KR790001842B1 - 신규 폴리펩티드의 제조법 - Google Patents

Abstract

내용 없음.

Description

신규 폴리펩티스의 제조법

본 발명은 우수한 ACTH활성을 가지며, 의약으로서 유용한 신규 폴리펩티스의 제조법에 관한 것이며, 그 요지는 하기 일반식(Ⅰ)로 표시되는 폴리펩티스를 제조함에 있어서, 아미노산 X₁또는 아미노산 X₁을 N말단으로 하여 이하 상기의 아미노산 배열을 갖는 부분 펩티스와 상기 목적 폴리펩티스의 아미노산 배열의 잔여부분을 구성하는 부분 펩티스와를 축합시키는 것을 특징으로 하는 상기 폴리펩티스의 제조법에 관한 것이다.

상기 식에서, Tyr, Ser, His, Phe, Arg, Trp, Gly, Lys, Pro, Val은 각각 L-티로신, L-세린, L-히스티딘, L-페닐알라닌, L-아르기닌, L-트립토판, 글리신, L-리신, L-프롤린, L-발린 잔기를 나타내고,

X₁은 α-아미노이소부티르산, β-알라닌, 글리신, γ-아미노부티르산, 사르코신, L-세린 또는 D-세린 잔기를 나타내고,

X₂는 L-메티오닌, L-노르로이신, L-이소로이신 또는 L-노르발린 잔기를 나타내고,

X₃는 L-글루타민산 또는 L-글루타민 잔기를 나타내고,

n은 1~4의 정수를 나타내고,

Y는

(식중, R₁, R₂은 각각 동일 또는 상이한 저급 알킬기 또는 수소를, 혹은 서로 헤테르 원자를 개입 또는 개입함이 없이 결합하여 치환 또는 비치환의 함질소 복소환을 나타낸다. 단, X₁, R₁, R₂및 n이 각각 α-아미노이소부티르산, 수소, 수소 4를 나타내는 경우는 제외됨)으로 표시되고, C말단 리신의 카르보닐에 결합하는 부분을 나타낸다.

본 발명자 등은 먼저 α-아미노이소부티르산을 제 1 위치에 갖고, 천연 ACTH의 N말단으로부터 18개의 아미노산 배열을 갖는 옥타데카펩티스(〔Ibu¹〕-ACTH(1-18)-NH₂)을 합성하여, 그것이 우수한 ACTH활성을 나타내는 것을 명백히 하였다(일본 특허공보 제 48-2545호). 또, 그 후의 연구에 의해, 제 1위치에 α-아미노이소부티르산을 갖고, 제 17 및 18위치의 아르기닌 잔기를 리신으로 치환한 대응하는 옥타데카펩티스(〔Ibu¹〕·Lys^17,18-ACTH(1-18)-NH₂)가 극히 강력한 ACTH활성을 갖는다는 사실도 명백히 하였다(일본국 특허출원 제 46147 호/1974). 이들의 옥타데카펩티스는 극히 강력한 부신 피질 자극 작용을 갖는 우수한 펩티스이지만, 부작용〔예를 들면, MSH (멜라민 세포 자극 호르몬 작용) 작용, 항이뇨 작용〕이 약간 강한 경향이 있었다. 그리하여, 본 발명자 등은 예의 연구한 결과, 상기 일반식으로 표시되는 폴리펩티스는 그와 같은 부작용은 약하며, 강력한 부신피질 자극 작용을 갖는다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명에 의해서 수득되는 폴리펩티스, 그의 산부가염 또는 착화합물은 극히 강한 ACTH 작용을 갖고, 또 부작용도 적어 부신피질 기능 검사의 진단약으로서 혹은 스테로이드제와 동일한 각종 질환, ACTH 특유의 각종 질환에 대한 치료약으로서 유용하다.

