DE2528935C2 - Verfahren zur Herstellung Arginylreste enthaltender Peptide und hierbei eingesetzte Zwischenprodukte - Google Patents

Description

R³

mit folgenden Substituenten-Bedeutungen und der für R¹, R² und R³ angegebenen Zuordnung: R⁴ Wasserstoff, t-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl,

R¹ R² R³

Wasserstoff	Methoxy	Wasserstoff
Methyl	Methyl	Methyl
Isopropyl	Isopropyl	Isopropyl

X = F, CI. Br oder I,
in an sich bekannter Weise umsetzt,

(B) mit den nach Einführung der Guanidino-Schutzgruppe gemäß Verfahrensstufe (A) erhaltenen Verbindungen Peptidsynthesen in üblicher Weise durchführt und hiernach

(C) die Guanidino-Schutzgruppe durch Einwirkung von Bortristrifluoracetat, einer Nicderalkansulfonsäurc oder Halogensulfonsäure bei -5 bis 50⁰C abspaltet.

2. N^G-Benzolsulfonyl-arginine der allgemeinen Formel

NH

y R¹

HN-C j

(CHj)₃ NH- SO₂-<fS— R²

j \._/

R⁴—NH-CH-COOH ]~Γ

mit folgenden Substituenten-Bedeutungen und der für R¹, R² und R³ angegebenen Zuordnung:

R⁴ Wasserstoff. t-Butyloxycarbonyl, Benzyloxycarbonyl,

R^! R² R³

Wasserstoff	Methoxy	Wasserstoff
Methyl	Methyl	Methyl
Isopropyl	Isopropyl	Isopropyl

3. Die an der Guanidino-Gruppe ihrer Arginylreste Schutzgruppen gernäfi Anspruch I aufweisenden Peptide:

(a) Bradykinin,

(b) PyrGlu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro-OH,

(c) luteinisierendes Hormon freisetzendes Hormon,
(d) Tuftsin,

(e) H-Thr-Lys-Arg-OH.

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Schutz der Guanidinogruppe in Arginylreste enthaltenden Pcptiden der Formel

NH

HN-C

(CH₂), NH₂

R—NH — CH—COOH

und zur Wiederabspaltung der Schutzgruppe.

Insbesondere betrifft die Erfindung das Herstellungsverfahren für Arginylreste enthaltende Peptide gemäß Anspruch 1, die mit einem reaktionsfähigen Halogenid der 4-MethoxybenzoIsulfonsäure oder einer Trialkylbenxolsulfonsäure gemäß Anspruch 1, Verfahrensstufe (A) umgesetzt werden, wobei die Schutzgruppe nach der Durchführung von Peptidsynthesen durch Einwirkung eine- starken Lewis-Säure gemäß Anspruch 1, Verfahrensstufe (C) abgespalten wird.

Als Schutzgruppe für Guanidinogruppen wurden z. B. häufig Tosylgruppen verwendet, insbesondere bei der Peptidsynthese. Jedoch sind nicht nur die Ausbeute bei der Einführung der Tosylgruppe in die Guanidinogrtppe, sondern auch die Abspaltung der Schutzgruppe nach erfolgter Peptidsynthese nicht immer befriedigend.

Mit dem Zwecke von Verbesserungen in dieser Hinsicht wurden umfangreiche Untersuchungen ausgeführt, wobei gefunden wurde, daß die 4-Meihoxybenzolsu!fony!gnjppe and die in Anspruch 1 genannter. Trialkyibeny.olsulfonylgruppen befriedigende Schutzgruppen für die Guanidinogruppe in Arginylreste enthaltenden Peptiden sind.

Ein Ziel der vorliegenden Erfindung ist es, Arginylreste enthaltende Peptide zur Verfügung zu stellen, deren C uanidinogruppen mit einer denn Anspruch 1 definierten Schutzgruppen geschützt sind.

Das Hauptziel der vorliegenden Erfindung ist ein neues Verfahren zum Schützen der Guanidinogruppe in einem Arginylreste enthaltenden Peptid mit den genannten spezifischen Schutzgruppen, und ein Verfahren zur Wiederabspaltung der Schutzgruppe zur Verfügung zu stellen.

Andere Ziele werden im Verlauf der folgenden Offenbarung deutlich werden.

Der Schutz der Guanidinogruppe Arginylreste enthaltender Peptide kann erfindungsgemäß verwirklicht werden durch L'-nselzung eines reaktionsfähigen Halogenids einer Methoxybenzolsulfonsäure oder einer Trialkylbenzolsulfonsäure, wie in Anspruch 1 definiert, mit der Guanidinogruppe des genannten Peptides.

Die Melhoxygruppe ist an die 4-Stellung des Benzolrings gebunden. Sie wird im folgenden als »MBS« abgekürzt.

Die Alkylgruppen des mit der Guanidinogruppe reagierenden Trialkylbenzolsulfonylhalogenids. sind gleich und sind Methyl- und Isopropylgruppen.

X-SO₂- ^ ^NN "²

Diese Gruppen sind in den Stellungen 2,4 und 6 gebunden. Somit handelt es sich um 2,4,6-Trimethylbenzolsulfonyl und 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonyl.

Der Schutz von Guanidinogruppen mit diesen Schutzgruppen kann nach bekannten zweckmäßigen Verfahren zur Einführung von substituierten Benzolsulfonylgruppen in die Guanidinogruppen Arginylreste enthaltender Peptide ausgeführt werden. Ein typisches Beispiel eines solchen Verfahrens ist die Umsetzung eines Halogenides, wie eines Fluorides. Chlorides, Bromides oder Jodides, der Benzolsulfonsäure mit dem Arginylreste enthaltenden Ausgangsmaterial. Die Reaktion dieses beispielhaften Verfahrens wird vorzugsweise in Gegenwart einer Base ausgeführt. Die Base kann z. B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid oder Lithiumhydroxid sein und wird gewöhnlich in einer Menge von ca. 1 bis 10 Äquivalenten, vorzugsweise ca. 1 bis 5 Äquivalenten, pro Äquivalent des Guanidinogruppen enthaltenden Ausgangsmaterials verwendet. Die Reaktion wird vorzugsweise in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Aceton, Dioxan, Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, ausgeführt. Die Reaktionstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von ca. -10 bis 25°C, vorzugsweise von ca. -5 bis 10-C.

Die Schutzgruppe kann somit in die Guanidinogruppe eingeführt werden.

NlI

/' Rl

HN-C

(CHj)₃ NH-SO₂-^ V
R⁴—NH- CH- COOH

Das Arginylreste enthaltende Peptid mit auf diese Weise geschützter Guanidinogruppe kann einigen herkömmlichen chemischen Modifizierungen, z. B. Synthesereaktionen zur Herstellung anderer Peptide, unterworfen werden. Danach kann die Schutzgruppe erforderlichenfalls leicht abgespalten werden, um die freie Guanidinogruppe zurückzuerhalten. Die Abspaltung der Schutzgruppen kann leicht und mit weniger Nebenreaktionen nach an sich bekannten Verfahren erfolgen, z. B. unter Verwendung von bestimmten Lewissäuren, z. B. Bortristrifluoracetat (das als »BTFA« abgekürzt werden kann).

In diesem Zusammenhang wurde gefunden, daß die Verwendung von Alkansulfonsäuren. z. B. Methansulfonsäure, Trifluormethansulfonsäure oder Äthansulfonsäure, oder von Halogensulfonsäuren, z. B. Fluorsulfonsäure. für die Abspaltung der Schutzgruppen vorteilhafter ist Diese Säuren können auch als Lösungsmittel für die ίο Abspaltungsreaktion dienen. Die Abspaltungsreaktion kann in einem Lösungsmittel, z. B. Trifluoressigsäure, Essigsäure, Chloroform oder Methylenchlorid, ausgeführt werden. Die Reaktionstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von — 5 bis 50° C.

Das vorliegende Verfahren zum Schutz von Guanidinogruppen in Arginylreste enthaltenden Peptiden läßt

sich in wirksamer Weise auf beliebige chemische Reaktionen unter Verwendung von Aminosäuren und Peptiden anwenden, sofern diese einen oder mehrere Arginylreste enthalten, wobei die Reaktion ohne Rücksicht auf die Konfiguration der Aminosäure oder des Peptides entweder in flüssiger oder fester Phase ausgeführt werden

Das vorliegende Verfahren hat die folgenden technischen Vorteile:

(1) Die vorliegenden Schutzgruppen werden in die Guanidinogruppe in einer guten Ausbeu-^ von mehr als ca.

70% eingeführt verglichen mit einer Ausbeute von ca. 40% im Falle der als Schutzgruppe bekannten

Tosylgruppe.
(2) Die Abspaltung der Schutzgruppe kann vollständig zu Ende verlaufen, verglichen mit einem Umsatz von ca.

20% bei der Tosylgruppe.
(3) Die Abspaltung der vorliegenden Schutzgruppen verläuft schneller als die Abspaltung der Tosylgruppe.

In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen werden Abkürzungen zur Bezeichnung von Aminosäuren, Peptiden und deren aktivierenden oder Schutzgruppen sowie von Aktivierungs- und Schutzmitteln für Aminosäuren oder Peptide verwendet, wie sie von der IUPAC-IUB Commission on Biological Nomenclature festgelegt wurden oder auf diesem speziellen Fachgebiet gewöhnlich verwendet werden.

Beispiele solcher Abkürzungen sind die folgenden.

