NO137151B - Analogifremgangsm}te for fremstilling av terapeutisk aktive ortiotropin-peptider - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelse angår analogifreargangsmåter for fremstilling av terapeutisk aktive /l-a-aminoisosmørsyre7-corticotropin-peptider med aminosyreester som tilsvarer sekvensen 1-18 til 1 - 27 av det naturlige corticotropin-molekyl,

representert ved den generelle formel: a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-A-B-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-C-D-E-F, hvori A er en rest av L-metionin, L-norvalin, L-norleucin, L-leucin eiler a-aminosmørsyre, B er en rest av L-glutaminsyre eller L-glutamin, C og D er hver en rest av L-lysin eller L-ornitin,

E er en rest av L-arginin, L-lysin eller L-ornitin og F er en rest

av L-arginin, L-arginyl-L-prolin, L-arginyl-L-prolyl-L-valin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-

tyrosin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartinsyre, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-alanin,L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tryosyl-L-proly1-L-aspartyl-glycy1-L-glutaminsyre, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-alanyl-glycyl-L-glutaminsyre eller L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-glycyl-L-alanin, det tilsvarende amid eller tilsvarende ester, ikke-giftige syreaddisjonssalter eller komplekser av dette og det særegne ved oppfinnelsen er at (a) en aminosyre-ester eller en peptidester som har en fri aminogruppe i nærvær av et kondensasjonsmiddel omsettes med en annen aminosyre eller et peptid hvor .aminogruppen henholdsvis aminogruppene er beskyttet, eller (b) en aminosyre eller et peptid som har en fri aminogruppe og hvor karboksylgruppen eventuelt er beskyttet

omsettes med en annen aminosyre eller et peptid som har en aktivert karboksylgruppe og hvor aminogruppen eller aminogruppene er beskyttet, eller (c) en aminosyre eller et peptid som har en fri karboksylgruppe og hvor aminogruppen henholdsvis aminogruppene er beskyttet i den angitte aminosyresekvens omsettes med en annen aminosyre eller et peptid som har en aktivert aminogruppe og beskyttet karboksylgruppe, og de beskyttende grupper fjernes fra det resulterende beskyttede peptid ved hydrogenolyse, acidolyse, hydrazinolyse, hydrolyse eller reduksjon med natrium i flytende ammoniakk, og eventuelt omdannes det dannede ubeskyttede peptid til syreaddisjonssalter eller komplekser av dette på vanlig måte.

^l-Q;-amino_isosmørsyre7-corticot.ropin-peptider som er fremstilt ifølge oppfinnelsen er nyttige som et medikament, fordi de viser markerte biologiske aktiviteter som f.eks. adrenalin-stimulerende aktivitet, melanocyt-stimulerende aktivitet og lipotropisk aktivitet.

I løpet av undersøkelsen av corticotropin-peptidene har det blitt oppdaget at amino-terminal-substitusjon ved cc-aminoisosmørsyre i et corticotropin-peptid vesentlig forbedrer dettes biologiske egenskaper og resulterer i forøkning av effekten og forlengelse av virkningen. Det har også blitt oppdaget at slike forbedrede egenskaper kommer av den avtatte følsomhet av /£I-a-aminoisosmørsyre7-corticotropin-peptid overfor virkningen av intracellulær aminopeptidase *

Peptid-bindingene blir dannet ved vanlige metoder, men de mest vanlige benyttede metoder er dicykloheksyl-karbodiimid-metoden, azid-metoden, den blandede anhydrid-metode og den aktiverte ester-metode.

Ved fremstillingen av £L-oc-aminoisosmørsyre7-corticotropin-peptider blir enhver fri funksjonell gruppe som ikke deltar i omsetningen med fordel beskyttet, særlig ved slike grupper som lett kan fjernes ved hydrogenolyse, acidolyse, hydrazinolyse, hydrolyse eller reduksjon med natrium i flytende ammoniakk. Karboksylgruppen er med fordel beskyttet ved forestring, f.eks. med en lavere alkanol. De karboksyl-beskyttende gruppene blir innført ved vanlige metoder.

Aminogruppen blir fortrinnsvis beskyttet ved innføring av f.eks.

en t-butyloksykarbonyl-gruppe, t-amyloksykarbonyl-gruppe, o-nitrofenylsulfenyl-gruppe, 2-(p-difenyl)-isopropyloksy-karbonyl-gruppe, benzyloksykarbonyl-gruppe, p-nitrobenzyloksykarbonyl-gruppe, p-metoksybenzyloksykarbonyl-gruppe, tosyl-gruppe, formylgruppe eller trityl-gruppe, på vanlig måte. For beskyttelse av guanidyl-gruppen i arginin, blir det fortrinnsvis benyttet en nitro-gruppe, tosyl-gruppe eller adamantyloksykarbonyl-gruppe, men beskyttelsen av guanidyl-gruppen er ikke alltid nødvendig. U)-amino-gruppen i lysin eller ornitin er med fordel beskyttet

av slike amino-beskyttende grupper som nevnt ovenfor. <-J -karboksylgruppen i glutamin-syre eller aspartinsyre blir fortrinnsvis beskyttet ved slike karboksyl-beskyttende grupper som nevnt ovenfor, og imidazol-gruppen av histidin kan bli beskyttet ved tosylgruppen, benzyloksykarbonyl-gruppen, benzyl-gruppen eller lignende. Videre kan hydroksyl-gruppen i serin eller tyrosin bli beskyttet ved acetyl-gruppen, benzyl-gruppen eller t-butyl-gruppen, men en slik beskyttelse er ikke alltid nødvendig.

/ T- a-aminoisosmørsyrey-corticotropin-peptidet fremstilt ifølge oppfinnelsen inneholder 1-18 til 1-27 aminosyrerester av corticotropin-molekylet. I tillegg til amino-terminal-substitusjonen kan en del andre aminosyrerester av sekvensen bli ytterligere erstattet ved andre forskjellige aminosyrer, uten vesentlig å svekke den corticotropiske aktivitet. For eksempel kan den 4. aminosyren, metionin, bli erstattet med norvalin, norleucin, leucin eller a-aminosmørsyre, 5-glutaminsyre med glutamin;

15- og/eller 16- lysin med ornitin; 17- og/eller 18- arginin med lysin eller ornitin; og/eller 25-aspartinsyre med valin.

En sammenbindingsreaksjon for fremstilling av peptidet (1) blir utført, f.eks. ved å kondensere et beskyttet decapeptid med formlen: R^-oc-aminoisobutyryl-O-I^-L-tyrosyl-L-seryl-A-Y -Rg-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin, hvori R^ er en amino-beskyttende gruppe; R2 er en hydroksyl-beskyttende gruppe; Rg er en karboksyl-beskyttende gruppe; og A har samme betydning som definert ovenfor, med et beskyttet peptid av formelen: N^~ -R^-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^ -R^-C-N0"' - R6-D-E'-F', hvori R4, R^ og Rg hver er en amino-beskyttende gruppe; E<1> er en beskyttet eller ubeskyttet L-arginin, L-lysin eller L-ornitin-rest; og F' er en beskyttet eller ubeskyttet aminosyrerest eller peptid-rest som definert ovenfor, i et inert løsningsmiddel ved en temperatur av -20°C til 60°c i fra 2 timer til 7 dager, og å fjerne de beskyttende grupper fra det dannede beskyttede peptid med formelen: R^- cx -aminoisobutyryl-0-R2-L-tyrosyl-L-seryl-A-Y' - Rg-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-N ^ -R^L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N1-0 -R^C-N^ -Rg-D-E 1 -F ' , hvori R^, R2, Rg, R^, R^, Rg, A, C,D, E<1> og F1 har den ovenfor nevnte betydning, på en tidligere kjent måte ved en temperatur av omtrent -20°C til 60°C fra omtrent 30 minutter til 24 timer.

De inerte løsningsmidler er dimétylformamid, dimetylsulfoksyd, dioksan, heksametyl-, fosfor-triamid, vandige løsningsmidler av disse og en blanding av disse.

De foretrukne fremgangsmåtene for fremstilling av dktadecapeptidet, tetracosapéptidet og heptacosapeptidet er vist i synteseskjemaene I, II og III.

I synteseskjemaene er folgende forkortelser benyttet: Ibu= a-aminoisosmbrsyre-rest, Tyr=L-tyrosin-rest, Ser=L-serinrest, Met=L-metionin-rest, Glu=L-glutaminsyre-rest, His=L-histidin-rest, Phe=L-fenylalanln-rest, Arg=L-arginin-rest, Trp=L-tryptofan-rest, Gly=glysinrest, Lys=L-lysin-rest, Pro=L-prolin-rest, Val=L-valin-rest, Asp=L-aspartinsyre-rest, Ala=L-alanin-rest, BOC=t-butyloksykarbonyl, Bzl=benzyl, OBu<t>=t-butoksy, DCC=N,N'-dicykloheksylkarbo-diimid, Z=benzyloksykarbonyl, HOSu=N-hydroksysuccinimid, M.A.= blandet anhydridmetode, ONP=p-nitrofenoksy.

Som vist i synteseskjemaene omfatter den foretrukne prosess en sammenbinding av tripeptidet inneholdende de forste 3 amino-syrene, dvs. a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-serin eller tetrapepticfet, dvs. a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionin med heptapeptidet eller heksapeptidet som svarer til posisjonen ^--10 eller 5-10, respektivt, fortrinnsvis ved azidmetnden, hvoretter det dannete decapeptid blir kondensert med peptidet som svarer til resten av molekylet, dvs. oktapeptidet (stillingene 11-18) i tilfelle for fremstillingen av oktadecapeptidet, tetradecapeptidet (stillingene 11-2<*>+) i tilfellet for tetracosapeptidet og hepta-decapeptidet (stillingene 11-27) i tilfellet for heptacosapeptidet. De andre /l-a-amino-isosmorsyre-7-corticotropin-peptidene kan bli fremstilt på lignende måte ved å kondensere amino-terminal-deca-peptidet med peptidet som tilsvarer, karboksyl-terminal-halvdelen.

Amino-terminal-decapeptidet, tetrapeptidet og tripeptidet er alle nye forbindelser, som aldri tidligere har blitt fremstilt og de er nyttige som mellomprodukter for syntesene for corticotropin-peptidene.

Selv om den ovenfor nevnte fremgangsmåte er den foretrukne for fremstillingen av corticotropin-peptidene er det mulig å bytte ut de beskyttende gruppene, sammenbindings-metodene eller avbeskytt-elsen som er benyttet ovenfor, med tilsvarende eller tilsvarende metoder og for passende forandring av stillingene og rekkefolgen for sammenbinding av peptid-fragmentene.

Beskyttende grupper som er benyttet ved den foreliggende

oppfinnelse kan fjernes ved hydrogenolyse, hydrolyse, hydrazinolyse, reduksjon med natrium i flytende ammoniakk eller ved behandling med en syre som f.eks. trifluoreddiksyre, maursyre, hydrogenhalogenid- (f. eks . hydrogenfluorid, hydrogenbromid, hydrogenklorid), hydrohalogensyre (f.eks. hydrofluorsyre, hydrobromsyre,

saltsyre) eller en blanding av disse, på en vanlig måte, avhengig av gruppens natur.

Corticotropin-peptidene som er fremstilt ved den foreliggende oppfinnelse kan bli renset ved kjente metoder som f.eks. kolonne-kromatografi med ione-bytter-harpiks, ione-bytter-cellulose,eller ione-bytt er-"Sephadex" eller mo ts tr oms-f or deling smetoden.

Corticotropin-peptidene fremstilt ifølge oppfinnelsen er i form

av base eller farmasøytisk akseptabelt ikke-giftig syreaddisjons-salt, avhengig av reaksjonsbetingelsene som benyttes. Disse saltene kan også bli fremstilt ved å' behandle peptidene med uorganiske syrer som f.eks. hydrohalogensyre (f.eks. bydrofluorsyre, hydrobromsyre, saltsyre) ,. hydrogenhalogenid (.f. eks. hydrogenf luorid, hydrogenbromid, hydrogenklorid), svovelsyre eller fosforsyre,

eller med organiske syrer som f.eks. eddiksyre, maursyre, propionsyre, glycolsyre,melkesyre, pyrodruesyre, oksalsyre, mabnsyre, rav-syre, maleinsyre, furnarsyre, tartarsyre, citronsyre, benzoesyre, metansulfonsyre, benzensulfonsyre eller toluensulfon-syre, på en vanlig måte. En ekvimolar eller overskuddsmengde av syre kan bli benyttet i slik saltdannelse.

/*1 -a-aminoisosmorsyre^Z-corticotropin-peptider således fremstilt viser markerte biologiske aktiviteter som omfatter adrenalin-stimulerende aktivitet, lipotropisk aktivitet og melanocytisk-stimulerende aktivitet, og disse er overlegne sammenlignet med naturlig corticotropin og med tidligere kjente bes: tete peptider.

Prover på de adrenalire-stimulerende aktivitetene av de foreliggende corticotropin-peptidene ble utfort i overensstemmelse med fem forskjellige metoder, sammenlignet med det naturlige corticotropin fra tau (as~ACTH) og Gly1-ACTH(1-18)-NH2 /Bull. Chem. Soc. Japan ^3 196 (1970)_7. Den adrenale ascorbinsyre-depleterende aktivitet i hypofysectomisert rotte ble bestemt ved metoden i henhold til United States Pharmacopeia XVII, 1V7 (1965). Den in vivo steroidogenetiske aktivitet ved intravenos tilforsel til hypofysectomisert rotte ble bestemt ved metoden til Lipscomb og Nelson /Endocrinol., 71 13 (1962)^7 med en mindre modifikasjon

/A. Tanaka og C.H.Li, Endocrinol. Japonica 13 180 (1966)/. Den in vivo steroidogeniske aktivitet ble også bestemt i deksametason-pentobarbital-forhåndsbehandlet mus /å. Tanaka og N. Nakamura, "Integrative mechanism of neuroendocrine system", Hokkaido University Medical Library Series. 1 *+9 (1968)/. I tillegg ble ieroidogenetisk aktivitet ved intramusculær tilforsel til hypofysectomisert rotte bestemt, hvor et peptid-preparat ble injisert inn i lårmusklen og en blodprove ble tatt fra abdominal aorta 30 minutter etter injeksjonen. Videre ble den steroidogenetiåe aktivitet ved intravenos tilforsel til hypofysectomisert rotte bestemt på en slik måte at et peptid-preparat ble injisert inn i femoral-venen og en blodprove ble tatt fra abdominal-aorta 30 minutter etter injeksjonen. Under eksperimentene ble the Third USP Corticotropin Reference Standard anvendt som standard og produksjonen av 11-hydroksycorticosteroider (11-OHCS) ble bestemt ved hjelp av fluorofoto-metrisk metode til Peterson ZJ. Biol. Chem. 225 25 (1957)-7. Fox hver provemetode ble flere bestemmelser utfort og de uavhengige oppnådde data ble underkastet statistisk behandling ved hjalp av Sheps og Moore fremgangsmåten /J. Pharmacol. Extl. Therap. 128. 99 (1960)7. Resultatene fra disse prover på

de foreliggende corticotropin-peptidene er gitt i tabell 1 , i sammenligning med naturlig cort1 icotropin (a s-ACTH) og beslektet kjent corticotropin-peptid Gly -ACTH(1-18)-NH2„

Merk: Aktivitetene er uttrykt i USP-enheter/mg, i forhold

til Third USP Corticotropin Reference Standard. Forkortelsene har folgende betydning: I=Ibu -i-ACTH(1-18)-NH2, II=Ibu<1->0rn<1>^-ACTH(1-l8)-NH2, III=Ibu<1->ACTH(1-27>-0H.'