목적하는 폴리펩티스의 제조에 있어서는, 펩티스 화학분야에서 통상 이용되고 있는 방법을 적당히 사용할 수 있다. 예를들면, 아지드법, 디사이클로헥실카르보디이미드법, 혼합산 무수물법, 활성 에스테르법(예를들면, p-니트로페닐에스테르법, N-하이드록시호박산이미드에스테르법) 등을 바람직한 축합방법으로서 들 수가 있다. N-하이드록시호박산이미드, N-하이드록시-5-노르보르넨-2, 3-디카르복시 이미드나 1-히드록시벤조트리아졸을 반응촉진제 및 라세미화 억제제로서 가해도 좋다.

또, 반응에 관여하지 않는 아미노산 또는 펩티스의 카르복실기는 일반적으로 에스테르시킴으로써, 즉 저급 알킬에스테르(예를 들면, 메틸에스테르, 에틸에스테르, 프로필에스테르, 제삼급부틸에스테르), 저급 아랄킬에스테르(예를들면, 벤질에스테르, p-니트로벤질에스테르, p-메톡시벤질에스테르)로 보호된다.

반응에 관여하지 않는 아미노기의 보호기로서는 1-메틸사이클로헥실옥시카르보닐기, 벤질옥시카르보닐기, p-니트로벤질옥시카르보닐기, p-브로모벤질옥시카르보닐기, p-메톡시벤질옥시카르보닐기, p-페닐아조벤질옥시카르보닐기, 2-(p-디페닐)-이소프로필옥시카르보닐기, 제삼급부틸옥시카르보닐기, 제삼급아밀옥시카르보닐기, 트리틸기, 포르밀기, 트리플루오로아세틸기, 그 외 이 분야에 있어서 사용되고 있는 적당한 아미노 보호기 등을 예시할 수 있다.

또, 측쇄에 2차 관능기를 갖는 세린, 티로신 등의 수산기는 아세틸기, 벤질기, 제 3 급 부틸기 등으로 보호되는 것이 있지만, 반드시 항상 보호할 필요는 없다. 리신의 ε위치 아미노기는 전술한 아미노 보호기에 의해서 동일하게 보호되지만, α-아미노 보호기와 선택적으로 제거할 수 있는 보호기로 보호하는 것이 좋다. 또, 아르기닌의 구아니도기는 토실기, 니트로기 등에 의해서 보호되지만, 항상 보호할 필요는 없다. 또, 글루타민산의 γ위치 카르복실기는 전술한 카르복실 보호기에 의해서 동일하게 보호된다. 또한, 히스티딘의 아미다졸기는 벤질기, 벤질옥시카르보닐기 또는 토실기로 보호되는 것이 있지만, 반드시 항상 보호할 필요는 없다.

보호기를 갖는 아미노산, 펩티스 단편, 최종적으로 제조된 폴리펩티스의 보호기의 제거는 통상 펩티스 화학분야에서 사용되고 잇는 방법이 사용 가능하며, 구체적으로 예시하면 접촉 환원, 액체암모니아/나트륨 환원, 산(불화수소, 취화수소, 염화수소, 불화수소산, 취화수소산, 염산, 삼불화, 초산, 초산, 의산)처리, 가수분해 등이 있다.

본 발명에 의해서 제조되는 폴리펩티스의 정제는 이온 교환수지, 이온 교환 셀룰로오스 등을 사용하는 이온교환 크로마토그라피법, 세파덱스(Sephadex), 실리카겔 등을 사용하는 분배 크로마토그라피법, 실리카겔, 알루미나 등을 담체로 하는 흡착 크로마토그라피법 또는 역류분배법, 혹은 그밖에 통상 펩티스 화학분야에서 사용되고 있는 다른 적당한 방법을 단독 또는 적당히 조합해서 사용함으로써 가능하다.

사용하는 반응조건, 정제조건에 의해서 목적하는 폴리펩티스는 유리 염기 또는 염의 형태로 수득된다. 물론, 이 염을 상용법에 따라서 유리 염기로 할 수 있고, 반대로 유리 염기를 적당한 산과 반응시킴으로써 산부가염으로 변활시킬 수도 있다. 산으로서는 무기산, 예를 들면 할로겐화수소산(염산, 취화수소산, 불화수소산), 인산 혹은 유기산으로서 예를 들면 의산, 초산, 프로피온산, 호박산, 구연산, 벤젠술폰산, p-톨루엔술폰산 등을 예시할 수 있다.