In der vorliegenden Beschreibung und den Ansprüchen sind Aminosäuren in der L-Konfiguration gemeint wenn sie nicht speziell anders bezeichnet werden.

Be^:s ρ ie I 1

0,1 mMol Tosylarginin und 0,1 mMol p-Methoxybenzolsuifonylarginin werden jeweils in 0,5 ml Trifluoressigsäure gelöst. Während die einzelnen Lösungen auf 0°C abgekühlt werden, werden Lösungen von 6, 8 oder 10

AIa:	Alanin
Arg:	Arginin
GIy:	Glycin
GIu:	Glutaminsäure
His:	Histidin
Leu:	Leucin
He	Isoleucin
Lys:	Lysin
Phe:	Phenylalanin
Pro:	Prolin
PyrGlu:	Pyroglutaminsäure
Ser:	Serin
TIr.	Threonin
Trp:	Tryptophan
Tyr:	Tyrosin
BOC:	tert- Butyloxycarbonyl
BTFA:	Bonristrifluoracetat
DCC:	N,N'- Dicyclohexylcarbodiimid
DCHA:	Dicyclohexylamin
HONB:	N-Hydroxy-5-norbornen-2,3-dicarboximid
OMe:	Methylester
ONBzI:	p-N'itrobenzylester
ONB:	HONBester
O1Bu:	tert.-Butylester
Tos:	Toluolsulfonyl
Z:	Benzyloxycarbonyl
OTcp:	2.4.5-Trichlorphenylester
GIn:	Glutamin

Äquivalenten BTFA in Trifluoressigsäure zugegeben. Jedes der Gemische wird 1 Stunde lang bei 0°C gerührt und mit 50 ml Wasser verdünnt. Die Gemische werden gefriergetrocknet, worauf der dabei erhaltene Rückstand der Aminosäureanalyse unterworfen wird. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben:

Tabcll-· I

Rückgewinnung von Arginin

Ausgaiiiisniiitcriiil 6 Äquivalente 8 Äquivalente IO Äquivalente

HTFA HTlA BTKA

Tos

H — Arg—OH 1,3% 3,2% 11,2%

MBS

i
H — Arg—OH 70,0% 82,0% 100%

Beispiel 2

Je 0.5 ml Methansulfonsäure, die 5% Anisol enthalten, werden zu ΙΟΟμΜοΙ H-Arg(MBS)-OH bzw. zu ΙΟΟμΜοΙ H-Arg(Tos)-OH gegeben, worauf die Gemische 40 Minuten lang bei 22°C behandelt werden. Die resultierenden öle werden gut mit Äther gewaschen und dann der Aminosäureanalyse unterworfen. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle wiedergegeben.

Tabelle Il

Ausgangsmaterial Rückgewinnung von Arginin

H-Arg(Tos)-OH 23,4%

H-Arg(MBS)-OH 100%

Beispiel 3

(1) Herstellung von Z-Arg(MSS)-OH, wobei »MSS;< eine Abkürzung für »Mesitylensulfony!« ist

3,08 g (0.01 Mol) Z-Arg-OH werden in einem Gemisch aus 10 ml 4-normaler wäßriger Natronlauge und 80 ml Aceton gelöst, worauf die Lösung mit Eis gekühlt wird. Eine Lösung von 438 g (0,02 Mol) Mesitylensulfcmylchlorid in 10 ml Aceton wird in 10 Minuten zu der Lösung zugetropft. Das Gemisch wird 2 Stunden lang gerührt und mit Zitronensäure versetzt, um die Lösung anzusäuern. Das Aceton wird im Vakuum verdampft und der ölige Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatschicht wird zweimal mit Wasser gewaschen und mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat extrahiert. Der wäßrige Extrakt wird mit Zitronensäure angesäuert. Die sich ausscheidende ölige Substanz wird mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird zweimal mit Wasser gewaschen und im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der ölige Rückstand wird mit Petroläther verrieben, wobei ein Pulver gebildet wird. Ausbeute 4,0g (81,8%). Smp. 110 bis 112⁰C (Zersetzung), [λ] ¹J -0.41° (c=0,97. Methanol).

iäi analyse für C23H28O5N4S so

Berechnet: C 5634; H 5.78; N 11,47; S 636
Gefunden: C 56,28; H 6.10; N 10,96; S 639

(2) Herstellung von H-Arg(MSS>OH

2,0 g Z-Arg(MSS)-OH werden in Methanol gelöst und über Palladiumschwarz hydriert Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird mit Äthylacetat versetzt und das resultierende Pulver durch Filtration isoliert Ausbeute 13 g (89,2%). Smp. 144 bis 146=C (Zersetzung), O]? -337° {c= 0,89. Methanol).

Elementaranalyse fürCisH2dO4N4S
Berechnet: C 50,54; H 6.79; N 15.27; S 9,00
Gefunden: C 5039; H 6.78; N 14,89; S 8,79

(3) Entfernung der MSS-Gruppe
(a) Entfernung mit Methansuifonsäure

0,5 ml Methansulfonsäure, die 5% Anisol enthalten, werden zu 35,6 mg (100 μΜοΙ) H-Arg(MSS)-OH gegeben, worauf das Gemisch 40 Minuten lang bei 22°C behandelt wird. Das Reaktionsgemisch wird mit Äther verset/.t. Di? resultierende ölige Substanz wird gut mit Äther gewaschen und in 10 ml Wasser gelöst. Ein Teil der Lösung wird einer Aminosäureanalyse unterworfen, wobei sich ein Arginingehalt von 78% ergibt.

ίο (b) Entfernung mit BTFA

Je 35,6 mg (100 μΜοΙ) H-Arg(MSS)-OH werden in drei Kolben gegeben und in je 0,5 ml Trifluoressigsäure gelöst. Unter Kühlen auf 0°C werden Lösungen von 6,8 bzw. 10 Äquivalenten BTFA in Trifluoressigsäure zu den Lösungen gegeben, worauf die Gemische 1 Stunde lang bei 0° C gerührt werden. Die Lösungen werden mit dem lOfachen Volumen Wasser verdünnt und gefriergetrocknet. Die dabei erhaltenen Rückstände werden in je 10 ml Wasser gelöst, worauf ein Teil jeder Lösung der Aminosäureanalyse unterworfen wird; man erhält die in Tabelle III angegebenen Resultate.

Tabelle III	6 Äquivalente BTFA	8 Äquivalente BTFA	10 Äquivalente BTFA
	71,0%	80,0%	91,0%
Rückgewinnung von Arginin

von Arginin

Beispiel 4

(1) Herstellung von Z-Arg(TPS)-OH

(»TPS« ist eine Abkürzung für »2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonyl«)

Unter Verwendung von 2,4,6-Triisopropylbenzolsulfonylehlorid wird die gewünschte Verbindung nach einem ähnlichen Verfahren wie demjenigen von Beispiel 3-(l) hergestellt. Ausbeute 78,0%. Smp. 130- 135°C, [*]? -0,54° (c= 1.11. Methanol).

Elementaranalyse fürC29H4:O6N4S

Berechnet: C 60,60; H 7.37; N 9,72; S 5,58
Gefunden: C 61.20; H7.41; N 8,68; S 5,70

(2) Herstellung von H-Arg(TPS)-OH

Die gewünschte Verbindung wird nach einem ähnlichen Verfahren wie demjenigen von Beispiel 3-(2) hergestellt. Ausbeute 82,0%, Smp. 225 - 226° C (Zersetzung),[λ] % -3,8° (c= 1,02. Methanol).

Elementaranalyse für C2iH36O4NtS · Vj H2O
Berechnet: C 56.10; H 8.07; N 12,46; S 7,13
Gefunden: C 56.12; H 8.24; N 12,04; S 7,21

(3) Entfernung der TPS-Gruppe

(a) Entfernung mit Methansulfonsäure |

0.5 ml Methansulfonsäure, die 5% Anisol enthalten, werden zu 44,0 mg (100 μΜοΙ) H-Arg(TPS)-OH gegeben, worauf das Gemisch 40 Minuten lang bei 22°C behandelt wird. Das Reaktionsgemisch wird mit Äther versetzt und die resultierende ölige Substanz gut mit Äther gewaschen. Die ölige Substanz wird in 10 ml Wasser gelöst und ein Teil der Lösung einer Aminosäureanalyse unterworfen, wobei sich ein Arginingehalt von 89,6% ergibt.

(b) Entfernung mit BTFA

Je 44,0 mg (100 μΜοΙ) H-Arg(TPS)-OH werden in drei Kolben gegeben und in Trifluoressigsäure gelöst. Unter

Kühlung werden die Lösungen mit Lösungen von 6 bzw. 8 bzw. 10 Äquivalenten BTFA in Trifluoressigsäurc versetzt. Die Mischungen werden 1 Stunde lang bei 0⁰C gerührt und mit der lOfachen Volumenmenge Wasser verdünnt. Die Lösungen werden gefriergetrocknet und die dabei erhaltenen Rückstände in je 10 ml Wasser gelöst. Teile der Lösungen werden einer Aminosäureanalyse unterworfen, wobei die in der folgenden Tabelle

wiedergegebenen Resultate erhalten werden: ϊ₃

Tabelle IV	25	28	935	IO Äquivalente BTFA
	b Äquivalente BTFA		8 Äquivalente BTFA	90,0%
Rückgewinnung von Arginin	69,0%		78%

ElcmentaranalysefürC33H49O7N₅S ■ CH₃CN
Berechnet: C 59,98: H 7.48: N 11.99: S 438
Gefunden: C 59,97; H 7.74; N 11,72; S 4,59

(2) Herstellung von H-Arg(MBS)-OH

2 g öliges Z-Arg(MBS)-OH werden in Methanol gelöst und über Palladiumschwarz hydriert. Das Methanol wird verdampft und der ölige Rückstand aus heißem Wasser umkristalüsiert. Ausbeute 900 mg (63,0%), Smp. 144,0 bis 146,0°C(Zersetzung),[>|? -6,1° (c=0,71, Methanol).

