaliumjodid och serumalbumin . 1251-märkta fraktioner uppsamlades genom kramatografi för erhållande av 1251 konjugerade föreningar till Tyrosin-återstoden, dvs. märkt N . 125 52 n Ü . 125 50 forening I-[Tyr ] h-PTH [52-84] och markt forening I-[Tyr h-PTH [50-84] vilka är användbara som RIA-reagens. 1 Märkning med 1251 och dess adsarption på materialen vid immunreaktians- rör med användning av [Tyr52] h-PTH [52-84] och [Tyrso] h-PTH [50-84] erhållen genom exemplen beskrivna belyses nedan. (1) Märkning med I: 453 510 10 En lösning av (10/ul) av [Tyrsz] h-PTH [52-84] (2/ug) eller [Tyrso] h-PTH [50-84] (2/ug) och en lösning av(20/ug) kloramin T (3,5 mg/ml) tillsattes i 0,5 M fosfatbuffert (pH-vörde 7,5, 50/ul) innehållande 1251-Nol (radioaktívitet 2 m Ci) omrördes under 30 sekunder och till- satt natriumvätesulfatlösning (4,5 mg/ml) (50/ul) för att stoppa reak- tionen. Ytterligare 0,1 N ättiksyralösning (0,5 ml) innehållande 5% humant serumalbumin tillsattes och fick passera genom en kolonn (1 x 50 cm) med Sephadex G-25 för gelfiltrering för avlägsnande av icke-reagerad 1251-NaI och för erhållande av den märkta föreningen 125I-[Tyr52] h-PTH [52-84] och den märkta föreningen 1251-[Tyrso] h-PTH [50-84] (framkallare: 0,1 N öttíksyralösning innehållande 0,5% humant serumalbumin. 125 52 Den specifika aktiviteten av den på detta sätt erhållna I-[Tyr h-PTH [s2-s4] och 1251_[Tyr5°] h-PTH [so-sa] var sza /uci//ug och 545/uCi//ug och utbytet var 75,5 % och 76,7 X. Två gånger böttre spe- ]_ cífik aktivitet och 3-4 gånger bättre'utbyte erhölls jämfört med märkt h-PTH [1-34] eller bovint PTH [1-84] (extraherad produkt). (2) Adsorptíon av 51 mörkt förening i immunreaktionsrör: Provmängd (10,5 ml) av 0,01 M ammoniumacetatlösning (300,000 cpm) 125 52 125 50 I-[Tyr ] h-PTH [52-84] eller I-[Tyr ] h-PTH [50-84] tillsattes till immunreaktíonsröret och tilläts stå under innehållande konstant tid, varefter innehållet avlögsnades och tvättades med över- skottsmängd av destillerat vatten , varefter den återstående radio- aktiviteten räknades i röret för uppmätning av adsorptionen på reaktions- röret. ' 125 52 1-[Tyr ] h-PTH [52-84] var 33,1 % för Pyrex Glass Tube (varunamn), 7,7 X för Eíken rör nr. 1 (varunamn), Adsorptionsförhållanden hos 5,0 % för Maruemu rör (varunamn) och 0,52 för Technicon rör (varunamn). 453 51Û 11 _ u 0 n 125 50 I Adsorptronsforhallanden for I-[Tyr ] h-PTH [50-84] var 38,8 X för Pyrex glasrör, 8,1 X för Eíken-rör nr 1, 5,51 för Moruemu-rör och O,4% för Technicon-rör.
Adsorptíonsförhållandet hos kontrollprov 1251-bovínt PTH [I-84] var 58,41 för Pyrex rör, l5,7% för Eíken-rör nr.1, 12,2% för Naruemu-rör och 4,5% för Technikon-rör.
Adsorptíonsförhållandet beräknades med följande ekvation. återstående radíooktívítet impuls/min. x 100 tillsatt radíoaktívítet (impuls/min) Adsorptionsförhållande (fl = (3) Stabílítet: (0) 1251-[Tyr52] h-PTH [52-84] och 1251-[Tyr50] h-PTH [50~84] lagra- des vid -20°C under 2 dagar, 18 dagar, el dagar eller 60 dagar och upptogs genom gelfíltreríng på Sephadex G-50 (kolonn? 1 x 30 cm, framkallare: 0,1 M ammoníumacetatbuffert). Radíoaktívíteten därav ob- serverades vid lägen motsvarande [Tyrsz] h-PTH [52-84] och [Tyr50] h-PTH och visade sig vara helt stabil. ' (b) Adsorptíonsaktívíteter hos 1251-[Tyr52] h-PTH [52-84] och 125I- [Tyrso] h-PTH [50-84] på talkpuder var 92-98% omedelbart efter adsorp- tion vid -20°C under 2 dagar, 18 dagar, 31 dagar och 61 dagar. Ingen minskning av adsorptíonsaktívíteten observerades.
Human PTH eller dess C-termínala fragment kan analyseras med EIA med användning av peptid med formeln [Ia] eller en peptíd med formeln [Ib] (nedan betecknade peptíd [Ia] och peptíd [Ib]).
Reogenser ör nödvändiga för analys av PTH med EIA , såsom ontíserum, antíkropp eller enzymmürkta föreningar framställes på följande sött. 453 510 12 För erhållande av specifika antikroppar med användning av peptid [Ia], peptíd [Ia] enbart eller peptid [Ia] konjugerat med protein, såsom BSA eller BSA behandlat med alkali eller natríumlaurylsulfat och mer- kaptoetanol för uppdelning av den inre molekylöra disulfidgruppen, administreras till däggdjur såsom kaniner, råttor, marsvin och mus för könsliggörande. Ovanstående peptid [Ia] eller dess proteinkonjugerade förening blandas exempelvis med Freunds fullständiga adjuvant, admini- strerat genom injektion 4-7 gånger under två veckors intervall för känslíggörande av däggdjur. Serum uppsamlat från künsliggjorda djur och konventionellt behandlade, exempelvis genom centrifugeríng för er- hållande av antíserum. Antiserumet innehållande hög koncentration av *specifika antikroppar kan lagras som de ör och kan användas i utspädda provmängder. Specifika antikroppar kan också renas på konventionellt sött genom utsaltning, isoelektrisk utföllning, dialys, kromatografi eller gelfiltrering.
Proteinkonjugerad peptid [Ia] kan erhållas med användning av polyfunk- tionella reagens, exempelvis aldehydföreníngar, såsom succinaldehyd, glutaraldehyd eller adipoaldehyd, diisocyanater, såsom hexametylendiiso- cyanat eller 2,4-toluendiisocyanat, 3-(2'-bensotiazolyl-ditio)propionat- succínímíd-ester (JP , A, 55-17302), 6-N[3-(2'-bensotiazolyl-dítío)- propionyl]kapronsyra-succínímíd-ester och N-[2-(2'-pyridyl-ditio)- etyl]-3-(2'-bensotiazolyl-ditio)-propionamid (JP,A, 55-94367, 55- 133382, 55-136261), maleinimíd-bensoat-succinimíd-ester, N,N'- etylen-bis-maleínimíd, bisdiazobensidin och dietylmalonimidat. Dessa polyfunktionella reagens kan utvöljas med avseende på de funktionella grupperna i peptid [Ia] eller proteinet, såsom amino,'karboxyl eller tiolgruppen. Föredragna exempel på peptid [Ia]-protein-konjugerade föreningar framställdes ur [Cys45] h-PTH [45-84] av peptid [Ia] och palyfunktionella reagens av 3-(2'-bensotíazolyl-ditio)-propionat-succin- ímidester till bundna tíolgrupper i Cys45. 453 510 13 Föredragna förhållanden För kanjugation av en mol protein, såsom BSA för 1-20 moler i peptid [Ia]. Vid reaktionen tillsättes peptid [Ia] i ett vattenhaltigtmedium med pH-vördet 7-8 med tillsatt polyfunktionellt reagens däri, vilket får reagera under kylning vid rumstemperatur under 1-5 timmar och renas genom gelfiltrering. BSA tillsättes därtill var- efter reaktionen fortsätter vid rumstemperatur under 1-5 timmar och renas genom konventionell gelfiltrering och dialys för framställning av peptid [Ia], konjugerad med BSA.
Ovanstående specifika antikroppar är potentiellt bundna med immobilí- serad bärare, exempelvis en immobiliserad proteinbörare, såsom albumín eller gelatin, immabiliserade halvsyntetiska polymerer, såsom agaros, cellulosa eller dextrin, behandlad med epiklorhydrin eller bromocyanat och polymerer eller sampolymerer av akrylnitril, akrylsyra, akrylsyra- ester, metakrylat, metakrylatester, vínylalkahol, vinylacetat, amino- styren, akrylamid eller eten med användning av ovanstående polyfunktionel- la reagens.
Exempel på enzymer för framställning av enzymmörkt peptíd [Ib] för EIA ar oxido-reduktas, hydrolas, transferas, lyas, isomeras eller ligas, exempelvis.hktatdehydrogenas, maleatdehydrogenas, öppelsyradehydrogenas, maltosdehydrogenas, laktatoxidas, malatoxidas, glukosoxidas, cholin- oxidas, xantinoxidas, aminosyraoxidas, sarcosinoxidas, katalas, a-ami- las, B-galaktosidas, lysazym, lipas, alkaliskt fasfatas, aminopeptidas, tripsin, papain, a-chymotrypsin, amidas, hexokinas, och glycerokinas.
Lämpliga mellanföreningar kan tidigare ha införts i dessa enzymer.
Exempel påssådana díaldehyder, såsom glutaraldehyd, reaktiva derivat, såsomflu -amino-öttiksyraklorid, diaminer som bindande av dialdehyd eller dikarboxylsyra och hexametylendiamín eller dekametylenamin, $-acety1- merkaptabörnstenssyraanhydrid och bindning av dialdehyder och 2-amino- etan-tiol. Aldehyd, amino eller tiolgrupper kan införas med användning 453 510 14 ovan nämnda mellanförenings införande reagens.
Peptid [Ib]-enzym-konjugat kan erhållas genom konjugering av peptid [Ib] och amino, hydroxi, karboxyl eller tialgrupper i enzymet eller aldehyd, amina, tiolgrupper kan införas i enzymet eller aldehyd, amino, tiol eller karboxylgrupper införes däri med användning av polyfunktionel- la reagens.
Förfaranden för framställning av enzymmörkta föreningar av peptid [Ib]-enzymkonjugat anges nedan. Exempelvis får peptíd [Ib] reagera med ett polyfunktionellt reagens vid O-40°C i närvaro av organiska lösnings- medel, såsom metanol, etanol, aceton, dioxan, dimetylsulfoxid, dimetyl- acetamid eller tetrahydrofuran i en buffert (pH-värde 6-8) eller direkt i dessa organiska lösningsmedel. Förhållandet mellan peptiden [Ib] och det polyfunktionella reagenset hålles företrädesvis ekvimolört. Efter reaktionen renas reaktionsprodukten om så krävs och enzymet reagerar därvid företrädesvis i en buffert med stabilt pH-värde för enzymet.
Mängden enzym är företrädesvis ekvimolär eller i något molekylört över- skott. Det sålunda framställda peptid [Ib]-enzymkonjugatet kan renas genom adsorptionskromatografi eller gelfiltrering.
Olika konventionella EIA-tekniker kan tillämpas på föreliggande uppfin- ning för analys av h-PTH. Exempel är kompetitiv hämníng eller skikt- metoden.
Detaljer för den kompetitiva hämningen ges nedan.
Prov innehållande h-PTH som skall analyseras, enzymmärkt peptid [Ib] och antíserum eller antikroppar mot peptid [Ia] inkuberas i ett immuno- reaktiansmedium, såsom fosfatbuffert och veronalbuffert vid 4-5°C under 1-3 dagar. Den immunologiskt bundna delen (bunden:B) och den icke bundna fria delen (fri:F) separeras (B-F-separation). B-F-separa- 'r 453 510 15 tionen genomfäres företrädesvis genom tillsats av normalt serum från samma däggdjur som användes för antiserumframställning och antiserum däremot, inkubering över natten och sedan centrifugering vid 3000 v/min under 20-30 min. för B-F-separation. Därefter analyseras enzymaktivi- teten hos utfälld enzym märkt förening (B) eller hos överstående vätska (F). Vid fastfasmetoden användes immobiliserade antikroppar för den kompetitiva reaktionen i stället för antiserum eller antikroppar av peptíd [Ia] i ovanstående kompetítiva metod, varefter B-F-separation genomföras och enzymaktíviteten analyseras på samma sätt som ovan.
Andra konventionellt kända skíktmetoder kan genomföras med lämpliga rea- gens. h-PTH eller dess C-terminala fragment kan analyseras med användning av antikroppar mot peptid [Ia] och enzymmärkt peptid [Ib] med god säker- het och på ett enkelt sätt. Helst utnyttjas B-galaktosidas märkt [Cys45] h-PTH [45-84] för denna analys.
Förkortningarnazi föreliggande beskrivning har följande betydelse.
BOC: t-butoxikarbonyl, AOC: t-amylaxíkarbonyl, PAC: fenacylester, z-Cl: o-klorobensyloxikarbonyl, Éšåš ïâgïšåidometyl T°S: t°Syl' Val: L-valin, OMe: metylester OEt: etylester, ONP: p-nitrotenylester, OBzl: bensylester, Cys: L-cysteín, OSU: N-hydroxisuccinimídester, Ser: L-serin, Thr: L-treonín, Asn: L-asparaginsyra, Glu: L-glutamínsyra, Leu: L-leucin, Pro: L~prolín, MeOH: metanol, Asp: L-asparaginsyra, Arg: L-arginin, Gly: glycin 453 510 16 Åla: L-olunin, Lys: L-lysín, BUOH: bufanol, Tyr: L-tyrosin, TosoH:p-toluensulfonsyro, TFA: trífluoroöttíksyro, THF: tetrahydrofuran, NMM: N'-metylmorfolín, GLn: L~glutamín, His: L-hístídín, Et0H: etanol MP: NÄmetyl-2-pyrrolídon, EtšN: tríetylamín, ether:díetyleter, DMF: dímetylformomíd, TBA: tribensylomín, HOBT: 1-hydroxíbensotriazol, NSCI: N-etyl-N'-dímetylomínopropyl-karbodíímíd, Följande exempel belyser föreliggande uppfinning, exemplen använder följande bärare och framkallníngslösníngsmedel för tunnskíktskromato- grafí.
Bürare: Sílíko-gel G. '(85 : 15 : 5) Framkallare: _ 1. Kloroform - metanol - öftíksyra (95 : 5 :_3) 2. "-"-"-" 3. kloroform-metanol-öttíksyra 4 'I _ 'Ü _ Il _ 'I 5. bensen -etylacetat (1 : 1) 0 u V _ || z (85 : 10 : 5) (80 : 25 : 2) 6 7 kloroform - etanol -etylacetaf (5 : 2 : 5) 8. ll _ il _ II Börare: Merck cellulosa.
Framkallare: (10 : 1 : 5) 9. butanol - pyridín - öttiksyra vatten (2 : 2 : 2 : 3) 10 . u _ u _ u __ (1 : 1 : 1 : 2) Amínosyraanalys genomfördes på följande sött. 453 510 17 Provet hydrolyseras vid 6 N-HCl (anísol tillsatt för skyddande av pep- tíden om så är nödvändigt) vid 110°C under 24-45 timmar i ett förseglat rör och därefter torkades hydrolysatet i vakuum.
Exempel 1. (1) P(83-84); soc-ser(ßz1)-Gln-oßzl [1].
BOC-Gln-0821 (184,4 g, 0,242 H) upplöstes i TFA (270 ml) och omrördes vid rumstemperatur under 45 minuter. Därefter avdestíllerades TFA í va- kuum , eter tillsattes och återstoden fälldes och uppsamlades. Föllníng- en Upplasfes 1 Dnr (270 ml) och Hoßï (32,67 g, 0,242 M), soc-ser(Bz1)_ OH (67,35 g, 0,242 M) och WSCI (44,29 ml, 0,242 M) tillsattes och om- rörníngen fortsatte under natten. Därefter ovdestillerades DNF och åter- stoden upplöstes í etylocetat (440 ml), tvöttodes med 1 N HCI, 5% i notríumvötekorbonatlösníng och vatten. Lösningen torkades genom till- sats av vattenfrítt nutríumsulfat och fíltrerodes och torkades í va- kuum. Omkristallísatíon ur etylacetot-hexan guv substansen [1] (10,143g, utbyte: 81,62).
Smültpunkt; 121 - 123°C.
Tunnskíktskromatogrofí gav ett Rf7= 0,75 453 510 18 27 [u]D = -14,12 (C = 1,0, DMF) Elementaranalys [C27H35O7N9]: C% H% Ní Erhållet: 62,98 7,03 8,01 Beräknat: 63,14 6,87 8,18 (2) P(s2-s4)= soc-LyS(2-cl)-ser(%z1)-Gln-oszl [2]= TFA (440 ml) tillsattes i ämnet [1] (9B.87 g, 192,5 mM), och omrör- des vid rumstemperatur under 30 minuter. TFA avdestíllerades i vakuum. Återstoden upplöstes i DNF (330 ml). HOBT (28,6 g) , DNF-lösning av BOC-Lys(Z-Cl)-OH [BGC-Lys(Z-Cl)-OH-TBA (103,33 g, 1,1 mol överskott) behandlades med etylacetat - 1 N-HCl. Etylacetatfasen torkades med vattenfritt natriumsulfat och índunstades i vakuum] och WSCI [38,72 ml (1,1 mol överskott)] tillsattes. Blandningen omrördes vid rumstemperatur under 2 dagar. DNF avdestíllerades i vakuum och isvatten tillsattes återstoden, varefter den på så sött bildade fällningen upp- samlades. Omkrístallisation skedde tre gånger ur etanol-hexan ,varvíd eihalls en [2] (111,os 9, utbyte; 71,21).
Tunnskiktskrematografi: Rf1=0,32, Rf7=O,76 sma1fpunkf= 145_147°c. [a}2š = -13,1° (C = 1,0 DMF).
Elementaranalys [C4ïH520 N Cl]: 10 5 Ci Hi Ni Erhållet: 61,02 6,65 8,74 Beräknat: 60,77 6,47 8,65 (3) P(80-81):BOC-Lys(Z-Cl)-Ala-0Me [3]: BOC-bys(Z-Cl)-OH-TBA (234,24 9) suspenderad i etylacetat tvöttades med 4í53 5'10 19 1 N-HCl och vatten och torkades med vattenfritt natriumsulfat. Suspen- síonen torkudes i vakuum och upplöstes DNF (400 ml). H-Ala-0Me-HCl (67,0 g), HOBT (64,8 g) och WSCI (87,84 ml) tillsattes och omrördes vid rumstemperatur över natten. DMF avdestillerades i vokuum och återstoden upplöstes i etylacetat (2 l.) tvöttades med 5%-íg natriumvötekarbonat- lösning, 1 N-HCl och vatten. Efter torkning med natríumsulfat indunsta- des lösningen i vakuum. Omkrístallisatíon ur etylacetat-hexan för er- hållande av ömnet [3] (231,8 g, utbyte: 96,6%). smalfpunkf : ss _ 6o°c.
