DE2112553B2

DE2112553B2 - 1-alpha-Aminoisobuttersäurecorticotropinpeptide, deren Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe sowie Arzneipräparate

Info

Publication number: DE2112553B2
Application number: DE2112553A
Authority: DE
Inventors: Ken Kobe Hyogo Inouye; Hideo Mino Osaka Otsuka
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1970-03-16
Filing date: 1971-03-16
Publication date: 1974-09-26
Also published as: SE395885B; FR2085715B1; NO137151C; NO137151B; SE7407603L; CA965777A; US3873511A; NL7103476A; BE764351A; DE2112553A1; SE395886B; GB1316545A; FR2085715A1; DE2112553C3; CH566297A5

Description

IO

in der X ein L-Lysin- oder L-Ornithinrest und Y ein L-Prolin-, L-Prolinester- oder L-Prolinamidrest ist, deren Säureadditionssalze und Komplexe.

10. t-oc-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide der allgemeinen Formel

oc-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-

i.-methionyl-L-g!utamyI-L-histidyI-i.-pnen\l-

alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-

i--lysyI-L-prolyi-L-valyl-glycyl-X-i-'-I\syl-

i-arginyl-i.-arginyl-L-proiyl-i.-valyl-

L-iysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolvi-

L-asparagyl-L-alanyl-Y

in der X ein L-Lysin- oder L-Ornithinrest und Y ein Glycin-. Glycinesler- oder Glycinamidrest ist. deren Säureadditionssalze und Komplexe.

11. Arzneipräparate, enthaltend ein 1-j-Aminoisobutiersäure-cor'-cotropinpeptid nach Anspruch 1 bis 10.

35

Die Erfindung betrifTl neue 1-a-Aminoisobuttersaure-corticotropinpeptide. die an Stelle des Serini'c>tes ini nativcn Corticotropin als aminocndständige Aminosäure eine α-Aminoisobuttersäurc enthalten, deren Derivate, pharmakologisch verträgliche Säureadditionssalze, Zwischenprodukte und Komplexe.

Die Erfindung beruht auf dem Befund, daß der Ersatz der aminoendständigen Aminosäure in Corticotmpinpeptiden durch a-AminoisoIiuttcrsäure deren biologische Eigenschaften erheblich verstärkt und zu einer VVirkungsverlängerung führt. Es wurde ferner festgestellt, daß diese verbesserten Eigenschaften auf einer verminderten Empfindlichkeit der 1-a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide gegenüber der Wirkungder intrazellulären Aminopeptidase beruhen.

Gegenstand der Ei findung sind 1-a-Aminoisobuttersäurc-corlicotropinpeptidc mit Aminosäureresten entsprechend der Sequenz 1-16 bis 1-39 des nativcn Corticotropins, deren Derivate. Säurcadditionssalze und Komplexe.

Die I-a-Aminoisobutlcrsäurc-coi licolropinpeplidc können nach an sich bekannten Methoden durch aufeinanderfolgende Kondensation der Aminosäuren oder durch Kondensation kleiner Pcplidfragmenle hergestellt werden. Insbesondere können die Verbindungen der Erfindung entweder
(al durch Umsetzung eines Aminosäureesters oder Pepiideslcrs mil einer freien Aminogruppc mil ft.¹; einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit geschützten Aminogruppen in Gegenwart eines Kondensalionsmiltcls oder

(b) durch Umsetzung einer Aminosäure oder eine Peptids mit einer freien Amirrogruppe und ge schützter oder ungeschützter Carboxylgruppe m einer anderen Aminosäure oder einem anderei Peptid mit einer aktivierten Carboxylgruppe um geschützter Aminogruppe oder

(c) durch Umsetzung einer Aminosäure oder eine Peptids mit freier Carboxylgruppe und geschützte Aminogruppe mit einer anderen Aminosäur oder einem anderen Peptid mit aktivierter Amino gruppe und geschützter Carboxylgruppe und an schließende Abspakun3der Schutzgruppen durc Hydrogenolyse, Acidolyse, Hydrolyse, Hydra zinolyse. Reduktion mit Natrium in flüssigen Ammoniak oder andere Weise hergestellt wer den.

Peptidhindungen werden nach üblichen
ausgebildet. Beispiele für diese Methoden sind die A/id Dicyclohexylcarbodiimid-. Carbonyldiimidazol-. ge mischte Anhydrid- oder aktivierte Estermethode /. B. die p-Nitrophenylestermethodc, die N-Hydro.\\ succinimidester-, Cyanmelhylester-, p-Nitrophenyl thiolester-. Pentachlorphenylesler-. Isoxazolium-N-Carboxyanhydrid-. Tetraäthylpyrophosphit ode Äthylchlorphosphitmethode oder deren Kombinatio nen. Die Peptide werden auch nach der sogenannter Synthese in fester Phise hergestellt. Die vorgenannter Methoden können zwar zur Ausbildung jeder Peptid bindung bei der Herstellung der Verbindungen de Erfindung angewendet werden, die bevorzugte Me thode ist jedoch die Dicyclohexylcarbodiimid-. Azidgemischte Anhydrid- und aktivierte Estermethode.

Zur Herstellung der i-a-Aminoisobuttersäurc-cor ticotropinpeptide werden freie funktioneile Gruppen die an der Reaktion nicht teilnehmen, vorzugsweisi geschützt, insbesondere durch solche Gruppen, d■■ durch Hydrogenolyse. Acidolyse. Hydr-izinolyse. Hy drolysc oder Reduktion mit Natrium in flüssigen Ammoniak leicht entfernt werden können. Die C'arbo xylgruppe wird vorzugsweise durch Veresterung, ζ. Β mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Metha nol. Äthanol. Propanol. Isopropanol oder tert.-Buta nol. oder einem durch einen aromatischen Rest sub stituierten aliphatischen Alkohol, wie Benzylalkohol p-Nitrobenzylalkohol oder p-Methoxybenzylalkohol oder durch Amidbiklung geschützt. Diese Carboxyl schutzgruppen werden in üblicher Weise eingeführt.

Die Aminogruppe wird vorzugsweise mit eine tert. Butyloxycarbonylgruppe. tcrt.-Amyloxycarbo nylgruppe. o-Nitrophenylsulfenylgruppe, 2-(p-Di phenyl (-isopropyloxycarbonylgruppc. Bcnzyloxy carbonylgruppe. p-Nitrobenzyloxycarbonylgruppc p-Methoxybenzyloxycarbonylgruppe. Tosylgruppe Formylgruppe oder Tritylgruppe in üblicher Weisi geschützt. Zum Schutz der Guanidylgruppe de Arginins wird vorzugsweise die Nitrogruppe. Tosyl gruppe oder Adamantyloxycarbonylgruppe vcrwcn det. Der Schutz der Guanidylgruppe ist jedoch nich immer erforderlich. Die cj-ständige Aminogruppe de Lysins oder Ornithins wird vorzugsweise durch cim der vorgenannten Aminoschutzgrtippen geschützt Die (/(-ständigen Carboxylgruppen der Glutaminsäure oder Asparaginsäure werden vorzugsweise durch du vorgenannten Carboxylschutzgruppcn geschützt. un<. die Imidaznlgruppc des llislidins kann /.B. ilurcl eine fosyl-. Benz¹ loxycarbonyl- oder Bcnzylgruppc geschützt werden. Die Hydroxylgruppe des Serine oder Tyrosins kann z.B. durch eine Acetyl-, Benzyl

2 Π2553

oder tert.-BMtylgmppe geschürt werden, doch ist dieser Schutz nicht immer erforderlich.

Die l-ct-Aininpisobuttersäure-corticotropinpeptide der Erfindung enthalten Vorzugs weise die AminosäureresteentsprechendderSequenzl-18bisl-27desnativen Corticotropins.

Außer dem Ersatz der aminoendständigen Aminosäure können einige andere Aminosäureresle der Sequenz durch andere Aminosäuren ersetzt werden, ohne die corticotrope Wirkung wesentlich zu beeinträchtigen. Beispielsweise kann die 4. Aminosäure Methionin durch Norvalin, Norleucin, Leucin oder a-Aminobuttersäure, die 5. Aminosäure Glutaminsäure durch Glutamin, die 15. und bzw. oder 16. Aminosäure Lysin durch Ornithin, die 17. und bzw. oder 18. Aminosäure Arginin durch Lysin oder Ornithin und bzw. oder die 25. Aminosäure Asparaginsäure durch Valin ersetzt »erden.

Die bevorzugten Corticotropinpeplide der Erfindung haben die allgemeine Formel I a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-

A-B-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-

L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-

glycyl-C-D-E-F (I)

in der A der L-Methionin-. L-Norvalin-, L-Norleucin-. L-Leucin- oder α-Aminobuttersäurerest. B der L-G!utaminsäure- oder L-Glutaminrest. C und D jeweils der · L-Lysin- oder L-Ornithinrest, E der L-Arginin·. L-Lysin- oder L-Ornithinrest und F der L-Arginin-. L-Arginyl-L-prolin-. L-Arginyl-L-prolyl-L-valin-, l-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysin-. L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valin-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosin-. L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-. L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-Iysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparaginsäure-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-valin-. L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparagyl-L- alanin-. L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparagyl-L-alanyl-glycin-, L-Arginyl-L-proiyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparagyl-glycyl-L-glutaminsäure-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L- alanyl-glycyl-L-glutaminsäure-, L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparagylglycyl-L-glutaminsäo.re- oder der L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-L-asparagylglycyl-L-alaninrest oder der entsprechende Ester oder das entsprechende Amid ist.

Die Peptide der allgemeinen Formel I können durch Umsetzung eines Aminosäureesters oder Peptidesters mit freier Aminogruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit geschützter Aminogruppe in Gegenwart eines Kondensationsmittels oder durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids mit freier Aminogruppe und geschützter oder ungeschützter Carboxylgruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe und geschützter Aminogruppe oder durch Umsetzung einer Aminosäure oder eines Peptids mit freier Carboxylgruppe und geschützter Aminogruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem anderen Peptid mit aktivierter Aminogruppe und geschützter Carboxylgruppe in der Reihenfolge der vorgenannten Aminosäurensequenz hergestellt werden.

Die letzte Kupplungsreaktion zur Herstellung des Peptids der allgemeinen Formel I wird z.B. durch Kondensation eines geschützten Decapeptids der allgemeinen Formel

R,-a-AminoisobutyryI-0-R₂-L-tyrosyl-L-seryl-

A-y-Rj-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-

L-arginyl-L-tryptc^nylglycin.

in der R₁ eine Aminoschutzgruppe, R₂ eine Hydroxylschutzgruppe und R₃ eine Carboxylschutzgruppe bedeutet und A die vorstehend angegebene Bedeutung hat. mit einem geschützten Peptid der allgemeinen Formel

N'-R₄-L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-

in der R₄, R₅ und R₆ eine Aminoschutzgruppe bedeuten. E' ein geschützter oder ungeschützter L-Arginin-. L-Lysin- oder L-Ornithinrest und F' ein geschützter oder ungeschützter Aminosäure- oder Peptidrest der vorgenannten Art ist. in einem inerten Lösungsmittel bei Temperaturen von -20 bis 60" C während etwa 2 Stunden bis 7 Tagen kondensiert und anschließend die Schutzgruppen aus dem erhaltenen geschützten Peptid der allgemeinen Formel

R,-a-Aminoisobutyryl-O-R₂-L-tyrosyI-L-seryl-

A-y-Rj-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-

L-arginyl-L-tryptophyI-glycyl-N^f-R₄-L-lysyl-

L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^w-R₅-C-N^ra-R₆-D-E'-F\

in der R₁, R₂. R₃, R₄. R₅, R₆, A. C. D, E^f und F' die obige Bedeutung haben, in üblicher Weise bei Temperaturen von etwa -20 bis 60°C während etwa 30 Minuten bis 24 Stunden abspaltet. Beispiele für verwendbare inerte Lösungsmittel sind Dimethylformamid. Dimethylsulfoxid, Dioxan, Hexamethylphosphortnamid, deren Gemische und Gemische mit Wasser.

Die bevorzugten Verfahren zur Herstellung de; Octadecapeptids. des Tetracosapeptids und des Hepta cosapeptids sind in den Tabellen I. II und Hl ange geben.

Tabelle I Herstellung des Octadecapeptids

B/l

ioC-tvr-ONP 4 H-Scr-OMe

''iC-Tvr ■ Ser-OMc

DB/l
BfK-GIu-ONP + H-Ilis Phc ■ Ari: Trp CiK-OI

OB/I

BOC-GUi His- Phe Arg ■ Trp -GIj-OII

lorlsct/urm

H/l lld λ,on

/.-Ihn-OlI ' 11-Tyr- Scr-OMc

B/l ■*·(■

1
/-IhuTvr Scr-OMc

Nil,Nil,
B/l i

/.-Ibu Tvr Ser-NIINH,

OH/I CI₁(OOII HOC-Mcl-ONI¹ ' Il-C.hi llis Phc Ar.u Trp CiU-OH

OH/I
Bf)C-MeI · CiIu His ■ Phc Arg Trp CiIy-OII

CI ,COOH

B/l ^HN°' ^

/■Ihn -Tyr 'scr-N, 4 Η-Met GUMIis Phe ■ Arg Tip CiIy-OH

B/1 lOB/l

; ι

Z-Ibu· Tyr-Scr- Met · GIu ■ His Phc-Arg-Trp- CiIy-OII

I)CC. Hf)Su

B/l

OB/I

BOC

BOCBOC

/■Ihn ■ Tyr ■ Scr · Met ■ GIu His ■ Phc · Arg ■ Trp · Gl)-(JSu - H-Lys ■ Pro ■ V.il · CiIy - Lys · t.ys ■ Arg ■ Arg-NH,

B/l OB/I BOC B(K BOC

7-lbu ■ Tyr ■ Scr · Met ■ CiIu · His ■ Phc ■ Arg · Trp ■ GIy ■ Lys ■ Pro ■ VaI ■ GIy ■ Lys Lys ■ Arg · Arg-NH>

^: HI-"

H-Ibu Tyr-Ser- Met · GIu · His- Phc -Arg · Trp ■ GIy · Lys- Pro- VaI ■ GIy · !.;.>■ Lys Arg Arg-Nil,

Tabelle II Herstellung des Tetracosapeptids

NO,
Z-Arg-OH + H-Pro-OMc Z-VaI Tyr-N, + !I-Pro-OMc

DCC

NO, Z-Arg Pro-OMe

; HBr CH₃COOH

Z-VaI Tyr Pro-OMc i
i H, Pd

NO, " NOj BOC ' ' ^:

Z-Arü-OH -i- Η-Arc Pro-OMe Z-L\s-OH + H-V al Tvr Pro-OMe

NO,

M. A. NO,

Z-Ara Ars: Pro-OMe

BOC
Z-Lvs- VaI- Tvr Pro-OMc

BOC

NOV

HBr OLCOOH NO-

BOC

H, Pd

Z-Lys-OH -t- H-Arg · Arg Pro-OMe Z-V_;i1-OH + H-Lys ■ VaI - Tyr · Pro-OMe"

j M. A.
BOCJNO, NO,

Z-Lys · Arg · Arg Pro-OMe

DCC BOC

Z-VaI Lys ■ VaI - Tyr - Pro-OMc

409539/369

Fortsetzung
on

11₂/IM

IK)CNO, N(I, I)OC

/·! >s Arg Arg ■ Pm-OH ι HAaI ■ l.ys ■ Viii Tyr Pm-OMc

IXC. IIOSii BOC NO, NO, BOC

i Ί ■ ■ I

Z-I-ys Arg · Arg ■ Pro VaI ■ Lys · VaI ■ Tyr ■ Pro-OMc

H₂/Pd BOC HOC BOC BOC

Z-L\s Pro ■ Viii CiIy I.ys-N, + Il-Lys ■ Arg · Arg ■ Pro ■ VaI · l.ys ■ VuI · Tyr ■ Pro-OMc

B/l OB/I BOC BOCBOC BOC

fc-lhn Tyr Scr Met GIu-Ilis-Phe-Arg-Trp GIy-OII Z-I.ys· Pro VaI CiIs · l.ys· L\s Arg-Arg- Pro- VaI- l.ys· VaI ■ Tyr · Pm-OMc

OB/I

DCC^-. HOSii

BOC

BOCHOC

II, Pil

BOC

fc-lbu-TyrScr-Met GIu His PlicArg Trp CiIy-OSu + II-Lys· Pro- VaI ■ CiIy Lys· L\s Arg Arg- Pro- VaI ■ Lys· VaI T\r ■ Pro-OMc B/l OB/1 BOC BOCBOC" BOC

Z-Ihu-Tyr-Scr Met Gin-Hiv PhcArgTrpCil) L\s Pro VaI CiIy l.ys· Lys Arg Arg- Pro VaI Lys· VaI Tyr Pro-OMc

\ Hl-H-lbu-TyrSer Met GIu His-Phe-Arg-Trp-GIy-iys-Pro-VaI GIy-Lys· Lys· Arg-Arg Pro VaI-Lys-VaI-Tyr-Pro-OMc

Tabelle III
Herstellung des Heptacosapeptids

NO,
Z-Arg-OH + H-Pro-OMe

NO_: ^D«

Z-Arg Pro-OMe

NO, _NOJ_; HBrAcOH

Z-Are-OH + H-Are ■ Pro-OMe

NO, NO,

M. A.

Z-Arg Arg Pro-OMe

j HBr AcOH

BOC NO, NO, j

Z-L>s-OH + H-Arg - Arg - Pro-OMc

MA. BOCNO, NO,

Z-Lvs · Arg · Arg ■ Pro-OMe

:OH BC)CNC), NO,

Z-[.\s-.Ari! Ars: Pm-OH

Fortsei/U π ι»

