DE2534086A1

DE2534086A1 - Polypeptide mit acth-aehnlicher wirkung, ihre salze und komplexe, verfahren zu deren herstellung und diese verbindungen enthaltende arzneimittel

Info

Publication number: DE2534086A1
Application number: DE19752534086
Authority: DE
Inventors: Ken Inouye; Masaru Shin; Kunio Watanabe
Original assignee: Shionogi and Co Ltd
Current assignee: Shionogi and Co Ltd
Priority date: 1974-07-30
Filing date: 1975-07-30
Publication date: 1976-02-12
Also published as: NL7508927A; FR2280388A1; GB1513472A; US4018753A; JPS5116667A; CH612917A5; FR2280388B1

Description

" Polypeptide mit ACTH-ähnlicher Wirkung, ihre Salze und Komplexe, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel "

Priorität: 30. Juli 1974, Japan, Nr. 87 759/74

.Die Erfindung betrifft Polypeptide mit ACTH-ähnlicher Wirkung, ihre Salze und Komplexe, Verfahren zu deren Herstellung und diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel.

Es sind eine Reihe von modifizierten CorticotropineACTH)-Polypeptiden bekannt, deren Kette kürzer als beim nativen Hormon ist und die eine ACTH-ähnliche' Wirkung aufweisen.

Diese Peptide weisen insbesondere in den Stellungen 1, 4, 5» 15, 16, 17 und 18 sowie am C-endständigen Rest Modifikationen auf. Beispielsweise ist die erste Aminosäure L-Serin gegen a-Aminoisobuttersäure, D-Serin, ß-Alanin, Glycin oder Sarcosin, die vierte Aminosäure L-Methionin gegen L-Morleucin, L-Isoleucin

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oder L-Norvalin, die 5· Aminosäure L-Glutaminsäüre gegen L-Glutamin, die 15. und 16. Aminosäure L-Lysin gegen L-Ornithin und die 17. und 18. Aminosäure L-Arginin gegen L-Lysin oder L-Ornithin ausgetauscht. Die Carboxylgruppe der C-endständigen Aminosäure kann als Amid vorliegen. Jedoch besteht ein Nachteil dieser Peptide darin, daß sie verglichen mit ihrer nebennierenstimulierenden Wirkung eine relativ starke melanozytenstimulierende Wirkung aufweisen. Da aber alle Polypeptide mit corticotroper Wirkung im Molekül die für die melanozytenstimulierende Wirkung verantwortliche Aminosäuresequenz enthalten,, weisen diese Peptide sämtliche in mehr oder weniger großem Umfang diese unerwünschte Wirkung auf. Werden solche Peptide mit starker melanozytenstimulierender Wirkung an Patienten verabfolgt, so wird deren Haut dunkel.

Für therapeutische Zwecke werden corticotrope Peptide im allgemeinen in Form eines Komplexes mit Zink verabfolgt. Der Grund für die Verwendung dieser Komplexe liegt darin, daß sie im Vergleich zum entsprechenden reinen Peptid eine verzögerte Wirkung aufweisen. In letzter Zeit wurde jedoch mehrfach darüber berichtet, daß bei Verabfolgung von ACTH-Peptiden in Form von Zinkkomplexen häufiger gefährliche anaphylaktische Reaktionen auftreten, als dies bei den reinen Peptiden der Fall ist.

Aufgabe der Erfindung war es daher, neue corticotrope Peptide zu schaffen, die eine langdauernde, starke, nebennierenstimulierende Wirkung aufweisen und deren melanozytenstimulierende Wirkung nur gering ist. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst. _j

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Es wurde erfindungsgemäß festgestellt, daß neben einem Austausch der Aminosäuren in den Stellungen 1, 17 und 18 durch eine Modifikation am C-endständigen Rest die biologischen Eigenschaften verstärkt und eine verlängerte Wirkungsweise erreicht werden kann, wobei nur geringfügige Nebenwirkungen auftreten.

Gegenstand der Erfindung sind somit Polypeptide der allgemeinen Formel I

X^Tyr-Ser-X^X^-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-(Lys)_n-Y (I)

OC-

in der X₁ einen/Aminoisobuttersäure-iß-Alanin-, L-Serin-, Glycin-, D-Serin-, D-Alanin-, y-Aminobuttersäure-oder Sarcosinrest, Xp einen L-Methionin-, L-Norleucin-, L-Isoleucin- oder L-Norvalinrest, X^ einen L-Glutaminsäure- oder L-Glutaminrest, η eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 4 und Y einen an die Carbonylgruppe des C-endständigen Lysinrests gebundenen Rest der allgemeinen Formel _D

/ ¹

bedeutet, wobei R₁ und Rp jeweils ein Wasserstoffatom oder gleiche oder verschiedene niedere Alkylreste mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellen oder R₁ und Rp zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, gegebenenfalls zusammen mit einem weiteren Heteroatom einen stickstoffhaltigen, gegebenenfalls substituierten, heterocyclischen Ring bilden, unter Ausschluß von Peptiden, bei denen X₁ einen a-Aminoisobuttersäure oder D-Serinrest und R₁ und R₂ jeweils ein Wasserstoffatom bedeutet und η den Wert 4 hat, sowie deren Salze mit Säuren und Komplexe. j

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Beispiele für niedere Alkylreste sind die Methyl-, Äthyl- und Propylgruppe. Beispiele für heterocyclische Ringe sind

Pyrrolidin, Prolin, Prolinol (2-Hydroxymethylpyrrolidin) und Prolinamid.

Bevorzugte Polypeptide der allgemeinen Formel I sind

/Xib¹,Lys¹⁷'¹?/-ACTH(1-18)-N(CHj₉, /Äib¹ ,Lys¹⁷'¹?/-ACTH(I-

/—T
18)-N und Z^i-b¹,Lys¹⁷'¹⁸J-ACTH(1-19)-NH₂ (Aib = a-Aminoisobuttersäure).

Die Polypeptide der allgemeinen Formel I lassen sich erfindungsgemäß durch schrittweise Verknüpfung der einzelnen Aminosäuren oder durch Verknüpfung von vorher synthetisierten Peptidbruchstücken in an sich bekannter Weise herstellen. Insbesondere können diese Verbindungen hergestellt werden, indem man

(a) einen Aminosäure- oder Peptidester mit einer freien Aminogruppe mit einer anderen Aminosäure oder einem Peptid, dessen Aminogruppe(n) geschützt ist, in Gegenwart eines Kondensationsmittels verknüpft oder

(b) eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer freien Aminogruppe, dessen Carboxylgruppe(n) gegebenenfalls geschützt ist, mit einer anderen Aminosäure oder einem Peptid mit aktivierter Carboxylgruppe und geschützten Aminogruppen umsetzt, und von dem erhaltenen geschützten Peptid die Schutzgruppen durch katalytische Hydrierung, saure Solvolyse, Hydrolyse, Hydrazinolyse, Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder nach anderen Verfahren entfernt.

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Die Peptidbindungen werden nach üblichen Verfahren geknüpft. Beispiele für derartige Verfahren sind das Azidverfahren, das Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, das Carbonyldiiinidazolverfahren, das gemischte Anhydridverfahren, das Aktivesterverfahren, z.B. mit dem p-Nitrophenyl-, N-Hydroxysuccinimid-, Cyanomethyl-, p-Nitrophenylthiol- und Pentächlorphenylester, das Isoxazoliumverfahren und das N-Carboxyanhydridverfahren. Die Peptide der Erfindung können auch nach der sogenannten Synthese in fester Phase hergestellt werden. Bevorzugt sind das Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, das Azidverfahren, das gemischte Anhydridverfahren und das Aktivesterverfahren. Bei der vorgenannten Kondensationsreaktion können N-Hydroxysuccinimid, N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboxyimid oder 1-Hydroxybenzotriazol zugesetzt werden.