또, 목적하는 폴리펩티스는 상용법에 의해서 펩티스와 착화합물을 형성하는 금속 화합물(예를 들면, 염화아연, 황산아연, 초산아연, 염화코발트, 염화니켈, 염화철, 염화구리 등) 혹은 폴리아미노산(예를 들면, 폴리-L-글루타메이트, 폴리-L-아스파르테이트, 코폴리-L-글루타민-L-티오시네이트 등)과의 착화합물로 할수가 있다.

본 발명에 의해서 수득되는 〔Ibu¹, Lys^{17, 18}〕-ACTH(1-18)-피롤리지드, 〔Ibu¹, Lys^{17, 18}〕-ACTH(1-18)-디메틸아미드와 천연 ACTH, 〔Gly¹〕-ACTH(1-18)-NH₂, 〔Ibu¹〕-ACTH(1-18)-NH₂, 〔Ibu¹, Lys^{17, 18}〕-ACTH(1-18)-NH₂, 코오트로신(Cortrosyn^R)(네델란드, 엔·브이 올가논사 제품), 코오트로신-Z와의 부신피질 자극 작용, MSH 작용에 관한 실험결과를 다음 표에 나타낸다.

또, 표 중 부신피질 자극작용, MSH 작용은 어느 것이나 상대적인 값으로 나타내고 있다. 부신피질 자극작용의 측정에는 여러가지의 방법이 있지만, 치료약으로서의 유용성을 볼 때에는 부신비대, 흉선축소효과에 의하는 것이 신뢰도가 높다. 그리하여, 부신비대, 흉선축소효과가 크고, 또 부작용이 있는 MSH 작용과의 비율(a/b)이 높은 것일수록 바람직한 펩티스라고 말할 수 있다. 또, 천연 ACTH, 〔Gly¹〕-ACTH(1-18)-NH₂, 코오트로신의 흉선 축소, 부신비대효과는 대단히 약하다. 본 발명에 의해서 수득되는 펩티스는 어느 것이든지 상기의 표로부터 명백한 바와같이, 천연 ACTH, 기지 펩티스 등에 비교하여 우수한 펩티스인 것으로 이해된다. 또, 생물활성은, 일본특허공고 제 2545 호/1973 명세서에 기재한 방법에 준해서 측정되었다.

본 발명에 의한 신규 폴리펩티스는 단독 또는 유기산, 무기산의 염으로서, 혹은 착화합물로서 필요하다면 적당한 부형제, 보존제, 안정제, 습윤제, 유화제, 현탁화제와 함께 주사제, 액제, 에어로졸제, 유제 등의 제제형태로 류우머티성 질환, 알레르기성 질환, 소아점두경련, 기란바레이증후군, 부신피질기능의 저해방지 등의 치료에 혹은 부신피질기능의 진단에 제공할 수가 있다.

이하에 실시예를 기재하지만, 이것은 어디까지나 예시이며, 하등 본 발명의 기술적범위를 제한하는 것은 아니다. 또, 실시예 중 아미노산은 모두 L-아미노산을 사용하고 있다.

[실시예 1]

Ibu-Tyγ-Seγ-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lsy-N(CH₃)₂(〔Ibu¹, Lys^{17, 18}〕-ACTH(1-18)-N(CH₃)₂)의 제조

(가) Z-Lys(Boc)-Lsy(Boc)-N(CH₃)₂(Ⅰ). (Z=벤질옥시카르보닐기, Boc=제 3 급 부틸옥시카르보닐기).

