DE2544348C3

DE2544348C3 - L-Leucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel

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Publication number: DE2544348C3
Application number: DE2544348A
Authority: DE
Inventors: Ernst Dr. 8034 Germering Jaeger; Gerhard Dr. 8021 Taufkirchen Wendlberger; Erich Prof. Dr. 8132 Tutzing Wuensch
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1975-10-03
Filing date: 1975-10-03
Publication date: 1979-12-13
Also published as: JPS5246068A; FR2326202B2; GB1507243A; SU593659A3; CH615904A5; IT1068299B; FR2326202A2; DE2544348A1; DE2544348B2

Description

(a) die miteinander verkniipfbaren Teilsequenzen Fragment I bestehend aus Arginyl-(hydrobromid)-asparaginyl-N'-tert.-butyloxycarbonyi-lysyl-glycyl-glutamin-tert.-butylester (Aminosäuren 18 — 22), Fragment 11, bestehend aus N^x-Benzyloxycarbonyl-glutamyl-iy-tert.-butylester)-glutamyl-fy-tert.-butylesterJ-NMert.-butyloxycarbonyl-lysyl-glutaminsäurey-tert.-butylester (Aminosäuren 14— 17), Fragment III, bestehend aus N^x-Benzyloxycarbonyl-N^.N^-di-benzyioxycarbonylarginyl-leucin (Aminosäuren 12-13), Fragmer.¹ IV,bestehend aus N^x-Bcnzyloxyearbonyl-glutamyl-^-tert.-butylcster)-leucyl-giutamin (Aminosäuren 9-11), Fragment V, bestehend aus O-tert.-Bniylthreonyl-O-tcrt.-butyl-tyrosyr-glycin (Aminosäuren 6-8) und
Fragment Vl, bestehend aus NMcrt.-Hutyl-

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung und weitere Ausgestaltung des Hauplpatents, aus dem I.-Norleucin-J-Motilin bekannt ist, welches sich von dem natürlich vorkommenden Motilin dadurch unterscheidet, daß es als IJ. von insgesamt 22 die Polypcptidketie aufbauenden Aminosäuren statt eines L-Methioninrestes der Formel

NH CH CO

I cn,

(II,

i
S

cn,

einen I.-Norleucinrest der Formel
NH (H CO

CII.
CII,
(II,

CII₁
enthält. Diis ssnthelische Moiilinderival hat

oxycarbonyl-phenylalanyl-valyl-prolylisoleucyl-phenylalanin (Aminosäuren I — 5)
aufbaut, in denen alle Seitenkettenfunktionen der polyfunktionellen Aminosäuren acidolytisch leicht abspaltbare Schutzgruppen auf tert.-Butylkohol-Basis tragen und die komplexe Funktion des Arginins teils durch N^lVl"-Diacylierung und teils durch eine durch Sülzbildung mit Bromwasserstoff bewirkte Protonierung maskiert ist,

(b) die Fragmente I bis VI mit Hilfe des literaturbekannten Dicyclohexylcarbodiimid-N-I lydroxysuccinimid-Verfahrens oder einer literaturbekannten Modifikation desselben miteinander verknüpft,

(c) aus dem erhaltenen, allseits maskierten, die Gesamtsequenz der Aminosäuren 1—22 aufweisenden Palypeptid alle Schutzgruppen mit Hilfe von Trifluoressigsäure abspaltet und danach die gebildete Trifluoracetat- und Bromidionen mit Hilfe eines Anionenaustauscherhar/.es entfernt und

(d) das erhaltene rohe L-Leucin-I J-Motilin isoliert und reinigt.

3. Mittel mit Motilinwirkung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an L-Leucin-I J-Motilin nach Anspruch I als wirksame Komponente.

die gleiche biologische Aktivität wie das natürliche Motilin (vgl. |. C. Brown in Demütig et al. »Die Oberbaucheinheit — The Upper Gastro-lntestin.il Tract, a Functional Entity« Schattaucr Verlag, Stuttgart - New York, 1974. Seilen 11-13).