/-Alii Cily-OHii¹

OHu' ¹^ ^Ul

/-Asp-Oil I H-Ma CiU-OHu'

OHu' j ^IKC

j *

/.-Asp Ala CiIv-OBu'

H₂ Pd OBu' j

Z-l'ro-OH (- Η-Asp Ala-CiIy-OHu'

IXC OHu'

/-Pro Asp Ala CiIy-OBu'

i H, I'd OBu¹

/.-Tu-ONP t H-Pm Asp Alii CiIy-OBu¹

Z _:OBu'

Z-Tyr- Pro Asp · Alii ■ CiIy-OBu¹

: π, Pil

OHu¹
J-VaI-ONP + H-Tyr· Pro Asp ■ Ala ■ CiIy-OBu¹

OBu'
Z-VaI Tyr ■ Pro Asp ■ Ala GIy-OBu¹

BOC i ^; OBu¹

ι * i

Z-Lys-ONP + H-VaI Tyr· Pro Asp Ala GIy-OBu'

BOC j OBu'

*

Z-Lys ■ VaI ■ Tyr Pro · Asp ■ Ala · GIy-OBu¹

^! H, Pd
BOC ' OBu¹

H-Lys · VaI · Tyr ■ Pro Asp ■ Ala - GIy-OBu¹

BOC OBu¹

i i

Z-VaI-ONP + H-Lys VaI ■ Tyr ■ Pro · Asp ■ Ala · GIy-OBu'

BOC OBu'

Z-VaI ■ Lys · VaI ■ Tyr ■ Pro ■ \sp ■ Ala · GIy-OBu¹

i H, Pd
BOCNO, NO, BOC [ OBu¹

Ϊ-Lys ■ Arg · Arg · Pro-OH + H-VaI ■ Lys · VaI · Tyr ■ Pro · Asp ■ Ala · GIy-OBu'

•'ortsctzimii

IXV. IIOSii

Ii(K V). N( I. IC K OHm'

/-l\s Λγιι Art I'm VaI l.y. VaI Tw Pro Asp Ala CiIy-OHu'

HOC UOC HOC IHK I OHu¹

Z-I.ys- Pm VaI ■ CiIv I ys-N, I ll-l.ys · Λτμ ■ Λΐϋ ■ l'rn· \'al I.ys · VaI Tu Pro · Asp ■ AIa · GIy-OBu'

rt/l H/l HOC H(K H(K HOC OHu'

/•Ihu-Tu Scr MctCilu-Mis-PhcAruTrp-Cily-OII Z-L>s- Pro Λ ¹Hl-CiIyLy; -I.ys-Arp-Ar^· Pro A'al-Lys-VuI Tyr- ProAsp-Ala CiIy-OHu

H/l

IXV. IIOSii

HOC

H(K HOC

II, IM
H(K

OHu'

i/.-lhii- I'\r ScrMcI din I lis-l'lic Au-Trp-CiIy-OSu ι I I-Lvs- Pro Va! -CiIv LyLy-Arp-Aru- Pro VaI -Lys-Vnl-Tyr Pro Asp AIa CiIv OHu

H/l H/l HOC Hi)CHOf HOC OHn¹

/-Ihn-Tyr-Scr-Met-CiIu I Ik- Phc Are-Trp GIv · I.ys· Pro- Viii · GIv · L_\s- LvsArivArü- Pro \.11 I.ys-VaI-Tyr-Pro-Asp-Aiii-CiIv-OM

'hu Tu ■-Scr-Mc! -Cilii Ills PIu- Arg Trp- CiIy -Ly Pro- VnI CiIv · l.vs I.ys- Are -Arg· Pro VaI I ys- VaI T u Pm Asp Ala CiIv- Ol

In ilen Tabellen werden folgende Abkürzungen für die Aminosäurereste verwendet:

Ihn =-- x-Amincisohuttersäurc. Tyr »-1.-Tyrosin. Scr - ι.-Serin. Met = i.-Methionin. GIu ^.-Glutaminsäure. His--1-Histidin. Phe = L-Phenylalanin. Arg --1.-Arginin. Trp = ι -Tryptophan. CJIy — Glycin. l>- -■ ι .-Lysin. Pro = 1. -Prolin. VaI - L-Valin. Asp = !,-Asparaginsäure. AIa = !.-Alanin. BOC=tert.-iutvloxyearbonyl. BzI= Benzyl. OBu¹ = lert.-But-• \>. DCC -- N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid. Z= ■V'nzyloxvcarbonyl. HOSu = N-Hydroxysuccinimid. Il -N = gemischte Anhydridmethode. ONP- p-Nitrophenoxv.

Aus den Tabellen is; ersichtlich, daß das Tripcptid. das die ersten drei Aminosäuren enthält, nämlich ■-Aniinos(ibutyryl-i,-tyros>l-i,-serin. oder das Tetraf ept id. nämlich Jc-Aniinoisobuiyryl-L-tyrosyi-i -seryl-1 -methionin, mit dem Heptapeptid oder dem Hexal'cpiid entsprechend der Stellung 4 bis 10 oder 5 bis 10 vorzugsweise nach der Azidmethode umgesetzt wird. vorauf das erhaltene Decapeptid mit dem Peptid entsprechend dem Rest des Moleküls, d.h. dem Octapeptid (Stellungen 11 bis 18) im Falle der Herstellung des Octadecapeptids. dem Tetradecapeptid (Stellung 1 1 bis 24) im Falle der Herstellung des Tetracosapeptids. und dem Heptadecapeptid (Stellungen 11 bis 27) im Falle der Herstellung des Heplacosapeptids kondensiert wird. Die anderen l-a-Aminojsohuuersäure-corticotropinpepiide können in ähnlicher Weise durch Kondensation des aminoendstäntügen Deeapcptids mit dem entsprechenden carboxylcndständigen Rest hergestellt werden.

Das aminoendständige Decapeptid. das Tetrapeptid und das Tripeptid sind neue Verbindungen, die wertvolle Zwischenprodukte zur Herstellung der Corlicotropinpeptide der HHindung sind.

Das vorgenannte Verfahren ist zwar das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der Corticotropinpeptide der Erfindung, man kann jedoch die Schutzgruppen, die Kupplungsmethodcn oder die vorgenannte Abspaltung der Schutzgruppe, durch äquivalente Methoden ersetzen und die Stellungen und die Reihenfolge der Kupplung der Peptidfragmente ändern.

Die im Verfahren verwendeten Schutzgruppen können durch Hydrogenolyse. Hydrolyse, Hydrazinol· e. Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak ^uer durch Behandlung mit einer Säure, wie Trifluoressigsäure, Ameisensäure, einem Halogenwasserstoff, wie Fluorwasserstoff. Bromwasserstoff oder Chlorwasserstoff, einer Halogenwasserstoffsäure, wie Fluorwasserstoffsäure. Bromwasserstoffsäure oder Chlorwasscrstoffsäurc. oder deren Gemisch in üblicher Weise und je nach der Art der Gruppe abgespalten werden.

Die auf die vorstehend geschilderte Weise hergestellten Corticotropinpeptide der Erfindung können nach an sich bekannten Methoden gereinigt werden, ζ. Β durch Säulenchromatographie an lonenaustauscherharzcn. ionenaustauschercellulose oder Ioncnaustauschersephadex" oder durch Gcgenstromverteilune.

Die Corticotropinpeptide der Erfindung fallen je nach den Reaktionsbedingungen in Form der freien Base oder in Form von Säureadditionssalzen an. Die Salze können auch durch Umsetzung der Peptide mit anorganischen oder organischen Säuren hergestellt werden. Beispiele fürdiese Säuren sind f la logen wasser-

stofTsäuren, z.B. Fluorwasserstoffsäure, ChlorwasserstofFsäure und BromwasserstotTsäure, wasserfreie Halogenwasserstoff:, wie FluorwasserstofT, Bromwasserstoff und Chlorwasserstoff, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure. Fumarsäure, Weinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Methnnsulfonsäure, Benzolsulfonsäure oder Toluolsulfonsäure. Zur Salzbildung kann die Säure in äqui- molarer Menge oder im Überschuß verwendet werden.

Die 1 -j-Aminoisobuttersäurc-corticotropinpeptide der Erfindung zeigen eine starke biologische Aktivität, sie stimulieren die Nebenrinde, sie haben eine lipotropc Wirkung, und sie stimulieren die Melanophoren. Die Verbindungen der Erfindung sind dem nativen Corticotropin und linderen ähnlichen Peptiden überlegen.

Die biologische Prüfung der Coriicoiropinpepiide der F.rfmdung im Vergleich zu nativem Corticotropin des Schafs U₅-ACTH) und GK ' -ACTH( l-l S)-NM, (Bull. Chem. Soc. Japan Bd. 43 fl97O]. S. 19oi eifok'te nach fünf verschiedenen Methoden. Der Asu'rhiiisäureverarinungstest an der hypopliyscctomien-jü R;u- :<; te wurde nach der United Siatcs Pharmacopeia XV⁷II. S. 147 (19i,5) durchgeführt. Die in vivo Aktivität der Stcroidbildung durch intravenöse Verabreichung an '".vpophysectomierten Ratten wurde nach der Meihode von Lipscomb und Nelson (Endocrinol., Bd. 71 [1962], S. 13), geringfügig modifiziert (A.Tanaka und C. H. Li, Endocrinol. Japonica Bd. 13 [1966]. S. 180) bestimmt- Die In-vivo-Aktivität der Sterojdbildung wurde auch an der mit Dexamethason und PentobarbitalbehandeltenMausbestimmtfA.Tanaka und N.Nakamura. »Integrtitive mechanism of neuroendocrine systeme Hokkaido University Medical Library Serie. Bd. 1 [1968]. S. 49). Außerdem wurde die Aktivität der Bildung von Steroiden durch intramuskuläre Verabfolgung an hypophysectomierte Ratten bestimmt, wobei ein Peptid präparat in den Oberschenkelmuskel injiziert und 30 Minuten nach der Injektion Blut aus der abdominalen Acrta entnommen wurde. Weiter wurde die Aktivität der Steroidbildung durch intravenöse Verabreichung an hypophysectomierte Rattenderart bestimmt, daß ein Peptidprä parat in die femorale Vene injiziert und 30 Minuten spater Blut aus der abdominalen Aorta entnommen wurde Für alle Versuche wurde der dritte USP Corticotropin Be/ugsiiandard verwendet, und die Bildung von I 1-1 fydroxycurtieosteroiden (1 1-C)HCSi wurde fluorometrisch nach Peterson |J. Biol. Chem. Bd. ."!25 [1957], S. 25) durchgeführt. Für jeden Versuch wurden mehrere Bestimmungen durchgefühlt, uiiu die erhaltenen Werte wurden nach der Methode von Sheps 1.1 ml Moore. J. Pharmacol. Fxptl. Thcrap. BJ. 12S (196Oi. S. 99 statistisch behandelt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle IV /usammermesteüt.

Tabelle IV Stimulierende Wirkung auf die Nebennieren

Methode

Ver.ihrci-

Ascorbinsäurevcrarmung ! s. c. I

in-vivo-Steroidbiklung im I

Ncbeiinicrenkanälchen j i.v.

Dexumethasonncmbutal- j

blockierte Maus j i.v.

periphcres Blut j i.v. I

' periphercs Blut j is. j

Anmerkung:

Die Aktivitäten sind ausgedrückt in WSP-ljnheitcn ms. Ixvoaen juf den 3. IJSP Corticotropin-Be/ui:ssi;iiiil;ird. I — Ihu'-ACTIIl I ISi-

NH₂. H = Ihii'-Orn¹⁵-ACTII(I IS)-NII₂. Ill ■= ihii'-ACTIIi Γ 27I-OII.

I!	Peptid	III	(r Il	>^:-ACTM	.,.-ACTI
250	t			26	100
305				151	ISO
360 3.S0 318		325 320		170 177 50

Aus label le IV ist ersichtlich, daß die C'orlieotropin- peptide der Erfindung eine sehr hohe Aktivität bei der Stimulierung der Nebennieren aufweiset:. Die Aktivität ist mehr als zweimal so groß als die von Gly'-ACTH(I-18)-NH₂ und natürlichem Corticotropin, bestimmt nach dem Ascorbinsäurcvei armungs- tesl und der Methode der In-vivo-Bilduiig von Steroiden. Außerdem ist icstzustcllcn. daß die Aktivität von I, Il und III. bestimmt durch den I l-l lvdro\\- cortieostcroidspieiiel im peripheral Blut der Ratte. unverändert isi. unabhängig davon, ob die Peptide intravenös oder intramuskulär verahfoliil werden.

Bei (}|y'-ACTH(l-l8)-NH_: hui jedoch das Aktivi- !ätsverhältnis son intramuskulärer zu intravenöser Vciabfolgung einen Wert von etwa I :3. Dies bedeutet.

to daß die l-x-Aminoisobuttersäuie-coi ticotropinpeptide der Erfindung gegenüber der Finwirkimg von Aminopeplidasc im Gewebe beständiger sind als das 1-CjIvcinanaloge.

Die Corticolropinpeptide der Erfindung /eigen

f->5 auch eine starke lipotropc Aktivität. In Tabelle V ist diese Wirkung mit der von ( ils'-ACTHl !-IS)-NI I₂ und natürlichem Schaf-Corticotropin <X₅-ACTI-I) vcr- »lichcn.

Tu hello V

Versuchstier

Mindest«irkdosis, 10" mg/50 mg Gewebe

GIy¹-ACTU-Il IS)-NHj

Il

IM

.■,-ACTH

Rattenfettgewebe 0.062 0,086 0,036 6,3 6,0 Kaninchenfettgewebe 0.47 0,013 0,001 0,35 7.1

Anmerkung:

Die lipolrope Aktivität wurde nach T a η a k a et al, Arch. Biochem. Biophv. Bd. 99 (1962). S. 294. an Fettacwebe der Ratten cpididymis und Kaninchennierenfcttgewebc bestimmt. Der Parameter ist die Zunahme der unveresterten Feltsaurckonzentratiün sowohl im Medium als auch im Gewebe. Die Aktivität wird ausgedrückt durch die Mindestwirkdosis pro 50 mg Gewebe. I, Il und II! haben die in Tabelle V angegebene Bedeutung.

Die Prüfung der nielanophoren-stimulierenden Ak- 15 peptide der Erfindung werden mit GIy¹-ACTH(I-18)-

·. ~. _t_ _1_ J__ 1 x..l_ _ J. Τ.Γ (it·. - viii 1 Λ /"¹T^TT / 1 1y1\ /~\ T4 iQ\mn f* t VlPn^'\ Λ7ί*Γ«ΙΪΓ·Κ/»Γ»

livilät wurde nach der Methode von K.Shizume, A.B. Lerner und T. B.Fitzpatrick, Endocrinol.

Bd. 54 (1954t. S. 553. mit isolierten Hnutfnigmenten von Rana pipicns durchgeführt. Die Ergebnisse siiul in Tabelle Vl zusammengesiclll. Die Corticoiropin-NH₁ und ACTH(l-24)-OH (Synacthen*) verglichen. Als "Bezugsstandard wird ein reines Präparat von nativem a-melanophoren-stimulierendeii Hormon I y-MSI 1) verwendet.

Tabelle Vl

Ibu'-ACTIK 1-1S)-NH, Ibu'-Orn^-ACTHd-lSl-NMl ihu'-ACTHd^l-OH ACTH(I-24 )-OH Gh'-ACTHd-lSl-NH,

MSH	ill.:·
Akt	eiu-i".
	HV
(ι.ο-	K)¹
Ι.1	if)"
1.6

6.7 -III^s

Die melanophoren-stiniuliereiule Aktivität der Corticotropinpcptide der Erfindung ist höher als die von Cily'-ACTH(1-18)-NH, und AC'TH(l-24)-()l 1.

Die biologische Halbwertszeit der Corticotropinpeptide der Erfindung und von natürlichem Corticotropin wurde mit der in vitro lipotropcn Aktivität bestimmt (ve!. A.Tanaka. B. T. Pickering und C. 11. Li. Arch. Biochem. Biophys. Bd. 99 |1%2;. S. 294). Die Ergebnisse sind in Tabelle VIl zusammen gestell!:

Tabelle VII

Peptid

111 MTO I

Pla>ma

Ulk 'i b|v-t"l Ulli

.\5 min
(<.O min
6.5 min
4.4 min
1.9 min

32.4 min
97.6 min
79.3 mm
5').2 min
30.0 min

122 261

91 250

42

Ibu'-ACTIld-lSl-NH,

Ibu'-Orn¹ '-ACTII(I- IX)-NMI,

Ibu'-ACTH(l-27)-OH '.. .. .

ACTH

GIy^ACTH(MS)-NH,

Anmerkung·

"I Fine Pepiidprohe wurde intravenös in die Vcru c:iva inferioi von ΗμιΙιίι inji/.icrt. un-1 HluipMibcn. die aus der ahdoiniii lieslininiien /.citabstiindeii cntiioinmen winden, wurden anuo^.iuo'l und ai>f die in Miro lipcirori.· \kti\itiit '.inlcrsiiclil.