Som vist i tabell 1 er corticotropin-peptidene fremstilt i folge oppfinnelsen meget aktive i alle henseender hva angår adrenal-stimulerende aktiviteter. Styrken er mer enn dobbelt så stor som for Gly -ACTH(1-18)-NR"2 og naturlig corticotropin når den blir undersakt ved adrenal ascorbin-syre-depleterende metode og ved in vivo steroidogenisk metode. Videre må det bemerkes at aktivitetene av I, II-og III beregnet ved 11-hydroksycorticosteroid-nivå i rotte-periferisk blod er uforandret enten peptidene blir tilfort intravenost eller irtramuskulært. For Gly<1->ACTH(1-18)-

NH2 er imidlertid styrkeforholdet for intramuskulær vs. intravenos tilforsel omtrent 1/3. Disse fakta betyr at /i-a-aminoisosmorsyre^-corticotropin-peptidene som her omhandlet er mer motstands-

dyktige overfor virkningen av aminopeptidase i vevet enn det analoge 1-glycin.

Corticotropin-peptidene som her omhandlet viser markert lipotropisk aktivitet, og dette er summert opp i tabell 2 og sammenlignes med Gly -ACTH(1-18)-NH2 og naturlig corticotropin (cxs-ACTH) - fra sau.

Merk: Den lipotropiske aktivitet ble bestemt i overensstemmelse med metoden beskrevet av Tanaka et al ZArch.Biochem. Biophys. 22 29^ (1962)J7,. med rotte-epididymal-adiposevev og kanin-perirenal^adiposevev. Okningen i konsentrasjonen av ikke-fore stret fettsyre i både medium og vev er parameteren. Aktiviteten uttrykkes som minste effektive dose pr. 50 mg vev. Folgende forkortelser er benyttet: I=lbu<1->ACTH(1-18)-NH2, II=Ibu<1->Orn<1>^-ACTH(1-18)-NH2, III=Ibu<1->ACTH(1-27)-0H.

Forsok'av in vitro melanocyt-stimulerende aktivitet av £\-a-aminoisosmorsyre.7-corticotrop:Ln-peptider ble utfort ifolge metoden til K. Shizume, A.B. Lerner og T.B. Fitzpatrick /Éndocrinol. 5^ 553 (195<!>+)-7\ ved bruk av isolerte hudfragmenter av frosk (Rana-pipiens). Resultatene er angitt i tabell 3, og sammenlignet med Gly1-ACTH(1-18)-NH"2 og ACTH(1-2^f)-0H ("Synacthen" fra Ciba Ltd.). En ren fremstilling av naturlig cx-melanocyt-stimulerende hormon (as~MSH) ble benyttet som referansestandard.

Den melanocyt-stimulerende aktivitet av de foreliggende corticotropin-peptidene er hoyere enn for Gly -ACTH(1-18)-NH2 og ACTH(1-2lf)-0H.

Biologisk halveringstid for corticotropin-peptidene og naturlig corticotropin ble bestemt med den in vitro lipotropiske aktivitet fk. Tanaka, B.T. Pickering og C.H. Li, Arch. Biochem. Biophys. 99 29^t (1962)7 som en parameter. Resultatene er summert opp i tabell lf. Tabell h . Halveringstid for corticotropin og beslektede syntetiske peptider som in vitro lipotropiske midler.

Merk: a) En peptidprove ble injisert intravenost inn i

lavere vena-cava av rotter, og blodprover, som ble tatt fra abdominal-aorta ved passende tidsintervaller og - sur gjort', ble undersakt for den in vitro lipotropiske aktivitet.

b) En prove ble lost i friskt plasma fra bedovet rotte eller i Krebs-Ringer bikarbonat-buffer som inneholder

lårmuskel-fragmenter av rotten, Dovin-serumåTbumin og glucose. Disse blandinger ble inkubert ved 37°C og provene som ble tatt fra blandingene etter passende tidsintervall ble undersakt for den in vitro lipotropiske aktivitet.

Verdiene som er angitt ovenfor viser at halveringstidene for /1-cx-aminoisosmorsyre/corticotropin-peptider er omtrent lik det naturlige corticotropin og er vesentlig lenger enn for Gly -ACTH (1-18)-NH2? og dette beviser at amino-terminal-substitusjonen ved oc-aminoisosmor syre i et corticotropin-peptid forbedrer peptidets biologiske egenskaper vesentlig ved forlengelse av virkning og potensiell forokning.

/i-a-aminoisosmorsyre_7-corticotropin-peptider som er fremstilt ifolge oppfinnelsen kan bli omdannet til det tilsvarende kompleks med et kompleks-dannende tungt metall (f.eks. sink, kobber, jern, nikkel, kobolt), en kompleks-dannende polyaminosyre (f.eks. poly-glutaminsyre, poly-aspartinsyre, kopolyglutamyl-tyrosin, kopoly-aspartyl-glutaminsyre) eller med en blanding av disse. Kompleksene viser en utmerket langt-virkende egenskap overfor et vanlig peptid. Det tunge metallkompleks kan bli fremstilt ved å behandle det foreliggende corticotropin-peptid med en tung metall-forbindelse som f.eks. et tungt metallhalogenid (f.eks. sinkklorid, kobberklorid, jernklorid, koboltklorid, nikkelklorid), acetat (f.eks. sinkacetat), sulfat (f.eks. sinksulfat) eller hydroksyd (f.eks. sinkhydroksyd) i et omtrent blandingsforhold av 1:0,1-100 beregnet som vekt, under svak sur betingelse, fortrinnsvis ved pH 6,5 til 7,0, på en vanlig måte. Blant de tunge metaller er sink foretrukket. Polyaminosyrekomplekset kan bli fremstilt ved å behandle det foreliggende corticotropin-peptid med en polyaminosyre i et mengdeforhold av 1:0,1-100 beregnet som vekt under svakt sur betingelse, fortrinnsvis ved pH 6,5 til 7,0, på en vanlig måte. Polyamino-syrene som benyttes er homopolymere eller kopolymerer av aminosyrer og de kan være av L-, D-, eller DL-konfigurasjon. Eksanpler på foretrukne polyaminosyrer er poly-L-glutaminsyre, poly-D-glutaminsyre, poly-DL-glutaminsyre, poly-L-aspartinsyre, poly-D-aspartinsyre, poly-DL-aspartinsyre, kopoly-L-glutamyl-L-tyrosin og kopoly-L-aspartyl-L-glutaminsyre. Foretrukket molekylvekt av polyaminosyren er omtrent 1.000 til 100.000, fortrinnsvis 2.000 til 6.000. Det er foretrukket å benytte en polyaminosyre som forut er blitt noytralisert med et alkali (f.eks. natriumhydroksyd). Andre passende tilsetnings-stoffer som f.eks. konserveringsmiddel (f.eks. benzylalkohol, fenpl, timerosal), buffer (f.eks. citrat, fosfat, karbonat) eller isotoniserende middel (f.eks. natriumklorid) kan bli tilsatt til fremstillingen av komplekset.

Det skal bemerkes at resultatverdiene som er angitt ovenfor

bare er vist som eksempler. Siden de andre forbindelsene av denne oppfinnelse såvel som de som er beskrevet ovenfor har omtrent de samme egenskaper og fordeler som et medikament, er Z"1 -a-amino-isosmorsyrey-corticotropin-peptidene ifdlge oppfinnelsen meget nyttige og fordelaktige som terapeutisk middel, f.eks. for behandling av akutt eller kronisk artikulær reumatisme, alergiske lidelser eller adrenarker hos mennesker og husdyr, eller for undersøkelsen av adrenocorticalfunksjonen.

De foreliggende corticotropin-peptidene, syreaddisjonssaltene og kompleksene kan bli tilfort oralt eller parenteralt på vanlig kjente måter, f.eks. ved injeksjon, væske, suspensjon, emulsjon eller aerosol, valgt med passende bærere, stabiliseringsmidler, emulgatorer, konserveringsmidler, buffere, isotoniserende og/eller fuktemidler, hvor en terapeutisk aktiv mengde av den aktive bestanddel er innesluttet.

Den effektive dose kan lett bli bestemt av medisinere på basis av de angitte data. F.eks. varierer en typisk klinisk dose av peptidene ifolge oppfinnelsen fra omtrent 0,2 U/kg til 0,8 U/kg for normale voksne personer. Det foreliggende corticotropin-peptid er med fordel tilfort i en dose i form av en injeksjon,

og tilføringen blir gjentatt så ofte som nodvendig i overensstemmelse med legens angivelse.

De folgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel 1.

(a) Benzyloksykarbonyl- a- aminoisosmorsyre.

Til en losning av oc-aminoisosmorsyre (5516 g) og vannfri natriumkarbonat (5>30 g) i 1N natriumhydroksyd (50 ml) blir det tilsatt benzylklorformat (9,39 g) ved 0°C, og blandingen blir rort i 3 timer. Reaksjonsblandingen blir vasket med eter for å fjerne overskudd av reagens, surgjort med 6N saltsyre og ekstrahert med etylacetat. De organiske ekstrakter blir blandet, torket over natriumsulfat og inndampet under redusert trykk for å gi en krystallinsk rest, som blir rekrystallisert i etylacetat-petroleumeter og gir 8,75 g av det onskede produkt med et smeltepunkt 65 til 66°C.

Analyse beregnet for C^H^NO^: C=60.75, H=6.37, N=5.90.

Funnet: C=61.0^, H=6.36, N=6.07.

b) t- butyloksykar bonyl- a- amino i s o sindr syr e.

Til en lbsning av cc-aminoisosmorsyre (^,7® og natriumbikarbonat

(^,25 g) i 1N natriumhydroksyd ( k6 ml) og dioksan (30 ml) blir det tilsatt dråpevis en dioksanlosning av t-butyl-azidformiat (7?25 g) , og blandingen blir omrort ved <*>+0 til 50°C i 5 dager.

En ytterligere mengde av t-butyl azidformiat (6,6 g) og 1N natriumhydroksyd (^6 ml) blir tilfort og blandingen blir omrort i 2 dager ved samme temperatur. Reaksjonsblandingen blir konsentrert under redusert trykk for å fjerne det organiske løsningsmiddel. Konsentratet blir avkjblt og surgjort med is-kald <*>+N saltsyre til pH 3- Losningen blir ekstrahert med etyl-adetat og den organiske lbsning blir torket over natriumsulfat. Etter inndamping av losningen blir de resulterende krystaller rekrystallisert i eter og gir 0,82 g av det onskede prodakt med smeltepunkt 119 til 120°C.

Analyse beregnet for C^H^NO^<:> C= 53-19, H=8A3, N=6.89.

Funnet: 0=53.6^, H=8.39, N=7.19-

c) t- butyloksykarbonyl- 0- benzyl- L- tyrosin- p- nitrofenylester.

Til en lbsning av t-butyloksykarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin (2,97.g)

og p-nitrofenpl (1,12 g) i etylacetat blir det tilsatt en etyl-acetatlbsning av N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (1,65:g) ved 0°C, og blandingen blir holdt ved !+°C i 3. dager. Det utskilte, dicykloheksylurea blir fjernet ved filtrering, og filtratet blir inndampet under redusert trykk..Den dannede faste rest blir

suspendert i varm etanol og krystallene som,faller ut ved avkjbling blir filtrert fra, vasket med kald etanol og torket under redusert trykk og gir den onskede ester (3539!g) med et smeltepunkt Ao til

til l<i>fi°c. A/p2-0.3+0A° (c=0.983, etylacetat).

Analyse kalkulert for C^B^gN^: C=65. 8k, H=5.73, N=5.69-

Funnet: 0=65.93, H=5-73, N=5.67. d) Benzvloksykarbonyl- a- aminoisobutyryl- L- tyrosin- hydrazid.

Benzyloksykarbonyl-cx-aminoisosmorsyre (1.5^ g) og L-tyrosin-metylester (1.27 g) blir lost i acetonitril, og til losningen blir det tilsatt en losning av N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (1,3^ g) i acetonitril ved 0°C. Blaningen blir holdt ved h°C natten over. Det utfelte N,N'-dicykloheksylurea blir fjernet ved filtrering, og filtratet blir inndampet under vakuum for å

gi en rest, som blir lost i etylacetat. Losningen blir vasket med 1N saltsyre og 5% natriumbikarbonat, torket over natriumsulfat og inndampet under redusert trykk og gir dipeptidesteren som en sirupformet rest. Resten blir lost i etanol 0 5ml) og hydrazinhydrat (0,8 ml) blir tilsatt. Etter at reaksjonsblandingen har blitt holdt ved romtemperatur i 2 dager blir det tilsatt vann for å skylde ut det onskede dipeptid-hydrazid som krystaller (2.35 g). Rekrystallisasjon i vandig etanol gir dat onskede produkt med et smeltepunkt 16^- til 165°C /a/^l . h±0. 7° (c=1 .078, metanol).

Analyse kalkulert for C21H26\°5: c=6°-86' H=6-32, N=13.52.

Funnet; 0=60.95, E=6M , N=13.31.

e) t- butvioksykarbonvl- O- benzyl- L- tyrosvl- L- serin- metylester.

Til en is-kald losning av L-serinmetylester-hydroklorid (1.03 g)

i dimetylformamid (8 ml) blir det tilsatt trietylamin (0.92 ml)

og det utskilte trietylamin-hydrokloridet blir filtrert fra. t-butyloksykarbonyl-O-benzyl-L-tyrosin-p-nitrofenyl-ester (2.96 g) blir tilsatt til filtratet med en del dimetylformamid og blandingen blir holdt ved ^C i 2 dager. Etter fjernelse av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk med en bad-temperatur av h5°C til 50°C blir resten lost i etylacetat og losningen blir vasket

i rekkefolge med. is-kald 1N saltsyre, vann, 2N vandig ammoniakk og vann, torket over natriumsulfat og inndampet under redusert trykk. Den dannede gelatinaktige masse blir utfelt fra etylacetat-petroleumeter. Rekrystallisasjon fra metanol-vann gir det rene dipeptid (2.75 g) med et smeltepunkt 73 til 77°C. /a/^?7•7+0.5°

(0=1.0^6, metanol).