Fs wurde nun gefunden, daß entsprechend vorteilhafte Ergebnisse er/iclbiir sind, wenn in I !-Stellung des Molilins statt des L-Norleuciiirestcs ein Ll.eueinrest der Formel

NH CII- CO

(H,

CII CW,
CII₁

eingebaut wird. Gegenüber dem bekannten Norleucin Motilin hat das Leucin Moiilin ilen Vorteil, daß es bei gleich guter biologischer Aktivität mit geringerem Kostenaufwand hergestellt werden kann, weil I.-Leinin hilliger ist als L-Norlcui'in. und dal! es im Körper besonders leicht abgebaut wird, weil I. I.l'iicoii eine am Protemaiifbau maßgebend beteiligte, natürliche vor kommende Aminosäure ist.

Motilin isl bekanntlich ein dir motorische Aktivität sowohl in den Antrtim- .ils auch in ilen hindus-Drüsen iirealen des Magens stimulierendes Pols peptid, das aus

.3

der Duodenalschleinihiiui des Dünndarms von Schweinen isoliert wurde (vgl, z, B. »Can, J. Physiol. Pharmacol.« Bd.49,1971,Seiten399-405,»Gastroenterology« Bd. 62. 1972, Seiten 401-404 und »Can. J. Biochem.«Bd. 51,1973, Seiten 533-537), die Pepsinausschüttung ohne eine Änderung der H+ -Sekretion stimuliert, und sich sowohl chemisch als auch physiologisch von den inzwischen aufgeklärten gastrointestinalen Hormonen unterscheidet. Dem Motilin kommt daher sowohl als Therapeutikum als auch als Diagnostikum eine besondere Bedeutung zu, da mit seiner Hilfe z. B. eine gesteuerte Pepsinausschüttung, beispielsweise mit dem Ziele der Bestimmung oder Isolierung des Pepsins oder der Regulierung des Pepsinspiegels, sowie eine gezielte Antikörperbildung bewirkt werden kann.

Die ursprüngliche Strukturaufklärung des Motilins ergab die Aminosäuresequenz -Met-Glu-Glu- in 13-14-15-Stellung, die an dem dem Hauptpatent zugrundeliegenden Priorilätstag als zutreffend angesehen wurde. Inzwischen wurde über eine Korrektur dieser Aminosäuresequenz berichtet, wonach in. 14-Siellung Glutamin statt Glutaminsäure vorliegen soll, so cviß obige Teilsequenz -Met-Gln-Glu- heißen müßte (vgl. »Can. J. Biochem.« Bd. 52,1974, Seiten 7-8). Demnach wäre das aus dem Hauptpatent bekannte Motilinderivat mit l3-L-Norleucin-14-desamido-Motilin und das nunmehr beanspruchte Motilinderivat mit F3-L-Leucin-I4-desamido-Motilin zu bezeichnen. So lange jedoch nicht mit Sicherheit feststeht, daß weitere Korrekturen der Aminosäuresequenz überflüssig sind, werden die bisherigen Bezeichnungen L-Norleucin-13-Motilin und L-Leucin-13-Motilin für die in 14-SteiIung einen Glutaminsäurerest aufweisenden Motilinderivate beibehalten, noch dazu, wo sich gezeigt hat, daß die Amidgruppe in der Seitenkette der 14-Glutaminsäure ;uif die biologische Aktivität keinen Einfluß hat (vgl. z. B.

die rechte Spalte von Seite 8 der oben genannten Druckschrift »Can. J, Biochem.« Bd. 52,1974).