Tunnskíktskromatografi: Rf,=0,77 [@]â7= _17,16 (==1,o, omr) Elementaranalys [C23H3407N3C1]: 6% H75 N71 Erhållet: 54,96 6,78 8,56 Beräknat: ' 55,25 6,85 8,40 (4) P(79-81): BOC-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-OMe [4]: Ämnet [3] (174,99 g, 0,35 M) tillsattes i TFA (500 ml) och omrördes vid rumstemperatur under 50 minuter. TFA destillerades í vakuum. Åter- stoden upplöstes i etylacetat och tvöttades med 5% natriumvötekarbonat och vatten. Lösningen torkades med vattenfritt natriumsulfat och ín- dunstades i vakuum. Återstoden upplöstes i DNF (400 ml). HOBT (49,95 g, 1,05 molört överskott), BOC-Thr(Bzl)-OH (114,33 g, 1,05 molört över- skott) och WSCI (67,7 ml, 1,05 molört överskott) tillsattes och omrör- des vid rumstemperatur över natten. DNF ovlögsnades i vokuum och is- vatten tillsattes till återstoden. Föllningen uppsamlades och omkristal- liserades ur varm etanol för erhållande av ömnet [4] (99,31 9); Moderluten koncentrerades i vakuum. Ãterstoden upplöstes i kloroform och tvöttades fyra gånger med 5%-ig natriumvötekarbonat, två gånger 453 s1o~g 20 1 N-HCl och två gånger med vatten. Efter dehydreríng med vattenfritt natríumsulfat índunstades lösningen í vakuum. Återstoden renades med kiselgelkolonnkromatografí [framkallarez kloroform-etanol-öttíksyra (5:1:5)] varvid erhölls ämnet [4] (35,09 g). Fraktíonerna innehållande föroreníngarna användes í nösta kolonnkromatografíska reníngssteg. Ämnet [3] (22,5 g, 45 mN) tillsattes i TFA (70 ml) och omrördes vid rumstemperatur under 45 minuter. TFA avlögsnades í vakuum och återstoden upplöstes i DMF (50 ml) varefter pH-värdet justerades till 7 genom tillsats av NMM. HOBT (6,68 g, 1,1 molürt överskott), BOC-Thr(Bzl)- OH (15,31 g, 1,1 molört överskott) och WSCI (9,06 ml, 1,1 molört över- skott) tíllsattes och omrördes över natten. Efter uvdestillatíon av DNF i vokuum upplöstes återstoden i kloroform (200 ml) och tvöttades med 5%-íg notriumvötekarbonotlösníng, 1 NfHCl och vatten. Lösningen tor- kades med vattenfrítt natríumsulfat och koncentrerades í vakuum. Åter- stoden blandades med föregående fraktioner innehållande föroreningar och renades genom sílíkagelkolonnkromatografi. Motsvarande fraktion índunstades i vakuum, återutfölldes två gånger med kloroform-hexan, varvid erhölls ämnet [4] (48,80 g). Totalt utbyte: 183,1 g. smanpunkf = 132 _ 1s4°c Tunnskiktskromatografí: Rf7=0,85 Elementaranalys [C34H4709N4Cl]: c% Hvë Nflë Erhållet: 59,06 7,05 7,41 Beräknat: 59,08 6,85 8,11 (5) P(77-78): BOC -Val-Leu-OEt [5]: BGC-Val-OH (101,99 g, 0,47 M), H-Leu-0Et-HCL (9l,98g, 0,47 M), HOBT (63,45 g) och WSCI (86,01 ml, 0,47 M) upplöstes í THF (400 ml) och omrördes över natten. THF destíllerades í vakuum, upplöstes i etylacetat (400 ml) och tvöttades med 5%-ig natríumvötekarbonatlösníng, 1 N-HCl och vatten. Efter torkning med vattenfrítt natríumsulfat in- 462» sm 21 dunstades lösningen i vakuum. Omkrístallisatíon skedde ur etylacetat- hexan varvid erhölls ämnet [5] (153,7 g, utbyte: 91,2%). smalfpunkf; 108 _ 11o°c tunnskiktskromatografí: = Rf1=0,63 27 [a] D = -25,78 (c=1,0, DNF) Elementaranalys [C18H3405N2]: Cfl H1 Nfl Erhållet: 60,35 9,42 8,29 Beräknat: 60,31 9,56 7,82 (6) P(77-78): BOC-Val-Leu-OH [6]: Till ämnet [5] (134,43 g, 0,375 M) upplöst í etanol (400 ml) sattes 1 N-No0H (412,5 ml, 1,1 molürt överskott) under ískylning och omröríng i 1,5 timmar. 1 N-Na0H (37,5 g, 0,1 molört överskott) tillsattes och omröríngen fortsatte under ytterligare 1 timme. 1 N-HCl (75 ml) till- sattes för justering av pH-värdet till 5. Lösningen tvüttades med eter. 1 N-HCl (400 ml) tillsattes vattenfasen och extraherodes med etylacetat.
Efter indunstning av etylacetatfosen omkrístalliserades ur etylacetot- hexan, varvid erhölls ämnet [6] (119,66 g, utbyte: 96,6 1)., Tunnskíktskromatogrofi : Rf]=0,35, Rf7=0,58 Elementaranalys [C16H3O05N2]: C? . Hi N71» erhåller; 57, sa 9, 40 8,78 Beräknat: 58,16 9,15 8,48 (7) P(77-81): BOC-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-OMe [7]: Ämnet [4] (182 g, 0,263 M) tillsattes i TFA (500 ml) och omrördes vid rumstemperatur under 50 minuter. TFA avdestíllerades och hexan till- sattes återstoden. Den utföllda oljíga substansen separerades genom 453 510- 22 dekantering och löstes i DNF (350 ml), vilken var pH-justerad genom till- sats av NMM. HOBT (42,61 g , 1,2 molärt överskott) , ämnet [6] (104,28g, 1,2 molärt överskott) och NSCI (57,8 g, 1,2 molürt överskott) tillsat- tes och omröringen fortsatte vid rumstemperatur 1,5 timmar. Reaktions- blandningen stelnade och var omöjlig att röra genom ytterligare till- sats av DMF (200 ml) , varefter den fick stå över natten vid rumstempe- ratur och vid 30°C under 4 timmar. Isvatten tillsattes och reaktions- blandningen uppsamlades och fällningen upplöstes i kloroform (2,5 l.) och tvättades med 5%-ig natriumvötekarbonatläsning, 1 N-HCl och vatten.
Kloroform avdestillerades och återstoden omkristalliserades ur kloroform- eter-hexan, varvid erhölls ämnet [7] (224,68 g, utbyte: 94,9 X). sma1fpunkf= 219 _ 221°c.
Tunnskiktskromatografi : Rf1=0,15 Rf8 = 0,68 [«]â7 =_11,72 (c=1,o, DMF) Elementaranalys [C45H670 N Cl]: ll 6 6% H% N%~ Erhållet: 59,80 7,56 9,83 Beräknat: 59,82 7,48 9,30 (8) P(77-81): Boc-V01-Lev-ïhr(B21)-Lys(z-cl)-A1°_oH [8]= En 90%-ig etanollösning (800 ml) 1 N-KOH tillsattes under iskylning till ämnet [7] (72,3 g, 80 mM) upplöst i kloroform (720 ml) och omrärdes vid O,5°C under 40 minuter. 1 N-HCl (800 ml) tillsattes under iskylning och extraherades med kloroform (500 ml) vilken åter tillsattes. Kloroform- fasen tvättades med vatten, torkades genom tillsats av vattenfritt na- triumsulfat och indunstades i vakuum. Ãterstoden renades med kíselgel- kolonnkromatografi '[framkallare: kloroform-etanol-etylacetat (5:1:5)]. Motsvarande fraktion torkades och indunstades i vakuum och omkristalliserades tre gånger ur kloroform-metanol-eter-hexan , varvid erhölls ämne [8]. Övanstående operation upprepades tre gånger för att hydrolysera ämnet 4553 5'10 23 [7] (216,9 g) för erhållande av ömnet [8] (156,07 g, utbyte: 73,11). smalfpunkfz 1so_1ss°c.
Tunnskiktskromatografi: Rf3=0,69 [a]š7=-7,54 (c=1,0, DNF) Elementaranalys [C H O N Cl' šH20]: 44 65 11 6 C? H% N% Erhållet: 58,94 7,67 9,64 Beräknat: 58,82 7,40 9,35 Amínosyraanalys [prov 3,1 mg/l ml 6 N-HCl + 0,1 ml anisol, hydroly- serad vid 110°C under 45 timmar]: Thr 0,96 (1) ,Ålc 1, Val 0,93,(1), LeU 0,94 (1), Lys 1,01 (1). (9) P(77-84): BOC-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)- Gln-0Bzl [9]: Ämnet [2] (104,5 g, 129 mM) tillsattes i TFA (400 ml) under omröring vid rumstemperatur under 40 minuter. TFA destíllerades av i vakuum och eter tillsattes återstoden. Bildad föllning uppsamlades och upplöstes i DMF (500 ml). HOBT (2Û,9 g, 1,2 malërt överskott), ämne [8] (137,7g, '1,2 molört överskott) och WSCI (28,3 ml, 1,2 molört överskott) till- sattes därtill, pH-värdet justerades till 7 genom tillsats av en NMM och omrördes över natten. Reaktionsblandningen blev en gel, var- efter tillsattes ytterligare DMF (150 ml) och WSCI (12,8 ml) och om- röringen fortsatte över natten. Isvatten tillsattes reaktionsbland- ningen, bildad föllning uppsamlades och tvüttades fem gånger med varm metanol, varvid erhölls ämne [9] (185,36 g, utbyte: 90,68 X).
Tunnskíktskramatografi: RF2=0,85 ~ [«]â7= -12,84 (c=1,o, DNF) Elementaranalys [C8OH1o7O18N11Cl2]: 4253 5'10 24 CX Hz N% Erhållet: 60,61 7,04 10,38 Beräknat: 60,75 6,82 9,74 Aminosyroonalys [prov 3,1 mg/l ml 6 N-HCl + 0,1 ml onisol, hydrolys vid 110°C under 45 timmar]: Th; 0,93 (1), ser 0,91 (1) , slu 1,01 (1), Alu 1, V01 0,74 (1), Leu 0,75 (1), Lys 2,01 (2). (10) P(76-84): BOC-Åsp(0Bzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Åla-Lys(Z-Cl)- Ser(Bzl)-Gln-0Bzl [10]: Ämne [9] (1aa,s g, 116 mm) fillsqffes 1 TFA (500 ml) och omrördes vid rumstemperatur under 65 minuter och TFA avdestillerades. Eter tillsat- tes återstoden och föllningen uppsomlades, vilken upplöstes i DMF (900 ml). HOBT (18,8 g, 1,2 molört överskott) BOC-Åsp(0Bzl)-OH (45,0 g, 1,2 molürt överskott) och WSCI (25,5 ml, 1,2 molört överskott) till- sattes, varefter pH-värdet justerades till 7 med tillsats av NMM, varefter omröríngen fortsatte vid rumstemperatur över natten. DNF av- destillerades i vakuum och isvatten tillsattes till återstoden. Föll- ningen uppsamlades och tvöttades två gånger med varm metanol. Olöslig- heter upplöstes i varm DNF och etanol tillsattes därtill. Föllníngen upp- samlades, suspenderades och filtrerodes för erhållande av ämnet [10] (205,5 g, utbyte: 99,14%). smalfpunkfz 2s9_262°c.
Tunnskiktskromatografi: Rf2=0,81 [«]â7= -13,7 (c=1,o, Dnr) Elementaranalys [C91H11802]N12Cl2]: C? H1 Ni Erhållet: 61,01 6,84 9,54 Beräknat 61,16 6,66 9,41 (11) P(75-84): BOC-Val-Asp(0Bzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys- (Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-0Bzl [11]: 453 510 25 Ämnet [10] (196,55 g, 0,11 M) tillsattes TFA (500 ml) , omrördes vid rumstemperatur under 60 minuter varefter TFA avlögsnades i vakuum. Eter tillsattes återstoden och füllníngen uppsamlades och upplöstes sedan i DMF (1,3 1)~ Hoßï (19,3 g , 1,3 molarf averskoff), Boc-V01-oH (31,1 g, 1,3 molört överskott) och WSCI (26,2 ml, 1,3 molört överskott) tillsat- tes under omröring varefter pH-vördet justerades till 7 genom tillsats av NMN och omröring vid rumstemperatur. Efter l timme blev reaktions- blandníngen gelande och tilläts stå över natten. NMP (400 ml), 2,4-di- nitrofenol (20,2 g) och WSCI (26,2 ml, 1,3 molürt överskott) tillsattes.
Gelning inträffade inom 10 minuter varefter blandningen tilläts stå över nattent Is och 5%-igt natriumkarbonatvötelösning tillsattes. Föll- ningen uppsamlades och tvöttades tre gånger med vatten och fyra gånger med varm etanol, varvid erhölls ämne [11] (203,74 g, utbyte: 98,21). sma1fpunkf= 267 _ 27o°c Tunnskíktskromatografi Rf3= 0,56 ' Elementaranolys [C9¿H,27O22N,3Cl2.H20]: C? H1 N% Erhållet: ' 60,25 6,78 9,82 Beräknat: 60,55 6,83 9,56 Amínosyraanalys: [prov 3,1 mg/l ml 6 N-HCl + 0,1 ml anísal, hydrolys under 48 timmar vid 110°C]: Asp 1,04 (1), Thr 0,83 (1), Ser 0,78 (1) , Glu 1,03 (1), Ala 1,08 (1), Leu 1, Val 1,87 (2), Lys 2,19 (2). (12) P(74-84): BOC-Asp(0Bzl)-Val-As-(0Bzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)- Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-0Bzl [12]: Ämne [11] (151,2 g, 0,08 M) upplöstes i metylenklorid (100 ml) och TFA (450 ml) och omrördes vid rumstemperatur under 40 minuter varefter TFA avlögsnades i vakuum. Eter tillsattes återstoden. DNF (500 ml) 4253 5'l0 26 NMP (1 l.) tillsattes föllningen för upplösning av densamma. Is och 5% natriumvötekarbonatlösning tillsattes . Den dörvid bildade föllningen uppsamlades, tvättades med vatten och torkades. Blandningen av DMF (500 ml) och NMP ( 11.) tillsattes för upplösning av materialet och BOC-Asp(OBzl)-OSU (44,0 g, 1,3 molärt överskott), HOBT (1,4 g, 0,13 mo- lürt överskott) och NMM (11,4 ml, 1,3 molërt överskott) tillsattes och omröringen fortsatte vid rumstemperatur över natten. Reaktíonsbland- ningen slogs i isvatten och den sålunda bildade föllningen uppsamlades och metanol tillsattes för vörmebehandling. Denna operation upprepa- des två gånger varvid erhölls en med [12] (157,6 g, utbyte:94,2%).
Tunnskiktskromatografi: Rfa = 0,56 Elementaranalys [C107H135025N14Cl2]: C% Hfl Nfi Beräknat: 61,35 6,66 9,90 s;ha11ef= 61,45 6,65 9,38 Aminosyruanqlys [6 N-Hcl/unisol, 11o?c, 48 f1mm@r]= Asp 1,86 (2), Thr 0,87 (1), ser 0,71 (1), clu 1,01 (1), A10 1,oo (1), vel 1,91 (2), Lev 1, Lys 2,01 (2). (13) P(72-73):BOC-Lys(Z-Cl)-Ala-OH [13]: 1 N-NaOH (115,2 ml, 1,2 malört överskott) tillsattes vid 0°C till ömnet [3] (48,0 g, 96 ml) upplöst i etanol (100 ml) och omrördes under 50 minuter. 1 N-HCl (19 ml) tillsattes för justering av pH-värdet till 6, varefter etanol avdestíllerades vid 35°C. Etylacetat, is-vatten och 1 N-HCl (96 ml) tillsattes återstoden för extraktion. Etylacetatfasen tvöttades med vatten, torkades genom tillsats av vattenfritt natrium- sulfat och indunstades i vakuum. Återstaden omkristalliserades ur etylacetat-hexan varvid erhölls ömne [13] (45,9O g, utbyte: 98,4 X). _sma11pUnkf = 11e-119°c Tunnskiktskromatografi: Rf7=0,44 453.510 27 Elementaranalys: [C22H32O N Cl]: 7 3 CX H% Ní Erhållet: 54,57 6,91 8,95 Beräknat: 54,37 6,64 8,65 (14) P(72-84): BOC-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(0Bzl)-Val-Asp(0821)-Val-Leu- Thr(Bzl)-Lys(ZCl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln-OB2l [14]: Metylenklorid (60 ml) och TFA (360 ml) tillsattes ämnet [12] (125,46 g, 60 mM), omrördes vid rumstemperatur 55 minuter, varefter TFA destíllerades av. Eter tillsattes återstoden och fällningen upp- samlades. DNF (600 ml) och NMP (600 ml) tillsattes för upplösning.
Is och 5%-ígt natríumvätekarbonatlösning tillsattes därtill. Det sålunda utföllda materialet uppsamlades, tvättades tre gånger med vatten och tvättades åter med metanol och eter och torkades. NNP (1200 ml) och DMF (600 ml) tillsattes för upplösning av materialet. HOBT (10,56 g, 1,3 molärt överskott) ämnet [13] (37,92 g, 1,3 molärt överskott) och WSCI (14,28 g, 1,3 molärt överskott) tillsattes därtill och omrördes vid rumstemperatur under 3 dagar. Reaktíonsblandningen slogs i isvatten, fällningen uppsamlades och tvättades tre gånger med vatten, varefter den tvättades två gånger med varm metanol. 'Ytterligare material tvät- tades med eter och torkades ,varvíd erhölls ämne [14] (142,74 g, utbyte: 96,7 %).
Elementaranalys [C124H16,O29N27Cl3]: C? H% N? erhållet: 6o,3o 6,79 9,70 Beräknat: 60,54 6,60 9,68 Aminosyraanalys [6N-HCl/anísol, 110°C, 48 tímmar]: Asp 1,86 (2), Thr 0,85 (1), Ser 0,67 (1), Glu 1,02 (1), Ålc 1,90 (2) Val 1,93 (2), Leu 1, Lys 2,93 (3). (15) P(71-84); ßoc-Asp(oßzl)-Lys(z-cl)-A10-Asp(oBz1)-vfl1-Asp(oßz1)-va1- ' Lev-Thr(B21)-Lys(z-cl)-A10-Lys(z-cl)-ser(ßz1)-cln-oezl [1s]= 453 510 za Ämne [14] tillsattes till TFA (420 ml), omrördes vid rumstemperatur under 55 minuter och därefter avdestillerades TFA i vakuum. Eter till- sattes återstoden, föllningen uppsamlades och därefter tillsattes NP (720 ml) och DNF (720 ml) för upplösning. Blandningen slogs i is och 5%-ig natriumvötekarbonatlösníng, varefter den bildade föllningen upp- samlades, tvöttades tre gånger med vatten, en gång med metanol och eter. NNP (840 ml) och DNF (840 ml) tillsattes för upplösning av mate- rialet. HOBT (O,732 g, 0,14 molört överskott), 2,4-dinitrofenol' (11,93 g, 1,2 molarf averskoff), soc-A$p(B=1)-osu (3,1s g, 1,2 molarf överskott) och NMN (5,94 ml, 1,4 molört överskott) tillsattes och om- röríngen fortsatte vid rumstemperatur 2 dagar. NMP (120 ml) och DNF (60 ml) tillsattes reaktionsblandningen för upplösning av materialet.
BOC-Asp(OBzl)-OSU (4,56 g, 0,2 molört överskott) och NNN (1,19 ml, 0,2 molört överskott) tillsattes för ytterligare omröring vid rumstempe- ratur under 2 dagar. Reoktionsblandningen slogs i isvatten, föllníngen uppsamlades och tvöttades med vatten vilken suspenderades i varm metanol.
Efter kylning fíltrerades föllningen. Denna operation upprepades tre gånger , varvid erhölls ömne [15] (136,72 g, utbyte: 95,01).
