Uicile-Grahr.-

RAN 4105/35

Verfahren zur Herstellung von Thymosin g, und einem Analogen.

Thymosin α, ist ein hitzestabiles, stark saures Polypeptid aus 28 Aminosäureeinheiten der folgenden Sequenz:

5 10

H^C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-

·* 15 20

Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-

25
Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-OH. (I)

Dieses Peptid, das ein starkes immunpotenzierendes Mittel ist, wurde aus der Thymosinfraktion 5 durch Goldstein et al. durch eine Kombination von Ionenaustauschchromatographie und Gelfiltration isoliert (Proc. Natl. Acad. Sei. USA 7_4_£. 725-729 (1977)).

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Synthese von Thymosin α, und dessen [Asn !-Analogen sowie deren pharmazeutisch verträglichen Salzen durch Entfernung der Schutzgruppen aus einem geschützten Octacosapeptid der Sequenz

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Mez/ 12.4.78

1 7 3 1

H₃C-CO-Ser(R )-X-Ala-Ala-Val-Asp(OR )-Thr(R ) -Ser(R )-

Ser(R¹)-GIu(OR⁴)-Ile-Thr(R³)-Thr(R³)-Lys(R⁵)-Asp(OR²)-Leu-Lys(R⁵)-GIu(OR⁴)-Lys(R⁵)-Lys(R⁵) GIu(OR⁴)-Val-Val-Glu(OR⁴J-GIu(OR⁴)-Ala-Glu(OR⁴)-

Asn-OR⁶ . (H)

, worin X Asn oder Asp (OR );

R eine für die Hydroxygruppe des Serins

übliche Schutzgruppe;

R , R und R übliche Carboxylschutzgruppen; R eine für die Hydroxygruppe des Threonins

übliche Schutzgruppe und R eine für die ω-Aminogruppe des Lysins

übliche Schutzgruppe darstellen,

und allfällige üeberführung der erhaltenen Verbindung in ein pharmazeutisch verträgliches Salz.

Beispiele von R sind Benzyl, Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, 4-Brombenzyl, 2,6-Dichlorbenzyl und Benzyloxycarbonyl, v/obei Benzyl bevorzugt ist. Beispiele von

2 4 6
R , R und R sind Arylgruppen, insbesondere Phenyl oder durch Alkyl, Halogen, Nitro, Mercapto oder substituiertes Mercapto,wie Methylthio, substituiertes Phenyl; Aralkylgruppen wie Benzyl oder durch Methoxy, Halogen oder Nitro substituiertes Benzyl; Niederalkylgruppen wie Methyl, Aethyl, tert.-Butyl oder tert.-Amyl; substituierte Niederalkylgruppen wie 2-Haloäthyl, /3, /3-Dimethylaminoäthyl oder Cyanomethyl; Benzhydryl- und Phenacylgruppenr wobei Benzyl bevorzugt ist. Beispiele von R sind Benzyl, Acetyl, Benzoyl, tert.-Butyl, Trityl, 2,6-Dichlorbenzyl, 4-Brombenzyl und Benzyloxycarbonyl, wobei Benzyl bevorzugt ist.

Beispiel von R sind Benzyloxycarbonyl, das gegebenenfalls am aromatischen Ring durch 4-Chlor, 2-Brom, 4-Brom, 2,4-Dichlor, 4-Nitro, 4-Methoxy, 3,5-Dimethoxy, 4-Methyl, 2,5,6-Trimethyl, 4-Phenylazo, 4-(4-Methoxyphenylazo), 2-(N,N-Dimethylcarbamido) und 2-Nitro-4,5-dimethoxy substituiert sein kann/ Schutzgruppen vom Urethantyp v/ie 4-Toluolsulfonyläthyloxycarbonyl, 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl und

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-T-

verwandte, unter basischen Bedingungen abspaltbare Gruppen, 4-Benzisoxazolylmethylenoxycarbonyl, Methylthio- und Methylsulfonyläthyloxycarbonyl, Isonicotinyloxycarbonyl, HaIoäthyloxycarbonyl, Diisopropylmethyloxycarbonyl, Benzhydrylöxycarbonyl, Isobornyloxycarbonyl, Dinitrodiphenylmethyloxycarbonyl, tert.-Butyloxycarbonyl, tert.-Amyloxycarbonyl, Adamantyloxycarbonyl, Cyclopentyloxycarbonyl, Methylcyclobutyloxycarbonyl, Methylcyclohexyloxycarbonyl, 2-Arylisopropyloxycarbonyl-gruppen wie 2-(p-Biphenylyl)-isopropyloxycarbonyl, 2-(4-Pyridyl)-isopropyloxycarbonyl und ähnliche stickstoffhaltige Urethangruppenj Acylgruppen wie Formyl, Trifluoracetyl, phthaloyl, Benzolsulfonyl, Acetoacetyl, Chloracetyl, 2-Nitrobenzoyl, 4-Toluolsulfonyl, Sulfenylgruppen wie Benzolsulfenyl, o-Nitrophenylsulfenyl und ähnliche Sulfenylgruppen, sowie Aryl-niederalkyl-gruppen wie Diphenylmethyl und Triphenylmethyl, wobei die Benzyloxycarbonylgruppe bevorzugt ist.