Elementaranalyse für Ci₃H₂₀O₅N₄S ■ V₂H₂O
Berechnet: C 44,18; H 5.99; N 15,85; S 9,07
Gefunden: C 44,05; H 5.80; N 15,75; S 8,99

(3) Herstellung von Z-Arg(MBS)-ONBzl

7,0g(0,01 Mol) Z-Arg(MBS)-OH - DCHA ■ CH₃CN werden in Äthylacetat suspendiert und durch Behandein mit 60 ml 0,2-normaler Schwefelsäure in Z-Arg(M BS)-OH übergeführt. Das Äthyiacetat wird verdampft und der ölige Rückstand in 30 ml Dimethylformamid gelöst Unter Eiskühlung werden 1,68 ml (0,012 Mol) Triäthylamin und 2^59 g (0,012 Mol) p-Nitrobenzylbromid zugesetzt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden lang bei 30°C gerührt und über Nacht bei Raumtemperatur stehengelassen. Das Gemisch wird in Wasser gegossen und das

Beispiel 5

Herstellung von BOC-Arg(MBS)-OH

2,76 g (8 mMol) H-Arg(MBS)-OH werden in einem Gemisch aus 4,4 ml Wasser und 1,68 ml (12 mMol)Triäthylamin gelöst. Diese Lösung wird mit einer Lösung von 2,1 g (8,8 mMol) S-4,6-Dimethylpyrimidin-2-ylthiokohlen- !5 süurc-tert.-butylester in 4,4 ml Dioxan versetzt. Das Reaktionsgemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und dann unter vermindertem Druck eingedampft, um das Dioxan zu entfernen. Die zurückbleibende Lösung wird mit Wasser verdünnt, mit Äthylacetat gewaschen und dann mit 5normaler Salzsäure auf pH = 2 gebracht. Der resultierende ölige Rückstand wird mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Lösungsmittel wird durch Eindampfen im Vakuum zur Trockene entfernt. Der ölige Rückstand wird mit Petroläther verrieben und dann durch Umfällung aus einem Gemisch aus Äthylacetat und Petroläther gereinigt. Ausbeute 3,25 g (91.3%), Smp. 85,0 bis 92,0"C(Zersetzung).[ac]" + l,19(c= 1,1, Methanol).

Elcmentaranalyse für C₁₈H₂₈O₇N₄S ■ V₂CH₃COOC₂H₅ Berechnet: C 49,17; H 6,60; N 11,47; S 6,56
Gefunden: C 49,15; H 6,53; N 12.04; S 6,89

B e i s ρ i e I 6

30 Herstellung von Bradykinin

(1) Herstellung von Z-Arg(MBS)-OH · DCHA · CH₃CN

55,5 g (0.18 Mol) Z ■ Arg-OH werden in einem Gemisch aus 180 ml 4-normaler Natronlauge und 1,3 Liter Aceton gelöst, worauf die Lösung mit Eis gekühlt wird. Eine Lösung von 74,4 g (0.36 Mol) p-Methoxybenzolsulfonylchlorid in 300 ml Aceton wird in 30 Minuten zugetropft, worauf das Gemisch 2 Stunden lang gerührt wird. s

Das Gemisch wird mit Zitronensäure angesäuert und unter vermindertem Druck destilliert, um das Aceton zu I

verdampfen. Der ölige Rückstand wird in Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatschicht wird zweimal mit Wasser |

gewaschen und mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat extrahiert. Der wäßrige Extrakt wird mit Zitronen· säure angesäuert und dip resultierende ölige Substanz mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicnt wird zweimal mit Wasser gewaschen und unter vermindertem Druck destilliert, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Der ölige Rückstand (86,0 g) wird in 600 ml Äthylacetat gelöst und mit 36,0 ml (0,18 Mol) Dicyclohexylamin versetzt. Man läßt das Gemisch in einem Kühlschrank stehen, damit es kristallisiert. Die Kristalle werden durch Filtration isoliert und zweimal aus Acetonitril umkristallisiert. Ausbeute 77,0 g (61.1%), Smp. 110,0 bis 112.0⁰C (Zersetzung),[α]? +5,1° (c= U5, Methanol).

wäßrige Gemisch mit Äthylacelat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit 1 -normaler Salzsäure und 5%igcm Natriumcarbonat gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Der ölige Rückstand wird mit Petroläther verrieben und liefert ein Pulver. Ausbeute 6,2 g (100%), Smp. 90,0 bis 110.0°C(Zersetzung).[*]ο -3,4° (c= 0.59, Dimethylformamid).

Elementaranalyse
Berechnet: C 54,80; H 5.09; N 11,41; S 5,23
Gefunden: C 55.49; H5.I5; N 11.15; S 4,36

ίο Rf =0,91 (Chloroform/Methanol/Essigsäure = 9 :1 :0,5).

Das gleiche Lösungsmittelsystem wird im folgenden zur Bestimmung von Rf -Werten verwendet.

(4) Herstellung von Z-Phe-Arg(M BS)-ON BzI

6,1 g(0,01 Mol) Z-Arg(MBS)-ONBzI werden bei Raumtemperatur 40 Minuten lang mit einer 25%igen Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure behandelt. Das resultierende Pulver wird durch Filtration isoliert, über Nacht in einem Exsikkator über Natriumhydroxyd getrocknet und in 30 ml Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird unter Eiskühlung mit 2,8 ml (0,02 Mol) Triäthylamin versetzt und das gebildete Salz abfiltriert. Das Filtrat wird mit 4,6 g (0,01 Mol) Z-Phe-ONB versetzt und das Gemisch über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird mit Wasser verdünnt und mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit 1 -normaler Salzsäure und 5%igem Natriumbicarbonat gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Der ölige Rückstand wird mit Petroläther verrieben unj ergibt Kristalle. Die Kristalle werden aus Äthanol umkristallisiert. Ausbeute 4,5 g (59,2%), Smp. 130,0 bis 132.0° C, [λ] y -6,8° (c=0,66. Dimethylformamid).

Elementaranalyse für C37H40O11 NeS

Berechnet: C 58,41; H 5.30; N 11,05; S 4,22
Gefunden: C 58,52; H 5,i9; N 10,98; S 4,36
30

Rf =0,82.

(5) Herstellung von BOC-Ser-Pro-Phe-Arg(MBS)-ONBzl

3,8 g (0,005 Mol) Z-Phe-Arg(MBS)-ONBzl werden bei Raumtemperatur 40 Minuten lang mit 20 ml einer 25%igen Lösung von Bromwasserstoff in Essigsäure behandelt. Äther wird zugesetzt und das resultierende Pulver isoliert. Das Pulver wird über Nacht in einem Exsikkator über Natriumhydroxyd getrocknet und in 20 mi Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird unter Eiskühlung mit 1,4 ml (0,01 Mol) Triäthylamin versetzt und das gebildete Salz abfiltriert. In dem Filtrat werden 1,5 g (0,005 Mol) BOC-Ser-Pro-OH [Smp. 147,0 bis 148.0' C (Zersetzung)] und 900 mg (0.005 Mol) HONB gelöst, worauf man Ν,Ν'-Dicylohexylcarbodiimid zugibt. Das Gemisch wird 2 Tage lang bei 4°C und dann einen Tag lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach dem Verdampfen des Dimethylformamids wird der Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatlösung wird mit 0,2-normaler Salzsäure und 5%igem Natriumbicarbonat gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat gel. ;cknct. Das Äthylacetat wird verdampft und der Rückstand mit Petroläther versetzt. Die resultierenden Kristalle werden aus einem Gemisch aus Äthylacetat und Petroläther umkristallisiert. Ausbeute 3,8 g (83,4%), Smp. 155,0 bis 160.0° C. [λ] % -26.0.0° (c=0,52. Dimethylformamid).

Elementaranalyse für C42H54O13N8S · V₂H₂O

Berechnet: C 54,83; H 6,02; N 12,!B; S 3,49
Gefunden: C 54,81; H 6,00; N1K87; 3,53

(6) Herstellung von BOC-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(MBS)-ONBzl

3,64 g (0.004 Mol) BOC-Ser-Pro-Phe-Arg(MBS)-ONBzl werden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang mit 30 ml Trifluoressigsäure behandelt. Nach dem Verdampfen der Trifluoressigsäure unter vermindertem Druck wird der Rückstand mit Äther versetzt, wobei sich ein Pulver bildet. Das Pulver wird über Nacht in einem Exsikkator über Natriumhydroxyd getrocknet und in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird unter Eiskühlung mit 0,56 ml (0,004 Mol) Triäthylamin und dann mit 1,72 g (0,004 Mol) BOC-Phe-ONB versetzt. Das Gemisch wird 6 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt und das Dimethylformamid im Vakuum verdampft. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 0,2-normaIer Salzsäure und 5%igem Natriumbicarbonat gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und destilliert, um das Lösungsmittel zu verdampfen. Der Rückstand wird mit Äther versetzt und das Gemisch filtriert, wobei man Kristalle erhält, die aus Äthylacetat umkristallisiert werden. Ausbeute 4,0 g (94.6%), Smp. 165,0 bis 170.0° C [λ] " -22.2° (c=0.59. Dimethylformamid).

ysibjug H2O
Berechnet: C 5652; H 6,09; N 11.71; S ZS2
Gefunden: C 56,58; H 5.76; N 11,66; S 3,17

Rf =0.65.