N^α-벤질옥시카아보닐-N^ε-제삼급부틸옥시카아보닐-L-리신 N-하이드록시 호박산이미도에스테르(2.275g)를 테트라하이드로푸란(15mℓ)에 용해하고, 0℃로 냉각한다. 디메틸아민(1.58g)을 가한 후 0℃에서 4시간 방치한다. 반응액을 감압유거하고, 잔류물을 초산에틸과 물에 용해하여 진탕 후 유기층을 분취하였다. 유기층을 건조 후, 감압농축하여 유상 잔류물을 얻었다. 이것을 메타놀(20mℓ)에 용해하고, 신온에서 3시간 접촉 환원한다. 반응액을 감압 유지하여, 유상 잔류물을 디메틸포름아므드에 용해한다. 여기에 Nα-벤질옥시카르보닐-Nε-제삼급부틸옥시카르보닐-L-리신호박산이미도에스테르(1.67g)을 가하고, 4℃에서 하룻밤 방치한다. 반응액을 감압농축하여, 유상 잔류물을 클로로 포름에 용해하고, 실리카겔의 컬럼 크로마토그라피(클로로포름 : 메타놀=9 : 1)에 걸어 목적물을 얻었다. 수량 2.07g

-13.8±0.6°(c 0.979, 메타놀).

원소분석치 : C₃₂H₅₃N₅O_8·H₂O

계산치 : C, 58.78; H, '8,48; N, 10.71

실측치 : C, 59.14; H, 8.56; N, 10.38

(나) Z-Lys(Boc)-Lsy(Boc)-Lys(Bnc)-N(CH₃)₂(Ⅱ)

화합물 Ⅰ(1.896g)을 메타놀(15mℓ)에 용해하고 실온에서 2시간 반 접촉환원을 행하여 용매를 감압유거한다. 잔류물을 디메틸포름아미드에 용해하고, 빙냉하에 Nα-벤질옥시카르보닐-Nε-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리신 N-하이드록시호박산이미도에스테르(1.06g)를 가한다. 4℃에서 하룻반 방치 후, 감압농축하고, 유상 잔류물을 초산에틸에 용해한다. 용액을 세정 후, 건조하여 감압유거한다. 잔류물을 초산에틸-석유에테르로부터 재침전하여 목적물을 얻었다. 수량 1.79g, 융점 : 68.5~70.5℃

-20.6±0.6°(c 1.007, 메타놀)

원소분석치 : C₄₃H₇₃N₇O₁₁

계산치 : C, 59.77; H, 8.52; N, 11.35

실측치 : C, 59.68; H, 8.50; N, 11.37

(다) Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-N(CH₃)₂(Ⅲ)

화합물 Ⅱ(0.804g)를 메타놀(5mℓ)에 용해하여, 실온에서 3시간 접촉환원한다. 반응액을 감압농축하여 수득되는 유상 잔류물을 디메틸포름아미드(10mℓ)에 용해하고, N^α-벤질옥시카르보닐-Nε-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리신-N-하이드록시호박산이미도에스테르(0.478g)를 가해서 4℃에서 하룻밤 방치한다. 용매를 감압유거하고, 초산에틸에 용해한다. 용액을 세정건조 후 감압농축하여 유상 잔류물을 얻었다. 이것을 초산에틸-석유에테르로부터 재침전하여 목적물을 얻었다. 수량 0.935g, 융점 : 90~92℃

-23.4±0.6°(c 1.014, 메타놀).

원소분석치 : C₅₄H₉₃N₉O₁₄

계산치 : C, 59.37; H, 8.58; N, 11.54

실측치 : C, 59.44; H, 8.62; N, 11.65

(라) Z-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-N(CH₃)₂(Ⅳ)

화합물 Ⅲ(0.546g)을 메타놀 중 실온에서 3시간 접촉환원한다. 용매를 감압유거하여 α-아미노기 유리의 테트라펩티스를 유상 잔류물로서 얻었다. 한편, Z-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-OH(0.317g)를 디메틸 포름아미드(5mℓ)에 용해하고, N-하이드록시호박산이미드(0.058g)을 가하고, 빙냉하에서 교반한다. N, N'-디사이클로헥실카르보디이미드(0.103g)의 디메틸포름아미드 용액을 가하고, 0℃에서 30분간 교반했다. 여기에 앞에서 얻은 테트라펩티스의 디메틸 포름아미드 용액을 가하여 0℃에서 6시간 교반한 후, 하룻밤 방치한다. 용매를 감압농축하여, 잔류물을 초산에틸에 용해하고, 세정 및 건조한다. 용액을 감압농축하여 잔류물을 초산에틸-석유에테르로 재침전한다. 침전물을 모아 실리카겔의 컬럼에 걸어, 클로로포름(200mℓ), 클로로포름-메타놀(95 : 5, 200mℓ) 클로로포름-메타놀(9 : 1, 200mℓ), 클로로포름-메타놀(85 : 15, 200mℓ)로 용출하여 목적물을 얻었다. 수량 0.447mg, 융점 : 130~141℃

-44.8±2.5°(c 0.348, 메타놀).