Gemäß Hauptpatent wurde das bei allen Naturstoffen bestehende Problem, daß die Isolierung aus beispiels-

Ί weise tierischen Organen unerhört zeit- und kostenaufwendig ist und nur in minimalen Ausbeulen gelingt, dadurch gelöst, daß eine Totalsynthesc des Motilins durchgeführt wurde unter Ersatz des in 13-Stellung befindlichen Methioninrestes durch einen Norleucinrest,

κι aus der Überlegung heraus, daß nach dem heuligen Stand der Peptidsynthese die mittelständige Arginylmethionyl-Bindung (Aminosäuren 12 und 13 des Motilins) praktisch kaum synthetisierbar ist, andererseits jedoch das dem Motilin entsprechende Norleucin-

r, 13-Dokosapeptid auf synthetischem Wege leichter zugänglich ist, eine vergleichsweise rasche Strukturermittlung gewährleistet und wichtige, Aufschlüsse über die biologische Wirkungsspezifität des Methionins zu geben vermag.

_>(i Das in hohen Ausbeuten vollsynthetisch hergestellte L-Norleucin-13-Motilin besitzt nach der Reinigung praktisch die gleiche Aktivität wie natürlich vorkommendes Motilin, was als Indiz dafür anzusehen ist, daß der Sequenzplatz des Methionins auch von Ncileucin

Ji eingenommen werden kann. Dieser Befund war insofern überraschend, als der Ersatz von Methionin durch Norleucin in natürlich vorkommendem Human-Gastrin I zu einem Syntheseprodukt führt, das nur etwa 10% Gasirin-Akiivität besitzt.

κι Gemäß vorliegender Erfindung wird eine weitere Verbesserung dadurch erzielt, daß ein gleich vorteilhaftes Motilinderivat wie nach dem Hauptpaterit zur Verfügung gestellt wird, das jedoch billiger herstellbar und biologisch leichter abbaubar ist.

Ci Gegenstand der Erfindung ist L-Leucin-13-Motilin der Kurzformel

H-l'he-Val-I'm-llc-Phc-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Ciln-Arii-Lcii-Glu-Glu-Lys-Glu-Arg-Asii-Lys-iily-Ciln-Oli (I) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (K)) (11) (12) (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22)

worin die in Klammern angegebenen Zahlen die von 1 bis 22 durchnumerierte Stellung der Aminosäurereste (außer Glycin alle Aminosäuren ir. L-Konfiguration) in der Peptidkcitc angeben und worin die Bezeichnung der Aminosäiircrestc in üblicher bekannter Weise abgekürzt ist.

Gegenstand der Erfindung sind ferner ein Verfahren zur Herstellung von L-Leucin-13-Motilin und ein dasselbe enthaltendes Mille!, wie sie in den Patentansprüchen näher gekennzeichnet sind.

Die Anwendung dieses Mittels erfolgt in der Regel in solchen Dc sierungen. daß pro kg Körpergewicht etwa 0.05-0.5)', entsprechend 50-500 ng Motilinderivat einfallen. Als Trägermittel dienst vorwiegend physiologische Kochsalzlösung. Die Applikation ist intravenös, intramuskulär oder subkutan. So kann /.. B. lyophylisiertes Motilinderivat je nach beabsichtigter Applikation in Mengen von l-IOOy/ml physiologische Kochsalzlösung, die ■/.. H. durch Mannit stabilisiert werden kann, gelöst werden. Zur intravenösen Verabreichung an einen etwa 80 kg schweren Menschen ergehen 2 mi Injektionslösiing. clic Hj¹ Motilinderivat enthalten, eine Dosierung von 0.1 y/kg Körpergewicht. Zur Infusion an einen Menschen des angegebenen Gewichts können 8 >■ Molilindcrivat in SO ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und 0,5 ml dieser Lösung pro Minute appliziert werden, was etwa 0.ι ;■ Motilindcrivat/kg Körpergewicht/Ski, entspricht. Im Tierversuch erwiesen sich vergleichbare Dosierungen als geeigne: und so wurde z. B. natürlich vorkommendes Motilin in Mengen von 0,05 y/kg Körpergewicht intravenös an Hunde verabreicht, wodurch ein kräftiger motorischer Aktivitätsanstieg bewirkt wurde (vgl. /.. B. du· angegebene Druckschrift »Can. J. Biochem.« 51 [197 3], 53 3. linke Spalte, Absatz 1).