(7) Herstellung von Z-Arg(MBS)-Pro-Gly-O'Bu

AS g (0,0106 Mol) öliges Z-Pro-Pro-GIy-O'Bu (Rf¹ =0,80) werden in 70 ml Methanol gelöst und 3 Tage lang der katalytischen Hydrierung über Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrai zur Trockene eingeengt. Der ölige Rückstand wird in 100 ml eines Mischlösungsmittels aus Dioxan und Tetrahydrofuran (9:1) gelöst. Z-Arg(MBS)-OH, das in herkömmlicher Weise aus 7,42 g (0.0106 Moi) Z-Arg(MBS)-OH - DCHA - CH₃CN hergestellt wurde, und 2,0 g (0,0111 MoI) HONB werden zu dieser Lösung gegeben und darin gelöst. Die Lösung wird unter Eiskühlung mit 2,4 g (0,0117 MoI) N.N'-Dicyclohexylcarbodiiniitl versetzt und das Gemisch 2 Tage lang bei 4°C gerührt. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Rltrat zur Trockene eingedampft Der ölige Rückstand wird in Athylacetat gelöst und die Lösung mit 0.2-normaler Salzsäure und 5%igem Natriumbicarbonat gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Athylacetat wird im Vakuum verdampft und der ölige Rückstand mit Äther verrieben. Das resultierende Pulver wird aus einem Gemisch aus Athylacetat und Äther umgefällt. Ausbeute 5,5 g (66,2%), Smp. 120.0 bis 130.0° C (Zersetzung), [λ] ²J - 47,7° (c= 033, Dimethylformamid).

Elementaranalyse für C37H51O10N7S - V2H2O
Berechnet: C 55,90; H 639; N 1233; S 4.03
Gefunden: C 55,89; H 6.62; N 1231; S 4.05

(8) Herstellung von Z-Arg(MBS)-Pro-Pro-Gly-OH

4.72 g (0.006 Mol) Z-ArgiMBS)-Pro-Pro-Gly-O^lBu werden bei Raumtemperatur 30 Minuten lang mit 30 ml Trifluoressigsäure behandelt. Die Trifluoressigsäure wird im Vakuum verdampft und der ölige Rückstand in Athylacetat gelöst. Die Lösung wird zweimal mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das Athylacetat wird verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Das resultierende Pulver wird durch Filtration isoliert und durch Umfällung aus Athylacetat gereinigt. Ausbeute 3,5 g (85.4%). Smp. 80,0 bis 90.0° C (Zersetzung), [λ] d - 46,4° (c= 036. Dimethylformamid).

ElcmentaranalysefürC3jH4jOioN7S · H2O

Berechnet: C 53.00; H 6.06: N 13,11; S 429
Gefunden: C 53,13; H 6.03; N 12,60: S 4,26

(9) Herstellung von Z-Arg(MBS)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(MBS)-ONBzl

i,06g (1 mMol) BOC-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(MBS)-ONBzlwerden in 12 ml kalter Trifluoressigsäure gelöst, worauf man die Lösung 30 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen läßt. Die Lösung wird mit 0.17 ml einer 5,85-normalen Lösung von Chlorwasserstoff in Dioxan versetzt und die Trifluoressigsäure verdampft. Der ölige Rückstand wird mit Äther versetz?, wobei sich ein Pulver bildet. Das Pulver wird durch Filtration isoliert und über Nacht in einem Exsikkator über Natriumhydroxyd getrocknet, worauf es in 20 ml Dimethylformamid gelöst wird. Die Lösung wird unter Kühlung mit 1,28 ml einer 10%igen Lösung von N-Äthylmorpholin in Dimethylformamid neutralisiert. 730 mg (1 mMol) Z-Arg(MBS)-Pro-Pro-Gly-OH und 270 mg (1,5 mMol) HONB werden zu der Lösung gegeben und darin gelöst, worauf 247 mg (1,2 mMol) Ν,Ν'-Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben werden. Das Gemisch wird 3 Tage lang bei 4°C und danach 1 Tag lang bei Raumtemperatur gerührt. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Dimethylformamid aus dem Filtrat verdampft. Der Rückstand wird durch Dekantieren mit Äther gewaschen und dreimal aus heißen Äthanol umkristallisien. Ausbeute 1,4 g (84.0%), Smp. 120,0 bis 125.O⁰C (Zersetzung), [λ] " -37,1° (c=0.56. Dimethylformamid). Rf³ = 0.06(Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser = 60 : 20 :6 :11).

ElcmentaranalysefürC79He₆O2iNi6S2 · 2 H2O

Berechnet: C 55,62; H 5.91; N 13,14; S 3,76 Gefunden: C 55,62; H 5.87: N 12,97: S 3,87

Aniinosäurcanalyse(6norm;ile Salzsäure. 110"C, 24 Stunden):
Arg 1.94(2); Ser 0,96(1): Pro 3.0S(3);GIy 0.96(1); Phc 1,98(2);
durchschnittliche Rückgewinnung 98,0%

(10) Herstellung von H-Arg(MBS)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(MBS)-OH

4,0 g (2,4mMol) Z-Arg(MBS)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(MBS)-ONBzl werden in 100 m! 80%iger wäßriger Essigsäurelösung gelöst und 8 Stunden lang der katalytischen Hydrierung über Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abnitriert und der Rückstand im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wird mit einem Gemisch aus Aceton und Äther (1 :1) verrieben und das resultierende Pulver gut mit heißem Aceton gewaschen. Ausbeute 3.4 g(100%), Smp. 170,0 bis 180,0⁰C (Zersetzung),[λ] ? -51J (c=0,50. Essigsäure).

ίο Elementaranalyse für C64H85O17N15S2 - H2O

Berechnet: C 54,19; H 6,18; N 14,81; S 4,52
Gefunden: C 54,16: H 635; N 14,76; S 4,58

Aminosäureanalyse (6-normale Salzsäure, 110⁰C, 24 Stunden):
Arg 2,07(2); Ser 033(1); Pro 2,90(3); GIy 1,00(1); Phe 1,95(2); durchschnittliche Rückgewinnung 100%

(11) Herstellung von H-Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg-OH (d. h. Bradykinin)
durch Entfernung der MBS-Gruppe mit Methansulfonsäure

280 mg (0,2 mMol) H-Arg(MBS)-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Phe-Arg(MBS)-OH werden in einem Gemisch aus 0,12 ml Anisol und 3,0 mi Methansulfonsäure gelöst, worauf das Gemisch 40 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt wird. Äther wird zugesetzt und die resultierende ölige Substanz durch Abdekantieren gewonnen. Die ölige Substanz wird gut mit Äther gewaschen und in Wasser gelöst Die Lösung wird durch eine Säule (2^ χ 10 cm) mit Amberlite^eIRA-410 (Acetatform) geleitet, um einen Ionenaustausch zu bewirken. Die ausströmenden Flüssigkeiten werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausbeute 233 mg.

Das erhaltene Pulver wird in Wasser gelöst und die Lösung in eine Säule (Z5 χ 12,0 cm) mit Carboxymethylcellulose gegossen, die mit 0,01-normalem Ammoniumacetat gewaschen wird. Die Eluierung erfolgt nach der linearen Gradientenmethode mit 500 ml 0,01-normalem Ammoniumacetat und 500 ml 03-normalem Ammoniumacetat. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausbeute 178 mg. Die Reinigung wird unter den gleichen Bedingungen wiederholt. Ausbeute 170 mg, [«] ¹S -80,8° (c=0,49, Wasser). Aminosäureanalyse (6-normale Salzsäure, 110° C, 24 Stunden):
Arg 2,03(2); Ser 0_r96( 1); Pro 3,03(3); GIy 1,00(1); Phe 2,02(2);
durchschnittliche Rückgewinnung 943%.
Papierelektrophorese: pH = 13 (Acetatpuffer) —4,2 cm.
Dünnschichtchromatographie:

Rt = 0.11 (Lösungsmittel: Äihviaceiai/n-Butanol/Essigsäüre/Wasscr=! :!:!:!)
Rr = 0.72 (Lösungsmittel: n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser = 30 :20 :6 :24)

Beispiel 7

Herstellung eines Inhibitors für das Angiotensin I in Angiotensin 11 überführende Enzym,
der der Formel PyrGlu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-lle-Pro-Pro-OH entspricht

(1) Herstellung von Z-lle-Pro-Pro-O'Bu

11,6 g(0,03 Mol) Z-Pro-Pro-O'Bu werden in Methanol 8 Stunden lang über Palladiumschwarz hydriert, worauf der Katalysator abfiltriert wird. Die Reaktion von H-Pro-Pro-O'Bu, das durch Einengen des Filtrates hergestellt wird, und Z-IIe-ONB, das durch Kondensieren von 7.96 g (0,03 Mol) Z-IIe-OH mit 5.40 g (0,03 Mol) HONB und 6,19 g (0,03 Mol) DCC hergestellt wird, wird in 80 ml Dioxan 7 Stunden lang bei 8O⁰C ausgeführt. Das Dioxan

wird verdampft und der Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat und 0.2-normaler Salzsäure gewaschen. Nach Verdampfen des Äthylacetats wird der ölige Rückstand durch Säulenchromatographie an Kieselgel mit Chloroform gereinigt. Ausbeute 12.0 g (77,4%) einer öligen Substanz.