Zur Herstellung der Polypeptide der Erfindung werden alle freien, funktioneilen, an der Reaktion nicht teilnehmenden Gruppen vorteilhaft durch Reste geschützt, die leicht durch spaltende Hydrierung, Säurehydrolyse, Hydrazinolyse, Hydrolyse oder durch Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak entfernt werden können. Die Carboxylgruppe wird vorzugsweise durch Veresterung, z.B. mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol oder tert.-Butanol, oder einem Arylalkohol, wie Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol oder p-Methoxybenzylalkohol, geschützt. Diese Carboxylschutzgruppen werden nach üblichen Verfahren eingeführt. Die Aminogruppe wird vorzugsweise durch Gruppen,wie die 1-Methylcyclohexyloxycarbonyl-, 1-Methylcyclop entyloxycarbonyl- , 9-Methyl-9-fluorinyloxycarbonyl-,

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Γ .6- ""

tert.-Butyloxycarbonyl-, tert.-Amyloxycarbonyl-·, o-Nitrophenylsulfinyl-, Z-Cp-DiphenylJ-isopropyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl-, Formyl- oder Tritylgruppe, auf übliche Weise geschützt. Zum Schutz der Guanidinogruppe im Arginin wird vorzugsweise die Nitro-, Tosyl- oder Adamantyloxycarbonylgruppe verwendet, jedoch ist es nicht immer notwendig, die Guanidinogruppe des Arginins während der Reaktion zu schützen. Die £ -Aminogruppe des Lysins wird vorteilhaft durch die vorgenannten Aminoschutzgruppen geschützt. Jedoch wird vorzugsweise eine Cü -Aminoschutzgruppe verwendet, die selektiv neben α-Aminoschutzgruppen entfernbar ist. Die y-Carboxylgruppe der Glutaminsäure wird vorzugsweise durch die vorgenannten Carboxylschutzgruppen geschützt, während die Imidazolgruppe des Histidins durch die Tosyl-, Benzyloxycarbonyl- oder Benzylgruppe geschützt werden kann. Außerdem kann die Hydroxylgruppe des Serins oder Tyrosins durch die Acetyl-, Benzyl- oder tert.-Butylgruppe geschützt werden, jedoch ist ein derartiger Schutz nicht immer notwendig.

Die Entfernung der Schutzgruppen von den Aminosäuren, den Zwischenprodukten oder den Polypeptid-Endprodukten wird nach in der Peptidchemie üblichen Verfahren durchgeführt. Beispiele für derartige Verfahren sind katalytische Hydrierung, Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak, saure Solvolyse unter Verwendung einer Säure, wie Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff, Chlorwasserstoff, Trifluoressigsäure, Essigsäure oder Ameisensäure, Säurehydrolyse, z.B. mit Salzsäure oder Bromwasserstoffsäure, und alkalische Verseifung, z.B. mit Natriumhydroxid.

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Der letzte Verknüpfungsschritt zur Herstellung der Polypeptide der allgemeinen Formel I wird beispielsweise durchgeführt, indem man ein geschütztes Dekapeptid der allgemeinen Formel

R¹-X₁-Tyr~Ser-X₂-X,(R²)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH

1 2

in der R eine Aminoschutzgruppe und R eine Schutzgruppe für die y-Carboxylgruppe der Glutaminsäure bedeutet und X₁, X₂ und X, die vorgenannte Bedeutung haben, mit einem geschützten Peptid der allgemeinen Formel

H-Lys(R³)-Pro-Val-Gly-^Lys(R⁴IZ_n-

3 A

in der R und R jeweils eine f-Aminoschutzgruppe bedeutet und Υ und η die vorgenannte Bedeutung haben, unter Anwendung des Aktivesterverfahrens, des Azidverfahrens, des Dicyclohexylcarbodiimidverfahrens, des gemischten Anhydridverfahrens oder einer Kombination dieser Verfahren kondensiert und vom erhaltenen geschützten Peptid der allgemeinen Formel

R¹-X₁-Tyr-Ser-X₂-X₃(R²)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(R³)-Pro-Val-Gly-ZLys(R⁴)7_n-Y ,

in der die einzelnen Symbole die vorgenannte Bedeutung haben, die Schutzgruppen durch saure Solvolyse, katalytische Hydrierung oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak entfernt.

Vorzugsweise wird die letzte Verknüpfungsreaktion unter Anwendung des Aktivesterverfahrens, insbesondere des N-Hydroxysuccinimidesterverfahrens, in einem inerten Lösungsmittel bei Temperaturen von -20 bis 60⁰C, insbesondere 0 bis 45⁰C, etwa

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1 Stunde bis 72 Stunden, insbesondere etwa mehrere Stunden bis 48 Stunden, durchgeführt. Beispiele für entsprechende Lösungsmittel sind Dimethylformamid, Dimethylsulfoxid, Hexamethylphosphortriamid und Gemische dieser Lösungsmittel gegebenenfalls im Gemißch mit Waesar. Die Schutzgruppen werden vorzugsweise durch saure Solvolyse unter Verwendung einer Säure, z. B. eines Halogenwasserstoffs, wie Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Chlorwasserstoff, Trichloressigsäure oder Trifluoressigsäure bei Temperaturen von -20 bis 60⁰C unter Einhaltung einer Behandlungsdauer von 30 Minuten bis einige Stunden entfernt.

Die.nach dem erfindungsgemäßen Verfahren hergestellten Polypeptide können nach verschiedenen Verfahren gereinigt werden, beispielsweise durch Ionenaustauschchromatographie, Verteilungschromatographie, Gelfiltration oder Adsorptionschromatographie an Säulen mit Ionenaustauscherharz, Ionenaustauscher ellulose, Cellulose, vernetztem Dextrangel, wie Sephadex, Polyacrylamidgel, wie Bio-Gel P, Kieselgel oder anderen in der Peptidchemie üblichen Materialien.

Je nach den verwendeten Reaktionsbedingungen erhält man die Poly peptide der Erfindung in Form der freien Basen oder ihren Salzen mit einer Säure. Die Salze können in die entsprechenden freien Basen und andererseits die freien Basen durch Behandlung mit einer entsprechenden Säure zu den entsprechenden Salzen umgesetzt werden. Beispiele für entsprechende anorganische Säuren sind Halogenwasserstoffsäure, wie Salzsäure oder Bromwasser-

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stoffsäure, und Phosphorsäure. Beispiele für organische Säuren sind Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Bernsteinsäure, Citronensäure, Benzolsulfonsäure und p-Toluolsulfonsäure. Zur Salzbildung wird die Säure in äquimolaren Mengen bzw. im Überschuß eingesetzt.

Die Polypeptide der Erfindung lassen sich mit komplexbildenden Schwermetallen, wie Zink, Kupfer, Eisen, Nickel oder Kobalt, oder mit komplexbildenden Polyaminosäuren, wie Polyglutaminsäure, Polyasparaginsäure, Copoly-glutamyl-tyrosin und Copolyaspartyl-glutaminsäure, in an sich bekannter Weise in die entsprechenden Komplexe überführen. Die auf diese Weise erhaltenen Komplexe zeigen eine langdauernde Wirkung.

Die Polypeptide der Erfindung zeigen eine ausgeprägte biologische Aktivität, die der von nativem Corticotropin und von verwandten, bekannten, Peptiden überlegen ist.

Die nebennierenstimulierende Wirkung der Polypeptide der Erfindung wurde nach verschiedenen Verfahren bestimmt. Als Vergleichsprodukte wurden natives Corticotropin (ACTH), /GIy/-ACTH(I-18)-NH₂ (vgl. Bull.Chem.Soc. Japan, Bd. 43 (1970), S. 196), /Aibl/-ACTH(i-18)-NH₂*(Bull. ehem. Soc. Japan, Bd. 43 (1970), S. 3873), /Xib¹,Lys¹⁷'¹^Z-ACTH(I-I8)-NH₂, Cortrosyn^R (N.V.Organon, Niederlande) und Cortrosyn-Z (N.V. Organon, Niederlande) verwendet. Die nebennierenstimulierende Wirkung wurde durch intravenöse Verabfolgung an hypophysenektomierte Ratten in der Weise bestimmt, daß ein Peptidpräparat in die Femoralvene verabfolgt und 30 Minuten später eine Blutprobe j

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aus der Abdominalaorta entnommen wurde. Die nebennierenstimulierende Wirkung wurde auch durch intramuskuläre Verabfolgung an hypophysenektomierte Ratten bestimmt, wobei ein Peptidpräparat in den Rattenschenkelmuskel injiziert und 30 Minuten später eine Blutprobe aus der Abdominalaorta entnommen wurde. Während des ganzen Experimentes wurde der "USP Corticotropin Reference Standard" als Standard verwendet und die Bildung von 11-Hydroxycorticosteroiden nach dem fluorometrischen Verfahren von Peterson (vgl. J. Biol. Chem,, Bd. 225 (1957), S. 25) bestimmt. Bei jedem Bestimmungsverfahren wurden üblicherweise mehrere Messungen durchgeführt, und die unabhängig voneinander gewonnenen Werte wurden nach dem statistischen Verfahren von Sheps und Moore ausgewertet (vgl. J.Pharmacol. Extl. Therap., Bd. 129 (1960),..S. 99).

Die Wirkung auf das Nebennierenwachstum und die Thymusrückbildung wurde folgendermaßen bestimmt:

Die Peptide wurden intramuskulär 2 Tage lang in Dosen von 20 ^ig bzw. 100 jig/Ratte/Tag verabfolgt. 24 Stunden nach der letzten Injektion wurden die Ratten autopsiert, und anschließend wurde das Gewicht der Nebennieren und der Thymusdrüsen bestimmt.