Zur Herstellung des Leucin-1 3-Motilins konnte der für das Norleucin-I3-Motilin entworfene Synthescplan herangezogen werden. Die Synthese der Fragmente I, II, IV. V und Vl erfoigte daher nach dem im Hauptpatent beschriebenen Verfahren, ebenso wie die Kondensation der Fragmente I und 11 zur Teilscquenz (14 — 22b) sowie dor Fragmente V und Vl zurTeilsequen/(l -8).

Das Fragment III (Aminosäuren 12- IJ) mit C'-ondstandigem Leucin wurde synthetisiert line/ mit der kondensierten Peptidfraklion I - Il (14-22b) umgesetzt zur kondensierten Peptidfraklion I-Il-III (12-22a), woraus nach trdrogenolytischcr Abspaltung der Benzyloxycarbonyl-Schulzgruppe das entsprechende Undccapcptid (12 — 22b) in Form des llydrobromids isoliert wurde. Die weitere Umsetzung mi' Fragment IV (9-11) lieferte die kondensierte Peptidfraktion I -Il -III -IV (9-22a), welche durch katalylische Hydrogenolyse in Gegenwart von Bromwasserstoffsiiii rc zum Hydrobromid des Tetradeeapeplids (^l)-22b) entacyliert und schließlich kondensiert wurde mit der kondensierten Pentidfraktion V-Vl (I H) /um voll-

kommen geschützten Verfahrensproduki I-Il IM -IV-V-VI (I-22a). aus dem schließlich nach Entfernung der .Schutzgruppen mittels Trifluoressigsäu re und nachfolgender loncnausiauscherbchandliing und Lyophilisation das gewünschte Leucin·13-Motilin (I -22b) als Rohprodukt erhalten wurde.

Die Lrfindiing wird durch die Zeichnung naher erläutert, in der darstellen:

(ig.! das Syntheseschema zur Herstellung des fragments III sowie zur Verknüpfung der Fragmente I+ 11+ 111.und

(■"ig.2 das Syntheseschema zur Herstellung des ragments IV sowie /ur Verknüpfung der F^:ragmente IV mit (I-III). Vl mit V, und (I - IV) mit (V - Vl).

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. In den Figuren und Beispielen werden die folgenden, in der Pcptidchemie üblichen Abkürzungen und Ssinbole verwendet:

Aminosäure
abkür/ungcn.

Zahlenangaben
in Klammern.

I)C ( I)

[X (I) HOSl '

DCCD/HOBt

gebildet aus 3 Buchstaben, bei denen es sich in der Regel um die 3 Anfangsbuchstaben handelt.

die die Stellung innerhalb der Polypcptidkette wiedergeben, und die keinen weiteren Zusatz erhalten, wenn die betreffende Verbindung kein weiteres Derivat bildet, die jedoch fortlaufend mit dem Zusatz a. b. c usw. \ersehen werden, wenn von a ausgehend weitere Derivate hergestellt werden.

als Angabe der Konfiguration, für den Benzyloxycarbonylrest (\gl. z. B. Bergmann et al. in »Berichte d. Dtsch. Chem. Ges.« Bd. 65. 1932. 1192 ff).

für den tert.-Butyloxycarbonvlrcst (vgl. z. B. McKa y et al. in »J. Am. Chem. Soc." Bu. 7v. i^57. .S. 46öo umi Anderson et al. in »J. Am. Chem. Soc. Bd. 79. 1957. S. 6180). für das N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid-Verfahren (vgl. z. B. S h e e h a n et al. in »|. Am. Chem. Soc.« Bd. 77. 1955. S. 1067).