(2) Herstellung von Z-Gln-Ile-Pro-Pro-O'Bu

12,0 g (0.0233 Mol) Z-lle-Pro-Pro-0 Bu werden in Methanol 8 Stunden lang über Palladiumschwar/. hydriert. Das resultierende H-lle-Pro-Pro-O'Bu (6,5 g, 0,0233 Mol) und 4,17 g (0,0233 Mol) HONB werden in 50 ml Dimethylformamid gelöst, worauf die Lösung unter Kühlen auf 0⁰C mit 4,81 g (0,0233 Mol) DCC versetzt wird. Das |

Gemisch wird 12 Stunden lang gerührt. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat mit s

Wasser verdünnt, worauf mit Äthylacetat extrahiert wird. Die Äthylacetatschicht wird mit 0.2-normalcr Salzsiiu- jJ

re und 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat gewaschen, getrocknet und destilliert, um das Äthylacetal /u ^fy

verdampfen. Der ölige Rückstand wird mit Petroläther versetzt, wobei sich Kristalle bilden. Die Kristalle werden i|j

durch Filtration isoliert und in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 2.5 ml N.N-Dimethylaminopropylumin 'ά

versetzt, worauf man das Gemisch 3 Stunden lang stehen läßt. Die Äthylacetatschicht wird mit 0.2-normalcr , _;

Salzsäure gewaschen und das Äthylacetat verdampft. Der Rückstand wird mit Pctroläihcr verrieben. Das '.;

resultierende Pulver wird durch Filtration isoliert und aus Äthanol umkristullisicrt. Ausbeute 3,8 g(2^l5,j%), Smp. £j

98 bis 100°C.[λ] 0 -82.2° (r=0,69. Dimethylformamid). ϊ\

10 ;l

KlemcnlaranalysefürCjjH^iOgNs · '/2HiO
Berechnet: C 60,72; H 7,72; N 10,73
Gefunden: C 6038; H 7,57; N 10,69

(3) Herstellung von Z-Arg(MBS)-Pro-0^!Bu

10,0 g (0.03 MoI) Z-Pro-O'Bu werden in herkömmlicher Weise über Palladiumschwarz hydriert, um H-Pro-O'Bu herzustellen. Das oben hergestellte H-Pro-O'Bu sowie Z-Arg(MBS)-OH. das aus 21,0 g (0,03 Mol) Z-Arg(MBS)-OH - DCHA - CH₃CN hergestellt wurde, und 5,4 g (0,03 MoI) HONE werden in 50 ml Dio^an gelöst; 62 g (0,03 Mol) DCC werden zugesetzt, worauf das Gemisch in einem kalten Raum bei 4° C 48 Stunden lang gerührt wird. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat destilliert, um das Dioxan zu verdampfen. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst Die Lösung wird mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat und 0,2-normaler Salzsäure gewaschen, getrocknet und destilliert, um das Äthylacetat zu verdampfen. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben, worauf die resultierenden Kristalle zweimal aus 50°/o:gem Äthanol umkristallisiert werden. Ausbeute 13,0 g (69,0%), Sn;p. 137 bis 139°C, [λ] i' -28,0° (c=0,53. Dimethyl- is formamid).

Elementaranalyse für C30H41O8N5S
Berechnet: C 57,04; H 644; N 11,09; S 5.07
Gefunden: C J6.70; H 6,67; NlUO; S 5,10

(4) Herstellung von Z-Pro-Arg(MBS)-Pro-O'Bu

12.6 g (0,02 Mol) Z-Arg(M BS)-PrO-O¹Bu werden nach dem herkömmlichen Verfahren 16 Stunden lang in Methanol hydriert. Das oben hergestellte H-Arg(MBS)-Pro-O'Bu und 8,2 g (0,02 Mol) Z-Pro-ONB werden in 100 ml Dioxan gelöst, worauf die Lösung 3 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wird. Das Dioxan wird verdampft und der Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat und 0,2-normaler Salzsäure gewaschen, getrocknet und destilliert, um das Äthylacetat zu verdampfen. Der Rückstand wird mit Äther verrieben und das resultierende Pulver aus einem Gemisch aus Äthylacetat und Äther umgefällt. Ausbeute 123 g (84,2%), Smp. 90 bis 95° C (Zersetzung), [>] 2 - 55,2° (c= 0,54, Dimethylformamid).

Elemeniaranalyse für dsW-wOgNf,^
Berechnet: C 57,60; H 6,77; N 11,52; S 439
Gefunden: C 57,40; H 6,77; N J UO; S 4,27

(5) Herstellung von Z-Trp-Pro-Arg(MBS)-Pro-O'Bu

11.7 g (0.016 Mol) Z-Pro-Arg(MBS)-Pro-O'Bu werden in Methanol gelöst und nach dem herkömmlichen Verfahren hydriert. Das oben hergestellte H-Pro-Arg(MBS)-Pro-O'Bu sowie Z-Trp-ONB, i<as aus 5,4 g (0,016 Mol) Z-Trp-OH hergestellt wurde, 2,9 g (0,016 Mol) HONB und 33 g (0,016 Mol) DCC werden in 150 ml Dioxan gelöst. Die Lösung wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Dioxan wird im Vakuum verdampft und der Rückstand in Äthylacetat gelöst. Di·; Äthylacetatschicht wird mit 5%igem wäßrigem Natriumbicarbonat und 0.2-normaler Salzsäure gewaschen und getrocknet. Das Äthylacetat wird verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Das resultierende Pulver wird in Äthylacetat gelöst und dann mit N.N-Dimethylaminopropylamin versetzt. Man läßt das Gemisch 1 Stunde lang stehen und wäscht die Äthylacetatschicht mit 0,2-normaler Salzsäure. Nach dem Verdampfen des Äthylacetats wird der Rückstand mit Äther verrieben und das resultierende Pulver durch Filtration isoliert. Ausbeute 11,5 g (79,0%), Smp. 120 bis 125° C (Zersetzung), [λ] V - 53,5" (c= 0,54, Dimethylformamid).

Elcmentaranalyse für C₄OH₅₈Oi₀N₈S · V₂H₂O Berechnet: C 59,7?; H 6.43; N 12,13; S 3,47
Gefunden: C 59,73; H 6,37; N 11,90; S 3,43

(6) Herstellung von PyrGlu-Trp-Pro-Arg(MBS)-Pro-OH

9,15 g (0,01 Mol) Z-Trp-Pro-Arg(MBS)-Pro-O'Bu werden in Methanol nach dem herkömmlichen Verfahren hydriert.

Das resultierende H-Trp-Pro-Arg(MBS)-Pro-O'Bu, 1,29 g (0,01 Mol) PyrGlu-OH) und 1,79 g (0,01 Mol) HONB werden in 30 ml Dimethylformamid gelöst. Bei 0°C werden 2,06 g (0,01 Mol) DCC zugesetzt, worauf das Gemisch 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wird. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Dimethylformamid im Vakuum verdampft. Wasser wird zugesetzt und die resultierende ölige Substanz durch Dekantieren gewonnen. Die ölige Substanz wird in Äthanol gelöst und mit Wasser versetzt. Die resultierende ölige Substanz wird wieder durch Dekantieren gewonnen. Die ölige Substanz wird in Äthanol gelöst und mit Äthylacetat versetzt. Das resultierende Pulver wird in 80 ml Trifluoressigsäure, die 1 ml Thioglycolsäure und 4 ml Anisol enthalten, gelöst, worauf man die Lösung 40 Minuten lang bei Raumtemperatur stehen läßt. Der größte Teil der Trifluoressigsäure wird im Vakuum verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben, worauf das resultierende Pulver durch Filtration isoliert wird. Ausbeute 7,8 g (83.8%), Smp. 130 bis 135⁰C (Zersetzung), [λ] ο -29,2° (c=0,60, Dimethylformamid).

Elementaranalyse für C59H49O10N9S

Berechnet: C 53,72; H 6,12; N 14.46; S 3,68
Gefunden: C 53,68; H 5.84; N 1333; S 3,40

(7) Herstellung von PyrGlu-Trp-Pro-ArgiMBSJ-Pro-Gln-IIe-Pro-Pro-O'Bu

1,29 g (0,002 Mol) Z-Gln-Ile-Pro-Pro-O'Bu werden in Gegenwart von 1 Äquivalent Salzsäure in Methanol der herkömmlichen katalytischen Hydrierung unterworfen. Das resultierende H-GIn-IIe-Pro-Pro-O'Bu - HCI, 1,67 g (0,002 MoI) PyrGIu-Trp-Pro-Arg(MBS)-Pro-OH, 537 mg (0,003 Mol) HONB und 0.26 ml (0,002 MoI) N-Äthylmorpholin werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst Bei 0⁰C werden 495 mg (0,0024 Mol) DCC zugesetzt, worauf das Gemisch in einem kalten Raum 12 Stunden lang bei 4°C und bei Raumtemperatur 3 Tage !ang gerührt wird. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt Der Rückstand wird mit Äther verrieben und das resultierende Pulver durch Säulenchromatographie an Kieselgel (3,0 χ 22,0 cm) mit dem Elutionsmittel »Rf²« (Äthylacetat/Pyridin/Essigsäure/Wasser=60 :20 :6 :11) gereinigt Ausbeute 2,2 g (83%), Smp. 175 bis 178° C (Zersetzung), [λ] ²S -68,1°(c=036, Dimethylformamid).

