DE2315271C3 - L- Norleucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel - Google Patents

Description

3. Mittel mit Motilinwirkung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an L-Norleucin-13-Motilin nach Anspruch 1 als wirksame Komponente.

Die Erfindung betrifft unter anderem t-Norleucin-13-Motilin, das sich von dem natürlich vorkommenden Molitin dadurch unterscheidet, daß es als 13. von insgesamt 22 die Polypeptidkette aufbauenden Aminosäuren statt eines L-Methioninrestes der Formel

— NH — CH — CO — CH,

einen L-Norleucinrest der Formel

— NH — CH — CO —

enthält.

H. CH,

CH, CH.

Motilin ist bekanntlich ein die motorische Ak hitäl sowohl in den Antrum- als auch in den Funaus-Drüsenarealen des Magens stimulierendes Polypeptid, das aus der Duodenalschleimhaut des Dünndarms von Schweinen isoliert wurde (verwiesen sei z. B. auf »Can. J. Physiol. Pharmacol.«, Bd. 49, 1971, S. 399 bis 405, und »Gastroenterology«, Bd. 62, 1V72, S. 401 bis 404), die Pepsinausschüttung ohne eine Änderung dei H⁺-Sekretion stimuliert, und sich sowohl chemisch als auch physiologisch von den inzwischen aufgeklärten gastrointestinalen Hormonen unterscheidet.

Motilin kommt daher sowohl als Therapeutikum als auch als Diagnostikum eine besondere Bedeutung zu. Wie bei allen Naturstoffen besteht jedoch das Problem, daß die Isolierung aus beispielsweise tierischen Organen unerhört zeit- und kostenaufwendig ist und nur in minimalen Ausbeuten gelingt.

Aufgabe der Erfindung ist es, Mittel und Wege anzugeben, die die Möglichkeit bieten, eine Verbindung mti Motilinwirkung auch in großem Maßstab synthetisch erstellen und verwenden zu können.

Der Erfindung Hegt die Erkenntnis zugrunde, daC die angegebene Aufgabe dadurch lösbar ist, daß eine Totalsyiithete des Motilins durchgeführt wird untei Ersatz des in 13-Stellung befindlichen L-Methioninrestes durch einen L-Norleucinrest, aus der Überlegung heraus, daß nach dem heutigen Stand dei Peptidsynthese die mittelständige Arginyl-methionyl-

23 Ii 271

Bindung (Aminosäuren 12 ond 13 des Motflins) prakfisch kaum synbar ist, andererseits jedoch das dem Moöün entsprechende Norleocin-lS-Dokosapeptid auf synheischem Wege leichter zugänglich ist, eine vergleichsweise rasche Strukturermittlung ge währleistet and wichtige Aufschhlsse aber die biologlsche Wirkungsspezifität des Methionins zu geben vermag.

Gegenstand der Erfindung ist L-Norleucm-13-Motflin der Kurzfonnel

H-I%e-Va^-PΓO-Ite-Phe-Tlu·-Tyr^ly-Ghl-Leu-Gm^ O) (2) (3) (4) (5) (6) (7) C8) (9)

worin die in Klammern angegebenen Zahlen die von bis 22 durchnumerierten Aminosäurereste alte Aminosäuren in !--Konfiguration bezeichnen.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des i^Norleucin-13-Motilins, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man

(a) die miteinander verknüpfbaren Teilsequenzen Fragment I, bestehend aus ArgjnyHhydrobromid)-asparaginyl-Ne-tert-butyloxycarbonyl-lysyl-glycyl-glutamin-terL-butylester (Aminosäuren 18 1,J₅ 22)

Fragment II, bestehend aus Na-Benzyloxycarbo-

nyl-glutamyHy-tert-butykster)-glutamyl-(y-tert.- butylesteO-Nc-tert-butyloxycsTbonyl-Iysyl-glut- aminsäure-γ- tert. -butylester (Aminosäuren 14 bis 17)

Fragment III, bestehend aus Nat-Benzyloxycar-

bonyl-Ni.Nm-di-benzyloxycarbonyl-arginyl-nor leucin (Aminosäuren 12 und 13),

Fragment IV, bestehend aus NÄ-Benzyloxycarbo-

nyl-glutamyl-iy-tert-butylesteO-leucyl-glutamin (AmUiosäuren9 bis 11)

FragmentV, bestehend ausO-teΓt..Buty^threonyl- O-tert-butyl-tyrosyl-glycin (Aminosäuren 6 bis 8)

Fragment VI,bestehend ausNa-tert.-Butyloxycarbonyl-phenyUdanyl-valyl-prolyl-isoleucyl-phenyl-

polyfunktionellen Aminosäuren acidolytisch leicht abspaltbare Schutzgruppen auf tert. Alkohol-Basis tragen und die komplexe Funktion des Arginins teils durch ΝΛ,ω-Diacylierung und teils durch eine durch Salztildung mit Bromwasserstoff bewirkte Protonierung maskiert ist,

(b) die Fragmente I bis VI mit Hilfe des bekannten N.N'-Dfeyclohexylcarbodiimid-N.Hydroxysuccinimid-Verfahrens oder einer literaturbekannten Modifikation desselben miteinander verknüpft,

(C) aus dem erhaltenen, allseits maskierten" die Gesamtsequenz der Aminosäuren 1 bis 22 aufweisenden Polypeptid alle Schutzgruppen mit Hilfe von Trifluoressigsäure abspaltet und danach die gebildeten Trifluoroacetat· und Bromidionen

^reinig^

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Mittel mit Motilinwirkung, das gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an L-Norleucin-13-Motilin als wirksame Kornponente.

Durch die Erfindung wird erreicht, daß eine Verbindung zur Verfügung steht, die in hohen Ausbeuten vollsynthetisch herstellbar ist und nach Reinigung an Ionenaustauschern eine Aktivität von über 90% des natürlich vorkommenden Motilins aufweist, was als Indiz dafür anzusehen ist, daß der Sequenzplatz des Methionins auch von Norleucin eingenommen werden kann. Dieser Befund ist insofern überraschend, als der Ersatz von Methionin durch Norleucin in natürlich vorkommendem Human-Gastrin I zu einem Synthese-

^{führt> das nur etwa 10%} Gas^trin-^Aktivität

^ao ,^Die Erfindung wird durch die Zeichnung naher erläutert, in der darstellt

F ι g. 1 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments I,

Fig. 2 das Syntheseschema zur Herstellung des ^a5 Fragmenten,

„ ^F»* ³ ^f Syntheseschema zur Herstellung des Fragments VI,

F i g. 4 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments,III sowie zur Verknüpfung der Fragmente

^F > 8- ⁵ ^f Syntheseschema zur Herstellung des

IV mit (I bis lip, VI mit V, und (I bis I V) mit (V bis VI), F i g 6diesäulenchrornatographische Elutionskurve J»n ^m Norleucin-13-Moühn an einem stark basischen Aruonenaustauscher und . ^F ^- 7 diesäulenchromatographische Elutionskurve J* Fraktion B₁ der F, g. 6 an einem stark sauren Kationenaustauscher.