') tine Probe wurde in fiisdicin PliKina \on ixicilhclisierlcn Kalten oder in Krehs-Rinücy-Biciirhon.ilpulTer gelöst, der RHitenohersclienkelniuske!. Rinderserun^ilhuinin und Ci!ueo<e enthielt iJiese (ienii-sthc wurde;· bei 37 ( inkuhiert. und ;uis in Zeituhständen cntnoniniene Proben wurden ;iuf die in Miro lipotropc Akliviliil untersueht

.9 min

S min .2 min .9 min .6 min

alen Aoit.i m

Sehnilte vor, dem CieniU(_lt

Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß die Halbwertszeit der I -a-Aminoisobuttcrsiiiirc-corticoiropinpcptide nahezu die gl.'iche isl wie die von n.ttiirliehem Coriicolropin und wesentlich langer ist als die von GIy¹-ACIH(I-IS)-NH₂. Dies zeigt, da» die aminoeiulsländigc Subsliliilion durch K-Aminoisobnitcrsäure im Corticotropin die Wirkungsyeriängeriing und Akti\nä!sslcigcruni» erheblich verbessei 1.

Die l-y-AminoisobuUcrsäiire-eorlicoiropinpepiide tier 1 1 t'nickmy können in Komplexe mti kviniplexbildendcn Schwermetallverbindungen. /.H /ink-Knplei-. Er-Cn-. Nickel- oder Kobaltvi.-fiiiiidiin.ue.il. loirplexbildetulen l'olv.inniM^äuien. ui,- Ι'·.ι1\ ljIim aminsäurc. PoKasparaginsäure. Copoly-glutaniyltyrosin oder Copoly-asparagyl-glutaminsäurc. oder mit deren Gemischen umgewandelt werden. Die Komplexe /eigen gegenüber dem normalen Peptid eine ausgezeichnete lange Wirkung. Die Schwcrmehillkoinplcxe können durch Umsetzung des Corticotropinpeptids mit einer Schwcrmctallvcrbindutig. /Ii. einem Sehwcrmetallhalogenid. wie /inkchlorid. Kupferchlorid. Eisenchlorid. Kobaltchlorid oiler Nik-

ds kelcliΙοί id. einem Acetat, vsie Zinkacetat .einem Sulfat, ν ic /inksulfat. oder einem Hydroxid, wie Zinkhydro ■>iil. im Gt-wichb verhältnis 1:0.1 bis 100 unter .1 ln\ai-h saiiien I'.e■ 1>nt-unt'cn. voiv.ug-,weise bei pH 6.5

bis 7,0, in üblicher Weise hergestellt werden. Das bevorzugte Schwermetall ist Zink. Der Polyaminosäurekomplex kann durch Umsetzen der Corticotropinpeptide der Erfindung mit einer Polyaminosäure in einem Gewichtsverhältnis von 1:0,1 bis 100 unter schwach sauren Bedingungen, vorzugsweise bei pH 6,5 bis 7,0, in üblicher Weise hergestellt werden. Die Polyaminosäuren können Homopolymerisate oder Copolymerisate von Aminosäuren sein, und sie können die l-, d- oder DL-Konfiguration besitzen. Beispiele für bevorzugte Polyaminosäuren sind PoIy-L-glutaminsäure, Poly-D-glutaminsäure, Poly-DL-glutaminsäure, Poly-L-asparaginsäure, Poly-D-asparaginsäure, Poiy-DL-asparaginsäure, Copoly-L-glutamyl-L-tyrosin und CopoIy-L-asparagyl-L-glutaminsäure. Die Polyaminosäure hat vorzugsweise ein Mole kulargewicht von 1000 bis 100000. insbesondere 2000 bis 6000. Vorzugsweise wird eine Polyaminosäure verwendet, die vorher mit einer Base. /.B. Natriumhydroxid, neutralisiert wurde. Zur Herstellung des Komplexes können noch andere geeignete Zusätze verwendet werden, wie Konservierungsmittel. z.B. Benzylalkohol, Phenol oder Thimerosal. PutTer. 2. B. Citrat-. Phosphat- oder CarbonatpulTer. oder lsotonisierungsmittel, wie Natriumchlorid.

Die vorstehend angegebenen Versuchsergebnisse sind lediglich Beispiele. Da die anderen Verbindungen der Erfindung ebenso wie die vorstehend beschriebenen Verbindungen nahezu die gleichen Eigenschaften lüid Vorteile als ArzneistofTe aufweisen, sind die 1 z-Aminoisobuttersäiire-corticutropir peptide der Erfindung wertvolle ArzneistofTi. die >. B. zur Behandlung von akutem und chronischem Gelenkrheumatismus. Allergosen oder Nebennicrenrindenerkrankungcn bei Menschen und Tieren eingesetzt werden können.

DieCorticotropinpeptideder Erfindung, ihre Säurendditionssalze und Komplexe können oral oder parenteral in üblichen Vcrabreichungsforiiicn. z.B. ills Injektionspräparate, Flüssigkeiten. Suspensionen. Emulsionen oder Aerosolen, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Trägerstoffen. Stabilisatoren. Emulgatoren. Konservierungsmitteln. Puffern. isolonisicrmiltein und bzw. oder Bcfcuchtungsinittcln. verabfolgt werden. Typische Verabreichungsdosen betragen etwa 0.2 L'/kg bis 0.8 U/kg für einen Erwachsenen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel I
(a) Benzyloxycarbonyl-ii-aminoisobuttcrsaurc

Eine Eösungvon 5,16 g a-Aminoisobuttcrsäure und 5.30 g wasserfreiem Natriumcarbonat in 50 ml 1 n-Natronlaugc wird bei 0"C mit 9.39 g Chloramciscnsäurebenzylc.4er versetzt, und das Clcmisch wird 3 Stunden gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch mit Äther extrahiert, um überschüssiges Reagenz abzutrennen, mit 6 η-Salzsäure angesäuert und in Alhylacetat extrahiert. Der Äthylacclalexlrakt wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der kristalline Rückstand '»\ird aus einer Mischung von Äthylacetat und Pctroliithcr umkristallisiert. Ausbeute 8.75g vom I Ci5 '"Ms (■(-. C.

(hl icil.-Riit\loxycarbonyl-</-aminoisohuttei saute

Eine l.i'isuii!'. von 4.75g a-Aminoist'buttersäure und J ""■ ι· NairiumhicarSoiiat in 46 ml I n-Natronlaui'.e und 30 ml Dioxan wird tropfenweise mit einer Dioxun- lösung von 7,25 g Azidoameisensäurc-tert.-bulylester versetzt und 5 Tage bei 40 bis 50°C gerührt. Hierauf werden nochmals 6,6 g Azidoameisensäure-tert.-butyl ester und 46 ml 1 η-Natronlauge zugegeben, und das Gemisch wird 2 Tage bei der gleichen Temperatur gerührt. Danach wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird abgekühlt und mit eiskalter 4 η-Salzsäure auf pH 3

ίο angesäuert. Die Lösung wird mitÄthylacetatextrahiert, der Extrakt .über Natriumsulfat getrocknet und einsedampft. Nach UmkristaHisation aus Äther werden 0.82 g Produkt vom F. 119 bis 120" C erhalten.

(c) teri.-Buiyloxycarbonyl-O-benzyl-L-iyrosinp-nitrophenylester

Eine Lösung von 2.97g tert.-Butyloxycarhonyl-O-benzyl-i.-tyrosin und 1.12 g p-Niirophenol in Äthyl-

:o acetal wird hei 0 Γ mit einer Äthylacetatlösung von Ι.6^ς g N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 3 Stunden bei 4 C stehengelassen. Der Dicyclohcxylharnstofi" wird abliltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft Der feste Rückstand wird

.-■5 in heißem Äthanol aufgenommen, und dio sich heim Abkühlen abscheidenden Kristalle werden abfilmen, mit kaltem Äthanol gewaschen und unter vermindertem Druck iielrocknet. Ausbeute 3.39 g vom E". 140 bis 141 C. [zß²-0.3 ±0.4 (c = 0.983. Äthylacetat).

(d) Bi:nz\loxycai bonvl-a-aminoisobutyryli.-ivrosin-hydrazid

1.54 g Benzyloxvcarbonyl-a-aminoisobuttersäure und 1.27 g L-Tyrosinmethylestcr werden in Acetonitril gelöst und bei 0 C mit einer Acctonitrillösung von 1.34 g N.N'-Dicyclohcxylcarbodiimic! versetzt. Das Gemisch wird 16bis 18 Stunden bei 4 C'stehengelasscn. danach wird der ausgeschiedene Dicyclohcxylharnstoff abfiltriert unc¹ das EiUj-U unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen, die Älhylacctatlösung mit 1 n-Salzsäure und 5prozcniigcr Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält den Dipcptidestcr als sirupösen Rückstand. Der Rückstand wird in 15 ml Äthanol gelöst und mit 0.8 ml Hydrarinhydrat versetzt. Nach 2tägigcm Stehen bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit

so Wasser versetzt. Hierbei scheidet sich das Dipcptidhydrazid kristallin aus. Ausbeute 2,35 g. Nach Umkiistallisalion aus wässricem Äthanol schmilzt das Produkt bei 164 bis 165^C. [aß⁷ -31.4 + 0.7 (<■=.-1.078. Methanol).

(el icrt.-Butyloxycarbonyl-O-bcnzyl-i.-lyrosvl-I -scrin-mcthylcstcr

E.inc eiskalte Lösung von 1.03 g i.-Scrinmcthylcsterhydrochlorid in 8 ml Dimethylformamid wird mit 0,92 ml 'I'riäthylamin versetzt. Das ausgeschiedene Triällnlamin-hydrochlorid wird abliltriert. Das EiI-irat wird mit 2.96 g lert.-Butyloxycarbonyl-O-benzyli.-tyroi-in-p-niifophenylester mit etwas Dimcthylfor-

('? tnamid versetzt und das Gemisch 2 lage bei 4 C stehengelassen. Manach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von

45 bis 50 c ahdcstülicTt. der Rückstand in Äthvl-

acetiit gelöst und die Lösung nacheinander mit eiskalter I η-Salzsäure, Wasser, 2 n-Ammoniaklösung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Die erhaltene gelatinöse Masse wird mit einer Mischung von Äthylacetat und Petroläther ausgefällt. Nach nochmaliger Ausfüllung mit wäßrigem Methanol werden 2,75 g reines Dipeptid vom F. 73 bis 77" C erhalten. W,²,²+ 7,7 ±0,5° (i·= 1,046, Methanol).

IO

(0 Beiuyloxycarbonyl-ii-aminoisobutyryl-O-benzyl-t.-tyrosyl-i.-serin-hydrazid

2,08 g tert.-Bu'yloxycarbonyl-O-benzyl-L-tyrosy!- i.-serinmethylester werden in 20 ml einer 1 n-ChlorwasserstofFlösung in Essigsäure gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach dem Abdampfen des Lösungsmittels hintcrbleibt ein öliger Rückstand, dor nadi Behandlung mit Äther kristallisiert. Die kristalle werden aM'illriert und in einer Mischung aus (. mi Wasser und 20 ml Dichlonnethan uelö.sl. Die Lösung wird mit 6 ml ei.sk lter 50prozenti-{:er Kaliumcarbonailösung versetzt, gründlich gemischt und die organische Lösung abgetrennt. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und unter \e: !Hinderten! Druck eingedampft.

üererhaltenekrNialiine O-Benzyl-i.-tyrosyl-i.-serinmethylester wird in Acetonitril zusammen mit 1.04 g Benzyloxycurhonyl-x-aminoisobuuersäure gelöst. Die Lösung wird mit einer Acetonitrillösung von 0.91 g Dicyelohexylcarbudiimid bei OC versetzt und 16 bis IS Stunden bei 4 C stehengelassen. Der ausgeschiedene Dicyclohexy!harnstoff wird abl'iltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und die Lösung nacheinander mit 1 n-Salzsäurc. Wasser und Sprozentiger Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene rohe Tripeptidester zeigt im Dünnschichtchromatogramm (in Äthylacetat) die Gegenwart einer geringen Menge einer weiteren Komponente. Der rohe Ester wird in 20 ml Äthanol gelöst und mit 1.0 mi Hydrazinhydrat versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen und hierauf unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, mit Wasser gewaschen und rasch über Natriumsulfat getrocknet. Die sich beim Stehen abscheidende Fällung wird abn'lriert. mit kaltem Äthyiacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrucknet. Ausbeute 1.91 g Hydrazid. Nach nochmaliger Umfallung aus Äthanol, schmilzt die re::ic Verbindung bei 151 bis 153° C. [aß²-2.2 ±0.4 (c=l,062, Essigsäure).

(g) lert.-Butyloxycarbonyl-j'-benzyl-i.-glulaminsäure-p-nitrophenylcster

9.0 g tcrt.-Butyloxycarbonyl-y-benzyl-i.-glulaminsäure-dicyclohexylaminsalz werden mit Dowex fto 5OW-8 (H ⁺ -Form. feuchtes Volumen IS ml) in öOprozcnligem Äthanol 30 Minuten geschüttelt. Sodann wird ei μ s Harz abfihriert. das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand in Äther gelöst. Die Lösung wird über Natriumsulfat r>s getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erluilt t|iiantitativ die freie Säure. Die Säure wird in Allylacetat zusammen mit 2.4gp-Nitrophena! gelöst, und die Lösung bei 0" C mit 3,6g Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 16 bis 18 Stunden stehengelassen, danach vom ausgeschiedenen DicycIoliecylhurnstofTabfiltriert, das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft und , der Rückstand aus Äthanol umkristallisiert. Nach nochmaliger Umkristallisation aus Äthanol werden 7,0 g Eister in reiner Form vom F. 118 bis 1 \^cj C erhalten [aß⁸ - 33.1 + 0,7^ί; (c = 1,082. Methanol).

(h) tert.-Butyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryplophyl-

glycin

Eine Lösung von 1,20 g L-Histidyl-L-phenylalanyli.-arginyl-L-tryptophyl-glycin-acetat in 10 ml Dimethylformamid wird mit 1,03 g tert.-Butyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutaminsäure-p-nitro-phenylesier und 25 ml Dimethylformamid versetzt und 3 Tage bei 4 C stehengelassen. Die -.rhaltene Lösung wird tropfenweise in 200 ml eines L-.-misches gleicher Volumteile Äthyiacetat und Äther gegeben. Die ausgeschiedene Fällung wird abliltriert. mit Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,86 g. Die Füllung wird in etwa i() ml 50prozenliger Essigsäure gelöst und mit etwa 100 ml Äthanol versetzt. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert und aus Essigsäure lyophilisiert. Anbeute 1.37 g Produkt. [Oi]Jf- 23.'Ji 0.6" (r= 1.020. 50prozentige Essigsäure).

Das Ausgangs-Pentapeptid. d.h. L-Histidyl-i.-phenylakuiyl-L-arginyl-i.-tryptophyl-glycin. kann nach Bull. Chem. Soc. Japan." Bd. 38Π965). S. 1148 oder der japanischen Patentanmeldung Nr. 17 117 1969 oder nach folgender Methode hergestellt werden:

tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-N^Cl-tosyl-[.-arginyl-i.-tryptuphyl-gly>.inmethylesiei

5.9 g tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylaIanyl-N^r>tosyl-L-areininhydrazid (hergestellt nach Bull. Chem Soc. Japan. Bd. 37 [1964], S. 1465) wird mit Natriumnitrit behandelt. Das ausgeschiedene Azid wird mit L-Tryptophyl-glycinmethylcster in Äthylacetat umgesetzt. Der L-Tryyptophyl-glycinmcthylcster wird durch katalytischc Hydrierung von 4,1 g Benzyloxycarbonyl-i.-tryptophyl-elycinmcthylcstcrerhalten. Ausbeute 5.3gvornF.l ISbis^CIa]?/⁷ - 14.8 + 0,3 (c= 2.077. Methanol).

Benzyloxycarbonyl-i.-histidyl-L-phenylalanyl-N^G-tosyl-i.-arginyl-t.-tryptophyl-glycinmethylcster

5,0 g des oben erhaltenen Tetrapeptidmelhylesten werden 4 Stunden bei Raumtemperatur mit Ameisen säure umgesetzt. Der erhaltene Tetrapeptidestcr win mit Ben~yloxycarbfenyl-L-hisiidinazid (hergestellt aiii 2.7 g des entsprechenden Hydrazids) kondensiert Nach beendeter Umsetzung wird das Produkt au Äthanol umkristallisiert. Ausbeute 3,9 g vom F. IfSr bis 190 C. [aß⁷-23,4+ 0.6"- (c= 1.037. Dimethyl formamid).

Benzy lox year bony l-i.-histidyl-l.-phcnyla lain I-N''-tosyl-ΐ -arginyl-i.-tryptophyl-glycin

2.2 g vies oben erhaltenen Pcntapeptidcsters werdet 30 Minuten in wäßrigem Methanol mit 2 Moläqiii

\alenlen Natriumhydroxid verseilt. Nach beendeter I insL't/iini! wird das Produkt aus wäßrigem Methanol iimkristnllisiert. Ausheule 1.6 i! vom I·. 175 bis I 7S C. |*tf/ -21.4 I O.fi (C= 1.066. Dimethylformamid).

