DE3151738A1

DE3151738A1 - Peptid fuer die analyse des menschlichen hormons der nebenschilddruese

Info

Publication number: DE3151738A1
Application number: DE19813151738
Authority: DE
Inventors: Shigeo Katsuragi; Sadami Mishima Shizuoka Kobari; Kaoru Morita; Nobuaki Nakagawa; Toshiharu Houston Tex. Noda; Kunio Ohyama; Masahiko Shizuoka Taniuchi; Susumu Shizuoka Watanabe
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1980-12-29
Filing date: 1981-12-29
Publication date: 1982-08-19
Also published as: GB2092160B; DE3151738C2; FR2497198B1; SE453510B; USRE33188E; FR2497198A1; CH661735A5; GB2092160A; US4409141A; SE8107687L

Description

BESCHREIBÜ NG

Die Erfindung betrifft ein Peptid für die Analyse des menschlichen Nebenschilddrüsenhormons (h-PTH). Sie betrifft insbesondere ein Peptid der Formel:

53 55

R — Ly s — Ly s — Gl u — Asp - As η — Ya 1 -

60

Leu - VaI - Gl u - Scr -His - GIu -

65 ^% 70

Lys — Ser — Leu — GIy — G-Iu - AIa -

75

Asp — Lys — AIa — Asp — VaI — Asp —

80

VaI - Leu - Thr - Lys - AIa - Lys 84

Ser - Gin - OH CH

52 51 52

worin R H, eine H-Tyr-Gruppe oder R₁-Pro-Arg-Gruppe bedeu-

50 46 47 48

tet, R₁ H, eine H-Tyr-Gruppe oder eine R^-Ala-Gly-Ser-Gln-

50 ' 45

Arg-Gruppe bedeutet und R₉ H, eine H-Cys-Gruppe oder eine

45 ^Z -

H-Tyr-Gruppe bedeutet, oder eines seiner Salze.

Das menschliche Nebenschilddrüsenhormon (h-PTH) ist ein Hormon/ welches aus 84 Aminosäuren besteht, und seine biologische Jvktivität wird durch 34 Aminosäurereste seines N-endständigen Restes bestimmt [G-W. Tregear et al., Hoppe-Seyler's Z. Physiol. Chem. !355' 415 (1974)].

Die Anmelderin hat den C-endständigen 32-Rest h-PTH [53-84] , den 34-Rest [51-84] und den 39-Rest h-PTH [46-84] synthetisiert und diese Peptide Kaninchen zur Sensibilisierung injiziert und dann mit Erfolg einen spezifischen Antikörper für das C-Terminal (C-endständig) erhalten.

- 1 25
Eine Markierung mit J bei h-PTH ist bei der Radioimmunoanalyse bzw. Kadioimmunoassay (RIA) recht schwierig. Das h-PTH [53-84], h-PTH [51-84] und h-PTH [46-84] enthält Tyro-

1 25
sin nicht, welches leicht mit J markiert werden kann,

no Kn 4 c,

jedoch [Tyr ]h-PTH [52-84][Tyr ]h-PTH [50-84] und [Tyr ] h-PTH [45-84] können leicht mit einer radioisotopen Markierungssubstanz markiert werden, und es ist schwierig, sie in dem Immunreaktionsrohr zu adsorbieren. Es wurde gefunden, daß diese h-PTH-Fragmente nützlich für markierte Verbindungen für die h-PTH-Analyse sind, bedingt durch ihre geringere nicht-spezifische Adsorption und ihre genaue quantitative Analyse an RIA.

h-PTH[53-84], h-PTH[51-84] und h-PTH[46-84] enthalten nicht die Aminosäure Cystein, die mit einem SH-Bindungsenzym markiert werden kann, es wurde jedoch gefunden, daß diese Peptide quantitativ analysiert werden können auf der Grundlage von EIA unter Verwendung von Antikörpern gegen h-PTH C-terminales Fragment unter Verwendung, eines Peptids der Formel:

R-Ala^-Gly-Ser-Gln-Arg-Pro⁵¹-

Arg-Lys⁵³-Lys-Glu⁵⁵-Asp-Asn-Va1-Leu-Val^6O-G1u-Ser-His-Glu-Lys⁶⁵-Ser-Leu-Gly-Glu-Ala⁷⁰-Asp-Lys-

Ala-Asp-Val⁷⁵-Asp-Val-Leu-Thr-

Lys⁸⁰-Ala-Lys-Ser-Gln^Bt(-0H [Ia]

45
worin Rl H oder die H-Cys-Gruppe bedeutet, unter der allgemeinen Formel (I), d.h. h-PTH [46-84] und [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84]. Besonders bevorzugt kann h-PTH oder das C-termina-Ie Fragment für h-PTH bevorzugt unter Verwendung eines spezifischen Antikörpers analysiert werden, den man durch Im-

45
munreaktion von [Cys ] h-PTH [45-84] oder seines Komplexes mit einem Protein, wie dem Immunkomplex von Rinderserumalbumin (BSA) als Antigen und unter Verwendung einer enzymmarkierten Verbindung der Formel:

^f 53 S

R — Lye — Lys — Gm — Αερ — Asn — VaI -— Leu — VaI — Glu — Ser — His — Glu — Lys ~ Ser — Leu — Gly — Glu — Ala° — Aep — Lya — Ala — Asp —.Val⁵— Asp — Val - Leu - Thr.— Lys°~ Ala — Lys -

ti λ

Ser — Gin — OH

51 52 erhält, wobei in der Formel R' H oder eine RJ-Pro -Arg -■

Gruppe, R' H oder eine R'-Ala⁴⁶-Gly-⁴⁷-Ser⁴⁸-Gln-⁴⁹-Arg⁵⁰-

45
Gruppe und Rl ^H oder eine H-Cys -Gruppe bedeuten, unter dem Peptid der Formel (I), d.h. h-PTH [53-84], h-PTH [51-84J h-PTH [46-84] und [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] als enzymmarkierte Verbindung bei EIA.

Die Synthese des erfindungsgemäßen Peptids (I) kann wie folgt durchgeführt werden.

Eine Aminosäure und/oder ein niedriges Peptid werden durch Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäuresequenz der Formel (I) umgesetzt, und die Schutzgruppe für die reaktive Gruppe wird bei der Endstufe der Reaktion freigesetzt. Die Kondensationsreaktion kann nach an sich bekannten Peptidsynthcseverfahren durch erneutes Anbringen und Entfernen der Schutzgruppen und Kondensation durchgeführt werden. Die Schut;:gruppen für die Synthese der Ausgangsmaterialien und der Zv/ischenprodukte sind an sich bekannte Schutzgruppen für die Peptidsynthese, und sie können leicht durch Hydrolyse, SMurezerSetzung, Reduktion, Aminolyse oder Hydrazino-Iyse entfernt werden.

Beispielsweise kann die Aminogruppe in an sich bekannter Weise durch eine Acylgruppe, wie eine Formyl-, Trifluoracetyl-, Phthaloyl-, p-Toluolsulfonyl- oder o-Nitrophenylsulfonylnruppe, eine Benzyloxycarbonylgruppe, wie eine Benzyl-

oxycarbonyl-, o-Brombenzyloxycarbonyl-, p-Brombenzyloxycarbonyl-, o- (oder p-) Chlorbenzyloxycarbonyl-, p-Nitrobenzyloxycarbonyl- oder p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe, eine aliphatische Oxycarbonylgruppe/ wie eine Trichloräthyloxycarbonyl-, t-Amyloxycarbonyl-, t-Butoxyaarbony1- oder Diisopropylmethoxycarbonylgruppe, oder eine Aralkyloxycarbonylgruppe, wie eine 2-Phenylisopropoxycarbonyl-, 2-Tolylisopropoxycarbonyl- oder 2-p-Diphenylisopropoxycarbonylgruppe, geschützt sein. Diese Aminogruppen können durch Umsetzung mit einem 1,3-Diketon, wie Benzoylaceton oder Acetylaceton, unter Bildung eines Enamins geschützt werden.

Die Carboxylgruppe kann durch Amidbildung, Hydrazidbildung oder Veresterung geschützt werden. Die Amidgruppe ist mit einer 3,4-Dimethoxybenzyl- oder Bis-(p-methoxyphenyl)-methylgruppe substituiert. Die Hydrazidgruppe ist mit einer Benzyloxycarbonyl-, Trichloräthyloxycarbonyl-, Trifluoracetyl, t-Butoxycarbonyl-, Trityl- oder 2-p-Diphenylisopropoxycarbonylgruppe substituiert. Die Estergrappe ist mit einem Alkanol, wie Methanol, Äthanol, t-Butanol oder Cyanomethylalkohol, einem Aralkanol, wie Benzylalkohol, p-Brombenzylalkohol, p-Chlorbenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, 2,6-Dichlorbenzylalkohol, Benzhydrylalkohol, Benzoylmethylalkohol, p-Brombenzoylmethylalkohol oder p-Chlorbenzoylmethylalkohol, einem Phenol, wie 2,4,6-Trichlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenoi oder 2,4-Dinitrophenol, oder einem Thiophenol, wie Thiophenol oder p-Nitrothiophenol, substituiert. Die Hydroxygruppe im Serin oder Tyrosin kann gegebenenfalls durch Veresterung oder Verätherung geschützt sein. Eine durch Veresterung geschützte Gruppe ist beispielsweise eine Acetylgruppe, eine Benzoylgruppe, eine Benzyloxycarbonylgruppe oder Äthyloxycarbonylgruppe. Eine durch Verätherung geschützte Gruppe ist beispielsweise eine Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder t-Buty!gruppe. Der Schutz der Hydroxy-

gruppe kann durch eine 2,2,2-Trifluor-1-t-butyloxycarbonylaminoäthyl- oder 2,2,2-trifluor-1-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppe erfolgen. Es ist im allgemeinen nicht immer erforderlich, diese Hydroxygruppen- zu schützen.

Die Aminogruppe in der Guanidinogruppe im Arginin kann durch Nitro-, Tosyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Methylen-2-sulfonylgruppen geschützt sein. Es ist jedoch nicht immer erforderlich, die Guanidinogruppe zu schützen.

Die Ininogruppe im Histidin kann durch Benzyl-, Trityl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl-, 2,2,2-Trifluor-1-t-butyloxycarbonylaminoäthyl- oder 2,2,2-Trifluor-1-benzyloxycarbonylaminoäthylgruppen geschützt sein, obgleich es nicht immer ex-forderlich ist, die Iminogruppe zu schützen.

Die Mercaptogruppe im Cystein kann durch eine Benzyl-, p-Methoxybenzyl-, p-Nitrobenzyl-, Trityl-, Benzylthiomethyl-, Äthylcarbamoyl- oder Acetamidmethylgruppe geschützt sein.

Das Peptid (I) wird durch Kondensation von Aminosäuren oder niedrigen Peptiden synthetisiert. Beispielsweise kann man eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer geschützten a-Aminogruppe und einer aktivierten endständigen Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien a-Aminogruppe und einer geschützten endständigen Carboxylgruppe umsetzen. Andererseits kann man eine Aminosäure oder ein Peptid mit aktivierter a-Aminogruppe und geschützter endständiger Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien endständigen Carboxylgruppe und einer geschützten a-Aminogruppe umsetzen.

Die Carboxylgruppe kann aktiviert werden beispielsweise durch eine Säureazid, Säureanhydrid, Säureimidazolid oder einen aktiven Ester, wie durch Umwandlung in den Cyanomethylester, Thiophenylester, p-Nitrophenylester, p-Nitro-

thiophenylester, p-Methansulfonylphenylester, Thiodylester, 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxychinolinester oder N-Hydroxypiperidinester, mit einem Carbodiimid, Ν,Ν'-Carbonyldiimidazol oder einem Isoxazoliumsalz, wie Woodward-Reagenz.

Die bevorzugten Kondensationsreaktionen sind das Carbodiimid-, Azid-, aktive Ester- und Säureanhydridverfahren. Bei der Kondensationsreaktion sollte die Razemisierung sorgfältig vermieden werden, und die bevorzugten Verfahren sind das Azid-, aktive Ester-, Wünsch- [Z.Naturforsch., 216, 426 (1966)] oder das Geiger-Verfahren [Cheiti. Ber., 103, 788 (1970)], insbesondere unter Verwendung von N-Äthyl-N'-3-dimethylaminopropylcarbodiimid (WSCI) als Kondensationsmittel.

Dem erfindungsgemäßen Verfahren geht eine Kondensationsreaktion in der Aminosäuresequenz der Formel (I) voraus, und es ist bevorzugt, von dem endständigen C aus zu synthetisieren.

Das geschützte h-PTH [53-84] wird bevorzugt gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI unter Kondensation des C-terminalen Fragments 55-84 und des N-terminalen Fragments 53-54 synthetisiert. Das C-terminale Fragment 55-84 wird bevorzugt unter Kondensation des Fragments 61-84 und des Fragments 57-60 gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI und anschließende Kondensation von 56. und 55. Aminosäure gemäß dem aktiven Esterverfahren damit und dann Kondensation des Fragments 51-54 gemäß dem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI synthetisiert. Das Fragment 61-84 wird bevorzugt durch aufeinanderfolgende Kondensation des Fragments 72-84 und der 71., 70. und 69. Aminosäure und des Fragments 62-68 und der 61. Aminosäure gemäß dem aktiven Esterverfahren oder dem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI synthetisiert.

Das Fragment 62-68 wird bevorzugt gemäß dem Azidverfahren unter Kondensation des Fragments 64-68 und des Fragments 62-63 synthetisiert. Das Fragment 72-84 wird bevorzugt gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI unter Kondensation des Fragments 77-84 und der 76./ 75. und 74. Aminosäure und des Fragments 72-73 synthetisiert. Das Fragment 77-84 wird bevorzugt nach dem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI unter Kondensation des Fragments 82-84 und des Fragments 77-81 synthetisiert.

Geschütztes h-PTH [51-84] wird bevorzugt durch Kondensation des C-endständigen Fragments 55-84, wie oben angegeben, und des N-endständigen Fragments 51-54 gemäß einem modifizierten Geig'er-Verfahren unter Verwendung von WSCI synthetisiert.

Geschütztes h-PTH [46-84] wird bevorzugt durch Kondensation des C-endständigen Fragments 55-84, wie oben angegeben, und des N-endständigen Fragments 46-54 gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI synthetisiert. Das N-endständige Fragment 46-54 wird bevorzugt gemäß dem Azidverfahren mit dem Fragment 51-54 und dem Fracjment 46-50 kondensiert.

52

Geschütztes [Tyr ] h-PTH [52-84] wird bevorzugt gemäß dem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI mit geschütztem h-PTH [53-84], wie oben angegeben, und 52. Tyrosine kondensiert.

Geschütztes [Tyr ] h-PTH [50-84] wird bevorzugt durch Kondensation des geschützten h-PTH [50-84], wie oben angegeben, und dem 50. Tyrosin gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI synthetisiert.

Geschütztes [Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] und geschütztes [Cys ] h-PTH [45-84] werden bevorzugt durch Kondensation von geschütztem h-PTH [46-84], wie zuvor angegeben/ und der entsprechenden 45. Aminosäure nach dem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI synthetisiert.

Bei den oben aufgeführten Peptidsynthesen ist die C-terminale Carboxylgruppe nicht immer geschützt. Beispielsweise ist es bei der Kondensationsreaktion gemäß dem Azid- oder aktiven Esterverfahren nicht erforderlich, diese Gruppen zu schützen. Die Carboxylgruppe kann durch Veresterung, wie eines Methyl-, Äthyl- oder Benzylesters, geschützt sein. Die Estergruppe, wie die Methylestergruppe, kann mittels verdünnter Natriumhydroxidlösung oder durch Umwandlung in das Hydrazid entfernt werden, und die Benzylestergruppe kann mit wasserfreiem Fluorwasserstoff oder durch katalytische Hydrierung entfernt werden. Die a-Aminogruppe des Peptids wird mit einer an sich bekannten Schutzgruppe, wie einer Benzyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyl- oder t-Arnyloxycarbonylgruppe, geschützt. Die Benzyloxycarbonylgruppe wird durch katalytische Hydrierung entfernt, und die t-Butoxycarbonyl- und die t-Amyloxycarbonylgruppe werden mit Trifluoressigsäure entfernt. Bevorzugte Schutzgruppen sind die Hydroxylgruppe von Serin und Threonin durch eine Benzylgruppe, die Hydroxylgruppe von Tyrosin durch eine 2,6-Dichlorbenzylgruppe, die £-Aminogruppe von Lysin durch eine o-Chlorbenzyloxycarbonylgruppe, die Aminogruppe in der Guanidinogruppe von Arginin durch eine Tosylgruppe und die Mercaptogruppe von Cystein durch eine p-Methoxybenzylgruppe.

Diese Schutzgruppen können mit wasserfreiem Fluorwasserstoff entfernt werden. Die Acetamidmethylgruppe kann als Schutzgruppe für die Mercaptogruppe von Cystein verwendet werden. Da diese Gruppe gegenüber wasserfreiem Fluorwasserstoff stabil ist, kann sie mittels Quecksilber-(II)-acetat bei einem pH von 4 zum Zeitpunkt der Entfernung der anderen Gruppen entfernt werden.

-ιοί Es werden so geschütztes h-PTH [53-84], geschütztes h-PTH [51-84], geschütztes h-PTH [46-84], geschütztes [Tyr⁵²] h-PTH [52-84], geschütztes [Tyr⁵⁰] h-PTH [50-84], geschütztes [Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84] und geschütztes [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] erhalten. Diese Schutzgruppen werden bevorzugt durch Säurezersetzung, wie eine einstufige Entfernung mittels wasserfreiem Fluorwasserstoff, abgespalten, wobei man die Verbindung der Formel (I) erhält.

Wenn die Mercaptogruppe des 45. Cysteins mittels einer Acetamidmethylgruppe geschützt ist, kann sie mit Quecksilber- (II) -ace tat bei einem pH von 4 nach Entfernung der anderen Schutzgruppen mittels wasserfreiem Fluorwasserstoff entfernt werden.

Die obige Verbindung (I) kann nach an sich bekannten Reinigungsverfahren für Peptide gereinigt werden. Beispielsweise kann sie durch Säulenchromatographie unter Verwendung von Sephadex LH-20 (Warenzeichen), Sephadex G-50 (Warenzeichen), Dowex 1 (Warenzeichen) und Carboxymethylcellulose gereinigt werden.

Das Peptid (I) kann in Form der Base oder des Salzes erhalten werden. Allgemein kann es mittels einer organischen Säure, wie Essigsäure, in ein Salz überführt werden.

Die eifindungsgemäßen Peptide(I), d.h. h-PTH [53-84], h-PTH [51-84], h-PTH [46-84] und [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] , ist für die Antikörperherstellung und für enzymmarkierte Peptide nützlich. Das h-PTH [46-84] und [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] besitzen den Vorteil für die Herstellung des Antikörpers. Insbesondere sind h-PTH [53-84] und h-PTH [51-84] besonders

nützlich als Mittel für die Kontrolle der Antikörperher-

52 Stellung. Ein Peptid mit N-terminalem Tyrosin, d.h. [Tyr ]

h-PTH [52-84], [Tyr⁵⁰] h-PTH [50-84] und [Tyr⁴⁵] h-PTH [45-84J, ist besonders nützlich als Markierungsmittel für

RIA. Beispielsweise wurden [Tyr⁵²] h-PTH [52-84] oder [Tyr⁵⁰]

h-PTH [50-84] und Chloramin T zu aliquoten Teilen von ra-

1 25
dioaktivem J im Phosphatpuffer (pH 7,4) gegeben, dann

wurde gerührt, es wurde Natriumbisulfid zugegeben, dann

wurden geringe Mengen an Kaliumjodid und Serumalbumin zu-

1 25
gegeben. J-markierte Fraktionen wurden durch Chromato-

1 25
graphie gesammelt, wobei man J-konjugierte Verbindungen

125 zu dem Tyrosinrest, d.h. die markierte Verbindung J-[Tyr⁵²] h-PTH [52-84] und die markierte Verbindung ¹²⁵J-iTyr⁵⁰] h-PTH [50-84], welche für RIA-Reagentien nützlich sind, erhält.