Elementöranalys [C135H172O32N18Cl3]: Cfl H% N? Erhållet: 60,33 6,55 9,76 Beräknat: 60,83 6,51 9,46 Amínosyraanalys [6 N-HCl/anisol, 110°C, 48 timmar]: Asp 2,60 (3), Thr 0,83 (1), ser 0,65 (1), alu 1,00 (1), A10 1,81 (2), Val 1,92 (2), Leu 1, Lys 2,85 (3). (16) P(7O - 84): BOC-Ala-Asp(0821)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)- ' - vq1_Leu_Thr(B21)-Lys(z-cl)-A10-Lys(z-cl)-ser(ßz1)_ Gln-OBzl [16]: Ämne [15] sattes till TFA (325 ml), omrördes vid rumstemperatur under 4453 5'lÛ 29 70 minuter och därefter avdestillerades TFA i vakuum. Eter sattes till återstoden. Föllningen uppsamlades och NP-(600 ml) och DNF (600 ml) tillsattes för upplösning av materialet, varefter tillsattes 5%-ig natríumvötekarbonatlösning. Föllningen uppsamlodes och tvöttades tre gånger med vatten och en gång med metanol. Föllningen upplöstes i NNP (720 ml) och DNF (720 ml). 2,4-dinitrofenol (9,0 9), HDBT (0,55 g, 0,1 molört överskott), BOC-Ala-OSU (17,52 g, 1,5 malört överskott) och NNN (6,72 ml, 1,5 molört överskott) tillsattes och omrördes vid rums- temperatur över natten. Ytterligore BOC-Ala-OSU (2,34 g) och NNN (0,9 ml) tillsattes och omrördes vid rumstemperatur under 5 dagar. Reaktions- blandningen slogs sedan i isvatten, föllníngen uppsamlades, tvöttades tre gånger med vatten och två gånger med metanol, varvid erhölls ömne
[16] (109,78 g, utbyte: 98,3 %).
Smöltpunkt: över 280°C (sönderdelning) Aminosyraanalys [6 N-HCl/anisol, 110°C, 48 timmar]: Asp 2,57 (3), Th; 0,34 (1), ser 0,67 (1), Giv 1,00 (1) A10 2,53 (3), vel 1,93 (2), Leo 1, Lys 2,79 (3). (17) P(69 -84): BOC-Glu(0Bzl)-Ala-Asp(0Bzl)-Lys(Z-Cl)-Åla-Asp(0Bzl)- Val-Asp(0Bzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Åla-Lys(Z-Cl)- Ser(Bzl)-Gln-0821 [17]: 1 Ämnet [16] (85,38 g, 31,2 mN) tillsattes i TFA (280 ml). omrördes vid rumstemperatur 60 minuter, varefter TFA avdestillerades; Eter tillsattes återstoden, föllningen uppsamlades, upplöstes genom tillsats av DNF (540 ml) och NNP (540 ml) och lösningen sattes till en blandning av 5% natriumvötekarbonat och is. Föllningen tvöttades tre gånger med vat- ten och en gång med metanol. Denna upplöstes i DNF (600 ml) och NNP (780 ml). 2,4-dínitrofenol (6,89 g, 1,2 molört överskott), HOBT (0,59 g, 0,14 molört överskott), BOC-Glu(0Bzl)-OSU (18,97 g, 1,4 molört överskott) och NNN (4,8 ml, 1,4 molört överskott) tillsattes och om- rördes vid rumstemperatur under 3 dagar. BOC-Glu(0Bzl)-0SU (2,71 g, 4!53 5'10 30 0,2 molürt överskott) upplöstes i DMF (60 ml) och N°1P (50 ml) och NMN (O,64 ml, 1,4 molärt överskott) tillsattes därtill och omrördes yt- terligare vid rumstemperatur under tre dagar. Ytterligare samma mängd av BOC-Glu(0Bzl)-OSU och NMM som ovan tillsattes och omrördes vid rums- temperatur över natten. Reaktionsblandningen slogs på is-vatten, den sålunda bildade föllningen uppsamlades och tvöttades tre gånger med vot- ten. Föllningen suspenderades i varm metanol, kyldes och filtrerades.
Denna operation upprepades tre gånger för erhållande av substansen (17) (88,97 g, utbyte 96,5%).
Aminosyrqqnulys [6 N-Hcl/6n1s61, 11o°c, 24'h ); Asp 2,66 (3), Th: 0,91 (1), ser 0,78 (1), G16 1,76 (2), A10 2,65 (3), V61 1,97 (2), Lev 1, Lys 2,88 (3). (18) P(66 - 68):BOC-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OBzl [l8]: WSCI (33,69 ml) tillsattes droppvis i BOC-Leu-0H.H20 (45,64 g), H-Gly-OBzl-Tos0H (61,87 g) HOBT (24,87 g) upplöstes i THF (200 ml) under kylning och omrördes vid rumstemperatur över natten. Reaktionsblandning- en koncentrerades i vakuum för erhållande av oljigt material, vilket upp- löstes i etylacetat (600 ml) och tvöttades tre gånger med en 5%-ig na- triumvötekarbonatlösning, 1 N-HCl och vatten. Den organiska fasen tor- kades genom tillsats av vattenfritt natriumsulfat och indunstades i vakuum, varvid erhölls ett oljigt ämne (69,0 g, utbyte: 99%). Detta upplöstes i metylenklorid (10 ml) TFA tillsattes (250 ml) vid 5°C och omrördes vid rumstemperatur under 20 minuter. TFA avdestillerades dör- efter i vakuum, DMF tillsattes (200 ml) till återstoden och neutralise- rudes genom tillsats av NMM vid o°c. Hoer (2o,7 9, 0,19 M), ßoc_ser(ßz1)_ OH (56 g, 0,19 M) och NSCI (34,8 ml, 0,19 M) tillsattes därtill och omrördes vid rumstemperatur över natten. DNF avlögsnades i vakuum, etylacetatet tillsattes återstoden som sedan tvüttades med 5%-ig natriumvütekarbonatlösning, 1 N-HCl och vatten. Efter torkningen med 453 516 31 vattenfrítt natriumsulfat koncentrerades blandningen i vakuum. Hexan tillsattes till återstoden och föllningen uppsomlades genom filtre- 'ring. Omkristallisatíon skedde ur etylacetat-hexan och etylacetat- eter-hexan, varvid erhölls [18] (72,47 g, utbyte: 72,0 %). sma1fpUnkf= 112 _ 11a°c Tunnskiktskromatografi: Rf5=0,55 Elementaranalys [C30H41O7N3]:_ c% H% N% erhåller: 65,06 7,75 7,36 Beräknat: 7 64,84 7,44 7,56 (19) P(65 - 68):BOC-Lys(Z~Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-0821 [19]: TFA (250 ml) tillsattes vid 5°C till ömnet [18] (72,47 g, 0,13 M) upplöstes i metylenklarid (20 ml) och omrördes vid rumstemperatur un- der 20 minuter. TFA avlögsnades i vakuum och eter tillsattes återstoden.
Föllningen uppsamlades och DNF tillsattes. NMM tillsattes vid 5qC för att neutralisera lösningen.
Etylacetat (200 ml) tillsattes till BOC-Lys(Z-Cl)-OH-TBA (70 g, 0,143 M) och tvöttades två gånger med 1 NHCl och vatten. Etylacetat- fasen torkades med vattenfritt magnesiumsulfat och koncentrerades i vakuum. DMF (100 ml) tillsattes det erhållna oljiga materialet för bild- ning av DMF-lösning av BOC-Lys(Z-Cl)-OH.
Till ovanstående neutraliserade DMF-lösning sattes HOBT (19,3 g) DNF-lösning av BOC-Lys(Z-Cl)-OH och WSCI (26,2 ml, 0,143 M) och omrör- des vid rumstemperatur över natten. DNF avdestillerades i vakuum, etylacetat tillsattes (400 ml) till återstoden och tvöttades tre gånger med en 5%-íg natríumvötekarbonatlösning, två gånger med 1 N-HCl och två gånger med vatten. Den organiska fasen torkades med vattenfritt magnesíumsulfat och koncentrerades i vakuum. Eter och hexan sattes till återstoden, varvid det sålunda utföllda materialet uppsamlades 4453 5'10 32 och omkristalliserades ur etylacetat-metanol-hexan, varvid erhölls
[19] (104 g, utbyte: 94,6%), sma1fpunkf= 128 _ 180°c.
Tunnskíktskromatografi Rf1=0,51, Rf2=0,88 Elementaranalys [C44H58010N5Cl]: ex 8% L 18 erhållet; . 61,96 7,02 7,91 8erakn6f= .62,00 6,86 8,22 Aminosyrqunulys [1/0m61/6 N-Hcl 0,8 m1, 1os°c, 20 fimm6r]= ser 0,92 (1), sly 0,98 (1), Lev 1, Lys 0,99 (1). (20) P(65 _ 68): 80c_Lys(z_c1)-s6r(Bz1)-Lsu-sly-0H [20]= Metanol (600 ml) tillsattes substansen [19] (85,3 g), 1 N-Na0H (120 ml) tillsattes under omröring vid 5°C, varefter omröríngen fort- satte vid rumstemperatur under 3 timmar. Efter tillsatsen av 1 N-HCl (20 ml) vid 5°C avdestíllerades metanol i vakuum. 1 N-H01 (100 ml) tillsattes vattenlösníngen av återstoden vid 5°C, varefter denna extra- herades med kloroform (500 ml). Kloroformfosen tvöttades med vatten, torkades med vattenfritt natríumsulfat och koncentrerades i vakuum.
Hexan tillsattes återstoden, varefter föllníhgen uppsamlades och om- krístalliserades ur etylacetat, varvid erhölls ämnet [20] (6ó,21 g, utbyte:87%). sma1fpunkf= 156 _1s8°c Tunnskiktskromatografí: Rfz = 0,63 Elementaranalys [C37H5201ON5Cl]: ox H% N% Erha11ef= 58,49 6,95 9,09 seraknqfz 58,80 6,88 9,19 Amínosyraanalys [1/umol/0,3 ml, 6 N-HCl, 105°C, 20 timmar]: 453 510 33 Ser 0,92 (1), Gly 0,97 (1), Leu 1, Lys 0,99 (1). (21) P(64 - 68):BOC-Glu(0Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly-OH [21]: Metylenklorid (300 ml) tillsattes ämnet [20] (66,2 g, 87 mmol), TFA tillsattes (250 ml) vid 5°C och omrördes vid rumstemperatur under 45 minuter. TFA ovdestíllerades i vakuum och eter tillsattes till åter- stoden. Füllníngen uppsamlades och upplöstes i DNF (100 ml), vilken neutraliserades genom tillsats av NMM vid 5°C. DNF (500 ml) tillsattes åter beroende på bildning av föllningen. BOC-Glu(0Bzl)-OSU (50 g, 113 mmol) och HOBT (1,53 g, 11,3 mmol) tillsattes, neutraliserades med NN och omrördes vid rumstemperatur över natten. DNF avdestillerades i vakuum och återstoden slogs i vatten. De sålunda erhållna föllningar- na tvöttades med vatten och torkades. Omkristallísation skedde två gånger ur aceton~metanol , varvid erhölls ämnet [21] (63,85 g, utbyte: ' 73, 5%) .
Smältpunkt: 165-16700 (söhderdelníng) Tunnskiktskromatografi: Rf4=0,72 Elementaranalys [C49H650]4N6Cl]: C% H% N% Efleneh 5261 q76 &s1 Beräknat: 59,00 6,57 8,42 Aminosyruunulys [o,927 mg/0,3 m1 , 6 N_Hc1, 1o5°c, 24 fimm°r]= ser 0,92 (1), alu 0,99 (1) , sly 0,97 (1), Lev 1, Lys 0,99 (1). (22) P(62 - 63):BOC-Ser(Bzl)-Hís-M-IM12 (221: THF (150 ml), H-His-oMe.2Hc1 (31,s g, 0,13 M) och Host (17,6 9, 0,13 M) tillsattes till BOC-Ser(Bzl)-OH (37 g, 0,125 mol). WSCI (23,8 ml, 0,13 M) tillsattes därtill, DMF tillsattes (150 ml) och om- rördes vid rumstemperatur över natten. HOBT (4,4 g) och NSCI (6 ml) tillsattes åter, varefter omrörníngen fortsatte vid rumstemperatur över 4553 5'1Û 34 natten. Lösningsmedlet avdunstades i vakuum, återstående oljigt mate- rial upplöstes i etylacetat och tvöttades tre gånger med en 5%-ig natriumvätekarbonatlösning och vatten. Efter torkning med vattenfritt magnesiumsulfat koncentrerades lösningen. Hexan tillsattes återstoden vilken uppsamlades som en föllning och amkrístalliserades ur etylacetat- eter-hexan, varvid erhölls oren BOC-Ser(Bzl)-His-0Me (tunnskiktskroma- tografí : Rf3=O,56) (46,l g).
Ovanstående produkt (44,6 g) upplöstes i DNF (300 ml). Hydrazinhydrat (100 Z) (100 ml) tillsattes och amrördes under rumstemperatur över natten. DNF avlögsnades i vakuum. Återstoden extraherades åtta gånger med etylacetot och extraktet tvöttades med små mängder vatten, varef- ter det torkades med vattenfritt magnesiumsulfat. Lösningen koncentre- rades i vakuum, hexan tillsattes återstoden och en fällning uppsamlades, vilken renades genom kíselgelkromatografi [framkallare: kloroform- metanol-etylacetat (5:O - 1 : 5) ]. Motsvarande fraktioner uppsamlades, torkades i vakuum och omkristallíserades ur bensen-hexan (liten mängd).
Sedan den fått stå i isskåp, utfölldes kristaller vilka omkristalisera- des två gånger ur etylacetat-metanol-hexan, varvid erhölls ämnet
[22]. sma1fpUnkf= 12s_129°c Tunnskiktskromatografí: Rf4=0,7O, Rf7=O,l4 Elementaranalys [C21H30O5N6]: C% Hfl Ni ' Erhållet: 56,30 6,98 18,54 Beräknat: 56,49 6,77 18,81 (23) P(62 - 68): BOC-Ser(Bzl)-His-Glu(OBzl)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu- Gly-OH [23]: Dioxanlösning (52 ml) av 4,32 N-HCl och isoamylnitril (20 ml) till- sattes till ämnet [22] (33,5 g) upplöstes í DNF (200 ml) vid Å5O° C 455 510 as och omrördes vid -20°C under 10 minuter. Et3N (31,6 ml) tillsattes vid -so°c.
Metylenklorid (20 ml) tillsattes ämnet [21] (63,85 9,64 mmol). TFA (200 ml) tillsattes vid 5°C och omrördes vid rumstemperatur under 50 minuter. TFA destillerades av i vakuum, eter tillsattes det återstående oljíga ämnet och den sålunda bildade föllningen uppsamlades , vilken upplöstes i DMF (200 ml), varefter den neutraliserades med NM vid 5°c.
Neutraliserad DNF-lösning .tillsattes till ovanstående tríetylamin- behandlade lösning och omrördes i isskåp över natten och vid rumstempe- ratur över natten. DNF ovlügsnades i vakuum och återstoden upplöstes i metanol. Lösningen slogs i vatten, varefter den bildade föllníngen tvöttades med vatten och torkades. Därefter omkristolliserades den ur DMF-eter, tvüttades två gånger med metanol och därvid erhölls ämnet
[23] (59,16 g, utbyte: 60,1 %).
Smöltpunkt: 209-213°C (sönderdelning) Tunnskiktskramatografi: Rf4=0,66 Elementoranalys [C¿5H83O17N1OCl]: c% H% N% Erha11ef= 59,43 6,58 10,67 Beraknuf= 59,51 6,38 10,68 Amínosyraanalys [1,549 mg/0,5 ml, 6 N-HCl, 105°C, 21 tímmar]: Ser 1,82 (2), Glu 1,01 (1), Gly 0,98 (1), Leu 1, Lys 1,01 (1), His 0,94 (1). (24) P(62 - 84): BOC-Ser(Bzl)-His-Glu(0821)-Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Leu-Gly- o1u(oßz1)_A1°-Asp(oazl)-Lys(z-cl)-A10-Asp(oB21)_vu1_ Asp(oßzl)-val-Leu-Thr(B21)-Lys(z-c1)-A1q-Lys(z-c1)- Ser(Bzl)-Gln-0Bzl [24]: 1FA (250 ml) tillsattes ämnet [17] (75,35 g, 25,5 mmol) och omrördes 453 510 36 vid rumstemperatur under 60 minuter. TFA cvlögsnades i vaküum och eter tillsattes återstoden. Fëllníngen uppsamlades och upplöstes i NMP (500 ml) och DNF (500 ml). Reaktíonsblcndningen slogs i ís-(%- íg natriumvötekarbonatlösning, füllningen uppsamlades och tvöttades med vatten och metanol. Föllningen upplöstes i NMP ( 1l.) och DNF ( 1 l.). 2,4-dinitrofenol (5,61 g, 1,2 molört överskott), HOBT (4,08 g, 1,2 mo- lürt överskott), ämnet [23] (40,16 g, 1,2 molört överskott) och WSCI (5,6 ml, 1,2 molärt överskott) tillsattes och omrördes vid rumstem - peratur under 4 dagar. Reaktionsblandningen slogs sedan i 5%-ig natríum- vötekarbonatlösning-is och filtratet uppsomlades och tvöttades med vatten, varm metanol och två gånger med metanol för erhållande av ämnet _[24] (93,53 g, utbyte:88,4%), Aminosyraanalys: Asp 2.6 7 (3). Thr 0,8 1 (1). ser 1,3 7 (s). Glu 2,5 9 (3)G1y 0,7 6 (1), Ala 2,6 8 (3), Val 2, Leu 1,7 4 (2), Lys 3,66 (4), His 0,6 6 (1) (~25)P( -Ser(Bzl) - His - GIu(0Bzl) - Lys(Z-Cl) - 5er(B2l) - Leu - Gly - Glu(0Bzl) - Ala - Åsp(OBzl) - Lys (Z-Cl) - Ala - Åsp(0Bzl) - Val - Asp(0Bz1) - Val - Leu - Thr(Bz1) - Lys(Z-Cl) - Ala - Lys(Z-Cl) - Ser (Bzl) ~ Gln - 0Bzl [25] TFA (150 ml) tillsattes till ämnet [24] (41,5 g, 10 mmol) , omrördes vid rumstemperatur under 60 minuter och TFA avlögsnades. Eter tillsattes till återstoden, füllningen uppsamlades, vilken föllning upplöstes i DNF (300 ml) och NMP (500 ml). Lösningen slogs sedan i en lösning av 5%-ig natriumvötekarbonat-is, föllningen uppsamlades, tvättodes med vatten och metanol.
DNF (700 ml) och NMP (600ml) tillsattes för upplösning. 2,4-dinitro- 453 510 37 fenol (2,2 g, 1,2 molört överskott) , BOC-Glu(0Bzl)-OSU (6,08 g, 1,4 mo- lört överskott), HOBT (0,23 g, 0,14 molört överskott) och NMM (1,52 ml, 1,4 molört överskott) tillsattes och omrördes vid rumstemperatur över natten. BOC-Glu(0Bzl)-OSU (0,87 g, 9,2 molört överskott) och NM (0,22 ml, 0,2 molört överskott) tillsattes och omröringen fortsatte vi- dare över natten. Reaktionsblandningen slogs i is-51-ig vattenlösning av natriumvötekarbonat, föllníngen uppsamlades, tvöttades med vatten och metanol. DMF (700 ml) och NMP (600 ml) tillsattes för upplösning av föllningen. 2,4-dinitrofenol (2,2 g, 1,2 molört överskott) ,BOC- Glu(0Bz1)-OSU (6,08 g, 1,4 molört överskott), HOBT (0,23 g, 0,14 molört överskott) och NMM (1,52 ml, 1,4 molört överskott) tillsattes och om- rördes vid rumstemperatur över natten. BOC-Glu(OBzl)-OSU (0,87 g, 0,2 molört överskott) och NMM (0,22 ml, 0,2 molört överskott) tillsattes ytterligare till reaktionsblandningen och omrördes över natten. Reak- tionsblandningen slogs i ett ísbad-5%-ig natriumvötekarbonatlösning, föllningen uppsamlades, tvöttades fullständigt med vatten och därefter tre gånger med varm metanol , varvid ömnet [25] erhölls (40,7 g, Utbyte: 93,2 %).
Aminosyraanalys [6 N-HCl/anísol, 110°C, 48 timmar]: Asp 2,66 (3), Thr 0,85 (1), Ser 1,56 (3), Glu 3,14 (4), Gly 0,71 (1), Ala 2,65 (3), Val 2, Leu 1,73 (2), Lys 3,67 (4), His 0,63 (1). (26) P(59 - 60): BOC-Leu-Val-0Bzl [26]: Etylacetat (100 ml) tillsattes H-Val-0Bzl-TosoH (17,8 g, 47 mmol), tvöttades med 5% natriumvötekarbonatlösning och vatten, torkodes med vattenfritt natríumsulfat och etylacetatet avlögsnades. Återstoden upp- lassfes i DMF (100 m1) . Boc-Leu-oimnzo (n,7 g, 56,4 mmol), HoBT (9,3 g, 1,2 molört överskott) och WSCI (10,3 ml, 1,3 molört överskott) till- sattes och omrördes vid rumstemperatur över natten. DMF avlögsnades 4!53 5'I0 aa återstoden upplöstes i etylacetat (300 ml) och tvöttades med en 52-ig _vattenlösning av natriumvätekarbonat , 1 N-HCl och vatten. Efter tork- ning med vattenfrítt natriumsulfat índunstades lösningen i vakuum. Åter- stoden omkristalliserades ur etylacetat -hexan för erhållande av ämnet [26] (17,55 g, utbyte: 88,8 %).