ι.-I lisii(lyl-i.-phcnyhihtny!-i.-arL'inyl-i.-tryplo|ih>lglyein

1 .^Ί.' }·. des oben erhaltenen Penlapeplids werden mit Fluorwasserstoff in Gegenwart von 1.3 ml Anisol 30 Minuten bei OC umgesetzt. Das von der Schutzgruppe befreite Pcntapcptidhydrofluorid wird auf eine Austauschersäure mit Amberlite CG-400' (Acetat-Form) gegeben und in das entsprechende Acetat umgewandelt. Das Acetat wird aiii eine Austauschersäulc mit Carboxymethylcellulose gegeben und mit einem Ammoniumacctatpufler mit einem linearen Kon/entrationsgradientcn von 0.01 bis 0.1 Mol eluiert. Ausbeute 0.76 g; [atf/ - 10.5 + 1.0 (c - 1.043. I n-Sal/.säurc).

Aminosäurenverhältnis nach Abbau mit Lcucinaminopcplidasc: Histidin 1.00. Phenylalanin 1.00. Arginin 1,02, Tryptophan 1.00. Cilycin 1.07.

(i) tert.-Biilyloxycarbonyl-i.-mcthioninp-nitrophenylestcr

K).S g tcrt.-Butyloxycarbonyl-i.-mcthionin-dicyclohcxylaminsal/ werden mit Dowe.x 50 W · 8* (H ' -Form) gemäß Beispiel 1 (g) behandelt. Die erhaltene ölige Säure und 3.5 g p-NitrophenoI werden in Äthylacetat gelöst, und die Lösung wird mit einer Äthylaeetatlösung von 5,2 g Dicyclohcxylcarbodiimid bei OX versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4' C stehengelassen, der ausgeschiedene DicyclohexylharnstofT abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert. Ausbeute 7,8 g vom F. 96 bis 97"C. lag¹ -48.3 ±0.9° (r= 1.020, Methanol).

(j) tert.-Butyloxycarbonyl-i.-methionyl-j-bcnzyl-

i.-glutamyl-i.-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-

i.-tryptophyl-glycin

1,26 g tert.-Butyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin werden im 6 ml Trifluoressigsäure gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird das Reaktionsgemisch in einem Eisbad abgekühlt und mit Äther versetzt. Hierbei fallen 1.34 g des partiell entblockierten Hexapeptids aus. Die Kristalle werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst, und die Lösung wird mit 0.46 ml Triäthyiamin sowie 0,74g tert.-Butyloxycarbonyl-L-methionin-p-nitrophenylester versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 4°C stehengelassen und anschließend in 250 ml eines eiskalten Gemisches von Äthylacetat und Diäthyläther (1:4) eingegossen. Die erhaltene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 1,56 g. Das Produkt wird in 15 ml Äthanol suspendiert und die Suspension zum Sieden erhitzt. Nach dem Abkühlen werden die ausgeschiedenen Kristalle abfiltriert, mit kaltem Äthanol und Äther gewaschen und aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 1.16 g. [aß²-18.5+0.5° (c= 1.072, Dimethylformamid).

Ik) Ben/yloxycarhonyl-rt-aminoisobiityryl-

O-bcn/.yl-i -tyrosyl-i.-scryl-i.-methionyl-j-ben/yli.-glutamyl-i.-histidyl-i.-phenylalanyl-i.-aruinyl-

i.-lryptophyl-glyein s

Fin Gemisch aus 0.47 g Ben/ylo.\ycarbonyl-a aminoisobutyi'yl-O-ben/yl-i.-lyrosyl-i.-scrinhydrazid 2 ml I η-Salzsäure und 2 ml Dimethylformamid wire in einem Fishad abgekühlt und tropfenweise mi

ίο 0.44 ml einer eiskalten 2 molaren Natriumnitritlösunj versetzt. Das Gemisch wird 4 Minuten bei 0⁰C gerühr und anschließend mit eiskaltem Äthylacetat extra hiert. Der Allylacetat wird mit eiskalter Natrium bicarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfa getrocknet. Die erhaltene Lösung wird mit einer Lö sung von L-Methionyl-y-benzyl-i.-glulamyl-i.-histidyl L-pheny la lanyl-L-arginyl-i.-tryptophyl-glycin-tri fluor acetat (hergestellt in quantitativer Ausbeute au: 0.4 mMol Produkt [j] durch Behandlung mit 3 ml Tri fluoressigsäure) und 0.25 ml Triäthyiamin in 10 m Dimethylformamid versetzt. Das Gemisch wird untei vermindertem Druck bei einer Badtemperatur vor 20 C eingedampft, bis eine klare Lösung erhaiter wird. Sodann wird die Lösung 24 Stunden bei 4^r C stehengelassen. Hierauf wird der größte Teil de; Lösungsnviiels unter vermindertem Druck bei einci Badtemperatur von 45 C abdcstillicrt. Der Rückstanc wird mit Äther versetzt. Hierbei scheidet sich eine Fällung aus. Ausbeute 0.67 g. Die Fällung wird au<

}o einem Gemisch von Wasser. Methanol und Äthano umgefällt. Ausbeute 0.62 g rohes Peptid. Das Peptic wird auf eine Chromatographiersäule mit Silikage (Merck. 0.05 bis 0.2 mm. 150g) gegeben und mit einetr Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol. Essigsäure und Wasser (4:1:1) eluiert. Es werden Fraktionen vor jeweils 5 ml aufgefangen. Das Produkt wird durch Messung der Absorption bei 280 nm oder durch Dünnschichtchromatographie im vorgenannten Lösungsmittelgemisch aus n-Butanol. Essigsäure unc Wasser diagnostiziert. Die Fraktionen 66 bis 90. die das Decapeptid enthalten, werden vereinigt und untei vermindertem Druck eingedampft. Der gelatinöse Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 0.51 g. Das Produkt gibt bei der Dünnschichtchroma· tographie an Silikagel einen einzigen Fleck (Rf= 0.44 Butanol-Essigsäure-Wasser 4:1:2). Der optische Drehwert des Hydrochlorids [α]" beträgt -24.7+1.2^; (c = 0.534. Dimethylformamid).

(1) a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-rnethionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-

L-arginyl-L-tryptophylglycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid

Eine Lösung von 0,32g Benzyloxycarbonyl-rt-amino isobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-ybenzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl· L-tryptophyl-glycin in Essigsäure wird mit 0.4 m 1 n-Chlorwa-öserstoff in Essigsäure versetzt und sofort lyophilisiert. Das Iyophilisierte Produkt wird übei Natriumhydroxidplätzchen unter verminderten· Druck getrocknet. Das erhaltene Decapeptid-hydrochlorid wird in 3 ml Dimethylformamid zusammer mit 0.083 g N-Hydroxysuccinimid gelöst. Die Lösung wird mit einer Lösung von 0.15 g Dicyclohexylcarbo diimid in 2 ml Dimethylformamid versetzt und If bis 18 Stunden bei 4° C stehengelassen. Der ausge schiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert unc

409539/36S

das Filtrat in ein eiskaltes Gemisch aus 50 ml Äthylacctat und 50 ml Diäthyläther gegeben. Die erhaltene Fällung wird «•bfiltricrt. mit Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Es werden 0.36 g des aktiven Dccapeptidesters erhalten.

D, s Triacctat von N^r-tcrt.-Butyloxycarbonyl-i.-lysyl-i.-prolyl-i-valyl-glycyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N'-tcrl.-bulyloxycarbonyl-i.-lysyl-L-arginyl-L-arginin-amid (hergestellt in quantitativer Ausbeute aus 0,12 mMol des entsprechenden N'-Benzyloxycarbonylderivats durch katalytische Hydrierung nach Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 39 [1966]. S. 882) wird in 2 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.18 ml Triäthylamin versetzt. Die Lösung wird mit einer Dimethylformamidlösung des obengenannten aktiven Esters versetzt, und das Gemisch (Gesamtvolumen 4 ml) wird 48 Stunden bei 4"C stehengelassen. Sodann wird das Gemisch in 100 ml eiskaltes Äthylacetat eingegossen, die ausgeschiedene Fällung abfiltriert, mit Äthylacetat und Diäthyläther gewaschen, aus Essigsäure lyophilisiert und unter vermindertem Druck über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet. Ausbeute 0.56 g des geschützten Octadccapeptids.

Das erhaltene geschützte Octadecapeptid wird in einen Reaktionsbehälter aus fluoriertem Polyäthylen gegeben, mit 0,1 g L-Methionin und 0.5 ml Anisol versetzt und in einem Trockeneis-Acetonbad mit Fluorwasserstoff versetzt. Das Reaktionsgemisch (etwa 10 ml) wird 90 Minuten bei 0⁰C gerührt und sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Dersirupöse Rückstand wird in eiskaltem Wasser gelöst, die Lösung mit Äthylacetat gewaschen und anschließend auf eine Äustauschersäule(1.7 χ 12cm)mit AmberliteCG-400* (Acetat-Form) gegeben. Die Säule wird mit Wasser cluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck auf etwa 20 ml eingedampft und lyophilisiert. Ausbeute 0.65 g rohes entblockiertes Peptid. Zur Reinigung wird das Produkt auf eine Säule (2.7 χ 27 cm) mit Carboxymethylcellulose (Serva Co.. 0.56 mÄq/g) gegeben und mit einem AmmoniumacetatpufTer (pH 6,8. 2000 ml) mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0.02 bis 0.6 Mol eluiert. Fraktionen von jeweils 10 ml/ Röhrchen werden aufgefangen, und die Absorption wird bei 280 nm bestimmt. Die Fraktionen mit dem Hauptmaximum (Nr. 156 bis 180) und der Schulter (Nr. 181 bis 200) werden aufgefangen, und die Haupt menge des Lösungsmittels wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 50 bis 55^JC abdestilliert. Die Rückstände werden bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert. Ausbeutel 89 mg(F-I)und 76 mg (F-II) farblose Pulver. F-I (189 mg) wird an einer Kolonne (2.2 χ 25 cm) mit Carboxymethylcellulose auf die vorstehend beschriebene Weise nochmals Chromatographien. Es werden 137 mg reines Peptid F-I-I mit einem einzigen Absorptionsmaximum erhalten. Eine kleine Schulter des Absorptionsmaximums liefert 37 mg der Fraktion F-I-2. Die Fraktionen F-II (76 mg) und F-I-2 (37 mg) werden vereinigt, und die Chromatographie wird zweimal wiederholt. Es werden 29 mg des gewünschten Peptids erhalten. Die Gesamtausbeute an Octadecapeptid beträgt 166 mg. [aß³-58.4 ±1.9" (<· = 0.514. O'.l n-Essigsäure).

O.l nHCI

279

E^ = 25.1). ;£«„»£' 288 nm

t£lcii=l9.7).^i"-^NiOH281 nm(£{ä = 25.2).288 nm {Ε¹*£ = 24.4). Das Peptid verhält sich bei der Dünnschichtchromatographie (Lösungsmittel in n-Butanol-Essigsäure-Pyridin-Wasser 30:6:20:24) und bei der Papicrclcktrophorcse (600 Voll/36 cm. in 2 n-Lssigsäurc) einheitlich gegenüber Ninhydrin-. Pauly-. Ehrlich-. Sakaguchi- und Methionin (PtJ,,") Reagenz. Das Aminosäiirevcrhältnis des sauren Hydrolysats (6 n-HCI. 105 C. 40 Stunden) beträgt: Serin 0.83. Glutaminsäure 1.00. Prolin 1.07. Glycin 2.10. a-Aminoisobuttersäure0.99. Valin 1,00. Methionin 1.02. Tyrosin 0.97. Phenylalanin 1.04, Lysin 3,17. Histidin 0.92. Arginin 2.90. Das Tryptophan :Tyrosin-Vcrhältnis im intakten Ocladecapeptid beträgt spcktropholometrisch 1.12:1.

Bei Verwendung von N'-tert.-Butyloxycarbonyli.-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N'-tert.-butyloxyearbonyl-L-lysyl-L-arginyl-t.-arginin (hergestellt gemäß Bull. Chem. Soc. Japan. Bd. 39 [1966], S. 882) alscarboxylendständiges Octapeptid bei der vorstehenden Reaktion wird in ähnlicher Weise das a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-i.-scry l-L-methionyl-t.-glutamyl-i.-histidyl-L-pheny IaIanyl-i.-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-i.-lysyl-i.-prolyl-i.-valyl-glycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-i.-arginin erhalten.

Beispiel 2

(a) N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-t.-prolyl-L-valyl-glycyl-

N^a-tert.-butyloxycarbonyl-i.-ornithinmethylcster

1.2 N"-Benzyloxycarbonyl-N'⁵-tert.-butyloxycarbonyl-L-ornithinmethylester (F. 69 bis 70" C, [aß^s - 10.6 + 0.5" [<■ = 1.092. Methanol]) wird 2 Stunden an einem Palladiumschwarz-Katalysator in Methanol, das 10"_o Essigsäure enthält, hydriert. Nach dem Eindampfen unter vermindertem Druck hinterbleibt N^-tert.-Butyloxycarbonyl-L-ornithinmethylester-acetat als sirupöser Rückstand, der mit 50prozentiger wäßriger Kaliumcarbonatlösung in Dichlor· methan bei 0" C behandelt wird. Die organische LOsunc wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei einer Badlemperatur von 20"¹C eingedampft. Der Rückstand wird in 10 ml Dichlor methan gelöst und die Lösung mit 1.83 g N '-Benzyl oxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-t.-pro lyl-L-valyi-glycin versetzt, das gemäß Bull. Chem. Soc Japan. Bd. 37. (1964). S. 1471, hergestellt worden war Die Lösung wird mit einer Lösung von 0.60 g Dicyclo hexylcarbodiimid in Dichlormethan bei 0⁰C versetz und 2 Tage bei 4° C stehengelassen. Nach dem Ab filtrieren des ausgeschiedenen DicyclohexylharnstofT wird das Filtrat unter vermindertem Druck einge dampft. Der sirupöse Rückstand wird in Äthylaceta gelöst, mit eiskalter 1 η-Salzsäure und 1 m-Natrium bicarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat ge trocknet und unter vermindertem Druck eingedampft Der Rückstand wird erneut in 30 ml Äthylacetat aufge nommen und mit 30 ml Äther versetzt. Man erhält de Pentapeptidmethylester in reiner Form. Ausbeut 2.24 g; [aß⁶-55,9+ 0,9° (c= 1,062. Methanol).

(b) NMJenzyloxycarbonyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-proIyl-L-valyl-glycyl-

N⁴-tert.-butyloxycarbonyl-L-ornithinhydrazid

2.2 g des oben erhaltenen Pentapeptidmethylestei werden in 30 ml Methanol gelöst und mit 0.26 η Hydrazin-hydrat versetzt. Das Reaktionsgemisch wir 3 Tage bei Raumtemperatur stehengelassen und d:

·■*■·>

nach das Hydrazid durch Zugabe von Wasser ausgelallt. Die Fällung wird abfiltrieil und das wäßrige Methanol umkristallisicrt. Ausbeute 2.1 g. F. 175 bis 180 C. |a]²,⁵ - 35,8 + 0.7" (<·= 1.040. Dimcthylformaniid).

(c) N'-Bcnzyloxycarbonyl-N'-tcrt.-bulyloxycarbonyl-i.-lysyl-L-prolyl-i.-vaIyl-glycyl-N''-tcrt.-butyloxycarbonyl-i.-ornithyl-N^r-lert.-butylo.\ycarbonyl-t.-lysyl-t.-arginyl-L-argininamiddiacctat ι ο

Eine eiskalte Lösung von 0.95 g des oben erhaltenen Pentapeplidhydrazids in 10 ml 90prozcntigem Tetrahydrofuran wird mit 2,75 ml eiskalter 1 n-Salzsäurc und 0.61 ml 2 molarer Natriumnitritlösung versetzt. ,₅ Das Gemisch wird 5 Minuten bei 0"C stehengelassen und sodann mit 0,38 ml Triäthylamin auf pH 7.4 bis 7.6 eingestellt. Danach wird die Lösung mit einer eiskalten Lösung von N^r-tcrt.-Butyloxycarbonyl-i -lysyli.-arginyl-L-argininamid-triacetat (hergestellt aus 0.92 mMol N'-Bcnzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-i,-lysyl-N^fi-nitro-L-arginyl-N''-nitro-i.-argininamid durch katalylischc Hydrierung gemäß Bull. Chem. Soc. Japan. Bd. 39 [1966]. S. 882) und 0.42 ml Triäthylamin in 7,5 mi SOprozentigem Tetrahydrofuran gegeben. Das Gemisch wird 3 Tage bei 4" C stehengelassen und sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit 10 ml Äthylacetat und 10ml 1 n-Essigsäure versetzt und gründlich durchgeschüttelt. Die wäßrige Phase wird dreimal mit Äthylacetat extrahiert, die vereinigten Äthylacetatextrakte werden unter vermindertem Druck auf etwa 10 ml eingedampft, und das Konzentrat wird mit I n-Essigsäure versetzt und gründlich durchgeschüttelt. Das Konzentrat wird mit wassergesättigtem n-Butanol gründlich extrahiert. Der Extrakt wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 0,85 g. [ag² -43,1 + 1.5" (c = 0.540, 50prozenlige Essigsäure).