,pe folgenden Beispiele sollendie Erfindung näher ff utern. In den Figuren und Beispielen werfen die folgenden m der Peptidchemie üblichen Abkürzungen und Symbole verwendet:

. Arninosaureabkurzungen, gebUdet aus 3 Buchstaben, ^¹^^{11 e}j ?^{lch in dcr Reßel um die 3} AnfangAuchhandelt. _Qt(,„„„„ _inn„_P

Zahlenangaben in Klammern, die die SteUung inner- ^^{b der}. Polypeptidkette wiedergegeben und die ^k,^ein,f.ⁿ weiteren Zusatz erhalten, wenn die betreffende Verbindung nich t.n Form eines weiteren Der,vatsnoch male auftntt, d« jedoc*forttouf«id mit dem Zuwte^ ^h'.^c _A ^usw: versehen werden wenn von a ausgegangen w.rd und we.terc Denvate hergestellt werden,

BOC für den tert.-Butyloxycarbonylrest (verwiesen sei z. B. auf M c K a y et al in »J. Am. Chem. Soc.«, Bd. 79,1957, S. 4686 ff., und A η d e rs ο η et al in »J. Am. Chem. Soc«, Bd. 79, 1957, S. 6180 ff.),

DCCD für das Dicyclohexylcarbodiimid-Verfahren

(verwiesen sei z. B. auf S h e e h a η et al in

»J. Am. Chem. Soc.«, Bd. 77,1955, S. 1067 ff.),

DCCD/ für das Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxy-

SU	für den N-Hydroxysuccinimidrest,	Beispiel 1
NP	für den p-Nitrophenylrest,
tBu	für den tert.Butylrest,
DBSI	für Dibenzolsulfimid als Salzbildner,
Me	für den Methylrest,
TFE	für Trifluoroessigsäure,
i.V.	für »im Vakuum«,
F.	für »Fließpunkt« und
(Z)	nach der Fließpunktsangabe für »unter Zer
	setzung«.

HOSU succinimid-Verfahren (verwiesen sei z. B. auf Methanol/Diäthyläther resullbrten Kristalle von

W ü η se h et al in »Berichte d. Deutschen F. = 135 bis 136⁰C; [«]? = + 10,78° (c -- 1,0; in

Chem. Ges.«, Bd. 99, 1966, S. 110 ff., und Methanol). Ausbeute = 146 g (97% der Theorie).

W e y g a η d et al in »Zeitschr. f. Natur- „ _. ,.,,,,

forschg.« Bd. 216, 1966, S. 426 ff., sowie 5 B. Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-glutamin-

König et al in »Berichte d. Deutschen tert.-butylester

Chem. Ges.«, Bd. 103,1970, S. 788 ff.), 115 g L-Glutamin-tert.-butylester-dibenzolsulfimid-

DCCD/ für das Dicyclohexylcarbodiimid-Hydroxy- salz, suspendiert in 800 ml Dichiormethan, wurden mit

HOBt benzotriazol-Verfahren (verwiesen sei z.B. 32,3 ml Triäthylamin und danach mit 70,5 g Benzyl-

auf K ö η i g et al in »Ber. d. Dtsch. Chem. io oiycarbonyl-glycin-N-hydroxysuccinimidester unter

Ges.«, Bd. 103, 1970, S. 788 ff.), Rühren versetzt. 24 Std. Rühren bei Raumtemperatur,

PAM für die Phosphorazo-Methode (verwiesen sei Einengen i.V., Aufnehmen des Öls in Essigester,

z.B. auf Goldschmidt in »Angew. Chem.«, Waschen dieser Lösung wie üblich mit Zitronensäure-,

Bd. 62,1950, S. 538 ff., und Goldschmidt Kaliumhydrogencarbonatlösung und Wassir, Trock-

et al in »Liebigs Ann.«, Bd. 580,1953, S. 68 ff.), 15 nen über Natriumsulfat und Eindampfen i.V. führte

zu einem öl. Ausbeute = 87 g (93% der Theorie).

C. Glycyl-L-ghitamintert.-butyles'er-dibenzolsulfimidsalz

20 80 g Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester (gemäß B) in 9COmI MeinenM wurden wis unter A beschrieben hydrogenolytisch entacyliert (60 g Dibenzolsulfimid) und aufgearbeitet. Es resultierte ein öliger Rückstand, der beim Verreiben mit

25 Petrolätherkristallisierte;F.= 92⁰C(Z);[«]?= -8,5° (c = 1,0; in Methanol). Ausbeute = HOg (98% der Theorie).

Herstellung des Fragments I (Teilsequenz 18 bis 22) d. Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl

H-GIn-OtBu (22b), aus Z-GIn-OH (22a) durch Ver- 30 Νε-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin

esterung mit Essigsäure-tert.-butylester unter Schwefel- 51 g Νε-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin wurden in säure-Katalyse und nachfolgender hydrogenolytischer üblicher bekannter Weise in das Benzyltriäthylammo-Entfernung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe zu- niumsalz übergeführt und danach in 700 ml Dimethylgänglich, wurde mit Z-GIy-OSU (21) zum Benzyloxy- formamid mit 81 g BenzyloxycarbonyJ-L-asparagincarbonyl-Dipeptidester (21-22a) verknüpft; der nach 35 4-nitrophenylester unter Zugabe von 1 Aquiv. Pyridin hydrogenolytischer Entfernung der N-Schutzgruppe 48 Std. lang bei 20° C gerührt. Der Vakuumverdamperhaltene H-GIy-GIn-OtBu (21-22b) wurde mit Z-Asn- fungsrückstand wurde mit Essigester und Kalium-Lys(BOC)-OH (19-20) nach dem angegebenen, von hydrogensulfatlösung gleichzeitig behandelt; der ge-Wünsch und Weygand in der genannten bildete dicke Niederschlag wurde abfiltriert und dann Literaturstelle beschriebenen Carbodiimid-N-Hydroxy- 40 aus Äthanol/Petroläther umkristallisiert F. = 174 succinimid-Verfahren oder nach dessen von Geiger bis 175°C (Z); [«]? = + 13,8° (c = 1,0; in Pyridin). in der angegebenen Literaturstelle beschriebenen Ausbeute = 70 g (71 % der Theorie). Modifikation zum Benzyloxycarbonyltetrapeptid-tert- „_n . , . - ■ v, » _ . ^ ,

butylester (19-22a) verknüpft. Die Kopfkomponente ^E· Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-Ne-tert.-butyl-(19-20) konnte durch Aminoacylierung von H-Lys- 45 oxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert-butylester (BOC)-OH (20) mit Z-Asn-ONP (19) unter üblichen 61,5 g Glycyl-L-glutamin-tert.-butylester-dibenzol-