Die in vivo-melanozytenstimulierende Wirkung wurde nach dem in Endocrinol. Japonica, Bd. 19 (1972), S. 383, beschriebenen Verfahren bestimmt.
Die Versuchsergebnisse sind in Tabelle I zusammengestellt:

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Tabelle I

Peptid·	nebenni erens timuli er en de Wirkung	i.m.	Wirkung auf das Keben- nierenv/achs· turn und die Thymusrück- bildung a)	melanozy- tenstimu- lierende Wirkung b) in vivo	Ver hält nis a/b
[.Axb ,Lys ' ' ]_ AarH(l-l8)-Nf~T	i.v.	16_;5	0_;4l	0;25	I₇ 64
lAibSLys¹⁷'¹⁸;}.. ACTH( 1-18) -NCr^Cir3 CHo	6_f8	11_;1	0_;30	0,11	2_;73
Native ACTH	8 ,5	4_;0	*	■
[GIy¹J-ACTH(1-18)- NIi₂	l_;0	l_;0	*	0_;ll	0,12
[AXb¹J-ACTH(I-IS)- NH₂	1,0	9;9	0_;12	l_;00	Oj 49
iW.Lys¹⁷'¹⁸^ ACTH(I-IS)-NH₂	V	9_;4 V	0_;40	0_;82
Cortrosyn	9,3	³Z¹			0_;58
Cortrosyn-Z	1,8		IjOO	1,72

Anmerkung:

* Die Wirkungen auf das Nebennierenwachstum und die Thymusrückbildung sind sehr schwach. CortrosynR = ACTH(i-24)-0H (N.V.Organon, Niederlande); Cortrosyn-Z = Zinlckomplex von Cortrosyn (N.V. Organon, Niederlande). Die Zahlenwerte für die nebennierenstimulierende und die melanozytenstimulxerende

L Wirkung geben relative Werte wieder. -¹

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Zur Bestimmung der nebennierenstimuli er enden Wirkung, v.^ras die Hauptaufgabe von ACTH ist, gibt es verschiedene Verfahren. Bei einem der zuverlässigsten Verfahren wird die Wirkung auf das Nebennierenwachstum und die Thymusrückbildung festgestellt. Demzufolge sind Polypeptide mit einem möglichst großen Verhältnis a/b (a = Wirkung auf das Nebennierenwachstum und die Thymusrückbildung; b = melanozytenstimulierende Wirkung) besonders wertvoll. Es ist festzustellen, daß die Wirkung von nativem ACTH, /Gly_7-ACTH(1-18)-NH₂ und Cortrosyn auf das Nebennierenwachstum und die Thymusrückbildung sehr schwach ist. Diese Peptide sind deshalb als Arzneistoffe nur von begrenztem Wert. Aus der Tabelle I geht hervor, daß sich die Polypeptide der Erfindung gegenüber nativem ACTH und anderen bekannten Peptiden durch ihr hohes a/b-Verhältnis auszeichnen.

Die Polypeptide der !Erfindung sind deshalb besonders bei der Behandlung von verschiedenen Entzündungen, Nebenniereninsuffizien auf Grund von Hypophysenstörungen , akutem oder chronischem Gelenkrheumatismus und allergischen Krankheiten und Nebeninsuffizienz
nierenrinden/ von Tieren und Menschen besonders wertvoll.

Ferner sind sie wertvolle Hilfsmittel zur Untersuchung der Nebennierenrindenfunktion von Tieren und Menschen.

Die Polypeptide der Erfindung, ihre Salze mit Säuren und Komplexe können oral oder parenteral in üblichen Darreichungsformen verabreicht werden, z.B. als Injektionspräparate, Flüssigkeiten, Suspensionen, Emulsionen oder Aerosole, im Gemisch mit Trägern, Stabilisatoren, Emulgatoren, Konservierungsmitteln,

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Puffern, isotonisierenden Verbindungen und/oder Netzraitteln.

Die Erfindung betrifft also auch Arzneipräparate, enthaltend ein Polypeptid der allgemeinen Formel I und übliche Trägerstoffe und bzw. oder Verdünnungsmittel und/bzw. oder Hilfsstoffe.

Die wirksame Dosis kann von Ärzten leicht unter Zugrundelegung der hier angegebenen Werte bestimmt werden. Z.B. beträgt eine typische klinische Dosis der Polypeptide der Erfindung etwa 0,001 mg/kg bis 0,02 mg/kg/Tag für einen normalen Erwachsenen. Die Polypeptide der Erfindung werden vorzugsweise in Form von Injektionspräparaten verabfolgt.

Die in den folgenden Beispielen, sowie in der übrigen Beschreibung und in den Ansprüchen verwendeten Abkürzungen für Aminosäuren, Peptide und deren Derivate entsprechen den Vorschlägen der IUPAC-IUB Commission of Biochemical Nomenclature (vgl. J. Biol. Chem., Bd. 241 (1966), S. 2491; Bd. 242 (1967), S. 555; und Bd. 247 (1972), S. 977). Sofern nicht anders angegeben, weisen alle Aminosäurereste die L-Konfiguration auf.

Die ACTH-Analogen mit den Aminosäureresten in den Stellungen m

bis η (vom N-endständigen Rest aus gezählt), werden in abgekürzter Schreibweise mit X-/Ä¹, B^,.. •7'-ACTH(m-n)-Y wiedergegeben, wobei mit A, B .... die Aminosäurereste in den Stellungen i, j, ... und mit X und Y das Wasserstoffatom oder dessen Substituent der N-endständigen a-Aminogruppe bzw. die Hydroxylgruppe oder deren Substituent der C-endständigen a-Car-

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boxylgruppe bezeichnet sind. Wenn X ein Wasserstoffatom bedeutet, so kann das Symbol H entfallen.

Die Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-N(CH,)₂ (Aib=a-Aminoisobuttersäure) (/Aib¹,Lys¹⁷'¹⁸7-ACTH(1-18)-N(CHJ₂)

1. Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-N(CH₃)₂ (i) (Z=Benzyloxycarbonyl, Boc=tert-Butyloxycarbonyl)

2,275 g l^-Benzyloxycarbonyl-N^ -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-N-hydroxysuccinimidester v/erden in 15 ml Tetrahydrofuran gelöst. Diese Lösung wird auf O⁰C gekühlt. Nach Zugabe von 1,58 g Dimethylamin wird das erhaltene Gemisch 4 Stunden bei O⁰C stehengelassen. Sodann wird die Lösung unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand in einem Gemisch aus Essigsäureäthylester und Wasser gelöst. Die Lösung wird ausgeschüttelt und die organische Phase abgetrennt. Die organische Lösung wird getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird in 20 ml Methanol gelöst und 3 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart von Palladiummohr hydriert. Die Reaktionslösung wird unter vermindertem Druck eingedampft und der Rückstand in Dimethylformamid gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 1,67 g I^-Benzyloxycarbonyl-N^ -terttbutyloxycarbonyl-L-lysin - N-hydroxysuccinimidester versetzt. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht bei 4°C stehengelassen.

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Sodann wird die Lösung unter vermindertem Druck zu einem öligen Rückstand eingedampft, der nach Chromatographie an einer Kieselgelsäule unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis 9 J 1 2,07 g des gewünschten Produkts ergibt; /oj^»⁵ = -13,8 + 0,6° (c = 0,979, Methanol) C₃₂H₅₃N₅O₈-H₂O C H -N

ber.i 58,78 8,48 10,71

gef.: 59,14 8,56 10,38.

2. Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-N(CH₃)₂ (II)

1,896 g der Verbindung I werden in 15 ml Methanol gelöst und 21/2 Stunden bei Raumtemperatur über Palladiummohr als Katalysator hydriert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck wird der Rückstand in Dimethylformamid gelöst. Die erhaltene Lösung wird unter Eiskühlung mit 1,06 g I^-Benzyloxycarbonyl-N^ -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-N-hydroxysuccinimidester versetzt. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht bei 4 C stehengelassen und sodann unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene ölige Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst, mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Nach dem Umfallen des Rückstands aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Petroläther erhält man 1,79 g Produkt vom F. 68,5 bis 70,5⁰C; ⁵'⁵ = -20,6 + 0,6° (c = 1,007, Methanol).

C₄₃H₇₃N₇O₁₁ CHN

ber.: 59,77 8,72 11,35
gef.: 59,68 8,50 11,37.