(d) a-Aminoisobulyryl-L-tyrosyl-L-seryl-

L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-

L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-i.-prolyl-

i.-valyl-glycyl-L-ornithyl-L-lysyl-L-arginyl-

L-argininamid

0.32 g des im Beispiel 1 (k) erhaltenen Decapeptidderivats werden in üblicher Weise in den entsprechenden N-Hydroxysuccinimidester umgewandelt. 0.32 g des erhaltenen aktiven Esters werden dann zu einer Lösung eines Octapeptids (hergestellt aus 0,19 g des im Beispiel 2 (c) erhaltenen Octapeptidderivats durch katalytische Hydrierung) 0.18 ml Triäthylamin in 4 ml Dimethylformamid gegeben. Das Reaktionsgemisch wird 64 Stunden bei 4°C stehengelassen und sodann in 100 ml eiskaltes Äthylacetat eingetropft. Die gebildete Fällung wird abfiltriert, mit Äthylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 0,49 g rohes geschütztes Octadeca peptid.

0,29 g des erhaltenen Rohproduktes werden in 5 bis 6 ml flüssigem Fluorwasserstoff zusammen mit 0,06 g Methionin und 0,29 ml Anisol bei der Temperatur des Gemisches aus Trockeneis und Aceton gelöst. Das Gemisch wird 90 Minuten bei 0°C gerührt, danach wird der Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in eiskaltem Wasser

553

gelöst und die Lösung zweimal mit Äthylacetat gewaschen. Die erhaltene wäßrige Lösung wird auf eine /\ustauschcrsäulc(1.7 χ 20cm) von AmbcrliteCG-400' (Acetat-Form) gegeben, und die Säule wird mit Wassei cluiert. Das Elual wird vereinigt, unter verminderten' Druck eingedampft und lyophilisicrt. Man erhall 0.34 g des cntblockicrtcn Octadccapcptids.

0.34 g des rohen Octadccapeptids werden an einet Chromalographicrsäule (1.7 χ 36cm) mit Carboxymethylcellulose (Serva, 0,56 mÄq/g) mit einem Ammoniumacetatpuffer (pH 6,8) mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,02 bis 0,6 Mo (1500 ml) chromatographiert. Es werden Fraktionen von 7.5 ml/Röhrchen aufgefangen, und es wird die Absorption bei 280 nm aufgenommen. Die Röhrchen entsprechend dem Hauptmaximum werden in zwei gesonderten Fraktionen F-I (Röhrchen 106 bis 130' und F-II (Röhrchen 131 bis 155) vereinigt. Die Hauptmenge des Lösungsmittels wird unter verminderten" Druck abdcstillicrt und der Rückstand wiederhol! bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert. Die Ausbeute an Fraktion F-I beträgt 76 mg und an F-II 84 mg Die 84 mg der Fraktion F-II werden erneut an einei Carboxymethylcellulosesäule auf die vorstehend beschriebene Weise chromatographiert. Es werden 30 mg der Fraktion F-Il-I erhalten. Die Fraktionen F-I und F-II-I werden vereinigt. Man erhält 106 mg teilweist gereinigtes Octadecapeptid. Zur weiteren Reinigung eines 65 mg Anteils wird dieses Produkt erneut an einei Säulc(l,7 χ 30 cmJmitCarboxymethylcelluloseiWhatman CM-52) mit einem Ammoniumacetatpuffei (pH 6,9) mit einem linearen Konzentrationsgradienter 0.02 bis 0.6 Mol (1500 ml) chromatographiert. Diejenigen Röhrchen, die einem einzigen Maximum ent sprechen, werden vereinigt, eingedampft und lyophili siert. Man erhält das reine Octadecapeptid, d.h. α· Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glut amyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl glycyl-L-Iysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-L-orr.thyl-L-lysyl L-arginyl-L-argininamid-acctat. Ausbeute 52 mg [aß⁵-57.3 ±1,9° (c= 0.499, 0,1 n-Essigsäure)

(Ej$ 17,8); ;^"-^NaOH= 281 nm (Zsfä 24,6). 288 nir (£j_cä 23,8). Das Aminosäureverhältnis im saurer Hydrolysat (6 n-Salzsäure, 105°C, 40 Stunden) hai folgenden Wert: Serin 0,80. Glutaminsäure 0.99 Prolin 1,04. Glycin 2,03. a-Aminoisobuttersäun 0.95, Valin 1.00, Methionin 1,03. Tyrosin 1.04, Phe nylalanin 1.05, Ornithin 1,08, Lysin 2,00, Histidin 1,01 Arginin 3,12. Das Tryptophan :Tyrosin-Verhältnis irr intakten Octadecapeptid bei der spektrophotometrisehen Bestimmung hat den Wert 1,19:1. Das Peptic verhält sich einheitlich bei der Dünnschichtchromato graphie (n-Butanoi-Essigsäure-Pyridin-Wasser 30:6 20:24) und bei der Papierelektrophorese (600 Volt 36 cm in 2 n-Essigsäure).

Beispiel 3

(a) Benzyloxycarbonyl-L-alanyl-glycintert.-butylester

6.70 g Benzyloxycarbonyl-L-alanin und 3,95 g GIy cin-tert.-butylester werden in 30 ml Äthylacetat gelös und mit einer Lösung von 6,20 g Dicyclohexylcarbodi imid in Äthylacetat bei 0°C versetzt. Das Gemiscl wird 16 bis 18 Stunden bei 4° C stehengelassen, dahacl wird der Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Filtra

nil eiskalter I η-Salzsäure und I m-Nalriiinibicarhoiatlosunu gewaschen, über Nalriumsulfal getrocknet iiui unier vermindertem Druck eingedampl'l. 'Der ■Uiekstand wird aus Allier und Petrnliilhcr umkrisialisictl. /\usbcutc7.S4i:. (".41 bis42 C.[xß" 41.h I O.U c 1.026. Methanol).

sH-it.Aiisheuic6.l)it. F. H8bisl5O' C.[7.i,V lc I.036. Methanol).

(h) Ben/.yliixyearhon\l-/'-lort.-huivl-i -aspart\ I-i.-alanyl ghein-lert.-butylesler

6,/3 » des üben erhaltenen Dipeplids werden ar l'alladiuni als Katalysator in 10",, I ssigsaure enthallcndcn\ Methanol 2 Stunden hydriert. Danach wini das Lösungsmittel unter vermindertem Druck ab is destilliert und der Rückstand mit wäßriger Kaliumearbonatlosiing in Gegenwart von Dichlormethan durchgeschüttelt. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck irngcdampfl. Man erhält i.-Alanyl-glyein-tert butylestcralsÖI.

Benzyloxyearbonyl-ß-tcrt. -but yl-i. -asparaginsäure (hergestellt durch Behandlung von 10.1 g des entsprechenden Dicyclohexylaminsalzcs mit Dowcx 50VV · K" [M ''-FormI in üblicher Weise) und der oben erhaltene Dipeptidester werden in Dichlormethan gelösl. und die Lösung wird mil einer Lösung von 4.1 3 g Dicyclohcxylcarbodimiid in Dichlormethan bei OC versetzt. Das Gemisch wird 16 bis IS Stunden bei 4 (' stehengelassen. Danach wird der ausgcscniedcnc Dicyclohcxylhamsioff abiiitriert. das Filtnit unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand in /Vinylacetat gelöst, mit eiskalter I n-Salzsäurc und 1 molarer Natriumcarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Das zurückbleibende Öl wird aus einer Mischung von Äther und Pelroliilher umkrislallisiert. Ausbeute 7.05 g reines Tripeptidderivat vom F. 111 bis 112C {-Al,¹ - 29.4 ±0.7* (c = 1.033. Methanol).

(c) ßenzyloxycarbonyI-i.-piol\l-₍;-tcrt.-buiyli.-asparagyl-i -alanyl-glycin-tert.-butylcstcr

6.10 g des oben erhaltenen Tripeptidesters werden an Palladiumschwarz als Katalysator 5 Stunden in 5"„ Essigsäure enthaltendem Methanol hydriert. Nach dem Abfiltrieren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft und der ölige Rückstand bei O¹ C mit wäßriger Kaliumcarbonatlösung in Gegenwart von Dichlormethan durchgeschüttelt. Die organisches) Lösungen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält den /i-tert.-Butyl-L-asparagyl-L-alanylglycin-tert.-butylester.

2.90 g Benzyloxycarbonyl-L-prolin und der oben erhaltene Tripeptidester werden in 50 ml Dichlormethan gelöst, und die Lösung wird mit einer Lösung von 2.48 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dichiormethan bei 0 C versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten bei 0^c C gerührt und hierauf 16 bis 18 Stunden bei 4' C stehengelassen. Der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit Ätheir digeriert. Es werden 6.45 g Kristalle erhalten, die in Acetonitril gelöst, und eine geringe Menge Dicyclohexy!harnstoff wird abfiltriert. Das Filtrat wird eineedampft und der Rückstand aus Äther umkristallild) N.O-1)iben/yloxyearbonyl-i -tyrns\l-i -proM-ii'-tert.-bulyl-i -asparagyl-i.-al'Mivl-glNcin-

tcrl.-biily':slcr

5.0 g des oben erhaltenen Tctrapcptidesters werd<-o 4 Stunden an Palladiumschwarz als Katalysator m Methanol hydriert, das 1 ml Essigsäure enthüll. Nic'n dem Abliltricrcn des Katalysators wird das Filirai unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wiril mit 50prozentiger wäßriger Kaliumcarbonatlösung in Gegenwart von Dichloimethan bei 0 ( ausgeschüttelt. Die organischen Lösungen werden vereinigt, über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Man erhält den i.-Prolyl-ß-tert.-bulyl-i asparagyl-i.-alanyl-glycin-tcrt.-butylester. Das Produkt ist einheitlich bei der Dünnschichlchromatographic an Kiesclgcl im Lösungsmiltelsystcm 11-Uulanol F.ssigsäuic-Pyridin-Wasser (30:6:20:24).

Carbodiimidmclhodc

0.45 g(l mMol) N.O-Dibcnzyloxycarhonyl-i.-tyrosin und 1 mMol des oben erhaltenen Tctrapepiidcsters werden in 10 ml Dichlormethan gelöst. Die Lösung wird mit einer Lösung von 0,206 g Dicyclohexylcarbodiimid in Diehlormethan versetzt und 16bis IS Stunden bei 4 C stehengelassen. Der ausgeschiedene Di cyclohexy'harnstolT wird abfiltriert, das Filtrat imuv vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit Äther versetzt. Die ausgeschiedene l'ällun;· wird abultricrt und aus Äthylacetat und Äther mnkristallisiert. Das Peptid schmilzt bei 121 bis 123 C. Ausbeute 0.51 g.

Das Produkt verhält sich einheitlich bei der Dünn schichtchromatogiaphie an Kicsclgel im l.ösungsmittelsy stern Chloroform-Methanol- F-.si esa nie

90:10:3.

Aktive Estermethode

5.77 mMol i.-Prolyl-/Mert.-butyl-i.-asparas!>l-! alanyl-glycin-tert.-buty tester werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst und mit 3.63 g N.O-Dibenzyloxycarbonyl-i.-lyrosin-p-nitrophenylester versetzt. Das Gemisch wird 3 Tage bei 4"C stehengelassen, d ach unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand aus Äthylacetat und Äther umkristallisiert. Nach nochmaliger Umkristallisation aus Athylaeeuu werden 6.65 g Produkt vom F. 126 bis 127 C erhalten [y.]l? - 48.3 ± 1.0 (c = 0.86. Methanol).

Ie) Benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosyl-i.-prolyli'-tert.-butyl-L-asparagyl-L-alanyl-glycin-

* tert.-butylester

6.60 g des oben erhaltenen Petitapeptidesters werder an Palladium als Katalysator in 10"_o Essigsäure enthaltendem Methanol 4 Stunden hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, das Lösungsmiue unter vermindertem Druck eingedampft und der Rück stand in Dichlormethan aufgenommen. Die Lösun; wird mit 50prozentiger wäßriger Kaliumcarbonat lösung bei 0⁰C durchgeschüttelt, die organische Lö sung über Magnesiumsulfat getrocknet und unte vermindertem Druck eingedampft. Der zurückblei

-*■

/f2 1

12 553

bende kristalline Pentapeptiddiester wird in 50 nil Dimethylformamid gelöst und mit 2,72 g Benzyloxycarbonyl-L-valin-p-nitophenylester versetzt. Das Gemisch wird 2 Tage bei 4° C stehengelassen und sodann unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 40 bis 45° C eingedampft. Das zurückbleibende Rohprodukt wird an Silikagel(Me rc k_T0,05bis0,2mm, 15d g) Chromatographien. Die Kolonne wird mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform mit einem linearen Methanolkonzcntrationsgradienten von 0 bis 5% entwickelt. Es werden 56 Fraktionen von jeweils 20 g/Röhrchen erhalten. Anschließend wird die Kolonne mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (5:95) eluiert. Jede Fraktion wird dünnschichtchromatographisch geprüft. Die Fraktionen der Röhrchen 55 bis 60 werden vereinigt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit Älher versetzt. Ausbeute 5.25 » Produkt. [u]iⁿ - 70.5 + 1.1 (c= 1.031. Methanol)."

(f) N"-Benzyloxycarbonyl-N'-teri.-but\li)\v-

carbonyl-i.-iysyl-i.-valyl-i.-tsrosvl-i.-proM-

/Mcrt.-butyl-L-asparagyi-i.-alanyl-ghcin-

lert.-butylcster

4.62 g lies Hexapeptidesiers werden 4 Stunden au Palladium als Katalysator in H.)'',, Essigsäure enthaltendem Methanol hydriert. Danach wird der Katah sato r abfiltriert, und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft Der Rückstand wird in Allylacetat aufgenommen, die Lösung mil Eis abgekühlt und mit SOprozentiger Kaliuniearbonatlösung durchgeschüttelt. Die organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und linie; vermindertem Druck eingedampft. Man erhält den Hcxapeptiddiester, der in 40 ml Dimethylformamid gelöst und mit 2.56 g N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-i.-lysin-p-nitrophenylcster versetzt wird. Das Gemisch wird 3 Tage bei 4 C stehengelassen und sodann bei einer Badlcmpcratur von 40 bis 45 C unter vertnindcrtem Druck eingedampft. Der Rückstand wird an Kieselgel (Merck. 0.05 bis 0.2 mm. 15OgI chromatographiert. Die Kolonne wird mit einer Mischung aus Methanol und Chloroform mit einem linearen Methanolkonzentrationsgradicnten von 0 bis 5",, entwickelt. Es werden 50 Röhrchen von jeweils 20 g'Röhrchen aufgefangen. Anschließend wird die Kolonne mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (5:95) weiter entwickelt. Die Fraktionen 71 bis 80 werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird mit Äther versetzt. Eis wird eine gelatinöse Masse erhalten, die mit Äther gewaschen und getrocknet wird. Ausbeute 4.38 g Produkt. [α],²,⁵ - 64.5 ± 1.0 (c = 1.037. Methanol). "

(g) Bcnzyloxycarbonyl-i -valvl-N^f-(crt.-butylo\\-
carbonyl-i -lysyl-i.-valyl-i.-tyrosyl-i.-prolyl-//-iert -butyl-i -asparagyl-i -alanyl-glvemtcrt.-butylestcr

3.5 g des oben erhaltenen Heptapeplidcsters weiden an Palladiumschwarz als Katalysator in K)".,, Essigsäure enthaltendem Methanol 3 Stunden hydriert. Danach wird der Katalysator abfillricri und das Lösungsmittel untervermindcitem Druckeingedampl'l. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen und die Lösung bei 0 C mit 50pro/entiger wäßriger Kaliuniearbonatlösung durchgcschültcll. Die organi

sche Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 30 ml Dimethylformamid gelöst und mit 1,29 g Benzyloxycarbonyl-L-valin-p-nitrophenylester versetzt. Das Gemisch wird 2 Tage bei 4⁼C stehengelassen und sodann bei einer Badtemperatur von 40 bis 45°C unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird an Silikagel (Merck. 0,05 bis 0,2 mm, 100 g) Chromatographien und die Kolonne mit einem Gemisch aus Chloroform und Methanol mit einem linearen Methanolkonzentrationsgradienten von 0 bis 5°-_o gewaschen. Es werden 50 Fraktionen von jeweils 20 g/Röhrchen aufgefangen. Sodann wird die Kolonne mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (5:95) weiter entwickelt. Die Fraktionen 52 bis 62. die das gewünschte Peptid enthalten, werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird mit Äther behandelt, abwaschen und getrocknet. Ausbeule 3.35 u Peptid. [2]^ -69,2 ± 1.0 (V = 1.061. Methanol).

lh) N²-Benz\loxycarbon>l-N^f'-nitro-L-argin\l-L-prolin-methylcster

Hin Gemisch aus 1,6 ml Thionylchlorid und 2.0 ml Methanol, das in einem Eis-Kochsalzbad abgekühlt wurden i>t. wird mit 2.30 g i.-Prolin versetzt und 16 bis \i> Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestillicrl und der Rückstand in Dichlormethan gelöst Die Lösung wird mit 2 ml Wasser versetzt und mit 4 ml eiskalter 50prozentiger wäßriger Kaliumcarbonatlösung bei OC durchgeschüttelt. Die wäßrige Lösung wird wiederholt mit Dichlormethan extrahiert, und die Extrakte werden vereinigt. Der Extrakt wird über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 20 C eingedampft. Man erhält den L-Prolinmethylester als sirupöscn Rückstand.