125
Die Markierung von J und seine Adsorption an Materialien

52

des Immunreaktionsrohrs unter Verwendung von [Tyr ] h-PTH

[52-84] und [Tyr⁵⁰] h-PTH [50-84], die den Beispielen gemäß hergestellt wurden, wird im folgenden näher erläutert.

(1) Markierung mit J:

Eine Lösung (10 μΐ) von [Tyr⁵²] h-PTH [52-84] (2 ug) oder [Tyr⁵⁰] h-PTH [50-84] (2 pg) und eine Lösung (20 μg) von Chloramin T (3,4 mg/ml) werden zu 0,5M-Phosphatpuffer (pH 7,5, 50 μΐ), welche ¹²⁵J-NaJ (Radioaktivität 2 mCi) enthält, zugegeben. Dann wird 30 see gerührt, und dann wird

Natriumbisulfid (4,5 mg/ml)-Lösung (50 μΐ) zur Beendigung der Reaktion zugegeben. 0,1N-Essigsäurelösung (0,5 ml), die 5% menschliches Serumalbumin enthält, wird zugegeben, und dann wird das Reaktionsgemisch auf eine Säule (1 χ 50 cm)

von Sephadex G-25 für die Gelfiltration zur Entfernung von 1 25
nichtumgesetztem J-NaJ und unter Erhalt von markierter

Verbindung ¹²⁵J-[Tyr⁵²] h-PTH [52-84] und markierter Verbindung ¹²⁵J-[Tyr⁵⁰] h-PTH [50-84] (Entwickler: 0,1N-Essigsäurelösung, die 0,5% menschliches Serumalbumin enthält) geleitet.
35

Die spezifische Aktivität der so erhaltenen J-[Tyr ] h-PTH [52-84] und ¹²⁵J-[Tyr⁵⁰] h-PTH [50-84] ist 523 \iCl/v9

bzw. 545 pCi/pg, und die Ausbeuten betragen 75,5% bzw. 76,7%. Es wird eine um das Zweifache bessere spezifische Aktivität erhalten, und die Ausbeute ist um das Drei- bis Vierfache größer, verglichen mit der Markierung von h-PTH [1-84] oder Rinder-PTH [1-84] (extrahiertes Produkt).

125
(2) Adsorption von J-markierter Verbindung an dem Immunreaktionsrohr:

Eine aliquote Menge (10,5 ml) von Ο,ΟΙΜ-Ammoniumacetatlösung (300 000 cpm), enthaltend ¹²⁵J-[Tyr⁵²] h-PTH [52-84] oder ' J-[Tyr ] h-PTH [50-84], wird in das Immunreaktionsrohr gegeben und während konstanter Zeit stehen gelassen, dann v/ird der Inhalt entfernt, mit einer überschüssigen Menge an destilliertem Wasser gewaschen, und die verbleibende Radioaktivität in dem Rohr wird gezählt, um die Adsorption in dem Reaktionsrohr zu bestimmen.

Adsorptionsverhältnisse von ¹²⁵J-[Tyr⁵²] h-PTH [52-84] betragen 33,t% für Pyrex-Glasrohr (Warenzeichen), 7,7% für Eiken-Rohr Nr. 1 (Warenzeichen), 5,0% für Maruemu-Rohr (Warenzeichen) und 0,5% für Technicon-Rohr (Warenzeichen). Die AdSorptionsverhältnisse von ¹²⁵J-[Tyr⁵⁰] h-PTH [50-84] betragen 30,8% für Pyrex-Glasrohr, 8,1% für Eiken-Rohr Nr. T, 5,5% für Maruemu-Rohr und 0,4% für Technicon-Rohr.

125 Das AcSorptionsverhältnis der Kontrolle J-Rinder-PTH [1-84] beträgt 58,4% für Pyrex-Glasrohr, 15,7% für Eiken-Rohr Kr. t, 12,2% für Maruemu-Rohr und 4,5% für Technicon-Rohr.

Das Adsorptionsverhältnis wird nach der folgenden Gleichung berechnet:

Adsorptionsverhältnis (%) = _χ

zugegebene Radioaktivität (cpm)

(3) Stabilität:

(a) ' J-[Tyr ] h-PTH [52-84] und '"j-[Tyr ^υ] h-PTH [50-84] werden bei -20⁰C 2,. 18, 31 oder 60 Tage lang gelagert, und dann wird eine Gelfiltration an Sephadex G-50 (Säule 1 χ 30 cm, Entwickler: Ο,ΙΜ-Ammoniumacetatpuffer) durchgeführt. Die Radioaktivitäten werden an den Stellungen entsprechend [Tyr⁵²] h-PTH [52-84] und [Tyr⁵⁰] h-PTH [50-84] gemessen, und man stellt fest, daß sie sehr stabil sind.

(b) Die Adsorptionsaktivitäten von ¹²⁵J-[Tyr⁵²] h-PTH [52-84] und ¹²⁵J-[Tyr⁵⁰] h-PTH [50-84] auf Talkpulver betragen 92 bis 98% unmittelbar nach der Adsorption, bei -20⁰C während 2, 18, 31 und 61 Tagen. Man beobachtet keine Abnahme in den Adsorptionsaktivitäten.

Menschliches PTH oder sein C-endständiges Fragment können durch EIA unter Verwendung des Peptids der Formel (Ia) oder des Peptids der Formel (Ib) (die im folgenden als Peptid [Ia]" und Peptid [Ib] bezeichnet werden) analysiert werden.

Die Reagentien, die für die Analyse von PTH durch EIA erforderlich sind, wie Antiserum, Antikörper oder enzymmarkierte Verbindung, werden wie folgt hergestellt.

Für die Herstellung eines spezifischen Antikörpers unter Verwendunq von Peptid (Ia), wird Peptid (Ia) selbst oder Peptid (Ia), konjugiert mit Protein, wie BSA oder BSA, das mit Alkali- oder Natriumlaurylsulfat und Mercaptoäthanol zur Aufspaltung der inneren molekularen Disülfidgruppe behandelt worden ist, Säugetieren, wie Kaninchen, Ratten, Meerschweinchen und Mäusen, für die Sensibilisierung verabreicht.

Beispielsweise wird das obige Peptid (Ia) oder seine protein-konjugierte Verbindung mit Freund's vollständigem Adjuvans vermischt und subkutan 4- bis 7-mal in

Intervallen von zwe'i Wochen zur Sensibilisierung der Säugetiere injiziert. Serum wird aus den sensibilisierten Tieren gesammelt und in an sich bekannter Weise behandelt, beispielsweise zur Herstellung des Antiserums zentrifugiert. Das Antiserum, das eine hohe Konzentration an spezifischem Antikörper enthält/ kann so, wie es ist, gelagert werden, und es kann in aliquoten Verdünnungen verwendet werden. Der spezifische Antikörper kann nach an sich bekannten Verfahren, wie Aussalzung, isoelektrische Präzipitation, Dialyse, Chromatographie oder Gelfiltration, gereinigt werden.

Das proteinkonjugierte Peptid (Ia) kann unter Verwendung von polyfunktionellen Reagentien, wie beispielsweise einer Aldehydverbindung, wie Succinaldehyd, Glutaraldehyd oder AdipOcildehyd, einem Diisocyanate wie Hexamethylendiisocyanat oder 2,4-Toluoldiisocyanat, eines 3-(2'-Benzothiazolyldithio)-propionatsuccinimidesters (JA-OS 55-17302), von 6-N[3-(2'-Benzothiazolyldithio)propionyl]capronsäuresuccinimidester und N-[2-(2'-Pyridyldithio)äthyl]-3-(2'-benzothiazolyldithio)propionamid (JA-OS 55-94367, 55-133382, 55-136261), Maieimidbenzoatsuccinimidester, N,N^f-Äthylenbism'aleimid, Bisdiazobenzidin und Diäthylmalonimidat erhalten werden. Diese polyfunktionellen Reagentien können unter Beachtung der funktioneilen Gruppen im (Ia) oder Protein, wie

Amino-, Carboxyl- oder Thiolgruppe, ausgewählt werden. Ein bevorzugtes Beispiel für die peptid-(Ia)-proteinkonjugierte Verbindung wird aus [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] des Peptids (Ia) und dem polyfunktionellen Reagenz von 3-(2'-Benzothiazolyldithio) propionat succinimides ter zur Bindung der Thiolgrup-

45
pe in Cys hergestellt.

Das be-vorzugte Verhältnis für die Konjugation beträgt 1 Mol Protein, wie BSA, für 1 bis 20 Mol Peptid (Ia). Bei der Reaktion wird zu dem Peptid (Ia) in wäßrigem Medium mit pH 7 bis 8 das polyfunktionelle Reagenz zugegeben, und dann wird unter Kühlen bei Raumtemperatur 1 bis 5 Stunden umgesetzt.

und dann wird durch Gelfiltration gereinigt. BSA wird zugegeben, dann wird bei Raumtemperatur während 1 bis 5 Stunden umgesetzt, und dann wird gemäß der an sich bekannten Gelfiltration und Dialyse unter Herstellung des Peptids (Ia), welches mit BSA konjugiert ist, gereinigt.

Der obige spezifische Antikörper kann an einen immobilisierten Träger, beispielsweise einen immobilisierten Proteinträger, wie Albumin oder Gelatine, ein immobilisiertes se- misynthetisches Polymerisat, wie Agarose, Cellulose oder Dextrin, mit Epichlorhydrin oder Bromcyanat behandelt, und ein Polymerisat oder Copolymerisat von Acrylonitril, Acrylsäure, Acrylsäureester, Methacrylat, Methacrylatester, Vinylalkohol, Vinylacetat, Aminostyrol, Acrylamid oder Äthylen unter Verwendung des obigen polyfunktionellen Reagenz gebunden sein.

Beispiele von Enzymen für die Herstellung von enzymmarkiertem Peptid (Ib) in EIA sind Oxidoreduktase, Hydrolase, Transferase, Lyase, Isomerase oder Ligase, zum Beispiel Lactatdehydrogenase, Malatdehydrogenase,Apfelsäuredehydrogenase. Maltosedehydrogenase, Lactatoxidase, Malatoxidase, Glucoseoxidase, Cholinoxidase, Xanthinoxidase, Aminosäureoxidase, Sarcosinoxidase, Catalase, cx-Amilase., ß-Galactosidase, Lysozym, Lipase,alkalische Phosphatase, Aminopeptidase, Tripsin, Papain, a-Chymotrypsin, Amidase, Hexokinase und Glycerokinase. Bevorzugte Abstandshalter (Spacer) können zuvor in diese Enzyme einverleibt werden. Beispiele sind Dialdehyde,wie Glutaraldehyd, reaktive Derivate, wie co~ Aminoessigsäurechlorid, Diamin, wie bei der Bindung des Dialdehyds oder Dicarbonsäure und Hexamethylendiamin oder Decamethylenamin, S-Acety!mercapto bernsteinsäureanhydrid und die Bindung des Dialdehyds und 2-Aminoäthanthiol. Eine Aldehyd-, Amino- oder Thiolgruppe kann unter Verwendung der oben aufgeführten Abstands- bzw. Spacer-Reagenzien eingeführt werden.

ί Das Peptid-(Ib)-Enzym-Konjugat kann erhalten werden, indem man das Peptid (Ib) und eine Amino-/ Hydroxy-/ Carboxyl- oder Thiolgruppe in dem Enzym konjugiert, oder indem man in das Enzym eine Aldehyd-/ Amino- oder Thiolgruppe einführt, oder indem man eine Aldehyd-, Amino-, Thiol- oder Carboxylgruppe unter. Verwendung von polyfunktionellen Reagenzien einführt.

Die Herstellung der enzymmarkierten Verbindung des Peptid-(Ib)-Enzymkonjugats erfolgt wie folgt. Beispielsweise wird das Peptid (Ib) mit dem polyfunktionellen Reagenz bei 0 bis 40 C in Anwesenheit eines organischen Lösungsmittels, wie Methanol, Äthanol/ Aceton, Dioxan, Dimethylsulfoxid, Dimethylacetamid oder Tetrahydrofuran, in Pufferlösung (pH 6 bis 8) oder direkt in diesem organischen Lösungsmittel umgesetzt. Das Verhältnis von Peptid (Ib) und polyfunktionellem Reagenz ist bevorzugt das äquimolare Verhältnis. Nach der Reaktion wird "das"Reaktionsprodukt gegebenenfalls gereinigt/ und das Enzym wird damit umgesetzt, bevorzugt in dem Puffer mit stabilem pH für das Enzym. Die Menge an Enzym ist bevorzugt äquimolar oder eine etwas überschüssige molare Menge. Das so hergestellte Peptid-(Ib)-Enzymkonjugat kann durch Adsorptionschromatographie oder Gelfiltration gereinigt werden.

Verschiedene bekannte EIA-Verfahren können bei der vorliegender Erfindung für die Analyse von h-PTH angewandt werden. Beispiele sind das Konkurrenzverfahren oder das Sandwich-Verfahren .

Einzelheiten des Konkurrenzverfahrens werden im folgenden näher erläutert.

Eine I robe, die das zü'analysiarende h^-.PTH, enzymmarkiertes Peptid (Ib) und Antiserum oder Antikörper des Peptids (Ia) enthält, wird in einem Immunoreaktionsmedium, wie einem

315

Phosphatpuffer oder einem Veronalpuffer, bei 4 bis 5 C während 1 bis 3 Tagen inkubiert. Dann werden der immunologisch gebundene Teil (gebundenes B) und der nichtgebundene, freie Teil (freies F) getrennt (B-F-Trennung). Die B-F-Trennung erfolgt bevorzugt durch Zugabe von normalem Serum des gleichen Säugetiers, wie es für die Antiserumherstellung und das Antiserum dafür verwendet wurde, Inkubieren über Nacht, Zentrifugieren bei 3 000 r.p.m. während 20 bis 30 Minuten für die B-F-Trennung. Danach wird die enzymatisohe Aktivität der ausgefallenen enzymmarkierten Verbindung (B) oder der überstehenden Lösung (F) analysiert. In dem Festen-Phasen-Verfahren wird immobilisierter Antikörper für die Konkurrenzreaktion anstelle von Antiserum oder Antikörper des Peptids (Ia) bei dem obigen Konkurrenzverfahren verwendet. Dann erfolgt nach der Reaktion die B-F-Trennung, und die Enzymaktivität wird auf gleiche Weise, wie oben beschrieben, analysiert.

Andere, an sich bekannte Sandwich-Verfahren können mit bevorzugten Reagenzien angewandt werden.

Das h-PTH oder sein C-terminales Fragment können unter Verwendung von Antikörper von Peptid (Ia) und enzymmarkiertem Peptid. (Ib) mit guter Genauigkeit und Einfachheit analysiert

45 werden. Bevorzugt wird ß-galactosidase-markiertes [Cys 1 h-PTH [45-84] für die Analyse verwendet.

Die in der vorliegenden Anmeldung verwendeten Abkürzungen besitzen die folgenden Bedeutungen:

30	BOC:	-	t-Butoxycarbonyl	AOC:	t-Amyloxycarbonyl
	PAC:	Phenacylester	Z-Cl:	o-Chlorbenzyloxycarbonyl
	BzI:	Benzyl	Tos:	Tosyl
	VaI:	L-VaIin	OMe:	Methylester
	OEt:	Äthylester	ONP:	p-Nitropheny!ester
35	OBzI:	Benzylester	Cys:	L-Cystein

1	OSU:	N-iiy aroxy succ immiaes	rer τη	r: ii-rnreonm
	Ser:	L-Serin	GIu:	L-Glutaminsäure
	Asn:	L-Asparaginsäure	Pro:	L-Prolin
	Leu:	L-Leucin	Asp:	L-Asparaginsäure
5	MeOH:	Methanol	GIy:	Glycin
	Arg:	L-Arginin	Gin:	L-Glutamin
	Ala:	L-Alanin	His:	L-Histidin
	Lys:	L-Lysin	EtOH:	Äthanol
	BuOH:	Butanol	NMP:	N-Methyl-2-pyrrolidon
10	Tyr:	L-Tyrosin	Et₃N:	Triethylamin
	TosoH:	p-Toluolsulfonsäure	Äther:	Diäthyläther
	TFA:	Trifluoressigsäure	DMF:	Dimethylformamid
	THF:	Tetrahydrofuran	TBA:	Tribenzylamin
	NMM:	N'-Methylmorpholin	HOBT:	1-Hydroxybenzotriazol
15	WSCI:	N-Äthyl-N'-dimethylaminopropylcarbodiimid.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen werden die folgenden Träger und Entwicklungsmittel für die Dünnschichtchromatographie (TLC) verwendet. 20 Träger: Silicagel G
Entwickler:

1. Chloroform - Methanol - Essigsäure

2. Chloroform - Methanol - Essigsäure

3. Chloroform - Methanol — Essigsäure 4. Chloroform - Methanol - Essigsäure

5. Bf-nzol - Äthylacetat (1 : T)

6. Benzol - Äthylacetat (2 : 1)

7. Chloroform. - Äthanol - Äthylacetat

8. Chloroform - Äthanol - Äthylacetat Träger: Merck-Cellulose

Entwickler:

9. Butanol - Pyrridin - Essigsäure - Wasser 10. Butanol - Pyrridin - Essigsäure — Wasser

(95 :	5	: 3)	3)
(85 :	15	: 5)	2)
(85 :	10	: 5)
(80 :	25	: 2)
( 5 :	2 :	5)
(10 :	1 :	5)
(2	: 2	: 2 :
(1	: 1	: 1 :

Die Aminosäureanalyse erfolgt wie folgt.

Die Probe wird in 6* N-HCl (Anisol wird bei geschütztem Peptid gegebenenfalls zugegeben) bei 110⁰C während 24 bis 45 Stunden in einem abgedichteten Rohr hydrolysiert, und das Hydrolysat wird im Vakuum getrocknet.

Beispiel 1

h-PTH ( 5 3 -8 4 ) ; H-Lys -Lys -

GIu - Asp - Asn - VaI ,- Leu - Va I - Glu -

Scr -His -GIu - Lys - Ser -Leu - GIy GIu — Al a — Asp —Lys — Al a — Asp ~ Va 1 — Asp - VaI - Leu - Thr - Lys - AIa -Lys Ser - Gin - OH

(1) P(83-84): BOC-Ser(BzI)-Gln-OBzl [1].

BOC-Gln-QBzl (181,4 g, 0,242 M) wird in TFA (270 ml) gelöst und bei Raumtemperatur während 45 Minuten gerührt. Nachdem das TFA im Vakuum abdestilliert wurde, wird Äther zu dem Rückstand gegeben, und der Niederschlag wird gesammelt.'Der Niederschlag wird in DMF (270 ml) gelöst, und HOBT (32,67 g, 0,242 M), BOC-Ser(BzI)-OH (67,35 g, 0,242 M) und WSCI (44,29 ml, 0,242 M) werden zugegeben, und dann wird über Nacht gerührt. DMF wird abdestilliert, und der Rückstand wird in Äthylacetat (440 ml) gelöst, dann mit 1N HCl, 5% Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die Lösung wird durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und filtriert und dann im Vakuum getrocknet. Die Umkristallisation erfolgt aus Äthylacetatr-Hexan und man erhält die Substanz [1] (101,43 g, Ausbeute: 81,6%).