für das N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxy-succinimid-Verfahren (vgl. z. B. Wünsch et al. in »Berichte d. Deutschen Chem. Ges.« Bd. 99. 1966, S. 110 und Weygand et al. in »Zeitschr. f. Naturforschg.« Bd. 216. 1966. S. 426. sowie König et al. in »Bereichte d. Dtsch. Chem. Ges.« Bd. 103.1970. S. 788) für das N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid-N-hydroxybenzotriazol-Verfahren (vgl. z. B. König et al. in »Ber. d. Dtsch. Chem. Ges.« Bd. 103. 1970. S. 788)

für die Phosphorazo-Methode (vgl. z. B. Goldschmidt in »Angew. Chem.« Bd. 62. 1950, S. 538 und G ο I d s c h m i d t et al. in »Liebigs Ann." Bd. 580. 1953. S.68)

Ausb.

d. Th.

für den N-I lydioxvsuccinimidresl

für den ρ Nilrophenylresl

für den tcrl.-Hiilylrest

für Dibenzolsulfimid als Sal/bildnei

für den Melhylrest

für Tri nitroessigsäure

für »im Vakuum«

für Ausbeute

(nach Ausbeuteangaben in ¹Vn) füi

>>der Theorie«

für llielipunkt (Schmelzpunkt) und

(nach der llieüpunktsangabe) fiii

»unter Zersetzung«.

Die Herstellung der Fragmente I. II. IV. V und Vl sowie die Kondensation der Fragmente I mit Il (l-ll-lll) mit IV. V mil Vl und (I — II —111 —IV) mn (V-Vl) ist im Ilaupipatent, aul das diesbezüglich verwiesen wird, detailliert beschrieben. Die Herstellung des Fragmentes III. dessen Kondensation mit (I — 11) urn den übrigen Fragmenten, sowie die Reindarstellung um Analyse des Verfahrensprodukts wird in den folgender Beispielen erläutert.

Beispiel 1
Herstellung des Fragments III (Teilscqucnz 12—13)

Zur Herstellung von NA.No.Noj-Tris-bcnz.yloxycarboiul-l.-arginyl-l. -leucin wurden 30 g Z-Arg(rt,o) Z_:) OSU (12) und 11.6g Leucin (13) in Dioxan/Wassei (1000:300 ml) nach Zugabe von 89 ml N-Natriumhy droxidlösung unter tSstündigcm Rühren umgesetzt Nach Zusatz von 89 ml N-Salzsäure wurde da« Reaktionsgemisch in Essigsäureäthylester aufgenommen, die erhaltene Lösung mit verdünnter Salzsäure unc Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet unc das Lösungsmittel i. V. entfernt. Der Rückstand wurde aus Wasser/Äthanol und Essigsäurcäthylester/Diäthyl äther/Petroläther umgcfällt.

AusDeutc: ^o,o giöo.o'Vn ei. Th.):

F 126- 128" C:

[\] -5.8± Γ bzw.[\] -7.Γ ([■ = 1 :in F.ssigsäure);

chromatographisch rein in n-Hcptan/tert.Butanol/Es sigsäure(5 : 1 : 1)

Analyse

Ber./gef. C 62.69/62.59; H 6.28/6.41; N 10.15/9.94

Aminosäureanalyse; Arg 1.00 Leu 1.00

Beispiel 2

Kondensation (I-Il) mit III

Eine Lösung von 1,7 g Peptid (14—22b), 1.4 j Z-Arg(n.o)-Z₂)-Leu-OH (12- 13), 0,3 g N-Hydroxysucci nimid und 0,14 ml Triethylamin in 100 ml Dimethylform amid wurde bei — 10° mit 0,412 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcar bodiimid versetzt und 24 Std. lang bei 4⁰C gerührt. Nae] weiterem 24stündigem Rühren bei Raumtemperatu wurde vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfil triert, das Lösungsmittel i. V. entfernt, und de Eindampfrückstand aus Methanol/Essigsäureäthyleste umgefällt. Das erhaltene Produkt wurde sorgfältig mi Wasser digeriert, abfiltriert und getrocknet.