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3. Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-N(CH₃)₂ (III)

0,804 g der Verbindung II werden in 5 ml Methanol gelöst und 3 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart von Palladiummohr hydriert. Die erhaltene Lösung wird unter vermindertem Druck zu einem öligen Rückstand eingedampft. Dieser wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 0,478 g i^-Benzyloxycarbonyl-N^ -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-N-hydroxysuccinimidester versetzt. Anschließend wird das Gemisch über Nacht bei 4⁰C stehengelassen. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck wird der Rückstand in Essigsäureäthylester gelöst. Die Lösung wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Nach dem Umfallen des erhaltenen öligen Rückstands aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Petroläther erhält man 0,935 g Produkt vom F. 90 bis 92°C; /ö/j^'⁵ = -23,4 + 0,6° (c = 1,014, Methanol).
C₅₄H₉₃N₉O₁₄ CH N

ber.: 59,37 8,58 11,54

gef.; 59,44 8,62 11,65.

4. Z-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(3oc)-)₂ (IV)

0,546 g der Verbindung III v/erden in Methanol gelöst und 3 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart von Palladiummohr als Katalysator hydriert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck erhält man ein Tetrapeptid

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ohne Schutzgruppe in der !^-Stellung als öligen Rückstand. Andererseits werden 0,317 g Z-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-OH in 5 ml Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird mit 0,058 g N-Hydroxysuccinimid versetzt. Anschließend wird das Gemisch unter Eiskühlung gerührt und mit einer Lösung von 0,10Jg NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethylformamid versetzt. Sodann wird das Gemisch 30 Minuten bei O⁰C gerührt. Die erhaltene Lösung wird mit einer Lösung des vorstehend erhaltenen Tetrapeptide in Dimethylformamid versetzt. Nach 6-stündigem Rühren bei 0⁰C läßt man das Gemisch über Nacht stehen. Sodann wird das Lösungsmittel durch Eindampfen entfernt, der Rückstand in Essigsäureäthylester gelöst und die Lösung gewaschen, getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Petroläther umgefällt und abfiltriert. Der abfiltrierte Niederschlag wird saulenchromatographisch an Kieselgel unter Verwendung von 200 ml Chloroform, 200 ml eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (95 : 5), 200 ml eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (9:1) und 200 ml eines Gemisches aus Chloroform und Methanol (85 : 15) als Laufmittel gereinigt. Man erhält 0,447 g Produkt vom F. 130 bis 141°C; faj^'⁵ = - 44,8 + 2,5° (c = 0,348, Methanol).

H₁₄O₂₀ C H-N

ber.: 58,76 8,45 12,46 gef.: 58,94 8,61 12,19.

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5. Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-N(CH₃)₂ /Äib¹,Lys¹⁷' ¹⁸-(V)

70,8 mg der Verbindung IV wer dan in 5 ml Methanol gelöst und 3 Stunden bei Raumtemperatur in Gegenwart von Palladiummohr hydriert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck erhält man das I^-freie Octapeptid als öligen Rückstand. Andererseits werden 63,5 mg Boc-Aib-Tyr-Ser-Met-GluCOBu^-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH (hergestellt gemäß der japanischen Patentveröffentlichung Nr. 2545/1973) in 1,5 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit Eis gekühlt und anschließend mit 0,1 ml 1 η Salzsäure versetzt. Das erhaltene Gemisch wird unter Kühlung mit Essigsäureäthylester versetzt. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet und sodann in 1 ml Dimethylformamid wieder in Lösung gebracht. Diese Lösung wird mit 10,1 mg N-Hydroxysuccinimid und 0,006 ml Triäthylamin versetzt und sodann mit Eis gekühlt. Zu dieser Lösung werden 31,8 mg des vorstehend erhaltenen Octapeptids und 31,8 mg NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid in 1 ml Dimethylformamid gegeben. Das Gemisch wird sodann 2 Stunden bei 0⁰C und 22 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Nach Zugabe von 50 ml Essigsäureäthylester wird der entstandene Niederschlag abfiltriert. Dieser Niederschlag wird in Essigsäureäthylester gelöst und zu 115 mg eines weißen Pulvers lyophilisiert. Dieses Pulver wird in 2 ml Trichloressigsäure, 0,1 ml Mercaptoäthanol und 0,1 ml Anisol gelöst. Die erhaltene Lösung wird 1 Stunde bei Raumtemperatur stehengelassen. Der nach Zugabe von Diäthyl-

L _l

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äther gebildete Niederschlag wird abfiltriert und getrocknet. Das erhaltene Produkt ist das von Schutzgruppen befreite Octadekapeptid. Dieses Octadekapeptid wird in 5 ml Wasser gelöst und an einer mit Amberlite CG-400 beschickten Säule der Abmessungen 0,9 χ 10 cm unter Verwendung von Wasser als Elutionsmittel gereinigt. Die Eluate werden zu 93 mg eines Pulvers lyophilisiert. Dieses Pulver wird in 1,5 ml Wasser gelöst und säulenchromatographisch an einer mit Carboxymethylcellulose beschickten Säule der Abmessungen 1,5 χ 17 cm gereinigt, wobei 1000 ml Ammoniumacetatpuffer vom pH-Wert 5,82 mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,6 m als Elutionsmittel verwendet v/erden. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und zu 94 mg eines gereinigten Pulvers lyophilisiert. Dieses Pulver wird verteilungschromatographisch an einer mit Sephadex G-25 (Medium) beschickten Säule der Abmessungen 2,3 x 41 cm unter Verwendung eines Gemisches aus Butanol, Essigsäure, Pyridin und Wasser (12 : 3:4: 6 Volumteile) als Laufmittel weiter gereinigt. Die Fraktionen Nr. bis 43 (6 g pro Fraktion) werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und zu 61 mg Peptid lyophilisiert.

Das vorstehend erhaltene Peptid wird an einer mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM-52) beschickten Säule der Abmessungen 1,5 x 30 cm weiter gereinigt, wobei 1000 ml Ammoniumacetatpuffer vom pH-Wert 6,13 mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,1 bis 0,6 m als Elutionsmittel verwendet werden. Die Eluate der Fraktionen Nr. 153 bis 175 (5 g/Fraktion) werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und zu 38 mg des

L -J

509887/ 1 097

gewünschten Produkts lyophilisiert. [oJ-q - -62,2 + 2,1° (c =0,5, 0,1 η Essigsäure). Aminosäuren-Molverhältnis: Lys 4,96 (5), His 1,00(1), Arg 1,02 (1), S_er 0,92 (1), GIu 0,98 (1), Pro 1,02 (1), GIy 1,93 (2), VaI 1,00 (1), Met 0,95 (1), Tyr 1,03 (1), Phe 0,99 (1), (Die Zahlen in Klammern geben die theoretischen Werte an). Das Produkt ergibt bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose F, (Merck) unter Verwendung von 1-Butanol, Essigsäure, Pyridin und Wasser im Volumenverhältnis 15 : 3 ί 10 : 15 als Laufmittel eine einzige Komponente.

Beispiel 2 Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-

Lys-Lys-Lys-N

(/Äib¹, Lys¹⁷'¹?7-ACTH(1-18)-pyrrolidid)

6. Z-Lys(Boc)-IT (VI)

Eine Lösung von 1,44 g IN^-Benzyloxycarbonyl-N^ -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-N-hydroxysuccinimidester (Z-Lys(Boc)-OSu) in 5 ml Dimethylformamid wird mit 0,25 ml Pyrrolidin versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 5 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen. Sodann wird das Lösungsmittel durch Abdampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der erhaltene Rückstand wird in

Essigsäureäthylester gelöst. Diese Lösung wird mit 0,5 η Salzlösung

säure und 0,5 m Natriumbicarbonai/gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Das erhaltene Produkt wird an einer mit 70 g Kieselgel (Kieselgel H, Merck) beschickten Säule unter Verwendung eines Gemisches aus Benzol, Essigsäureäthylester und Essigsäure im Volumenver-L

509887/1097

Γ ^Π

hältnis von 70 : 30 : 3 als Lösungsmittel gereihigt. Die das gewünschte Material enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus einer Mischung von Diäthyläther und Petroläther umgefällt. Man erhält 1,40 g eines gelatinösen Feststoffs; /clJ-q = -3,2 + 0,9° (c = 0,5, Methanol).
C₂₃H₃₅N₃O₅ CHN

ber.: 63,72 8,14 9,69

gef.: 63,94 8,22 9,42.

7. Z-Lys(Boc)-Lys(Boc )-N^ I (VIl)

1,40 g der Verbindung VI werden 5 Stunden in etwas Essigsäure enthaltendem Methanol in Gegenwart von Palladium hydriert. Man erhält H-Lys(Boe)-pyrrolidid in Form eines Öls. Dieses Öl wird in Essigsäureäthylester gelöst und bei 0⁰C mit 1,44 g Z-Lys(Boc)-OSu versetzt. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht bei 4⁰C gerührt und anschließend mit 0,5 η Salzsäure und 0,5 m Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Das erhaltene . Produkt wird an einer mit 70 g Kieselgel (Kieselgel H, Merck) beschickten Säule unter Verwendung eines Gemisches aus Benzol, Essigsäureäthylester und Essigsäure im Volumenverhältnis von 70 : 30 : 3 gereinigt. Die das gewünschte Material enthaltenden Fraktionen werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält 2,5 g Öl, das direkt weiter verarbeitet wird.