Analyse kalkulert for C25H32<N>2°7: 063.5^, H=6.83, N=5.93.

Funnet: 0=63.36, H=6.97, N=5.71. f) Benzyloksykarbonyl-a-aminoisobutyryl- O-benzyl-L- tyrosyl-L- serin- hydrazid. t-butyloksykarbonyl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-serin-metylester (2.08g) blir lost i 1N saltsyre i eddiksyren. (20 ml), og blandingen blir satt til side ved romtemperatur i 30 minutter. Inndampingen av losningsmidlet gir en oljeaktig rest, som stivner ved behandling med eter. Faststoffet som har blitt filtrert fra blir lost i en blanding av vann (6 ml) og diklormetan (20 ml) og til denne lbsning blir det tilsatt is-kald 50% kaliumkarbonat (6 ml). Blandingen blir godt rystet og den organiske fase skilt ut. Den organiske lbsning blir torket over natriumsulfat og inndampet under redusert trykk.

Den krystallinske 0-benzyl-L-tyrosyl-L-serin-metyl-ester oppnådd ovenfor blir lbst i acetonitril sammen med bezyloksykarbonyl-a-aminoisosmbrsyre (1.0*+ g) , og til losningen blir det tilsatt en acetonitril-lbsning av N, N'-dicykloheksylkarbodiimid (0.91 g)

ved 0°C. Blandingen blir holdt ved ^f°C natten over. Det utfelte dicykloheksylurea blir filtrat fra og filtratet blir inndampet under redusert trykk. Resten blir lbst i etylacetat og losningen blir vasket i rekkefolge med 1N saltsyre, vann og 5% natrium-bikarbonat, torket over vandfri natriumsulf at og inndampet under redusert trykk for å gi den urene tripeptidester, som vises på

et tynt-lag kromatogram (i etylacetat) i nærvær av liten mengde av tilsetningskomponent. Den urene ester blir så lost i etanol (20 ml) og hydrazinhydrat (1.0 ml) blir tilsatt. Reaksjonsblandingen blir satt til side ved romtemperatur i 2 dager og

deretter konsentrert under redusert trykk. Resten blir lost i etylacetat, vasket med vann og hurtig torket over natriumsulfat. Utfellingene som er skilt ut ved henstand blir filtrert fra,

vasket med kald etylacetat og eter og torket under redusert trykk for å gi det onskede hydrazid (1.91 g). Rekrystallisasjon fra etanol gir det rene produkt med et smeltepurkt 151 til 153°C«

/a/22 -2.2+0.*+° (c=1.062, eddiksyre).

Analyse kalkulert for C^H^N^O : <0=6>2.93, H=6.30, N=11.8<l>f.

Funnet: 0=62.98, H=6.31 , N=11.81. g) t- butyloksykarbonyl- t^ benzyl- L- glutaminsyre- p- nitrofenvl- ester.

t-butyloksykarbonyl-T-benzyl-L-glutaminsyre-dicykloheksylamin-

salt (9.0 g) blir ristet med "Dowex" 50W x 8 (H<+>form, våttvolum 18 ml) i 60% etanol i 30 minutter. Etter at harpikset har blitt fjernet ved filtrering, blir filtratet inndampet under redusert trykk og gir en rest som blir lost i eter. Losningen blir torket over natriumsulfat og inndampet under redusert trykk og gir den frie syre kvantitativt. Syren blir lost i etylacetat sammen med p-nitrofenol (2A g) og til denne losning blir det tilsatt N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (3.6 g) ved 0°C Reaksjonsblandingen blir satt til side natten over. Etter fjernelse av det utfelte dicykloheksylurea ved filtrering, blir filtratet inndampet under redusert trykk og gir en rest, som blir krystallisert i etanol. Rekrystallisasjon fra samme løsningsmiddel gir den aktiverte ester, (7.0 g) i en ren form med et smeltepunkt 118 til 11:9°C. /«7p8-33.1+0.7° (c=1.082, metanol).

Analyse kalkulert for C^H^NOg: C=60.26, H=5.72, N=6.11.

Funnet: 0=60.38, H=5.80, N=6.29. h) t-butyloksykarbonyl-V1 benzyl-L-glutamyl-L-hi stidyl-L- fenylalanyl- L- arginyl- L- tryptofyl- glycin.

Til en losning av L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin-acetat (1.20 g) i dimetylformamid (10ml) ble det tilsatt t-butyloksykarbonyl-T^benzyl-L-glutaminsyre p-nitrofenylester (1.03 g) og dimetylformamid (25 ml) og blandingen ble holdt ved ^C i 3 dager. Den resulterende losning ble tilsatt dråpevis til en blanding av etylacetat-eter (1:1 som volum)

(200 ml). De dannete utfellinger ble samlet ved filtrering, vasket med etylacetat og eter, og torket under redusert trykk, (utbytte 1.86 g). Disse utfellinger ble på nytt lost i 50% eddiksyre (omtrent 10 ml) og etanol (omtrent 100 ml) ble tilsatt til dette. De dannete utfellinger ble samlet ved filtrering og lyofilisert fra eddiksyre med utbytte 1,37 g av det onskede produkt. /a/22-23.9+0.6° (c=1.020, 50% eddiksyre).

Analyse kalkulert for C^H^N-^O-, 1 . CH^COOH. 3R"20: 0=56.07, H=6.57, N=11+.81, CH3C0=3.79.

Funnet: C=56.<l>+0, H=6.22, N=l5.+0, 01^00=3.25.

Utgangs-peptapeptidet, dvs. L-histidyl-L-fenyl-alanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin kan bli fremstilt ved metoden beskrevet i Bull. Chem. Soc. Japan 38 11+8 (1965) eller i det japanske patent nr. 17117/1969 eller ved folgende metode.

t-butyloksykarbonyl-L-fenylalanyl-N Q-tosyl-L-arginyl-L-tryptofyl- glycin- metylester.

t-butyloksykarbonyl-L-fenylalanyl-N Q-tosyl-L-arginin-hydrazid (5-9 g) /fremstilt ved metoden som beskrevet i Bull. Chem. Soc. Japan 3Z A65 096+1/ blir behandlet med natriumnitrit, og det utfelte azid blir omsatt med L-tryptofyl-glycin-metyl-ester /fremstilt ved katalytisk hydrogenering av benzyloksy-karbonyl-L-tryptofyl-glycin-metyl-ester (+.1 gl/i etylacetat og gir 5-3 g av det onskede produkt med et smeltepunkt 115 til 120°C. /a/p<7->A.8+0.3<O> (c=2.077, metanol).

Analyse kalkulert for C^H^NgO^: <0=>59.12, H=6.29, N=13.+5, S=3-85.

Funnet: C=58.82, H=6.55, N=13.1 5, S=3.76.

Benzyloksykarbonyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-N n-tosyl-L-arginyl-L- tryptofvl- glycin- metyl- ester.

Den ovenfor fremstilte tetrapeptid-metyle ster (5.0 g) ble behandlet med maursyre ved romtemperatur i h timer. Den dannete tetrapeptid-ester ble kondensert med benzyloksykarbonyl-L-histidin-azid (fremstilt fra 2.7 g av det tilsvarende hydrazid). Etter fullførelse av reaksjonen ble det onskede produkt krystallisert fra etanol. Utbyttet 3«9 g med et smeltepunkt 188-190°C. /*a7p7-23.++0.60 (c=1 .037, dimetylformamid).

Analyse kalkulert for C^R"^-^ 101QS: C=59.81, H=5.72, N=15.3+, S=3.19.

Funnet: 0=59-57, H=5.59, N=15.37, S=3.27.

Benzyloksykarbonyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-N Q-tosyl-L-arginyl-L- tryptofyl- glycin.

Den ovenfor fremstilte pentapeptid-ester (2.2 g) blir forsåpet

i vandig metanol i 30 minutter under anvendelse av to ekvivalente mol av natriumhydroksyd. Etter fullforelse av reaksjonen blir produktet krystallisert fra, vandig metanol'og gir 1,6 g av det onskede produkt med et smeltepunkt 175 til 178°C. A/^-21 A+O.60 (c=1.066, dimetylformamid).

Analyse kalkulert for Clf$H^N110^S.B^O: 0=58.38, H=5-70, N=15.28, S=3.18.

Funnet: 0=57.95, H=5.83, N=15.19, S=3-58.

L- histidyl- L- fenylalanyl- L- arginvl- L- tryptofyl- glycin.

Det ovenfor - fremstilte pentapeptid (1.23 g) ble behandlet med

hydrogenfluorid I nærvær av anisol (1.3 ml) ved 0°C i 30

minutter. Det avblokkerte pentapeptid-hydroklorid blir sendt gjennom en kolonne av "Amberlit" CG- hOO (acetatform) for å omdannes til det tilsvarende acetat. Acetatet blir sendt gjennom en kolonne av karboksylmetyl-cellulose og elutert med en ammoniakk-acetat-buffer som har en lineær konsentrasjonsgradient fra 0.01 til 0.1 M. Utbytte O.76 g. A/27-10.5+1 .0° (c=1.0+3, 1N saltsyre).

Aminosyreforhold ved leucin-aminopeptidase-digestion: histidin 1.00, fenylalanin 1.00, arginin 1.02, tryptofan 1.00, glycin 1.07.

i) t- butyloksykarbonyl- L- metionin- p- nitrofenyl- ester.

t-butyloksykarbonyl-L-metionin-dicykloheksylamin-salt (10.8 g) blir behandlet med "Dowex 50W'x 8 (H form) på samme måte som beskrevet i eksempel 1 (g). Den dannede oljeaktige syre og p-nitrofenol (3.5 g) blir lost i etylacetat og til losningen blir det tilsatt en etylacetat-ldsning av N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (5.2 g) ved 0°C. Blandingen blir satt til side ved k°C natten over. Det utfelte dicykloheksylurea blir filtrert fra og filtratet blir inndampet under redusert trykk og gir en rest,

som blir krystallisert i etanol. Rekrystallisasjon i etanol gir den aktive ester (7.8 g) med et smeltepunkt 96 til 97°C. /o7<27->+8.3+0.9° (c=1£20, metanol).

Analyse kalkulert for C-jgHggNgOgS: 0=51.88, H=5.99, N=7.56.

Funnet: 0=52.05, H=5.97, N=7.68.

j) t-butyloksykarbonyl-L-metionyl-T-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl- L- fenylalanyl- L- arginyl- L- tryptofyl- glycin.

t-butyloksykarbonyl-Y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin (1.26 g) blir lost i trifluoreddiksyre (6 ml) og blandingen blir holdt ved romtemperatur i 30 minutter. Etter at reaksjonsblandingen er avkjolt på et isbad frembringer tilsetningen av eter det partielt avblokkerte heksapeptid som en utfelling (1.3+ g)* Utfellingen blir lost i dimetyl-

formamid (10 ml) og til losningen blir det tilsatt trietyleamin (0.+6 ml) og t-butyloksykarbonyl-L-metionin-p-nitrofenyl-ester (0.7+ g). Blandingen blir satt til side ved +°C i 2+ timer og deretter tilsatt til en is-kald losning av etylacetat-eter (1: + ved volum, 250 ml). De dannete utfellinger blir filtrert fra, vasket med eter og torket under redusert trykk, (utbytte 1.56 g). Produktet blir suspendert i etanol 0 5 ml) og suspensjonen blir oppvarmet til kokepunktet. Etter avkjoling blir utfellingene samlet ved filtrering, vasket med kald etanol og eter og lyofilisert fra eddiksyre og gir 1.16 g av det onskede foj^ -I8.5+O.5

Analyse kalkulert for C^H,-,^ 0.,2S. CH^COOH. 2R"20: C=5+.23,

B>6.67, N=1+.18.

Funnet: C=5+.51, H=6.16, N=13.9+.

k) Benzyloksykarbonyl-oc-aminoisobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-Y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl- L- arginyl- L- tryptofyl- glycin.

En blanding av benzyloksykarbonyl-a-aminoisobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-serin-hydrazid (0.+7 g), 1N saltsyre (2 ml) og dimetylformamid (2 ml) blir avkjolt i et isbad og til losningen blir det tilsatt dråpevis is-kald 2M natrium-nitrit (0.++ ml). Blandingen blir omrort ved 0°C i + minutter og deretter ' ekstrahert med'.is-kald etylacetat. De organiske ekstraktene blir blandet, vasket med is-kald natriumbikarbonat og torket over natriumsulfat.. Den dannete losning blir blandet med en losning av L-metionyl-Y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin-triflJDracetat /fremstilt kvantitativt fra 0.+ mmol av. t-butyloksykarbonyl-derivat (j), ved behandling med trifluoreddiksyre (3 ml)/ og trietylamin (0.25 ml) i dimetylformamid (10 ml). Blandingen blir konsentrert under redusert trykk ved en badtemperatur på 20°C inntil den blir klar, og deretter blir losningen holdt ved +°C i 2+ timer. Meste parten av losningsmidlet blir fjernet ved inndamping under redusert trykk ved en badtemperatur av +5°C. Utfellingene (O.67 g) som utskilles ved tilsetning av eter blir utfelt på nytt fra metanol-etanol-vann og gir 0.62 g av det urene peptid. Peptidet blir underkastet en kromatografering i en kolonne av silikagel (merck 0.05 til 0.2 mm, 150 g) ved bruk av et lbsningsmiddelsystem av n-butanol-eddiksyre-vann i forholdet +:'1:1 beregnet som volum, og 5 nil fraksjoner blir samlet opp. Det onskede produkt blir oppdaget ved å måle absorpsjonen av 280 mn eller ved tynnskikts-kromatografering i et løsningsmiddel-system av n-butanol-eddiksyre-vann A:1:1 beregnet som volum). Fraksjoner (ror nr. 66-90) som inneholder dekapeptidet blir samlet og konsentrert under redusert trykk for å gi en gelatinaktig-rest, som blir lyofilisert fra eddiksyre og gir 0.51 g av det onskede produkt. Produktet gir et enkelt utslag (Rf=0.M+, butanol-eddiksyre-vann i forholdet 4-:1:2 beregnet som volum, silicagel tynt-skikt) på et kromatogram. Hydrokloridet av produktet har OD r>

en spesifikk optisk dreining lik /qc7D -2+.7+1.2 (0=0.53^, dimetylformamid).

Analyse kalkulert for C82H9gNl6017S.2CH COOH.lfHgO: 0=57.26, H=6.37, N=12A2.

Funnet: 0=57.31, H=5.82, N=12.33. 1) a-aminoi sobutyryl-L- tyrosyl-L-s eryl-L-me tionyl-L- glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L- arginin- amid.