원소분석치 : C₆₇H₁₃₂N₁₄O₂₀

계산치 : C, 58.76; H, 8.45; N, 12.46

실측치 : C, 58.94; H, 8.61; N, 12.19

(마) Ibu-Tyγ-Seγ-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-N(CH₃)₂[Ibu², lys^17,18-ACTH(1-18)-N(CH₃)₂](V)

화합물 Ⅳ(70.8mg)를 메타놀(5mℓ)에 용해하여, 실온에서 3시간 접촉 환원한다. 용매를 감압 유거하여 α-아미노기 유리의 옥타펩티스를 유상 잔류물로서 얻었다. 한편, Boc-Ibu-Tyγ-Seγ-Met-Glu(OBu^t)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH(63.5mg)(일본 특허공고 제 2 , 545호/1973, 일본특허출원 제 46147 호/1974 명세서에 기재된 방법에 준해서 제조됨)를 디메틸포름아미드(1.5mℓ)에 용해하여 빙냉하고, 여기에 N-염산(0.1mℓ)을 가했다. 이 혼합물을 빙냉하에서, 초산 에틸에 가해서 생성되는 침전물을 모아서 건조한다. 이것을 다시 디메틸포름아미드(1mℓ)에 용해하고, 여기에 N-하이드록시호박이미드(10.1mg)와 트리에틸아민(0.006mℓ)을 가해서 빙냉한다. 이 용액에 앞에서 얻은 옥타펩티스와 N, N'디사이클로헥실카르보디이미드(31.8mg)의 디메틸포름아미드 용액(1mℓ)을 가해서 0℃에서 2시간, 실온에서 22시간 방치한다. 반응액을 초산에 (50mℓ)중에 적하하여 석출하는 침전물을 여취한다. 이것을 초산에 용해하여 동결 건조하여 115mg의 백색분말을 얻었다. 이것을 메르캅토에타놀(0.1mℓ) 및 아니졸(0.1mℓ)과 함께 트리클로로초산(2mℓ)에 가해 실온에서 1시간 방치한다. 에테르를 가해서 석출되는 침전물을 모아. 건조하여 보호기가 제거된 옥타데카펩티스를 얻었다. 이것을 물(5mℓ)에 용해한 후 암벌라이트(Amberlite) CG-400의 컬럼(0.9×10cm)에 통과시키고, 물로 세척한다. 용출액을 동결 건조하여 분말 93mg을 얻었다. 이 분말을 물(1.5mℓ)에 용해하고, 카르복시 메틸셀룰로오스(Serva, 0.70meq/g)의 컬럼(1.5×17cm)에 걸었다. 0~0.6M의 직선농도 구배를 갖는 초산암모늄(pH5.82, 1, 000mℓ)로 전개하여 용출액 중 목적물을 함유하는 부분을 모아, 동결건조하여 정제된 분말(94mg)을 얻었다. 이 분말 더욱을 정제하기 위해 세파덱스 G-25(매질, 2.3×41cm)의 컬럼에 걸어 부타놀/초산/피리딘/물(12 : 3 : 4 : 6)을 전개 용매로서 사용하여 분배 크로마토그라피를 행한다. 용출액(시험관 No.18-43 : 6g/tube)을 모아, 감압농축한 후 동결건조하여 펩티스를 61mg을 얻었다.

상기 펩티스를 더욱 정제하기 위해 카르복시메틸셀룰로오스(Whatman CM-52)의 컬럼(1.5×30cm)에 걸어, 0.1~0.6M의 직선농도 구배를 갖는 초산암모늄 완충액(pH6.13, 1, 000mℓ)으로 용출했다. 이 용출액(시험관 No.153~175 : 5g/tube)을 모아, 감압농축하여 잔류물을 얻었다. 이것을 동결건조하여 목적하는 팹티드를 얻었다. 수량 38mg.