Bedingungen gewonnen werden. sulfimidsalz und 54,5 g Benzyloxycarbonyl-L-aspara-

Entfernung der Benzyloxy-carbonyl-Schutzgruppe ginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin in 700 ml Diaus Z-Asn-Lys(BOC)-GIy-GIn-OtBu (19-22a) mittels methylformaroid wurden unter Rühren bei 0°C zukatalytisch erregtem Wasserstoff führte zum Tetra- 50 nächst mit 15,5 ml Triäthylamin und nach 15 Min. mit peptid-Ester-Derivat (19-22 b), das mit Z-Arg(r5,cü-Z₂)- 13 g N-Hydroxysuccinimid sowie 23 g N,N'-Dicyclo-ONP (18) zum Z-A^(O₅O)-Zj)-ASn-LyS(BOC)-GIy-GIn- hexylcarbodiimid versetzt. Nach 3 Std. wurde weitere OtBu (18-22a) vereinigt wurde. 24 Std. bei Raumtemperatur nachgerührt. Das Filtrat

Die experimentelle Durchführung war wie folgt: vom Ν,Ν'-Dicyclohexylharnstoff wurde i.V. einge-

^, . 55 dampft; der Rückstand kristallisieit beim Behandeln

ν ^'^L*?'™ -a 1 mi* Essigester. Umfaistaffisieit vrwäe aus Meffianol/

terL-butylester^ibenzoisulfirnKbak Wasser und Isopropanol/Bssigester. P. = 155 bis

103 g B inzyloxycaftönyl-glutaajin-teit.-butylester, 156°C; Ia]W = —20,8° {c = 1,0; in ÄÖanol). Auserhalen nachdem von Schnabel et al in »Liebigs beute = 63 g (78% der Theorie).

Ann.«, Bd. 68$, 1965, S. 229«^ beschriebenen Ver- 60 _Am!ira^„_{rf M tert ω}_ ,_ . , _lxma

ί toe 1 io 21 Methaeoi wnrdea nnter Zetropfen von ^F· L-Aφaragmyi-Nε-teΓL-lϊII^ylox3r«^onyi-I--IysyI-91 % iDibenZölsuffiffiM to 500 ml Methanol bei pH = 3,5 ^y^^^uianuB-teit.^i^ester-liydiocfllorKi

in üblicher bekannte? Weise katalytisch (Palladium- 47,5 g Benz^oxycarbonyl-L-aspar^flyl-Nc-tert.-

schw jrz) hydriert. butyloxycaibonyl-i.^ysvl^ycyl-i.ighitasm-tert.-iiutyl-

Das Filtrat wurde i. V. eingedampft, zum Schlau 65 ester (gemäß E) in 800 ml Methanol wurden unter unter azeotroper Destillation mit Benzol; ans der pH-Stat-Bedingungen wie üblich iiydriert (pH = 5^5; Essigesteriöstmg des öligen Röckstandes trat beim 25,2 mi 2^ Q-Chiorwasserstofflcisuag M Methanol). "Versetzen mit Diäthyläther Kristallisation ein. Aas Des i. V. eingedampfte FStrat ergdj em Öl; farbloses

ZD 10 έ / 1

7 8

Pulver nach Verreiben mit Diäthyläther. F. = 98^CC; komponente wurde schließlich das Fragment H, näm-

[«]» = + 9,5° (c = l.Oin Methanol). Ausbeute = 40 g lieh Z-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-OH

(97 % der Theorie). (14-17a) erhalten.

^ „,.„.—., . . ι -ι Die experimentelle Durchführung erfolgte in ana-

G. Ν«,Νί,Νω - Tns - benzyloxycarbonyl - L - argmy - ₅ , _{Weise> wie m BeJ id l besch}Z_eben, L-asparagmyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl- Ausbeute: 48% über alle Stufen, bezogen auf L-glutamin-tert.-butylester H-GIu(OtBu)-OMe (17); F. = 147 bis 149⁰C;

31,9 g L-Asparaginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl- [<x]f = -9,8 ± 1° bzw. [<x]g, = -12,3° (c = 1 in

L-Iysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester-hydrochlorid Dimethylformamid); chromatographisch rein in Cyclo-

(gemäß F) und 33,68 g Να,Νί,Νω-Tris-benzyloxy- io hexan/Chloroform/Eisessig 45: 45:10.

carbonyl-L-arginin-N-hydroxysuccinimidester in 11 Di- Analyse·

methylformamid wurden bei 0⁰C mit 7 ml Triäthyl- Berechnet ... C 59,02, H 7,86, N 7,48;

amin versetzt; nach 24stündigem Rühren bei Raum- gefunden C 58 70 H 8 04 N 7 72

temperatur, Eindampfen i.V., Umfallen des Rück- ^e ' ' '

Standes aus Methanol/Wasser und danach Umkristalli- 15 B e i s ρ i e 1 3

sieren aus Methanol resultierte ein farbloses Pulver; _u .. „ .. ,, ,.,.

[*]f = -7,6° (c = 1,0; in Eisessig). Ausbeute = 46,5 g Herstellung des Fragments III (Teilsequenz 12 und 13)

(80% der Theorie). Die Herstellung des Fragments III, nämlich Z-Arg-

„ . . „. . . .. · 1 χι . . («S.o-Z^-Nle-OH (12-13), konnte in 86 %iger Ausbeute

H. L-ArgjnyKhydrobroinid-L-asparagmyl-Ne-tert- _{ao durch Aminoacylierun}^ _{von Nor}leucin (13) mittels

butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutomm-tert.-butyl- _Ζ-Ατ_Β(δ,ω.Ζ^·ΟΙ U (12) bewerkstelligt werden.

ester-hydrobromid-dihydrat _{Die experimenteUe} Durchführung erfolgte in analo-

45,5 g Na.No.Nej-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl- ger Weise wie in Beispiel 1 beschrieben.