Schmelzpunkt: 121 - 123°C
TLC: Rf₇ = 0,75

⁷ = -14,12 (c = 1,0, DMF)

H%	03	N%	οΊ
7,	87	8,	18
6,	8,

- 20 -

1 Elementaranalyse [C₂₇H₃₅O₇N₉]:

C%

gefunden: 62,98

berechnet: 63,14

(2) P(82-84): BOC-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-Gln-OBzl [2]:

TFA (440 ml) wird zu der Substanz [1] (98,87 g, 192,5 mM) zugegeben, und dann wird bei Raumtemperatur während 30 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in DMF (330 ml) gelöst. HOBT (28,6 g) und DMF-Lösung von BOC-Lys(Z-Cl)-OH [BOC-Lys(Z-Cl)-OH-TBA (103,33 g, 1,1 molarer Überschuß) wird mit Äthylacetat - 1 N-HCl behandelt. Die Äthylacetatschicht wird über wasserfreiem

15* Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft, und VJSCI [38,72 ml (1,1.molarer Überschuß)] wird zugegeben. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur während 2 Tagen gerührt- DMF wird im Vakuum abdestilliert, und Eiswasser wird zu dem Rückstand zugegeben, und dann wird der so gebildete Niederschlag gesammelt. Die ümkristallisation erfolgt dreimal aus Äthanol-Hexan,wobei man die Substanz [2] (111,06 g, Ausbeute: 71,2%) erhält.

TLC: Rf₁ = 0,32, Rf₇ =0,76 25 Sclimelzpunkt: 145 - 147°C [a]£⁷ = -13,1° (c =1,0, DMF) Elomentaranalyse [C...H₅₂O₁₀N

gefunden:
30 berechnet:

(3) P(80-81): BOC-LyS(Z-Cl)-AIa-OMe [3]:

BOC-Lys(Z-Cl)-OH·TBA (234,24 g) wird in Äthylacetat suspen diert und mit 1 N-HCl und Wasser gewaschen und über wasser freiem Natriumsulfat getrocknet. Die Suspension wird im Va

c%	,02	H%	65	N%	74
61	,77	6,	47	8,	65
60	6/	8,

kuum eingedampft und in DMF (400 ml) gelöst. H-Ala-OMe-HCl (67,0 g) , HOBT (64,8 g) und WSCI (87,84 ml) werden zugegeben, und dann wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. DMF wird im Vakuum abdestilliert, und der Rückstand wird in Äthylacetat (2 1) gelöst und dann mit 5% Natriumbicarbonat, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über Natriumsulfat wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Die Umkristallisation erfolgt aus Äthylacetat-Hexan, und man erhält die Substanz [3] (231,8 g, Ausbeute: 96,6%). 10

Schmelzpunkt: 58 - 60⁰C

TLC: Rf₁ = 0,77	» 1	/0,	DMF)	•	,96	H%	78	N%	56
[α]ρ⁷ = -17,16 (c	^iC23	^H34	O₇N₃Cl]	C%	,25	6,	85	⁸'	40
Elementaranalyse				54		6,		8,
				55
gefunden:
berechnet:

(4) P(79-81): BOC-Thr(BzI)-Lys(Z-Cl)-AIa-OMe [4]:

Die Substanz [3] (174,99 g, 0,35 M) wird zu TFA (500 ml) gegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 50 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und mit 5% Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft.Der Rückstand wird in DMF (400 ml) gelöst. HOBT (49,95 g, 1,05 molarer Überschuß), BOC-Thr(BzI)-OH (114,33 g, 1,05 molarer Oberschuß) und WSCI (67,7 ml, 1,05 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt, und dann wird Eiswasser zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und von heißem Äthanol umkristallisiert, und man erhält die Substanz [4] (99,31 g).

Die Mutterlauge wird im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird in Chloroform gelöst, viermal mit 5% Natriumbicarbonat,

zweimal mit 1 N-HCl* und zweimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Lösung im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird durch Silicagelsäulenchromatographie [Entwickler: Chloroform - Äthanol -

Essigsäure (5 : 1 : 5)] gereinigt, und man erhält die Substanz [4] (35,09 g). Die Fraktionen, die die Verunreinigungen enthalten, werden bei der nächsten Säulenehromatographiereinigungsstufe verwendet.

Die Substanz [3] (22,5 g, 45 mM) wird zu TFA (70 ml) zugegeben und bei Zimmertemperatur während 45 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in DMF (50 ml) gelöst, und dann wird durch Zugabe von NMM auf pH eingestellt. HOBT (6,68 g, 1,1 molarer Überschuß), BOC-THr (BzI)-OH (15,31 g, 1,1 molarer Überschuß) und WSCI (9,06
ml, 1,1 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird über Nacht gerührt. Nach dem Abdestiliieren von DMF im Vakuum wird der Rückstand in Chloroform (200 ml) gelöst und
mit 5% Natriumbicarbonat, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft.Der Rückstand wird mit den zuvor erwähnten Fraktionen, welche die Verunreinigungen enthalten, vermischt und durch Silicagelsäulenchromatographie gereinigt. Die entsprechenden Fraktionen werden im Vakuum getrocknet, zweimal mit Chloroform-Hexan wieder ausgefällt,
wobei man die Substanz [4] (48,80 g) erhält. Gesamtausbeute: 183,2 g.

Schmelzpunkt: 132 - 134°C
TLC: Rf₇ =0,85
Elementaranalyse [C₃₄H₄₇O₉N₄CIl:

C%

gefunden: 59,06

berechnet: 59,08

H%	05	N%	41
7,	85	7,	11
6,	8,

(5) P (77-78): BOC-Val-Leu-OEt [5]:

BOC-VaI-OH (101,99 g, 0,47 M), H-Leu-OEfHCl (91,98 g, 0,47 M), HOBT (63,45 g) und WSCI (86,01 ml, 0,47 M) werden in THF (400 ml) gelöst und über Nacht gerührt. THF wird im Vakuum abdestilliert, in Äthylacetat (400 ml) gelöst und mit 5% Natriumbicarbonat, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird im Vakuum eingedampft.umkristalIisation erfolgt aus Äthylacetat-Hexan. Man erhält die Substanz [5] (153,7 g, Ausbeute: 91,2%).

Schmelzpunkt: 108 - 110°C
TLC
15

Rf₁ = 0,63	(c =	1	/0,	DMF)	C%	35	H%	42	N%	39
= -25,78	e [C.	I 8	^H34	O₅N₂]:	60,	31	9,	56	8,	82
η tar analyst					60,		9,		7,

gefunden:	•
berechnet

(6) P(77-78): BOC-Val-Leu-OH [6]:

Zu der Substanz [51 (134,43 g, 0,375 M), die in Äthanol (400 ml) gelöst ist, gibt man 1 N-NaOH (412,5 ml, 1,1 molarer Überschuß) unter Eiskühlung, und man rührt 1,5 Stunden. 1 N-NaOH (37,5 g, 0,1 molarer Überschuß) wird zugegeben, und dann wird weiter 1 Stunde gerührt. 1 N-HCl (75 ml) wird zur Einstellung des pH-Werts auf 5 zugegeben. Die Lösung wird mit Äther gewaschen. 1 N-HCl (400 ml) wird zu der wäßrigen Lösung zugegeben, und dann wird mit Äthylacetat extrahiert. Nach dem Trocknen der Äthylacetatschicht wird sie zur Trockene eingedampft, und dann wird aus Äthylacetat-Hexan umkristallisiert, und man erhält die Substanz [6] (119,66 g, Ausbeute: 96,6%).

TLC: Rf₁ = 0,35, Rf₇ = 0,58
Elementaranalyse I^c<ic^H30^5^N2^ ^:

- 24 -

	,83	* -	40	N%	78
c%	,16	H%	15	8,	48
57	9,		8,
58	9,

gefunden:
berechnet:

(7) P(77-81): BOC-Val-Leu-Thr(BzI)-Lys(Z-Cl)-AIa-OMe [7]:

Die Substanz [4] (182 g, 0,263 M) wird zu TFÄ (500 ml) gegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 50 Minuten gerührt. TFA wird abdestilliert, und Hexan wird zu dem Rückstand zugegeben. Die ausgefallene ölige Substanz wird durch Abdekantierung abgetrennt und in DMF (350 ml) gelöst, und dann wird der pH-Wert durch Zugabe von NMM auf 6,5 eingestellt. HOBT (42,61 g, 1,2 molarer Überschuß), die Substanz [6] (104,28 g, 1,2 molarer Überschuß) und WSCI (57,8 g, 1,2 molarer Überschuß) werden zugegeben und bei Zimmertemperatur 1,5 Stunden gerührt. Das Reaktionsgemisch wird fest, und es ist unmöglich, zu rühren; daher wird weiteres DMF (200 ml) zugegeben, und dann wird über Nacht bei Zimmertemperatur und bei 30 C während 4 Stunden stehengelassen.

Eiswasser wird zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, und dann wird der Niederschlag abgetrennt und in Chloroform (2,5 1) gelöst und mit 5% Natriumbxcarbonat, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Das Chlorofrom wird im Vakuum abdestilliert, und der Rückstand wird aus Chloroform - Äther - Hexan umkristallisiert, und man erhält die Substanz [7] (224,68 g, Ausbeute! 94,9%).

Schmelzpunkt: 219 - 221⁰C

TLC: Rf₁ = 0,15, Rfg = 0,68
ζ¹

[O]J' = -11,72 (c =	1,0, DMF)	,80	H%	56	N%	83
Elementaranalyse [C₁	J₅H₆₇O₁₁NgCl]:	,82	7,	48	9,	30
	C%		7,		9,
gefunden:	59
berechnet:	59

(8) P(77-81): BOC-Vai-Leu-Thr(BzI)-Lys(Z-Cl)-AIa-OH [8]

Eine 90%ige Äthanoilösung (800 ml) von 1 N-KOH wird unter Eiskühlung zu der Substanz [7] (72,3 g, 80 mM), gelöst in Chloroform (720 ml), zugegeben, und dann wird bei 0 - 5 C während 40 Minuten gerührt. 1 N-HCl (800 ml) wird unter Eiskühlung zugegeben, und dann wird mit Chloroform (500 ml) extrahiert, und dann wird nochmals Chloroform (500 ml) zugegeben. Die Chloroformschicht wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum eingedampft.Der Rückstand wird durch Silicagelsäulenchromatographie [Entwickler: Chloroform - Äthanol - Äthylacetat (5 : 1 : 5) gereinigt. Die entsprechende Fraktion wird, im Vakuum getrocknet und dreimal aus Chloroform Methanoi-Äther - Hexan umkristallisiert, wobei man die Substanz [8] erhält.

Der obige Vorgang wird dreimal zur Hydrolyse der Substanz [7] (216,9 g) wiederholt, wobei man die Substanz [8] (156,07 g, Ausbeute: 73,1%) erhält.

Schmelzpunkt: 180 - 183°C
TLC: Rf₃ =0,69
[CX]₀ ¹⁷ = -7,54 (c = 1,0, DMF)
Elementaranalyse [C₄₄H₆₅O.. ..NgCl'-5H₂O] :

gefunden: berechnet:

Aminosäureanalyse [Probe 3,1 mg/1 ml 6 N-HCl + 0,1 ml Anisol, 45 Stunden bei 110⁰C hydrolysiert]:

Thr 0,96 (1), AIa 1, VaI 0,93 Cl), Leu 0,94 (1), Lys 1,01 (1)
35

c%	,94	H%	67	N%	64
58	,82	7,	40	9,	35
58	7,	9,

(9) P(77-84): BOC-Val-Leu-Thr(BzI)-Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl) -

Ser(BzI)-GIn-OBzI [9]:

Die Substanz [2] (104,5 g, 129 mM) in TPA (400 ml) wird bei Zimmertemperatur während 40 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert/ und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und in DMF (500 ml) gelöst. HOBT (20,9 g, 1,2 molarer Überschuß), Substanz [8] (137,7 g, 1,2 molarer Überschuß) und WSCI (28,3 ml, 1,2 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird der pH-Wert auf 7 durch Zugabe von NMM eingestellt, und es wird über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird ein Gel, dann werden weiter DMF (150 ml) und WSCI (12,8 ml) zugegeben, und dann wird über Nacht gerührt. Eiswasser wird zu dem Reaktionscemisch zugegeben, dann wird der Niederschlag gesammelt und fünfmal mit heißem Methanol gewaschen, wobei man die Substanz [9] (185,36 g, Ausbeute: 90,68%) erhält.

TLC: Rf₂ =0,85 ⁷

c%	,61	H%	04	N%	,38
60	,75	7,	82	10	74
60	6,	9,

[a]p⁷ = -12,84 (C = 1,0, DMF)
Elementaranalyse [Cg₀H₁ Q₇O₁ ^

gefunden: berechnet: 25

Aminosäureanalyse [Probe 3,1 mg/1 ml 6 N-HCl + 0,1 ml Anisol, hydrolysiert bei 110 C während 45 Stunden]:

Thr 0,93 (1), Ser 0,91 (1), GIu 1,01 (1), AIa 1, VaI 0,74 (1), Leu 0,75 (1), Lys 2,01 (2)

(10) P(76-84): BOC-Asp(OBzI)-Val-Leu-Thr(BzI)-Lys(Z-Cl) Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-GIn-OBzI [10]:

Die Substanz [9] (183,5 g, 116 mM) wird zu TFA (500 ml) gegeben und bei Zimmertemperatur während 65 Minuten gerührt, und dann wird das TFA abdestilliert. Äther wird zu dem Rück-

stand zugegeben, dann wird der Niederschlag gesammelt und in DMF (900 ml) gelöst. HOBT (18,8g, 1,2 molarer Überschuß), BOC-Asp(OBzI)-OH (45,0 g, 1,2 molarer Überschuß) und WSCI (25,5 ml, 1,2 molarer Überschuß) werden zugegeben, der pH-Wert wird durch Zugabe von NMM auf 7 eingestellt, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum abdestilliert, und Eiswasser wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und zweimal mit heißem Methanol gewaschen. Die unlöslichen Verbindungen werden in heißem DMF gelöst, und Äthanol wird zugegeben.

Der Niederschlag wird gesammelt, suspendiert und filtriert, wobei man die Substanz [10] (205,5 g, Ausbeute: 99,14%) erhält.

Schmelzpunkt: 259 - 262°C
TLC: Rf₂ =0,81
[a]£⁷ = -13,7 (c = 1,0, DMF)
Elementaranalyse I^C9i^htj8°21^N12^C12·' ^:

20 gefunden:

berechnet:

(11) P(75-84): BOC-Val-Asp(OBzI)-Val-Leu-Thr(BzI)-Lys(Z-Cl) Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-GIn-OBzI [11]:

Die Substanz [10] (196,55 g, 0,11 M) wird zu TFA (500 ml) gegeben, bei Zimmertemperatur wird während 60 Minuten gerührt, und TFA wird im Vakuum entfernt. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, und der Niederschlag wird gesammelt und dann in DMF (1,3 1) gelöst. HOBT (19,3 g, 1,3 molarer Überschuß), BOC-VaI-QH (31,1 g, 1,3 molarer Überschuß) und WSCI (26,2 ml, 1,3 molarer Überschuß) werden unter Rühren zugegeben, der pH-Wert wird durch Zugabe von NMM auf 7 eingestellt, und dann wird bei Zimmertemperatur gerührt. Eine Stunde später bildet das Reaktionsgemisch ein Gel und wird über Nacht stehen gelassen. NMP (400 ml), 2,4-Dinitrophenol

c%	01	H%	84	N%	54
61,	16	6,	66	9,	41
61,	6,	9,

- 28 -

(20,2 g) und WSCI (26,2 ml, 1,3 molarer Überschuß) werden zugegeben. Eine Gelbildung tritt während etwa 10 Minuten auf, dann läßt man über Nacht stehen. Eis und 5%ige Natriumbicarbonatlösung werden zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt, dreimal mit Wasser und viermal mit heißem Methanol gewaschen, und man erhält die Substanz [11] (203,74 g, Ausbeute: 98,2%).

Schmelzpunkt: 267 - 270⁰C

TLC: Rf₃ =0,56	>6^il127^U22^W13⁽--^L2 ¹V	>] :	N%
Elementaranalyse [C_c	C%	H%	9,82
	60,25	6,78	9,56
gefunden:	60,55	6,83
berechnet:

Aminsosäureanalyse: [Probe 3,1 mg/1 ml 6 N-HCl + 0,1 ml

Anisol, Hydrolyse bei 110⁰C während 48 Stunden]:

Asp 1,04 (1), Thr 0,83 (1), Ser 0,78 (1), GIu 1,03 (D/ AIa 1,08 (1), Leu 1, VaI 1,87 (2), Lys 2,19 (2)

(12) P (74-84): BOC-Asp(OBzI)-Val-Asp(OBzI)-Val-Leu-Thr(BzI) Lys(Z-Cl)-AIa-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-GIn-OBzI [12]

Die Substanz [11] (151,2 g, 0,08 M) wird in Methylenchlorid (100 ml) und TFA (450 ml) gelöst, während 40 Minuten wird bei Zimmertemperatur gerührt, und dann wird TFA im Vakuum entfernt. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. DMF (500 ml) ur.d NMP (1 1) werden zu dem Niederschlag zugegeben, um ihn aufzulösen. Eis und 5%iges Natriumbicarbonat werden zugegeben. Der so gebildete Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser gewaschen und getrocknet. Ein Gemisch aus DMF (500 ml) und NMP (1 1) wird zum Auflösen des Materials zugegeben, und BOC-Asp(OBzI)-OSU (44,0 g, 1,3 molarer Überschuß), HOBT (1,4 g, 0,ΐ3 molarer Überschuß) und NMM (11,4 ml, 1,3 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird

in Eiswasser gegossen, der so gebildete Niederschlag wird gesammelt, und dann wird Methanol zugegeben und eine Wärmebehandlung durchgeführt. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt, und man erhält die Substanz [12] (157,6 g, Ausbeu-

5 te: 94,2%).