Til en losning av benzyloksykarbonyl-a-aminoisobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-Y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin (0.32 g) som er fremstilt ovenfor i eddiksyre, blir det tilsatt 1N saltsyre i eddiksyre.(0A ml) og blandingen blir oyeblikkelig lyofilisert. Den lyofiliserte substans blir torket over natriumhydroksydperler under redusert trykk og gir dekapeptid-hydrokloridet, som blir lbst i dimetylformamid (3 ml) sammen med N-hydroksysuccinimid (QO83 g). Til denne lbsning blir det tilsatt en lbsning av N,N'-dicykloheksylkarbodi imid (0.15 g) i dimetylformamid (2 ml), og blandingen blir satt til side ved h°C natten over. Det utfelte dicykloheksylurea blir samlet ved filtrering og filtratet blir tilsatt til is-kald etylacetat (50 ml) og eter (50 ml). De dannete utfellinger blir samlet ved filtrering, vasket med etylacetat og eter og torket under redusert trykk og gir den dekapeptid-aktive ester (O.36 g).

Triacetatet av N<£->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N€-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-N*-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin-amid /fremstilt kvantitativt fra

0.12 mmol av det tilsvarende Na<->benzyloksy-karbonylderivat ved katalytisk hydrogenering i folge metoden beskrevet i Bull. Chem. Soc. Japan 22 882 (1966)/ blir lost i dimetylformamid (2 ml) og trietylamin (0.18 ml) blir tilsatt. Losningen blir blandet med en dimetylformamid-losning av den aktive ester oppnådd ovenfor og blandingen (totalt volum ='^ml) blir holdt ved h°C i h8 timer. Reaksjonsblandingen blir deretter tilsatt til is-kald etylacetat (100 ml) og de utskilte bunnfall blir samlet ved filtrering, vasket med etylacetat og eter, lyofilisert fra eddiksyre og torket over natriumhydroksyd-perler under redusert trykk og gir det beskyttede oktadekapeptid (0.56 g).

Det ovenfor fremstilte beskyttede oktadekapeptid blir tilsatt til et reaksjonskar (laget av fluorinert polyetylen) med L-metionin (0.1 g) og anisol (0.5 ml) og hydrogen-fluorid blir tilfort til karet, som er plassert i et tort is-acetonbad. Reaksjordblandingen (omtrent 10 ml) blir omrort ved 0°C i 90 minutter, inndampet under vakuum og gir en sirupaktig rest, som blir lost i is-kaldt vann. Losningen blir vasket med etylacetat og deretter sendt gjennom en kolonne (1 .7 x 12 cm) av"Amberlite" CG-+00 (acetatform). Kolonnen blir vasket med porsjoner av vann. De oppsamlete

vandige losninger blir konsentrert til omtrent 20 ml under redusert trykk og lyofilisert. Det urene avblokkerte peptid således dannet (0.65 g) blir underkastet en rensing, kromatografering i en kolonne (2.7 x 27 cm) av karboksylmetylcellulose (Serva Co., 0.56 meq/g) ved bruk av en ammoniumacetat-buffer (pH 6.8, 2000 ml) med en lineær konsentrasjonsgradient fra 0,02 til 0,6 M. Hver fraksjon (10 ml/proveror) blir samlet og absorpsjonen ved 280 rap. blir notert. Fraksjonene som svarer til en hovedtopp (proveror nr. 156-180) og dennes skulder (proveror

nr. 181-200) blir separat oppsamlet og hovedmassen av lbsnings-iidlet blir fjernet ved inndamping under redusert trykk ved en bad-temperatur av 50-55°C Restene blir lyofilisert til konstant vekt og gir 189 mg (F-I) og 76 mg (F-II) av farvelost pulver fra de forste fraksjonene og fra de siste respektivt. F-I (189 mg) blir kromatografert på nytt i en karboksylmetylcellulose-kolonne (2,2 x 25 cm) på samme måte som beskrevet ovenfor for å

gi det rene peptidet (137 mg, F-1-1) fra en enkel topp. En liten skulder av toppen gir F-I-2 (37 mg). F-II (76 mg) og F-1-2 (37 mg) blir blandet og kromatograferingen blir gjentatt to ganger for å oppnå 29 mg av det onskete peptid. Totalt utbytte av oktadeka-peptidamidet utgjor således 166 mg. /«7^-58A+1.9° (c=0.5A, 0.1N eaaiksyre).* ^.HC1=279 W =25.1) .X^^ =288

<E<!L=>19.7); *£;i"<a>°<H>=281 «lL=25-2).288

Peptidet oppforer seg som en enkel komponent overfor ninhydrin-, Pauly-, Ehrlich-, Sakaguchi- og metionin (Ptlg")-reagens'er i tynn-skikts-kromatografering (losningsmiddelsystem: n-butanol-eddiksyre-pyridin-vann i forholdet 30:6:20:2+ beregnet som volum) og i papir-elektroforese (600 V/36 cm, i 2N eddiksyre). Aminosyreforholdene i syrehydrolysatet er folgende (6N HC1, 105°C,

<1>+0 timer): serin O.83, glutaminsyre 1.00, prolin 1 .0 7, glycin 2.10, a-aminoisosmorsyre 0.99? valin 1.00, metionin 1,02,

tyrosin 0.97, fenylalanin 1.0+, lysin 3.17, histidin 0.92,

arginin 2.90. Tryptofan/tyrosin-forholdet i intakt oktadekapeptid-amid ble bestemt spektrofotometrisk til 1.12.

Når N<*->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N<*->t-butyloksykarbonyl-L- ly syl-N*-- t-butyl oksykarbonyl-L- lysyl-L-arginyl-L-arginin /fremstilt ifolge metoden beskrevet i Bull. Chem. Soc. Japan 22. 882 (1966X7 blir benyttet som det C-terminale oktapeptid i den ovenfor nevnte reaksjon blir det tilsvarende dannet a-aminoisoburyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-ar ginyl-L-tryptof yl-glycyl-L-ly syl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-ar ginyl-L-arginin.

Eksempel 2.

(a) Na"benzyloksykarbonyl-Ne- t-butyl oksykarbonyl-L-lysyl-L-proiyl-L-valyl-glycyl-N<*->t-butyloksykarbonyl-L-ornitin-metyl- ester.

Na<->benzyloksykarbonyl-lA-t-butyloksykarbonyl-L-ornitin-metyl-ester /i.20 g, smeltepunkt 69-70°C, foj^-10.6+0. 5° (c=1 .092, metanol)./ blir hydrogenert over palladium-sort katalysator i metanol som inneholder 10% eddiksyre i 2 timer. Inndamping av losningsmidlet under redusert trykk gir W^-t-butyloksykarbonyl-L-ornitin-metyl-ester-acetat som en sirupaktig rest, som blir behandet med 50% vandig kaliumkarbonat i diklormetan ved 0°C.

Det organiske lag blir torket over natriumsulfat og inndampet under redusert trykk ved en bad-temperatur av 20°C. Den dannete rest blir lost i diklormetan (10 ml) og til losningen blir det tilsatt Na<->benzyloksykarbonyl-N^-t-butyloksy-karbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycin (1.83 g), som er fremstilt i overensstemmelse med metoden beskrevet i Bull. Chem. Soc. Jpan 1<*>+71 (196+). Til losningen blir det tilsatt en losning av N,N'-dicykloheksylkarbodiimid (0.60 g) i diklormetan ved 0°C og blandingen blir satt tfl. side ved +°C i 2 dager. Etter fjerning av det utfelte dicykloheksylurea ved filtrering, blir filtratet konsentrert under redusert trykk og gir en sirupaktig rest. Resten blir lost i etylacetat, og vasket med is-kald 1N saltsyre og 1M natrium-bikarbonat, torket over natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk. Den dannete rest blir igjen lost i etylacetat (30 ml) og blandet med eter (30 ml) for å gi den onskete pentapeptidmetyl-estrien ren form. Utbytte 2.2+ g. focj^ 6-55.9+0.9° (c=1.062, metanol).

Analyse kalkulert for <C>^<H>^<N>,<.>^2<:><C=>58.52, H=7.83, N=11.37.

Funnet: C=58.52, H=8.08, N=11.33. b) N -benzyloksykarbonyl-Nfc-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^-t-butyloksykarbonyl-L-ornitin-hydrazid.

Den ovenfor fremstilte pentapeptid-metyl-ester (2.2 g) blir lost

i metanol (30 ml) og hydrazin-hydrat (0.26 ml) blir tilsatt. Reaksjonsblandingen blir satt til side ved romtemperatur i 3 dager og hydrazidet felles ut ved tilsats av vann. Utfellingen blir samlet opp ved filtrering og krystallisert fra metanol-vann og gir det onskete hydrazid (2.1 g) med et smeltepunkt 175-180°C. C* J^-35-8+0.7° (0=1.0+0, dimetylformamid).

Analyse kalkulert for Ci+1 Hg-N 1 : 0=57.13, H=7.83, N=1+.62.

Funnet: 0=57.01, H=7.87, N=1+.+1. c) Na<->benzyloksykarbonyl-N<*->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N<*->t-butyloksykarbonyl-L-ornityl-N^-5- butyloksykarbonyl- L- lysyl- L- arginyl- L- arginin- amid- diacetat.

Til en is-kald losning av det ovenfor oppnådde pentapeptid-hydrazid (0.95 g) i 90% tetrahydrofuran (10 ml) blir det tilsatt is-kald 1N saltsyre (2."75 ml) og 2M natriumnitrit (0.61 ml). Blandingen blir satt til side ved 0°C i 5 minutter og justert

til pH 7A til 7.6 ved tilsats av trietylamin (O.38 ml). Til losningen blir det tilsatt en is-kald losning av W<£->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin-amid-triacetat /fremstilt fra 0.92 mmol av Na<->benzyloksykarbonyl-N^-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-N G -nitro-L-arginyl-N G-nitro-L-arginin-amid ved katalytisk hydrogenering i folge metoden beskrevet i Bull. Chem. Soc. Japan 32 882 (1966)7 og trietylamin (0.+2 ml) i 80% tetrahydrofuran (7.5 ml). Blandingen blir satt til side ved h°C i 3 dager og konsentrert under redusert trykk.. Den resulterende rest blir tilsatt med etylacetat (10 ml) og 1N eddiksyre (10 ml), og blandingen blir vel ristet. Den vandige fase blir ekstrahert 3 ganger med etylacetat, og de blandete ekstrakter blir konsentrert under redusert trykk til omtrent 10 ml. Konsentratet blir blandet med 1N eddiksyre og blandingen blir godt ristet. Konsentratet blir godt ekstrahert med vann-mettet n-butanol. Ekstraktet blir tirket over natriumsulf at og konsentrert under redusert trykk.

Den dannete rest blir lyofilisert fra eddiksyre og gir det onskete produkt,(0.85 g). /a/jp-^3.1+1.5° (c=0.5^0, 50% eddiksyre). Analyse kalkulert for C^B^ ^N^O^.aCH^COOHAE^O: 0=51.70, H=8.0+, N=15.96, 01^00=5.11.

Funnet: C=51.60, H=7.72, N=15.62, CH"3C0=+.30. d) a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornityl-L-lysyl-L-arginyl-L- arginin- amid.

Dekapeptidderivatet (O.32 g) fremstilt i eksempel 1(k) blir omdannet til den tilsvarende N-hydroksy-succinimidester på en vanlig måte. Den aktive ester (O.32 g) således fremstilt blir tilsatt til en losning av et pktapeptid (fremstilt fra 0.19 g av oktapeptid-derivatet fremstilt i eksempel 2 (c) ved katalytisk hydrogenering), og trietylamin (0.18 ml) i dimetylformamid. ( h ml). Reaks jordblandingen blir holdt ved k°C i 6h timer og deretter tilsatt dråpevis til is-kald etylacetat (100 ml). Den dannete utfelling blir samlet ved filtrering, vasket med etylacetat og eter og torket under redusert trykk for å gi det urene beskyttete oktapeptid (0.+9 g).

Det urene produkt (0,29 g) blir lost i flytende hydrogenfluorid (5-6 ml) sammen med metionin (0.06 g) og anisol (0.29 ml) ved en torr is-aceton-badtemperatur og blandingen blir omrort ved -0°C i 90 minutter, hvoretter hydrogenfluorid blir fjernet ved inndamping under redusert trykk. Resten blir lost i is-kaldt vann og lesningen blir vasket 2 ganger med etylacetat. Den resulterende vandige losning blir sendt gjennom en kolonne (1.7 x 20 cm) av "Amberlite" CG-+00 (acetatform) og kolonnen blir vaået med porsjoner av vann. Utstrømningene blir blandet, konsentrert under redusert trykk og lyofilisert for å gi det urene avblokkerte oktapeptid (0.3+ g).

Det urene oktadekapeptid (0.3+ g) blir underkastet en rensing ved kromatografering i en kolonne (1.7 x 36 cm) av karboksylmetyl-cellulose (Serva, 0.56 meq/g) ved bruk av en ammoniumacetat-buffer (pH 6.8) med en lineær konsentrasjons-gradient av 0.02 til 0.6 M (1500 ml). Fraksjonene (7.5 ml/proveror) blir samlet og absorpsjonen ved. 280 mu blir notert. Proverorene som tilsvarer, en hovedtopp blir samlet i to separate fraksjoner F-I (proveror 106-130) og F-II (proveror 131-155). Hovedmassen av løsnings-midler blir fjernet ved inndamping under redusert trykk og resten blir lyofilisert gjentatte ganger til konstant vekt.

F-I og F-II utgjor således 76 mg og 8+ mg respektivt. F-II

(8+irg) blir kromatograf ert på nytt i en karboksylmetyl-cellulose-kolonne på samme måte som beskrevet ovenfor og gir F-II-1 (30 mg). F-I og F-II-1 blir blandet og gir et partielt renset onsket oktadekapeptid (106 mg). For ytterligere rensing blir 65 mg av dette produkt igjen underkastet kromatografering i en kolonne (1.7 x 30 cm) av karboksylmetyl-cellulose (Whatman CM-52) ved bruk av en ammoniumacetat-buffer (pH 6.9) med en lineær konsentrasjonsgradient av 0.02 til 0.6 M (1500 ml). Proverorene som tilsvarer en enkel topp blir blandet, inndampet og lyofilisert og gir det rene oktadekapeptid, dvs. a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-f enylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-ornityl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginin-amid-acetat (52 mg). A/^<5->57-3<+1->9° (c=0.+99, 0.1N eddiksyre). X ^s.<H>°<1>=279 m^

(E1cm"24'0) skulder ~288 ^ (E1 eir?7•8) ' *maks. ~281 m^

(e!^ =2h.6), 288 mu (e]% =23.8). Aminosyreforholdene i syre-

f cxti i om

hydrolysatet (6N saltsyre, 105 C, ho timer): serin 0.80, glutaminsyre 0.99, prolin 1.0+, glycin 2.03, a-aminoisosmorsyre 0.95, valin 1.00, metionin 1.03, tyrosin 1, 0h, fenylalanin 1.05, ornitin 1.08, lysin 2.00', histidin 1.01, arginin 3.12. Tryptofan/tyrosin-forholdet i intakt oktadekapeptid ble bestemt spektrofotometrisk til 1.19- Peptidet oppforer seg som en enkel komponent i tynn-skikts-kromatografering (n-butanol-eddiksyre-pryidin-vann i forholdet 30:6:20:2+ beregnet som volum) og i papir-elektroforese (600 V/36 cm, i 2N eddiksyre).