6.IX g N¹-Benzyloxycarbonyl-N^c'-niiro-L-arginin werden in Methanol gelöst, und die Lösung wird unter vermindertem Druck zu einem sirupösen Rückstand eingedampft, der in Acetonitril gelöst wird. Danach wird die Lösung npit dem oben erhaltenen L-Prolinmcthylcstcr sowie 3.61 g Dicyclohcxylcarbodiimid bei 0 C versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4 C stehengelassen. Die ausgeschiedenen Kristalle werden abliltricrt. mit kaltem Acetonitril gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Das erhaltene Produkt (9.98 g) wird in heißern Methano gelöst und von unlöslichem Dicyclohexylharnstofl abfiltriert. Das Filtrat wird unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Acetonitril um kristallisiert. Ausbeute 5.75 g vom F. 162 bis 163 C [%}]{■ - 50.9 ± 0.4' (c = 2.022. Methanol).

(i) N'-Benzyloxyearbonyl-N^tr-nitro-i.-arginvl-Ν''-nitro-i.-arginyl-i.-prolin-niethylcstcr

4.12 g des oben erhaltenen Dipeptidesters werdet in !() ml Essigsäure gelöst, die mit Bromwasserstof gesättigt ist. Die Lösung wird 60 Minuten bei Raum temperatur stehengelassen. Nach Zusatz von Äthc wird die amorphe Fällung abfiltriert, gründlich mi Älher gewaschen und über Natriumhydroxidplätz then unter vermindertem Druck getrocknet. Mai erhält das N'^Nitro-L-arginyl-i.-prolin-mcthylcster hvdrobromid.

134

2,83 g N*-Benzyloxycarbonyl-N^G-nitro-L-arginin werden in 2,5 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst und mit 1,63 g Tri-n-btUylamin versetzt. Die Lösung wird in einem Eis-Kochsalzbad abgekühlt und tropfenweise mit 0,96 g Chlorameisensäureäthylesier versetzt. Das Gemisch wird 30 Minuten in der Kältemischung gerührt, danach mit einer Lösung von 2,96 g des oben erhaltenen Dipeptidester-hydrobromids sowie mit Tri-n-butylamin in 40 ml Dioxan, das 1 ml Wasser enthält, versetzt. ι ο

Das Reaktionsgemisch wird 3 Stunden bei 0⁰C gerührt und 16 bis 18 Stunden bei 4° C stehengelassen. Danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand in 10% n-Butanol enthaltendem Äthylacetat gelöst. Die Lösung v.irdmit 1 n-Salzsäureund 1 moIarerNairiumcarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in 30 ml einer Mischung von Methanol und Chloroform (5'.¹J^) gelöst und an Silikage! (Merek. 0.05 bis 0.2 mm. 60 g) Chromatographien. Die Kolonne wird hintereinander mit 600 ml Chloroform. 200 ml eines Gemisches aus Methanol und Chloroform (5 :95). 1000 ml eines Gemisches au.·. Methanol und Chloroform (7:93). 400 ml eines Gemisches au·* ;s Methanol und Chloroform (10:90) und 400 ml eines Gemischesaus Methanol und Chloroform (1:1 jeliiiert. Jede Fraktion wird dünnschichichromatographisch geprüft, und die das Peptid enthaltenden Fraktionen wet ien vereinigt. Die Lösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand mit Athylacetat versetzt. Die gelatinöse Fällung wird abfiltriert, mit Athylacetat gewaschen und unter vermindertem Druck uetrocknet. Ausbeute 3.8 « vom F. 115 bis 120 C (Zersetzung), [aß⁷- 37.1 ±0.8 («=0.967. ,5 Essigsäure). —30.5 χ 0.7 (<■ = 0.950. Dimethylformamid).

(J) N'-Benzylox year bonyl-N^r-tert.-buly low carbonyl-i.-lysy l-N''-iiitro-ΐ. -argin yl-N^f '-nit ro-1.-a rgitiyl-i.-p'olin-methy lesler

3.7 g des oben erhaltenen Trineplidcsters werden in 10 ml Essigsäure gelöst, die mit Bromwasserstoff gesättigt ist. Die Lösung wird 90 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen und sodann mit wasserfreiem Äther versetzt. Hierbei fällt das Tripcptidcsterhydrobroniid aus. das aus einer Mischung von Methanol und Äther umkristallisiert wird. Ausbeute 4.6 g amorpher Feststoff. Das Produkt zeigt bei der Papier-Chromatographie im Lösungsmittclsyslcm n-Butanol-F.ssigsäure-Pyridin-Wasser (30:6:20:24)einen llauptflcck (Rf=O[M) und kleinere Flecken (Rf== 0.44 und 0.52).

N'-Benzyloxycarbonyl-N'-lert.-butyloxycarbonyli.-lysin (hergestellt aus .1.05 g des entsprechenden Dicyclohexylaminsalz.es durch Behandlung mit Dowex 50W ■ 8^ä in der H '-Form) und 1.11 gTri-n-butylamin werden in 20 ml wasserfreiem Tetrahydrofuran gelöst und in einem Eis-Koehsalz.bad abgekühlt. Die Lösung Ίο wird mit 0.65 g Chlorameisensaurcalhylester versetzt und 30 Minuten im Eis-Koehsalz.bad gerührt. Danach wird das Gemisch mit ei tier Lösung Jos oben erhaltenen Tripcplidcsters und 2.0 g Tri-n-butylamm m 30 ml Dioxan versetzt, das 3ml Wasser ent hält. Das erhaltene '-5 < icmisch wird 3 Stunden !>.·■ OC gerührt und danach 16 bis IX Stunden bei 4 C stehengelassen. Hierauf wird das Gemisch unter vermindertem Druck einuedampft, der Rückstand in 10% n-Butano| enthaltendem Äthylacelat aufgenommen, die Lösung nacheinander mit eiskalter 1 η-Salzsäure und 1 molarer Natriumcarbortaüösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Danach wird die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird zweimal aus einer Mischung von Athylacetat und Äther umgefällt. Ausbeule 3,82 g Produkt, [a]]? -37.9 + 0.7° (r = 1.064, Methanol).

(k) N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxy-

carbonyl-L-lysyl-N^G-nitro-L-arginyl-N^G-nitro-

L-arginyl-L-prolin

3.8 g des oben erhaltenen Tetrapeptideslers werden in 10 ml Methanol gelöst und 5,1 ml 1 n-Natronlauge \ ersetzt. Das Gemisch wird bei Raumtemperatur 90 Minuten stehengelassen und danach mit 5.Ί !:■: I n-Sal/.säure angesäuert. Hierauf wird das Mcth:i;n.| unter vermindertem Druck abdestilliert und der c v^· Rückstand mit 10",, n-Butanol enthaltendem ΛΛί-acctat extrahiert. Der Extrakt wird unter vermin.. *■. tem Druck eingedampft und der Rückstand au·· Mischlina von Methanol und Äther umknsui.ii . ; Ausbeute 2.6 g Produkt, [atf/ - 36.7 ± 0.S (< - v:- Methanol).

II) N'-Benzyloxycarbonyl-NMcrt.-hulyUm-

carbonyl-i.-lysyl-N^(:-nilro-i.-arginyl-N^t;-nitro-

i.-aruinyl-i.-proiyi-i.-\al\l-N^r-tert.-butyloxycai hui] i.-lysyl-i.-valyl-i.-tyrosyl-i.-prolyl-fMert.-bunl-1 -asparagvl-i -alanvl-glycin-tert.-butylcster

1.19 iz des oben erhaltenen Tripcptids werden 1. 1.5 ml Methanol gelöst, und die Lösung wird mit > ■ Essigsaure versetzt. Danach wird die l.ösuiv.: Palladiumschwarz als Katalysator 4 Stunden hvilrv Nach dem Abliltricrcn des Katalysators wird ■; : Lösungsmittel untervcrmindertem Druck eingeda¹·!··■: und der Rückstand in Allylacetat aufgenommen. 1 )·■. Lösung wird abgekühlt und mit kalter 5()nrozenn . ·; wäßriger Kaliumcarbonatlösungdurehgeschüitelt. 1 iv organische Phase wird über Natriumsulfat getrockn··: und unter vermindertem Druck eingedampft. Ni;;. erhält den Octapcptiddicster. Dieser Oct.ipeptuKliester wird in 30 ml Dimethylformamid gelöst und um einer Lösung von 1.32 g N'-Bcnz.yloxycarbonyl-N lcrt.-bulyloy.ycarbonyl-i.-lysyl-N^-nilro-i.-urginyl-N''-nitro-l.-arginyl-i -prolin.0.173gN-Hydroxysuecimmu und 0.310 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dimeilnl formamid versetzt. Das Gemisch wird 2 Tage bei 4 ( stehengelassen und danach wird der Dicyclohexyl harnstoff abfiltriert. Das Fillrat wird unter vermin dcrtcm Druck bei einer Badlcmpcralur von 40 bi 45 C' eingedampft, und der Rückstand wird an SiIi kagel (Merck. 0.05 bis 0.2 mm, 40 g) cliromatogia phicrl. Die Kolonne, die vorher mit einem Gemiscl aus Methanol und Chloroform (2:9K) behände! w01 den war. wird mit dem gleichen Lösungsmiiu entwickelt. Es werden 50 Fraktionen von jcweil KMnI Röhrchen aufgefangen. Die Kolonne wird liiei aiii' mil einer Mischung aus Methanol und Chlore form (1 5:S5) weiter enlwickelt. Die Fraktionen 34 Ir 66 werden vereinig; und unter vermindertem Druc em»eda^-.ipf!. Dei Rückstand wird in Äthylacelat au genommen, und mil einer Mischung \<mi Methane und Älhvl.icelai \ ι r-;eizl. I lierbei lallt das Produkt au

Ausheute 1,73 g. [α]

78,5 ± 1, p (r = 1.030, Metha

im) N^c-tert.-Butyloxycarbonyl-i.-lysyl-t.-arginii-L-arginyl-L-piOlyl-L-valyl-NMert.-butyloxycaibonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-^'-tert.-butyl-"
L-asparagyl-L-alanyl-glycin-tert.-butylester

577 mg des oben erhaltenen Dodescapeptidesters werden in 15 ml 90prozentiger Essigsäure an Palladium ,₀ als Katalysator 16 bis 18 Stunden hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird aus Wasser lyophilisiert und über Natriumhydroxidplätzchen untervermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 570 mg Produkt. Das Aminosriureverhältnis im Säurehydrolysat hat folgenden \\ ,!■■. : Asparaginsäure 1.19, Prolin 2.29. Glycin 1.00. Ai.iP.m 0.99. Valin _.15. Tyrosin 0.91. Lysin 2.11. /Vl'mm 1.96.

iüi \'^r-tert.-Butyloxycarbon\l-i -'\s_\l-i-pro M-

i -valyl-glycyl-NMert.-butNlowcarhmi;,!-

i -^.svl-NMcrt.-butyloxycarhoinl-i -hs\l-i -ari:m\l-

i -arginyl-i.-pro!yl-i--vaIyl-V-teri.-r>ut\li>\\- ²>

carhonyl-l.-lysyl-i.-valyl-i.-tyros\l-i -pr.'hl-

,;-icrl.-butyI-L-asparag\l-i -alan\l-gl\cin-

tert.-buisiesier

(..492 ggcmäß Bull. Chem.Soc. Japan. Bd. 37 (1%4). ;· 1471. hergestelltes N^a-Ben/\ ioxyca ',-lonyl-N'-lert.-iuit vloxycarbonyl-L-Iysyl-i.-pro! . I-l-v lyl-glycyl-N'- tei' -butyloxycarbonyl-L-lysin-hvilrazid werden in 4 ml Pmethylformamid gelöst. Die lösung wird mit Fis eekühlt und mit 1,375 ml eiskalter 1 η-Salzsäure sowie <% (1.303 ml 2 molarer Nalriumnitritlösung verseUi. Da-Genii-.ch wird 4 Minuten hei 0 C geschüttelt. Das erliaiienc Azid wird mit eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Der Äthylacctalextrak; wird mit kalter gesättigter Natriumbicarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Die erhaltene Lösung des A/ids wird zu einer Lösung von 0.27^ mMol des oben erhaltenen Dodecapcptids und 0.12" ml Triäthylamin in 4 ml Dimethylformamid gegeben, da- 0.2 ml Wasser enthält. Das Reaktionsgemisch wird ui.i.:r verminderlern Druck bei einer Badlcmperaiur \on 10 bis 15 C eingedampft, bis man eine klare Lösung erhält. Die I ösimg wird 24 Stunden bei 4 C stehengelassen und danach mit dem PcrUapcptidazid versetzt, das aus 0.138 mMol des entsprechenden Llydiazids auf die vorstehend beschriebene Weise hergestellt wurde. Das Gemisch wird 16bis 1 8 Stunden bei 4 C stehengelassen, danach wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand durch Zusatz von Äther ausgefällt. Die Fällung wird in einem Gc- ss misch von n-Butanol und Äthylacetat (Γ. 2) gelöst und mit I n-Hssigsäiirc gewaschen. Dir organische Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet und aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 1,12 g lleptadccapeptitlcster.

Das erhaltene Peptid wird in Methanol und in G :- ho genwart von Essigsäure 90 Minuten an Palladium als Katalysator hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel unter \crminilerlem Druck abdestilliert. Der Rückstand wird ans l\siüsäure KophilisieiI. Ausbeute 1.007 g. <■"·

Ο.37' ν. des Lyophilisats werden der Gclnlti.ition an einer kolonne (2.3 κ 143 cm) von Sephadex G-25' mit 20pro/e;iti;.'cr Essigsäure unk'rwoi-fen. Ls werden 5 ml Fraktionen aufgefangen, und die Absorption b«i 275 nm aufgenommen. Die Fraktionen 32 bis 45, die das Peptid enthalten, werden vereinigt, konzentriert und aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 0,21 g des Hepladecapeptidesters. [α]" - 74,2 ± 1,6° (c = 0,667, 50prozentige Essigsäure).

(o) ii-Aminoisobuiyryl-L-lyrosyl-L-seryl-u-mclhionyli.-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-

L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-

L-lysyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-

L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyi-L-prolyl-

L-asparagyl-L-alanyl-glycin

Eine Lösung von 0.32 g Benzyloxycarbonyl-aaminoisobutyryl-O-benzyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methiony'.-y-benzyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-i.-tryptophyl-glycin fhergestellt gemäß Beispiel I [k]) in Essigsäure wird mit 0.45 ml 1 n-C'h!orwassersiofnösung in Essigsäure versetzt und sofort lyophilisiert. Der Rückstand wird unter vermindertem Drück über Natriumhydroxidplalzchen getrocknet. Das erhaltene Decapeptidhydrochlorid wird in 3 ml Dimethylformamid zusammen mit 0.0X3 g N-IIydroxysuecinimid gelöst und die Lösung mit einer Lösung von 0.1 5 g Dicyclohexylcarbodiiniid in 2 rrl Dimethylformamid versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden hei 4 C stehengelassen. Sodann wird der Dicyclohcxylharnstoff abfiitriert. Das Filtrat wird in 100 ml eines eiskalten Gemisches aus Athylacetal und Äther (1:1) eingegossen, und die ausgeschiedene Fällung abfiltriert. Die Fallung wird mit Athylacetal und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält den aktiven Decapeptidester.

0.30 g des oben erhaltenen Lleptadecapcptidcstcracctats werden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0.17 ml Triethylamin vcrsetzl. Hierauf wird die Lösung mit einer Lösung des oben erhaltenen Decapcptideslers in Dimethylformamid versetzt und das Gemisch (Gesamtvolumen 5 ml) 3 Tage bei 4 C gerührt. Sodann wird das Reaktionsgemisch in 50 ml eiskaltes Äthylacetat eingegossen und mit 50 ml Äther versetzt. Die gebildete Fällung wird abfiitriert. mit Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0.60 g rohes geschütztes Heptacosapcptid.

Das oben erhaltene geschützte Heptacosapeptid wird zusammen mit 0.1 g Methionin und 0,6 ml Anisol in ein Reaktionsgefäß aus fluoriertem Polyäthylen gegeben, in einem Trockcneis-Acetonbad abgekühlt und mit Fluorwasserstoff gas versetzt. Das Reaktionsgemisch (etwa 20 ml) wird 40 Minuten bei Raumtemperatur gerührt und sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Eiswasser gelöst, die Lösung mit Chloroform gewaschen und auf eine Austauschersäule (1,4 χ 30 cm j von AmberliteC'G-4B" (Acetat-Form) gegeben. Die Kolonne wird mit Wasser cluieit. das Hluat unter vermindertem Druck eingedampft und lyophilisiert. Ausbeult 0.41 g Peptid. Das Peptid wird an einer Kolonne (2.2 χ 30cm) von Garboxymethylccllulosc (Scrva. 0.56 mÄq/g) mit AinmoniumacctatpulTcr (pH 6.5. 2000 ml) mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0.02 bis 0.6 Mol gereinigt. Die ,Absorption bei 2H0 nm wird aufgenommen und jeweils Fraktionen von 10 ml.'Höhrchcn aufgelangen. Die Fraktionen F-I (Nr. 91 his 104) und F^-Il (105 bis 130). die einem Hauptabsorptionsmaximum entsprechen, ν erden gesondert aufgefangen. ' Die Ilaupimenge di s Lösungsmitteln wird abdcslilliert

und der Rückstand wiederholt bis zur Gewichtskonsiunz lyophilisiert. Es werden 100 mg F-I und 180 mg F-II entblockiertes Heptacosapeptid erhalten. F-II wird erneut an Carboxymethylcellulose in gleicher Weise, wie vorstehend beschrieben, chromatographiert. Man erhält die Fraktion F-II-I (80 mg) und F-II-2 (85 mg) als erste Hälfte und den Rest des Hauptabsorpticnsmaximums. F-I und F-II-I werden vereinigt (180 mg) und nochmals Chromatographien. Man erhält das Peptid in ziemlich reiner Form, was sich aus der Dünnschichtchromatographie an Cellulose mit dem Lösungsmittelsystem n-Butanol-Essigsäure-Pyridin-Wasser (30:6:20:24) ergibt. Ein Anteil von 147 mg des vorgenannten Produktes wird an einer Kolonne (2,0x30 cm) von Carboxymethylcellulose (Whatman CM-52) mit Ammoniumacetatpufter (pH 6.5. 2000 ml) mit einem Iineaiui FCon/entrationsgradienten von 0.02 bis ü.5 Mol Chromatographien. Die Fraktionen, die einem einzigen Maximum entsprechen, werden vereinigt, eingedampft und lyophilisiert. Man erhält 100 me reines Heptacosapeptid. [α]²/ -89.2 ±2.5 U= 0.53^0.1 n-Essigsäure).^,'·/,"-"⁰ 276 nm (E[¹JS₁ 22.0). 2SS nm (E\".^ 15.8). /.^'_v ^H"^N:iU" 2*2 nm (E\ ^ 23.0). 288 nm (E] [._m 23.S).