TLC: Rf₃ = 0,56	107	^H135°25^N14^C	I₂]:	H%	N%	90
Elementaranalyse I		C%		6,66	9,	38
		61	,35	6,65	9,
gefunden:		61	,45
berechnet:

Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110⁰C, 48 Stunden]:

Asp 1,86 (2), Thr 0,87 (1), Ser 0,71 (1), GIu 1,01 (1), AIa 1,00 (1), VaI 1,91 (2), Leu 1, Lys 2,01 (2)

(13) P(72-73): BOC-Lys(Z-Cl)-AIa-OH [13]:

1 N-NaOH (115,2 ml, 1,2 molarer Überschuß) wird bei 0⁰C zur Substanz [3] (48,0 g, 96 ml) zugegeben, die in Äthanol (100 ml) gelöst ist, und während 50 Minuten wird gerührt. 1 N-HCl (19 mX) wird zur Einstellung des pH-Werts auf 6 zugegeben, und das Äthanol wird bei 35°C abdestilliert. Äthylacetat, Eiswasser und 1 N-HCl (96 ml) werden zu dem Rückstand für die Extraktion zugegeben. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen, unter Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum eingedampft.Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Hexan umkristallisiert, und man erhält die Substanz [13] (45,90 g, Ausbeute: 98,4%). 30

Schmelzpunkt: 116 - 119°C
TLC: Rf₇ = 0,44
Elementaranalyse l^c ₉2^H32^O7^N

35 gefunden:

berechnet:

C%	,57	H%	91	N%	95
54	,37	6,	64	8,	65
54	6,	8,

(14) P(72-84): BOC-LyS(Z-CI)-AIa-ASp(OBzI)-VaI-ASp(OBzI)-

Val-Leu-Thr(BzI)-Lys(Z-CI)-AIa-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-GIn-OBzI [14]:

Methylenchlorid (60 ml) und TFA (360 ml) werden zu der Substanz [12] (1.25,46 g, 60 mM) zugegeben, bei Zimmertemperatur wird 55 Minuten gerührt, und dann wird das TFA abdestilliert. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, und der Niederschlag wird gesammelt. DMF (600 ml) und NMP (600 ml) werden zum Auflösen zugegeben. Eis und 5%iges Natriumbicarbonat werden zugegeben. Das so ausgefallene Material wird gesammelt, dreimal mit Wasser und erneut mit Methanol und Äther gewaschen und getrocknet. NMP (1200 ml) und DMF (600 ml) werden zugegeben, um das Material aufzulösen. HOBT (10,56 g, 1,3 molarer Überschuß), die Substanz [13] (37,92 g, 1,3 molarer Überschuß) und WSCI (14,28 g, 1,3 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 3 Tage lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eiswasser gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, dreimal mit Wasser und dann zweimal mit heißem Methanol gewaschen. Weiteres Material wird mit Äther gewaschen, und dann wird getrocknet, um die Substanz [14] zu erhalten (142,74 g, Ausbeute: 96,7%)

taranalyse [C.	24^H161°29^N27^Cl3^i:	H%	79	N%	70
	C%	6,	60	9,	68
gefunden:	60,30	6,		9,
berechnet:	60,54

Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110⁰C, 48 Stunden]:

Asp 1,86 (2), Thr 0,85 (1), Ser 0,67 (1), GIu 1,02 (1), AIa 1,90 (2), VaI 1,93 (2), Leu 1 , Lys 2,93 (3)

(15) E (71-84): BOC-ASp(OBZI)-LyS(Z-CI)-AIa-ASp(OBzI)-VaI-Asp(OBzI)-Val-Leu-Thr(BzI)-Lys(Z-Cl)-AIa-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-GIn-OBzI [15]:

Die Substanz [14] wird zu TFA (420 ml) zugegeben, bei Zimmertemperatur 55 Minuten lang gerührt, und TFA wird im Vakuum abdestilliert, Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt, und dann werden NMP (720 ml) und DMF (720 ml) zum Auflösen zugegeben. Das Gemisch wird in Eis und 5%ige Natriumbicarbonatlösung gegossen, der so gebildete Niederschlag wird gesammelt und dreimal mit Wasser und einmal mit Methanol und Äther gewaschen. NMP (840 ml) und DMF (840 ml) werden zugegeben, um das Material aufzulösen. HOBT (0,732 g, 0,14 molarer Überschuß), 2,4-Dinitrophenol (11,93 g, 1,2 molarer Überschuß), BOC-Asp(QBzl)-OSU (3,18 g, 1,2 molarer Überschuß) und NMM (5,94 ml, 1,4 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur zwei Tage lang gerührt. NMP (120 ml) und DMF (60 ml) werden nochmals zu dem Reaktionsgemisch zugegeben, um das Material aufzulösen. BOC-Asp(OBzI)-OSU (4,56 g, 0,2 molarer Überschuß) und NMM (1,19 ml, 0,2 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur zwei Tage lang weitergerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eiswasser gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser gewaschen und in heißem Methanol suspendiert. Nach dem Kühlen wird der Niederschlag abfiltriert. Dieser Vorgang wird dreimal wiederholt, und man erhält die Substanz [15] (136,72 g, Ausbeute: 95,0%).

Elementaranalyse i^ci35^Hi72°32^N18^C'''3-'^:

gefunden: .

berechnet: 30

Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110⁰C, 48 Stunden]:

Asp 2,60 (3), Thr 0,83 (1), Ser 0,65 (1), GIu 1,00 (1) , AIa 1 ,81 (2) , VaI 1 ,92 (2) , Leu 1, Lys 2,85 (3)

c%	33	H%	55	N%	76
60,	83	6,	51	9,	46
60,	6,	9,

(16) P(70-84): BOC-AIa-ASp(OBZI)-LyS(Z-CI)-AIa-ASp(OBzI)-

Val-Asp(OBzI)-Val-Leu-Thr(BzI)-Lys(Z-Cl) Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-GIn-OBzI [16]:

Die Substanz [15] wird zu TFA (325 ml) zugegeben, bei Zimmertemperatur wird während 70 Minuten gerührt, und TFA wird im Vakuum abdestilliert. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt, und NMP (600 ml) und DMF (600 ml) werden zugegeben, um das Material aufzulösen, und dann wird 5%iges Natriumbicarbonat zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und dreimal mit Wasser und einmal mit Methanol gewaschen. Der Niederschlag wird in NMP (720 ml) und DMF (720 ml) gelöst. 2/4-Dinitrophenol (9,0 g), HOBT (0,55 g, 0,1 molarer Überschuß), BOC-Ala-OSÜ (17,52 g, 1/5 molarer Überschuß) und NMM (6,72 ml, 1,5 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Weiteres BOC-AIa-OSu (2,34 g) und NMM (0,9 ml) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 5 Tage lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eiswasser gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, dreimal mit Wasser und zweimal mit Methanol gewaschen, und man erhält die Substanz [16] (109,78 g, Ausbeute: 98,3%).

Schmelzpunkt: über 280⁰C (zers.) Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110⁰C, 48 Stunden]:

Asp 2,57 (3), Thr 0,84.(1), Ser 0,67 (1), GIu 1,00 (1), AIa 2,53 (3), VaI 1,98 (2), Leu 1, Lys 2,79 (3)

(17) P(69-84): BOC-GIU(OBzI)-AIa-ASp(OBzI)-LyS(Z-Cl)-AIa-Asp(OBzl)-Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(Bzl)-

Lys(Z-Cl)-Ala-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-Gln-OBzl [17]

Die Substanz [16] (85,38 g, 31,2 mM) wird zu TFA (280 ml) gegeben, bei Zimmertemperatur 60 Minuten lang gerührt, und das TFA wird abdestilliert. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt, dann wird durch

Zugabe von DMF (540 ml) und NMP (540 ml) gelöst, und die Lösung wird zu einem Gemisch aus 5%igem Natriumbicarbonat und Eis gegeben. Der Niederschlag wird dreimal mit Wasser und einmal mit Methanol gewaschen. Dies wird in DMF (600 ml) und NMP (780 ml) gelöst. 2,4-Dinitrophenol (6,89 g_f 1,2 molarer Überschuß), HOBT (0,59 g, 0,14 molarer Überschuß), BOC-GIu(OBzI)-OSU (18,97 g, 1,4 molarer Überschuß) und NMM (4,8 ml, 1,4 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 3 Tagen gerührt. BOC-GIu (OBzI)-OSU (2,71 g, 0,2 molarer Überschuß), gelöst in DMF (60 ml), und NMP (50 ml) und NMM (0,64 ml, 1,4 molarer Überschuß werden zugegeben, und dann wird weiter bei Zimmertemperatur 3 Tage lang gerührt. Die gleiche Menge an BOC-GIu (OBzI)-OSU und NMM wie oben wird zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eiswasser gegossen, der so gebildete Niederschlag wird gesammelt und dreimal mit Wasser gewaschen. Der Niederschlag wird in heißem Methanol suspendiert, gekühlt und filtriert. Dieser Vorgang wird dreimal wiederholt, und man erhält die Substanz [17] (88,97 g, Ausbeute: 96,5%).

Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110⁰C, 24 Stunden]:

Asp 2,66 (3), Thr 0,91 (1), Ser 0,78 (1), GIu 1,76 (2), AIa 2,65 (3), VaI 1,97 (2), Leu 1 , Lys 2,88 (3) 25

(18) P(66-68): BOC-Ser(BzI)-Leu-Gly-OBzl [18]:

WSCI (33,69 ml) wird tropfenweise zu B0C-Leu-0H*H₂0 (45,64 g), H-Gly-OBzl'TosOH (61,87 g) und HOBT (24,87 g) , gelöst in THF (200 ml), unter Kühlen gegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird im Vakuum konzentriert, und man erhält ein öliges Material, das in Äthylacetat (600 ml) gelöst wird, und man wäscht dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat, 1 N-HCl und Wasser. Die organische Schicht wird durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, und dann wird im Vakuum eingedampft, und man erhält eine ölige Substanz (69,0 g, Aus-

beute: 99%). Diese -wird in Methylenchlorid (10 ml) gelöst, TFA (250 ml) wird bei 5°C zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 20 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert, DMF (200 ml) wird zu dem Rückstand zugegeben und dann durch Zugabe von NMM bei 0⁰C neutralisiert. HOBT (20,7 g, 0,19 M), BOC-Ser(BzI)-OH (56 g, 0,19 M) und WSCI (34,8 ml, 0,19 M) werden zugegeben, dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt, Äthylacetat wird zu dem Rückstand zugegeben, dann wird mit 5%igem Na.triumbicarbonat, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird das Gemisch im Vakuum konzentriert. Hexan wird zu dem Rückstand zugegeben, und der Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt. Die ümkristallisation erfolgt von Äthylacetat-Hexan und Äthylacetatäther-Hexan, und man erhält die Substanz [18] (72,47 g, Ausbeute: 72,0%).

Schmelzpunkt: 112 - 11 3°C
TLC: Rf₅ = 0,55
El€imentaranalyse t^C3o^H4i°7^N3^ ^:

gefunden: berechnet:

(19) P(65-68): BOC-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-Leu-Gly-OBzl [19]:

TFA (250 ml) wird bei 5°C zur Substanz [18] (72,47 g, 0,13 M), gelöst in Methylenchlorid (20 ml) zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 20 Minuten lang gerührt. TFA wird im Vakuum entfernt, und Äther wird zu dem Rückstand zugege-

c%	,06	H%	75	N%	36
65	,84	7,	44	7,	56
64	7,	7,

ben. Der Niederschlag wird gesammelt, und DMF wird zugegeben. Be;
sieren.

ben. Bei 5 C wird NMM zugegeben, um die Lösung zu neutrali-

Äthylacetat (200 ml) wird zu BOC-Lys(Z-Cl)-OH"TBA (70 g, 0,143 M) zugegeben, und dann wird zweimal mit 1 N-HCl und

Wasser gewaschen. Die Äthylacetatschicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. DMF (100 ml) wird zum erhaltenen öligen Material zugegeben, um eine DMF-Lösung aus BOC-Lys(Z-Cl)-OH zu ergeben. 5

Zu der obigen neutralisierten DMF-Lösung gibt man HOBT (19,3 g) , DMF-Lösung von BOC-Lys(Z-Cl)-OH und WSCI (26,2 ml, 0,143 M) zu und rührt bei Zimmertemperatur über Nacht. DMF wird im Vakuum abdestilliert, dann wird Äthylacetat (400 ml) zu dem Rückstand zugegeben und dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat gewaschen, zweimal mit 1 N-HCl und zweimal mit Wasser, Die organische Schicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Äther und Hexan werden zu dem Rückstand zugegeben, das so ausgefallene Material wird gesammelt und aus Äthylacetat-Methanol-Hexan umkristallisiert. Man erhält die Substanz [191 (104 g, Ausbeute: 94,6%).

Schmelzpunkt: 128 - 130⁰C 20 TLC: Rf₁ = O,51, Rf₂ =0,88 Elementaranalyse [C₄₄H₅₈O₁₀N

gefunden: berechnet: 25

Aminosäureanalyse [1 μΜ/6 N-HCl 0,3 ml, 105⁰C, 20 Stunden]: Ser 0,92 (1), GIy 0,98 (1), Leu 1, Lys 0,99 (1)

(20) P(65-68): BOC-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-Leu-Gly-OH [20]:

Methanol (600 ml) wird zur Substanz [19] (85,3 g) zugegeben, unter Rühren bei 5°C wird 1 N-NaOH (120 ml) zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 3 Stunden lang gerührt. Nach der Zugabe von 1 N-HCl (20 ml) bei 5°C wird das Methanol im Vakuum abdestilliert. 1 N-HCl (100 ml) wird zu der wäßrigen Lösung des Rückstands bei 5 C zugegeben, und dann wird mit Chloroform (500 ml) extrahiert. Die Chloroformschicht wird

c%	/96	H%	02	N%	91
61	,00	7,	86	7,	22
62	6,	8,

c%	,49	H%	95	N%	09
58	,30	6,	88	9,	19
58	6,	9,

mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Hexan wird zu dem Rückstand zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt und aus Äthylacetat umkristallisiert, und man erhält die Sub-

5 stanz [20] (66,21 g, Ausbeute: 87%)

Schmelzpunkts 156 - 158°C TLC: Rf₂ =0,63 Elementaranalyse .[C₃₇H₅₂O₁₀N 10

gefunden:

berechnet:

Aminosäureanalyse [1 μΜ/0,3 ml, 6 N-HCl, 105⁰C, 20 Stunden]: Ser 0,92 (1), GIy 0,97 (1), Leu 1, Lys 0,99 (1)

(21) P(64-68): BOC-GIu(OBzI)-Lys(Z-Cl)-Ser=Bzl)-Leu-Gly-OH [21]:

Methylenchlorid (300 ml) wird zur Substanz 120] (66,2 g, mM) zugegeben, TFA (250 ml) wird bei 5°C zugegeben, dann wird bei Zimmertemperatur 45 Stunden gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und in DMF (100 ml) gelöst, dann wird durch Zugabe von NMM bei 5°C neutralisiert. DMF (500 ml) wird erneut zur Bildung eines Niederschlags zugegeben. BOC-GIu(OBzI)-OSU (50 g, 113 mM) und HOBT (1,53 g, 11,3 mM) werden zugegeben, dann wird mit NMM neutrelisiert und bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt.

DMF wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in Wasser gegossen. Der so erhaltene Niederschlag wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die ümkristallisation erfolgt zweimal aus Acetonmethanol, und man erhält die Substanz [21] (63,85 g, Ausbeute: 73,5%).

Schmelzpunkt: 165 - 167°C (zers.) TLC: Rf₄ =0,72

c%	,61	H%	76	N%	31
59	,00	6,	57	8,	42
59	6,	8,

Elementaranalyse [C₄₉Hg₅O₁₄N

gefunden:

berechnet: ,

Amxnosäureanalyse [0,927 mg/0,3 ml 6 N-HCl, 105⁰C, 24 h]: Ser 0,92 (1), GIu 0,99 (1), GIy 0,97 (1), Leu 1, Lys 0,99 (1)

(22) P (62-63): BOC-Ser(BzI)-HiS-NHNH₂ [22]:

THF (150 ml), H-His-OMe·2HCl (31,5 g, 0,13 M) und HOBT (17,6 g, 0,13 M) werden zu BOC-Ser(BzI)-OH (37 g, 0,125 M) zugegeben. WSCI (23,8 ml, 0,13 M) wird zugegeben, DMF (150 ml) wird zugegeben, und es wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. HOBT (4,4 g) und WSCI (6 ml) werden erneut zugegeben, dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Die !lösungsmittel werden im Vakuum abdestilliert. Das zurückbleibende ölige Material wird in Äthylacetat gelöst und dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird konzentriert. Hexan wird zu dem Rückstand zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt und aus Äthylacetatäther-Hexan umkristallisiert, wobei man rohes BOC-Ser(BzI)-His-OMe erhält (TLC: Rf₃ = 0,56) (46,1 g) .

Das obige Produkt (44,6 g) wird in DMF (300 ml) gelöst. Hydrazinhydrat (100%) (100 ml) wird zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird achtmal mit Äthylacetat extrahiert, und der Extrakt wird mit einer geringen Menge an Wasser gewaschen und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Die Lösung wird im Vakuum konzentriert, Hexan wird zu dem Rückstand zugegeben, und der Niederschlag wird gesammelt, welcher durch Silicagelchromatographxe [Entwickler: Chloroform - Methanol - Äthylacetat (5 : 0-1 : 5)]

c%	30	H%	98	N%	,54
56,	49	6,	77	18	,82
56,	6,	18

gereinigt wird. Die entsprechenden Fraktionen werden gesammelt, im Vakuum getrocknet und aus Benzol-Hexan (geringe Menge) umkristallisiert. Nach dem Stehenlassen in einem Kühlschrank werden die ausgefallenen Kristalle zweimal aus fithylacetat-Methanol-Hexan umkristallisiert, und man erhält die Substanz [22].

Schmelzpunkt: 125 - 129°C
TLC: Ri₄ = 0_#70, Rf₇ =0,14
Elementaranalyse [C₂IH₃₀O₅Ng]:

gefunden: berechnet:

(23) P(62-68): BOC-Ser(BzI)-His-Glu(OBzI)-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI) -

Leu-Gly-OH [23]:

Eine Dioxanlösung (52 ml) von 4,32 N-HCl und Isoamylnitril (20 ml) wird zu der Substanz [22] (33,5 g), gelöst in DMF (200 ml) bei -50°C zugegeben, und bei -20⁰C 10 Minuten lang gerührt. Et₃N (31,6 ml) werden bei -50⁰C zugegeben.

Methylenchlorid (20 ml) wird zur Substanz [21] (63,85 g, mM) zugegeben. TFA (200 ml) wird bei 5 C zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 50 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert, Äther wird zu der verbleibenden öligen Substanz zugegeben, und der so gebildete Niederschlag wird gesammelt, welcher in DMF (200 ml) gelöst und. dann mit NMM. bei 5°C neutralisiert wird.

Neutralisierte DMF-Lösung wird zu der obigen_mit Triäthylamin behandelten Lösung zugegeben, und dann wird in einem Kühlschrank über Nacht und bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in Methanol gelöst. Die Lösung wird in Wasser gegossen, dann wird der gebildete Niederschlag mit Wasser gewaschen und getrocknet, ümkristallisation aus DMF-Äther

und zweimaliges Waschen mit Methanol ergibt die Substanz [23] (59,16 g, Ausbeute: 60,1%).

Schmelzpunkt: 209 - 213°C (zers.)

TLC: Rf₄ =0,66	^[C65^H83°17^N1	_OC1]:	43	H%	58	N%	,67
Elementaranalyse		C%	51	6,	38	10	,68
		59,		6,		10
gefunden:		59,
berechnet:

Aminosäureanalyse [1,549 mg/0,5 ml 6 N-HCl, 105⁰C, 21 h]: Ser 1,82 (2), GIu 1,01 (1), GIy 0,98 (1), Leu 1, Lys 1,01 (1), His 0,94 (1)

(24) P(62-84): BOC-Ser(BzI)-His-Glu(OBzI)-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-

Leu-Gly-Glu(OBzI)-Ala-Asp(OBzI)-Lys(Z-Cl) Ala-Asp(OBzI)-Val-Asp(OBzI)-Val-Leu-Thr(BzI)-LyS(Z-Cl)-AIa-LyS(Z-Cl)-SeX(BzI)-GIn-OBzI [24]:

TFA (250 ml) werden zu der Substanz [17] (75,35 g, 25,5 mM) zugegeben, und bei Zimmertemperatur wird 60 Minuten lang gerührt. TFA wird im Vakuum entfernt, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und in NMP (500 ml) und DMF (500 ml) gelöst. Das Reaktionsgemisch wird in Eis/5%iges Natriumbicarbonat gegossen, der Niederschlag wird gesammelt und mit Wasser und Methanol gewaschen. Der Niederschlag wird in NMP (1 1) und DMF (1 1) gelöst. 2,4-Dinitrophenol (5,61 g, 1,2 molarer Überschuß), HOBT (4,08 g, 1,2 molarer Überschuß), die Substanz [23] (40,16 g, 1,2 molarer Überschuß) und WSCI (5,6 ml, 1,2 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 4 Tage lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in 5%iges Natriumbicarbonat-Eis gegossen, und der Niederschlag wird gesammelt, welcher mit Wasser, heißem Methanol und zweimal mit Methanol gewaschen wird, und man erhält die Substanz [24] (93,53 g, Ausbeute: 88,4%).