Eksempel 3.

a) Benzyloksykarbonyl- L- alanvl- glycin- t- butyl- ester.

Benzyloksykarbonyl--L-alanin (6.70 g) og glycin-t-butyl-ester

(3.95 g) blir lost i etylacetat (30 ml), og til losningen blir

det tilsatt en losning av N,N'-dicykloheksyl-karbodiimid (6.20 g)

i etylacetat ved 0°C. Blandingen blir satt til side natten over ved +°C og det utfelte dicykloheksylurea blir fjernet ved filtrering. Filtratet blir vasket med is-kald 1N saltsyre og

1N natriumbikarbonat, torket over natriumsulfat og inndampet under redusert trykk og gir en rest, som blir krystallisert fra eter og petrdJeum-eter og gir 7.8+ g av det onskete produkt med et smeltepunkt +1 til +2°C. faj^- hl .6+0.8° (c=1.026, metanol).

Analyse kalkulert for Cj-H^NgO^: 0=60.70, H=7.19, N=8.33.

Funnet: 0=60.39, H=7.+2, W=8^5. b) Benzyloksykarbonyl- (3-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin-t- butyl- ester.

Det ovenfor fremstilte dipeptid (6.73 g) blir hydrogenert over palladium som katalysator i 10% eddiksyre-metanol i 2 timer.

Etter fjerning av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir den dannete rest ristet med kaliumkarbonat-losning i nærvær av diklormetan. Den organiske fase blir torket over natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk og gir L-alanyl-glycin-t-butyl-ester som en olje.

Benzyloksykarbonyl-B-t-butyl-L-aspartinsyre (fremstilt ved å behandle det tilsvarende dicykloheksylamin-salt (10.1 g) med "Dowex 50W" x 8 (H+ form) på vanlig måte) og den ovenfor fremstilte dipeptidester blir lost i diklormetan og til losningen blir det tilsatt en losning av dicykloheksylkarbodiimid (+.13 g) i diklormetan ved 0°C. Blandingen blir satt til side natten over ved +°C. Etter fjerning av det dannete dicykloheksylurea ved filtrering, blir filtratet konsentrert under redusert trykk.

Den dannete rest blir lost i etylacetat, vasket med is-kald 1N saltsyre og 1M natriumkarbonat, torket over vannfri natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk for å gi en olje, som blir krystallisert fra eter-petroleum-eter. Rekrystallisasjon fra

det samme losningsmidlet gir det rene tripeptid-d^ivatet (7-05 g) som smelter ved 111 til 112°C. /"cc/^-29. h+ 0.7° (c=1.033, metanol).

Analyse kalkulert for C^H N^Ogi <0=>59.16, H=7.35, N=8.28.

Funnet: 0=59.22, H=7.38, N=8.2+. c) Benzyloksykarbonyl-L-prolyl-(3-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin- t- butyl- ester.

Den ovenfor fremstilte tripeptid-ester (6.10 g) blir hydrogenert over palladium-sort som katalysator i 5% eddiksyre-metanol i 5 timer. Etter fjerning av katalysatoren blir filtratet konsentrert under redusert trykk og gir en oljeaktig rest, som blir ristet med kalium-karbonat-losning i nærvær av diklormetan ved 0°C. De organiske losningene blir blandet og konsentrert under redusert trykk og gir B-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin-t-butyl-ester.

Benzyloksykarbonyl-L-prolin (2.90 g) og den ovenfor fremstilte tripeptid-ester blir lost i diklormetan (50 ml) og til losningen blir det tilsatt en losning av dicykloheksylkarbodiimid (2.+8 g)

i diklormetan ved 0°C. Blandingen blir omrort ved 0°C i 30 minutter og satt til side natten over ved h°C. Det utfelte dicykloheksylurea blir fjernet ved filtrering og filtratet blir konsentrert under redusert trykk og gir en rest, som blir læhandlet med eter for krystallisasjon. Krystallene (6.+5 g) blir lost i acetonitril og en liten mengde av uloselig dicykloheksyluera blir fjernet. Etter fjerning av losningsmidlet blir den resulterende rest krystallisert fra eter. Utbytte 6.00 g med et smeltepunkt 1+8-150°C. /a/p<7->66.0+1.0° (c=1.036, metanol).

Analyse kalkulert for C^<H>^<N>^: 0=59-59, H=7.33, N=9.27.

Funnet: 0=59.69, H=7A6, N=9.12. d) N,O-dibenzyloksykarbonyl-L-tyrosyl-L-prolyl-B-t-butyl-L-aspar tyl- L- aianyl- glycin- t- butyl- e ster.

Den ovenfor oppnådde tetrapeptidester (5.00 g) blir hydrogenert over palladium-sort som katalysator i metanol som inneholder 1 ml eddiksyre i h timer. Etter fjerning av katalysatoren ved filtrering blir filtratet konsentrert under redusert trykk og gir en rest, som blir ristet med 50% kaliumkarbonat i nærvær av diklormetan ved 0°C. De organiske losninger blir blandet,

torket over natriumsulfat og konsentrert for å gi L-prolyl-B-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin-t-butyl-ester. Produktet gir et enkelt utslag på tynn-skikts kromatografering (silicagel)

i løsningsmiddel-systemet n-butanol-eddiksyre-pyridin-vann i forholdet 30:6:20: 2k beregnet som volum.

Kar bodi iraid- met oden.

N,0-dibenzyloksykarbonyl-L-tyrosin (0.+5 g? 1 mmol) og den

ovenfor fremstilte tetrapeptidester)(1 mmol) ble lost i diklormetan (10 ml) og til losningen blir det tilsatt en losning av dicykloheksylkarbodiimid (0.206 g) i diklormetan. Blandingen blir satt til side natten over ved h°C og den dannete utfelling blir fjernet ved filtrering. Filtratet blir konsentrert under redusert trykk og gir en rest, som blir blandet med eter og gir krystaller. Rekrystallisasjon fra etylacetat og eter gir dat onskede peptid med et smeltepunkt 121 til 123°C. Utbytte 0.51 g.

Produktet oppforer seg som et enkelt utslag på tynn-skikts-kromatografering (silikagel) i losningsmiddel-systemet av kloroform-metanol-eddiksyre i forholdet 90:10:3 beregnet som volum.

Aktiv- ester- metode.

L-prolyl-B-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin-t-butyl-ester

(5.77 mmol) blir lost i dimetylformamid (30 ml) og til losningen blir det tilsatt N,0-dibenzyloksykarbonyl-L-tyrosin-p-nitrofenyl-ester (3S63 g). Blandingen ble satt til side ved h°C i 3 dager. Etter fjerning av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir den dannete rest krystallisert fra etylacetat og eter. Rekrystallisasjon fra etylacetat gir 6.65 g av det onskede produkt med et smeltepunkt 126 til 127°C..0° (c=0.86, metanol).

Analyse kalkulert for ^C^H^N^O^: 0=62.58, H=6.59, N=7.76.

Funnet: 0=62.M+, H=6.56, N=7.52.

e) Benzyloksykarbonyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-B-t-butyl-L- aspartyl- L- alanyl- glycin- t- butyl- ester.

Den ovenfor fremstilte pentapeptid-ester (6.60 g) blir hydrogenert over palladium som katalysator i metanol som inneholder 10% eddiksyre i k- timer. Etter fjerning av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir den resulterende rest lost i diklormetan. Losningen blir ristet med 50% kaliumkarbonat ved 0°C. Den organiske lbsning blir torket over magnesiumsulfat og konsentrert under redusert trykk for å gi den krystallinske pentapeptid-dieier. Produktet blir lbst i dimetylformamid (50 ml) og benzyloksykarbonyl-L-valin-p-nitrofenyl-ester (2.72 g) blir tilsatt til losningen. Blandingen blir omsatt ved k°G i 2 dager og konsentrert under redusert trykk ved en bad-temperatur av ^0 til +5°C og gir det urene produkt. Det urene produkt blir kromatografert på en kolonne av silikagel (Merck, 0.05 til 0.2

mm mesh, 150 g). Kolonnen er utviklet med metanol-kloroform som har en lineær metanolkonsentrasjons-gradient av 0 til 5% for å

gi 56 fraksjoner (20 g/prbverbr). Deretter blir kolonnen vasket med metanol-kloroform (5:95? beregnet som volum). Hver fraksjon blir kontrollert ved tynn-skikts-kromatografering og fraksjonene (proveror nr. 55-60) blir blandet. Losningen blir konsentrert under redusert trykk og resten blir blandet med eter for å gi 5.25 g av det onskete produkt, faf^- 70. 5+1 .1 0 (c=1 .031, metanol).

Analyse kalkulert for C^H^N^ 2.H20: 0=59-71, H=7-29, N=9^0.

Funnet: 0=59.65, H=7.19, N=9-30. f) Na-benzyl oksykar bonyl-N*--t-butyl oksykarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyr osyl-L-pr olyl-(3-t-butyl-L-aspar tyl-L-alanyl-gly ein-1-butyl- ester.

Heksapeptid-esteren (+,62 g) blir hydrogenert over palladium som katalysator i 10$ eddiksyre-metanol i k- timer. Etter fjerning av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir den resulterende rest lbst i etylacetat. Losningen blir avkjblt med is og ristet med 50$ kaliumkarbonat. Den organiske lbsning blir torket over natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk for å gi heksapeptid-diesteren. Peptidet blir lost i dimetylformamid ( ho ml) og til losningen blir det tilsatt ^-benzyloksykarbonyl- N^-t-butyloksykarbonyl-L-lysin-p-nitrofenyl-ester (2.56 g). Blandingen blir satt til side ved h C i 3 dager og konsentrert under redusert trykk ved en bad-temperatur av ho til h5°C. Den resulterende rest blir kromatografert på en kolonne av silikagel (Merck, 0,05-0,2 mm mesh, 150 g). Kolonnen blir vasket med metanol-kloroform som har en lineær metanolkonsentrasjons-gradient for å samle 50 proveror (20 g/proveror). Deretter blir metanol-kloroform (5:95? beregnet som volum) benyttet for ytterligere utvikling. Fraksjoner (proveror nr. 71-80) blir blandet og inndampet under redusert trykk for å gi en rest, som blir behandlet med eter til en gelatinaktig masse. Produktet blir vasket med eter og torket og gir +,38 g av det onskete produkt. foJ^- Sh. 5+1 .0° (c=1.037, metanol).

Analyse kalkulert for C^Hg2Ng01 ^:R"20: C=59.3+, H=7.61 , N=10.07.

Funnet: 0=60.05, H=7.67, N=10.06. g) Benzyloksykarbonyl-L-valyl-N<*->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-B-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin- t- butyl- ester. Den ovenfor fremstilte heptapeptidester (3.5 g) blir hydrogenert over palladium-sort som katalysator i 10$ eddiksyre-metanol i 3 timer. Etter fjerning av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir den resulterende rest lost i etylacetat. Losningen blir ristet med 50$ kaliumkarbonat ved 0°C. Deretter blir den organiske losning torket over natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk for å gi en rest, som blir lost i dimetylformamid (30 ml). Losningen blir tilsatt med benzyloksykarbonyl-L-valin-p-nitrofenyl-ester (1.29 g) • Blandingen blir satt til side ved h°C i 2 dager og konsentrert under redusert trykk ved en bad-temperatur av <I>fO-+5°C for å gi en rest. Resten blir underkastet kromatografering på en kolonne av silikagel (Merck, 0.05 til 0,2 mm mesh, 100 g) og kolonnen blir vasket med kloroform-metanol som har en lineær metanol-konsentrasjonsgradient av 0 til' 5$ pr. volum for å samle 50 fraksjoner (20 g/proveror). Kolonnen blir ytterligere utviklet med metanol-kloroform (5:95? v/v). Fraksjoner (proveror nr. 52-62) som inneholder det onskede peptid blir samlet og konsentrert under redusert trykk for å gi en rest. Resten blir behandlet med eter, vasket og torket og gir 3.35 g av det onskete peptid. /a/^-69.2+1 .0° (c=1.061, metanol).

Analyse kalkulert for C60H91<N9>°16<!><C=>60.3+, H=7.68, N=10.55-Funnet: 0=60.30, E=7. 8h, N=10.28. h) N cx -benzyloksykarbonyl-N G-nitro-L-arginyl-L-prolin-metyl-ester.

Til en blanding av tionyl-klorid (1.6 ml) og metanol (2.0 ml) avkjolt i et is-saltbad blir det tilsatt L-prolin (2.30 g), og blandingen blir satt til side ved romtemperatur natten over.

Etter fjerning av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir den resulterende rest lost i diklormetan. Losningen blir blandet med vann (2 ml) og ristet med is-kald 50% natriumkarbonat ( h ml) ved 0°C. Den vandige losning blir ekstrahert gjentatte ganger med diklormetan og ekstraktene' blir blandet. Ekstraktet blir torket over natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk ved en badtemperatur av 20°C

for å gi L-prolin-metyl-ester som en sirupaktig rest.

N oc -benzyloksykarbonyl-N G-nitro-L-arginin (6.18 g) blir lbst i metanol, og losningen blir konsentrert under redusert trykk for å gi en sirupaktig rest, som blir lbst i acetonitril. Til losningen blir den ovenfor fremstilte L-prolin-metyl-ester tilsatt og dicykloheksylkarbodiimid (3.61 g) blir tilsatt til losningen ved 0°C. Blandingen blir satt til side ved k°C natten over.

Det krystallinske bunnfall blir samlet og ved filtrering', vasket med kald acetonitril og torket under redusert trykk. Det resulterende produkt (9.98 g) blir lbst i varm metanol og det ulbselige dicykloheksylurea blir fjernet ved filtrering. Filtratet blir konsentrert under redusert trykk for å gi en rest, som blir rekrystallisert fra acetonitril og gir 5?75 g av det onskete produkt med et smeltepunkt 162-163°C. fø22-50.9+0. h° (c=2.022,

metanol).

Analyse kalkulert for C^H^NgO^: C=51.72, H=6.08, N=18.09.

Funnet: 0=51.63, H=6.1+, N=17.92.

i) N cc -benzyloksykarbonyl-N G -nitro-L-arginyl-N G-nitro-L-arginyl- L- prolin- metyl- ester.

Den ovenfor fremstilte dipeptidester (+.12 g) blir lost i eddiksyre som er mettet med hydrogenbromid (10 ml). Losningen blir satt til side ved romtemperatur i 60 minutter. Det amorfe bunnfall som skilles ut ved tilsats av eter blir samlet ved filtrering, vasket godt med eter og torket over natriumhydroksyd-perler under redusert trykk for å gi N -nitro-L-arginyl-L-prolin-metyl-ester-hydrobromid.