L-asparaginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl- F. = 130 bis 132°C; [«]? = +7,2 ± 1° bzw. L-glutamin-tert.-butylester (gemäß G) in 1,51 Dime- 25 [<x]f„= +8,4° (c = 1 in Eisessig); chromatographisch

thylformamid/Methanol (2:1) wurden unter pH-Stat- rein in n-Heptan/tert.-Butanol/Eisessig 5:1:1 und

Bedingungen in üblicher bekannter Weise hydrogeno- n-ButanoI/Eisessig/Wasser 3:1:1. Iytisch entacyliert (pH = 4,5; 80 ml 1 n-Bromwasser- Analyse-

stoffsäure) Eindampfen des Filtrate i. V und Umfallen Berechnet ... C 62,69, H 6,28, N 10,15;

des Ruckstandes aus AthanoVDiathylather führte zu 30 _{funden c} ^_{45 H 6 2g N 10 16} einem amorphen Pulver: [α]? = —4,8 (c = 1,0; in

80%iger Essigsäure). Ausbeute = 37 g (98 % der B e i s ρ i e 1 4

Ausbeute 55% über alle Stufen, bezogen auf Herstellung des Fragments IV (Teilsequenz 9 bis 11) H-GIn-OtBu (22b) als Startmaterial; [a]? = —7,6 35 Das nach dem in »Berichte d. Dtsch. Chem. Ges.«,

±1° bzw. [*]£6=-9,4° (c = l in Essigsäure); Bd. 104, 1971, S. 2430 ff., beschriebenen Verfahren

chromatographisch rein in n-ButanoI/Eisessig/Wasser synthetisierte Dipeptid H-Leu-Gln-OH wurde als

3:1:1 und n-Heptan/tert.-Butanol/Eisessig 5:1:1. Sequenzteilstück (10-11) verwendet. Aufknüpfung von

_Anal . Z-GIu(OtBu)-OSU (9) auf das Dipeptid (10-11) führte Berechnet C 57 98 H 6 69 N 13 29 O 22 02· ⁴° ^{in 74}%ⁱ8^er Ausbeute zum Fragment IV, nämlich

gefunden ... C 57,70, H 6,56, N 13,29, O 22,45. Z-G u(OtBu)-Leu-Gln-OH (9-11).

⁶ Die experimentelle Durchfuhrung erfolgte in analo-

Durch katalytische Entfernung der drei Benzyloxy- ger Weise wie in Beispiel 1 beschrieben.

carbonyl-Maskierungen durch katalytische Hydro- F. = 146 bis 148°C; [*]? = -31,6 ± 1° bzw.

genolyse unter Zusatz von zwei Äquivalenten Brom- 45 HS₆ = —38,1° (c = 1 in Methanol); chromato-

wasserstoff wurde die gewünschte Fraktion I, nämlich graphisch rein inn-Heptan/tert.-Butanol/Eisessig5:1:1

H - Arg(HBr) - Asn - Lys(BOC) - GIy - GIn - OtBu.HBr und n-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1.

(18-22b), erhalten. Analyse-

Ausbeute: 98%; [«]? = -4,8 ± 1° bzw. _ Berechnet ... C 58,12, H 7,32, N 9,68;

M& = -6,05 (c = 1 in 80%iger Essigsaure); 50 _gefunden ... _C 58,05, H 7,24, N 9,48. chromatographisch rein in n-Butanol/Eisessig/Was-

ser 3:1:1 und tert.-Amylalkohol/Pyridin/Wasser Beispiel 5

35: 35: 30. Herstellung des Fragments V (Teilsequenz 6 bis 8)

ifi7?- S5 Das nach dem in »Zeitedir. f. PhysM, Oie».«,

... C 40,46, H 6^3, N 15,89, Br 16,51. _{syHtiietisiErte} uipep^ H-Ty^i^Gfy^ti

Bök (78) d Vk

Beisniel 2 SequenzteBstöck (7-8) verwendet. VerkaS^pfang von

^v _ ,...,_ H-Tyi<t»iH^-OH (7-β) ttat Z-Tbr(tBn)OSU (6)

HersteBnng des Fragments II (Teflseqaeaz 14 bis 17) _6o ^^ _das BeaMöX5carb©n^-e%eptid (&«a|, das

Z-Lys(BOCVOSU (16) nnd H-GIa(OtBu)-OMe (17) durch katalytische EatbenzytexycarfeonyheroBii das Seßen sich säS got zum Benzyloxy- ä^RÄVSBdltT^^Kre^l

^^^ 7) s lklih

g yy

doj^^pepes a«-17a) veraasen; alkalische GIy-OH (6-*b| &&&.

Ew und aitschüeSende fca*aJytische Ent- Dk experimentelle fhfülaag erfolgte in amacyBeraag fShrte aber das Dtpeptid-Derivat (16-17b) 65 loger Weise me in Beispiel I besetefebem.

m H4.ys(BOC)-GIu(OlBuK>H 0€-l?c). In zwei- Ausbeute: etwa 81 % über beide Stafen, feezogen

öialigeffl «u Anbauverrahren am Hufe von auf eingesetztes Dipeptid (7-8); F. = 126 bis 127"C:

Z-GIu(OtBuKSU (15 bzw. 14) als jeweilige Kopf- IaJT= f7,f ± r bzw. ϊλ|» ( 8,9' {r = I m

Methanol); chromatographisch rein in tert.-Amyl- matographisch rein in n-Butanol/Eisessig/Wasser alkohol/Pyridin/Wasser 35: 35 : 30. 3:1:1 und n-Heptan/tert.-Butanol/Eisessig 3:2:1

Analyse: Analyse: Berechnet ... C 60,88, H 8,30, N 8,88; Berechnet ... C 55,48, H 7,29, N 12,82,

gefunden ... C 60,69, H 8,31, N 8,91, ⁵ 020,92, Br 3,48;

ßbezogen auf ein Dipeptid mit Vi Mol Kristall-Essig- gefunden ... C 45,24, H 7,27, N 12,62,

ester. 0 20,97, Br 3,20.