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8. Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-N (VIII)

2,5 g der Verbindung VII werden 4 Stunden in Methanol in Gegenwart von Palladium hydriert. Man erhält H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-pyrrolidid in Form eines Öls. Dieses Öl wird in 20 ml Essigsäureäthylester gelöst und bei 0⁰C mit 1,44 g Z-Lys(Boc)-OSu versetzt. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht bei 4°C gerührt und anschließend mit 0,5 η Salzsäure und 0,5 η Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der Rückstand wird aus einer Mischung von Diäthyläther und Petroläther kristallisiert. Man erhält 2,60 g Produkt vom F. 67 bis 69⁰C; ^⁵ -21,6 + 0,6° (c = 1,0, Methanol).

C₄₅H₇₅N₇O₁	1	60	C	H	1	1	N
ber.	•	60	,72	8,49	1	1	,02
gef.	•	,62	8,41		,10.

9. Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-N^ (IX)

1,10 g der Verbindung VIII werden 4 Stunden in etwas Essigsäure enthaltendem Methanol in Gegenwart von Palladium hydriert. Man erhält H-LysiBocJ-LysiBocJ-LysiBocJ-pyrrolidid in Form eines Öls. Dieses Öl wird in 10 ml Essigsäureäthylester gelöst und bei O⁰C mit 0,583 g Z-Lys(Boc)-OSu versetzt. Das Gemisch wird über Nacht bei 4°C gerührt und anschließend mit 0,5 η Salzsäure und 0,5 m Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird aus einer Mischung von Diäthyläther und

J 509887/1097

Petroläther gefällt. Man erhält 1,30 g Produkt vom F. 115 Ms 117°C; /ö/ß⁴'⁵ = -22,8 +0,6° (c = 1,0, Methanol). C₅₆H₉₅N₉O₁₄ CHN

ber.: 60,14 8,56 11,27 gef.: 60,31 8,68 11,27.

10. Z-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys

(Boc)-N^ j (X)

50 ml

1,25 g der Verbindung IX werden 5 Stunden in/Methanol in Gegenwart von Palladium hydriert. Anschließend \irird das Lösungsmittel durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt. Man erhält H-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-pyrrolidid als Öl. Dieses Öl wird in 10 ml Dimethylformamid zusammen mit 0,67 g Z-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-OH und 0,105 g N-Hydroxysuccinimid gelöst. Die erhaltene Lösung wird bei O⁰C mit 0,187 g N,N^f-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht bei O⁰C gerührt. Anschließend wird der gebildete Dicyclohexylharnstoff abfiltriert und das Filtrat bei 40 bis 45°C unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst und die Lösung mit 0,5 η Salzsäure und 0,5 m Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird aus einer Mischung von Diäthyläther und Petroläther gefällt. Man erhält 1,40 g Produkt vom F. 120 bis 125°C; ^7§⁴'⁵ = -46,1 + 0,9 (c = 1,0; Methanol).

_J 50988 7/1097

Γ Π

" ²⁴ " 2534Ü86

C₇₉H₁	34^Ν14^Ο2Ο·^Η2^Ο	C	64	H	12	N
	ber.;	58,	72	8,47	12	,12
	gef.:	58,	8,36	,26

11. Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-pyrrolidid (Xl) /Äib¹,Lys¹⁷'¹⁶^-ACTH

0,16 g der Verbindung X werden 5 Stunden in 0,16 g Methanol in Gegenwart von Palladium hydriert. Anschließend wird das Lösungsmittel durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt. Man erhält N^-freies Octapeptid-pyrrolidid. 0,145 g Boc-Aib-Tyr-Ser-Met-Glu(OBu^t)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH v/erden in 2 ml Dimethylformamid gelöst. Die erhaltene Lösung wird mit 0,2 ml 1 η Salzsäure versetzt. Das auf diese Weise gebildete Dekapeptidhydrochlorid wird mit Diäthyläther gefällt und unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxid getrocknet.

Das vorstehend erhaltene Dekapeptid und das vorstehend erhaltene Octapeptid-Derivat werden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,023 g N-Hydroxysuecinimid versetzt. Die erhaltene Lösung wird bei O⁰C mit 0,041 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht bei 4°C stehengelassen und anschließend in 100 ml eines 1 : 1-Gemisches aus Essigsäureäthylester und Diäthyläther eingebracht. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert, mit Essigsäureäthylester und Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck eingedampft. Man erhält das rohe, geschützte Octadekapeptid-Derivat. L -J

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" ²⁵ " 2534Ü86

Das vorstehend erhaltene geschützte Peptid wird zusammen mit 0,1 ml Anisol und 0,1 ml 2-Mercaptoäthanol in 3 ml Trifluoressigsäure gelöst. Die erhaltene Lösung wird 60 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen. Der nach Zugabe von Diäthyläther gebildete Niederschlag wird abfiltriert, gründlich mit Diäthyläther gewaschen und getrocknet. Dieses Produkt wird in 10 ml Wasser gelöst und die erhaltene Lösung über eine mit Amberlite CG-400 (Acetatform) beschickte Säule der Abmessungen 1,2 χ 15 cm gegeben. Die Säule wird mit einzelnen Wasserportionen gewaschen bzw. eluiert. Die Eluate werden vereinigt und lyophilisiert. Man erhält ein rohes, von Schutzgruppen befreites Octadekapeptid.

Dieses rohe Peptid wird an einer mit Sephadex G-25 (Medium) beschickten Säule der Abmessungen 2,1 χ 75 cm der Verteilungschroraatographie unterworfen, wobei ein Gemisch aus 1-Butanol, Essigsäure, Pyridin und Wasser im Verhältnis von 12 : 3 : 4 : als Lösungsmittel verwendet wird. Es werden jeweils Fraktionen mit einem Volumen von 5 ml aufgefangen und nach dem Folin-Ciocalteu-Verfahren auf ihren Peptidgehalt untersucht. Die Fraktionen 18 bis 24 und 25 bis 40 werden jeweils getrennt voneinander vereinigt, bei einer Badtemperatur von 45 bis 5O⁰C unter vermindertem Druck eingedampft und lyophilisiert. Man erhält 115 mg Produkt F-1 bzw. 122 mg Produkt F-2. F-2 wird an einer mit Sephadex G-25 beschickten Säule der Abmessungen 2,8 χ 83 cm unter Verwendung des vorgenannten Lösungsmittels rechromatographiert. Die Fraktionen 71 bis 95 (4 ml/Fraktion) werden vereinigt und unter vermindertem Druck eingedampft. Nach Lyophili-L _J

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sation des Rückstands erhält man 80 mg des partiell gereinigten Octadokapeptids.

Dieses Peptid wird anschließend chromatographisch an einer mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM-52) beschickten Säule der Abmessungen 2,1 χ 21 cm weiter gereinigt, wobei 2000 ml eines Ammoniumacetatpuffers vom pH-Wert 6,5 mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,6 m verwendet werden. Es werden jeweils Fraktionen mit einem Volumen von 10 ml aufgefangen. Die einem Hauptmaximum entsprechenden Fraktionen 143 bis 157 werden vereinigt, bei einer Badtemperatur von 50 bis 55⁰C unter vermindertem Druck eingedampft, lyophilisiert und über Natriumhydroxidplätzchen und Phosphorpentoxid bei 60°C getrocknet. Man erhält das gewünschte reine Octadekapeptid-pyrrolidid in einer Ausbeute von 58 mg; /Ö7q⁴'⁵ = -63,5 + 2,0°, (c = 0,5, 0,1 η Essigsäure). Dieses Produkt verhält sich bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose unter Verwendung eines Gemisches aus 1-Butanol, Essigsäure, Pyridin und Wasser im Volumenverhältnis von 15: 3 : 10 : 15 als Laufmittel und Ninhydrin- und Ehrlich-Reagens einheitlich.

Aminosäureverhältnis nach saurer Hydrolyse: Lys 5,45 (5), His 1,07 (1), Arg 1,15 (D, NH₃ 0,68 (θ), Ser 0,73 (1), GIu 1,00 (1), Pro 1,29 (1), GIy 2,05 (2), VaI 1,0 (1), Met 0,99 (1), Tyr 1,04 (1), Phe 1,05 (1). Die Zahlen in Klammern gegen die theoretischen Werte an.