Das Aminosäureverhälinis im Säurehydrolysat hat fuigenden Wert: Asparaginsäure (1.99. Serin 0.89. Glutaminsäure 1.00. Prolin 3.93. Glycin 3.00. Alanin 1.02. Valin 2.80. Methionin 1.01. Tyrosin 1.90. Phenylalanin 0.99. a-Aminoisobuttersäure 1.19 Lysin 4*52. Histidin 1,22. Arginin 2.91. Das Tryptophan :'Ty- ,_o rosin-Verhäitnis im intakten Heptacosapeptid hat spektrophotometrisch bestimmt den Wert 0.54.

B e i s ρ i e I 4

(a) Benzyloxycarbonyl-i.-valyl-i.-tyrosinmethyiester

5.78 g Benzyloxycarbonyl-L-valin und 4.49 g L-Tyrosinmethylester werden in 10 ml Dimethylformamid gelöst und bei 0° C mit 4.75 g Dicyclohexylcarbodiimid in 50 ml Dichlormethan versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4 C stehengelassen, danach wird der ausgeschiedene DicyclohcxylharnstofT abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Älhyiacetat gelöst und die Lösung mit 1 η-Salzsäure und 1 molarer Natriumbicsrbonatiösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nachdem Eindampfendes Lös up esmittels hinterbleibt ein kristalliner Rückstand, der aus einer Mischung von Äthylacetat und Äther umkristallisiert wird. Ausbeute 8.47 g. F. 154 bis 155 C: [α]²² — 18,3 + 0,6' (c = 0.98. Methanol).

(b) Benzyloxyearbonyl-L-valyl-i.-tyrosinhydni/id

Eine Lösung von 6,42 g Bcnzyloxycarbonyl-i.-valyl-L-tyrosinmethylester in 10 ml Dimethylformamid und 30 ml Äthanol wird mit 1.8 ml Hydrazin-hydrat versetzt und 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Die abgeschiedenen Kristalle werden abfiltriert, mit kalten, Äthanol und Äther gewaschen und über Schwefelsäure unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbu'.'e 6.26 g. F. 243 bis 244 C (Zersetzung); [α],²²-12.0 + 0.5 (r= 1.01. Dimethylformamid).

(c) Benzyloxycarbonyl-L-valyl-L-ty-osylu-prolinmethylesier

20 ml in einem Eis-Kochsalzbad gekühltes Methanoi werden tropfenweise mit 1.5 ml Thionylchlorid und anschließend mit 2,0 g L-Prolin versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und hierauf unter vermindertem Druck eingedampft. Der sirupöse Rückstand wird in etwa 5 ml Wasser gelöst und mit 20 ml Dichlormethan versetzt. Das Gemisch wird abgekühlt und mit 10 ml eiskalter 50prozentiger wäßriger Kaliumcarbonailösung versetzt. Die wäßrige Phase wird wiederholt mit Dichlormethan extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Es hinterbleibt r.-ProIinmeih} !ester als freie Base.

Eine gekühlte Lösung ',on 6.0 g Benzyloxycarboir.ii-valyl-L-tyrosin-hydrazir :i 20 ml Dimethylformamid und 35 ml Salzsäure wird mit "\7 ml eiskalter 2molarei Natriumnitritlösung versetzt. 4 Minuten bei 0 C gerührt und danach zweimal mit eiskaltem Aihylacet.ii extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinig!, mit eiskalter !molarer Natriumbicarbonallösung gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Die erhaltene Lösung des Azids wird zu dem oben hergestellten L-Prolinmethvlesier gegeben und das Gemi>ch 2 Tage bei 4 C stehengelassen. Danach wird da·· Reaktionsgemisch mil I η-Salzsäure. Wasser und 1 molarer Natriumbicarbonallösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand (5.9 g) wird in einer Mischung aus Methanol und Chloroform (5:95) gelöst und die Lösung auf eine Silikagelsäuie (Merck. 0.05 bis 0.2 mm. 170 g) gegeben, die mit dem gleichen Methanol-Chloroformgemisch vorbehandelt worden war. Dieses Lösungsmittelgcmisch wird auch zum Eluieren verwendet. Diejenigen Fraktionen, die eine Hauptkomponente bei der Dünnschichtchromatographie an Silikagel G mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (1:9) als Lösungsmittel zeigen (Rf= 0.57. Schwefelsäure) werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Es hinterbleibt das Tripeptid als schaumiger Rückstand. Ausbeute 5.44 g. [α]²,²-60.6 ±1.0 (< = 1,01, Methanol).

(d) N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxy-

carbonyl-i.-lysyl-i.-valyl-L-tyrosyl-i.-prolin-

methylester

2.63 g Benzyioxycarbonyl-L-valyl-L-tyrosyi-i.-prolinmeth >lester werden in Methanol gelöst und 3 Stunden an Palladium als Katalysatur hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmitte! unter vermindertem Druck abdestilliert. Es hinter bleibt L-Valyl-L-tyrosyl-L-prolinmcthylester als freie Base. N'-BenzyloxVcarbonyl-N'-tert.-butyloxyc.irbnnyl-L-lysin (hergestellt aus 2,82 g des Dicyclohcxvlaminsalzes in üblicher Weise) und der oben erhaltene Tripeptidester werden in Dichlormethan gelöst und mit einer Dichlormcthanlösung von 1.03 g Dicvclohcxylcarbodiimic! bei 0 C versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4 C stehengelassen, danach vom auskristallisierten Dicyclohexy !harnstoff befreit und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdeslilliert. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und die Lösung mit eiskalter 1 η-Salzsäure. Wasser und I molarer Natriumbicarbonatlösuniieewaschen. über M:mnc-

iiiimsulfiit getrocknet und unter vermindertem Druck :ingcdampft. Es liinterblcibt ein farbloser schaumiger Rückstand, der aus einer Mischung von Allylacetat und Äther umgefüllt wird. Ausbeute .1.61 g[a]f,² - 56.3 ± 1.0" (ί·- 1.00. Methanol).

(c) Ben/yloxycarbonyli.-valyl-N'-tert.-butylow-

carbonyl-L-lysyl-i.-valyl-i.-tyrosyl-K-prolin-

methylester

IO

1,51 g N'-Benzyloxycarbonyl-N'-terl.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-i.-tyrosyl-i.-prolinmelhylcster werden in Methanol 3 Stunden an Palladium als Katalysator hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Es hinterblcibt N'-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-i.-valyl-i.-tyrosyl-r -prolinmethylcster als schaumiger Rückstand. Der Tetrapeptidester wird zusammen mit 0,50 g Benzyloxycarbonyl-L-valin in Dichlormethan gelöst und bei O¹C mit einer Lösung von 0.41 g Dicyclohexylcarbodiimid in Dichiormethan versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4°C stehengelassen, danach wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen und die Lösung nacheinander mit eiskalter 1 η-Salzsäure. Wasser und 1 molarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus einer Mischung aus Äthylacetat und Äther umgefällt. Ausbeute 1.43 g. Nach nochmaliger Umfallung aus Acetonitril beträgt die Ausbeute 1.14 g. [aß²-66.4 ±1.1° (r=1.03. Methanol).

(0 N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxy-

carbony1-L-lysyl-N^G-nitro-L-arginyI-N^G-nitro-

i.-arginyl-L-prolyl-i.-valyl-N^e-tert.-butyloxy-

carbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolin-

methylester

35

40

0,51 g Benzyloxycarbonyl-L-valyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolinmethylester in Methanol werden 3 Stunden an Palladium als Katalysator hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Dk Rückstand wird über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet und anschließend in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird mit 0,53 g N^-Benzyloxycarbonyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^G-nitro-L-arginyl-N^G-nitro-L-arginyl-L-piolin und 0,10 g N-Hydroxysuccinimid sowie bei 0⁰C mit einer Lösung von 0.19 g Dicyclohexylcarbodiimid in 8 ml Dichiormethan versetzt. Das Gemisch wird 2 Tage bei 4^C C stehengelassen und anschließend tropfenweise in 100 ml eines Gemisches aus Äthylacetat und Äther (1:1) gegeben. Die entstandene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und getrocknet, Ausbeute 1.13 g. Die erhaltene Fällung wird in einer Mischung aus Methanol und Chloroform (1:9) gelöst und auf eine Kolonne mit Silikagel (Merck. 0,05 bis 0,2 mm. 40 g) gegeben, die mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch vorbehandelt worden war. Auch die Eluierung wird mit dem gleichen Lösungsmittel-. gemisch durchgeführt. Fraktionen, die eine Hauptkomponente im Dünnschichtchromatogramm an SiIikagel G und mit einem Gemisch aus Methanol und Chloroform (1:9) als Lösungsmittel enthalten (Rf= 0.25. Schwefelsäure) werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und aus Essigsäure lyophilisiert. Man erhält 0.48 gdcs Nonapeptids. [α],²,² - 74.X ± 1.2"(C= 1.00. Methanol).

(g) N'-tcrt.-BuIyloxyairbonyl-i.-Iysyl-i.-prolyI-

i.-valyl-glycyl-N'-t'crt.-butvloxycarbonyl-i.-hsyl-

N'-tcrl.-butyloxycarbonyl-i.-lysyl-[.-argin\l-i.-arginyli-prolyl-i.-valyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-i -lysyl-

i.-valyl-i.-tyrosyl-i.-prolinmelhylester

0.39 g N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-nitroarginyl-L-nitroarginyl-L-prolyl-ivalyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-i -lysyl-i.-valyl-i-tyrosyl-i.-proiinmethylester in 90prozentiger Essigsäure werden 6 Stunden an Palladium als Katalysator hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert und das Lösungsmittel unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert. Man erhält 0,42 g N'-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-t.-arginyl-L-prolyl-L-valyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-i.-tyrosyl-L-prolinmethylester.

Zu einer gekühlten Lösung von 0.32 g N'-Benzyloxycarbonyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycvl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysinhydrazid in 5 ml 90prozentigem Tetrahydrofuran wird nacheinander 0.9 ml eiskalte 1 η-Salzsäure und 0,2 ml 2molare Natriumnitritlösung gegeben, und das Gemisch wird 4 Minuten bei O⁰C gerührt. Sodann wird das Gemisch mit 15 ml eiskaltem Äthylacetat und 5 ml 5molarer Natriumbicarbonatlösung versetzt. Die organische Lösung wird erneut mit eiskalter 1 molarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen und bei 0°C über Magnesiumsulfat getrocknet. Die erhaltene Lösung des Pentapeptidazids wird zu einem Gemisch aus dem oben erhaltenen Nonapeptid und 0,067 ml Triäthylamin in 3 ml Dimethylformamid gegeben. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 20⁰C eingedampft, bis die gebildeten Fällungen wieder verschwinden. Sodann wird das Gemisch 2 Tage bei 4° C stehengelassen. Hierauf wird eine weitere Mengedes Azids (hergestellt aus 0,18 mMol des Hydrazids) zugesetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei 4° Q stehengelassen und anschließend in 100 ml Äther eingegossen. Die ausgeschiedene Fällung wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeutt; 0,68 g. Nach Umfällung aus einer Mischung von Methanol und Äthylacetat erhält man 0,65 g rohen N*- Benzyloxycarbonyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-arginyl-i.-arginyl-L-prolyl-L-valyl-NMert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolinmethylesteT.

Ein Anteil von 0,20 g des oben erhaltenen Tetradecapeptids in 90prozentiger Essigsäure wird 3¹I₁ Stunden an Palladium als Katalysator hydriert. Danach wird der Katalysator abfiltriert, das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand aus Essigsäure Iyophilisiert. Man erhält rohes N*-freies Tetradecapeptid. Diese Verbindung wird chromatographisch an einer Säule (1.7 χ 33 cm) von Carboxymethylcellulose (Serva. 0.70 mÄq/g) mit Ammoniumacetatpuffer (pH 5,9. 2000 ml) mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,005 bis 0,25 Mol gereinigt. Es werden 8 ml Fraktionen aufgefangen und ihre Absorption bei 275 nm aufgenommen. Die Fraktionen, die einem Hauptabsorptions-

409539/369

maximum entsprechen (Fraktion 111 bis 140). werden vereinigt, und die Hauptmenge des Lösungsmittels wird unter vermindertem Druck abdcstillicrt. Der Rückstand wird lyophilisiert. Man erhält 0.154 g reines Peptid. [a],V -67.0 + 2 (r = 0.551. Methanol)!'

(h) Bcnzyloxycarbonyl-ff-aminoisobutyryli.-tyrosyl-i -scryl-i.-melhioninhydra/id

Eine eiskalte Lösung von 2.3 g Bcnzyloxycarbonyla-aminoisobutyryl-i.-tyrosin-hydrazid in 15 ml 1 n-Salzsäure wird tropfenweise mit 3.0 ml eiskalter 2molarer Natriumnitritlösung versetzt, 4 Minuten gerührt und danach mit eiskaltem Äthylacetat extrahiert. Der organische Extrakt wird dreimal mit eiskalter 1 molarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen und bei OC über Magnesiumsulfat getrocknet. Dicerhallenc Äthylacetatlösung des Dipcptidazids wird zu einer Lösung von L-scryl-L-methioninmcthylcstcr (hergestellt aus 5 mMol tert.-Butyloxycarbonyl-i.-scryl-i.-mcthioninmethylcster) in 5 ml Dimethylformamid gegeben, und das Gemisch wird 65 Stunden bei 4"C stehengelassen. Nach beendeter Umsetzung wird das Gemisch nacheinander mit 1 n-Sal/säurc. Wasser und !molarer Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Es hintcrblcibt ein schaumiger Rückstand, der zweimal aus einer Mischung von Äthylacetav und Äther umgefüllt wird. Es werden 2,81 g roher Tetrapcptidmclhylestcr erhalten. Dieser rohe Ester wird in 25 ml Äthanol gelöst und mit 2.4 ml Hydrazinhydrat versetzt. Das Gemisch wird 16 bis 18 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, danach unter vermindertem Druck eingedampft, der Rückstand mit 10 ml Wasser versetzt und mit 20 ml Äthylacetat ausgeschüttelt. Die wäßrige Lösung wird noch zweimal mitÄthylacctalcxtrahicrt. DicvcrciniglenÄthylaeetatextraktc werden mit Wasser gewaschen und eingedampft. Der gelatinöse Rückstand wird mit kaltem Älhylacelat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Ausbeute 2,47 g. Nach nochmaliger Umfällung aus einer Mischung von Äthanol und Äthylacetat wird das reine Tetrapcptidhydrazid erhalten. Ausheute 1.86 g.

(i) Bcnzyloxycarbonyl-ri-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-

i.-seryl-i.-methionyl-y-benzyl-i-glutamyl-L-histidyl-

i.-phenylalanyl-i.-arginyl-i.-tryptophyl-glycin

0.23 g tert.-Butyloxycarbonyl-y-benzyl-L-glutamyli.-histidyl-i.-phenylalanyl-L-arginyl-r.-tryptophyl-glycin werden in etwa 1.5 ml Trifluoressigsäure gelöst und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wird das Gemisch mit Äther versetzt, die ausgeschiedene Fällung wird abfillricrt. mit Äther gewaschen und getrocknet. Es werden 0.24 g N²-freies Hexapeplid erhalten.

0.25 g Benzyloxycarbonyl-a-aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methioninhydrazid werden in 1 ml Dimethylformamid gelöst und mit 1 ml 1 n-Salzsäure versetzt. Das Gemisch wird in Eis abgekühlt und mit 0.22 ml eiskalter 2molarer Natriumnitritlösung versetzt. Das erhaltene Azid wird mit eiskaltem Athylacetat extrahiert, der Extrakt mit eiskalter !molarer Natriumdicarbonallösunggewaschenundüber Magnesiumsulfat getrocknet. Danach wird diese Lösung mit einer Losung des oben erhaltenen Hexapcptids und 0.125 ml Triäihylamin in 5 ml Dimethylformamid versetzt. Das Gemisch wird unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 15 bis 20 C eingedampft, bis eine klare Lösung entsteht. Sodann wird die Lösung 40 Stunden bei 4 C stehengelassen, Ilierauf wird das Gemisch in 100 ml einer Mischung von Äthylacctat und Äther (1:1) eingegossen, die ausgeschiedene Fällungabfillricrl. mit Älhylacctal und Äther uewaschen und aus Essigsäure lyophilisiert. Ausbeute 0.32 g.