N cx -benzyloksykarbonyl-N G-nitro-L-arginin (2.83 g) blir lbst i vannfri tetrahydrofuran (2.5 ml), og tri-n-butylamin (1.63 g) blir tilsatt. Losningen blir avkjblt i et is-saltbad og til losningen blir det dråpevis tilsatt etylklorformat (O.96 g). Blandingen blir omrort i 30 minutter i et is-saltbad og blandingen blir tilsatt en lbsning av den ovenfor fremstilte dipeptid-ester-hydrobromid (2.96 g) og tri-n-butylamin i dioksan (+0 ml) som inneholder vann (1 ml).

Reaksjonsblandingen blir omrort ved 0°C i 3 timer og satt til side ved +°C natten over. Etter fjerning av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir den resulterende rest lbst i 10$ n-butanol-etyl-acetat. Losningen blir vasket med 1N saltsyre og 1M natriumkarbonat, torket over natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk for å gi en rest. Resten blir lbst i metanol-kloroform (5:95? v/v, 30 ml) og losningen blir underkastet kromatografering på en kolonne av silikagel (Merck, 0.05-0.2 mm mesh, 60 g). Kolonnen blir vasket suksessivt med kloroform (600 ml), metanol-kloroform (5:95? v/v, 200 ml), metanol-kloroform (7:93? v/v, 1000 ml), metanol-kloroform (10:90, v/v, +00 ml) og metanol-kloroform (1:1, v/v, +00 ml)

for å elutere det onskete peptid. Hver fraksjon ble kontrollert

ved. tynn-skikts-kromatografering og fraksjonene som inneholdt det onskete peptid ble blandet. Losningen ble konsentrert under redusert trykk for å gi en rest, som ble behandlet med etylacetat for å gi gelatinaktig utfelling. Utfellingen ble samlet ved filtrering, vasket med etylacetat og torket under redusert trykk og ga 3.8 g av det onskete peptid med et smeltepunkt 115 til 120°C under dekomponering, /oe/<27->37.1+0.8° (c=0.967, eddiksyre), 30.5+0.7° (c=0.950, dimetylformamid).

Analyse kalkulert for C^H^I^ 1 01 Q .R"20: <C>=+5.68, H=6.05, N=22.5+.

Funnet: C=+5.52, H=5.92, W=22.85.

j) N oe -benzyloksykarbonyl-NÉ c -t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-N G"-nitro- L- arginyl- N Q- nitro- L- arginyl- L- prolin- metyl- ester.

Den ovenfor fremstilte tripeptid-ester (3-7 g) blir lost i eddiksyre (1.0 ml) mettet med hydrogenbromid og losningen blir satt til side ved romtemperatur i 90 minutter. Vannfri eter blir tilsatt til losningen for å felle ut tripeptid-ester-hydrobromidet. Utfellingen blir rekrystallisert fra metanol-eter og gir +.6 g

av et amorft fast stoff. Produktet viser et hovedutslag (Rf 0.6+) og mindre utslag (Rf 0.^,0.52) på papirkromatografi i losnings-middelsystemet av n-butanol-eddiksyre-pyridin-vann i forholdet 30:6:20:2+ beregnet som volum.

Na<->benzyloksykarbonyl-N^-t-butyloksykarbonyl-L-lysin /fremstilt fra det tilsvarende dicykloheksylamin-salt (3«05) ved behandling med "Dowex 50W" x 8 (H<+>form).7 og tri-n-butylamin (1.11 g) blir lbst i vannfri tetrahydrofuran (20 ml), og blbsningen blir avkjblt i et is-saltbad. Til losningen blir det tilsatt etyl-klorformiat (0.65 g) , og blandingen blir omrort i et is-saltbad i 30 minutter. Til blandingen blir det tilsatt en lbsning av den ovenfor fremstilte tripeptid-ester og tri-n-butylamin (2.0 g) i dioksan (30 ml) som inneholder vann (3 ml), og den dannete blanding blir omrort ved 0°C i 3 timer. Etter at blandingen har. stått natten over ved ^0C blir den konsentrert under redusert trykk og gir en rest,

som blir lbst i etylacetat inneholdende 10$ n-butanol. Losningen blir vasket i rekkefolge med is-kald 1N saltsyre og 1M natrium-

karbonat og torket over natriumsulfat. Losningen blir konsentrert under redusert trykk og gir en rest, som blir utfelt to ganger fra etylacetat-eter og gir 3»82gav det onskete produkt. 'A7<29->37.9±0.7° (0=1.06+, metanol).

k) Na<->benzyloksykarbonyl-N€-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-W c - nitro- L- arginyl- N c- nitro- L- arginyl- L- prolin.

Den ovenfor fremstilte tetrapeptid-ester (3.8 g) blir lost i metanol.(10 ml), og til losningen blir det tilsatt 1N natriumhydroksyd (5-1 ml). Blandingen blir omsatt ved romtemperatur i 90 minutter og surgjort med 1N saltsyre (5.1 ml). Etter fjerning av metanolen ved inndamping under redusert trykk blir den resulterende oljeaktige rest ekstrahert med 10$ n-butanol-etyl-acetat. Ekstraktene blir konsentrert under redusert trykk og gir en rest, som blir rekrystallisert fra metanol-eter og gir 2.6 g av det onskete produkt. A/2/5"36.7+0.8° (c=0.977, metanol).

Analyse kalkulert for C^<H>^<N>^O^.-<H>gO: C=+7-21, H=6.67, N= 19.89.

Funnet: C=+7.6+, H=6.+3, N=19.28.

1) N cx -benzyloksykarbonyl-N*-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-N G-nitro-L-arginyl-N G-nitro-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-Nc-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl- B- t- butyl- L- aspartyl- L- alanyl- glycin- t- butyl- ester.

Det ovenfor fremstilte tripeptid (1.19 g) blir lost i metanol (1.5 ml), og til losningen blir det tilsatt eddiksyre (1 ml). Losningen blir hydrogenert over palladium-sort som katalysator under en hydrogenstrom i h timer. Etter fjerning av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir den resulterende rest lost i etylacetat. Losningen blir avkjblt og ristet med kald 50$ kaliumkarbonat. Den organiske fase blir torket over natriumsulfat og konsentrert under redusert trykk for å gi oktapeptid-diesteren. Oktapeptid-diesteren blir lost i dimetylformamid (30 ml), og til losningen blir det tilsatt en losning av N cx -benzyloksykarbonyl-N6— t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-N G-nitro-L-arginyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolin (1.32 g), N-hydroksysuccinimid (0.173 g) og dicykloheksylkarbodiimid (0.310

g) i dimetylformamid. Blandingen blir satt til side ved h°C i 2 dager og det utfelte dicykloheksylurea blir fjernet ved

filtrering. Filtratet blir konsentrert under redusert trykk ved en bad-temperatur av k- 0 til i+5°C og gir en rest, som blir under-

kastet en rensing aved kromatografering i en kolonne av silikagel (Merck, 0.05 til 0.2 mm mesh,. hO g). Kolonnen som tidligere har blitt behandlet med metanol-kloroform (2:98, v/v) blir utviklet med samme løsningsmiddel for å oppsamle 50 fraksjoner (10 ml/

proveror) og kolonnen blir ytterligere utviklet med metanol-

kloroform 05:85, v/v). Fraksjonene (proveror nr. 3+-66) blir blandet og konsentrert under redusert trykk for å gi en rest,

som blir lost i etylacetat og behandlet med metanol-etylæetat for å utfelle det onskete produkt, (utbytte 1.73 g). A/^ op-78.5+

1.1° (c=1.030, metanol).

Analyse kalkulert for c88HAo<N>22°26'H2^: C=!^-A8, H=7.38, N=

15.88.

Funnet: C=5+.A, H=7.53, N=15.88.

m) N<*->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-N'-t-butyleksykarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-B-t-butyl-L-aspartyl-L-alanyl-glycin-t- but yl- est, er.

Den ovenfor fremstilte dodecapeptid-ester (577 mg) blir

hydrogenert over palladium som katalysator i 90% eddiksyre (15 ml) natten over. Etter fjerning av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir resten lyofilisert fra vann og lirket over natriumhydroksyd-perler under redusert trykk for å gi 570 mg av det onskete produkt.

Amino-syre-forholdet i syrehydrolysatet: aspartinsyre 1.19?

prolin 2.29, glycin 1.00, alanin 0.99, valin 2.15, tyrosin 0.91,

lycin 2.11, arginin 1.96.

Analyse kalkulert for c8oHl36N20°20* 2Ca2C0Cm']+' R20'' C=53-37, H=8.11, N=1*f.82, CE^COA.55-

Funnet: 0=53.07, H=7-57, N=1+.82, CH^COA.57-

n) N^-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N<£->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-N<c->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-N*-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-B-t-butyl-L- aspartyl- L- alanyl- glycin- t- butyl- ester.

Na-benzyloksykarbonyl-Nc-t-butyl oksykar bonyl-L-lysyl-L- pr olyl-L-valyl-glycyl-NÉ-t-butyloksykarbonyl-L-lysin-hydrazid (0.+92 g) /fremstilt ifolge metoden beskrevet i Bull, Chem. Soc. Japan <_>Z 1+71 (196+X7 blir lost i dimetylformamid ( k ml) og losningen blir avkjblt med.is. Til losningen blir det tilsatt is-kald 1N saltsyre (1.375 ml) og 2M natriumnitrit (O.303 ml), og blandingen blir ristet ved 0°C i h minutter. Det dannete azid blir ekstrahert med is-kald etyl-acetat og ekstraktene blir blandet. Ekstraktet blir vasket med kald mettet mtriurrtnkabonat-losning og torket over natriumsulfat. Det således dannete azid blir tilsatt til en losning av det ovenfor fremstilte dodecapeptid (0.275 mmol) og trietylamin (0.127 ml) i vandig dimetylformamid ( h ml) som inneholder vann (0.2 ml). Reaksjonsblandingen blir konsentrert under redusert trykk ved en bad-temperatur av 10°C til 15°C inntil blandingen blir klar. Losningen blir satt til side ved h°C i 2h timer og til losningen blir det tilsatt pentapeptid-azidet (fremstilt fra 0.138 mmol av det tilsvarende hydrazid ved metoden beskrevet ovenfor). Blandingen blir satt til side ved samme temperatur natten over og losningsmidlet ble fjernet ved inndamping under redusert trykk for å gi en rest, som blir utfelt ved tilsetning av eter. Utfellingene blir lost i n-butanol-etyl-acetat (1:2, v/v) og losningen blir vasket med 1N eddiksyre. Den organiske losning blir torket over natriumsulfat og lyofilisert fra eddiksyre for å gi heptadekapeptid-esteren (1.12 g).

Det ovenfor fremstilte peptid blir hydrogenert over palladium

som katalysator i metanol i nærvær av eddiksyre i 90 minutter. Etter fjerning av losningsmidlet ved inndamping under redusert

trykk blir den dannete rest lyofilisert fra eddiksyre (utbytte 1 .007 <g>)•

En del (0.37 g) av lyofilisatet blir underkastet for rensing til gel-filtrering på en kolonne (2.3 x 1+3 cm) av S^hadex G-25 ved bruk av 20$ eddiksyre. Hver 5 ml fraksjon blir samlet og absorpsjonen ved 275 m;i blir merket. Fraksjoner (proveror nr. 32-+5) som inneholder det onskete peptid blir samlet, konsentrert og lyofilisert fra eddiksyre for å gi 0.21 g av heptadekapeptid-esteren. faj^- yh. 2+1.6° (c=0.667, 50$ eddiksyre).

o) a-amindsobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl- L- aspartyl- L- alanyl- glycin.

Til en losning av benzyloksykarbonyl-cx-aminoisobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-T-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-f enylalanyl-L-arginyl-.L-tryptofyl-glycin (0.32 g) /fremstilt ifolge metoden beskrevet i eksempel 1 ( k) J i eddiksyre blir tilsatt 1N saltsyre i eddiksyre (0.+5 ml), og blandingen blir øyeblikkelig lyofilisert, fulgt av torking under redusert trykk over natriumhydroksyd-perler. Det dannete dekapeptid-hydroklorid blir lost i dimetylformamid (3 ml) sammen med N-hydrdsysuccinimid (O.O83 g), og til losningen blir det tilsatt en losning av dicykloheksylkarbodiimid (0.15 g) i dimetylformamid (2 ml). Blandingen blir satt til side ved +°C i 2+ timer og det utfelte dicykloheksylurea blir fjernet ved filtrering. Filtratet blir helt over i is-kald etylacetat-eter (1:1, v/v, 100 ml), og den dannete utfelling blir samlet ved filtrering. Utfellingen blir vasket med etylacetat og eter og torket under redusert trykk for å gi den dekapeptidaktive ester.

Det ovenfor fremstilte heptadekapeptid-ester-acetat (0.300 g)

blir lost i dimetylformamid (3 ml), og trietylamin (0.17 ml)

blir tilsatt. Losningen blir blandet med en losning av den ovenfor fremstilte dekapeptid-ester i dimetylformamid og blandingen

(totalt volum: 5 ml) blir omrort ved +°C i 3 dager. Reaksjonsblandingen blir tilsatt til is-kald etylacetat (50 ml) og eter (50 ml) blir tilsatt. Den dannete utfelling blir samlet ved filtrering, vasket med eter og torket under redusert trykk for å

gi det urene beskyttede heptakosapeptid (0.60 g).

Det ovenfor fremstilte beskyttete heptakosapeptid blir plassert

i et reaksjonskar laget av fluorinert polyetylen, sammen med metionin (0.1 g) og 'anisol (0.6 ml), og hydrogenfluorid blir tilfort til reaksjonskaret i et torr-is-acetonbad. Reaksjonsblandingen (omtrent 20 ml) blir omrort ved romtemperatur i +0 minutter og konsentrert under redusert trykk for å gi en rest,

som blir lost i is-vann. Losningen blir vasket med kloroform cg sendt gjennom en kolonne (1.+ x 30 cm) av 'Amberlite" CG-+B (acetatform). Kolonnen blir vasket godt med porsjoner av vann og de vandige eluerte losningene blir blandet. Losningen blir konsentrert under redusert trykk og lyofilisert. Det resulterende peptid (0A1 g) blir underkastet en rensing ved kromatograf ering på en kolonne (2.2 x 30 cm) av karboksylmetylcellulose (Serva, 0.56 meq/g) med en ammoniumacetatbuffer (pH 6.5? 2000 ml) med en lineær konsentrasjonsgradient fra 0.02 til 0.6 M. Absorpsjon ved 280 mu blir angitt og fraksjoner (10 ml/proveror) blir samlet. Fraksjonene F-I (proveror nr. 91-10+) og F-II (proveror nr. 105-130) som tilsvarer en hovedtopp blir samlet separat. Hovedmassen av losningsmidlet blir fjernet ved jnndamping og resten" blir lyofilisert gjentatte ganger til konstant vekt. F-I og F-II utgjor 100 mg og 180 mg av det avblokkerte heptakosapeptid, respektivt. F-II blir kromatografert på nytt på en karbokyl-metylcellulose på samme måte som beskrevet ovenfor og gir F-II-1 (80 mg) og F-II-2 (85 mg) som forste halvdel og resten av hovedtoppen, respektivt. F-I og F-II-1 blir blandet (180 mg)

og kromatografert igjen for å frembringe det onskete peptid i en så ren tilstand at det kan bli godkjent fra'tynnskikts-kromatografering på en celluloseplate i et losningsmiddel-system av n-butanol-eddiksyre-pyridin-vann i forholdet 30:6:20:2+ beregnet som volum. En 1+7 mg-del av det fremstilte produkt blir underkastet for kromatografering på en kolonne (2.0 x 30 cm) av karboksylmetyl-cellulose (Whatman CM-52) ved bruk av en ammonium-acetatbuf f er (pH 6.5, 2000 ml) med en lineær konsentrasjonsgradient

av 0.02 til 0.5 M. Fraksjonene som tilsvarer en enkelt topp blir blandet, inndampet og lyofilisert for å gi det rene heptakosapeptid. Utbytte 100 mg. /a/2^-89.2+2.5° (c=0.53, 0.1N eddiksyre), X ^;HC1 276mu (E^ 22.0), 288 mu (E1^ffil5.8),

<Xm;ks>"<N>a0<H>282 m^ ^?m23-°>> 288 ^ (^^23.8).