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Beispiel 3

Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-NH₂ (/Äib^Lys¹⁷'¹⁸/-ACTH(1-19)-NH₂) 12. Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-OMe (XII)

Eine eiskalte Lösung von 0,89 g (3 inMol) von Ν^έ -tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin-methylester-hydrochlorid (H-Lys(Boc)-OMe. HCl) und 0,46 ml (3,3 mMol) Triäthylamin in 8 ml Dimethylformamid wird mit 1,43 g (3 mMol) N^a~Benzyloxycarbonyl-N^£-tert.-butyloxycarbonyl-L-Lysin-N-hydroxysuccinimidester (Z-Lys(Boc)-OSu ; vgl. Bull. Chem. Soc. Japan, Bd. 39 (1966), S. 882) versetzt. Das erhaltene Gemisch wird über Nacht bei 4 C stehengelassen und anschließend bei einer Badtemperatur von 40°C unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst. Die Lösung wird nacheinander mit eiskalter 1 η Salzsäure, Wasser und 1 m Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Petroläther gefällt. Nach dem Umfallen aus dem gleichen Lösungsmittel erhält man 1,80 g reines Produkt (96,5 % d. Th.); /o/^²'⁵ = - 11,7 + 0,5° (c = 1,0, Methanol). Das Produkt verhält sich bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform, Methanol und Essigsäure im Volumenverhältnis von 90 : 10 : 3 und Ninhydrin als Nachweisreagens (nach Vorbehandlung mit Bromwasserstoffsäure) einheitlich.

- ^C31^H55^N4°9 ^C HN

ber.: 59,79 8,09 9,00
_L gef.: " 59,55 7,96 8,97 _J

609887/1097

Γ Π

13. Z-LyS-(BOc)-LyS(BoC-)-NUNH₂ (XIIl) ■

1,50 g (2,4 mMol) der Verbindung XII werden in 10 ml Äthanol gelöst und mit 1,16 ml (24 mMol) Hydrazinhydrat versetzt. Das erhaltene Gemisch wird 24 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen und anschließend unter vermindertem Druck eingedampft. Der entstandene feste Rückstand wird in mit Wasser gesättigtem Essigsäureäthylester gelöst. Die Lösung wird zweimal mit Wasser gewaschen und anschließend rasch über Magnesiumsulfat getrocknet. Der nach dem Stehenlassen bei Raumtemperatur ausgefallene kristalline Niederschlag wird abfiltriert, mit Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Nach Umkristallisation aus einer Mischung von Essigsäureäthylester und Diäthyläther erhält man 1,41 g (94 % d. Th.)des Hydrazids XIII in reiner Form vom F. 121 bis 123⁰C; /üj^'³ = -8,5 + 0,5° (c = 1,0, Dimethylformamid),-18,2 £ 0,6° (c = 1,0, Methanol). ^C30^H50^N6°8 ^{C H N}

ber.: 57,86 8,09 13,50 gef.: 57,61 8,05 13,36

14. H-PrO-NH₂ (XIV)

1,24 g Benzyloxycarbonyl-L-prolinamid (Z-Pro-NH₂) werden in 5 ml Essigsäure gelöst und mit 6 ml Essigsäure, die 1 m an Chlorwasserstoff ist, versetzt. Die erhaltene Lösung wird 3,5 Stunden in Gegenwart von Palladium katalytisch hydriert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels erhält man einen sirupösen Rückstand, der aus Diäthyläther kristallisiert wird. Nach Umkristallisa-L J

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^Γ -29- ^Π

tion aus einer Mischung von Methanol und Diäthyläther erhält man 0,68 g (91 % d. Th.) Produkt; fa/^² = - 68,2 + 1,1° (c = 1,0, Methanol).
C₅H₁₀N₂O₄HCl C H N Cl ber.: 39,87 7,36 18,60 23,54 gef·: 39,93 7,44 18,67 23,54

15. Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-PrO-NH₂ (XV)

Eine Lösung von 1,25 g (2 mMol) der Verbindung XIII in 8 ml Dimethylformamid wird in einem Trockeneis/Aceton-Bad auf -40 bis -50⁰C gekühlt und mit 1,37 ml Dioxan, das 3,66 m an Chlorwasserstoff ist, versetzt. Anschließend werden tropfenweise 0,29 ml (2,2 mMol) Isoamylnitrit zugegeben, und das Gemisch wird 10 Minuten bei -10 bis -20⁰C gerührt. Nach erneutem Abkühlen des Gemisches auf -40 bis -50⁰C wird eine eiskalte Lösung von 0,30 g (2 mMol) der Verbindung XIV und 1,1 ml (7,7 mMol) Triäthylamin in 10 ml Dimethylformamid eingebracht. Sodann läßt man die Temperatur auf O⁰C ansteigen und rührt das Gemisch weitere 3 Stunden bei dieser Temperatur. Nach dem Einstellen des pH-Werts mit 0,27 ml (2 mMol) zusätzlichem Triäthylamin auf etwa 8 wird das Reaktionsgemisch 2 Tage bei 4 C stehengelassen. Sodann wird das

Lösungsmittel durch Abdampfen unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 4O⁰C entfernt. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst und die Lösung mit eiskalter 1 m SaIzsäure und 1 m Natriumbicarbonatlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck eingedampft. Nach wiederholter Umfällung des vorstehend erhaltenen Rück-L -J

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stands erhält man 1,29 g (91 % d. Th.) des Tripeptide XV vom F. 85 bis 9O⁰C; /Ö/q² = -40,5 + 0,4° (c = 2,0, Methanol).

^C35^H56^N6°9 CHN

ber.: 59,64 8,01 11,92

gef.: 59,75 8,08 11,66

16. Z-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Pro-NH₂ (XVl)

1,06 g (1,5 mMol) der Verbindung XV werden 3 Stunden in Methanol in Gegenwart von Palladium hydriert. Der nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck erhaltene Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst. Die erhaltene Lösung wird in einem Eisbad gekühlt und mit 0,72 g (1,5 mMol) ^-Benzyloxycarbonyl-N^ -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-N-hydroxysuccinimid versetzt. Dieses Gemisch wird sodann über Nacht bei 4⁰C gerührt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, mit eiskaltem Essigsäureäthylester gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 1,31 g Produkt. Eine zusätzliche Menge von 0,08 g erhält man nach Eindampfen des Filtrats. Die vereinigten Niederschläge werden in Methanol gelöst. Sodann wird ein Großteil des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der erhaltene sirupöse Rückstand wird aus einer Mischung von 20 nl Essigsäureäthylester und 20 ml Diäthyläther gefällt. Man erhält 1,35 g (96 % d. Th.) Produkt.

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17. Z-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys (Boc)-PrO-NH₂ (XVII)

0,37 g (0,4 mMol) der Verbindung XVI werden 3 1/2 Stunden in Methanol in Gegenwart von Palladium hydriert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck erhält man einen schaumigen Rückstand, der über Natriumhydroxidplätzchen und Phosphorpentoxid getrocknet wird.

Eine Lösung von 0,35 g (0,4 mMol) l^-Benzyloxycarbonyl-N^ tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N'S tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin-hydrazid (Z-Lys(Boc)-Pro-Val-Gly-Lys(Boc)-NHNHp) in 3 ml Dimethylformamid wird in einem Trockeneis/Aceton-Bad auf -40 bis -50⁰C gekühlt und sodann mit 0,27 ml (1 mMol) einer 3,66 m Chlorwasserstofflösung in Dioxan versetzt. Diese Lösung wird hierauf tropfenweise mit 0,057 ml

(0,44 mMol)
Isoamylnitrit/versetzt und anschließend 10 Minuten bei -10 bis -20⁰C gerührt. Sodann wird das Gemisch wiederum auf -40 bis -50°C gekühlt und mit einer eiskalten Lösung des vorstehend erhaltenen N^ -tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^ -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-N^ -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-prolinamid (H-LyS(BOc)-LyS(BoC)-LyS(BOc)-PrO-NH₂) und 0,16 ml (1,5 mMol) Triäthylamin in 2 ml Dimethylformamid versetzt. Man läßt die Temperatur auf 4°C steigen und rührt das Reaktionsgemisch 2 1/2 Tage bei dieser Temperatur. Anschließend wird das Lösungsmittel bei einer Badtemperatur von 45⁰C unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wird in mit Wasser gesättigtem Essigsäureäthylester und 1 m Natriumbicarbonatlösung gelöst, über Magnesiumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck j

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eingedampft. Der erhaltene Rückstand wird liieraüf in heißem Essigsäureäthyiester gelöst. Durch Zusatz von Diäthyläther und Petroläther wird das Produkt ausgefällt. Nach Umfällung aus einer Mischung von heißem Essigsäureäthyiester und Diisopropyläther erhält man 0,59 g (90 % d. Th.) des Nonapeptids XVII in reiner Form; /öj^ = -57,3 + 2,3° (c = 0,4, Methanol). Das Produkt verhält sich bei der Dünnschichtchromatographie an Kieselgel unter Verwendung eines Gemisches aus Chloroform und Methanol im Volumenverhältnis von' 8 : 2 und Ninhydrin-Reagens nach Vorbehandlung mit Salzsäure einheitlich.