(J) «-Aminoisobutyryl-i.-tyrosyl-i.-seryl-i.-mcthionyl-

i.-glulamyl-L-histidyl-i.-phenylalanyl-i.-arginyll -tryptophyl-glycyl-L-lysyl-i.-prolyl-L-valyl-glycyli.-lysyl-t-lysyl-i.-arginyl-L-arginyl-t.-prolyl-i.-valyli.-lysyl-i.-valyl-i.-tyrosyl-i.-prolinmclhylcslcr

Eine Lösung von 0.257 g Benzyloxycarbonyl-aaminoisobulyryl-i.-lyrosyl-i.-scryl-i.-methionyl-y-ben-/yl-i.-glutamyl-i.-histidyl-L-phcnylalanyl-t.-arginyl-i- liyptophyl-glycin in Essigsäure wird mit 0,3 ml einer I n-Salzsäurclösung in Essigsäure versetzt und sofort lyophilisiert und unter vermindertem Druck über Natriumhydroxidplätzchen getrocknet. Das erhaltene Decapcplid-hydrochlorid wird in 3 ml Dimethyl-

formamid zusammen mit 0.069 g N- Hydroxysuccinim id gelöst und mit 0,12 g Dicyelohexylcarbodiimid versetzt. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 4°C stehengelassen, danach wird der ausgeschiedene DicyclohcxylharnslofT abfillricrt, das Filtrat in ein eiskaltes Gemisch gleicher Teile Allylacetat und Äther eingegossen und die gebildete Fällung abfiltriert, mit Allylacetat und Äther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 0,29 g des aktiven Decapepliclcslcrs.

0.248 g des Tclradecapcptids N'-lcrl.-Butyloxycaibonyl-L-lysyl-i.-prolyl-L-valyl-glycyl-NMcrt.-buUloxycarbonyl-i.-lysyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-i-lysv: i.-arginyl-L-arginyl-i.-prclyl-L-valyl-N'-tcrt.-bulylov carbonyl-i.-lysyl-i.-valyl-L-tyrosyl-i.-prolinmeth\!-

ester-acetat werden in 2 ml Dimethylformamid gcio" und mit 0.15 ml Triäihylamin versetzt. Die Lösung w-ii\i mit einer Dimethylformamidlösung des oben erhaltenen aktiven Decapeptidestcrs versetzt und 48 Stunden bei 4T stehengelassen. Sodann wird das Reaktion:·- gemisch in 100 ml eiskaltes Äthylacctal eingegossen, die ausgeschiedene Fällung abfiltriert. mit Äthylacetai und Äther gewaschen, aus Essigsäure lyophilisieü und unter vermindertem Druck über NalriumhydroxidpläUchen getrocknet. Ausbeute 0,48 g rohes ge-

schütztesTetracosapeptid.

0.20 g des oben erhaltenen geschützten Peptidwerden 90 Minuten bei 0⁰C in üblicher Weise in Gegenwart von 0.05 g Methionin und 0,2 ml Anisol als Radikalianger mit wasserfreiem Fluorwasserstoff behandelt. Danach wird der Fluorwasserstoff unter vermindertem Druck abgetrennt, der Rückstand in Wasser gelöst und die Lösung mit Äthylacetat gewaschen. Die wäßrige Lösung wird auf eine Kolonne von Amberlite CG-400 (Acetat-Form) gegeben, und die Kolonne wird

mit Wasser eluiert. Das Eluat wird unter vermindertem Druck eingedampft und lyophilisiert. Das erhaltene rohe entblockierte Peptid wird an einer Kolonne von Carboxymethylcellulose (Serva, 0,70 mÄq/g) mit einem Ammoniumacetatpuffer (pH 6.5, 2000 ml) mit

einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,02 bis 0,6 Mol gemäß Beispiel 2 Chromatographien. Man erhält 0,074 g a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-i.-glutamyl-i.-histidyl-L-phenylalanyl-L-ar-

ginyl-i.-lryptophyl-glycyl-i.-lysyl-i.-prolyl-i.-valyl-glycyl-i.-lysyl-i.-lysyl-i.-arginyl-i.-arginyl-i.-prolyl-i.-valyli.-lysyl-i.-valyl-i,-i\rosyl-i.-prolinmcthylcstcr. \y.]f,^[ - 75 ± 2Mf = 0.5.0.1 n-Fssigsäurc).

Beispiel 5

0,5 mg Ibu'-ACTH(l-18)-NH₂-acetat werden in 0.25 ml 40mmolarer Zinkchloridlösung bei Raumtemperatur gelöst. Die Lösung wird mit 0.25 ml einer 40mmolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt, die 4,5 mg Natriumchlorid enthält. Man erhält eine Suspension eines Komplexes, der durch Zusatz, von 0.1 η-Natronlauge auf pH 7.0 eingestellt wird.

Beispiel 6

0.5 mg lbu'-ACTH(l-18)-NH₂-acetat werden in 0.15 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 0.1 ml einer Lösung von 0.5 mg Poly-i.-glutaminsäure (Molekulargewicht etwa 1500 bis 2000) versetzt, die mit 0.1 η-Natronlauge neutralisiert worden war. Das Gemisch wird mehrere Minuten gerührt und danach mit 0.25 ml eines M/30-PhosphatpulTcrs versetzt. der 4.5 mg Natriumchlorid enthält. Der erhaltene Komplex wird mit 0,1 n-Natronlaugc auf pH 7.0 eingestellt.

Beispiel 7

1,0 mg Ibu'-ACTH(l-18)-NH₂-acctat werden in 0.2 ml destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird unter Rühren mit einer Lösung von 2 mg PoIy-L-asparaginsäure (Molekulargewicht etwa 3000) versetzt, die mil 0.3 ml 0.1 n-Natronlaugc vor der Verwcndung neutralisiert worden war. Es bildet sich eine weiße Fällung. Die Suspension wird mit 0.5 ml einer M ■ 15-Dinatriumhydrogerphosphat-Kaliumdihydrogenphosphat-Lösung pH 6.8 versetzt, die 9,0 mg Natriumchlorid enthält und mit 0.1 η-Natronlauge auf pH 7.0 eingestellt.

Beispiel 8

0,5 mg Ibu¹-ACTH(I-18)-NH₂-acetat werden in 0.15 ml lOOmmolarer Zinkchloridlösung gelöst. Andererseits werden 0.5 mg Poly-L-glutaminsäurc (Molekulargewicht etwa 2000 bis 3000) mit 0.1 ml 0.1 n-Natronlauge neutralisiert. Die Lösung wird mit 4.5 mg Natriumchlorid sowie0.25 ml 40mmolarerDinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt. Die erhaltenen Lösungen werden vereinigt und bei Raumtemperatur gerührt. Es entsteht eine Suspension des Komplexes, der mit 0.1 η-Natronlauge neutralisiert wird.

sung wird mit 0.25 ml einer M 15-Kaliumdihydrogenphosphal-Dinatnumhydrogenphosphat-Lösung versetzt, die 4.5 mg Natriumchlorid enthalten. 20 mg Copoly -1 - glutamyl -1. - tyrosin (Molekulargewicht 21 850) werden mil 0.15 ml 0.1 n-Natronlaugc neutralisiert. Die neutralisierte Lösung wird zu der oben erhaltenen I'cptidlösung gegeben, und das Gemisch wird gerührt. Die Suspension des erhaltenen Komplexes wird mil 0,1 η-Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt.

Beispiel 10

0.5 mg Ibu'-ACTH(1-18)-NH₂-acetat werden in 0.1 ml Wasser gelöst. Diese Lösung wird mit 0,25 ml M/l5-PhosphatpulTer pH 7.0 versetzt, die 4,5 mg Natriumchlorid enthalten. 7 mg Copoly-L-glutamyl-L-tyrosin (Molekulargewicht etwa 21850) werden mit 0.1 η-Natronlauge neutralisiert. 0.1 rnl der neutralisierten Lösung werden zu der Lösung des erhaltenen Peptids gegeben. Man erhäk eine Suspension,die sofort klar wird. Die Lösung wird mit 0.1 mg Thimerosal in 0.05 ml Wasser versetzt und die erhaltene klare Lösung mit 0.1 n-Natronlaugc auf pH 7.0 eingestellt.

Beispiel 11

0.5 mg Ibu'-Orn¹⁵-ACTH(l-18)-NH₂-acetal werden bei Raumtemperatur in 0,25 ml 40mmolarer Zinkchloridlösung gelöst. Die Lösung wird mit 0,25 ml einer 40mmolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt, die 4.5 mg Natriumchlorid enthalten. Man erhält eine Suspension eines Komplexes, derdurch Zusatz von 0.1 η-Natronlauge auf pH 7.0 eingestellt wird.

55

Beispiel 9

0,5 mg Ibu¹ -ACTH(I-18)-NH₂-acetat werden bei Raumtemperatur in 0.1 ml Wasser gelöst. Diese Lö-

Beispiel 12

0.5 mg lbu'-ACTH(l-24)-OCH,-acetat werden bei Raumtemperatur in 0,25 ml 40mmolarer Zinkchloridlösung gelöst. Die Lösung wird mit 0.25 ml einer 40mmolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt, die 0,45 mg Natriumchlorid enthält. Die erhaltene Suspension des Komplexes wird mit 0.1 n-Natronlauge auf pH 7,0 eingestellt.

Beispiel 13

0.5 mg Ibu'-ACTH(l-27)-OH-acetat werden bei Raumtemperatur in 0.25 ml 40mmolarer Zinkchloridlösung versetzt. Die erhaltene Lösung wird mit 0,25 ml einer 40mmolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt, die 0.45 mg Natriumchlorid enthält. Die erhaltene Suspension des Komplexes wird mit 0,1 n-Natronlauge auf pH 7 eingestellt.

In ähnlicher Weise, wie vorstehend beschrieben können andere l-a-Aminoisobuttersäure-corticotro· pinpeptide in die entsprechenden Komplexe umgewan delt werden.

Claims

Patentansprüche:

1. l-ot-Aminoisobuttersäure-corticotropinpep- :ide mit Aminosäureresten entsprechend der Se-}uenz 1-16 bis 1-39 des nativen Corticotropins, deren Derivate. Säureadditionssalze und Komplexe.

2. l-at-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide, in denen die 4. Aminosäure L-Methionin, L-Norvalin. L-Norleucin. L-Leucin oder ot-Aminobuttersäure, die 5. Aminosäure L-Glutaminsäure oder L-Glutamin, die 15. und 16. Aminosäure L-Lysin oder L-Ornithin, die 17. und 18. Aminosäure L-Arginin, L-Lysin oder L-Ornithin und die 25. Aminosäure L-Asparaginsäuie oder L-Valin ist. sowie deren Derivate, Säureadditionssalze und Komplexe.

3. 1 -a-Aminoisobuttersäure-corticoiropinpcptide mit Aminosäureresten entsprechend der Sequenz 1-16 bis 1-39 des nativen Corticotropins, in deren 4. Aminosäure L-Methionin. i.-Norvalin. L-Norleucin. i.-Leucin oder a-Aminobuitersaure. die 5. Aminosäure L-Glutaminsäurc oder L-Glutamin. die 15. und 16. Aminosäure L-Lysin oder I-Ornithin, die 17 und 18. Aminosäure t-Arginin.

I.-Lysin oder L-Ornithin und die 25. Aminosäure 1 -Asparaginsäure oder i.-Valin ist. deren Derivate. Säureadditionssalze und Komplexe.

4. l-ac-Aminoisobutiersäure-corticotropinpeptide mit Ammosäureresten entsprechend der Sequei.z 1-18 bis 1-27 des nativen Corticotropins der allgemeinen Formel

2-Aminoisobutyryl-L-lyrosyi-L-seryl-

A-B-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-

i.-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-

i.-vaiyl-glycyl-C-D-E-F

in der A ein L-Methionin-. i.-Norvalin-. L-Norleucin-. L-Leucin- oder a-Ammobuttersäurerest. B ein 1 -Glutaminsäure- oder i.-Glutaminrest. C und D jeweils ein L-Lysin- oder t.-Orni'hinrcst. L ein L-Arginin-, L-Lysin- oder I.-Ornithinrcst und F ein L-Arginin-, L-Arginyl-i.-prolin-. i.-Arginyl-i.-prolyl-L-valin-. L-Arginyl-i.-prolyl-i.-valyl-L-lysin-, L-Arginyl-L-prolyl-i.-valyl-L-Iysyl-i.-valin-. L-Arginyl-i.-prolyl-L-vaIy 1-L-lysyl-i.-vaIy!-(.-tyrosin-. L-Arginyl-L-prolyl-i.-valyl-L-lysyl-i-valyl-L-tyrosyli -prolin-. L-Arginyl-[.-prolyl-L-valyl L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-prolyl-i.-asparaginsäurc-, i.-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-i.-lysyl-i -va IyI-L-ty rosy l-i.-prolyl-L-valin-, i.-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-i -tyrosyl-L-prolyl-L-aspiiragyl-i.-alanin-. L-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-i.-lysyl-L-valyl-L-lyrosyli.-prolyl-L-aspartyl-t.-alanyl-glycin-, i.-Arginyl-l.-prolyl-L-valyl-i.-iysyl-i.-valyl-L-iyrosyl-L-piOlyl-i.-asparagy!-glycyl-i.-gl utaminsäure-. I.-Arginyl-L-proly l-i.-va Iy l-i.-lysyl-i.-va IyI-I.-ty rosy l-i.-prolyl-L-alanyl-glycyl-i.-gluuiminsäure. i.-Arginyl-i.-prolyl-L-valyl-i.-lysyl-i.-valyl-i.-tyrosyl-i.-prolyl-i.-a.sparagyl-glycyl-i.-gluiaminsäurc oder i-Arginyl-L-prolyl-L-valyl-i.-lysyl-i.-valyl-i.-iyrosyl-i.-prolyl-i -asparagyl-glycyl-i.-alaninrcst oiler der entsprechende I M ·.· roder da s entsprechende Λ mid ist. deren Sä ureadditionssal/e und Komplexe.

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5. 1 -at-Aminoisobuttersäure-corticoiropinpeptide der allgemeinen Formel

a-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-

A-B-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-

L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-

L-valyl-?lycyl-C-D-E-F

inderAeinL-Methionin-.L-Norvaiin-.L-Norleucin, L-Leucin- oder a-Aminobuttersäurerest, B ein L- Glutaminsäure- oder L-Glutaminrest, C und D jeweils ein L-Lysin- oder L-Omithinrest, E ein L-Arginin-. L-Lysin- oder L-Ornithinrest und F ein L-Arginin-, L-Lysin-, L-Ornithin-, L-Argininester-. L-Lysinester-, L-Ornithinester, L-Argininamid-, L-Lysinamid oder L-Ornithinamidresl ist, deren Säureadditionssalze und Komplexe.

6. l-Df-Aminoisobuttersäure-cortieotropinpeplide der allgemeinen Formel

2-Aminoisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-

A-B-i-histidy 1-L-phenylalanyl-L-arginyl-

L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-proIyl-

L-valyl-glycyl-C-D-E-F-prolyl-L-valyl-

L-K syl-L-valyl-L-lyrosyl-G

in der A ein L-Methionin-, L-Norvaiin-. L-Norleucin-. L-Leucin- oder a-AminobuUersäurerest. B ein L-Glutaminsäure- oder i.-Glutaminrest. C und D jeweils ein L-Lysin- oder L-Ornithinrest. E und F jeweils ein L-Arginin-. L-Lysin- oder L-Ornithinrest und G ein L-Prolin-, L-1'rolinester- oder L-Prolinamidrest ist. deren Säureadditionssalze und Komplexe.

7. I -x-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeplide der allgemeinen Formel

ϊ-Aminoisobutyryl-i.-tyrosyl-L-seryI-

A-B-L-histidyl-L-phenylalanyl L-arginy¹-

L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-l.-valyl-

elycyl-C-b-F.-F-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-

L-\;il>l-L-iyrosyI-L-prolyl-G

in der Λ ein L-Methionin-. L-Norvalin-. L-Norleucin-. L-Lcucin- cder x-Aminobuttcrsäureivst. Bein L-Glutaminsäurc-oder L-Glutaminrest. C und D jeweils ein L-Lysin- oder t.-Ornithinrcst. E und F jeweils ein L-Arginin-. L-Lysin- oder L-Ornithin-1""¹St und G ein L-Asparagyl-i.-alanyl-glycin-. L-Asparagyl-glycyl-L-alanin-, L-Alany!-glycyl-L-glut aminsäure-. i.-Asparagyl-glycyl-L-glutaminsäure- oder L-Valyl-L-alanyl-glycinrest, der entsprechende Ester oder das entsprechende Amid ist. deren Säureadditionssalze und Komplexe.

8. I -a-Aminoisobuttersäure-corticotropinpeptide der allgemeinen Formel

a-Aminoisobulyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-i.-histidyl-L-phcnyl-

alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-

L-lysyi-i.-prolyl-L-valyl-glycyl-X-L-lysyl-

i.-arginyl-Y

in der X ein 1 -Lysin- oder L-Ornithinrcst und Y ein i.-Arginin-. 1 -Argininester- oder i.-Argininamidrcst i·■'.. deren Saurcadditionssal/e und Komplexe.

9. I-a-Aminoisobuttersäure-corticotropjnpeptide der allgemeinen Formel

a-Aminüisobutyryl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenyl-

alanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-X-L-lysyl-L-arginyl-L-arginyl-L-prolyl-L-valyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-Y