Beispiel 6 Einwirkung von katalytisch erregtem Wasserstoff

ίο auf das Undecapeptid-Derivat (12-22a) führte zur EntHerstellung des Fragments VI (Teilsequenz 1 bis 5) fernung der drei Benzyloxycarbonyl-Schutzgrur pen;

nach Neutralisation der frei gewordenen Guanido-

Nach dem angegebenen Carbodiimid-Verfahren Funktion mit Bromwasserstoffsäure (während der wurde Z-IIe-OH (4) mit H-Phe-OtBu (5) verknüpft. Hydrierung vorgenommen) wurde H-Arg(HBr)-Nle-Durch anschließende katalytische Entacylierung des 15 GIu(OtBu) - GIu(OtBu) - Lys(BOC) - GIu(OtBu) - Argintermediären Benzyloxycarbonyl-Dipeptid-Esters (HBr)-Asn-Lys(BOC)-Gly-Gln-OtBu(12-22b) in Form (4-5 a) konnte H-Ile-Phe-OtBu (4-5 b) in über 90%iger des Hydrobromids gewonnen. Ausbeute isoliert werden. Auf kondensation des Fragments IV (9-11) ai f den

Gleichzeitig wurde BOC-VaI-OH (2a) und Η-Pro- Undecapeptid-tert.-butylester (12-22b) verließ räch OMe (3a) nach der angegebenen Phosphorazo-Me- ao dem angegebenen Dicyclohexylcarbodi.mid-N-Hythode zum tert.-Butyloxycarbonyl-Dipeptid -Ester droxybenzotriazol-Verfahren erfolgreich. (2-3a) vereinigt; nachfolgende alkalische Esterver- Aus dem Verknüpfungsprodukt, dem Tetra-deca-

seifung ergab in über 70%iger Ausbeute BOC-VaI- peptid-Derivat (9-22a) konnte nach hyirogenolytischer Pro-OH (2-3b). Einfacher und in hoher Ausbeute Abspaltung der Benzyloxycarbonvl-Schutzgn^irpe (83%) verlief die Herstellung von 2-3 b) durch Um- »5 H-Glu(OtBu)-Leu-Gln-Arg(HBr)-Ne-Glii(otBu) Gusetzung von BOC-VaI-OSU (2b) mit zwei Äquivalenten (OtBu) - Lys(BOC) - GIu(OtBu) - Arg(Hbr) - Asn - Lys-Prolin (3 b). (BOC)-GIy-GIn-OtBu (9-22 b), wiederum in Form des

Beide Dipeptid-Derivate ließen sich mit Hilfe der Hydrobromids und als Tetrahydrat, rein isoliert angLgebenen Carbodiimid-Methode zum BOC-VaI- werden.

Pro-Ile-Phe-OtBu (2-5a) verknüpfen; Trifluoressig- 30 Ausbeute über beide Stufen 77%; [*]? = -6,3 ±1° säure-Einwirkung auf (2-5a) führte zum freien Tetra- bzw. [«]& — —8,3° (c — 0,7 in Methanol); chromapeptid H-Val-Pro-Ile-Phe-OH (2-5b), an das in tographisch rein in n-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1. üblicher bekannter Weise BOC-Phe-OSU (1) zum Analyse

BOC-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-OH (l-5a) (Fragment VI) Berechnet ... C 47 99, H 7,58, N 13,72;

angebaut wurde. 35 _gcf_unden ... C47.81, H 7,28, N 13,69.

Die experimentelle Durchführung erfolgte in analoger Weise wie in Beipiel 1 beschrieben. Aminosäure-Analyse: Lys 1,99 Arg 1,98 Asp 1,03

Ausbeute 63% über die letzten drei Stufen, bezo- GIu 6,30 GIy 0,98 Leu 0,97 Nie 1,01. gen auf (4-5b); F. = 218°C; [a]f = 64,2 ± 1° bzw. Während des Ablaufs vorstehend beschriebener

WTn — —75,82° (c=l in Essigsäure); chromato- 40 Teilstück-Kondensationen wurden die Fragmente V graphisch rein in n-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1 (6-8 a) und VI (1-5 a), nach dessen Überführung in den und tert.-Amylalkohol/Pyridin/Wasser 35: 35: 30. (N-Hydroxysuccinimid)-ester (l-5b) vereinigt; es ge

Analyse: lang jedoch nicht, dieses Teilstück, nämlich BOC-Phe- Berechnet C 64 88 H 7 64 N 9 70" Val-Pro-Ile-Phe-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH (1-8) rein

.»f»_nH»_n r&ATi η 7 7« NOS1 ⁴S zu gewinnen. Auf Grund der Aminosaureanalyse-Werte

gerunaen ... L. w,u, η /,/υ, in v,oi. _{waf daj}, _Octapeptid-Derivat mit etwa 10% (1-5a oder

Beispiel 7 ^b) verunreinigt; Versuche einer Auftrennung dieses

. Gemisches verliefen ohne Erfolg. Das erhaltene »rohe«

Kondensation der Fragmente 1 bis Vl Teilstück (1-8) aus den Fragmenten V und VI wurde

(Gesamtsequenz 1 bis 22) _{5<J mit dem} Xetradecapeptid-Derivat (9-22 b) aus den

Auf das carboxylendständige Fragment I (18-22b) Fraktionen I bis IV) wiederum nach dem angegebenen

wurde mit Hilfe des angegebenen Dicyclohexyl- Dicyclohexylcarbodiimid - N - Hydroxysuccinimid-

carbodiimid-N-Hydioxysuccinimid-Verfahrens das Verfahren zum BOC-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr(tBu)-

Fnigment II (i4-17a) mit bestem Erfolg aufgeknüpft; Tyr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Gln-Arg(HBR)-Nle-Glu-

der erhaltene N-Benzyloxycarbonyl-noiiapeptki-tert.- 55 (OtBu)-GIu(OtBu)-LyS(BOQ-GIa(OtBB)-Arg(HBr)-

featyfesier (14-2ZaJBeB ach dmcfc tartaiyliselie Hydro- Asn-Lys(BOC)-Giy-Gta-OtBn (l-22a) veAnfi]prt;

genolyse uiei in H-GIu(OtBo)-GIn(OtBu)- nach Abspakimg aller Schutzgrappea mittels wasser-

Lys(BOC)-Gln!(O^u)-Arg(H Br)-Asn-Lys{BOC)-Gry- freier Trifluoressigsäure und anschließendem Austausch Ofaj43lBn (14-221)) Sberföhren. Der Anbau des Frag- der Trifluoracetat- und Bromid-ionen durch Ionen-

otentsni auf vorstehendes Nonapepödester-Derivat 60 austauschchromatographie an ämm unter der Be-

(14-22b) gelang wiederaja nrit Hflfe des genanntenVer- zeichnung »Dowex 44* bekannten scfewaeJi basischen,

fafirens eswandirei unter Bildung von Z-AIg(O^u-Z₁)- das Kondensatisasprodokt ans EpicMoifcydrin mit

NIe-GMOtBa)-GIu(OtBo)-LyS(BOC^GlB(OtBu)-ArB- Ammoniak darstellenden lonenaustaaascaieTbarz mit

(HBr)-AOTiV^BOC)-GIy-GIn-OtBD(Il-ZZa), das in tertiären aliphatischen Aminogruppen {Acetat-Form)

der erwünschten Remheit isoriert werden kOTnte. «5 wurde era »Roh-Norleadn-13-Moffim (l-22b) er-

Aasfeeate etwa &% aber afle dta Stufen, bezogen aalten, das auf Grund des Einsatzes von »unreinem«

auf das t Fisgment I; %φ = —4,9 ±1° Teästück (1-8) ηώ einer »Fehl-Seqaenz« benaftet sein

|a]»i — —6$° (c = 0,7 in MethanoO; chro- mußte.