^C80^H135^N15°21 ^{C H N}

ber.: 58,48 8,28 12,79 gef.: 58,30 8,62 12,74

18. H-Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Pro-NH₂ (/Äib¹,Lys¹⁷'¹?7-ACTH(1-19)-NH₂ (XVIII)

120 mg (0,073 mMol) der Verbindung XVII werden in Methanol gelöst. Diese Lösung wird 3 l/2 Stunden in Gegenwart von Palla-. dium hydriert. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck erhält man einen schaumigen Rückstand, der unter vermindertem Druck zum ^-freien Nonapeptid-Derivat getrocknet wird. Dieses Produkt wird mit einer Lösung von 120 mg (0,073 mMol) Z-Aib-Tyr-Ser-Met-Glu (OBzl)-His-Phe-Arg(NO₂)-Trp-Gly-OH (/fo^²'⁵ = -20,5 + 0,7° (c = 1,0, 50prozentige Essigsäure); hergestellt aus Z-Aib-Tyr-Ser-Met-NHNH₂ und H-GIu(OBzI)-His-Phe-Arg(NO₂)-Trp-Gly-0h nach

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dem Azidverfahren) und 16,8 ml (0,146 mMol) N-Hydroxysuccinimid in 2 ml Dimethylformamid versetzt. Anschließend werden 60,3 mg (0,292 mMol) N,N¹-Dicyclohexylcarbodiimid zusammen mit 2 ml Dimethylformamid als Lösungsmittel zugegeben. Das erhaltene Gemisch wird 2 1/2 Tage bei 4⁰C stehengelassen. Der ausgeschiedene N,N^f-Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat in 50 ml Essigsäureäthylester eingebracht. Nach Zusatz eines gleichen Volumens an Diäthyläther wird der gebildete Niederschlag abfiltriert, mit Essigsäureäthylester und Diäthyläther gewaschen und unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 218 mg Produkt.

Dieses rohe Produkt wird bei O⁰C 60 Minuten mit etwa 15 ml Fluorwasserstoff in Gegenwart von 100 mg Methionin und 0,23 ml Anisol behandelt. Anschließend dampft man bei O⁰C unter vermindertem Druck ein. Der erhaltene Rückstand wird in 10 ml eiskaltem Wasser ■ gelöst . Die Lösung wird mit Essigsäureäthylester gewaschen und sodann über eine mit Amberlite CG-400 (Acetatform) beschickte Säule der Abmessungen 1,2 χ 18 cm gegeben. Nach Elution mit Wasser werden die Eluate vereinigt, bei einer Badtemperatur von 50⁰C unter vermindertem Druck eingeengt und lyophilisiert. Man erhält 345 mg Produkt. Dieses Produkt wird anschließend an einer mit Carboxymethylcellulose (Serva; 0,63 meq/g) beschickten Säule der Abmessungen 1,7 x 30 cm chromatographiert, wobei 2000 ml eines Ammoniumacetatpuffers vom pH-Wert 6 mit einem linearen Konzentiationsgradienten von 0 bis 0,6 m verwendet wer-

(bei 280 nm)
den. Die Extinktion/der einzelnen Fraktionen mit einem Volumen von jeweils 10 ml wird gemessen. Die einem Hauptmaximum entspre-

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chenden Fraktionen 98 bis 135 werden vereinigt, unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 5O⁰C eingedampft und lyophilisiert. Man erhält 111 mg des partiell gereinigten Nonadekapeptids.

Zur weiteren Reinigung wird das vorstehend erhaltene Produkt an einer mit Sephadex G-25 (Medium) beschickten Säule der Abmessungen 1,7 x 37 cm chromatographiert, wobei als Lösungsmittelsystem ein Gemisch aus 1-Butanol, Essigsäure, Pyridin und Wasser im Volumenverhältnis von 12 ι 3 ί 4 ; 6 verwendet wird. Fraktionen von jeweils 3,6 ml werden abgenommen und dünnschichtchromatographisch an Celluloseplatten (Merck) unter Verwendung eines Gemisches aus 1-Butanol, Essigsäure, Pyridin und Wasser mit einem Volumenverhältnis von 15 : 3 : 10 : 15 als Laufmittel untersucht. Zum Nachweis des Produkts dient Dimethylarainobenz» aldehyd (Ehrlich-Reagens). Die Fraktionen 23 bis 40 werden vereinigt, bei einer Badtemperatur von 50⁰C unter vermindertem Druck eingedampft und lyophilisiert. Man erhält 71 mg Produkt. Dieses Produkt wird hierauf an einer mit Carboxymethylcellulose (Whatman CM-52) beschickten Säule der Abmessungen 1,7 χ 18 cm chromatographiert, wobei 1500 ml eines Ammoniumacetatpuffers vom pH-Wert 6 mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0 bis 0,6 m verwendet werden. Die Fraktionen 141 bis 170 (7,2 ml/Fraktion),die dem Maximum entsprechen, werden vereinigt, unter vermindertem Druck eingedampft und bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert. Man erhält 68 mg Produkt; /ä/f. ' = -75,9 +2,4° (c = 0,5, 0,1 m Essigsäure). Das Produkt verhält sich bei der Dünnschichtchromatographie an Cellulose unter Ver-Wendung eines Gemisches aus 1-Butanol, Essigsäure, Pyridin und j

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Wasser mit einem Volumenverhältnis von 15 : 3 :■ 10 : 15 und Ninhydrin- und Ehrlich-Reagens einheitlich.

280 n» (E %_m 23,0); _Λ °^^1 ₂₈₉ "

^); ^ ²⁸²

NaOH «

Aminosäureverhältnis nach saurer Hydrolyse: Lys 5,08 (5), His 0,98 (1), Arg 1,03 (D, Ser 0,92 (1), GIu 1,01 (1), Pro 2,07 (2), GIy 1,96 (2), Aib 0,93 (D, VaI 1,00 (1), Met 1,02 (1), Tyr 0,97 (D, Phe 1,01 (1). Das Ver hältnis von Trp/Tyr wurde spektrophotometrisch zu 1,0 bestimmt. Die in Klammern angegebenen Zahlenv/erte betreffen die theoretischen Werte.

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Claims

Patentansprüche ■

Polypeptide der allgemeinen Formel I

X₁-Tyr-Ser-Xp^-X^-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-(Lys)_n-Y (i)

in der X^ einen α-Aminoisobuttersäure-, ß-Alanin-, L-Serin-, Glycin-, D-Serin-, D-Alanin-, y-Aminobuttersäure- oder Sarcosinrest, Xp einen L-Methionin-, L-Norleucin-, L-Isoleucin- oder L-Norvalinrest, X^ einen L-Glutaminsäure- oder L-Glutaminrest, η eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 4 und Y einen an die Carbonylgruppe des C-endständigen Lysinrests gebundenen Rest der allgemeinen Formel

-N

^R2

bedeutet, wobei R^ und R₂ jeweils ein Wasserstoffatom oder gleiche oder verschiedene niedere Alkylreste mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellen oder R^ und Rp zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, gegebenenfalls zusammen mit einem weiteren Heteroatom einen stickstoffhaltigen, gegebenenfalls substituierten heterocyclischen Ring bilden, unter Ausschluß von Peptiden, bei denen X,, einen ct-Aminoisobuttersäure- oder D-Serinrest und R^ und R₂ jeweils ein Wasserstoffatom bedeutet und η den Wert 4 hat, sowie deren Salze mit Säuren und Komplexe.