AminsosäureanaXyse: Asp 2.6 7 (3^TlIr0.8 1 (1),

Ser 1.3 7 (3)>Glu 2.5 9 (3^GIy 0.7 6 (1), Ala 2.6 8 (?,) ,VaI 2, Leu 1,7 4 (2)_Λ Lys 3.66

U), His 0.6 6 (1)

(25) P(61-84): _ß Q C - GIu(OBzI )

- Scr(Bzl) - His - GIu(OBzI) Lys [Z-Gt) - Ser (BzI ) - Leu - (Hy -

GIu(OBzI) -Ala -Asp(OBzl) -Lys (Z-C-d) - AU -Asp(OBzl) -VaI -

Asp (OBzI) - VaI - Leu - Thr (BzI) Lys (Z-OO - Ala - Lys (Z -Gd) - Ser ·■

(BzI) - Gin - OBzI C25}

TFA (150 ml) wird zu der Substanz [24] (41/5 g, 10 mM) zugegeben, bei Raumtemperatur wird 60 Minuten lang gerührt, und das TFA wird entfernt. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt, welcher in-DMF (300 ml) und NMP (500 ml) gelöst wird. Die Lösung wird in 5%iges Natriumbicarbonat-Eis gegossen, der Niederschlag wird gesammelt und mit Wasser und Methanol gewaschen. DMF (700 ml) und NMP (600 ml) werden zum Auflösen zugegeben. 2,4-Dinitrophenol (2,2 g, 1,2 molarer Überschuß), BOC-GIu(OBzI)-OSU (6,08 g, 1,4 molarer Überschuß), HOBT (0,23 g, 0,14 molarer Überschuß) und NMM (1,52 ml, 1,4 molarer Überschuß) werden hinzugefügt, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. BOC-GIu(OBzI)-OSU (0,87 g, 9,2 molarer Überschuß) und NMM (0,22 ml, 0,2 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird weiter über Nacht gerührt. Das Reaktions gemisch wird in Eis/5%iges Natriumbicarbonat gegossen, der

Niederschlag wird gesammelt und mit Wasser und Methanol gewaschen. DMF (700 ml) und NMP (600 ml) werden zum Auflösen des Niederschlags zugegeben. 2,4-Dinitrophenol (2,2 g-, 1,2 molarer Überschuß), BOC-GIu(OBzI)-OSU (6,08 g, 1,4 molarer Überschuß), HOBT (0,23 g, 0,14 molarer Überschuß) und NMM (1,52 ml, 1,4 molarer Überschuß) werden hinzugegeben, und bei Zimmertemperatur wird über Nacht gerührt. BOC-GIu(OBzI)-OSU (0,87 g, 0,2 molarer Überschuß) und NMM (0,22 ml, 0,2 molarer Überschuß) werden weiter zu dem Reaktionsgemisch -JO zugegeben, und über Nacht wird gerührt. Das Rea<tionsgemisch wird in Eis/5%ige Natriumbicarbonatlösung gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, vollständig mit Wasser gewaschen und dann dreimal mit heißem Methanol gewaschen, wobei man die Substanz [25] (40,7 g, Ausbeute: 93,2%) erhält. 15

Aminosäureanalyse [6 N-HCl/Anisol, 110⁰C, 48 Stunden]:

Asp 2,66 (3), Thr 0,85 (1), Ser 1,56 (3), GIu 3,14 (4), GIy 0,71 (1), AIa 2,65 (3), VaI 2, Leu 1,73 (2), Lys 3,67 (4), His 0,63 (1) 20

(26) P(59-60): BOC-Leu-Val-OBzI [26]:

Äthylacetat (100 ml) wurde zu H-Val-OBzl*TosoH (17,8 g, mM) zugegeben, es wird mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Äthylacetat entfernt. Der Rückstand wird in DMF (100 ml) gelöst. BOC-Leu-OH·H₂O (11,7 g, 56,4 mM), HOBT (9,3 g, 1,2 molarer Überschuß) und WSCI (10,3 ml, 1,3 molarer Überschuß) werden hinzugegeben, und bei Zimmertemperatur wird über Nacht gerührt. Das DMF wird entfernt, der Rückstand wird in Äthylacetat (300 ml) gelöst und mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung, t N-HCl und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Lösung im. Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthylacetat-Hexan umkristallisiert, und man erhält die Substanz [26] (17,55 g, Ausbeute: 88,8%).

TLC: Rfr. = 0,85

(27) P(58-60): BOC-Val-Leu-Val-OBzl [27]:

TFA (50 ml) wird zu der Substanz [26] (17,2 g, 41 mM) zugegeben, und dann wird bei Z inuner temperatur gerührt und das TFA entfernt. Äther wird zu dem Rückstand gegeben, der Niederschlag wird gesammelt und in DMF (60 ml) gelöst. HOBT (7,7 g, 1/2 molarer Überschuß), BOG-VaI-OH (1,07 g, 1,2 molarer Überschuß) und WSCI (9,0 mi, 1,2 molarer Überschuß) werden zugegeben, dann wird der pH-Wert durch Zugabe von NMM auf 7 eingestellt, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird entfernt, der Rückstand wird in Äthylacetat (300 ml) gelöst und mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird zweimal aus Äthylacetat-Hexan uinkristallisiert, und man erhält die Substanz [27] (17,38 g, Ausbeute: 81,6%).

Sclunelzpunkt: 149 - 152°C

TLC: Rf₅ = 0,82	1,0, DMF)	C%	,80	H%	81	N%	20
[α]_ = -32,36 (c =	>8^Η45^Ο6^Ν3^ί:	64	,71	8,	73	8,	09
Eltonen taranaly se [C,	64		8/		8,

gefunden:
berechnet:

(28) P(57-60): BOC-Asn-Val-Leu-Val-OBzl [28]:

TFA (50 ml) wird zu der Substanz [27] (17,15 g, 33 inM) zugegeben, bei Zimmertemperatur 25 Minuten lang gerührt, und das TFA wird entfernt. Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt und in DMF (100 ml) gelöst. HOBT (0,62 g, 0,14 molarer Überschuß) und BOC-Asn-ONP (16,32 g, 1,4 molarer Überschuß) werden zugegeben, der pH-Wert wird durch Zugabe von NMM auf 7 eingestellt, und dann

wird 2 Tage lang be"i Zimmertemperatur gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt, und der Rückstand wird in 5%iges -.Natriumbicarbonat-Eis gegossen. Der Niederschlag wird in Chloroform gelöst und mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird zweimal aus Äthanoläther umkristallisiert, und man erhält die Substanz [28] (13,82 g, Ausbeute: 79,5%).

TLC: Rf₂ = 0,70
Elementaranalyse [C₃₂Hr₁OgN₅]:

gefunden: berechnet

(29) P(57-60): BOC-Asn-Val-Leu-Val-OH [29]

c%	,83	H%	1	9	N%	,09
60	,64	8,	1	1	11	,05
60	8,		11

Die Substanz [28] (13,2 g, 25 mM) wird in Äthanol (50 ml) und DMF (60 ml) gelöst. 5% Pd/C (1 g) wird zugegeben, und dann wird drei Stunden hydriert. Der Katalysator wird abfiltriert, und das Filtrat wird im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird zweimal aus Äthanol-Äther umkristallisiert/ wobei man die Substanz [29] (9,70 g, Ausbeute: 71,4%) erhält.

TLC: Rf₂ =0,56

Aminosäureanalyse: Asp 1,02 (1), VaI 1,95 (2), Leu 1

Elementaranalyse. t^C25^H45°R^N5^^:

C% H% N%

gefunden: 55,02 8,13 13,06

berechnet: 55,23 8,34 12,88

(1)

(30) P(57-84): BOC-Asn-Val-Leu-Val-Glu(OBzI)-Ser(BzI)-His-GIu(OBzI)-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-Leu-Gly-Glu(OBzI)-Ala-Asp(OBzI)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp(OBzI)-Val-Asp

(OBzI)-Val-Leu-Thr(BzI)-Lys(Z-Cl)-AIa-Lys(Z-Cl) Ser(BzI)-GIn-OBzI [30]:

TFA (150 ml) wird z-u der Substanz [25] (39,75 g, 9,1 πιΜ) zu gegeben, und bei Zimmertemperatur wird während 60 Minuten gerührt. TFA wird entfernt, und zu dem Rückstand wird Äther zugegeben, der Niederschlag wird gesammelt und in DMF (600 ml) und NMP (600 ml) gelöst. Die Lösung wird in Eis-5%ige-NatriumbicarbonatlÖsung gegossen, und der Niederschlag wird filtriert und dreimal mit Wasser und einmal mit Methanol gewaschen. NMP (1,2 1) und DMF (1,2 1) werden zum Auflösen des Niederschlags zugegeben. HOBT (1,60 g, 1,3 molarer Überschuß), 2,4-Dinitrophenol (2,18 g, 1,3 molarer Überschuß), die Substanz [29] (6,43 g, 1,3 molarer Überschuß) und WSCI (4,32 ml, 2,6 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 2 Tage gerührt. Weitere Substanz [29] (0,99 g, 0,2 molarer Überschuß), gelöst in DMF (100 ml), wird zugegeben, und bei Zimmertemperatur wird über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in 5%ige-Natriumbicarbonatlösung/Eis gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, in DMF (100 ml) suspendiert und erhitzt. Nach dem Kühlen des Gemisches werden die unlöslichen Stoffe abfiltriert. Die unlöslichen Stoffe werden mit Methanol und Äthanol unter Erhitzen gleich wie oben behandelt, wobei man die Substanz [30] erhält (42,25 g, Ausbeute: 97,2%).

Aminosäureanalyse: Asp 3,34.(4), Thr 0,93 (1), Ser 1,60 (3), GIu 3,24 (4), GIy 0,85 (1), AIa

3, VaI 3,39 (4), Leu 2,58 (3), Lys 4,24 (4), His 0,79 (1)

(31) P(56-84):
BOC- Asp(OBzI)-

Asn - VaI - Leu -VaI - GIu(OBz!)-Ser (BzI) -His ~ GIu(OBzI) - L ν s (Z-C£) - Ser (BzI)- Leu - GIy - GIu (OBzI) -Ala -ASp(OBzI)-LyS(Z-

CZ)-AIa --Asp(ÜBzl) - Va 1 - Asp(

OBzI) -VaI - Leu-Thr(Bz1)-Lys(Z- .

Cl) - Ala -Ly s (Z-OdO-Se r (BzI) -Gin 5

- OB-z 1C3 O

TEA (150 ml) wird zu der Substanz [301 (28,7 g, 6 iriM) gegeben, und dann wird bei Zinunertemperatur 50 Minuten lang gerührt. TFA wird entfernt, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und über NaOH über Nacht getrocknet» Der Niederschlag wird in DMF (300 ml) und HMP (500 ml) gelöst. HOBT (0,16 g, 0,2 molarer Überschuß) und BQC-Asp(OBzI)-OSU (5,04 g, 2 molarer Überschuß) werden zugegeben, und der pH-Wert wird durch Zugabe von NMM auf 7,0 eingestellt, und es wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. Weiteres BOG-Asp(OBzI)-OSU (2,50 g, äquimolar) wird zugegeben, und es wird über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eiswasser gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, in Wasser gewaschen, und dann wird Methanol zugegeben und unter Hitze behandelt. Nach dem Kühlen werden die unlöslichen Stoffe abfiltriert. Das obige Erhitzen wird dreimal wiederholt, wobei man die Substanz [311 (27,75 g, Ausbeute: 92,5%) erhält.

Aminosäureanalyse: Asp 4,00 (5), Thr 0,92 (1), Ser 1,69

(3), GIu 3,57 (4), GIy 0,81 (1), AIa 3, VaI 3,22 (4), Leu 2,62 (3), Lys 4,12 (4), His 0,62 (1) 30

(32)-P155-84): U OC"

Asp (OBz I)-Asη -VaI - Leu -VnI Ω 1u(OBz1 ) - Scr(Bz1) - His - G!u (Ü

BzI) - Lysfl-Ct) - Scr (BzI) - Leu _ GIy■- GIu(OBzI)- AIa - Asp(OBzI) -

Lys[Z-GL) -Ala - Asp(OBz1)-Va1-Asp (O

BzI) -VaI -Leu ~ Thr(Bz1)- Lys(Z-CX)- AIa - Lys (Z-O£.) ~ Ser (BzI) - Gin - OBzI C3lO

TFA (150 ml) wird zur Substanz [31] (27,50 g, 5,5 mM) gegeben, und bei Zimmertemperatur wird während 55 Minuten gerührt. TFA wird entfernt, Äther wird zu dem Rückstand zugegeben/ und der Niederschlag wird gesammelt und über NaOH während 2 Tagen getrocknet. Der Niederschlag wird in DMF (300 mU und NMP (500 ml) gelöst. 2,4-Dinitrophenol (1,01 g, äquimolare Menge), HOBT (0,11 g., 0,15 molarer Überschuß) und BOC-GIu(OBzI)-OSU (3,10 g, 1,3 molarer Überschuß) werden hinzugefügt, und bei Zimmertemperatur wird über Nacht gerührt. Weiteres BOC-GIu(OBzI)-OSU (3,10 g, 1,3 molarer Überschuß) wird zugegeben, und es wird 2 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eis-5%iges Natriumbicarbonat gegossen. Der Niederschlag wird zweimal mit 5%igem Natriumbicarbonat und dreimal mit Wasser gewaschen. Methanol wird zu dem Niederschlag zugegeben dann wird erhitzt, und die unlöslichen Stoffe werden nach dem Abkühlen abfiltriert. Die obige Erwärmungsbehandlung wird dreimal wiederholt, und man erhält die Substanz [32] (26,77 g, Ausbeute: 93,3%).

Aminosäureanalyse: Asp 4,11 (5), Thr 0,92 (1), Ser 1,59

(3), GIu 3,99 (5), GIy 0,83 (1), AIa 3, VaI 3,28 (4), Leu 2,49 (3), Lys 4,08 (4), His 0,71 (1)

(33) P(53-54): BOC-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-PAC [33]:

BOC-Lys(Z-Cl)-OH-TBA (36,6 g, 75 mM) wird in Äthylacetat (300 ml) suspendiert, dann wird mit Eis/1 N-HCl und Wasser gewaschen. Die Äthylacetatschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum eingedampft und in DMF (50 ml) gelöst. Phenacylbromid (19,40 g) und Et₃N (13,60 ml,

1,3 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 4 Stunden gerührt. Natriumacetat (3,68 g, 0,5 molarer Überschuß), gelöst in Äthylacetat (500 ml), wird zu dem Reaktionsgemisch gegeben, dann wird dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat, 1 N-HCl und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der Äthylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat wird im Vakuum getrocknet. Der Rückstand wird durch Silicagelsäulenchromatographie [Entwickler: Benzol - Äthylacetat (2 : 1)] gereinigt, und die Fraktionen mit Rf. = 0,77 auf TLC werden gesammelt und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Äther-Hexan umkristallisiert, und man erhält BOC-Lys(Z-Cl)-PAC (23,46 g, Ausbeute: 60,5%).

Schmelzpunkt: 52 - 54°C
TLC: Rf₁ =0,86

TFA (60-Jftl) wird zu dem obigen Produkt (20,68 g, 40 mM) gegeben, und bei Zimmertemperatur wird 20 Minuten lang gerührt. TFA wird entfernt, Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, dann wird der Niederschlag gesammelt und in DMF (50 ml) gelöst.(bezeichnet als DMF-Lösung A).

BOC-Lys(Z-Cl)-OH-TBA (23,42 g, 1,2 molarer Überschuß), suspendiert in Äthylacetat (200 ml), wird mit Eis/1 N-HCl (200 ml) und Wasser (100 ml) gewaschen. Nach dem Trocknen der Äthylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat wird im Vakuum eingedampft. Das so erhaltene ölige Material wird in DMF (50 ml) gelöst (bezeichnet als DMF-Lösung B). ^N

Die DMF-Lösung B, HOBT (6,48 g, 1,2 molarer Überschuß) und WSCI (8,78 ml, 1,2 molarer Überschuß) werden zu der DMF-Lösung A gegeben, der pH-Wert wird durch Zugabe von NMM auf 7. eingestellt, und es wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt, der Rückstand wird in Äther (500 ml) gelöst und dreimal mit 5%igem Natriumbicar-

c%	,22	N%	98	H%	81
59	,35	5,	07	6,	75
59	6,	6,

bonat gewaschen. Ät-hylacetat (300 ml) wird zu der Ätherschicht zugegeben, dann wird zweimal mit 1 N-HCl und dreimal mit Wasser gewaschen. Die organische Schicht wird über wasserfreiem Natrium getrocknet und im Vakuum konzentriert.

Der Rückstand wird dreimal aus Äther umkristallisiert, und man erhält die Substanz [33] (18,73 g, Ausbeute: 57,5%).

Schmelzpunkt: 72 - 75°C

Elomentaranalyse f^C4-i^H5o⁰i n^N4^C12-' ^: 10

gefunden: berechnet:

(34) P(53-54): BOC-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-OH [34]:

Die Substanz [33] UvO7 <3r 5 mM) wird in Essigsäure (30 ml) gelöst. Zinkpulver (20 g)/Essigsäure (30 ml) wird zugegeben, und es wird 1,5 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Das Zz-nkpulver wird entfernt, und das Filtrat wird zur Entferung der Essigsäure konzentriert. Der Rückstand wird in Äther (100 ml) gelöst und dreimal mit 5%igem Natriumbicarbonat (70 ml) extrahiert. Der pH-Wert der wäßrigen Schicht wird durch Zugabe von 1 N-HCl unter Eiskühlung auf 2 eingestellt, und dann wird mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird aus Äther-Hexan umkristallisiert, und man erhält die Substanz [34] (3,08 g, Ausbeute: 85,8%).

Schmelzpunkt: 59 - 62°C
TLC: Rf₂ =0,45
Elementaranalyse [C₃₃H₄₄O₉N₄Cl₂]:

gefunden: 35 berechnet:

C%	,58	H%	40	N%	58
55	,69	6,	23	7,	87
55	6,	7,

(35) P(53 - 84): -

BOC- Lys(Z-C/.)- , Lys(Z-C/) - GIu(OBzI) -As ρ(OBzI)-Asn-VaI - Leu -VaI - GIu(OBzI)-

Ser(Bz I) -His - Glu (OBzI) - Lys( Z-C/) - Ser (BzI) - Leu - GIy - GIu

(OBzI) -AIa -Asp(OBzI) -Lys(Z-C/) 10

-Ala -Asp (OBz I) -YaI -As ρ (OBz I)-

-VaI - Leu - ThrIBz I)- Lys(Z-C/) . - Ala - LyS(Z-C/) - Scr (BzI) - Gin -OBzI [35}

TFA (50 ml) wird zu der Substanz [32] (7,83 g, 1,5 mM) zugegeben, und bei Zimmertemperatur wird 55 Minuten gerührt. TFA wird entfernt, Äther wird zu dem Rückstand gegeben, der Niederschlag wird gesammelt und in DMF (150 ml) und NMP . (150 ml) gelöst. HOBT (0,41 g, 2,0 molarer Überschuß), Substanz [34] (2,13 g, 2,0 molarer Oberschuß) und WSCI (0,55 ml, 2,0 molarer Überschuß) werden hinzugegeben, und es wird bei 5 bis 10⁰C 3 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eiswasser gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser gewaschen und mit Methanol erhitzt. Nach dem Abkühlen werden die unlöslichen Stoffe abfiltriert. Die Wärmebehandlung wird dreimal wiederholt, und man erhält die Substanz [351 (8,31 g, Ausbeute: 95,3%).