Tunnskíktskromatografí: Rf6=0,85 (27) P(58 - 60): BOC-Val-Leu-Val-Oßzl [27]: TFA (50 ml) tillsattes ömnet [26] (17,2 g, 41 mmol), omrördes vid rums- temperatur och TFA avlügsnades. Eter tillsattes återstoden, füllningen uppsamlades, vilken fällning upplöstes i DMF (60 ml). HOBT (7,7 g, 1,2 molört överskott), BOC-Val-OH (1,07 g, 1,2 molört överskott)och WSCI (9,0 ml, 1,2 molärt överskott) tillsattes därtill, pH-värdet juste- rades till 7 genom tillsats av NMM, varefter omröríng vid rumstemperatur fortsattes över natten.DMF avlägsnades, återstoden upplöstes í etyl- acetat (300 ml) och tvüttades med en vattenlösníng av 5%-íg natríumvüte- karbonot, T N-HCl och vatten. Lösningen torkades med vattenfritt na- triumsulfat och torkades i vakuum. Ãterstoden omkristalliserades två gånger ur etylacetat-hexan, varvid erhölls ämnet [27] (17,38 g, utbyte: 81,6 %), sma1fpUnkf= 149_1s2°c.
Tunnskíktskromatografi : RF5=0,82 [ajâz = -ams Elementaranalys [C28H4506N3]: Ci H% N% Erhållet: ' 64,80 8,81 8,20 Beräknat: 64,71 8,73 8,09 (28) P(57 - 60):BOC-Asn-Val-Leu-Val-0Bzl [28]: TFA (50 ml) tillsattes ämnet [27] (17,15 g, 33 mmol), varefter bland- ningen omrördes vid rumstemperatur under 25 minuter, varefter TFA av- 4553 5'10 39 t avlögsnades. Eter tillsattes återstoden och föllningen uppsamlades och upplöstes i DMF (100 ml). HOBT (0,62 g, 0,14 molört överskott), och BOC- Asn-ONP (16,32 g, 1,4 molört överskott) tillsattes därtill, pH-värdet justerades till 7 genom tillsats av NMM, varefter blandningen omrördes vid rumstemperatur under 2 dagar. DMF avlögsnades i vakuum, och åter- stoden slogs i en vattenlösníng av 5% natríumvötekarbonat-is. Föllningen upplöstes i kloroform, tvöttades med en ' 5%-ig natríumvötekarbonatlös- ning och vatten. Lösningen torkades med vattenfrítt natriumsulfat -och índunstades i vakuum. Återstoden omkristalliserades två gånger ur etanol-eter varvid erhölls ämnet [28] (13,82 g, utbyte: 79,51).
Tunnskiktskromatografi: Rf2=0,70 Elementaranalys ' [C32H5,08N5]: C? H1 N? Erhållet : 60,83 8,19 11,09 Beräknat: 60,64 8,11 11,05 (29) P(57 - 60): BOC-Asn-Val-Leu-Val-OH [29]: Ämnet [28] (13,2 g, 25 mmol) upplöstes i etanol (50 ml) och DMF (60 ml). 5% Pd/C ( 1 g) tillsattes och hydrogenerades under 3 timmar.
Katalysatorn avfiltrerades och filtratet koncentrerades i vakuum. Återstoden omkristalliserades två gånger ur etanol-eter ,varvid erhölls ämnet [29] (9,70 g, utbyte:71,4%).
Tunnskiktskromatografi:Rf2=0,56 Aminosyraanalys: Asp 1,02 (1), Val 1,95 (2), Leu 1 (1).
Elementaranalys [C25H4508N5]: C% H% N% erhållet; 55,02 8,13 13,06 seraknuf= 55,23 8,34 12,88 (30) P(57 - 84): BOC-Asn-Val-Leu-Val-Glu(0Bzl)-Ser(Bzl)-His-Glu(0Bzl)- Lys(Z-Cl)-Ser(Bz1)-Leu-Gly-Glu(0Bzl)-Ala-Asp(0Bzl)-Lys (Z-Cl)-Ala-Asp(0821)-Val-Asp(0Bzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)- Lys ( Z-CD-Ala-Lys ( Z-Cl )-Ser(Bzl)-Gln-0Bzl [30]: 453 510 40 TFA (150 ml) tillsattes ämnet [25] (39,75 g, 9,1 mmol) och omrördes vid rumstemperatur under 60 minuter. TFA avlägsnodes och eter tillsat- tes återstoden, fällningen uppsamlades, vilken fällning upplöstes i DMF (600 ml) och NMP (600 ml). Läsningen slogs i is-5%-ig vattenlös- ning av natriumvätekarbonat, fällningen filtrerades och tvättades tre gånger med vatten och en gång med metanol. NMP (1,2 1) och DMF (1,2 l.) tillsattes och fällníngen upplöstes. HOBT (1,60 g, 1,3 molärt över- skott), 2,4~dinitrofenol (2,18 g, 1,3 molärt överskott), ämne [29] (6,43 g, 1,3 molärt överskott) och WSCI (4,32 ml, 2,6 molärt överskott) tillsattes därtill och omrärdes vid rumstemperatur under 2 dagar.
Ytterligare ämne [29] (0,99 g, 0,2 molärt överskott) upplöstes i DNF (100 ml) och tillsattes däri samt omrärdes vid rumstemperatur över nat- ten. Reaktionsblandningen slogs i en 5%-ig läsning av natríumvätekar- bonot-is, Fällningen uppsamlades, suspenderades i DNF (100 ml) och upphettades. Efter kylning av blandningen filtrerades oläsligt mate- rial. Ytterligare olösligt material behandlades med metanol och etanol under upphettning på samma sätt som ovan för att erhålla ämne [30] (42,25 g, utbyte: 97,2%).
Amínosyraanalys: Asp 3,34 (4), Thr 0,93 (1) , Ser 1,60 (3), Glu 3,24 (4), Gly 0,85 (1), Ala 3, Val 3,39 (4), Leu 2,58 (3), Lys 4,24 (4), His 0,79 (1). (31) P(56 - 84): B 0 C - Asp (0821)- Åsn - Val - Leu - Val - Glu(0Bzl)- Ser(Bzl) - His - Glu(0Bzl) - Lys (Z-Cl) - Ser(Bzl) - Leu- Gly - Glu (0821) - Ala - Asp(0Bzl) - Lys(Z- Cl)-Ala - Asp(0Bzl) - Val - Asp (0Bzl) - Val - Leu-Thr(Bzl)-Lys(Z- Cl - Ala - Lys(Z-Cl)-Ser(Bzl)-Gln -oszusn ,_..___._..___..._.-~... .Msn q-.gq va., 453 510 41 TFA (150 ml) sattes till ämnet [30] (28,7 g, 6 mmol) och omrördes vid rumstemperatur under 50 minuter. TFA avlügsnades och eter tillsattes återstoden. Föllningen uppsamlades och torkades över Na0H'över natten.
Föllningen upplöstes i DNF (300 ml) och HMP (500 ml) . HOBT (0,16 g, 0,2 molört överskott) och BOC-Asp(0B2l)-OSU (5,04 g, 2 molärt överskott), pH-värdet justerades till 7,0 genom tillsats av NNM och omrördes vid rumstemperatur över natten. Ytterligare BOC-Asp(0Bzl)-OSU (2,5O g, ekvimolört) tillsattes och omrördes över natten. Reaktionsblandningen slogs i is-vatten, fällningen uppsamlades, tvöttades med vatten och därefter tillsattes metanol för behandling genom upphettning. Efter kyl- ning avlügsnades olösligt material genom filtrering. Ovanstående upp- hettníng upprepades tre gånger för erhållande av ömnet [31] (27,75 g, utbyte; 92,5 %).
Aminosyraanalys: Asp 4,00 (5), Thr 0,92 (1), Ser 1,69 (3), Glu 3,57 (4), Gly 0,81 (1), Ala 3, Val 3,22 (4), Leu 2,62 (3), Lys 4,12 (4), His 0,62 (1). (32) P (55 _ 84): B o c -G1u(øßz1)- Asp(OBzl)-Asn - Val - Leu - Val - Glu(0Bzl) - Ser(Bz1) - His - Glu(0 Bzl) - Lys(Z-Cl) - Ser(Bz1) - Leu -Gly - Glu(0Bzl)- Ala - Åsp(0Bzl)- Lys(Z-Cl) - Ala - Asp(0Bzl) -Val-Asp(0 Bzl)-Val - Leu - Thr(Bzl) - Lys(Z-Cl)-Ala -Lys(Z-Cl) - Ser(Bz1) - Gln - 0321 [32] TFÅ (150 ml) tillsattes ämnet [31] (27,50 g, 5,5 mmol) och omrördes vid rumstemperatur under 55 minuter. TFA avlögsnades och eter tillsat- tes återstoden, füllningen uppsamlades och torkades över Na0H under 2 dagar. Föllningen upplöstes i DNF (300 ml) och MP (500 ml). 2,4-dinitrafenol (1,01 g, ekvimolöra mängder), HOBT (0,11 g, 0,15 453 510 42 molürt överskott) och BOC-Glu(0Bzl)-OSU (3,10 g, 1,3 molört överskott) tillsattes därtill , varefter blandningen omrördes över natten vid rumstemperatur . Ytterligare BOC-Glu(0Bzl)-OSU (3,10 g, 1,3 molört överskott) tillsattes och omrördes 2 dagar. Reaktionsblandningen slogs is- en vattenlösníng av 5%-ig natriumvötekarbonat. Föllningen tvöttades två gånger med natríumvötekarbonat och tre gånger med vatten. Metanol sattes till föllningen som upphettades och olöslígt material avfíltre- rades efter kylning. Ovanstående vürmebehandlíng upprepades tre gånger för erhållande av ämnet [32] (26,77 g, utbyte 93,3%).
Aminosyraanalys: Asp 4,11 (5), Thr 0,92 (1), Ser 1,59 (3), Glu 3,99 (5), Gly 0,83 (1), Ala 3, Val 3,28 (4), Lev 2,49 (3), Lys 4,08 (4), His 0,71 (1). (33) P(53 - 54): BGC-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-PAC [33]: BOC-Lys(Z-Cl)-OH-TBA (36,6 g, 75 mmol) suspenderades i etylacetat (300 ml) , tvöttades med is- 1 N-HCl och vatten. Etylacetatfasen torka- des med vattenfrítt natriumsulfat, torkades i vakuum och upplöstes i DNF (50 ml). Fenacylbromid (19,40 g) och Et3N (13,6O ml, 1,3 molört överskott) tillsattes därtill och blandningen omrördes vid rumstempera- tur under 4 timmar. Natriumacetat (3,68 g, 0,5 molört överskott) upplöstes í etylacetat (500 ml) och tillsattes reaktíonsblandníngen, vilken sedan tvöttades tre gånger med en vattenlösníng av 5% natríum- vötekarbonat, 1 N-HCl och vatten. Efter torkning av etylocetatfasen med vattenfritt natríumsulfat indunstades denna i vakuum. Återstoden renades genom kiselgelkolonnkromatografi [framkallarez bensen - etyl- acetat (2:1) ] , fraktíonerna uppsamlades uppvisande ett RF,-värde på 0,77 vid tunnskíktskromatografí och torkades i vakuum. Ãterstoden omkrístalliserades ur eter-hexan, varvid erhölls BOCpLys(Z-Cl)-PAC (23,46 g, utbyte:60,5 %). smanpunkf; 52 _ 54°c 453 510 43 Tunnskíktskromatografi: Rfï-värde = 0,86 TFA (60 ml) sattes till ovanstående produkt (20,68 g, 40 mmol) och omrördes vid rumstemperatur under 20 minuter. TFA avlögsnades, varefter eter tillsattes återstoden, föllningen uppsamludes och upplöstes i DNF (50 ml). (Betecknad som DNF, lösning A).
BOC-Lys(Z-Cl)-OHfTBA (23,42 g, 1,2 molört överskott) suspenderades i etylacetat (200 ml) och tvüttades med is - 1 N-HC1 (200 ml) och vat- ten (100 ml). Efter torkning av etylacetatfosen med vattenfritt natrium- sulfat, torkades denna i vakuum. Därvid erhölls ett oljigt material vilket upplöstes i DNF (50 ml). (Betecknad som DNF, lösning B).
DMF lösning B, HOBT (6,48 g, 1,2 molört överskott) och WSCI (8,78 ml, 1,2 molört överskott) tillsattes till DNF, lösning Å, pH-värdet juste- rades till 7 genom tillsats av NNN och omrördes vid rumstemperatur över natten. DNF avlögsnades i vakuum, återstoden upplöstes i eter (500 ml) och tvöttades tre gånger med 5%-ig vattenlösning av natriumvötekarbonat.
Etylacetat (300 ml) sattes till eterfasen, vilken sedan tvöttades tvâ gånger med 1 N-HCl och tre gånger med vatten. Den organiska fasen tor- kodes med vattenfritt natriumsulfat och koncentrerades i vakuum. Åter- stoden omkrístalliserades tre gånger ur eter, varefter ämnet [33] erhölls (18,73 g, utbyte: 57,5 2). smaupunkf; 72 _ 7s°c.
Elementaranalys: [C4]H5O010N4Cl]: 6% H% N75 Erhållet: 59,22 5,98 6,81 Beräknat: 59,35 6,07 6,75 (34) P(5a _ 54): ßoc-Lys(z_c1)_Lys(z_c1)_oH [34] 453 510 44 Ämnet [33] (4,07 g, 5 mmol) upplöstes i ëttiksyra (30 ml). Zinkpulver (20 g/üttiksyra (30 ml) tillsattes och omrördes vid rumstemperatur under 1,5 timmar. Zinkpulvret avlügsnades och filtratet koncentrerades under avlägsnande av öttiksyran. Ãterstoden upplöstes i eter (100 ml) och ex- traherades tre gånger med en 5%-ig vattenlösníng av natriumvötekarbonat (70 ml). Vattenfasen justerades till pH-värdet 5 genom tillsats av 1 N- HCl under iskylning, varefter den extraherades med etylacetat. Etylace- tatfasen tvöttades med vatten, torkades med vattenfritt natrïumsulfat och torkades i vakuum. Återstoden omkrístalliserades ur eter-hexan, varvid erhölls ämnet [34] (3,08 g, utbyte 85,8 %). I Smältpunkt: 59 - 62°C.
Tunnskiktskromatografi: Rf2=0,45 Elementaranalys [C33H4409N4Cl2]: Cfi H% Nfl Erhållet: 55,58 6,40 7,58 Beräknat: 7 55,69 6,23 7,87 (35) P(53 - 84): B 0 C - Lys(Z~Cl)- Lys(Z-Cl) - Glu(0Bzl) - Asp(OBzl)- Asn - Val - Leu - Val - Glu(0Bzl)- Ser(Bzl) - His - Glu(0Bzl) - Lys (Z-Cl) - Ser(Bzl) - Leu - Gly ~ Glu (0Bzl) - Ala - Asp(0Bzl) - Lys(Z-Cl) -Ala - Åsp(0Bzl) - Val - Asp(OBzl)- -Val - Leu - Thr(Bzl) - Lys(Z-Cl) -Ala - Lys(Z-Cl) - Ser(Bzl) - Gln -0Bzl [35] TFA (50 ml) sattes till ämnet [32] (7,83 g, 1,5 mmol) och omrördes vid rumstemperatur under 55 minuter. TFA avlögsnades, eter tillsattes åter- stoden, föllningen uppsamlades , vilken föllníng upplöstes i DNF 453 510 45 (150 ml) och NMP (150 ml). HOBT (0,41 g, 2,0 molürt överskott), ämnet
[34] (2,13 g, 2,0 malört överskott) och WSCI (O,55 ml, 2,0 molört över- skott) tillsattes, varefter omröringen fortsatte vid 5-10°C under 3 dagar. Reaktíonsblandníngen slogs i is-vatten, föllninaen uppsamlades, tvöttades med vatten och upphettades med metanol. Efter kylning upp- samlades olöslígt material genom filtrering. Vörmebehandlíngen upprepa- des tre gånger varvid erhölls ämnet [35[ (8,31 g, utbyte: 95,3 %). Åmínosyraanalys: Thr 0,92 (1), Ser 1,60 (3), Glu 4,06 (5), Gly 0,85 (1), Ala 3,00 (3) , Val 3,33 (4), Leu 2,48 (3), Lys 5,41 (6), His 0,70 (1).
Exempel 2. h - P T H (51 - 84): H - Pro - Arg - Lys - Lys - Glu - Asp - Asn - Val - Leu - Val -Glu - Ser - His - Glu - Lys - Ser - Leu - Gly - Glu - Ala - Asp - Lys - Ala - Asp - Val - Asp - Val - Leu ~ Thr - Lys - Ala - Lys - Ser - Gln - O H 453 510 iaf. (1) P (51 - 84) : B 0 C - Pro - Arg (Tas)- Lys(Z-Cl) - Lys(Z-Cl) - Glu(OBzl) - Åsp(OBzl) - Asn ~ Val - Leu - Val - Glu(0Bzl) - Ser(Bzl) ~ His - Glu(0Bzl) -Lys(Z-Cl) - Ser(Bzl) - Leu -Gly - Glu(0Bzl)- Alu - Aspuaßzl) - Lys(z-c1)- Ala - Asp(OBzl) - Val - Asp(OBzl) - Val - Leu - Thr(Bzl) - Lys(Z-Cl) - Ala - Lys (z-c1) - serum) - Gln - oßzl [39] TFA (50 ml) sattes till ämnet [32] (7,82 g, 1,5 mmal) erhållen enligt exempel 1 och omrördes vid rumstemperatur under 60 minuter. TFA avlägs- nades och etern tillsattes återstoden. Föllningen uppsamlades och upplöstes i DNF (120 ml) och NMP (120 ml). HOBT (O,3O g, 1,5 molört överskott), ämnet [38] (2,52 g, 1,5 molört överskott) med formeln BOC-Pro-Arg(Tas)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-OH och WSCI (O,41 ml, 1,5 molört överskott) tillsattes varefter omröríngen fortsatte under 2 dagar vid rumstemperatur. Reaktíonsblandníngen slogs därefter í ísvatten.
Den sålunda bildade föllníngen tvöttades med vatten och metanol och sattes till föllníngen, vilken behandlades under upphettníng. Efter kyl- ning uppsamlades olöslígt material. De ovanstående upphettníngsopera- tíonerna upprepades två gånger och tvöttníngen med eter för ernållande av ämnet [39] (8,2O g, utbyte:87,9 X).
Amínosymnelys; Asp 4,09 (s), The 1,05 (1) , ser 2,30 (3), 4453 Sflfl 010 4,08 (5), Pro 0,52 (1), 01y 0,83 (1), Alu 3, vel 3,42 (4), Lev 2,53 (3), Lys 5,11 (6), His 0,69 (1) , Arg 0,51 (1). (2) h-PTH [51 - 84]: Ämnet [39] (3,73 g, 0,6 mmol) och anisol (4 ml) sattes till HF (40 ml) vid 0°C under omröríng 60 minuter. HF avdestillerades i vakuum och etern tillsattes återstoden. Föllningen uppsamlades och fick passera ge- nom en kolonn av Dowex XI (acetatfarm, 2,7 x 33 cm) efter upplösning í öttiksyra (50 ml). Eluatet lyofiliserades för erhållande av en oren pro- dukt (2,41 g), Denna upplöstes i 8 N karbamid (50 ml), pH-värdet justerades till 10,0 genom tillsats av vattenlösníng i ammoniak, varefter den tilläts stå un- der 30 minuter, Lösningen överfördes till en kalonn (4,2 x 11,5 cm) CM-cellulosa packad med B M vottenhaltig karbamid, varefter karbamiden av- lögsnades genom tillsats av 0,01 M ammoníumacetat (pH-värde 4,5), var- efter den eluerades med linjör gradientelution av 0,01 M ammoniumacetat (pH-vörde 4,5, 700 ml) - 0,1 M ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) och eluera- des med 0,2 H ammoniumacetat (pH-värde 4,5, 250 ml). Eluatet fraktionera- des med fraktioner om 8,5 ml och varje fraktion provades med Folin-Lowry- metoden (500 nm) för erhållande av froktíonerna 30 - 63 (fraktion C, ), fraktionerna 105-150 (fraktion C2) och fraktionerna 151-195 (fraktion C3).