(8) Herstellung von PyrGlu-Trp-Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro-OH
durch Entfernung der MBS-Gruppe mit Methansulfonsäure

266 mg PyrGlu-Trp-Pro-Arg(MBS)-Pro-Gln-IIe-Pro-Pro-0'Bu werden in einem Gemisch ?us 0,12 ml Anisol, 0,05 m! Thioglycolsäure und 3,0 ml Methansulfonsäure gelöst Die Lösung wird bei Raumtemperatur 30 Minuten lang gerührt und mit Äther versetzt Die resultierende ölige Substanz wird durch Dekantieren gewonnen und gut mit Äther gewaschen. Die ölige Substanz wird in Wasser gelöst und die Lösung durch eine Säule (2,5 χ 12,0 cm) mit Amberlite³! IRA-410 (Acetatform) geleitet, um einen Ionenaustausch auszuführen. D'.z ausströmende Flüssigkeit wird mit 20 ml 1 -normalem Ammoniumacetat versetzt und die gemischte Lösung auf eine Säule (2,5 χ 10,0 cm) mit Amberlite® XAD-2, die mit 100 ml 0,0i-normalem Ammoniumacetat gewaschen wird, aufgebracht. Das Eluieren erfolgt nach der linearen Gradienteneluierungsmethode mit 500 ml 0,01-normalem Ammoniumacetat und 500 ml 5O°/oigem Äthanol, die 03% Essigsäure enthalten. Ausbeute 130 mg. Das erhaltene Produkt wird in 0,01-normalem Ammoniumacetat gelöst und die Lösung durch eine Säule '2,5 x 10 cm) mit Carboxymethylcellulose geleitet. Die ausströmende Flüssigkeit wird vereinigt und gefriergetrocknet Aubeute 125 mg, [a] % - 160.4° (c= 0,48, Wasser). Aminosäureanalyse (6-normaIe Salzsäure, 110° C, 24 Stunden):
Arg 1,02(1), Trp 0,90(l);Glu 2,10(2); Pro 336(4); iie 1,02(1);
durchschnittliche Rückgewinnung 91,0%.
Dünnschichtchromatographie:

Rf = 0.67 (Elutionsmitteisystem: n-Butanoi/Pyridin/Essigsäure/Wasser=30 :20 :6 :24)

(8') Herstellung von PyrGIu-Trp Pro-Arg-Pro-Gln-Ile-Pro-Pro-OH
durch Entfernung der MBS-Gruppe mit Fluorsulfonsäure

266 n.g PyrGlu-Trp-Pro-ArgiMBSJ-Pro-GIn-Ile-Pro-Pro-O'Bu werden in einem Gemisch aus 0,12 ml Anisol, 0,03 ml Thioglycolsäure und 3,0 ml Fluorsulfonsäure gelöst Die Lösung wird 30 Minuten lang bei Raumtemperatur gerührt und mit Äther versetzt. Die sich ausscheidende ölige Substanz wird durch Dekantieren gewonnen, gut mit Äther gewaschen und in Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule (2,5 χ 12,0 cm) mit Amberlitc® IRA-410 (Acetatform) geleitet, um einen Ionenaustausch auszuführen. 120 ml 1-normales Ammouiumaceiat werden zu der ausströmenden Flüssigkeit gegeben, worauf das Gemisch auf eine Säule (2,J χ 10,0 cm) mit Amberiite® XAD-2, die mit 100 ml 0,01-normalem Ammoniumacetat gewaschen wird, aufgebracht wird. Das Eluieren erfolgt nach der linearen Gradientenmethode mit 500 ml 0,01-normalem Ammoniumacetat und 500 ml 50%igem Äthanol, die 0,5% Essigsäure enthalten. Ausbeute 130 mg. Die erhaltene Substanz wird in 0,01 -normalem Ammoniumacetat gelöst und die Lösung durch eine Säule (2,5 χ 10 cm) mit Carboxymethylcellulose geleitet.

Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausbeute 125 mg, [«] I³ - 159,3° (C= 0.60. Wasser).

Aminosäureanalyse (6-normale Salzsäure, 110° C, 24 Stunden):
Arg l,01(1);Trp0,89(l);Glu 1,98(2); Pro4,00(4);lie I₁OO(IV
durchschnittliche Rückgewinnung 90,2%.

Dünnschichtchromatographie:

Rf = 0,67 (Lösungsmittel: n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/Wasser = 30 : 20 :6 : 24).

(8") Herstellung von PyrGlu-Trp-Pro-Arg-Pro-Glp-lle-Pro-Pro-OH
durch Entfernung der MBS-Gruppe mit Bortristrifluoracetat

266 mg (0,2 mMol) PyrGIu-Trp-Pro-Arg(MBS)-Pro-Glu-lle-Pro-Pro-0'Bu werden in 30 ml Trifluoressigsäurc gelöst, worauf die Losung bei O⁰C 1 Stunde lang mit 75 Äquivalenten BTFA behandelt wird. Die Trifluoressigsäure wird im Vakuum verdampft und der Rückstand in 100 ml Wasser gelöst, worauf das unlösliche Material abfiltriert wird. Das Filtrat wird gefriergetrocknet und der dabei erhaltene Rückstand in einer kleinen Menge Wasser gelöst Die Lösung wird auf einer Säule (2,Ox 10,0cm) mit Amberlite® iRA-410 (Acetatform) dem Ionenaustausch unterworfen. Die ausströmende Flüssigkeit (200 ml) wird mit 1,5 g Ammoniumacetat versetzt und das Gemisch auf eine Säule (2,5 χ 14,0 cm) mit Amberlite® XAD-2, die mit 100 ml 0,01-molarem Ammoniumacetat gewaschen wild, aufgebracht. Das Eluieren erfolgt nach der exponentiellen Gradienleneluierungsmctho-

dc mit 1000 ml 0,01-molarem Ammoniumacetat und 1000 ml 50%igem Äthanol, die 0.5% Essigsaure enthalten. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt, worauf das Äthanol verdampft wird. Der Rückstand wird gcfriergei rock net und der dabei erhaltene pulvrige Rückstand in Wasser gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule (2,0 χ 7,5 cm) mit carboxymethylcellulose geleitet. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausbeute I30mg.[*]o' -152,8° (c=0,19, Wasser).

Aminosäureanalyse(6-normale Salzsäure, 110"C, 24 Stunden):

Arg 1.02(1);T>p 0,94(1);GIu 2,04(2); Pro 3,98(4); He 1,00(1);

durchschnittliche Rückgewinnung 92,0%.

Beispiele

Herstellung von GnRH [d. h. PyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH:]
(1) Herstellung von Z-Arg(MBS)-Pro-OH

(a) Das Z-Arg(MBS)-OH, das aus 14,0 g (0,02 Mol) Z-Arg(MBS)-OH · DCHA ■ CH₃CN hergestellt ist, und 4,0 g (0,022 Mol) HONB werden in 100 ml Dioxan gelöst. Unter Kühlen werden 4,33 g (0,021 Mol) DCC zugesetzt, worauf das Gemisch über Nacht bei 4⁰C gerührt wird. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert. Das Füii-ai wird mit einer Lösung von M-Pro-OMe. das aus 4,98 g (0,03 Mol) H-Pro-OMe · HCI und 4,2 ml (0,03 Mol)Triethylamin hergestellt wurde, in 100 ml Dimethylformamid kombiniert, worauf das Ciemisch 2 lage lang bei Raumtemperatur gerührt wird. Nach dem Verdampfen des Dioxans wird das zurückbleibende Dimethylformamid mit Wasser verdünnt, worauf das resultierende öl mit Äthylacetat extrahiert wird. Die Äthylacetatschicht wird mit 5%igem wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und mit 0,2-normaler Salzsäure gewaschen, worauf 2.5 m! N.N-Dimethylaminopropylamin zugesetzt werden. Man läßt das Gemisch 1 Stunde lang stehen. Die Äthylacetatschicht wird mit 1 -normaler Salzsäure gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Durch Verdampfen des Äthylacetats erhält man 10 g einer öligen Substanz.

Die ölige Substanz wird in 100 ml Methanol gelöst und mit 50 m! 1-normaler Natronlauge versetzt. Man läßt das Gemisch 4 Stunden lang bei Raumtemperatur stehen. Eine entsprechende Menge Zitronensäurekristalle wird zugesetzt, um das Gemisch anzusäuern, worauf das Methanol Utirch Verdampfen entfernt wird. Der ölige Rückstand wird mit Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen, getrocknet und der Destillation im Vakuum unterworfen. Der ölige Rückstand wird durch Säulenchromatographie an Kieselgel (Lösungsmittel: Chloroform, Säule 6.Ox 15,0 cm) gereinigt. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und eingeengt. Der Rückstand wird mit Äther verrieben, wobei die gewünschte Verbindung als Pulver erhalten wird. Ausbeute 3.5 g(30,5%), Smp.90,0 bis93,0° (Zersetzung),[λ]? - 27,5° (c= 0,59, Methanol).