Die Entfernung der Schutzgruppen aus dem geschützten Octacosapeptid der Sequenz I kann leicht nach an sich bekannten Methoden erfolgen, beispielsweise durch Behandlung mit wasserfreier Säure wie Fluorwasserstoff, vorzugsweise in Gegenwart von Anisol.

Das geschützte Octacosapeptid der Sequenz I kann erfindungsgemäss durch Kondensation eines geschützten Tetradecapeptids der Sequenz

H₃C-C0-Ser(R¹J-X-AIa-AIa-VaI-ASp(OR²)-Thr(R³)-Ser(R¹) Ser(R¹)-GIu(OR⁴)-Ile-Thr(R³)-Thr(R³)-Lys(R⁵)-OR II

mit einem geschützten Tetradecapeptid der Sequenz

Η-Asp(OR²)-Leu-Lys(R⁵)-GIu(OR⁴)-Lys(R⁵)-Lys(R⁵)-GIu(OR⁴)-VaI-VaI-GIu(OR⁴)-GIu(OR )-AIa-GIu(OR )-

6 HI

Asn-OR

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worin X, R , R , R , R , R und R wie oben definiert sind und R Wasserstoff oder eine aktivierende Gruppe darstellt,
hergestellt werden.

Die Kondensation kann nach Methoden, die aus der Flüssigphasen-Peptidsynthese gut bekannt sind, örfolgen. So kann, zum Beispiel, das Amino-endständige Tetradecapeptid mit 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) und Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) zu dem aktivierten Ester umgesetzt werden, den man dann mit dem Carboxy1-endständigen Tetradecapeptid zu dem gewünschten geschützten Octacosepeptid reagieren lässt.

Die geschützten Tetradecapaptide können nach an sich bekannten Methoden hergestellt werden.

So wurde das geschützte Carboxy1-endständige Tetradecapeptid I [X = Asp(OBzI)] nach folgender Strategie erhalten:

Zunächst wurde H-GIu(OBzI)-OH an Boc-Ala-OSu zu dem Dipeptidfragment Boc-Ala-Glu(OBzI)-OH gekoppelt, dass dann mit HCl · H-Asn-OBzl nach dem DCC/HOSu-Verfahren von Wünsch und Drees, Chem. Ber. £9, 110 (1966) kondensiert wurde. Das Hydrochloridsalz des Asparaginbenzylesters wurde aus Boc-Asn-OBzl hergestellt, das wiederum aus kommerziell erhältlichem Boc-Asn-0H und Benzylbromid nach der Cäsium-salzmethode synthetisiert wurde. Die Boc-Schutzgruppe wurde durch 30-minütige Behandlung mit 4N HCl in trockenem Tetrahydrofuran abgespalten.

Die Umsetzung von H-GIu(OBzI)-OH mit Boc-Glu(OBzI) OSu lieferte Boc-Glu(OBzI)-GIu(OBzI)-OH in Form eines farblosen klaren Oeles, das anschliessend für die Synthese des geschützten Pentapeptids Boc-Glu(OBzI)-GIu(OBzI)-AIa-GIu(OBzI)-Asn-OBzl verwendet wurde, wobei die Umsetzung in Gegenwart von DCC/HOSu mit HCl * H-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI

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stattfand, das aus Boc-Ala-Glu(OBzI)-Asn-OBzl durch Behandlung mit 4N HCl/THF gewonnen wurde. Das geschützte Pentapeptid wurde in reiner, kristalliner Form in guter Ausbeute erhalten.