Fraktíon C2 och fraktion C3 fick passera genom Sephadex LH-20 för avsalt- ning. Eluatet fraktionerades med fraktioner på 5,2 ml. Fraktion C2 fick passera en kalonn (3,4 x 110 cm) för erhållande av fraktionerna 51-63 (fraktion C2L,) och fraktionerna 64-80 (fraktion C2L2). Fraktíonen C3 fick passera genom en kalonn (3,4 x 120 cm) varvid erhölls fraktionerna 50-69 (fraktion C3L,) och fraktionerna 70-78 (fraktion C3L2). Varje frak- tion lyofiliserades för erhållande av komponenter visade i följande tabell. ovensfående frokfioner (32L2 (375 mg) upplösw i 0,1 N affiksyre (4 m1) matodes till en kalonn (2,0 x 31 cm) CM~ce1lulasa och eluerades genom HB 4553 5'l0 S S.. ä... mmg. mod åá mwá m mo; ä... :nä 86 2.; ä". 5 no @>.° ~>.=J>~.° m@.m _@.m m~.m m +@.° Nm.« «~.m m°.~ mw.+ ßøfl .J nu äá å... ä... åzm åá .lää m aczo šæ .äš ä... æé mä Ä No @m.° @m.° G@.° mm.m m@.~ m@.n m «@.° mm.+ æ_.~ N°.~ æm.« GOA. :_ No E 3 E S. 3 É E 3 š E É š é. _ ß % kmšoÜ. .Ä mha m_.I P3 :Å __..> .wïlšü EC .Bm .EB amáknp: -#95 m>fimznm._ïflmo:flë< houzozoneox Lä 4133 5110 línjör gradientelution med 0,01 M ammoniumacetat (pH-vörde 4,5, 500 ml) -0,2 M ammoníumacetat (pH-vörde 4,5, 500 ml). Eluatet fraktíonerades för varje 7,5 ml och fraktionerna 85-103 (fraktion C2L2-C) erhölls. Dessa fördes genom en kolann av Sephadex LH-20 (3,0 x 123 cm) för avsaltníng.
Eluatet fraktíonerades för varje 6 ml fraktion för erhållande av frak- tianerna 34-42 (fraktion C2L2-CLI) och fraktionerna 43-50 (fraktion C2L2-CL2). Varje fraktion lyofiliserades för erhållande av följande frak- tioner.
C2L2-CL1: 80,0 mg Aminosyraanalys: Asp 4,95 (5), Thr 0,98 (1), Ser 2,47 (3), elu 5,14 (5), sly 1,01 (1), A10 3 (3), vel 4,05 (4), Leu 3,02 (3) Lys 6,16 (6), His 0,96 (1) Arg 0,97 (1) , Pro 1,06 (1).
C2L2-CL2: 197,6 mg.
Amínosyraanalys: Asp 5,00 (5), Thr 0,93 (1), Ser 2,30 (3), Glu 5,17 (5), sly 1,o1 (1), A10 3 (3), v01 4,03 (4), Leu 3,00 (3), Lys 6,15 (6), His 0,95 (1), Årg 1,01 (1), Pro 1,04 (1).
Fraktíonerna C2L2-CL2 (195 mg) ovan upplöstes i 0,1 N öttiksyra (2 ml) och överfördes till en kolonn (2,0 x 15 cm) med CM-cellulosa och elue- rades genom linjör gradíentelutíon med 0,01 M ammoníumacetat (pH-värde 4,5, 300 ml) - 0,2 N ammoniumacetat ( pH-vörde 4,5, 300 ml). Eluatet fraktionerades i fraktioner på 6,4 ml vardera för erhållande av fraktioner- na 55-64 (fraktion CZL2-CL2-C1) och fraktíanerna 66-72 (fraktion C2L2-CL2-C2), Varje fraktion fick passera genom Sephadex LH-20 för avsalt- ning. Fraktíonen C2L2-CL2~C1) fick passera genom en kolann (3,0 x 123 cm) och eluatet fraktionerades i fraktioner om 7,4 ml vardera för erhållande av fraktíanerna 31-38 (fraktion C2L2-CL2-ClL1) och fraktíanerna 39-43 (fraktion C2L2-CL2-C1L1). Fraktionen C2L2-CL2-CIL1 lyafiliserades för erhållande av h-PTH [5]-84] (77,2 mg).
Tunnskiktskromatografi : R1O= 0,89 (en fläck). 453 510 ef.
Exempel 3. h-PTH [46-84]: H-Alo-Gly- Ser - Gln - Arg - Pro - Arg - Lys - Lys - Glu - Asp - Asn - Val - Leu ß Vol - Glu - Ser - His - Glu - Lys - Ser - Leu - Gly - Glu - Ala - Asp - Lys - Ala - Asp - Val - Asp - Vol - Leu - Thr - Lys - Ala - Lys - Ser - Gln - 0 H (1) P (46 - 84): B O C - Åla - Gly - Ser(Bzl) - Gln - Årg(Tos) - Pro- Arg (Tos) - Lys(Z-Cl) - Lys(Z-Cl) - G1u(O Bzl) - Asp(OBzl) - Asn - Vol - Leu - Val - Glu(0Bzl) -_Ser(Bzl) - His - G1u(oBz1) _ Lys(z-cl) _ ser(Bz1) _ Leu - Gly - Glu(OBzl) ~ Ala - Åsp(OBzl) -Lys(Z-Cl) - Ala - Asp(OBzl) - Vol - Asp(OBzl) - Val - Leu - Thr(Bzl) - Lys(Z~Cl) - Ala - Lys(Z-Cl) - Ser(Bzl) -cln _ om [46] TFA (80 ml) tillsoftes substansen [32] í exempel 1 (10,44 g, 2 mmol) och omrördes vid rumsfemperofur under 60 minuter. TFA ovlögsnades i vakuum och efer tillsattes återsfoden för bildning av en fällning, vil- ken upplöstes vid DMF (160 m1) och NMP (160 m1). Ämnef [45] (4,28 g, 1,15 molört överskoft) med formeln BGC-Ala-Gly-Ser(Bzl)-Gln-Arg(Tos1-Pro-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-OH HOBT(O,32 g, 1,2 molört överskoff) och WSCI (O,44 ml, 1,2 molörf över- skott) tillsattes därtill och omrördes vid rumsfemperotur 2 dagar.
DMF ovlögsnodes i vokuum. Isvaften fillsoffes åferstoden och den från- fílfrerode föllningen upphettodes efter tillsats av metanol (200ml) 453 510 Efter kylning uppsamlades olösligt material. Denna operation upprepades två gånger för erhållande av ämnet [46] (12,17 g, utbyte: 87,4 1). (2) h-PTH [46-84]: Ämnet [46] (4,18 g, 0,6 mmol) och anísol (10 ml) tillsattes i HF (60 ml) vid 0°C och omrördes under 60 minuter. Efter reaktion ovdestillerades HF i vokuum och eter tillsattes återstoden. Föllningen uppsamlades, upplöstes i 10%-ig öttiksyra (50 ml) och fick passera genom en kolonn Dowex XI (aeetotform, 2,5 x 24 cm). Eluatet lyofiliserades för erhållande av den arena produkten (2,82 g)', vilken upplöstes i 8 M karbamid (pH- vörde 9,0, 50 ml) och tillåts stå vid rumstemperatur under 60 minuter.
Lösningen påfördes en kolonn (2,0 x 33 cm) CN-cellulosa packad med 8 M karbamidlösning och eluerades genom linjär gradientelution med 0,1 M ammoniumacetat (pH-värde 4,5, 500 ml) - 0,3 M ammoniumacetat (pH-värde 4,5, 500 ml). Eluatet fraktionerades i fraktioner på 7,5 ml , vilka pro- vades med Folin-Lowry-metoden (500 nm) för erhållande av fraktion nr 1-22 (fraktion C1), fraktionerna 23-45 (fraktion C2), fraktionerna 46-80 (fraktion C3) och fraktionerna 81-120 (fraktion C4). Varje fraktion fick passera genom en kolonn med Sephadex LH-20 för avsaltning. Fraktion C fick passera genom en kolonn (3,0 x 120 cm) för fraktionering av 1 fraktioner med vardera 7,5 ml och för erhållande av fraktionerna 28-42 (fraktion CIL). Fraktíon C2 till fraktioner på 7,6 ml , varvid erhölls fraktionerna 33-40 (fraktion fick passera genom en kolonn (3,4 x 120 cm) C2L,) och 41-62 (fraktion CZL2). Fraktion C3 fick passera genom en kolonn (3,0 x 120 cm) under bildning av fraktioner på vardera 6,0 ml varvid er- hölls fraktionerno 31-40 (fraktion CSL1) och fraktianerna 41-51 (fraktion C3L2). Fraktion C4 fick passera genom en kolonn (3,4 x 120 cm) , och uppdelades i fraktioner på vardera 7,5 ml , varigenom erhölls fraktioner- na 35-48 (fraktion C4 ). av fraktion C1L (312 mg), C2L] (142,3 mg), C2L2 (1380 mg), C35] (104 mg), C3L2 (510 mg) och C4L (130 mg).
Vordera parten lyofiliserades för erhållande 453 510 *Q Ovanstående fraktion C2L2 (1380 mg) upplöstes i 0,1 N öttiksyra (13 ml) och överfördes på en kolonn (4,3 x 6,0 cm) CN-cellulosa och eluerades genom linjär gradientelution med 0,01 M ammoniumacetat (pH-värde 4,5, 500 ml) - 0,3 M ammoniumacetat (pH-värde 4,5, 500 ml). Eluatet fraktione- rades till fraktioner på 7,6 ml varvid erhölls fraktion 40-50 (frak- tion C2L2-C,) och 53-77 (fraktion C2L2-C2). Varje fraktion fick passera genom Sephadex LH-20 för avsaltning. Fraktionen C2L2-C, fick passera en kolonn (2,9 x 120 cm), eluatet fraktíonerades till fraktioner på 8,0 ml varvid erhölls fraktionerna 26-30 (fraktion CZL2-C,L,) och 31-39 (frak- tion C2L2-C,L2). Fraktíonen C2L2-C2 fick passera genom en kolonn (3,4 x 120 cm) och fraktionerades i fraktioner på 8 ml , varvid erhölls frak- tionerna 34-44_(fraktion C2L2-C2L,) och nr 45-53 (fraktion C2L2-C2L2).
Varje fraktion lyofiliserades för erhållande av fraktion C2L2-C,L2 (79,o mg), c2L2-c,L2 (455 mg), cZLZ-cZL, 057,3 mg) och cZLZ-CZLZ (5517 m9).
Aminosyraanalys av fraktion CZL2-C2L2: Asp 4,65 (5), Thr 0,97 (1), Ser 3,47 (4), Glu 5,99 (6), Pro 0,93 (1), Gly 1,96 (2), Ala 4 (4), v01 3,97 (4), Lau 3,01 (3), Lys 6,13 (s), His 0,93 (1), Arg 1,96 (2).
Fraktionen C2L2-CZL2 upplöstes i 0,1 N öttiksyro (5 ml) och överfördes till en kolonn (4,2 x 7,0 cm) CM-cellulosa och eluerades med linjär gradientelution av 0,01 M ammoniumocetat (pH-vörde 4,5, 300 ml) - 0,3 M ammoniumacetat (pH-värde 4,5, 300 ml). Eluatet fraktionerades i fraktioner om 8,0 ml för erhållande av fraktionerna 39-45 (fraktion C2L2-C2L2-C), vilka överfördes till en kolonn (2,9 X 120 cm) Sephadex LH-20 för avsalt- ning. Eluatet fraktionerodes i fraktioner om 8 ml varvid erhölls frak- tionerna 24-30 (fraktion C2L -C L -CL,), fraktionerna 31-35 (fraktion 2 2 2 C L -C L -CL2) och fraktionerna 36-39 (fraktion C L2-C2L2-CL3). Varje 2 2 2 2 2 fraktion lyofiliserades varvid erhölls fraktion C2L2-C2L2-CL2 (200 mg) och fraktion C2L2-C2L2-CL, (h-PTH _[46-841, 94,9 mg), Tunnskiktskromatogrofi gav Rf9=0,76. 453 510 r_ -1 ka' Amínosyrounclys: Asp 4,86 (5), Thr 0,99 (1), Ser 3,58 (4), Glu 6,17 (6), Pro 0,96 (1), Gly 1,97 (2), Ålo 4 (4), v01 4,02 (4), Leu 2,93 (a), Lys 6,05 (e), His 0,90 (1), Årg 1,87 (2).
Exempel 4. [fyr 45] h-PTH(4s_s4)= Hmyr Ala-Gly - Ser- Gln - Arg - Pro - Arg I - Lys - Lys - Glu - Asp - Asn - Vol - Leu - Val - Glu - Ser - His - Glu - Lys - Ser - Leu - Gly - Glu Alu - Asp - Lys - Ala - Asp - Vol - Asp - Val - Leu - Thr - Lys - Ala - Lys -'Ser - Gln - 0 H (1) P (45 - 84): B 0 C - Tyr(BZl-C12) - Alu - Gly - Ser(Bzl) - Gln - Arg(Tos) ~ Pro - Arg(Tos) - Lys(Z-Cl) - Lys(Z-Cl) -Glu (OBzl) - Asp(0Bzl) - Asn - Val - Leu - Vol - Glu(OBzl) - Ser(Bz1) - His - Glu (0821) - Lys(Z-Cl) - Ser(Bzl) - Leu- Gly - Glu(OBzl) - Alu - Asp(0Bzl) - Lys (Z-Cl) - Alu - Asp(0Bzl) - Vol - Asp(0Bzl) - Vol ~ Leu - Thr(Bzl) - Lys(Z-Cl) - Alu - Lys(Z-Cl) - Ser(Bzl) - Gln - 0Bzl
[47] TFA (60 ml) sattes till ämne [46] (6,27 g, 0,9 mmol) í exempel 3 och omrördes vid rumstemperatur under 60 minuter. TFA ovlögsncdes i vckuum och efer fíllsurtes återstoden, Föllníngen fíltrerodes för erhållande av de-BÛC förening (6,3O g).
Ovonsrående de-BOC förening (2,10 g, 0,3 mmol) upplöstes i DNF (35 ml) 453 5.10 och NMP (35 ml). BOC-Tyr(Bzl-C12)-OH (0,16 g, 1,2 molört överskott), HOBT (0,05 g, 1,2 molört överskott) och WSCI (0,07 ml, 1,2 molört över- skatt) tillsattes vid OOC och amrördes vid rumstemperatur över natten.
DNF avlögsnades och isvatten tillsattes återstoden . Föllníngen filtrera- des och dörvid erhölls ömne I47] (2,00 g), (z) [Tyr45]-h_.PTH [45-841; Ämne [47] (2,00 g, 0,27 mmol) och anisol (1,0 ml) tillsattes till HF (20 ml) vid ODC och amrördes under 60 minuter. HF avdestillerades i vakuum och eter tillsattes återstoden. Den sålunda erhållna föllningen uppsamla- des, upplöstes i 0,1 N öttiksyra (20 ml) och fick passera en kolonn Dowex X1 (acetatform, 2,5 x 15 cm). Eluatet lyofilíserades för erhållande av den arena produkten. (1,37 g).
Den arena produkten upplöstes i 8 M karbamidlösníng ( pH-värde 9,5, 50 ml) och tillöts stå vid rumstemperatur under 60 minuter. Lösningen över- fördes till en kolonn (4,3 x 8,0 cm) av CM-cellulosa, packad med 8 N karbamídlösning och eluerades med linjär gradíentelutíon med 0,01 M ammaníumocetat (pH-vörde 4,5, 400 ml) - 0,3 M ammoniumacetat (pH-vörde 4,5, 400 ml). Eluatet fraktianerades sedan med fraktioner på 6,5 ml. Var- je fraktion provades med Folin-Lowrys metod (500 nm) för erhållande av fraktionerna 30-43 (fraktion C1), fraktionerna 51-68 (fraktion C2), Frak- tíonerna 69-83 (fraktion C3) och fraktianerna 84 - 199 (fraktion C4), Var- je fraktion fick passera genom Sephadex LH-20 för avsaltning. Fraktion C1 fick passera en kolonn (3,4 x 120 cm) för fraktionering i fraktioner på 7,5 ml , varvid erhölls fraktianerna 25-41 (fraktion CIL). Fraktion C2 fick passera genom en kolonn (3,0 x 120 cm) till fraktioner på 7,5 ml för erhållande av fraktíanerno 25 - 36 (fraktion C2L). Fraktion C3 fick pas- sera en kolann (2,9 x 120 cm) och fraktianerades i fraktioner på 8,0 ml för erhållande av fraktionerna 24-27 (fraktion C3L1) och nr 28-38 (fraktion C3L2). Fraktion C4 fick passera en kolonn (2,8 x 95 cm) för 1.5, 453 510 bildning av fraktioner på 7,6 ml vardera, varvid erhölls frakfíonernu nr 20 _ 25 (fraktion c 411) och 26-30 (fmkfion c 41.2). varje fmkfion lya- fílíserades för erhållande av fraktion C1L (521,ó mg), C2L (230,2 mg), C3L] (41,8 mg) , C3L2 (222,4 mg), C4L1 (74,3 mg) och C4L2 (48,9 mg).
Fraktíon C2L ovan upplöstes i 0,1 N öttíksyra (3 ml) och överfördes till en kolonn (2,1 x 25 cm) med CM-cellulosa och eluerades med linjär gradient- elufion med 0,01 M ammoníumacetatlösning (pH-vörde 4,5, 300 ml) - 0,3 M ammoníumacefat (pH-värde 4,5, 300 ml). Eluatet frakfíonerades i frakfíoner om 8,0 ml varvid erhölls frakfíonerna 30-36 (fraktion C2L-C) vilka passe- rades genom en kolonn (2,9 x 90 cm) Sephadex LH-20 för avsaltning. Eluat- ef fraktionerades í fraktioner om 8,0 ml och frakfíonerna 20-29 lyofílí- serades för erhållande av [Tyr45]~h-PTH [46-84] (163,3 mg).
Tunnskíktskromatografi-värde : Rf9=O,75 Aminosyraanalys: Asp 4,86 (5), Thr 1,02 (1), Ser 3,51 (4), Glu 6,05 (6), Pm ø,9s (1), Gly 1,90 (2), A10 4 (4), v01 4,oo (4), Leu 2,93 (a), Tyr 0,88 (1), Lys 6,02 (6), His 0,86 (1), Arg 1,81 (2).
Exempel 5.
[Cys (ACm)45] - h - P T H (45 - 84): H - Cys(Acm) - Ala - Gly - Ser - Gln - Arg - Pro - Arg - Lys - Lys - Glu - Asp - Asn - Val - Leu - Val - Glu - Ser - His ~ Glu - Lys - Ser - Leu - Gly - Glu - Ala - Asp - Lys - Ala - As- - Val - Asp - Val - Leu - Thr - Lys - Ala - Lys - Ser - Gln - OH (1) P ( 45 - 84) ; B 0 C - Cys(Åcm) - - Ah - Gly - Ser(Bzl) - Gln - Arg(Tos) 453 510 - Pro - Arg(Tos) - Lys(Z-Cl) - Lys(Z-Cl) - Glu(OBzl) - Asp(OBzl) ' lsn - Val - Leu - Vol - Glu(0Bzl) - Ser(Bzl) - His - Glu(O Bzl) - Lys(Z-Cl) - Ser(Bzl) - Leu - Gly - Glu(0Bzl) - Ala - Åsp(0Bzl) - Lys(Z-Cl) - Ala - Asp(0Bzl) - Val - Åsp(0Bzl) - Val - Leu - Thr(Bzl) - Lys(Z-Cl) - Ala - Lys(Z- cl) _ sef(Bz1) _ eln _ oßzi [48] Den återstående de-BOC-föreningen (4,20 mg, 0,6 mmol) enligt exempel 4 upplöstes i en blandning av DNF (70 ml) och NMP (70 ml). HOBT (0,10 g, l,2 molört överskott), BOC-Cys(Åcm)-OH (0,20 g, 1,2 molört överskott) och WSCI (0,13 ml ,l,2 molört överskott) tillsattes vid 0°C därtill och omrördes vid rumstemperatur över natten. DMF avdestillerades i vakuum, isvatten tillsattes återstoden och föllningen uppsamlades. Föllningen suspenderades i etanol, upphettades, kyldes därefter och det olösliga mo- terialet uppsamlades genom filtrering. Denna operation upprepades två gånger för erhållande av substansen [48] (4,07 g, utbyte:95,0 1). (2) [Cys(Acm)45] h-PTH [45-84]: Ämnet [48] (4,oø 9, 0,57 mmøl) och qnisol (10 ml) fillsuffes vid o°c fill vattenfritt HF (60 ml) och omrördes under 60 minuter. HF avdestillerades i vakuum och eter tillsattes återstoden. Föllníngen upplöstes i 20 % öttiksyra (40 ml) och fick passera genom en kolonn Dovex X1 (acetat- form, 2,8 x 35 cm). Det lyofiliserade eluatet upplöstes i 8 M karbamid- lösning, pH-värdet justerades till 9,0 genom tillsats av en vattenlös- ning av ammoniak , varefter det tilläts stå under 30 minuter. Lösningen överfördes till en kolonn (3,4 x 35 cm) av CM-cellulosa packad med 8 M karbamidlösning och eluerodes genom linjär grodientelution av 0,01 M ammoniumacetat (pH-värde 4,5 , 700 ml) - 0,3 M ammoniumacetot (pH-vörde 4,5, 700 ml). Eluatet fraktionerades i fraktioner om 0 ml och 453 5111) testades med Folin-Loury-metoden (500 nm) för erhållande av fraktionerna 25-35 (fraktion C1), fraktioner nr 36-45 (fraktion C2) och fraktionerna 46-84 (fraktion C3). Varje fraktion fick passera genom Sephadex LH-20 för avsaltning. Fraktionen C2 fick passera genom kolonnen (3,0 x 120 cm) och fraktionerades i fraktioner om 8,0 ml till erhållande av fraktionerna 27 - 33 (fraktion C2L1) och nr 34 - 40 (fraktion CZLZ). Fraktionen C3 fick passera genom en kolonn (3,4 x 120 cm) och fraktionerades i frak- tioner om 8,0 ml till erhållande av fraktion 35-47 (fraktion C3L1) och fraktion 48-53 (fraktion C3L2). Varje fraktion lyofiliserades för erhål- lande av fraktion C2L,(148 mg), C2L2 (620 mg), C3L1 (212 mg) och C3L2 605 m9 ).