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2. Verbindungen der allgemeinen Formel

Aib-Tyr-Ser-Xg-X-z-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-(Lys)_n-Y

in der X₂ einen L-Methionin, L-Norleucin, L-Isoleucin- oder L-Norvalinrest, X-, einen Glutaminsäure-oder L-Glutaminrest, η eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 4 und Y einen an die Carbonylgruppe des C-endständigen Lysinrests gebundenen Rest der allgemeinen Formel

bedeutet, in der R^ und R₂ jeweils ein Wasserstoffatom oder gleiche oder verschiedene niedere Alkylreste mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen bedeuten oder R^ und R₂ zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, gegebenenfalls zusammen mit einem weiteren Heteroatom einen stickstoffhaltigen, gegebenenfalls substituierten heterocyclischen Ring bilden, unter Ausschluß von Peptiden, bei denen X^ einen a-Aminoisobuttersäure- oder D-Serinrest und R₁ und R₂ jeweils ein Wasserstoffatom bedeutet, und η den Wert 4 hat, sowie deren Salze mit Säuren und Komplexe.
3. Verbindungen der allgemeinen Formel

Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-^Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-(Lys)_n-Y

in der η eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 4 und Y einen an die Carbonylgruppe des C-endständigen Lysinrests gebundenen L J

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Rest der allgemeinen Formel

bedeutet, wobei R^ und Rp jeweils ein Wasserstoffatom oder gleiche oder verschiedene niedere Alkylreste mit 1 bis 5 Kohlenstoffatomen darstellen, oder R^ und Rp zusammen mit dem Stickstoffatom, an das sie gebunden sind, gegebenenfalls zusammen mit einem weiteren Heteroatom einen stickstoffhaltigen, gegebenenfalls substituierten heterocyclischen Ring bilden, unter Ausschluß von Peptiden, bei denen R^ und Rp jeweils ein Wasserstoff atom bedeutet und η den Wert 4 hat, sowie deren Salze mit Säuren und Komplexe.
4. Verbindungen der allgemeinen Formel

Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-(Lys)_n-y

in der η eine ganze Zahl mit einem Wert von 1 bis 4 und Y, einen an die Carbonylgruppe des C-endständigen Lysinrest* gebundenen OH- oder NHp-Rest oder einen Rest der allgemeinen Formel

-N,

R»
bedeutet, wobei R^! ein Wasserstoffatom oder einen -COOH-, -CONH₂- oder -CH₂0H-Rest bedeutet,unter Ausschluß von Peptiden, bei denen η den Wert 4 hat und Y den -MLj-Rest bedeutet, sowie deren Salze mit Säuren und Komplexe.

J 609887/1097
5. Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-

CH

Lys-Lys-lys-Lys-Nv._CH , Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-

Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys~Lys-Lys-N. | und Aib-Tyr-Ser-

Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-PrO-NH₂, sowie deren Salze mit Säuren und Komplexe.
6. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise die einzelnen Aminosäuren nacheinander bzw. entsprechende, kleine Peptidbruchstücke miteinander verknüpft.
7. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide nach Anspruch 1,

geschütztes dadurch gekennzeichnet, daß man ein/Dekapeptid der allgemeinen Formel

R¹-X₁-TyT-SeT-X₂-X₃(R²)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH

1 2

in der R eine Aminoschutzgruppe, R eine Schutzgruppe für die y-Carboxylgruppe der Glutaminsäure bedeutet und X₁, X₂ und X^ die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 haben, mit einem geschützten Peptid der allgemeinen Formel

H-Lys(R⁵)-Pro-Val-Gly-/Lys(R⁴)7_n-Y

3 4

in der R und R jeweils eine Aminoschutzgruppe bedeuten und η und Y die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 1 haben, nach dem Aktivesterverfahren, Azidverfahren, Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, gemischten Anhydridverfahren oder einer Kombination der vorgenannten Verfahren kondensiert und vom erhaltenen geschützten Peptid der allgemeinen Formel

J b O 9 H B 7 / 1 O 9 7

^Γ - 40 -

R¹ -X₁-Tyr-Se-T-X₂-X₃ (R²) -His-Phe-Arg-Trp-rGly-

Phe-Arg-Trp-rGly Lys(R³)-Pro-Val-Gly-^Lys(R⁴l7_n~Y

in der die einzelnen Symbole die vorgenannte Bedeutung haben, alle Schutzgruppen durch saure Solvolyse, katalytische Hydrierung oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak entfernt und gegebenenfalls das von Schutzgruppen befreite Peptid in an sich bekannter Weise in Salze mit Säuren oder Komplexe überführt.
8. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide nach Anspruch 3»

geschütztes dadurch gekennzeichnet, daß man ein/Dekapeptid der allgemeinen Formel

R¹-Aib-Tyr-Ser-Met-Glu(R²)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-0H

1 2

in der R eine Aminoschutzgruppe und R eine Schutzgruppe für die y-Carboxylgruppe der Glutaminsäure bedeutet, mit einem geschützten Peptid der allgemeinen Formel

H-Lys(R³)-Pro-Val-Gly-ZLys(R⁴ i7_n-

■7. h

in der R und R jeweils eine Aminoschutzgruppe bedeuten und η und Y die gleiche Bedeutung wie in Anspruch 3 haben, nach dem Aktivesterverfahren, Azidverfahren, Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, gemischten Anhydridverfahren oder einer Kombination der vorgenannten Verfahren kondensiert, vom erhaltenen geschützten Peptid der allgemeinen Formel

R¹-Aib-Tyr-Ser-Met-Glu(R²)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys (R³)-Pro-Val-Gly-^Lys(R⁴ )7_n~Y

b 0 9 8 8 7/1097

in der die einzelnen Symbole die vorgenannte Bedeutung haben, alle Schutzgruppen durch saure Solvolyse, katalytische Hydrierung oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak entfernt und gegebenenfalls das erhaltene, von Schutzgruppen befreite Peptid in an sich bekannter Weise in Salze mit Säuren oder Komplexe überführt.
9. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide der allgemeinen Formel

Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-I/ps-Pro-Val-Gly-(Lys)_n-Y

in der η den Wert 4 hat und Y einen an die Carbonylgruppe des C-endständigen Lysinrests gebundenen Rest der Formeln -OH, -N(CH₃)₂ oder

-N

R^f
bedeutet, wobei R¹ ein Wasserstoffatom oder einen -COOH-, -COWHp- oder -C^OH-Rest bedeutet, sowie deren Salze mit Säuren und Komplexe, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Peptid der allgemeinen Formel

R¹-Aib-Tyr-Ser-Met-Glu(R²)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-0H

1 2

in der R eine Aminoschutzgruppe und R eine Schutzgruppe für die y-Carboxylgruppe der Glutaminsäure darstellen, mit einem geschützten Peptid der allgemeinen Formel

H-Lys (R³)-Pro-Val-Gly-/i,ys (R⁴)7_n-Y wobei R und R jeweils eine Schutzgruppe für die £.-Aminogrup-

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pe darstellen und η und Y die vorgenannte Bedeutung haben, nach dem Aktivesterverfahren, gemischten Anhydridverfahren, Azidverfahren, Dicyclohexylcarbodiimidverfahren oder einer Kombination der vorgenannten Verfahren kondensiert, vom erhaltenen, geschützten Peptid der allgemeinen Formel

R¹-Aib-Tyr-Ser-Met-Glu(R²)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-

Lys(R³)-Pro-Val-Gly-^Lys(R⁴ 17 -Y

in der die einzelnen Symbole die vorgenannte Bedeutung haben, alle Schutzgruppen durch saure Solvolyse, katalytische Hydrierung oder Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak entfernt und gegebenenfalls das erhaltene, von den Schutzgruppen befreite Peptid in an sich bekannter Weise in Salze mit Säuren oder Komplexe überführt.
10. Verfahren zur Herstellung der Polypeptide der allgemeinen Formel

Aib-Tyr-Ser-Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys-Pro-Val-Gly-Lys-Lys-Lys-Lys-Y

in der Y einen an die Carbonylgruppe des C-endständigen Lysinrests gebundenen Rest der Formeln

oder -N

)₂, -N

CONH₂

und deren Salzen mit Säuren und Komplexen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein geschütztes Dekapeptid der allgemeinen Formel

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R¹-Aib-Tyr-Ser-Met-Glu(R²)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-OH

1 2

in der R eine Aminoschutzgruppe und R eine Schutzgruppe

für die y-Cart>oxylgruppe der Glutaminsäure bedeutet, mit einem geschützten Peptid der allgemeinen Formel

H-Lys(R³)-Pro-Val~Gly-/Lys(R⁴)/₄-Y

■ζ λ bedeutet

in der R und R jeweils eine £-Aminoschutzgruppe/und Y die vorgenannte Bedeutung hat, nach dem Aktivesterverfahren kondensiert, vom erhaltenen geschützten Peptid der allgemeinen Formel

R¹-Aib-Tyr-Ser-Met-Glu(R²)-His-Phe-Arg-Trp-Gly-Lys(R³)-Pro-Val-Gly-ZLys(R⁴ )J^-Y

in der die einzelnen Symbole die vorgenannte Bedeutung haben, alle Schutzgruppen durch saure Solvolyse entfernt und gegebenenfalls das erhaltene, von Schutzgruppen befreite Peptid in an sich bekannter Weise in Salze mit Säuren oder Komplexe überführt.
11. Arzneimittel, enthaltend eine Verbindung nach Anspruch 1 und übliche Trägerstoffe und/oder Verdünnungsmittel und/oder Hilfsstoffe.

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