-62.2 2.1°(c 0.5, 0.1N 초산).

아미노산 분석치 : Lys 4.96(5), His 1.00(1), Arg 1.02(1), Ser 0.92(1), Glu 0.98(1), Pro 1.02(1), Gly 1.93(2), Val 1.00(1), Met 0.95(1), Tyr 1.03(1), Phe 0.99(1) (또, ( )내는 기대치를 나타냄).

본품은 박층크로마토그라피(Cellulose F. Merck : 1-부타놀/초산/피리딘/물 = 15 : 3 : 10 : 15)에 있어서 단일 스폿트를 나타낸다.

[실시예 2]

α-아미노이소부티릴-L-티로실-L-세릴-L-메티오닐-L-글루타밀-L-히스티딜-L-페닐알라닐-L-아르기닐-L-트립토필-글리실-L-리실-L-프롤릴-L-발릴-글러실-L-리실-L-리실-L-리실-L-리실-피롤-리시드(〔Ibu¹, Lys^{17, 18}〕-ACTH(1-18)-피롤리지드)의 제법.]

(바) Z-Lys(Boc)-Py(Py=피롤리딜기)(Ⅵ).

N^α-벤질옥시카아보닐-N^ε-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리신 N-하이드록시호박산이미도에테르(1.44g)의 디메틸포름아미드(5mℓ) 용액에 피롤리딘(0.25mℓ)을 가하여, 실온에서 5시간 유지한다. 반응용액을 감압농축하고, 잔류물을 초산에틸에 용해하고, 0.5N 염산 및 0.5M 탄산수소나트륨으로서 세정한다. 황산나트륨으로 건조 후, 용액을 감압 농축한다. 생성물을 실리카겔(Kieselgel H. Merck, 70g)의 컬럼에 걸어, 벤젠-초산에틸-초산(70 : 30 : 3)으로 용출한다. 용출액을 모아, 감압 농축하고, 잔류물을 에테르 석유에테르로부터 침전시켜서 겔상의 목적물을 수득했다. 수량 1.40g

-3.2±0.9°(c 0.5, 메타놀).

원소분석치 : C₂₃H₃₅N₂O₅

계산치 : C, 63.72; H, 8.14; N, 9.69

실측치 : C, 63.94; H, 8.22; N, 9.42

(사) Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Py (Ⅶ).

화합물 Ⅵ(1.40g)을 메타놀 중에서 팔라듐 촉매의 존재하에 5시간 접촉 환원하여 N-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리신 피롤리시드를 유상 물질로서 수득했다. 이것을 초산에틸에 용해하고, Nα-벤질옥시카르보닐-Nε-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리신 N-하이드록시호박산이미도에스테르(1.44g)를 0℃에서 가한다. 혼합액을 4℃에서 하룻밤 교반하고, 세정 건조 후, 감압농축한다. 생성물을 실리카겔(Kieselgel H. Merck, 70g)의 컬럼에 걸어 벤젠-초산에틸-초산(70 : 30 : 3)을 사용하여 용출했다. 이 용출액을 모아 감압농축하여 목적물질을 유상물질(2.5g)로서 얻었다. 본품은 정제하지 않고 다음 단계의 반응에 사용한다.

(아) Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Py (Ⅷ).

화합물 Ⅵ(2.5g)을 메타졸 중에서 4시간 팔라듐으로 접촉환원하여 N^ε-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리실-N^ε-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리신 피롤리시드를 유상 물질로서 얻었다. 이것을 초산에틸(20mℓ)에 용해하고, N^α-벤질옥시카르보닐-Nε-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리신 N-하이드록시호박산이미도에스테르(1.44g)을 0℃에서 가한다. 혼합액을 4℃에서 교반하면서 하룻밤 방치하고, 0.5N염산 및 0.5M 탄산수소나트륨으로 세정하고 황산마그네슘으로 건조 후, 감압농축한다. 잔류물을 에테르 석유 에테르로부터 침전시켜서 목적물을 얻었다. 수량 2.60g, 융점 : 67~69℃.