Aminosyreforholdet i syrehydrolysatet: aspartinsyre 0.995 serin 0.89, glitaminsyre 1.00, prolin 3.93, glycin 3.00, alanin 102, valin 2.80, metionin 1.01, tyrosin 1.90, fenylalanin 0.99, a-aminoisosmbrsyre 1.19, lysin +.52, histidin 1.22, arginin 2.91. Tryptofan/tyrosin-forholdet i intakt heptakosapeptid ble bestemt spektrofotometrisk til 0.5^.

Eksempel +.

a) Benzyloksykarbonyl- L- valyl- L- tyrosin- metyl- ester.

Benzyloksykarbonyl-L-valin (5-78 g) og L-tyrosin-metyl-ester

(+.+9 g) ble lost i dimetylformamid (10 ml) og til denne losning ble det tilsatt dicykloheksylkarbodiimid (+.75 g) med diklormetan (50 ml) ved 0°C. Blandingen ble holdt ved +°C natten over. Det utfelte dicykloheksylurea ble fjernet ved filtrering og filtratet ble inndampet under rediært trykk. Resten ble lost i etylacetat og losningen ble vasket med 1N saltsyre og 1M natriumbikarbonat, og torket over magnesiumsulfat. Inndamping av losningsmidlet gir en krystallinsk rest som blir rekrystallisert fra etylacetat-eter og gir 8.+7 g med et smeltepunkt 15*+ - 155°C. /a/p<2->l8.3<+>0',6° (c=0.98, metanol) .

Analyse kalkulert for C^H^N^: C=6+.+7, H=6.59, N=6.5^.

Funnet: C=6+.58, H=6.62, N=6.58.

b) Benzyloksykarbonyl- L- valyl- L- tyrosin- hydrazid.

Til en losning av benzyloksykarbonyl-L-valyl-L-tyrosin-metyl-ester (6.+2 g) i dimetylfo rmamid (10 ml) og etanol (30 ml) blir det tilsatt hydrazin-hydrat (1.8 ml) og blandingen blir satt tjl side ved romtemperatur i 2k timer. De utfelte krystaller blir filtrert fra, vasket med kald etanol og eter og torket over svovelsyre under redusert trykk: utbytte 6.26 g, smeltepunk 2+3-2++°C (dekomponering). /tx/^2-12.0+0. 5° (c=1.01, dimetylformamid) .

Analyse kalkulert for C^B^gN^O^: 0=61.67, H=6.59, N=13.08.

Funnet: C=61.50, H=6.81, N=12.5+.

c) Benzyloksykarbonyl- L- valyl- L- tyrosyl- L- trolin- metyl- ester.

Til metanol (20 ml) tidligere avkjblt i et is-salt bad blir det

tilsatt diåpevis tionylklorid (1.5 ml) og deretter L-prolin (2.0 g). Blandingen blir holdt ved romtemperatur natten over og inndampet under redusert trykk. Den resulterende sirupaktige rest blir lost i vann (omkring 5 ml) og diklormetan (20 ml) Hir tilsatt. Blandingen blir avkjblt og ristet med is-kald 50$ kaliumkarbonat (10 ml). Den vandige fase bTir gjentatte ganger ekstrahert med diklormetan. De organiske ekstrakter blir blandet, torket over magnesiumsulfat og inndampet under redusert trykk for å gi L-prolin-metyl-ester som en fri base.

Til en avkjblt lbsning av benzyloksykarbonyl-L-valyl-L-tyrosin-hydrazid (6.0 g) i dimetylformamid (20 ml) og 1N saltsyre (35 ml) blir det tilsatt is-kald 2M natriumnitrit (7.7 ml) og blandingen blir omrort ved 0°C i h minutter, hvoretter acyldipeptid-azidet blir ekstrahert 2 ganger med is-kald etyl-acetat. De organiske ekstrakter blir blandet, vasket med is-kald 1M natriumbikarbonat og torket over magnesiumsulfat. En lbsning av det således fremstilte azidet blir tilsatt til den ovenfor fremstilte L-prolin-metyl-ester og blandingen blir holdt ved +°C i 2 dager. Reaksjonsblandingen blir deretter vasket med 1N saltsyre, vann og 1 M natriumbikarbonat, torket over magnesiumsulfat og inndampet under redusert trykk. Den resulterende rest (5-9 g) blir lbst i metanol-kloroform (5:95? v/v) og losningen blir tilfort til en kolonne av silikagel (E. Merck,. 0.05-0.2 mm, 170 g) som har blitt behandlet med den samme metanol-kloroform-blanding. Dette lbsningsmiddelsystem blir også benyttet for eluteringen. Fraksjoner som inneholder en hovedkomponent (Rf=0.57? rykende svovelsyre) i tynn-skikts-kromatografering (silikagel G, metanol-kloroform (1:9? v/v) som løsningsmiddel) blir samlet og inndampet under redusert trykk for å frembringe det onskete tripeptid som en skumformet rest', utbytte 5.++ g. A/p po<->60.6+ 1.0° (c=1.01, metanol).

Analyse kalkulert for CggH^N^O : 0=63.98, H=6.71, N=8.00.

Funnet: 0=63.70, H=6.77, N=8.00.. d) Na<->benzyloksykarbonyl-N<*->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L- valyl- L- tyrosyl- L- prolin- metyl- ester. Benzyloksykarbonyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-metyl-ester (2.63 g) blir lost i metanol og hydrogenert over palladium i 3 timer. Etter fjerning av katalysatoren ved filtrering blir losningsmidlet inndampet under redusert trykk og gir L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-metyl-ester som en fri base. Na<->benzyloksy-karbonyl-N^-t-butyloksykarbonyl-L-lysin (fremstilt fra dicykloheksylamin-saltet (2.82 g) på vanlig måte) og den ovenfor fremstilte tripeptidester blir lost i diklormetan og til denne losning blir det tilsatt en diklormetan-losning av dicykloheksylkarbodiimid (1.03 g)

ved 0°C. Blandingen blir holdt ved +°C natten over og etter fjerning av det utfelte dicykloheksylurea blir losningsmidlet inndampet under redusert trykk. Resten blir lost i etylacetat og losningen blir vasket med is-kald 1N saltsyre, vann og 1M natriumbikarbonat, og deretter torket over magnesiumsulfat. Fjerning av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk gir et utbytte av en farvelost skumformet rest, som blir utfelt fra etylacetat-eter og gir 3.61 g. /a/2,2-56.3+1 .0° (c=1.00, metanol).

Analyse kalkulert for <c>^<H>^<N>^<O.>^<:><0=>62.13, H=7-35, N=9.29.

Funnet: 0=62.13, H=7.35, N=9.20. e) Benzyloksykarbonyl-L-valyl-N<*->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L- valyl- L- tyrosyl- L- prolin- metyl- ester.

Na<->benzyloksykarbonyl-N<£->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-metyl-ester (1.51 g) blir hydrogenert i metanol over palladium i 3 timer. Etter at katalysatoren er filtrert fra blir filtratet inndampet under redusert trykk og gir N<£->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-metyl-ester som en skumformet rest. Tetrapeptid-esteren blir lost i diklormetan sammen med benzyloksykarbonyl-L-valin (0.50 g) og til denne losning blir det tilsatt ved 0°C en losning av dieykloheksylkarbodiimid (0A1 g) i diklormetan. Blandingen blir satt til side natten over ved k°C. Det utfelte dicykloheksylurea blir fjernet ved filtrering og filtratet blir inndampet under redusert trykk. Resten blir på nytt lost i etylacetat og losningen blir suksessivt vasket med is-kald 1N saltsyre, vann og 1M natriumbikaronat, og deretter torket over magnesiumsulfat og inndampet under redusert trykk. Den dannete rest blir utfelt fra etylacetat-eter (1.+3 g) og på nytt utfelt fra acetonitril, utbytte 1.1+ g. /a/p2-66A+1 .1° (c=1.03, metanol).

Analyse kalkulert for C^H^N^ 1 : 0=61.95, H=7-56, N=9.85.

Funnet: C=61.87 , H=7.66, N=10.05. f) Na<->benzyloksykarbonyl-N<£->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-N G-nitro-L-arginyl-N -nitro-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-Nc-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-metyl- ester.

Benzyloksykarbonyl-L-valyl-N^-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-^rolin-metyl-ester (0.51 g) blir hydrogenert

i metanol over palladium i 3 timer. Katalysatoren blir filtrert fra og losningsmidlet blir fjernet ved inndamping under redusert trykk. Resten blir torket over natriumhydroksyd-perler og deretter lost i dimetylformamid (2 ml). Til denne losning blir det tilsatt Na<->benzyloksykarbonyl-N<*->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-N G -nitro-L-arginyl-N G-nitro-L-arginyl-L-prolin (0.53 g) og N-hydroksysuccinimid (0.10 g), og en losning av dicykloheksyl-

karbodiimid (0.19 g) i diklormetan (8 ml) blir tilsatt ved 0°C. Blandingen blir holdt ved V°C i 2 dager og deretter dråpevis tilsatt til etylacetat-eter (1:1, 100 ml) for å frembringe utfellinger, som blir vasket med eter og torket (1.13 g)« Disse utfellinger blir lost i metanol-kloroform (1:9? v/v) og losningen blir sendt gjennom en kolonne av silikagel (E. Merck, 0.05-0.2 mm, U- 0 g) , som har blitt bearbeidet med metanol-

kbroform (1:9? v/v). Eluteringen ble utfort med samme lbsningsmiddelsystem. Fraksjoner som inneholder en hovedkomponent (Rf=0.25, rykende svovelsyre) i tynn-skikts-kromatogaferingen (silikagel G, metanol-kloroform (1:9? v/v) som løsningsmiddel)

blir samlet, inndampet under redusert trykk og lyofilisert fra eddiksyre for å gi det onskete nonapeptid. Utbytte 0A8 g. /a/p2-7+.8+1 .2° (c=1.00, metanol).

Analyse kalkulert for 1 N1 ^0^ .H^O: C=5<>>+.09, H=7.25,

W=16.65.

Funnet: C=5+.06, H=7.35, .N=l6.+0.

g) N^-t-butyjoksykarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N€-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-Ne<->t-butyloksykarbonyl-L

lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-N--t-butyloksykarbonyl- L- lysyl- L- valyl- L- tyrosyl- L- prolin- metyl- ester. .Na<->benzyloksykarbonyl-N<£->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-nitroarginyl-L-nitroarginyl-L-prolyl-L-valyl-N^-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-metyl-ester (0.39 g) blir hydrogenert over palladium i 90$ eddiksyre i 6 timer. Etter fjerning av losningsmidlet ved inndamping under redusert trykk blir resten lyofilisert fra eddiksyre og gir N^-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-N^-t-butyloksykarbonyl--L-lysyl-L-valyl-L-tyr osyl-L-pr olin-me tyl-es ter (0A2 g)..

Til en avkjjlt losning av Na<->benzyloksykarbonyl-N^-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N€-t-butyloksy-karbonyl-L-lysin-hydrazid (0.32 g) i 90$ tetrahydrofuran (5 ml) blir det suksessivt tilsatt is-kald 1N saltsyre. (0.9 ml) og 2M natrium-nitrit .(0.2 ml) og blandingen blir omrort ved 0°C i h minutter. Til denne blir det tilsatt is-kald etylacetat 0 5 ml) og 1M. natriumbikarbonat (5 ml). Det organiske lag blir vasket igjen med is-kald 1M natrium-bikarbonat og torket over magnesiumsulfat ved 0°C. Den dannete Isning av pentapeptid-azidet blir tilsatt til en blanding av det ovenfor fremstilte nonapeptid og trietylamin (0.067 ml) i dimetylformamid (3 ml). Blandingen blir konsentrert under redusert trykk ved en bad-temperatur av 20°C inntil utfellingen, som er skilt ut, forsvinner og blir holdt ved V°C i 2 dager. En ytterligere mengde av azidet (fremstilt fra 0.l8mmol av hydrazidet som beskrevet ovenfor) blir tilsatt. Blandingen blir holdt ved V°C natten over og blir deretter tilsatt til eter (100 ml). Utfellingene som skilles ut blir filtrert fra, vasket med eter <p>g torket under redusert trykk (0.68 g). En ny utfelling fra metanol-etyl-acetat gir-en uren ftemstiUing av Na<->benzyloksykarbonyl-Nf<->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-Nff<->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-N€--•-t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-proylyl-L-valyl-N<£->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-metyl-ester (0.65:g).

En 0.200 g-del av det ovenfor fremstilte tetradekapeptid-blir hydrogenert over palladium i 90$ eddiksyre i 3ir time. Etter fjerning av losningsmidlet ve'd inndamping under redusert • trykk blir resten lyofilisert fra eddiksyre og gir én uren fremstilling av det Na-frie tetradekapeptid. Dette blir underkastet en rensing ved kromatografering på en kolonne (1.7 x 33 cm) av karbokysmetyl-cellulose (Serva, 0.70 meq/g) ved bruk av en ammonlumacetatbuffer .

(pH 5-9 v 2000 ml), med en lineær konsentrasjonsgradient av 0.005-0.25M. Åtte ml-fraksjoner blir samlet og absorpsjonen ved 275 mil blir angitt. Fraksjonene som tilsvarer en hovedtopp (proveror

111-1<J>+0) blir samlet og hovedmassen av losningsmidlet blir fjernet ved inndamping under redusert trykk. Etterfølgende lyofilisering av resten gir en ren fremstilling av det onskete peptid med utbytte 0.15^ g. /V<21->67.0+2° (c=0.55l, metanol). h) Benzyloksykarbonyl-a-amino L- metionin- hydrazid.