35 Elemcntaranalyse für C26H JjOeNsS · H₂O

Berechnet: C 52.60; H 5.94; N 11,80; S 5.40

Gefunden: C 52,64; H 5.56: Nii.2i: S 5.43

(b) 400 mg Z-Arg(MBSVPro-O¹ Bu werden in Trifluoressigsäure gelöst, worauf man die Lösung 45 Minuten lang bei Raumtemperatur beläßt. Nach dem Verdampfen des größten Teiles der Trifluoressigsäure wird der ölige Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und getrocknet. Nach dem Verdampfen des Athylacetats im Vakuum wird der ölige Rückstand mit Äther verrieben, wobei ein Pulver erhalten wird. Ausbeute 310 mg. Smp. 93.0 bis 95,0°C, [λ]? - 29,2° (c=0,55. Methanol).

45 ElemeritaranalysefürCjeHjjOgNjS · H2O

Berechnet: C 52.60; H 5.94; N 11,80; S 5,40
Gefunden: C 52.64; H 5.56; N 11.69; S5.I7

(2) Herstellung von Z-Arg(MBS)-Pro-Gly-NH₂

3,45 g (6 mMol) Z-Arg(MBS)-PrO-OH und 1.29 g (7,2 mMol) HONB werden in Dioxan gelöst, worauf unter Kühlung 1.36 g (6,6 mMol) DCC zugesetzt werden. Das Gemisch wird 5 Stunden lang gerührt und der gebildete Dicyclohexylharnstoff durch Filtrieren entfernt; das Filtrat wird mit 740 mg (10 mMol) H-GIy-NH? versetzt und das Gemisch über Nacht gerührt. Das Dioxan wird verdampft und der ölige Rückstand in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 5%igem Natriumbicarbonat und mit 0.2-normaler Salzsäure gewaschen und getrocknet. Das Äthylacetat wird verdampft und der ölige Rückstand mit Petroläther verrieben. Das resultierende Pulver wird aus Äthylacetat und Petroläther umgefällt Ausbeute 2,8 g (74,0%), Smp. 90 bis 95,0° C (Zersetzung), [λ] ο - 192° (c= 0.53, Methanol).

Elementaranalyse für C28H3-O8N7S

Berechnet: C 53,24; H 5,90; N 1532: S 5,08
Gefunden: C 5335; H 6.32; N 1437; S 4,40

(3) Herstellung von Z-Leu-Arg(MBS)-Pro-Gly-NH2

2,7 g (0.0042 Mol) Z-Arg(MBS)-Pro-Gly-NH2 werden in 50 ml Methanol gelöst und bei Raumtemperatur 8 Stunden lang der katalytischen Hydrierung über Palladiumschwarz unterworfen. Das Methanoi wird verdampft

und der ölige Rückstand in 50 ml Dioxan gelöst. Diese Lösung wird mit Z-Leu-ONB, das aus 11,11 g (0,0042 Mol) Z-Leu-OH, 752 mg (0,0042 Mol) HONB und 866 mg (0,0042 Mol) DCC hergestellt ist, versetzt und das Gemisch über Nacht gerührt. Das Dioxan wird im Vakuum verdampft und der ölige Rückstand mit einem Gemisch aus Äthyiacetat und n-Butanol (1:1) extrahiert. Die organische Schicht wird mit 5%igem Natriumbicarbonat und mit 0,2-normaler Salzsäure gewaschen und getrocknet. Das Lösungsmittel wird verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Das resultierende Pulver wird zweimal aus Äthylacetat umgefällt. Ausbeute 2,2 g (70,3%), Smn. 125,0 bis 130.0°C, [λ] Ό³ - 35,6° (c= 0,57, Methanol).

Elementaranalyse für C34H4QO9N8S · ¹A HjO
to Berechnet: C 54,10; H 6,68; N 14,84; S 4,25
Gefunden: C 54,18; H 6,52; N 14,68; S 4,33

Aminosäureanalyse (6-normale Salzsäure, 110⁰C, 24 Stunden):

Arg 1,03(1); Pro 1.00(1); GIy 0,97(1); Leu 0,93(1);
durchschnittliche Rückgewinnung 98,0%.

(4) Herstellung von PyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(MBS)-Pro-Gly-NH₂

1,34 g (1,8 mMol) Z-Leu-Arg(MBS)-Pro-Gly-NH₂ werden in 70 ml Methanol gelöst und 8 Stunden lang der katalytischen Hydrierung über Palladiumschwarz unterworfen. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der ölige Rückstand wird über Nacht in einem Exsikkator im Vakuum getrocknet und in 20 ml Dimethylformamid gelöst. Diese Lösung wird mit 1,37 g (1,8 mMol) PyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-OH und 645 mg (3,6 mMol) HONB versetzt und das Gemisch auf - 1O⁰C abgekühlt. 743 mg (3,6 mMol) DCC werden zugesetzt, worauf das Gemisch über Nacht gerührt wird. Der gebildete Dicyclohexylharnstoff wird abfiltriert und das Filtrat im Vakuum destilliert. Der Rückstand wird mit Acetonitril versetzt. Das resultierende Pulver wird durch Filtration isoliert und zweimal durch Umfällungen aus Äthanol gereinigt. Ausbeute 1,78 g (73,0%), Snip.

180 bis 185°C (Zersetzung), [λ] ³S -27,4° (c= 1,07. DMF).

Elementaranalyse für C₆2H₈iOi6Ni₇S ■ HjO
Berechnet: C 54,33; H 6,10; N 17,38; S 2,34
Gefunden: C 54.47; H 6.23: N 16,64; S 2,27

(5) Herstellung von PyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂(d. h. GnRH)

676 mg (0.5 mMol) PyrGlu-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg(MBS)-Pro-Gly-NH2 werden zu einem Gemisch aus 7 ml Methansulfonsäure, 0,5 ml Anisol und 0,05 ml Thioglycolsäure gegeben, worauf das Gemisch 1 Stunde lang bei Raumtemperatur gerührt wird. Äther wird zugesetzt und die resultierende öiige Substanz durch Dekantieren mit Äther gewaschen. Die ölige Substanz wird in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung durch eine Säule (2,5 χ 10,0 cm) mit Amberlite³ I RA-410 (Acetatform) geleitet. Die ausströmende Flüssigkeit (200 ml) wird in eine Säule (2,5 χ 14,0 cm) mit Carboxymethylcellulose gegossen, die mit 500 ml 0,005-molarem Ammoniumacetat eluiert wird. Das Eluieren erfolgt nach der linearen Gradienteneluierungsmethode mit 500 ml 0,005-molarcm Ammoniumacetat und 500 ml 0,2-molarem Ammoniumacetat. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und auf eine Säule (2.5 :< 12,0 cm) mit Amberlite® XAD-2 aufgebracht. Die Säule wird mit 200 ml 0,005-molarcm Ammoniumacetat gewaschen und nach der linearen Gradientenmethode mit 500 ml 0,005-molarem Ammoniumacetat und 500 ml 60%igem wäßrigem Äthanol eluiert. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt, worauf das Äthanol verdampft wird. Der Rückstand wird gefriergetrocknet und der dabei erhaltene Rückstand in 0,1-molarer Essigsäure gelöst. Die Lösung wird durch eine Säule (3 χ 130 cm) mit Sephadex LH-20 geleitet, worauf die gewünschten Fraktionen vereinigt und gefriergetrocknet werden. Ausbeute 375 mg, [λ] " -50.5" (c= 0,49,5% wäßrige Essigsäure).

so Aminosäureanalyse (6-normale Salzsäure, 110⁰C, 24 Stunden);

His0.96(l);Arg0.96(l)_:Trp0,83(l);Ser0,89(l);Glu 1.06(1); Pro 1,02(1);
GIy 2.06(2); Leu 1,00(1 );Tyr 1,00(1); durchschnittliche Rückgewinnung 89,0%.
Die Verbindung zeigt die gleichen chemischen und biologischen Eigenschaften wie eine authentische Probe.

B e i s ρ i e 1 9

Herstellung von Tuftsin
(1) Herstellung von Z-Pro-Arg(MBS)-OH

2,76 g (8 mMol) H-Arg(MBS)-OH werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst, worauf man unter Kühlung 1,12 ml (8 mMol) Triäthylamin und danach 3,28 g (8 mMol) Z-Pro-ONB zusetzt Das Gemisch wird 6 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Das Gemisch wird mit 1,5 ml Esssigsäure versetzt und das Dimethylformamid im Vakuum verdampft. Der ölige Rückstand wird in Äthyiacetat gelöst und die Äthylacetatschicht dreimal mit Wasser gewaschen. Das Äthyiacetat wird im Vakuum verdampft- Der öiige Rückstand wird mit Äther verrieben und aus einem Gemisch aus Chloroform und Äther umgefällt. Ausbeute 33 g (85,0%), Smp. 80,0 bis 85,0" C (Zersetzung),[ä]? - 163° (c=0,58, DMF).