11 12

Die experimentelle Durchführung der Fragment- Es resultierte L-Arginyl-(hydrobromid)-L-norIeucyl-

kondensation war wie folgt: L - glutamy 1 - (y - tert. - butylester) - l - glutamyl - (y - tert-

. „ . _¥ .... butylestert-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glut-

A. Kondensation I mit II _amJ,. _(y _'_tert . _butylest/_r). _L'_ arginyl - (hydrobromid)-

9,2 g Fragment I (gemäß Beispiel 1 H), 9,36 g Ben- 5 L-asparaginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-

ryloxycarbonyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-L)glut- glutamin-tert.-butylester-hydrobromid in Form eines

amyl - (y - tert. - butylester) - Νε- tert. - buty loxycarbonyl- Pulvers.

L-lysyl-L-glutaminsäure-y-tert.-butylester (Fragment11) [<x\f = —21,7° (c = 1,0; in Methanol),

und 1,4 ml Triäthylamin in 200 ml Dimethylformamid Ausbeute = 3,0 g (95 % der Theorie),

wurden bei 0⁰C mit 2,3 g N-Hydroxysuccinimid und io , .

anschließend mit 3,1 g NJN'-Dicyclohexylcarbodiimid ^C Kondensate (I-Il-III) mit IV

versetzt; die Reaktionsmischung wurde 24 Std. lang 2,7 g Undecapeptid - tert. - butylester - hydrobromid

bei 5⁰C und 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt (gemäß B), 1,5 g Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl-

und das Filtrat i. V. eingedampft. Der Rückstand (y-tert.-butylester)-L-leucyl-L-glutamin (Fragment IV)

wurde mehrmals mit Wasser digeriert und schließlich 15 und 0,405 g 1-Hadroxybenzotriazol in 200 ml Di-

zweimal aus Methanol/Essigester umgefällt. methylformamid wurden bei 0°C mit 0,182 ml Tri-

Es resultierte Benzyloxycarbonyl-L-giutamyl-(y-tert.- äthylamin und anschließend mit 0,577 g N,N'-Dicyclo-

butylester)-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-Ne-tert.- hexylcarbodiimid versetzt. Die Reaktionsmischung

butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl-(y-tert.-butyl- wurde 24 Std. lang zwischen 0 und +5⁰C und an-

ester)-L-arginyl-(hydrobromid)-L-asparaginyl-Ni-tert.- so schließend weitere 5 Tage lang bei 25⁰C gerührt. Der

butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-glutamin-tert.-butyl- Vakuumverdampfungsrückstand wurde zweimal aus

ester in Form eines amorphen Pulvers. Methanol/Essigester umgefällt, nach Trocknen i. V.

[a]f = —14,6° (c = 1,0; in Dimethylformamid). mit Wasser digeriert und anschließend nochmals aus

Ausbeute = 14,8 g (84% der Theorie). Methanol/Diäthyläther umgefällt. Es resultierte Ben-

12,3 g der erhaltenen Verbindung in 800 ml Metha- 25 zyloxycarbonyl-L-glutamyl-iy-tert.-butylesterJ-L-leu-

nol wurden unter pH-Stat-Bedingungen in üblicher cyl-L-glutaminyl-L-arginyl-ihydrobromidJ-Lnorleu-

bekannter Weise katalytisch hydriert (pH = 5,5; 7 ml cyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-glutamyl-(y-tert.-

1 n-Bromwasserstoffsäure). Das Filtrat wurde i.V. butylesterJ-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glut-

eingedampft, der Rückstand aus Äthanol/Essigester amyl - (y - tert. - butylester) - l - arginyl - (hydrobromid)-

zweimal umgefällt. 3° L-asparaginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysylglycyl-

Es resultierte L-Glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-glut- L-glutamin-tert.-butylester-dihydrat in Form eines

amyl - (y - tert. - butylester) - Ne - tert. - butyloxycarbonyl- amorphen Pulvers.

L-lysyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-arginyl-(hy- [λ]% — —4,3° (c = 0,7; in Methanol).

drobromidJ-L-asparaginyl-Nc-tert.-butyloxycarbonyl- Ausbeute = 2,7 g (82 °₀ der Theorie).

L-lysyl-glycyl-glutamin-tert-butylester-hydrobromid 35 2,0 g des erhaltenen Tetradecapeptid-Derivats in

als das gewünschte Kondensationsprodukt. 800 ml Methanol wurden unter pH-Stat-Bedingungen

fixlf = —21,5" (c = 1,0; in Methanol). in üblicher bekannter Weise katalytisch hydriert

Ausbeute = 11,4 g (96% der Theorie). (pH ~ 4,5; 8 ml 0,1 n-Bromwasserstoffsäure). Das

. . eingedampfte Filtrat hinterließ einen Rückstand, der

B. Kondensation (l-II) mit III _{<ο aus Methano}]/_Essj_gester umgefällt wurde.

3.4 p Nonapepti i-tert.-butylester (gemäß A) und Es resultierte L-Glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-leu-2,S g N ι,Να,Νω-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl- cyl-i--glutaminyl-L-arginyl-(hydrobromid)-i.-norleucyl-L-norleuun (Fragment III) in 200 ml Dimethylform- L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-i-glutamyl-(y-tert.-buamid und 0,70 g N-Hydroxysuccinimid wurden bei tylesterJ-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl-— 10°C rr it 0,28 πΑ Triäthylamin und danach mit « (y-tert.-butylester)-L-arginyl-(hydrobromid)-L-aspara-0 825 η Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die ginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glut-Mi.chung wurde 24 Std. lang bei +4°C und 24 Std. amin-tert.-butylester-hydrobromid-tetrahydratinForrn lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Ent- eines amorphen Pulvers.

ferne η des Dimethylformamids i. V. wurde der Rück- [a]f = —6,3° (c = 0,7; in Methanol),

stand aus Methanol/Essigester umgefällt, dann mit 50 Ausbeute = 1,92 g (94°·„ der Theorie).