Ovanstående fraktion C2L2 upplöstes i 0,1 N üttiksyra ( 6 ml) och över- fördes till en kolonn (5,0 x 12 cm) CM-cellulosa och eluerades genom lin- jär gradientelution med 0,01 M ammoniumacetat (pH-vörde 4,5, 400 ml) -0,3 H ammoniumacetat (pH-vörde 4,5, 400 ml). Eluatet fraktionerades i fraktioner om vardera 6,0 ml , varvid erhölls fraktíonerna nr 110-126 (fraktion CZLZ- C), vilka fick passera genom en kolonn (4,0 x 20 cm) med Sephadex LH-20 för avsaltning. Eluotet fraktionerades i fraktioner om 8,0 ml . Fraktioner- na 38 f 54 (fraktion C2L2-CL) vilka lyofíliserades för erhållande av [Cys(Acm)45] h-PTH [45 - 84] (246,8 mg).
Tunnskiktskromatografi: Rf9=0,74 Amínosyraanolys: Asp 4,91 (5), Thr 0,98 (1), Ser 3,50 (4), G11, 6,11 (6), Pm 0,98 (1), Gly 1,98 (2), A10 4 (4),v@1 4,04 (4), Cys 0,42 (0,5), Leu 2,90 (3), Lys 5,99 (6) His 0,87 (1), Arg 1,87 (2).
Exempel 6.
[ Cys45] - h - P T H (45 - 84) ; H - Cys - Ala - Gly - Ser - Gln - Arg - Pro - Arg' - Lys - Lys - Glu - Asp - Asn - Val - Leu 455 510 - Vol - Glu - Ser - His - Glu - Lys - Ser - Leu - Gly - Glu - Ala - Asp - Lys - Alo - Asp - Vol - Asp - Vol - Leu - Thr - Lys - Alu - Lys - Ser - Gln - O H [Cys(ocm)45] h-PTH [45-84] (88 mg, 0,02 mmol) , erhållen i exempel 5 upplöstes i 50% öttiksyrc (2 ml). Kvicksilver(II)ocefct (52,24 m g, 0,18 mmol) tillsattes och omrördes vid rumstemperatur under 70 minuter. Ytter- ligare B-merkupfoefonol (3,4 mll tillsoffes och omrördes vid rumstempe- ratur under 24 timmar. Reoktíonsblondningen cenfrifugercdes och den över- sfående lösningen fördes fill en kolonn (3,2 x 42 cm) Sephodex LH-20 och eluerodes med 0,1 M üttiksyro. Eluuten fruktionerodes i fraktioner om 5 ml och de ninhydrinposifívo froktionernu 9 - 14 uppsumlcdes, vilka lyo- filisercdes för erhållande av [Cys45] h-PTH [45-84] (76,l mg).
Tunnskíktskromcfogrufí: Rf9 = 0,73 Exempel 7.
[Tyr 52] h - P T H (52 - 84): H - Tyr - Lys - Lys - Glu - Asp - Asn - Vol -Leu - Vol - Glu - Ser - His - Glu - Lys - Ser - Leu - Gly - Glu -Ålo - Åsp - Lys - Ålo - Asp - Vol - Asp - Val - Leu - Thr - Lys - Alc - Lys - Ser - Gln - OH (1) P (52 - 84): B 0 C - Tyr(Bzl-Cl2) - Lys(Z-Cl) - Lys(Z-Cl) - Glu(OBzl) -Asp(OBzl) - Asn - Vol - Leu - , Vol - Glu(0Bzl) - Ser(Bzl) - His - Glu(0Bzl) ~ Lys(Z-Cl) - Ser (Bzl) - Leu - Gly - Glu(OBzl) - Alu - Asp(OBzl) - Lys(Z-Cl) - Alu - Asp (OBzl) - Vol - Asp(OBzl) - Vol 453 510 - Leu - Thr(Bzl) - Lys(Z-Cl) - Ala - Lys(Z-Cl) - $er(BZ1) - Gln - 0Bzl [49] TFA (50 ml) tillsattes ämnet [35] (5,82 g, 1,0 mmol), erhållen i exempel 1 och amrördes vid rumstemperatur under 50 minuter. TFA avlügsnades i vakuum och eter tillsattes. Fëllningen upplöstes i DNF (150 ml) och NMP (150 ml). HOBT (0,27 g, 2 molört överskott) tillsattes för upplösning, varefter WSCI (0,37 g, 2 malört överskott) tillsattes , och amrördes vid rumstemperatur under 2 dagar. Reaktiansblandningen slogs i isvatten, Föllningen uppsamlades, tvöttades med vatten, suspenderades i metanol, upphettades och kyldes. Det olösliga materialet uppsamlades genom filtre- ring. Föllningen suspenderades i metanol och upphettades. Suspensionen kyldes och uppsamlades för erhållande av ämne [49] (5,59 g, utbyte:91,0%).
Aminasyraanalys: Asp 4,09 (5), Thr 0,90 (1), Ser 1,65 (3), Glu 4,10 (5), Gly 0,88 (1), Ala 3 (3), v01 3,41 (4), Leu 2,50 (3), Tyr 9,82 (1), Ly; 5,4o (6), His 0,71 (1) (2) [Tyr52] h_PrH [sz _ s4]= Ämnet [49] (3,68 g, 0,6 mmal) och anísol (5 ml) tillsattes vattenfritt hF (50 ml) vid O°C och omrördes under 60 minuter. HF avdestíllerades och eter tillsattes återstoden. Föllningen uppsamlades och upplöstes i 0,1 N Öttiksyra (50 ml). Lösningen fick passera genom en kalann av Dowex Xi (acetatform , 2 x 45 cm), varefter den eluerades med 0,1 N ättik- syra. Eluatet lyofilíserades för erhållande av orent material (2,30 g), vilket upplöstes i 8 M karbamídlösning (50 ml), justerades till pH-värdet 9,5 genom 'tillsats av en vattenlösning av ammoniak, varefter det fick stå vid OOC under 60 minuter. Denna lösning överfördes sedan till en 453 510 kolonn (4,4 x 12 cm) av CM-cellulosa packad med 8 M karbamidlösníng och eluerades med 0,01 M ammoniumacetat (pH-vörde 4,5, omkring 100 ml) varef- ter det eluerades med linjär gradientelutian med 0,01 M ammoníumacetat (pH-värde 4,5, 700 ml) - 0,1 M ammoniumocetat (pH-värde 4,5 , 700 ml), varefter det eluerades med 0,2 M ammoniumacetat (300ml). Eluatet uppsam- lades i fraktioner om 13,5 ml , vilka provodes beträffande absorbans vid ultraviolett ljus vid 280 nm för uppsamling av fraktionerna 54-110 och lyo- filiserades. Lyofilisatet upplöstes i 0,1 N öttiksyra (5 ml) och fick pas- sera genom en Sephadex LH-20 kolonn (3,4 x 120 cm). Eluatet fraktionerades i fraktioner om 8,5 ml och fraktionerna 47- 53 uppsamlades och lyofílisera- des, varvid erhölls material i en möngd av (510 mg). Detta material upp- löstes i 0,1 N öttiksyra (20 ml) och överfördes till en kolonn (4,5 x 70 cm) CH-cellulosa och eluerades med linjörgradient-elution med 0,01 M ammonium- acetat (pH-värde 4,5, 500 ml)~0,1 M ammoniumacetat (pH-värde 4,5, 500 ml).
Eluatet fraktionerodes í fraktioner om vardera 6,0 ml. Varje eluat testo- des betröffande absorbons för ultraviolett ljus vid 280 nm och fraktioner- na 109 - 120 uppsamlades och lyofiliserades. Lyofílísatet upplöstes i 0,1 N öttiksyra (5ml) och fick passera genom en kolonn (3,4 x 120 cm) med Sephadex LH-20. Varje fraktion fraktíonerades i fraktioner om 3,4 ml och fraktionerna 56 - 73 uppsamlades och lyofilíserades, varvid erhölls [min] mm [sz _ 84] (102 mg).
Tunnskiktskromatografi: Rf9=O,75, en fläck.
Aminosyraanalys: Asp 4,55 (5) , Th; 0,93 (1), ser 2,20 (3), G10 4,98 (5), sly 0,96 (1), A10 3, vel 3,98 (4), Leu 2,93 (3), Tyr 0,90 (1), Lys 6,10 (6), His 1,00 (1).
Exempel 8, 0 [Tyrs ] h - P T H (50 - 84); H - Tyr - Pro - Arg - Lys - Lys - Glu - Aso - Asn - Val - 453 s1à Leu _ vel _ Glu _ ser _ His _ Glu _ Lys - Ser - Leu - Gly - Glu - A la - Asp - Lys - Ala - Asp - Vol - Asp - Val - Leu - Thr - Lys - Ala - Lys - Ser - Gln - OH (1) P (50 - 84); B O C - Tyr (Bzl - C12) - Pro - Årg(Tos) - Lys(Z-Cl) - Lys (Z-Cl) - Glu (0821) - Asp (0821) - Åsn- Val - Leu - Val - G1u(0Bzl) - $er(Bzl) - His - Glu(OBzl) - Lys(Z -Cl) - Ser(Bzl) - Leu - Gly - Glu (oßzl) _ A10 _ Asp(oBz1) _ Lys(z_c1) -Ala - Asp(0Bzl) - Val - Åsp(OBzl) -Val - Leu - Thr(Bzl) - Lys(Z-Cl) -Ala - Lys(Z-Cl) - Ser(Bzl) - Gln - OBzl [50] TFA (50ml) tillsattes ämnet [39] i exempel 2 och omrördes vid rumstempe- ratur under 55 minuter. TFA avdestillerades i vakuum och eter tillsattes.
Den sålunda bildade fëllníngen upplöstes í DNF (160 ml) och NMP (160 ml).
HOBT (O,27 g, 2 molört överskott) och BOC-Tyr(Bzl-C12)-OH (0,88 g, 2 mo- lört överskott) tillsattes för upplösning, kyldes till -20°C , NSCI (O,37 g, 2 molört överskott) tillsattes och omrördes vid rumstemperatur under 3 dagar. Reaktíonsblandníngen slogs í is-vatten. Den sålunda bildade föllníngen uppsamlades, tvüttades med vatten och suspenderades í meta- nol och upphettades. Därefter kyldes metanolsuspensianen och olöslígt material frånfíltrerodes. Föllníngen suspenderudes och upphettades i me- tanol och kyldes för uppsamlíng av töllníngen. Denna operation upprepades åter och det erhållna ämnet [50] (5,97 g, utbyte : 90 %) tvöttodes med eter. 453 510 Aminosyroanalys: Asp 4,21 (s), th: 0,95 (1), ser 2,32 (a), Glu 4,50 (5), Pro 0,75 (1), Gly 0,88 (1), Ala 3, Val 3,45 (4), Leu 2,60 (3), Tyr 0,70 (1), Lys 5,21 (6), His 0,72 (1), Arg 0,71 (1). (2) [Tyrfio] hmm [so _ s4]= Ämnet [50] (3,98 g, 0,6 mmol) och anisol (6 ml) tillsattes vattenfritt HF (60 ml) vid 0°C , varefter blandningen omrördes vid OO C under 60 minuter. HF avdestíllerades i vakuum, eter tillsattes återstoden och föllningen uppsamlades. Föllningen upplöstes i 0,1 N öttiksyra (50 ml) och fick passera genom en kolann Dowex X1 (acetatform, 3 x 45 cm). Eulat- et lyofilíserodes för erhållande av en oren produkt (2,30 g). Denna upp- löstes i 8 M karbamídlösníng, pH-värdet justerodes till 10,0 genom till- sats av en vattenlösning av ammoniak och blandningen fick stå vid 0°C under 30 minuter. Lösningen överfördes till en kolann (4,2 x 11,5 cm) CM-cellulosa-packad med 8 M karbamídlösning och eluerades med 0,01 M ammoniumacetatlösning (pH-värde 4,5) för avlägsnande av karbamid , var- efter den eluerades genom linjär gradientelution med 0,01 H ammonium- ocetat (4,5 pH-värde, 700 ml) - 0,1 M ammoniumacetat (pH-värde 4,5, 700 ml), varefter den eluerades med 0,2 M ammoníumacetatlösníng (pH- värde 4,5, 250 ml). Eluatet fraktionerades i fraktioner om 8,5 ml , vars obsorbans proviodes vid 280 nm, varefter fraktionerna 110-155 upp- somlades och lyofilíserades. Lyofilísatet upplöstes i 0,1 M ättiksyra (6 ml) och fick passera genom en kolann Sephadex LH-20 (3,4 x 110 cm).
Fraktionerna 66-82 av vardera fraktioner på 5,2 ml uppsamlodes och lyo- filiserades , varvid erhölls ett lyofilísat (360 mg). Detta lyofilísat upplöstes i 0,1 N öttiksyro (10 ml), överfördes till en kolann (2,0 X 31 cm) av CM-cellulosa och utsattes för linjär gradientelution med 0,01 483 510 ammoníumacetat (pH-värde 4,5, 500 ml) -0,2 M ammoníumocetat (pH-värde 4,5, 500 ml). Eluatet fraktíonerodes i fraktioner om 7,5 ml. Fraktionerna 90-110 uppsomlades, lyofílíserades och upplöstes i 0,1 N öttíksyro (3 ml).
Lösningen fick passera genom en kolonn (3,0 x 123 cm) Sephadex LH-20.
Eluatet fraktionerodes i fraktioner om 6 ml och fraktíonerna 35-43 uppsam- lades, varefter de lyofíliserades för erhållande av [Tyrßo] h-PTH [50 - 84] (115 mg).
Tunnskiktskromatografí: Rf1O=0,88 (en fläck) Åminosyraanalys: Asp 4,95 (5), Thr 0,91 (1) srr 2,32 (3), 010 5,10 (5) , Prr 1,01 (1), sly 0,99 (1), A18 8, v81 4,01 (4), Leu 2,99 (8), fyr 0,85 (1), Lys 6,03 (6), H15 0,92 (1), Arg 1,02 (1).
Exempel 9. (1) Antigener: h-PTH (53 - 841, h_P1H [51 _ 841, h~P1H [46 _ 84] orh 8sA-[cyr45],h_P1H[4s4M¶ erhållna enligt ovan beskrivna förfarande användes som antigener. 45 .. 8 H _ N BSA-[Cys ] h-PTH [45-84] framstalldes pa foljande satt.
Tefranafrium EDTA (4 mg) fillsrrrfer BSA (50 mg) upplörf i 0,1 M farfar- buffert (pH-värde 8,0, 1 ml). Dímetylformamidlösning (150/ul) 3-(2'- "' bensotíazolyl-ditia)propíanat-succinimídester (500/ug) tillsattes och om- rördes under iskylníng i 60 minuter. Efter reaktionen tillsattes [Cys45] h-PTH [45-84] (50 ml) , fick reagera med ískylníng under 30 minu- ter, varefter pH-värdet justerades till 7,0 och lösningen fick passera ge- 453 510 ,,._ nom en kolonn (1 x 50 cm) Sephodex G-75 packad med 0,01 M fosfatbuffert (pH-värde 7,2) innehållande 0,15 M NaCl , för gelfiltrering. Eluat på 15 ml - 20 ml uppsamlades för erhållande av fraktioner innehållande BÅS- [Cys45] h-PTH [45-84].[Genamsnítt var 11 moler [Cys45] h-PTH [45-84] konjugerat per mol av BSA]. (2) Antíkroppar: En lösning (500/ug/ml) av ovanstående antigen i 0,01 M fosfatbuffert (pH-vörde 7,0) innehållande 0,15 M NaCl framställdes. Vardera 2,5 ml lösning därav blandades med Freunds fullständiga tillsatsmedel (2,5 ml) och ímmuníserodes han-marsvin, fem i grupp, vilka injicerades subkutant (subkutana injektíoner fem gånger med två veckors mellanrum). Efter 2 veckor slutlig immuníseríng uppsamlades blod från hjärtat för erhållande av antíserum på konventionellt sött.
I det följande förkortas antiserum av h-PTH [53-84] som (A), antiserum av h-PTH [51-84] som (B); antiserum från h-PTH [46-84] som (C) och anti- serum från BSA-[Cys45] h-PTH [45-84] som (D), (3) Enzym-märkning. 1) ¿ [cys45] h-PTH [45-84] (4 mg) upplöstes 1 0,1 M føsfqfbufferf (pH-varde- 7,0, 1 ml) . N-[2-(2'~pyrídylditia)etyl]-3-(2'-bensotíazolyl-dítio)- propionamíd (0,6 mg) í dímetylformamid (0,9 ml) tillsattes och omrördes vid 0°C under 60 minuter. pH-värdet justerades till pH-värdet 6,0 genom tillsats av HCl, Lösningen fick passera genom en Sephadex G-25 kolonn (1 x 50 cm) med 0,1 M fosfatbuffert (pH~vörde 6,0) för erhållande av fraktionerna 15-19 ml. (660/ug/ml av [Cys45] h-PTH [45-841. Ovanstående fraktion (20/ul) sattes till 0,1 M fosfatbuffert (pH-värde 8,0, 1,5 ml) innehållande B-galaktosídas (1,2 mg) och omrördes vid OOC under 60 minuter.
Inkubationsblondningen fick sedan passera genom en Sephadex G-100 kolonn m 453 510 (1 X 50 cm) med 0,01 M fasfatbuffert (pH-värde 7,2) innehållande 0,15 M NaCl för gelfiltrering för erhållande fav fraktionerna innehållande 13 - 17 ml . I denna fraktion var förhållandet ß-galaktosidas-märkt kon- jugat till [Cys45] h-PTH [45-84]: B-galaktosidas = omkring 1:1 (härefter betecknad Lot A.). 2) h-PTH [53-84] (2 mg) upplöstes i 0,1 M fosfatbuffert (pH-värde 8,0, 1 ml). Dimetylformamidlösning (0,2 ml) av 3-(2'-bensotiazalyl-ditio)- propionat-succinímidester (0,2 mg) tillsattes och omrördes vid OOC under 60 minuter. Efter reaktion tillsattes 20/ul till 0,1 M fosfatbuffert (pH-värde 7,0, 1ml) innehållande B-galaktosidas (1 mg) och fick reagera vid OOC under 60 minuter. Reaktionsblandningen passerade sedan genom en Sephadex G-100 - kolonn (1 x 50 cm) för gelfiltrering, varvid erhölls fraktioner på 14-17 ml. Ett förhållande av B-galaktosidaskonjugat är h-PTH [53-84]:B-galaktosidas = 1 : 1 (hädanefter betecknat Lot B). (4) Analysmetod: Provlösning (100/ul) , enzymmärkt konjugat (100 /ul) , en provmängd ut- spätt antiserum (100/ul) och normalt serum från marsvin(utspätt 100 gånger) (100/ul) inkuberades vid 5°C under 24 timmar. Anti-marsvins-1'-globulin- kaninserum (10 gånger utspädning, 100/ul) tillsattes därefter och inkube- rades vid 5°C under 24 timmar. 0,5 M NaCl (3 ml) tillsattes och centri- fugerades vid 3000 v/min under 15 minuter för uppsamling av sedimentatet.
Sedimentatet sattes till 0,1 M fosfatbuffert (innehållande 0,1 % natrium- ozíd, O,1( BSA, 20 mmol merkaptoetanol och 10% etanol, pH-värde 6,7) in- nehållande po-nitrofenyl-$~galaktosíd ( 5 mg/ml) (200/ul) och reagerade vid 37°C under 90 minuter. Reaktíonen avbröts genom tillsats av 0,2 N glycinbuffert (pH-värde 10,4 2,5 ml) och uppmättes optiskt vid 420 nm. 0,01 N fosfatbuffert (pH-värde 7,2) innehållande 0,1 % natriumazid, 0,25 % BSA, 0,15 M NaCl och 5 mmol EDTA användes som utspädningsmedíum. 453 510 T) Lot A användes som enzymmörkt kanjugat. Antíkroppstitern (Bo/T) hos varje antíserum ovan analyserades. Resultaten framgår av Tabell 1.
Varje antíserum användes i 1000 gångers utspädning.
Tabell 1. antiserum marsvin 110- antikroppstitanla-:as 11- 1 _19 A A-z 2 a 11-3 1 1 B_- 1 1 s 'B 13-2 1 s __ B - s 1 s_ __. __ c- 1 a__s._. a a- z a 9 i c- 3-1 _ D - 1 -3 o _ ' l 1) D - 2 11-6* 11-' s 4 2 2) Enzymmörkt kanjugat Lat B användes och antíkropptítern (Ba/T) ana- lyserades på ovanstående C och D antíserum.
Resultaten visas i Tabell 2. 453 51-0 -J Tabell 2. antíserum maT5Vífl H0- pntikroppstitèflê?9* 0 _- 1 2 9 Û Cl - 2 3 2 C - 3 2 9 10 - 1 2 4 1) 1) - 2 3 4 1) '“' 3 3 4 Varje anfíserum användes i en ufspödníng av 2000 gånger. 3) Standardkurvor framställdes med användning av ovan angivna anfísera.
Använda anfisera: A-2; 600 gångers utspädning, B-2; 500 gångers utspädning.
C-2; 1500 gångers ufspödníng, och D-2; 2000 gångers uf- spödníng.
Enzymmörkt konjugat: Lot B.
Standardkurva för h-PTH [53-84] framställdes med användning av ovanstående.
Resultaten visas 1 f1g.1 för A_2, fig.2 för B-2,'fig.s för c-2 Qch fí9.4 för D-2.
Som ovan visas erhålles antísera med användning av peptíd [Ia] enligt föreliggande uppfinning för att erhålla önskade sfandardkurvar och därför kan h-PTH eller dess C-fenmínala fragment analyseras genom EIA med godo resultat. 4. Kort förklaring av rítníngarna: Fig.1, fíg.2, fíg.3 och fig. 4 visar sfandardkurvar.