Aminosäureanalyse: Thr 0,92 (1), Ser 1,60 (3), GIu 4,06

(5), GIy 0,85 (T), AIa 3,00 (3), VaI

3,33 (4), Leu 2,48 (3), Lys 5,41 (6),

His 0,70 (1)

(36) h-PTH [53-84] :-

a) Die Substanz'.[35] (3,49 g, 0,6 mM) und Anisol (3 ml) werden zu wasserfreiem HF (25 ml) bei 0 C zugegeben, und es wird 75 Minuten lang gerührt. Nach der Reaktion wird das HF im Vakuum entfernt, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der so gebildete Niederschlag wird gesammelt, in 0,1. N Essigsäure (50 ml) gelöst und durch eine Dowex-X1-Säule (2,7 χ 35 cm) geleitet. Das Eluat wird lyophilisiert, und man erhält das Rohprodukt (2,18 g). Dies wird in 8M Harnstofflösung (50 ml) gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf 9,5 eingestellt, und dann wird während 50 Minuten stehengelassen. Die Lösung wird auf eine Säule (4,4 χ 12 cm), die mit CM-Cellulose unter Ver-Wendung von 8M Harnstofflösung gepackt wurde, gegeben, und dann wird mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, etwa 100 ml) eluiert».: und dann erfolgt eine Elution mit linearem Gradientein mittels 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) bis " 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml), dann wird mit 0,2 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) elüiert. Das Eluat wird in je 13,5-ml-Fraktionen fraktioniert. Jede Fraktion wird gemäß dem Folin-Lowry-Verfahren (500 nm) geprüft. Die Fraktionen Nr. 30 bis 50 (Fraktion C.), die Fraktionen Nr. 56 bis 119 (Fraktion C₂) und die Fraktionen Nr. 120 bis 150 (Fraktion C₃) werden erhalten.

Jede Fraktion wird durch Durchleiten durch eine Sephadex-LH-20-Säule entsalzt. Das Eluat wird in 8,5 ml fraktioniert, ■ und die Aktivitäten werden auf gleiche Weise, wie oben beschrieben, geprüft. Die Fraktion C₁ wird durch eine Säule (3,4 χ 113 cm) geleitet, wobei man die Fraktionen Nr. 31 bis 40 (Fraktion L-), die Fraktionen Nr. 41 bis 44 (Fraktion L₂) und die Fraktionen Nr. 45 bis 54 (Fraktion L^) erhält.

Die Fraktion C₃ wird durch eine Säule (3,4 χ 120 cm) geleitet, und man erhält die Fraktionen Nr. 35 bis 45 (Fraktion

31 b Γ/38

L₁), die Fraktionen Nr. 46 bis 52 (Fraktion L₂) und die Fraktionen Nr. 53 bis 60 (Fraktion L₃).

Die Fraktion C₃ wird durch eine SSuIe (3,4 χ 120 cm) geleitet, und man erhält die Fraktionen Nr. 31 bis 44 (Fraktion L₁) und die Fraktionen Nr. 45 bis 52 (Fraktion L₃). Alle Fraktionen werden lyophilisiert, wobei man die in der folgenden Tabelle angeführten Komponenten erhält.

b) Reinigung von C₃L₃:

C₃L₃ (565 mg), gelöst in 0,1 N Essigsäure (5 ml), wird auf eine Säule (4,4 χ 70 cm) aus CM-Cellulose gegeben, und mittels einer linearen Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetatlösung (pH 4,5, 500 ml) bis 0,1 M Ammoniuinacetatlösung (pH 4,5, 500 ml) wird eluiert. Das Eluat wird in je 6,0-ml-Fraktionen fraktioniert, und jede Fraktion wird gemäß dem Folin-Lowry-Verfahren geprüft, wobei man die Fraktionen Nr. 113 bis 136 (Fraktion C₂L₃-C₁), die Fraktionen Nr.137 bis 151 (Fraktion C₃L₂-C₂) und die Fraktionen Nr. 152 bis 190 (Fraktion C₃L₃-C₃) erhält.

Alle Fraktionen werden durch Sephadex LH-20 zum Entsalzen geleitet. Die Eluate werden in je 5,2-ml-Fraktionen fraktioniert, und jede Fraktion wird gemäß dem gleichen Verfahren wie oben geprüft. Die Fraktion C₃L₃-C- wird durch eine Säule (3,4 χ 3.20 cm) geleitet, wobei man die Fraktionen Nr. 55 bis 72 (Fraktion C₂L₃-C₁L₁) und die Fraktionen Nr. 73 bis 80 (Fraktion C₃L₃-C₁L₃) erhält. Die Fraktion C₃L₃-C₃ wird, durch eine Säule (3,4 χ 110 cm), wobei man die Fraktionen Nr. 50 bis 59 ..(Fraktion C₃L₃-C₂L₁) und die Fraktionen Nr. 60 bis 67 (Fraktion C₃L₃-C₃L₃) erhält. Die Fraktion C₃L₃-C₃ wird durch eine Säule (3,4 χ 110 cm) geleitet, wobei man die Fraktionen Nr. 45 bis 60 (Fraktion C₃L₃-C₃L₁) und die Fraktionen Nr. 61 bis 72 (Fraktion C₃L₃-C₃L₃) erhält. Jede Fraktion wird lyophilisiert, wobei man die folgenden Komponenten erhält.

C₂L₂ -C, L, 1 O 8 . 7 π? ·

C₂ L₂ -C₁ L₂ 9 5.9"?

C₂ L₂ -C₂ L₁ 5 3 . 6W

C₂L₂-C₂L₂ 44.1WjI

C₂ L₂ -C₃ L₁ 9 7 .on?

C₂ L₂ -C₃ L₂ 9 5.li?

c) Reinigung von C₂L₂-C₁-L₁:

Die obLge Fraktion C₂L₂-C..L.. werden in 0,1 N Essigsäure gelöst und auf eine Säule (2,0 χ 15 cm) aus CM-Cellulose gegeben, und dann wird gemäß der linearen Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) bis 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) eluiert. Die Eluate werden in je 7,4-ml-Fraktionen fraktioniert, und jede Fraktion wird gemäß dem Folin-Lowry-Verfahren (500 mn) geprüft, wobei man die Fraktionen Nr. 46 bis 56 (Fraktion C₂L₂-C₁L₁-C) erhält. Diese Fraktion wird im Vakuum konzentriert und auf eine Säule (3,0 χ 90 cm) aus Sephadex LH-20 gegeben und mit 0,1 N Essigsäure eluiert. Das Eluat wird in je 6,0-ml-Fraktionen fraktioniert. Die Fraktion wird nach dem gleichen Verfahrer., wie oben beschrieben, geprüft, wobei man die Fraktioner Nr. 25 bis 35 (Fraktion C₂L₂-C₁L₁-CL) erhält, welche lyophilisiert wird, wobei man h-PTH [53-84] (90,0 mg) erhält.

TLC: Bf₉ = 0,76 (ein Fleck)

Aminosäureanalyse: Asp 4,45 (5), Thr 0,92 (1), Ser 2,16

(3), GIu 4,94 (5) ,.GIy 0,96 (1), AIa 3, VaI 3,96 (4), Leu 2,92 (3), Lys 6,22 (6), His 1,01 (1)

31

51738

	a S	(C	(E	cc	00	cc	(C	ro	in
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3

Be "i spiel 2.

h - P T H ( 5 1 - 8 4 ) ;H- Pro - Arg Ly s — Ly s —(JIu — Asp — As η — VaI — Leu — VnI

- Ol u -Se r - His - GIu - Lys - Scr - Leu - (J Iy — G1u — Al a — As ρ -Ly s — A1 a — Asp — Va I

— Asp — Va 1 — Leu — Thr — Lys — AIa — Lys — Ser - GIn - 0 H

(1) P(51-84): BOC-Pro-Arg(Tos)-Lys (Z-Cl) -Lys (Z-Cl) -GIu (QBzI)-Asp(OBzI)-Asn-Val-Leu-Val-Glu(OBzI)-Ser(BzI) -

His-Glu(OBzI)-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-Leu-Gly-Glu (OBzI)-Ala-Asp(OBzI)-Lys(Z-Cl)-Ala-Asp-(OBzI) Val-Asp(OBzl)-Val-Leu-Thr(BzI)-Lys(Z-Cl)-AIa-Lys(Z-Cl)-Ser(BzI)-GIn-OBz1 [39] 20

TFA (50 ml) wird zu der Substanz [32] (7,82 g, 1,5 mM), erhalten gemäß Beispiel 1, gegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 60 Minuten gerührt. TFA wird entfernt, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und in DMF (120 ml) und NMP (120 ml) gelöst. HOBT (0,30. g, 1,5 molarer Überschuß), Substanz [38] (2,52 g, 1,5 molarer Überschuß) der Formel BOC-Pro-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)-OH und WSCI (0,41 ml, 1,5 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 2 Tage lang gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eiswasser gegossen. Der so gebildete Niederschlag wird mit Wasser gewaschen, und Methanol wird zu dem Niederschlag zugegeben, welcher dann unter Erhitzen behandelt wird. Nach dem Abkühlen werden die unlöslichen Stoffe gesammelt. Der obige Erwärmungsvorgang wird zweimal wiederholt, und dann wird mit Äther gewaschen, wobei man die Substanz [39J (8,20 g, Ausbeute 87,9%) erhält.

Aminosäureanalyse: Asp 4,09 (5), Thr 1,05 (1), Ser 2,30

GIu 4,08 (5), Pro 0,52 (1), GIy 0,83

(1), Ala 3, VaI 3,42 (4), Leu 2,53 (3),

Lys 5,11 (6), His 0,69 (D/ Arg 0,51 (1)

(2) h-PTH [51-84]:

Die Substanz 139] {3,73 g, 0,6 mM) und Anisol (4 ml) werden zu HF (40 ml) bei 0⁰C zugegeben, und es wird 60 Minuten gerührt. HF wird im Vakuum abdestilliert, und Äther wird zu •dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und durch eine Säule aus Dowex X1 (Acetatform, 2,7 χ 33 cm) nachdem Auflösen in Essigsäure (50 ml) geleitet. Das Eluat wird lyophilisiert, wobei man das Rohprodukt (2,41 g) erhält.

Dies wird in 8 M Harnstofflösung (50 ml) gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf 10,0 eingestellt, und dann wird 30 Minuten stehen gelassen. Die Lösung wird auf eine Säule (4,2 χ 11,5 cm) aus CM-Cellulose gegeben, die mit 8 M Harnstofflösung gepackt ist, dann wird der Harnstoff durch Zugabe von 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5) entfernt, dann wird mit einer linearen Graiientenelution von 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) bis 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) eluiert, und dann wird mit 0,2 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 250 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 8,5-ml-Fraktionen fraktioniert, und jede Fraktion wird gemäß dem Folin-Lowry-Verfahren (500 nm) geprüft, und man erhält die Fraktionen Nr. 30 bis 63 (Fraktion C^), die Fraktionen Nr. 105 bis 150 (Fraktion C₂) und die Fraktionen Nr. 1.51 bis 195 (Fraktion C₃). Die Fraktionen C₃ und C₃ werden zum Entsalzen durch Sephadex LH-20 geleitet. Das Eluat wird in je 5,2-ml-Fraktionen fraktioniert. Die Fraktion C₂ wird durch eine Säule (3,4 χ 110 cm) geleitet, und man erhält die Fraktionen Nr. 51 bis 63 (Fraktion C₃L.) und die Fraktionen Nr. 64 bis 80 (Fraktion C₃L₂). Die Fraktion C₃ wird durch eine Säule (3,4 χ 120 cm) geleitet, und man erhält die Fraktionen Nr. 50 bis 69 (Fraktion C₃L₁) und die

Fraktionen Nr. 70 bis 78 (Fraktion C₃L₃). Alle Fraktionen werden lyophilisiert, wobei man die in der folgenden Tabelle aufgeführten Komponenten erhält.

	Komponente	Aus beu te (mg)	Aminosaureanalyse	ASp (5)	Thr (D	Ser (3)	GlU (5)	GIy (D	AIa (3)	VaI (4)	Leu (3)	Lys (6)	His (D	Arg (D	Pro (D
10	Frak tionen	100	4,38	1,07	2,18	4,28	0,84	3	3,65	2,65	5,23	0,69	0,56	0,59
	^C2^L1	378	4,78	0,95	2,30	5,02	0,99	3	3,95	2,96	5,97	0,89	0,96	0,99
	^C2^L2	C₃L₁ ' 196	4,45	1,06	2,24	4,52	0,94	3	3,75	3,01	5,63	0,77	0,71	0,76
15		4,70	0,93	2,31	4,92	1,03	3	3,89	2,94	6,05	0,93	0,99	1,00
	458

Die obige Fraktion C₃L₃ (375 mg) wird in 0,1 N Essigsäure (4 ml) gelöst und auf eine Säule (2,0 χ 31 cm) von CM-Cellulose gegeben und mittels der linearen Gradientenelution von 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) bis 0,2 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) eluiert. Die Eluäte werden in je 7,5-ml-Fraktionen fraktioniert, und die Fraktionen Nr. 85 bis·103 (Fraktion C₃L₃-C) werden erhalten. Diese wird durch eine iiäule aus Sephadex LH-20 (3,0 χ 123 cm) zum Entsalzen geleü-et. Das Eluat wird in je 6-ml-Fraktionen fraktioniert, und man erhält die Fraktionen Nr. 34 bis 42 (Fraktion C₃L₃-CL₁) und die Fraktionen Nr. 43 bis 50 (Fraktion C₃L₃-CL₃) erhält. Die Fraktionen werden lyophilisiert, wobei man die folgenden Fraktionen erhält.

C₃L₃-CL₁: 80,0 mg
"Aminosaureanalyse: Asp 4,95 (5), Thr 0,98 (1), Ser 2,47

(3), GIu 5,14 (5), GIy 1,01 (1), AIa (3), VaI 4,05 (4), Leu 3,02 (3), Lys 6,16 (6), His 0,96 (1), Arg 0,97 (1), Pro 1,06 (1)

₂₂₂: 197,6 -mg
Aminosäureanalyse: Asp 5,00 (5), Thr 0,93 (1), Ser 2,30

(3), GIu 5,17 (5), GIy 1,01 (1), Ala 3 (3), VaI 4,03 (4), Leu 3,00 (3), Lys 6,15 (6), His 0,95 (1), Arg 1,01

(1), Pro 1,04 (1)

Die Fraktion C₂L₂-CL₂ (195 mg) wird in 0,1 N Essigsäure (2 ml) gelöst und auf eine Säule (2,0 χ 15 cm) aus CM-Cellulose gegeben und durch lineare Gradientenelution mittels 0,01 M Aitunoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) bis 0,2 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 6,4-ml-Fraktionen fraktioniert, wobei man die Fraktionen Nr. 55 bis (Fraktion C₂L₂-CL₃-C₁) und die Fraktionen Nr. 66 bis 72 (Fraktion C₂L₂-CL₂-C₂) erhält. Alle Fraktionen werden durch Sephadex LH-20 zum Entsalzen geleitet. Die Fraktion C₃L₃-CL₂-C₁ wird durch eine Säule (3,0 χ 123 cm) geleitet, und das Eluat wird in je 7,4-ml-Fraktionen fraktioniert, wobei man die Fraktionen Nr. 31 bis 38 (Fraktion C₂L₂-CL₃-C₁L₁) und die Fraktionen Nr. 39 bis 43 (Fraktion C₃L₃-CL₂-C₁L₂) erhält. Die Fraktion C₃L₃-CL₃-C₁L₁ wird lyophilisiert, und man erhält h-PTH [53-84] (77,2 mg).

TLC: Rf₁₀ = 0,89 (ein Fleck)
25

Beispiel 3

h-PTH 146 - 84]: H-Ala-Gly-

Ser — Gin — Arg — Pro —Arg — Lys - Lys GIu - Asp - As η - \^ra 1 - Leu - Ya 1 - GIu - Ser - His - GIu - Lys - Ser - Leu - Oly — Gl u — AIa — Asp — Lys - AIa - Asp - VaI

· - Asp - Va1 - Leu - Thr - Lys - Ala - Lys - Ser - Gin - O H

(D
P (4 6-84); BOG- AIa-Ql y -

Ser(BzI) - Gin - Arg(Tos) - Pro - Arg (Tos) - Lys(Z-Oe) - Lys(Z-CZ) - GIu(O BzI) - As ρ (OBzI) - Asn -VaI - Leu VaI - Gl u (OBz 1) - Se r (BzI) -llis GIu(OBzI) -Ly s (Z-C-O - Scr (BzI) -15 Leu -GLy -GIu(OBzI; -Ala -Asp (OB₂I

- Lys(Z-C£) - Ala -Asp(OBzI) - VaI Asp(OBzl) - VaI - Leu - Thr(BzI) -

Lys (Z-CZ) -AIa - Lys (Z-C^) - Scr (UzU

- GIn - OBzI C46D

TFA (80 ml) wird zu der Substanz [32] in Beispiel 1 (10,44 g, 2 mM) gegeben/ und bei Zimmertemperatur wird 60 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum entfernt, und Äther wird zu dem Rückstand unter Bildung eines Präzipitats zugegeben, welches in DMF (160 ml) und NMP (160 ml) gelöst wird. Die Substanz [45] (4,28 g, 1,15 molarer Überschuß) der Formel BOC-AIa-Gly-Ser(BzI)-Gin-Arg(Tos)-Pro-Arg(Tos)-Lys(Z-Cl)-Lys(Z-Cl)- OH, HOBT (0,32 g, 1,2 molarer Überschuß) und WSCI (0,44 ml, 1,2 molarer Überschuß) werden zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 2 Tagen gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt. Eiswasser wird zu dem Rückstand zugegeben, und dann wird der Niederschlag filtriert, welcher nach der Zugabe von Methanol (200 ml) erhitzt wird. Nach dem Kühlen werden die unlöslichen Stoffe gesammelt. Dieser Vorgang wird

zweimal wiederholt,'wobei man die Substanz [46] (12,17 g, Ausbeute; 87,4 %) erhält.

(2) h-PTH [46-84]:

Die Substanz [46] (4,18 g, 0,6 inM und Anisol (10 ml) werden in HF (60 ml) bei 0⁰C zugegeben, und während 60 Minuten wird gerührt. Nach der Reaktion wird HP im Vakuum abdestilliert, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt/ in 10%iger Essigsäure (50 ml) gelöst, und dann wird er durch eine Säule von Dowex X1 (Acetatform, 2,5 χ 24 cm) geleitet. Das Eluat wird lyophilisiert, wobei man das Rohprodukt (2,82 g) erhält, welches in 8 M Harnstofflösung (pH 9,0, 50 ml) gelöst wird und bei Zimmertemperatur während 60 Minuten stehen gelassen wird. Die Lösung wird auf eine Säule (2,0 χ 33 cm) von CM-Cellulose gegeben, die mit 8 M Harnstofflösung gepackt ist, und dann wird gemäß der linearen Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) bis 0,3 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 7,5-ml-Fraktionen fraktioniert, welche gemäß dem Folin-Lowry-Verfahren (500 nm) geprüft werden, wobei man die Fraktionen Nr. 1 bis 22 (Fraktion C₁), die Fraktionen Nr. 23 bis 45 (Fraktion C₂), die Fraktionen Nr. 46 bis 80 (Fraktion C₃) und die Fraktionen Nr. 81 bis 120 (Fraktion C₄) erhält. Alle Fraktionen werden durch eine Säule aus Sephadex LH-20 zum Entsalzen geleitet. Die Fraktion C₁ wird durch eine Säule (3,0 χ 120 cm) geleitet, wobei man je 7,5-ml-Fraktionen entnimmt und die Fraktionen Nr. 28 bis 42 (Fraktion C₁L) erhält. Die Fraktion C₂ wird durch eine Säule ( 3,4 χ 120 cm) geleitet, wobei man je 7,6-ml-Fraktionen entnimmt und die Fraktionen Nr. 33 bis 40 (Fraktion C₃L₁) und Nr. 41 bis 62 (Fraktion C₃L₂) erhält. Die Fraktion C₃ wird durch eine Säule (3,0 χ 120 cm) geleitet, je 6,0-ml-Fraktionen werden entnommen, und man erhält die Fraktionen Nr. 31 bis 40 (Fraktion C₃L₁) und Nr. bis 51 (Fraktion C₃L₂) erhält. Die Fraktion C₄ wird durch eine Säule (3,4 χ 120 cm) geleitet, und es werden je 7,5-ml-

Fraktionen entnommen/ wobei man die Fraktionen Nr. 35 bis 48 (Fraktion C₄L) erhält. Jeder Teil wird lyophilisiert, und man erhält die Fraktionen C.L (312 mg), C₃L₁ (142,3 mg), C₃L₂ (1380 mg), C₃L₁ (104 mg), C₃L₃ (510 mg) und C₄L (130 mg) .