Es resultierte Na,N(5,NDj-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyi-L-leucyl-L-glutamyliy-iert.-butylester)-

l.-gliitamyl()'-lcrl.-bulylcstcr)-N(-tcrt.-biityloxyciirb()nyl-l.-lysyl-l.-glulaniyl-()'-tert.-butylcslcr)-l.-arginyl(hyclrobromid)-l.-asparaginyl-Nf -tcrt.-Inityloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tcrl.-
biitylcster (12 — 22a).

Ausb. 1.94 g(85%d.Th.).

^hromatographisch rein in η Heptan/lcrt.-ßutanol/Fssigsätirc (3:2:1) und nßutanol/Fssigsäurc/Wasser

Asp 1.00 C]Iu 3,98

Am jnosiiurcanaly.se:
I .ys 2.02 Arg 2.01
(JIy 1.01 Leu 1,00

1.8 g Peptid in 500 ml Methanol wurden unter Zutropfcn von 15.70 ml 0.1 N-Bromwasscrstoffsäurc bei pH 4.5 durch katalytische Hydrierung entacyliert. Das vom Katalysator befreite f⁷iltrat wurde i. V. eingedampft und der erhaltene Riirksland wnrrlr au«. Methanol/lissigsäurcäthylestcr umgefüllt.

Ls resultierte L-Arginyl(hydrobromid)-L-Icucyl-LgIu ta my !-()■-tert.-buty lestcrJ-L-gltitamy l()'-tert.-butylester)-Nf-tert.-biityloxycarbonyl-L-lysyl-L-gliitamyl^'-tert.-butylcster^L-arginylihydrobromidj-L.-asparaginyl-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-L-lvsyl-glyeyl-L-glutamin-tert.-butylester-hydrobromid-Dihydrat(12-22b).
Ausb. 1.61 g(98%d.Th.)
Analyse

Ber./gef. C 47.12/47.20: H 7.43/7.50; N 14.07/14.00

Kondensation der Fragmente I bis IV
(Gesamtsequenz 1 -22)

Kondensation vereinigt und aus dem erhaltenen Tctradecapeptid-Derivat (9—22a) wurde nach hydrogenolytischer Abspaltung der Benzyloxycarbonyl-Schui/-gruppe

ll-Glu(OtBu)-Leu-Gln-Arg(HBr)-Lcü-Glu(OtBu) Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys( BOC)-GIy-GIn-OtBu (9-22b)

in erhalten.

Während des Ablaufs vorstehender Reaktionen wurden die Fragmente V (6—8a) und Vl (1—5a). letzteres nach Überführung in den (N-Hydroxysuccinimid)-cster(1 —5b). vereinigt. Es gelang jedoch nicht
ι ι

BOC-Phe-Val-Pro-lle-Phe-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH(l-8)

rein zu gewinnen und die Aminosäureanalyse zeigte :n eine Verunreinigung mit etwa 10% (1—5a) oder (I—5b) an. Versuche zur Auftrennung dieses Gemisches verliefen ohne Erfolg.

Das erhaltene »rohe« Teilstück (I —8) wurde mit dem

obigen Teilstück (9 —22b) wiederum nach dem angege-.'■) benen Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Verfahren zum

BOC-Phe-Val-Pro-lle-Phe-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Gln-Arg(HBr)-Hi Leu-Glu(OtBu)-GIu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-

Arg(HBr)-Asn-Lys-(BOC)-GIy-GIn-OtBu (I -22a)

Mit dem carboxylendständigen Fragment I (18 —22b) wurde mit Hilfe des angegebenen Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Verfahrensdas Fragment Il (14 —17a) durch Kondensation vereinigt und der erhaltene N-Benzyloxycarbonyl-nonapeptid-tert.butylester (14 —22a) wurde durch katalytische Hydrogenoly-

H-GIu(OtBu)-GIu(Ot Bu)-LyS(BOC)-GIu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-GIy-Gln-OtBu(14-22b) 4-,

überführt.