-21.6±0.6°(c 1.0, 메타놀).

원소분석치 : C₄₅H₇₅N₇O₁₁

계산치 : C, 60.72; H, 8.49; N, 11.02

실측치 : C, 60.62; H, 8.41; N, 11.10

(자) Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Py (XI).

화합물 Ⅷ(1.10g)을 메타놀 중에서 4시간 접촉환원하여 Nε-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리실-Nε-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리실-N^ε-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리실-피롤리시드를 유상 물질로서 얻었다. 이것을 초산에틸(10mℓ)에 용해하고, Nα-벤질옥시카르보닐-Nε-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리신, N-하이드록시호박산이미도에스테르(0.583g)를 0℃에서 부가했다. 혼합액을 4℃에서 하룻밤 교반하고, 0.5N염산, 0.5M 탄산수소나트륨 용액으로 세정한다. 황산마그네슘으로 건조 후, 감압농축하고, 잔류물을 에테르/석유-에테르로부터 침전시켜서 목적물을 얻었다. 수량 1.30g, 융점 : 115~117℃.

±0.6°(c 1.0, 메타놀).

원소분석치 : C₅₆H₉₅N₉O₁₄

계산치 : C, 60.14; H, 8.56; N, 11.27

실측치 : C, 60.31; H, 8.68; N, 11.27

(차) Lys(Boc)-Pro-Val-Cly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Py (X).

화합물 Ⅸ(1.25g)을 팔라듐 촉매의 존재하에 메타놀중에서 5시간 접촉환원한다. 용매를 감압유거하여, 유상잔류물을 N^α-벤질옥시카르보닐-N^ε-제 3 급 부틸옥시카르보닐-L-리실-L-프롤릴-L-발릴-글리신(0.67g) 및 N-하이드록시호박산이미드(0.105g)와 함께 디메틸포름아미드(10mℓ)에 용해했다. 여기에, N, N'-디사이클로헥실카르보디이미드(0.186mg)를 가해서 0℃에서 하룻밤 교반한다. 반응액을 여과하고 이 여액을 감압 농축하여 잔류물에 초산에틸에 용해했다. 이 용액을 세정, 건조 후, 감압 농축하고, 잔류 물을 에테르/;석유 에테르부터 침전시켜서 목적물을 얻었다. 수량 1.40g, 융점 : 120~125℃

-46.1 0.9° (c 1.0, 메타놀).

원소분석치 : C₇₉H₁₃₄N₁₄O₂₀·H₂O

계산치 : C, 58.64; H, 8.47; N, 12.12

실측치 : C, 58.72; H, 8.36; N, 12.26

(카) Ibu-Tyγ-Seγ-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Py(〔Ibu¹·Lys^{17, 18}〕-ACTH(1-18)-Py (X).

화합물 Ⅹ(0.16g)을 팔라듐 촉매의 존재하에 메타놀 중에서 5시간 접촉 환원한다. 용매를 감압하에서 유거하여 α-아미노기가 유리된 옥타펩티스 피롤리시드를 얻었다.

Boc-Ibu-Tyγ-Seγ-Met-Glu(OBu^t)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH(0.145g)를 디메틸포름아미드(2mℓ)에 용해하고, 여기에 1N-염산(0.2mℓ)을 가한다. 에테르를 가해서 데카펩티스 염산염을 얻어 이것을 건조한다.

위에서 얻은 데카펩티스, 옥타펩티스 유도체를 디메틸포름아미드(3mℓ)에 용해하고, N-하이드록시호박산이미드(0.023g)을 가한다. 이 융점에 N, N'-디사이클로헥실카르보디이미드(0.041g)를 가하고, 4℃에서 하룻밤 방치한다. 혼합액을 초산에틸-에테르(1 : 1, 100mℓ)에 가하여 침전물을 모아 초산에틸과 에테르로 세정 후 건조하여 보호기를 갖는 옥타데카펩티스를 얻었다.