Til en is-kald lbsning av benzyloksykarbonyl-a-ajrinoisobutyryl-L-tyrosin-hydrazid (2.3 g) i 1N saltsyre 05 ml) blir det dråpevis tilsatt is-kald 2M natriurnnitrit (3.0 ml) , og blandingen blir omrort i h minutter, hvoretter azidet blir ekstrahert med is-kald etylacetat. Det organiske ekstrakt blir vasket 3 ganger med is-kald 1M natrium-bikarbonat og torket over magnesiumsulfat ved 0°C. En etyl-acetat-lbsning av det således fremstilte dipeptid-azid blir tilsatt til en lbsning. av L-seryl-L-metionin-metyl-ester (fremstilt fra 5 mmol av t-butyloksykarbonyl-L-seryl-L-metionin-metyl-ester) i dimetylformamid (5 ml) og blandingen blir holdt ved k°C i 65 timer. Når reaksjonen er fullfort blir blandingen vasket suksessivt med 1N saltsyre, vann og 1M natriumbikarbonat og deretter torket over magnesiumsulfat og inndampet under redusert trykk for å gi en skumformet rest, som blir utfelt 2 ganger fra etylacetat-eter for å frembringe en uren fremstilling av tetrapeptid-metyl-esteren (2.81 g). Den.urene ester blir deretter lbst i etanol (25 ml) og hydrazin-hydrat ( 2. k ml) blir tilsatt. Blandingen blir holdt ved romtemperatur natten over. Meste-parten av losningsmidlet blir fjernet ved inndamping under redusert trykk og resten blir ristet med vann (10 ml) og etylacetat (20 ml). Det vandige laget blir ekstrahert med etylacetat 2 ganger til.

De organiske lbsninger blir blandet, vasket med vann. Gelatinaktige utfellinger, som skilles ut ved inndamping av etylacetat-Ibsningen, blir samlet, vasket med-kald etylacetat og eter og torket under redusert trykk (2. *+7 g) . En ny utfelling fra etanol-etyl-acetat frembringer det rene tetrapeptid-hydrazid med utbytte 1.86 g.

i) Benzyloksykarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-aa-yl-L-metionyl-T-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-Lr. ar. ginyl.- L- tryptof yl- glycin.

t-butyloksykarbonyl-T-bénzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin (0.23 g) blir lbst i trifluoreddiksyre (ca. 1.5 ml) og blandingen blir holdt ved romtemperatur i

30 minutter. Tilsetning av eter gir utfellinger, som blir

filtrert fra, vasket med eter og torket for å gi det Na-frie heksapeptid (0.2+ g).

Benzyloksykarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionin-hydrazid (0.25 g) blir lost i dimetylformamid (1 ml) og 1N saltsyre (1 ml) blir tilsatt. Blandingen blir avkjblt i is og til denne blir det tilsatt is-kald 2M natriumnitrit (0.22 ml).

Det dannete azid blir ekstrahert med is-kald etylacetat. Det organiske ekstrakt blir vasket med is-kald 1M natriumbikarbonat, torket over magnesiumsulfat og deretter blandet med en lbsning a/ det ovenfor fremstilte heksapeptid og trietylamin (0.125 ml)

i dimetylformamid (5 ml). Blandingen blir konsentrert under' redusert trykk ved en bad-temperatur av 15-20°C inntil den blir klar og blir holdt ved l+°C i kO timer. Reaks jonsblandingen blir deretter tilsatt til etylacetat-eter (1:1 beregnet som volum,

100 ml) og utfellingene som skilles ut blir filtrert fra, vasket med etylacetat og eter, lyofilisert fra eddiksyre (0.32 g).

j) a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-metyl- ester.

Til en lbsning av benzyloksykarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-Y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycin (0.257 g) i eddiksyre blir det tilsatt 1N saltsyre i eddiksyre (0.3 ml), og blandingen blir øyeblikkelig lyofilisert og torket under redusert trykk over natriumhydroksyd-pellet. Det dannete dekapeptid-hydroklorid blir lbst i dimetylformamid (3 ml) sammen med N-hydroksysuccinimid (0.069 g) og N, N'-dicyklo-heksylkarbodiimid (0.12 g) blir tilsatt. Blandingen blir satt til side ved k°C i 2k timer og det utfelte urea blir fjernet ved filtrering. Filtratet blir.deretter tilsatt til is-kald etylacetat-eter (1:1 beregnet som volum) og utfellingene som dannes blir samlet ved filtrering, vasket med etylacetat og eter og torket under redusert trykk for å gi den dekapeptidaktive

ester (0.29 g).

Tetradekapeptidet, N<c->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-Ncf<->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-Nf<->t-butyloksykarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-N<£->t-butyl^ oksy-karbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-metyl-ester-acetat (0.2+8 g) blir lost i dimetylformamid (2 ml) og trietylamin (0.15 ml) blir tilsatt. Til denne losning blir det tilsatt en dimetylformamid-losning av den ovenfor fremstilte dekapeptid-aktive ester og blandingen blir holdt ved k°C i ^8 timer. Reaksjonsblandingen blir deretter tilfort til is-kald etylacetat (100 ml) og utfellingene som skilles ut blir filtrert fra, vasket med etylacetat og eter, lyofilisert fra eddiksyre og torket over natriumhydroksydperler under redusert trykk, og frembringer det urene beskyttete tetrakosapeptid (0.+8 g).

Det ovenfor fremstilte beskyttede peptid (0.20 g) blir behandlet med vannfri hydrogenklorid ved 0 C i 90 minutter på en vanlig måte i nærvær av metionin (0.05 g) og anisol (0.2 ml) som radikal-frigjorer. Etter fjerning av hydrogenfluorid ved inndamping under redusert trykk blir resten lost i vann.og losningen blir vasket med etylacetat. Den vandige losning blir deretter sendt gjennom en kolonne av Amberlite CG-+00 (acetatform). Kolonnen blir vasket med porsjoner av vann. Den blandete losning blir konsentrert under redusert trykk og lyofilisert. Det således fremstilte urene avblokkerte peptid blir underkastet en kromatografering på. en kolonne av karboksymetylcellulose (Serva, 0.70 meq/g) ved. bruk av ammoniumacetat-buffer (pH 6.5, 2000 ml) med en lineær konsentrasjonsgradient av 0.02-0.6M, på samme måte som beskrevet i eksempel 2. Det dannes således oc-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-metionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-metyl-ester (0.07^ g). foj^ Oi -75+2 r\ (c=0.5, 0.1N eddikyre).

Eksempel 5.

Ibu1-ACTH(1-18)-NH2 acetat (0.5 mg) blir lost i ho mM sink-klorid (0.25 ml) ved romtemperatur, og til losningen blir det tilsatt en losning (0.25 ml) av k- 0 mM dinatrium-hydrogenfosfat inneholdende natriumklorid ( + .5 mg). Således blir det dannet en suspensjon av det onskete kompleks og denne blir justert til pH 7-0 ved tilsetning av 0.1N natriumhydroksyd.

Eksempel 6.

Ibu1-ACTH(1-18)-NH2 acetat (0.5 mg) blir lost i destillert vann (0.15 ml). Til losningen blir det tilsatt en losning (0.1 ml)

av poly-L-glutaminsyre (0.5 mg', molekylvekt=ca. 1.500-2.000) som har blitt nøytralisert med 0.1N natriumhydroksyd. Blandingen blir omrort flere minutter og deretter blir det tilsatt en losning (0.25 ml) av M/30 fosfatbuffer inneholdende natriumklorid (*+.5 mg). Den dannete kompleks-forbindelse blir justert til pH 7.0 med 0.1N-natriumhydroksyd.

Eksempel 7.

Ibu -1-ACTH(1-18)-NH2 acetat (1.0 mg) blir lost i destillert vann (0.2 ml). Til losningen blir det tilsatt, under omrbring, en losning av poly-L-aspartinsyre (2 mg", molekylvekt=ca. 3.000) som har blitt nøytralisert med 0.1N natriumhydroksyd (0.3 ml)

for bruk, og således blir det dannet en suspensjon av en hvit utfelling. Den onskete suspensjon av komplekset blir fremstilt ved å tilsette til suspensjonen en losning (0.5 ml<*>, pH 6.8) av M/15 dinatrium-hydro genfosfat-kalium-dihydrogen-fosfat inneholdende natriumklorid (9.0 mg) og justere suspensjonens pH til 7.0 med 0.1N natriumhydrdsyd.

Eksempel 8.

Ibu1-ACTH(1-18)-NH2 acetat (0.5 mg) blir lbst i 100 mM sink-klorid (0.15 ml). Videre blir poly-L-glutaminsyre (0.5 mg', molekylvekt= ca. 2.000-3.000) nbytralisert med 0.1N natriumhydroksyd (0.1 ml) og til losningen blir det tilsatt natriumklorid (*+.5 mg) °g *+0 mM dinatriumhydrogenfosfat (0.25 ml). De dannete losningene blir blandet og omrort ved romtemperatur for å fremstille en suspensjon av det onskete kompleks, som blir nøytralisert med en passende mengde av 0.1N natriumhydroksyd.

Eksempel 9.

Ibu1-ACTH(1-18)-NH? acetat (0.5 mg) blir lost i vann (0.1 ml) ved romtemperatur, og til dette-blir det tilsatt M/15 kalium-dihyJrogen-fosfat-dinatrium-hydrogenfosfat (0.25 ml) som inneholder <+> .5 mg av natriumklorid. Kopoly-L-glutamyl-L-tyrosin (20 mg) (molekylvekt=21.850) blir nøytralisert ved tilsetning av 0.1N natriumhydroksyd (0.15 ml). Den nøytraliserte losning blir tilsatt til den ovenfor fremstilte peptid-losning og blandingen blir omrort for å fremstille en suspensjon av det onskete kompleks, som blir justrert til pH 7.0 med 0.1N natriumhydroksyd.

Eksempel 10.

Ibu1-ACTH(1-18)-NH2 acetat (0.5 mg) blir lost i vann (0.1 ml) og til dette blir det tilsatt M/15 fosfatbuffer (0.25 ml) (pH7.0) inneholdende +.5 mg av natriumklorid. Kopoly-L-glutamyl-L-tyrosin (7 mgj molekylvekt=ca. 21.850) blir nøytralisert med 0.1N natriumhydroksyd. Den nøytraliserte losning (0.1 ml) blir tilsatt til losningen av det ovenfor fremstilte peptid for å gi en suspensjon som øyeblikkelig blir klar. Til losningen blir det tilsatt timerosal (0.1 mg) i vann (0.05 ml), og den dannete klare losning blir justert til pH 7.0 ved tilsetning av 0.1N natriumhydroksyd.

Eksempel 11.

Ibu1-0rn15-ACTH(1-l8)-NH2 acetat (0.5 mg) blir lost i <1>+0 mM sink-klorid (0.25 ml) ved romtemperatur, og til losningen blir det tilsatt en losning (0.25 ml) av ho mM dinatrium-hydrogenfosfat inneholdende natriumklorid C+.5 mg). Derved dannes en suspensjon av det onskete kompleks og denne blir justert til pH 7.0 ved tilsetning av en passende mengde av 0.1N natriumhydroksyd.

Eksempel 12

Ibu<1->ACTH(l-24)-OMe acetat (0.5 mg) blir løst i 40 mM sink-

klorid (0.25 ml) ved rom-temperatur, og til løsningen blir det tilsatt en løsning (0.25 ml) av 40 mM dinatrium-hydrogenfosfat inneholdende natrium-klorid (0.45 mg). Dermed dannes en suspensjon av det ønskede kompleks og denne blir justert til pH 7.0 ved tilsetning av en passende mengde av 0.1N natriumhydroksyd.

Eksempel 13

Ibu<1->ACTH(l-27)-OH-acetat (0.5 mg) blir løst i 40 mM sink-klorid (0.25 ml) ved romtemperatur og til løsningen blir det tilsatt en løsning (0.25 ml) av 40 mM dinatrium-hydrogenfosfat inneholdende natriumklorid (0.45 mg). Dermed dannes en suspensjon av det ønskede kompleks og denne blir justert til pH 7.0 ved tilsetning av en passende mengde av 0.1N natriumhydroksyd.

På lignende måte som nevnt ovenfor kan de andre l-«-amino--±sbsmør-syre-corticotropin-peptidene bli omdannet til de tilsvarende komplekser.

Claims (1)

1. Analogifremgangsmåter for fremstilling av terapeutisk aktive /JL^a-aminoisosmørsyre7-corticotropin-peptider med aminosyrerester som tilsvarer sekvensen 1-18 til 1 - 27 av det naturlige corticotropin-molekyl, representert ved den generelle formel:

   et -aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-A-B-L-histidyl-L-fenylalanyl-L-arginyl-L-tryptofyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-C-D-E-F, hvori A er en rest av L-metionin, L-norvalin, L-norleucin, L-leucin eller a-aminosmørsyre, B er en rest av L-glutaminsyre eller L-glutamin, C og D er hver en rest av L-lysin eller L-ornitin, E er en rest av L-arginin, L-lysin eller L-ornitin og F er en rest av L-arginin, L-arginyl-L-prolin, L-arginyl-L-prolyl-L-valin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysy.') - t,~valyl-L-fcyro :;y prolyl-L-aspartinsyre, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-L-alanin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-proly1-L-aspartyl-L-alanyl-glycin, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-glycyl-L-glutaminsyre, L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosy1-L-prolyl-L-alany1-glycyl-L-glutaminsyre eller L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-aspartyl-glycyl-L-alanin, det tilsvarende amid eller tilsvarende ester, ikke-giftige syreaddisjonssalter eller komplekser av dette, karakterisert ved at (a) en aminosyre-ester eller en peptidester som har en fri aminogruppe i nærvær av et kondensasjonsmiddel omsettes med en annen aminosyre eller et peptid hvor aminogruppen henholdsvis aminogruppene er beskyttet, eller (b) en aminosyre eller et peptid som har en fri aminogruppe og hvor karboksylgruppen eventuelt er beskyttet omsettes med en annen aminosyre eller et peptid som har en aktivert karboksylgruppe og hvor aminogruppen eller aminogruppene er beskyttet, eller (c) en aminosyre eller et peptid som har en fri karboksylgruppe og hvor aminogruppen henholdsvis aminogruppene er beskyttet i den angitte aminosyresekvens omsettes med en annen aminosyre eller et peptid som har en aktivert aminogruppe og beskyttet karboksylgruppe, og de beskyttende grupper fjernes fra det resulterende beskyttede peptid ved hydrogenolyse, acidolyse, hydrazinolyse, hydrolyse eller reduksjon med natrium i flytende ammoniakk, og eventuelt omdannes det dannede ubeskyttede peptid til syreaddisjonssalter eller komplekser av dette på vanlig måte.