Claims (1)

1. 455 510 Lax P A T E N T K R A V En peptíd, k ä n n e t e c k n a d av att den har formeln 53 55 R - Lys - Lys - Glu - Asp - Asn - Val - 50 Leu - Val - Glu - Ser - His - Glu - 65 70 Lys - Ser - Leu - Gly - Glu - Ala - 80 Val - Leu - Thr - Lys - Ala - Lys - 8H Ser - Gln ' OH (I) där R betecknar H-Tyr-gruppen eller Rl-Pro-Arg-gruppen, där R1 betecknar H, H-Tyr- eller R2-Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-gruppen och där R2 betecknar H, H-Cys-gruppen eller-H-Tyr-gruppen eller salter därav.
SE8107687A 1980-12-29 1981-12-21 Peptid for analys av humant paratyroidhormon SE453510B (sv)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP55187686A JPS57126456A (en) 1980-12-29 1980-12-29 Peptide for determining human parathormone
JP5769181A JPS57184969A (en) 1981-04-16 1981-04-16 Measuring method for immunity of homo-pth
JP56152377A JPS5855449A (ja) 1981-09-25 1981-09-25 h−PTH誘導体

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE8107687L SE8107687L (sv) 1982-06-30
SE453510B true SE453510B (sv) 1988-02-08