Die Vereinigung mit Fragment III wiederum mit Hilfe des genannten Verfahrens führte zur Bildung von

50

Z-Arg(o,a>-Z2)- LeU-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-GIy-GIn-OtBu (12-22a).

Durch katalytische Hydrierung wurden aus dem Undecapeptid (12—22a) die drei Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppen entfernt und durch Neutralisation der freigewordenen Guanido-Funktion mit Bromwasserstoffsäure während der Hydrierung resultierte

60

H-Arg(HBr)-Leu-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-GIy-GIn-OtBu (12-22b)

in Form des Hydrobromids,

Der erhaltene Undecapeptidester wurde mit Fragment IV (9—11) nach dem angegebenen Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxybenzitriazol- Verfahren durch verknüpft.

Nach Abspaltung aller Schutzgruppen mittels wasserfreier Trifluoressigsäure und anschließendem Austausch der Trifluoracetat- und Bromidionen durch lonenaustauschchromatographie an einem unter der Bezeichnung »Dowex 44« bekannten schwach basischen lonenaustauscherharz (Acetat-Form) wurde ein »Roh-Leucin-13-Motilin« (1 —22b) erhalten, das aufgrund des Einsatzes von »unreinem« Teilstück (1—8) mit einer »Fehisequenz« behaltet sein mußte, was sicn Dei der Reinigungsoperation auch bestätigte.

Beispiel 3
Reindarstellung und Aminosäureanalyse

Gemäß Hauptpatent erfolgte die Reinigung in Anlehnung an die Reindarstellung von natürlichem Motilin durch Ionenaustausch-Chromatographie mit Hilfe eines stark basischen Anionenaustauscherharzes, z. B. des in der Acetatform vorliegenden, unter der Bezeichnung »QAE-Sephadex A-25« bekannten Harzes auf der Basis eines modifizierten Dextrans mit Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylresten als funktionelle Gruppen, und danach mit Hilfe eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, z, B. des in der Ammoniumform vorliegenden, unter der Bezeichnung »SP-Sephadex C-25« bekannten Harzes auf der Basis eines modifizierten Dextrans mit Sulfopropylresten als funktionellen Gruppen.

Eine Aminosäureanalyse wurde nach saurer Hydrolyse (6 N-HCl) durchgeführt, wobei sich zeigte, daß praktisch dieselben Werte bei 20 und bei 72 Std. Hydrolysezeit erzielt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle aufgeführt

IO

Tabelle

Gefunden Berechnet

Lys	2,(K)	2
Arg	1,9.1	2
Asp	1,00	1
Thr	0,97	1
GIu	6,18	6
Pro	0,98	1
GIy	1,99	2
VaI	0,90	1
He	0,90	1
Leu	1,94	2
Tyr	0,93	I
Phe	1,82	2

Die biologische Aktivität des gefriergetrockneten l.-i.eucin-l 3 Motilins war praktisch gleich derjenigen des L-Norleucin-13-Motilins und unterschied sich somit kaum von derjenigen des natürlichen Molilins.

Hier/u 2 Bkitt /eicliiuiimcn

Claims

Patentansprüche:

I. Weitere Ausbildung des Gegenstandes von Patent 23 15 271, betreffend L-Norleucin-13-Motilin der Furmel

H-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gln-Arg-Nle-Cilu-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln-OH (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (I I) (12) (Ll) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22)

dadurch gekennzeichnet, daß die vorgenannte Verbindung in Stellung (13) an Stelle von L-Norleucyl (Nie) L-Leucyl (Leu) aufweist.
2. Verfahren zur Herstellung von L-Leucin-I 3-Motilin nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß man in an sich bekannter Weise