Wasser digeriert und nochmals aus Methanol/Essig- ^ _¥, . . ,, ....

ester umgefällt. ^D· Kondensate V mit Vl

Es resultierte ΝΛ,ΝΑ,Νω-Tris-benzyloxycarbonyl- 21.6 g Fragment VI und 6,9 g N-Hydroxysuccinimid

L-arginyl-L-norleucyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)- in 400 ml Dimethylformamid wurden bei — 5°C mit

L-giutamyl-^tert.-tratylesterH^e-tert.-butyloxycarbo- 55 6,3 g Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt, die Reak-

ayl-L-iysyl-L-glulaniyl-iy-terL-butylesterJ-L-arginyl- tionsmischung wurde 2 Std. lang bei O°C und über

^ydrobromidl-L-asparaginyl-Ne-tejt.-butyloxycarbo- Nacht bei Raumtemperatur gerührt Das Filtrat wurde

ayl-L-lysyl-glycyl-glotenrin-terL-butylester in Form L V. eingedampft; der ölige Rückstand kristallisierte

eines amorphen Pulvers. aus Isopropanol.

|«]f = —4,9° (c = 0,7; in Methanol). 60 Es resultierte terL-Butyloxycarboayl-L-iAenyfafanyl-

Ausbeete = 3,9 g (85 % der Theorie). L-valyl-L-proiyl-L-isoleacyl-L^heaylalanhi-N-fcydFBXy·

3.5 g des erhaltenen Undecapeptid-Derivats in succinimidester.

8Θ0ιη1 Methane! wutden imter ptt^Stat-Bedinguagen F. = 190 bis 192°C; {*]? = +593° {c = 1,0; ii

in äMkher bekannter Weise katalytisch hydriert Dioxan). Aosbeate = 21,3 g (88% der Theorie).

(pH ~ 4,3; 31 ml 0,1 n-Bromwasserstofflösung in 65 12,2 g Fragment V und 3,8 mi Triätfeyiamin ii

Mtibasoil, Der Rückstand aus dem i. V. einge- 400 ml Dimethylformamid wurden mit 14,8 g de:

dampften Filtrat winde ans Methanol/Essigester um- angegebenen tert - Butyloxycarbonylpentapeptid

gefällt N-hydroxysuccinimidesters versetet; die Reafcöons

1684

mischung wurde nach 24stündigem Rühren bei Raumtemperatur L V. eingedampft und der ölige Rückstand zwischen Essigester und ZiUonensäurelösung verteilt. Die Essigesterphase wurde wie üblich gewaschen, getrocknet und i. V. van· Trockne gebracht Aus Essigester/Petroläther wurden farblose Kristallenen erhalten, bestehend aus tert-Butyloxycarbonyl-i-phenylalanyl - L - valyl - L - prolyl - L - isoleucyl - L - phenylalanyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-0-tert.-butyl-L-tryosyl-gIycin.

{«]? = -44,0° (c = 1,0; in Äthanol).

Ausbeute = 18,2 g (87% der Theorie).

E. Kondensation (I-II-III-IV) mit (V-VI)

1,3 g Tetradecapeptid-tert-butylester-hydrobromid (gemäß C) und 1,17 g tert-Butyloxycarbonyl-oktapeptid (gemäß D) 0,07 ml Triäthylamin und 0,175 g N-Hydroxysuccinimid (bzw. in weiteren Versuchen 0,20 g Hydroxybenzotriazol) in 100 ml Dimethylformamid wurden bei -10⁰C mit 0,257 g N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Die Mischung wurde 2 Tage lang bei 0⁰C und 3 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels i. V. wurde der Rückstand sorgfältig mit heißem Essigester digeriert, das harzartige Produkt aus Methanol/Essigester umgefällt, nach Verreiben mit Essigester getrocknet und danach 5 Std. lang erschöpfend mit Wasser behandelt.

Nach Umfallen aus Methanol/Wasser resultierte ein amorphes Pulver (1,1 g), bestehend aus tert-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoIeucyl-L-phenylalanyl-0-tert.-butyJ-L-threonyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-glycyl-L-glutamyl-iy-tert.-butylesterJ-L-Ieucyl-L-gJutaminyl-L-arginyHhydrobromidJ-L-norleucyl-L-glutamyl-(y-tert.-butyIester)-L-glutamyl-(y-tert.-butylesterJ-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-arginyl-(hydrobromid)-L-asparagmyl-Nc-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester.

0,2 g des erhaltenen geschützten Produktes wurden mit 20 ml eiskalter Trifluoressigsäure Übergossen und 2 Std. lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurde überschüssige Trifluoressigsäure i. V. bei möglichst tiefer Temperatur entfernt, das verbleibende Material in verdünnter Essigsäure aufgenommen, die erhaltene Lösung zweimal mit 4 g eines schwach basischen Anionenaustauschers in der OH-Form behandelt, worauf das Austauscher-Eluat lyophilisiert wurde.

Ausbeute = 157 mg.

Beispiel 8
Reindarstellung des synthetischen Produktes

A) In Anlehnung an die mit bestem Erfolg durchgeführte Reinigung von natürlichem Motilin wurde eine Ionenaustausch-Chromatographie von 25 mg des erhaltenen Roh-Norleucin-13-Motilins an einem in der Acetatform vorliegenden, unter der Bezeichnung »QAE-Sephadex A-25« bekannten stark basischen Anionenaustauscherharz auf der Basis eines modifizierten Dextrans mit Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylresten als funktionellen Gruppen durchgeführt.

Die experimentellen Bedingungen waren wie folgt:

Säule: 30 y 0,9 cm; 25 mg Rohprodukt gelöst in 2 ml 0,5%igem Ammoniak;

Elutionsmittcl: 0,025 m-Ammoniumacetat-Lösung (mit verd. Ammoniak auf pH 9,27 eingestellt);

Durchflußgeschwindigkeit: 18ml/Std.; ö-xal-Fraktionen.

Es erfolgte eine Auftrennung in zwei Hauptfraktionen, wie F i g. 6 zeigt

Die Fraktion B* (etwa 4 mg) erwies sich als die erwartete Fehlsequenz (1-5/9-22), die Fraktion B₁ (etwa 12 mg) als das gesuchte Norieudn-13-Motilki. Das durch Gefriertrocknung in fester Form erhaltene Dokosapeptid zeigte sich chromatographisch einheitlich im System n-ButanoI/Eisessig/Wasser/Pyridin 30: 6:24:20 und n-Butanol/Eisessig/Wasser/Pyridiri 30:12:24:20, sowohl nach dem Verfahren der Papier- als auch der Dünnschichtchromatographie.

Eine Aminosäureanalyse der Fraktionen B₁ und B, wurde nach saurer Hydrolyse (6n-HCL 20 St i.) durchgeführt, wobei sich zeigte, daß bei 72 htd. Hydrolysezeit praktisch dieselben Werte erzielt wurd;n. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.