위에서 얻은 펩티스를 아니졸(0.1mℓ) 및 2-메르캅토에타놀(0.1mℓ)과 함께 삼불화초산(3mℓ)에 용해하고, 실온에서 60분간 유지했다. 에테르를 가해서 생성되는 침전물을 여취하고, 에테르로 세정 후 건조한다. 이어서, 물(10mℓ)에 용해하고, 암벌라이트 CG-400(초산형)의 컬럼에 통과시키고, 물로 세척한다. 용출액을 모아 감압하에서 농축하고, 동결 건조하여 보호기가 제거된 옥타데카펩티스를 얻었다. 이것을 세파덱스 G-25의 컬럼(2.1×75cm)에 걸어, 1-부타놀/초산/피리딘/물(12 : 3 : 4 : 6)을 사용해서 분배 크로마토그라피를 행한다. 용출액을 모아 감압농축 후, 동결건조하여 F-1(115mg)과 F-2(122mg)를 얻었다. F-2를 세파덱스 G-25의 컬럼(2.8×83cm)에 걸어, 먼저와 동일한 용매를 사용해서 재분배 크로마토그라피를 행했다. 동일한 조작에 의해, 상당히 정제된 옥타데카펩티스를 얻었다.

상기 펩티스를 더욱 정제하기 위해, 카르복시메틸셀룰로오스(Whatman CM-52)의 컬럼(2.1×2.1cm)에 걸어, 0~0.6M의 직선농도 구배를 갖는 초산암모늄 완충액(pH 6.5, 2, 000mℓ)으로 전개한다. 주요 피이크에 상당하는 용출획분을 모아 감압농축한다. 잔류물을 동결건조하여 목적하는 순수한 옥타데카 펩티스 피롤리시드를 얻었다. 본품은 박층 크로마토그라피에 있어서 단일 스폿트를 나타낸다(셀룰로오스 Merck 1-부타놀/초산/피리딘/물 15 : 3 : 10 : 15). 수량 58mg.

-63.5 2.0° (c 0.5, N/10-초산).

아미노산 분석치 : Lys 5.45(5), His 1.07(1), NH₃0.68(1), Arg 1.15(1), Ser 0.73(1), Gly 1.00(1), Pro 1.29(1), Gly 2.05(2), Val 1.0(1), Met 0.99(1), Tyr 1.04(1), Phe 1.05(1).

Claims (1)

1. 하기 식(Ⅰ)로 표시되는 폴리펩티스를 제조함에 있어서, 아미노산 X₁또는 아미노산 X₁을 N 말단으로 하여 이하 상기 아미노산 배열을 갖는 부분 펩티스와, 하기 목적 폴리펩티스의 아미노산 배열의 잔여부분을 구성하는 부분 펩티스를 축합시키는 것을 특징으로 하는 하기 식(Ⅰ)로 표시되는 폴리펩티스의 제조법.

   

   상기 식에서,

   Tyr, Ser, His, Phe, Arg, Trp, Gly, Lys, Pro, Val은 각각 L-티로신, L-세린, L-히스티딘, L-페닐알라닌, L-아르기닌, L-트립토판, 글리신, L-글리신, L-프롤릴, L-발린 잔기를 나타내고,

   X₁은 α-아미노이소부티르산, β-알라닌, 글리신, γ-아미노부티르산, 사르코신, L-세린 또는 D-세린 잔기를 나타내고,

   X₂는 L-메티오닌, L-노르 로이신, L-이소토이신 또는 L-노르발린 잔기를 나타내고,

   X₃은 L-글루타민산 또는 L-글루타민 잔기를 나타내고,

   n은 1~4의 정수를 나타내고,

   Y는

   

   (식중·R₁·R₂는 각각 동일 또는 상이한 저급 알킬기 혹는 수소, 혹은 서로 헤테로 원자를 개입 또는 개입함이 없이 결합하여 치환 또는 비치환의 함질소복소환을 나타냄. 단, X₁, R₁, R₂및 n이 각각 α-아미노이소부티르산, 수소, 수소 및 4를 나타내는 경우에는 제외됨)으로 표시되고, C 말단 리신의 카르보닐에 결합하는 부분을 나타냄.