Die obige Fraktion C₃L₃ (1380 mg) wird in 0,1 N Essigsäure (13 ml) gelöst und auf eine Säule (4,3 χ 6,0 cm) von CM-Cellulose gegeben und gemäß der linearen Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) bis 0,3 M Ammoniumacetat ( pH 4,5, 500 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 7,6-ml-Fraktionen fraktioniert, wobei man die Fraktionen Nr. 40 bis 50 (Fraktion C₂L₃-C₁) und Nr. 53 bis 77 (Fraktion C₂L₃-C₃) erhält. Jede Fraktion wird durch Sephadex LH-20 zum Entsalzen geleitet. Die Fraktion C₃L₃-C₁ wird auf eine Säule (2,9 χ 120 cm) gegeben, und das Eluat wird in je 8,0-ml-Fraktionen fraktioniert, wobei man die Fraktionen Nr. 26 bis 30 (Fraktion C₃L₃-C₁L₁) und Nr. 31 bis 39 (Fraktion C₃L₃-C₁L₃) erhält. Die Fraktion C₃L₃-C₃ wird durch eine Säule (3,4 χ 120 cm) geleitet, und es werden je 8-ml-Fraktionen entnommen, wobei man die Fraktionen Nr. 34 bis 44 (Fraktion C₂L₃-C₃L₁) und Nr. 45 bis 53 (Fraktion C₃L₃-C₂L₂) erhält. Alle Fraktionen werden lyophilisiert, und man erhält die Fraktionen C₃L₃-C₁L₁ (79,0 mg), C₃L₃-C₁L₃ (455 mg), C₃L₃-C₃L₁ (157,3 mg) und C₂L₃-C₃L₂ (551,7 mg).

Aminosäureanalyse der Fraktion C₂L₂-C₂L₃: Asp 4,65 (5),

Thr 0,97 (1), Ser 3,47 (4), GIu 5,99 (6), Pro 0,93 (1), GIy 1,96 (2), AIa 4 (4), VaI 3,97 (4), Leu 3,01 (3), Lys

6,13 (6),-His 0,93 (1), Arg 1,96 (2)

Die Fraktion ^C2^L2~^C2^Ii2 ^{wird in} °'^ ^N Essigsäure (5 ml) gelöst und. auf eine Säule (4,2 χ 7,0 cm) aus CM-Cellulose gegeben und gemäß der linearen Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 300 ml) bis 0,3 M Ammoniumacetat

(pH 4,5, 300 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 8,0-ml-Fraktionen fraktioniert, wobei man die Fraktionen Nr. 39 bis (Fraktion C₂L₂-C₂L₂-C) erhält, welche durch eine Säule (2,9 χ 120 cm) von Sephadex LH-20 zum Entsalzen geleitet wird. Das Eluat wird in je 8-ml-Fraktionen fraktioniert, und man erhält die Fraktionen Nr. 24 bis 30 (Fraktion C₂L₂-C₂L₃-CL₁), die Fraktionen Nr. 31 bis 35 (Fraktion C₂L_2-C₃L₂-CL₂) und die Fraktionen Nr. 36 bis 39 (Fraktion C₂L₂-C₂L₂-CL₃). Jede Fraktion wird iyophilisiert, und man erhält die Fraktionen C₂L₂-C₂L₂-CL₂ (200mg) und C₂L₂-C₂L₃-CL₁ (h-PTH [46-84], 94,9 mg) .

TLC: Rf₉ = 0,76

Aminosäureanalyse: Asp 4,86 (5), Thr 0,99 (1), Ser 3,58 (4), GIu 6,17 (6)/ Pro 0,96 (1), GIy

1,97 (2), AIa 4 (4), VaI 4,02 (4), Leu 2,93 (3), Lys 6,05 (6), His 0,90 (1), Arg 1,87 (2)

Beispiel 4

C Ty r"}. h - P T H ( 4 5 - 8 4 ) ; H - Tyr - AIa-GIy - Ser - Gin - Arg - Pro - Arg

- Lys - Lys — GIu — Asp - As η - Va I — Leu

- VaI - GIu - Scr - His - GIu - Lys - Set - Leu - GIy - GIu - AIa - Asp - Lys - AU

- Asp - Vai- Asp - VaI - Leu - Thr - Lys

- AIa - Lys - Ser - Gin - O H

( 1 ) P ( 4 5 - 8 4 ) ; ß O C - Tyr (BzI- Ci-J - AIa - GIy - Ser (Bz I) - Gin - Arg (Tos)

- Pro - Arg (Tos) - Lys (Z-Od) - Lys (Z-Ci)

-GIu(OBzI)-ASp(OBzI)-ASn -VnI -Uu'

-VaI-GIu(OBzI) -Scr (Bz I) -His -QIu " (OBzI) - Lys(Z-CZ) - Scr(BzI)- Leu -

GIy - GIu (OBzI) - AIa — Asp (OBz I) - Lys (Z-CZ) -Ala -Asp (OBzI) - Va 1 -Asp (OBzI) -VaI -Leu -Thr(Bzl) -Lys(Z-OZ)-

AIa- Lys(Z-CZ) - Ser (BzI ) - Gin - OBzI C47}

TFA (60 mi) wird zu der Substanz [46] (6,27 g, 0,9 mM) in Beispiel 3 zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 60 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum entfernt, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird filtriert, und man erhält die de-BOC-Verbindung (6,30 g)

Die obige de-BOC-Verbindung (2,10 g, 0,3 mM) wird in DMF (35 ml) und NMP (35 ml) gelöst. BOC-Tyr(BzI-Cl₂)-OH (0,16 g, 1,2 molarer Überschuß), HOBT (0,05 g, 1,2 molarer überschuß) und WSCI (0,07 ml, 1,2 molarer Überschuß) werden bei 0⁰C zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird entfernt, und Eiswasser wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird filtriert, und man erhält die Substanz [47] (2,00 g).

(2) [Tyr⁴⁵]-h-PTH [45-84]:

Die Substanz 147] (2,00 g, 0,27 mM) und Anisol (1,0 ml) werden zu HF (20 mi,) bei 0⁰C gegeben, und dann wird 60 Minuten lang gerührt. HF wird im Vakuum abdestilliert, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der so gebildete Nieder-

schlag wird gesammelt, in 0,1 N Essigsäure (20 ml) gelöst und auf eine Säule aus Dowex X1 (Acetatform, 2,5 χ 15 cm) gegeben. Das Eluat wird lyophilisiert, und man erhält das Rohprodukt (1,37g).

Das Rohprodukt wird in 8 M Harnstofflösung (pH 9,5, 50 ml) gelöst und bei Zimmertemperatur während 60 Minuten stehen gelassen. Die Lösung wird auf eine Säule (4,3 χ 8,0 cm) von CM-Cellulose, die mit 8 M Harnstofflösung gepackt ist, gegeben, und dann wird mittels linearer Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 400 ml) bis 0,3 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 400 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 6,5-ml-Fraktionen fraktioniert. Alle Fraktionen werden gemäß dem Foiin-Lowry-Verfahren (500 nm) geprüft, wobei man die Fraktionen Nr. 30 bis 43 (Fraktion C₁), die Fraktionen Nr. 51 bis 68 (Fraktion C₃), die Fraktionen Nr. 69 bis 83 (Fraktion C₃) und die Fraktionen Nr. 84 bis 100 (Fraktion C₄) erhält. Alle Fraktionen werden zum^Entsalzen durch Sephadex LH-20 geleitet. Die Fraktion C₁ wird auf eine Säule (3,4 χ 120 cm) gegeben, wobei je 7,5-ml-Fraktionen entnommen werden, und man erhält die Fraktionen Nr. 25 bis 41 (Fraktion C₁L). Die Fraktion C₂ wird auf eine Säule (3,0 χ 120 cm) gegeben, wobei je 7,5-ml-Fraktionen entnommen werden, und man erhält die Fraktionen Nr. 25 bis 36 (Fraktion C₂D. Die Fraktion C₃ wird auf eine Säule (2,9 χ 120 cm) gegeben, wobei je 8,0-ml-Fraktionen entnommen werden, und man erhält die Fraktionen Nr. 24 bis 27 (Fraktion C₃L₁) und Nr. 28 bis 38 (Fraktion C₃L₂). Die Fraktion C₄ wird auf eine Säule (2,9 χ 95 cm) gegeben, wobei je 7,6-ml-Fraktionen entnommen werden, und man erhält die Fraktionen Nr. 20 bis 25 (Fraktion C₄L₁) und Nr. 26 bis 30 ,(Fraktion C₄L₃). Alle Fraktionen werden lyophilisiert, und man erhält die Fraktionen C₁L (521,6 mg), C₂L (230,2 mg), C₃L₁ (41,8 mg), C₃L₃ (222,4 mg), C₄L₁ (74,3 mg) und C₄L₂ (48,9 mg).

Die obige Fraktion C₃L wird in 0,1 N Essigsäure (3 ml) gelöst und auf eine Säule (2,1 χ 25 cm) aus CM-Cellulose ge-

geben und gemäß linearer Gradientenelution mittels 0,01 M Ammoniumacetatlösung (pH 4,5, 300 ml) bis 0,3 M Ammoniumacetat (4,5, 300 ml) eluiert. Die Eluate werden in je'8,0-ml-Fraktionen fraktioniert, wobei man die Fraktionen Nr.

bsi 36 (Fraktion C₂L-C) erhält, welche durch eine Säule (2,9 χ 90 cm) aus Sephadex LH-20 zum Entsalzen gegeben wird. Das Eluat wird in je 8,0-ml-Fraktionen fraktioniert, und die Fraktionen Nr. 20 bis 29 werden lyophilisiert, wobei man

-[Tyr⁴⁵]-h-PHT [46-84] (163,3 mg) erhält.

TLC: Rf₉ = 0,75

Aminosäureanalyse: Asp 4,86 (5), Thr 1,02 (1), Ser 3,51

(4), GIu 6,05 (6), Pro 0,93 (1), GIy 1,90 (2), AIa 4 (4), VaI 4,00 (4), Leu 2,93 (3), Tyr 0,88 (1), Lys 6,02 (6),

His 0,86 (1), Arg 1,81 (2)

Beispiel
20

Γ Cys(Acm)*⁵^ - h - P T H ( 4 5 -84); II - Cys(Acm) - AIa - GIy - Ser - GIn -Arg

- Pro — Arg — Lys — Lys — GIu — Asp — As η

- VaI - Leu -VaI - GIu - Scr - His - GIu

- Lys - Ser - Leu - GIy - G1 u - Ala -Asp 30

- Lys - Al a - Asp -VaI - Asp -VaI - Leu

- Thr - Lys - AIa - Lys -Scr - Gin - O il (I)P (4 5-84 ) ; B O C - Cys(Acm) -

- Ab - GIy - Scr (BzI) -Gin - Arg(Tos)

-Pro - Arg(Tos) - Lys(Z-Od) - Lys(Z-Od)-

GIu(OBzI) - Asp(OBzI) - Asn - YaI - Leu -

VaI - GIu(OBzI) - Scr (BzI) - His - GIu(O 5

BzI) - Ly s-(Z-CZ) -Se r (Bz I) - Leu -G I y -

Gl.u (OBzI) - AIa - Asp (OBzI) - Lys (Z-Od) AIa-A&p(OBzI) -VaI- Asp(OBz I) -VaI-Leu - Thr (Bz I) - Lys <Z-Od) - AIa - Lys (Z- ', - Se r (BzI) - Gin - OBzI C 48 3

Die verbleibende de-BOC-Verbindung (4,20 mg, 0,6 mM) von Beispiel 4 wird in einem Gemisch aus DMF (70 ml) und NMP (70 ml) gelöst. HOBT (0,10 g, 1,2 molarer Überschuß), BOC-Cys(Acm)-0H (0,20 g, 1,2 molarer Überschuß) und WSCI (0,13 ml, 1,2 molarer Überschuß) werden bei 0⁰C zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum abdestilliert, Eis-Wasser wird zu dem Rückstand zugegeben, und der Niederschlag wird gesammelt. Der Niederschlag wird in Äthanol suspendiert, erhitzt, anschließend abgekühlt, und das unlösliche Material wird abfiltriert. Dieser Vorgang wird zweimal wiederholt, wobei man die Substanz [481.(4,07 g, Ausbeute: 95,0%) erhält.

(2) tCys(Acm)⁴⁵]. h-PTH [45-84]:

Die Substanz [481 (4,00 g, 0,57 mM) und Anisol (10 ml) werden bei 0⁰C zu wasserfreiem HF (60 ml) zugegeben, und dann wird 60 Minuten lang gerührt. HF wird im Vakuum abdestil- ?.iert, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird in 20%iger Essigsäure (40 ml) gelöst und durch eine Säule aus Dowex X1 (Acetatform, 2,8 χ 35 cm) gegeben. Das lyophilisierte Eluat wird in 8 M Harnstofflösung

gelöst, dann wird der pH-Wert durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf 9,0 eingestellt, und dann wird 30 Minuten stehen gelassen. Die Lösung wird auf eine Säule (3,4 χ 35 cm) aus CM-Cellulose, die mit 8 M Hanrstofflösung gepackt ist, gegeben, und dann wird mittels linearer Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) bis 0,3 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 8-ml-Fraktionen fraktioniert, und dann wird gemäß dem Folin-Lowry-Verfahren (500 nm) geprüft, wobei man die Fraktionen Nr. 25 bis 35 (Fraktion C₁), die Fraktionen Nr. 36 bis 45 (Fraktion C₂) und die Fraktionen Nr. 46 bis 84 (Fraktion C₃) erhält. Alle Fraktionen werden durch Sephadex LH-20 zum Entsalzen geleitet. Die Fraktion C₂ wird durch eine Säule (3,0 χ 120 cm), geleitet, und dann werden je 8,0-ml-Fraktionen entnommen, wobei man die Fraktionen Nr. 27 bis 33 (Fraktion C₂L₁) und Nr. 34 bis 40 (Fraktion C₃L₃) erhält. Die Fraktion C₃ wird durch eine Säule (3,4 χ 120 cm) geleitet, und es werden je 8,0—ml-Fraktionen entnommen, wobei man die Fraktionen Nr. 35 bis 47 (Fraktion C₃L₁) und Nr. 48 bis 53 (Fraktion C₃L₃) erhält. Alle Fraktionen werden lyophilisiert, und man erhält die Fraktionen C₃L₁ (148 mg), C₃L₃ (620 mg), C₃L₁ (212 mg) und C₃L₃ (605 mg).

Die obige Fraktion C₃L₃ wird in 0,1 N Essigsäure (6 ml) gelöst und auf eine Säule (5,0 χ 12 cm) von CM-Cellulose gegeben, und dann wird gemäß der linearen Gradientenelution mit 0,01 M Ammoniumacetat (pH 3,5, 400 ml) bis 0,3 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 400 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 6,0-ml-Fraktionen fraktioniert, wobei man die Fraktionen Nr. 110 bis 126 (Fraktion C₃L₃-C) erhält, die durch eine Säule (4,0 χ 120 cm) aus Sephadex LH-20 zum Entsalzen gegeben wird. Das Eluat wird in je 8,0-ml-Fraktionen fraktioniert. Die Fraktionen Nr. 38 bis 54 (Fraktion C₀L₀-CL) wer-

4S den lyophilisiert, und man erhält [Cys(Aera) ] h-PTH [45-84] (246,8 mg).

TLC: Rf₉ = 0,74 -

Aminosäureanalyse: Asp 4,91 (5), Thr 0,98 (1), Ser 3,50

(4), GIu 6,11 (6), Pro 0,98 (1), GIy 1,98 (2), AIa 4 (4), VaI 4,04 (4), Cys 0,42 (0,5), Leu 2,90 (3), Lys 5,99 (6), His 0,87 (1), Arg 1,87 (2)

Beispiel 6
10

C Cys⁴⁵^ - h - P T H ( 4 5 - 8 4 ); H - Cys

- AIa - GIy - Ser - GIn - Arg - Pro - Arg - Lys - Lys - Glu - Asp'- Asn -VaI - Leu

- Va 1 - G1 u - Ser -His -Glu - Ly s - Se r-Leu -GIy -Glu -AIa - ASp - Lys - AIa -

Asp - VaI - Asp - \^ra 1 - Leu - Thr - Ly s -

Al a - Ly s -Ser - G1 η -OH

[CysXAcm)⁴⁵] h-PTH [45-84] (88 mg, 0,02 inM) , erhalten in Beispiel 5, wird in 50%iger Essigsäure (2 ml) gelöst. Quecksilber-(II)-Acetat (52,24 mg, 0,18 mM) wird zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur während 70 Minuten gerührt. Weiteres ß-Mercaptoäthanol (3,4 ml) wird zugegeben, und es wird 24 Stunden bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird zentrifugiert, und die überstehende Lösung wird auf eine Säule (3,2 χ 42 cm) aus Sephadex LH-20 gegeben, dann wird mit 0,1 M Essigsäure eluiert. Das Eluat wird in je 5-ml-Fraktionen fraktioniert, und dann werden

und lyophilisiert, und man erhält'[Cys⁴⁵] h-PTH [45-84]

die ninhydrin-positiven Fraktionen Nr. 9 bis 14 gesammelt und lyophi
(76,1 mg).

TLC: Rf_g =0,73

Beis-piel7

⁵²D h - P T H (52-84) ; H - Tyr Lye — Lys — Glu —'Asp -* As η — VaI

~ Leu — VaI — Glu - Ser — His —

Glu — Lys — Ser — Leu — Gly — Glu — Aia — Asp — Lys — Ala — Asp — VaI

— Asp — VaI — Leu — Thr — Lys — Ala

— Lys — Ser — Gin — OH 15

ti) P (52 -84) ; BOG -Tyr (Bsi -

^: Lys (Z-C£) -Lys (Z-CX) -Glu(OBzi)

— Asp (OBzI) — Asn — VaI — Leu —

Val — Glu (OBzI) — Ser (BzI ) — His ·

- Glu (O BzI ) — Lys (Z — C£)' — Ser

(BzI) — Leu — Gly — Glu (OBzI) — AIa — Asp (OBzI) — Lys (Z — O0-) --- Ala" — Asp (O Bzl ) -VaI ■— Asp (O BzI ) - VaI - Leu - Thr (Bsi) - Lys (Z-C^) AIa — Lys (Z-GI) "— Ser (Bzl) -Gin -OBzI [49]

TFA (50 ml) wird, zu der Substanz [35} (5,82 g, 1,0 mM) , die gemäß Beispiel 1 erhalten wurde, zugegeben, und dann wird

50 Minuten lang bei" Zimmertemperatur gerührt. TPA wird im Vakuum entfernt, und Äther wird zugegeben. Der Niederschlag wird in DMF (150 ml) und NMP (150 ml) gelöst. HOBT (0,27 g, 2 molarer Überschuß) wird zum Auflösen zugegeben, dann wird WSCI (0,37 g, 2 molarer Oberschuß) zugegeben, und dann wird bei Zimmertemperatur 2 Tage gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eis-Wasser gegossen, der Niederschlag wird gesammelt, er wird mit Wasser gewaschen, in Methanol suspendiert, erhitzt und abgekühlt. Die unlöslichen Stoffe werden abfiltriert. Der Niederschlag wird in Methanol suspendiert und erhitzt. Diese Suspension wird abgekühlt und gesammelt, wobei man die Substanz [49] (5,59 g, Ausbeute: 91,0%) erhält.