F.lcmcntaianalyse fürCjbHjjOgNiS ■ '/j H2O
Berechnet: C 53,41; H 5.86; N 12,00; S 5.49
Gefunden: C 53,37; H 5,78; N 11.66; S 5,20

(2) Herstel!ungvonBOC-Lys(Z)-Pro-Arg(MBS)-OH

3,46 g (6 mMol)Z-Pro-Arg(MBS)-OH werden in 100 ml eines Gemisches aus Methanol, Wasser und Essigsäure (6 : 3 : I) gelöst und 8 Stunden lang der katalytischen Hydrierung über Palladiumschwarz unterworfen. Der

■ Katalysator wird entfernt und das Filtrat im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird mit Wasser versetzt und

das Wasser im Vakuum verdampft. Dieses Verfahren wird dreimal wiederholt, um die Essigsäure zu entfernen. Der Rückstand wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst, worauf 0,84 ml (6 mMol) Triäthylamin und 3,36 g (bmMol) BOC-Lys(Z)-OTcp zugegeben werden. Das Gemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. 2 ml Essigsäure werden zugesetzt, worauf das Dimethylformamid im Vakuum verdampft wird. Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatschicht wird dreimal mit Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum destilliert, um das Äthylacetat zu verdampfen. Der Rückstand wird durch Säulenchromatographic über Kieselgel [Säule 6,0 χ 6,0 cm. Lösungsmittel Chloroform/Methanol (97 :3)] gereinigt. Ausbeute 3,4 g

Λ (70.90/0).Smp. 103.0 bis 109°C(Zersetzung),[λ]M - 19,4" (c=0,70, DMF).

•i illcmcniaranalysc für C₃₇HOiO_nN₇S · V₂ H_:O

■■■ Berechnet: C 54,67; H 6,69; N 12,06; S 3,94

',; Gefunden: C 54,72; H 6.70; N 11,78; S 3.80

'■■ (3) Herstellung von Z-Thr-Lys(Z)-Pro-Arg(MBS)-OH

a 1,86 g (2.3 mMol) BOC-Lys(Z)-Pro-Arg(MBS)-OH werden in 10 ml Trifluoressigsäure gelöst, worauf die Lö-

-' sung 20 Minuten lang bei 10°C gerührt wird. Der größte Teil der Trifluoressigsäure wird im Vakuum verdampft

i; und Äther zugesetzt. Der resultierende Niederschlag wird durch Filtration isoliert und getrocknet. Das Produkt

Ji wird in 10 ml Dimethylformamid gelöst, worauf 0,64 ml (4,6 mMol) Triäthylamin unter Kühlen mit Eis zugegeben

\ und dann 952 mg (2,3 mMol) Z-Thr-ONB zugesetzt werden. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur

ii gerührt. 2 ml Essigsäure werden zugegeben, worauf das Dimethylformamid im Vakuum verdampft wird. Der

S ölige Rückstand wird mit Äther versetzt. Das resultierende Pulver wird durch Filtration isoliert und aus einem

% Gemisch aus Äthylacetat und Äther umgefällt. Ausbeute 2,1 g (95,5%), Smp. 90,0 bis 95,0⁰C (Zersetzung), [λ] ?

^]4 - 15.3° (c·= 0,62, DMF).

S ElcmentaranalysefürC^HseOuNsS

Berechnet: C 56,28; H 6.23; N 11,93; S 3,42
Gefunden: C 55.99: H 6.22: N 11,56: S 3.36

(4) Herstellung von H-Thr-Lys-Pro-Arg-OH (d.h. Tuftsin)

1,88 g (2 mMol) Z-Thr-Lys(Z)-Pro-Arg(MBS)-OH werden bei Raumtemperatur 45 Minuten lang mit fnem Gemisch aus 1,0 ml Anisol und 17 ml Methansulfonsäure behandelt. Äther wird zugesetzt und die resultierende ölige Substanz unter Dekantieren gut mit Äther gewaschen. Die ölige Substanz wird in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung durch eine Säule (2,5 χ 10,0 cm) mit Amberlite® IRA-410 (Acetatform) geleitet. Die ausströmende Flüssigkeit (200 ml) wird auf eine Säule (2,5 χ 15,0 cm) mit Carboxymethylcellulose aufgebracht, die mit 500 ml Wasser gewaschen wird. Das Eluieren erfolgt nach der linearen Gradientenmethode mit 500 ml Wasser und 500 ml 0,2-molarem Ammoniumacetat. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Der dabei erhaltene Rückstand wird in 0,1-molarer Essigsäure gelöst und die Lösung durch eine Säule (3.Ox 130,0 cm) mit Sephadex® LH-20 geleitet. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausbeute 840 mg.j/tj? -60,2^c (c=0.55, 5%ige Essigsäure).
Aminosäureanalyse (6-normaie Salzsäure, 110° C. 24 Stunden):
Lys 1,01(1); Arg l,00(l);Thr0,99(1); Pro 1,06(1);
durchschnittliche Rückgewinnung 100%.
Das erhaltene Produkt zeigt eine starke chemotaktische Wirkung.

55 Beispiel 10

Herstellung von H-Thr-Lys-Arg-OH
(1) Herstellung von BOC-Lys(Z)-Arg(MBS)-OH

2,76 g (8 mMol) H-Arg(MBS)-OH werden in 15 ml Dimethylformamid gelöst, worauf unter Eiskühlung 1,12 ml (8 mMol) Triäthylamin zugesetzt und dann 4,48 g (8 mMol) BOC-Lys(Z)-OTcp zugegeben werden. Das Gemisch wird 48 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt 3 ml Essigsäure werden zugegeben, worauf das Dimethylformamid im Vakuum verdampft wird. Der ölige Rückstand wird in Äthylacetat gelöst und die Äthylacetatschicht mit Wasser gewaschen. Das Äthylacetat wird hn Vakuum verdampft und der Rückstand mit Äther verrieben. Das resultierende Pulver wird aus Acetonitril und Äther umgefällt. Ausbeute 4.8 g (84.4%), Smp. 95,0 bis 100° C (Zersetzung),[a]g -42° (c=0,69,DMF).

Elementaranalyse für C32H46O10N6S

Berechnet: C 54,38: H 6,56; N 11,89; S 4,54
Gefunden: C 54,06; H 6,49: N 11,84; S 4,48

(2) Herstellung von Z-Thr-Lys(Z)-Arg(MBS)-OH

4,24 g (6 mMol) BOC-Lys(Z)-Arg(MBS)-OH werden in 30 ml Trifluoressigsäure gelöst, worauf die Lösung 20 Minuten lang bei 1O⁰C gerührt wird. Der größte Teil der Trifluoressigsäure wird im Vakuum verdampft und Äther zugesetzt. Der resultierende Niederschlag wird durch Filtration isoliert und getrocknet. Das Produkt wird in 20 ml Dimethylformamid gelöst, worauf unter Eiskühlung 1,68 ml (12 mMo!) Triethylamin zugesetzt und dann 2,49 g (6 mMol) Z-Thr-ONB zugegeben werden. Das Gemisch wird 12 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. 3 ml Essigsäure werden zugegeben, worauf das Dimethylformamid im Vakuum verdampft wird. Der ölige Rückstand wird in Athylacetat gelöst. Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen und der Destillation im Vakuum unterworfen, um das Athylacetat zu verdampfen. Der ölige Rückstand wird mit Äther verrieben

und aus Athylacetat und Äther umgefällt. Ausbeute 4,7 g (93,1%), Smp. 77 bis 82,0⁰C (Zersetzung), [,x]" -0.9" (c=0,53, DMF).

y395ii27

Berechnet: C 55,63; H 6,11; ,N 11,65; S 3,8!
Gefunden: C 55,30; H 6,18: N 11,55; S 3,95

(3) Herstellung von H-Thr-Lys-Arg-OH

1,68 g (2 mMol) Z-Thr-Lys(Z)-Arg(MBS)-OH werden bei Raumtemperatur 45 Minuten lang mit einem Gemisch aus 1,0 ml Anisol und 17,0 ml Methansulfonsäure behandelt. Äther wird zugesetzt und die resultierende ölige Substanz gut mit Äther gewaschen. Die ölige Substanz wird in 10 ml Wasser gelöst und die Lösung durch eine Säule (2,5 χ 10,0 cm) mit Amberlite® lRA-410 (Acetatform) geleitet. Die ausströmende Flüssigkeit (200 ml) wird vereinigt und auf eine Säule (2,5 χ 15,0 cm) mit Carboxymethylcellulose aufgebracht, die mit 200 ml Wasser gewaschen wird. Das Eluie.en erfolgt nach der linearen Gradientenmethode mit 200 ml Wasser und 500 ml 0,2-molarem Ammoniumacetat. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Der dabei erhaltene Rückstand wird in 10 ml0,l-mo!arer Essigsäure gelöst und die Lösung durch eine Säule (3.0 χ 130,0 cm) mit Sephadex LH-20 geleitet. Die gewünschten Fraktionen werden vereinigt und gefriergetrocknet. Ausbeute 737 mg, [λ]? -8,8° (c=0.55.5%ige Essigsäure).
Aminosäureanalyse (6-normale Salzsäure, HO⁰C, 24 Stunden):
Lys 1,00(1); Arg 1,03(1); Thr 1,00(1); durchschnittliche Rückgewinnung 100%).

Claims (1)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung Arginylreste enthaltender Peptide, ausgehend von an der Guanidino-Gruppe geschützten Argininderivaten oder Argininpeptiden, dadurch gekennzeichnet, daß man

(A) das Guanidino-Gruppen enthaltende Ausgangsmaterial mit einem Halogenid einer Benzolsulfonsäure der allgemeinen Formel

X-SO₂