Family

ID=27296341

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE8107687A SE453510B (sv) 1980-12-29 1981-12-21 Peptid for analys av humant paratyroidhormon

Country Status (6)

Country Link
US (2) US4409141A (sv)
CH (1) CH661735A5 (sv)
DE (1) DE3151738A1 (sv)
FR (1) FR2497198B1 (sv)
GB (1) GB2092160B (sv)
SE (1) SE453510B (sv)

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4591552A (en) * 1982-09-29 1986-05-27 New York Blood Center, Inc. Detection of hepatitis B surface antigen (or antibody to same) with labeled synthetic peptide
US4683292A (en) * 1983-08-12 1987-07-28 Immunetech, Inc. Immunotherapeutic polypeptide agents which bind to lymphocyte immunoglobulin FC receptors
GB8327966D0 (en) * 1983-10-19 1983-11-23 Nyegaard & Co As Chemical compounds
US4861868A (en) 1985-02-22 1989-08-29 Monsanto Company Production of proteins in procaryotes
DE3751997T2 (de) * 1986-07-18 1997-07-10 Univ Melbourne Aktives protein in humoraler hyperkalzemia, durch bösartigkeit verursacht
IT1223301B (it) * 1987-09-11 1990-09-19 Eniricerche Spa Polipeptidi sequenziali immunologicamente attivi
US6797461B2 (en) * 2000-10-27 2004-09-28 Promega Corporation Tryptase substrates and assay for tryptase activity using same
JP2005508832A (ja) * 2001-02-16 2005-04-07 セルゲイト, インコーポレイテッド 間隔を開けてアルギニン部分を含むトランスポーター
US20030082179A1 (en) * 2001-07-03 2003-05-01 Hutchison James Scott Parathyroid hormone antibodies and related methods
US8883857B2 (en) 2012-12-07 2014-11-11 Baylor College Of Medicine Small molecule xanthine oxidase inhibitors and methods of use

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3886132A (en) * 1972-12-21 1975-05-27 Us Health Human parathyroid hormone
DE2363281A1 (de) 1972-12-21 1974-06-27 Us Health Peptid und verfahren zu seiner herstellung
US4086196A (en) * 1975-03-28 1978-04-25 Armour Pharmaceutical Company Parathyroid hormone

Also Published As

Publication number Publication date
DE3151738C2 (sv) 1990-12-13
US4409141A (en) 1983-10-11
CH661735A5 (de) 1987-08-14
FR2497198A1 (fr) 1982-07-02
DE3151738A1 (de) 1982-08-19
FR2497198B1 (fr) 1985-09-20
USRE33188E (en) 1990-03-27
GB2092160A (en) 1982-08-11
GB2092160B (en) 1984-06-13
SE8107687L (sv) 1982-06-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4423034A (en) Process for the preparation of antibodies
US4038222A (en) Untriakontapeptide with opiate activity
CA2091873C (en) Parathyroid hormone derivatives
US4656250A (en) [Nle8, Nle18, Tyr34 or Phe34 ]-h-PTH peptide derivatives
US4086221A (en) Polypeptides and process for producing the same
US4261886A (en) Peptides having thymopoietin-like activity
Bodanszky et al. The structure and synthesis of malformin A
Schleifer et al. The Immunochemistry of Peptidoglycan: I. THE IMMUNODOMINANT SITE OF THE PEPTIDE SUBUNIT AND THE CONTRIBUTION OF EACH OF THE AMINO ACIDS TO THE BINDING PROPERTIES OF THE PEPTIDES
US4420424A (en) New peptides and a process for their preparation
SE453510B (sv) Peptid for analys av humant paratyroidhormon
US4138394A (en) Peptide derivatives and a method of measuring collagenase activity
US3978035A (en) 13-Norleucine-14-desamido motilin, a method for preparing it and an agent containing it
US3963691A (en) Synthetic antigens of luteinizing hormone releasing hormone
GB2062644A (en) Glucagon fragment and utility hereof
US3873511A (en) (1-{60 -Aminoisobutyric acid)-corticotropin peptides
US4397842A (en) Peptides having thymopoietin-like activity
US4176009A (en) Method of measuring collagenase activity
CA1105925A (en) Pentapeptide compositions and methods
IE49755B1 (en) Peptides having thymopoietin-like activity,therapeutic compositions containing them,and process for their preparation
US3917581A (en) Derivatives of somatostatin and process therefor
US4117117A (en) Tridecapetide having gastrin effect
US4058512A (en) Synthetic peptides having growth promoting activity
KR970001510B1 (ko) 합성 펩타이드 및 이를 포함한 제약학적 조성물
US3873510A (en) Peptides of ACTH activity containing {60 -aminooxy carboxylic acid on the N-terminal moiety, and a process for the preparation thereof
FujINo et al. Synthesis of Porcine Motilin and Its D-Phe1-Analog by the Use of Methanesulfonic Acid

Legal Events

Date Code Title Description
NAL Patent in force

Ref document number: 8107687-9

Format of ref document f/p: F

NUG Patent has lapsed

Ref document number: 8107687-9

Format of ref document f/p: F