Aminosäureanalyse:

Asp 4.09(5), Thr 0.90(1), Ser 1.65(3)'

Glu 4.10(5), Gly 0.8 8(1)-, Ala 3 (3),

VaI 3.4 1(4), Leu -2.5 0(3), Tyr 0.8 2(1)»

*Lys 5.4 0 (6), Hiß 0.71(1).

(2) [Tyr⁵²] h-PTH [52-84]:

Die Substanz [49] (3,68 g, 0,6 mM) und Anisol (5 ml) werden zu wassrfreiem HP (50 ml) bei 0⁰C zugegeben, und es wird während 60 Minuten gerührt. HF wird abdestilliert, und Äther wird zu dem Rückstand zugegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und in 0,1 N Essigsäure (50 ml) gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule aus Dowex XI (Acetatform, 2 χ 45 cm) gegeben, und dann wird mit 0,1 N Essigsäure eluiert. Das Eluat wird lyophilisiert, und man erhält das Rohmaterial (2,30 g), welches in 8 M Harnstofflösung (50 ml) gelöst wird. Dann wird der pH-Wert durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf 9,5 eingestellt, und dann wird bei 0⁰C 60 Minuten stehen gelassen. Diese Lösung wird auf eine Säule (4,4 χ

12 cm) aus CM-CeIlulose, die mit 8 M Harnstofflösung gepackt ist, gegeben, und dann wird 0,01 M Ammoniuniacetat (pH 4,5, etwa 100 ml) eluiert, und anschließend wird gemäß linearer Gradientenelution mittels 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) bis 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) eluiert, danach mit 0,2 M Ammoniumacetat (300 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 13,5-ml-Fraktionen fraktioniert, von denen die Absorption bei UV 280 nm geprüft wird, und es werden die Fraktionen Nr. 54 bis 110 gesammelt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in 0,1 N Essigsäure (5 ml) gelöst und durch eine Sephadex-LH-20-Säule (3,4 χ 120 cm) geleitet. Das Eluat wird in je 8,5-ml-Fraktionen fraktioniert, und es werden die Fraktionen Nr. 47 bis 53 gesammelt, welche lyophilisiert werden, wobei man das Material (510 mg) erhält. Dieses Material wird in 0,1 N Essigsäure (20 ml) gelöst und auf eine Säule (4,5 χ 70 cm) aus CM-Cellulose gegeben, und dann wird gemäß linearer Gradientenelution mittels 0,0t M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) bis 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 6,0-m!-Fraktionen fraktioniert. Von jedem Eluat wird die Absorption von UY bei 280 nm bestimmt, und dann werden die Fraktionen Nr. 109 bis 120 gesammelt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in 0,1 N Essigsäure (5 ml) gelöst und durch eine Säule (3,4 χ 120 cm) aus Sephadex LH-20 gegeben. Es werden je Fraktionen von 3,4 ml entnommen, und die Fraktionen Nr. 56 bis 73 werden gesammelt und lyophilisiert, wobei man [Tyr⁵²] h-PTH [52-84] (102 mg) erhält.

TLC: Rf₉ =0,75 (ein Fleck)
Aminosäureanalyse:

A&p 4.55 (5), -Thr 0.93 Cl)," Ser £.20t3), Gau 4.9 8(5), G Iy 0.96(1), Ala 3, -YaI 3.9 8 (4 ), Leu 2.9 3(3), Tyr 0.9 0(1), Lyε 6.1 0(6), His LOO (1).

Beispiele

⁵⁰D h -PTH (50 - 84) ; H- Tyr - Pro ^! Arg — Lye — Glu — Asp — Asn — VaI — \

! Leu —"Val — Glu — Ser — His — Glu — Lys — Ser — Leu — Gly — Glu — Ala — \ Asp — Lyta — Ala — Asp — VaI — Asp — j

VaI — Leu — Thr — Lys— Ala — Lys—

Ser — Gin — OH ··

(1) P (50 - 84 ); B O C - Tyr (BzI - C-X-ζ )

- P-ro — Arg (Tos) - Lys (Z-C^) — Lyä (Z-C^) - Glu. (OBzl) - Asp (OBsl) Asn - VaI -Leu- VaI - Glu (OBsl ) -

Ser (Bzl)-His-Glu (OBzI)- Lys (Z

— CS) — Ser (BzI) — Leu — Gly — Glu (OBzl ) - Ala - Asp (OBzl) - Lys (Z ~ O£)

- Ala - Asp (OBzl) - VaI - Asp (OBzl)

- VaI - Leu — Thr (BzI) - Lys (Z--O2) , - Ala - Lys (Z-C^) - Ser (Bzl) -Gin _ . — OBzl 150]

TFA (50 ml) wird zu der Substanz [39] in Beispiel 2 zugegeben, und es wird bei Zimmertemperatur 55 Minuten gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert, und Äther wird zugegeben.

Der so gebildete Niederschlag wird in DMF (160 ml) und NMP (160 ml) gelöst. HOBT (0,27 g, 2 molarer Überschuß) und BOC-Tyr(BzI-Cl₂)-OH (0,88 g, 2 molarer Überschuß) werden zum Auflösen zugegeben, dann wird auf -20°C abgekühlt, und dann wird WSCI (0,37 g, 2 molarer Überschuß) zugegeben, und es wird bei Zimmertemperatur während 3 Tagen gerührt. Das Reaktionsgemisch wird in Eis-Wasser gegossen. Der so gebildete Niederschlag wird gesammelt, mit Wasser gewaschen, in Methanol suspendiert und erhitzt. Danach wird die Methanolsuspension gekühlt, und das unlösliche Material wird abfiltriert. Der Niederschlag wird erneut unter Erhitzen in Methanol suspendiert, und dann wird abgekühlt, und der Niederschlag wird gesammelt. Dieser Vorgang wird erneut wiederholt, und dann wird mit Äther gewaschen, wobei man die Substanz. [50] (5,97 g, Ausbeute: 90%) erhält.

Amxnosäureanalyse:

Asp 4.21 (5), Thr 0.95 (1), Ser 2.32 (3),

Glu 4.5 0(5), Pro 0.7 5(1), Gl y 0.88(1),

AIa 3,, VaI 3.4 5(4),-. Leu 2.6 0(3), Tyr 0.7 0(1),:. Lys 5.21(6),, His 0.72(1), Arg

(2) [Tyr⁵⁰] h-PTH [50-84]:

Die Substanz [501 (3,98 g, 0,6 mM) und Anisol (6 ml) werden zu wasserfreiem HF (60 ml) bei 0⁰C gegeben, und dann wird bei 0°^{c 60} Minuten lang gerührt. HF wird im Vakuum abdestilliert, Äther wird zu dem Rückstand zugegeben, und der Niederschlag wird gesammelt. Der Niederschlag wird in 0,1 N Essigsäure (50 ml) gelöst und durch eine Säule aus Dowex X1 (Acetatform, 3 χ 45 cm) geleitet. Das Eluat wird lyophilisiert, wobei man das Rohprodukt (2,30 g) erhält. Dies wird in 8 M Harnstofflösung gelöst, der pH-Wert wird durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf 10,0 eingestellt, und es wird bei

O⁰C während 30 Minuten stehen gelassen. Die Lösung wird auf eine Säule (4,2 χ 11,5 cm) aus CM-Cellulose, die mit 8 M Harnstofflösung gepackt ist, gegeben, und dann wird mit 0,01 M Ammoniumacetatlösung (pH 4,5) zur Entfernung des Harn-Stoffs und danach mittels linearer Gradientenelution mittels 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) bis 0,1 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 700 ml) eluiert. Dann wird mittels 0,2 M Ammoniumacetatlösung (pH 4,5, 250 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 8,5-ml-Fraktionen fraktioniert, von denen die Absorption bei 280 nm geprüft wird, dann werden die Fraktionen Nr. 1; 10 bis 155 gesammelt und lyophilisiert. Das Lyophilisat wird in 0,1 M Essigsäure (.6 ml) gelöst und durch eine Säule aus Sephadex LH-20 (3,4 χ 110 cm) gegeben. Die Fraktionen Nr. 66 bis 82 jeder 5,2-ml-Fraktion werden gesammelt und lyophilisert, und man erhält das Lyophilisat (360 mg). Dieses Lyophilisat wird in 0,1 N Essigsäure (10 ml) gelöst, auf eine Säule (2,0 χ 31 cm) aus CM-Cellulose gegeben und dann mittels linearer Gradientenelution mittels 0,01 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) bis 0,2 M Ammoniumacetat (pH 4,5, 500 ml) eluiert. Das Eluat wird in je 7,5-ml-Fraktionen fraktioniert. Die Fraktionen Nr. 90 bis 110 werden gesammelt, lyophilisiert und in 0,1 N Essigsäure (3 ml) gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule (3,0 χ cm) aus Sephadex LH-20 gegeben. Das Eluat wird in je 6-ml-Fraktionen fraktioniert, und die Fraktionen Nr. 35 bis 43 werden gesammelt und dann lyophilisiert, wobei man [Tyr ] höPTH [50-84] (115mg) erhält.

TLC: Rf₁₀ =0,88 (ein Fleck) .

Aminosäureanalyse:

Asp 4.9 5(5), Thr 0.9 1(1),. Ser 2.3-2(3), Glu 5.10(5), Pro 1.0 1(1), Gly 0.9 9(1). AIa 3, Val 4.0 1(4), Leu 2.99(3),· Tyr

0.8 5(1), Lys 6.0 3(6), His 0.9 2(1); ; Arg" 1.0 2(1).

Beispiel 9

(1) Antigene:

Die hrrPTH [53-84]., h-PTH [51-84], h-PTH [46-84] und BSA-[Cys⁴⁵] h-PTH [45-84], die nach dem folgenden Verfahren er halten werden, werden als Antigene verwendet.

BSA-[CyS⁴⁵I h-PTH" [45-84] wird wie folgt hergestellt.

Tetrana.trium-EDTA (4 mg) wird zu BSA (50 mg) , gelöst in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0, 1ml), gegeben. Eine Dimethylformamidlösung (t50 μΐ) von 3-(2'-Benzothiazolyl-dithio)propionatsuccinimidester (500 μg) wird zugegeben, und dann wird unter Eis-Kühlen während 60 Minuten gerührt. Nach der Reaktion wird [Cys ] h-PTH [45-84] (50 mg) zugegeben, und dann wird unter Eis-Kühlen während 30 Minuten gerührt, der pH-Wert wird auf 7,0 eingestellt, und dann wird durch eine Säule (1 χ 50 cm) aus Sephadex G-75, die mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2) gepackt ist und 0,15 M NaCl enthält, für die Gelfiltration geleitet. Eluate mit 15 ml bis 20 ml werden gesammelt, und man erhält die Fraktionen, welche BSA-[Cys⁴⁵]. h-PTH [45-84] enthalten. [Durchschnittlich 11 Mol [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] pro 1 Mol BSA werden konjugiert.1

(2) Antikörper:

Eine Lösung (500 μg/ml) des obigen Antigens in 0,01 M Phosphatpiffer (pH 7,0), enthaltend 0,15 M NaCl, wird hergestellt. Je 2,5 ml dieser Lösung werden mit Freund's komplettem Adjuvans (2,5 ml) vermischt, und dann werden Meerschweinchen, männlich, je fünf in einer Gruppe, durch subkutane Injektion immunisiert (subkutane injektion fünfmal in je Zwei-Wochen-Intervallen). Zwei Wochen nach der Endimmunisierung wird aus dem Herzen Blut gesammelt, und man erhält das Antiserum nach üblichen Verfahren.

Im folgenden werden das Antiserum von h-PTH [53-84] als (A), das Antiserum von h-PTH [51-84] als (B), das Antiserum von h-PTH [46-84] als (C) und das i
PTH [45-84] als (D) abgekürzt.

h-PTH [46-84] als (C) und das Antiserum von BSA-[CyS⁴⁵] h-

(3) Enzymmarkierung:

1) [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84] (4 mg) wird in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0, 1 ml) gelöst. N-[2-(2'-Pyridyldithio)äthyl]-3-(2^l-benzothiazolyl-dithio)propionamid (0,6 mg) in Dimethylformamid (0,9 ml) wird zugegeben, und dann wird bei 0 C während 60 Minuten gerührt. Der pH-Wert wird durch Zugabe von HCl auf 6,0 eingestellt. Die Lösung wird durch eine Sephadex-G*-25-Säule (1 χ 50 cm) mit 0,1 M Phosphatpuffer (pH 6,0) geleitet, wobei man die Fraktionen 15 bis 19 ml erhält.(660 γ/ml [Cys⁴⁵] h-PTH [45-84]). Die obige Fraktion (20 μΐ) wird zu 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0, 1,5 ml) gegeben, welche ß-Galactosidase (1,2 mg) enthält, und dann wird bei 0⁰C 60 Minuten gerührt. Das Inkubationsgemisch wird durch eine Sephadex-G-100-Säule (1 χ 50 cm) mit 0,01 M Phosphatpuffer (pH 7,2), welcher 0,15 M NaCl enthält, zur Gelfiltration geleitet, und man erhält Fraktionen mit 13 bis 17 ml. In diesen Fraktionen ist das Verhältnis von ß-

45 galactosidase-markiertem Konjugat [Cys ] h-PTH [45-84] :

ß-Galactosidase etwa 1 : 1 (im folgenden als Charge A abgekürzt) .

2) h-PTH [53-84] (2_mg) wird in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0, 1. mJL) gelöst. Eine Dimethylformaaiidlösung =(0,2 ml) von 3~(2'-Benzothiazolyl-dithio)propionatsuccinimidester (0,2 mg) wird zugegeben, und dann wird bei 0 C 60 Minuten gerührt. Nach der Reaktion werden 20 μΐ davon zu 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,0, 1 ml) zugegeben, welcher ß-Galactosidase (1 mg) enthält, und dann wird bei 0⁰C 60 Minuten lang umgerührt. Das Reaktionsgemisch wird durch eine Sephadex-G-100-Säule (t χ 50 cm) für die Gelfiltration geleitet, wobei man die Fraktionen mit 14 bis 17 ml erhält.

Das Verhältnis von -ß-Galactosidase-Konjugar beträgt h-PTH [53-84] : ß-Galactosidase =1:1 (im folgenden als Charge B abgekürzt).

(4) Analyse- bzw. Assay-Verfahren:

Die Probenlösung (100 μΐ) , enzyinmarkiertes Konjugat (100 μΐ) , ein aliquoter Teil an verdünntem Antiserum (100 μΐ) und normales Serum von Meerschweinchen (100fache Verdünnung) (100 μΐ) werden bei 5°C während 24 Stunden inkubiert. Anti-MeerschweLnchen-Y-Globulin-Kaninchen-Serum (TOfache Verdünnung, 100 μΐ) wird zugegeben, und dann wird bei 5°C während 24 Stunden inkubiert. 0,5 M NaCl (3 ml) wird zugegeben, und dann wij?d bei 3 000 r.p.m. 15 Minuten lang zum Sammeln des sedimcintierten Materials zentrifugiert. Das sedimentierte Material wird zu 0,1 M Phosphatpuffer (welcher 0,1% Natriumazid/ 0,1% BSA, 20 mM Mercaptoäthanol und 10% Äthanol enthält, pH 6,7), der o-Nitrophenyl-3-galactosidase (5 mg/ml) (200 μΐ) enthält, gegeben, und dann wird bei 37°C 90 Minuten lang umgesetzt. Die Reaktion wird durch Zugabe von 0,2 M Glycinpuffer (pH 10,4, 2,5 ml) beendet, und dann wird die optische Absorption bei 420 nm bestimmt.

0,0t M Phosphatpuffer (pH 7,2), der 0,1% Natriumazid, 0,25% BSA, 0,15 M NaCl und 5 mM EDTA enthält, wird als Verdünnungsmittel verwendet.

1) Die Charge A wird als enzyinmarkiertes Konjugat verwendet. Der Antikörpertiter (Bo/T) von jedem zuvor erwähnten Antiserum wird analysiert. Die Ergebnisse sind in Tabelle I aufgeführt. Jedes Antiserum wird in lOOOfacher Verdünnung verwendet.

- 77 "-*¹

Tabelle I

Antiserum	•	D	Meerschweinen. Nr.	Antikörpertiter (-^) %
			A — 1	1 9
A	A — 2	2 3
	A — 3	1 7
	B-I	1 5
B	B - 2	1 6
	B — 3	16.-
	0—1	. 3 .8 ....
O	C — 2	3 9
0-3	3 4
D — 1	' 3 0 ' '
D — 2	4 6'
D — 3	4 2

2) Das. enzyitmarkierte Konjugat Charge B wird verwendet, und der Antikörpertiter (Bo/T) wird wie"" oben beschrieben für das Antiserum C und das Antiserum D bestürmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II

Antiserum	Meerschweinen. Nr.	Antikörpertiter (^H) %
C	0 — 1 C — 2 C — 3	2 9 3 2 2 9
D	D — 1 D ■ — 2 D — 3	2 4 3 4 3 4

Jedes Antiserum wird in 200Ofacher Verdünnung verwendet.

3) Standardkurven werden unter Verwendung der oben beschriebenen Antisera hergestellt.

Verwendete Antisera: A-2, 60Ofache Verdünnung; B-2, 50Ofa-

che Verdünnung; C-2, 150Ofache Verdünnung; D-2, 2000fache Verdünnung Enzymmarkiertes Konjugat: Charge B

Standardkurv, e von h-PTH [53-84] wird unter Verwendung der obigen Angaben hergestellt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 für A-2, in Fig. 2 für B-2, in Fig. 3 für C-2 und in Fig. für D-2 angegeben.

Aus den obigen Ausführungen folgt, daß Antisera, die unter Verwendung des erfindungsgemäßen Peptids [I].hergestellt werden, sehr günstige Standardkurven ergeben, und somit kann h-PTH oder seine C-endständigen Fragmente durch EIA mit guter Genauigkeit analysiert werden.

In den beigefügten Zeichnungen zeigen die Fig. 1, 2, 3 und 4 die Standardkurven.
20

Claims

PATENTANWÄLTE

UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENTAMT I

OR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER · DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE "

IRMGARDSTRASSE 15 . D-SOOO MÜNCHEN 71 ■ TELEFON 089/797077-79 7078 · TELEX O5-2I2156 kpatd

TELEGRAMM KRAUSPATENT

3162 AW/an

TOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA
Tagata, Japan

Peptid für die Analyse des menschlichen Hormons der

Nebenschilddrüse

PATENTANSPRUCH
Peptid der Formel (I):

R - Lys - Lys - GIu - Asp - Asn - VaI -

Le u- VaI -GIu -Ser -His -GIu-Lys - Ser - Leu - GIy - GIu - Alä. -

Asp - Lys - AIa - Asp -VaI- Asp -

VaI - Leu - Thr - Lys - AIa - Lys -

Ser - Gin - OH [IJ

worin RH, eine H-Tyr-Gruppe oder eine R₁-Pro-Arg-Gruppe bedeutet, R₁ H, eine H-Tyr- oder R^Ala-Gly-Ser-Gln-Arg-Gruppe bedeutet und R- H, eine H-Cys-Gruppe oder H-Tyr-Gruppe bedeutet, oder eines seiner Salze.