Tabe3e I

	Fraktion	B,	B1	Her. Verh. füi
	1,98	2,04	(N.eIl)-Motilin
a5 Lys	1,98	1,99	2
Arg	1,00		2
Asp	1,00	—	1
Thr	6,08	6,00	1
GIu	0,97	0,91	6
30 Pro	1,99	1,06	1
GIy	0,94	0,88	2
VaI	0,95	0,86	1
He	1,00	0,99	1
Leu	1,01	1,00	1
35 Nie	0,91		1
Tyr	1,82	1,73	1
Phe		2

Orientierende Versuche ergaben eine biologische Aktivität der gefriergetrockneten Fraktionen B₁ von mindestens 50%.

Enzymatische Abbau-Versuche erbrachten eine weitgehende Bestätigung der vorgeschlagenen Primärstruktur.

B) Die unter (A) angegebene Verfahrensweise wurde wiederholt unter Verwendung folgender experimenteller Bedingungen:
Säule 80 χ 1,5 cm;

235 mg Rohprodukt, gelöst in 15 ml 0,5%igem Ammoniak wurden auf die mit 0,025 m-Ammoniumacetatlösung (mit verd. Ammoniak auf pH 9,20 eingestellt) äquilibrierte Säule aufgegeben.

Elutionsmittel: 0,025 m-Ammonium-acetat-Lösung (pH 9,20).
Durchfließgeschwindigkeit: 47ml/Std.;

23,5-ml-Fraktionen gesammelt, Peptidverteilung bestimmt durch Messung der Extinktion bei 220 mn. Es erfolgte eine Auftrennung in die Fraktionen B₁ (135 mg) und B₂ (44 mg), Gewichtsangaben, bezogen auf lyophilisierte Fraktionen.

C) Zur weiteren Reinigung wurden 135 mg der Fraktion B₁ an einem in der Ammoniumform vorliegenden, unter der Bezeichnung »SP-Sephadex C-25« bekannten stark sauren Kationenaustauscherharz auf Jer Basis eines modifizierten Dextrans mit Sulfopropylresten als funktionellen Gruppen säulenchromatographisch behandelt. Die experimentellen Bedingungen waren wie folgt:

Säule: 80 χ 1,5 cm;

135 mg Fraktion B₁, gelöst in 10 ml 0,5%iger Essigsäure.

Elutionsmittel: (1) 0,025 m-Ammoniumacetat-Lösung (hergestellt aus 0,025 m-Essigsäure, durch Zusatz von verd. Ammoniak auf pH 5,0 eingestellt); 24 Std. bei einer DurchfließgefAwindigkeit von llOml/Std.; (2) 0,025 m-Ammoniumacetat-Lösung (pH 5,38);

Durchfließgeschwindigkeit: llOml/Std.;

37-ml-Fraktionen.

F i g. 7 gibt den nach Wechsel des Elutionsmittels erhaltenen Teil der Elutionskurve wieder. Wie ersichtlich, wurden zwei Hauptfraktionen, nämlich C₁ (57 mg) und C₈ (48 mg), erhalten.

Die Fraktion C₂ war biologisch inaktiv, die Fraktion C₁ zeigte eine biologische Aktivität von über 90% im Vergleich mit natürlichem Motilin (es sei verwiesen auf J. C. B r ο w η et al, »Can. J. Physiol. Pharmacol.«, Bd. 49, 1971, S. 399 bis 405, und »Gastroenterology«, Bd. 62, 1972, S. 401 bis 404).

Die Ergebnisse der durchgeführten Aminosi analysen sind in der folgenden Tabelle Π aufgef

Tabelle H

	Q	C,
Lys	1,99	1,98
Arg	2,03	1,96
Asp	1,00	1,03
Thr	1,00	1,00
GIu	6,08	6,14
Pro	0,99	1,05
GIy	2,02	2,03
VaI	0,95	0,91
Ue	0,95	0,90
Leu	1,00	1,00
Nie	0,99	1,00
Tyr	0,91	0,91
Phe	1,92	1,91

Hierzu 6 Blatt Zeichnungen

Claims (2)

1. 23 IS

   Patentansprüche: 1. L-Noricndn-13-Motilin der Formel

   H-i1ie-Va!4*o-ne-P!ie-Tlff~Tyr^

   Ο) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10)01)02) 03) O*) 05) OQ (17) (18) (W) (20) (21) (22)
2. 2. Verfahren zur Herstellung von L-Norieucin-13-Motilin nach Ansprach 1, dadurch gekennzeichnet, dafiman

   (a) die miteinander verknüpf baren Teflsequenzen Fragment I, bestehend aus ArginyHhydrobromid)-asparagjnyl-N£-tert-butyloxycarbo· nyl - lysyl - glycyl - glutamin - tert. - butyiester (Aminosäuren 18 bis 22), Fragment Π, bestehend aus Na-Benzyloxycarbonyl-glutamyl-iy^ert.-butyfester^glutamyl- ao (y-terL-butyJester^NE-tert-butyloxycarbonyllysyl-glutaminsäure-y-tert-butylester (Aminosäuren 14 bis 17),

   Fragment HI, bestehend aus Noc-Benzyloxytarbonyl-Ni.Ntö-di-benzyloxycarbonyl-arginyl- as norleucin (Aminosäuren 12 und 13), Fragment IV, bestehend aus Not-Benzyloxycarbonyl-glutamyHy-tert.-butylesterHeucyl-. glutamin (Aminosäuren 9 bis 11), Fragment V, bestehend aus O-tert-Butylthreonyl-O-teit-butyl-tyrosyl-glycin (Aminosäuren 6 bis 8) und

   Fragment VI, bestehend aus Na-tert-Butyloxycarbonyl-phenylalaEyl-valyl-prolyl-isoIeucyl-phenylalanin (Aminosäuren 1 bis 5) aufbaut, in denen alle Seitenkettenfunktioaei der polyfunktionellen Aminosäuren acidoly tisch leicht abspaltbare Schutzgroppen au tert Alkohol-Basis tragen und die komplex» Funktion des Arginins teils durch N3,oo-Di acyh'erung und teils durch eine durch Salz bildung mit Bromwasserstoff bewirkte Proto nierung maskiert ist,

   (b) die Fragmente I bis VI mit Hilfe des bteratur bekannten Dicyclohexylcarbodümid - N - Hy droxysuccinimid-Verfahrens oder einer literaturbekannten Modifikation desselben miteinander verknüpft,

   (c) aus dem erhaltenen, allseits maskierten, die Gesamtsequenz der Aminosäuren 1 bis 22 aufweisenden Polypeptid alle Schutzgruppen mil Hilfe von Trifluoroessigsäure abspaltet und danach die gebildeten Trifluoroacetat- tnd Bromidionen mit Hilfe eines Anionenauslauscherharzes entfernt und

   (d) das erhaltene rohe L-Norleucin-13-Motilk isoliert und reinigt.