Zur Herstellung des geschützten Octapeptids Boc-Glu-(OBzI)-Val-Val-Glu(OBzI)-GIu(OBzI)-Ala-Glu(OBzI)-Asn-OBzl wurde zunächst das geschützte Tripeptid Boc-Glu(OBzI)-VaI-VaI-OH hergestellt. Boc-Val-OSu wurde mit freiem Valin umgesetzt zu Boc-Val-Val-OH,'das nach Deblockierung mit 4N HCl in THF und anschliessende Reaktion mit Boc-Glu-(OBzI)-OSu das gewünschte Tripeptid in kristalliner Form als Cyclohexylaminsalz Boc-Glu(OBzI)-Val-Val-OH * CHA lieferte. Das Cyclohexylaminsalz wurde in die freie Säure übergeführt und dann mittels DCC in Gegenwart von HOSu mit HCl " H-Glu(OBzl)-Glu(OBzl)-Ala-Glu(OBzl)-Asn-OBzl, das aus Boc-Glu(OBzI)-GIu(OBzI)-Ala-Glu(OBzI)-Asn-OBzl durch Behandlung mit HCl in THF erhalten wurde, gekoppelt. Das geschützte Octapeptid BOC-GIU(OBZl)-VaI-VaI-GIu(OBzI)-GIu-(OBzI)-Ala-Glu(OBzI)-Asn-OBzl wurde in gereinigter Form als amorpher Feststoff erhalten und durch Hydrogenolyse sowie anschliessende Behandlung mit Trifluoressigsäure in der üblichen Weise in das freie Octapeptid Glu-Val-Val-GIu-GIu-AIa-GIu-Asn übergeführt. Es wurde gereinigt durch Ionenaustausch-Säulenchromatographie und lieferte ein dünnschichtchromatographisch und papierelektrophoretisch einheitliches Material.

Für die Herstellung des geschützten Undecapeptids Boc-Glu(OBzI)-Lys(Z)-Lys(Z)-GIu(OBzI)-Val-Val-Glu(OBz1)-GIu(OBzI)-Ala-Glu(OBzI)-Asn-OBzl wurde zunächst ein Tripeptid synthetisiert aus Boc-Lys(Z)-OSu und H-Lys(Z)-OH. Das erhaltene Dipeptid Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH wurde mit 4N HCl in THF behandelt und das erhaltene Salz HCl ♦ H-Lys(Z)-Lys(Z)-OH wurde dann mit Boc-Glu(OBzI)-OSu umgesetzt. Das so erhaltene Tripeptid Boc-Glu(OBzI)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH wurde mit DCC und HOSu aktiviert nach Weygand et al., Z. Naturforsch. 21b, 426 (1966) und die Lösung des in situ gebildeten aktivierten Tripeptidesters Boc-Glu(OBzI)-Lys(Z)-Lys(Z) -

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OSu wurde kombiniert mit dem Trifluoracetat von H-GIu-(OBzI)-Val-Val-Glu(OBzI)-GIu(OBzI)-Ala-Glu(OBzI)-Asn-OBzl, das aus dem entsprechenden geschützten Octapeptid durch 30-minütige Behandlung mit TFA erhalten wurde. Nach Zusatz einer geringen Menge einer Base wurde das gewünschte geschützte Undecapeptid BOc-GIu(OBzI)-LyS(Z)-LyS(Z)-GIu-(OBzI)-Val-Val-Glu(OBzI)-GIu(OBzI)-Ala-Glu(OBzI)-Asn-OBzl erhalten. Abspaltung der Schutzgruppen aus dem geschützten undecapeptid mit wasserfreier Flussäure lieferte das freie Undecapeptid Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn, das nach Ionenaustausch-Säulenchromatographie papierelektrophoretjsch einheitlich war.

Nach einem ähnlichen Schema erfolgte die Synthese des geschützten Tetradecapeptids Boc-Leu-OSu wurde an H-Lys(Z)-OH gekoppelt und lieferte Boc-Leu-Lys(Z)-OH.

Nach Entfernung der N^a-Boc-Gruppe mit 4N HCl in THF und Umsetzung mit Boc-Asp(OBzI)-OSu wurde das geschützte Tripeptid Boc-Asp(OBzI)-Leu-Lys(Z)-OH in kristalliner Form erhalten. Es wurde in den aktivierten Ester Boc-Asp-(OBzI)-Leu-Lys(Z)-OSu übergeführt und mit dem Trifluoracetat von H-GIU(OBZl)-LyS(Z)-LyS(Z)-GIu(OBzI)-VaI-VaI-GIu-(OBZI)-GIU(OBZl)-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI, erhalten durch Behandlung des entsprechenden geschützten Undecapeptids mit TFA, kondensiert. Das gewünschte Produkt, Boc-Asp-(OBzI)-Leu-Lys(Z)-GIu(OBzI)-Lys(Z)-Lys(Z)-GIu(OBzI)-Val- Val-Glu (OBzI) -GIu (OBzI) -Ala-Glu (OBzI) -Asn-OBzl, wurde in guter Ausbeute erhalten und war dünnschichtchromatographisch einheitlich. Das freie Tetradecapeptid Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn wurde aus der geschützten Verbindung durch Behandlung mit wasserfreier Flussäure und Reinigung an einer Ionenaustauschersäule erhalten.

In ähnlicher Weise wurde das geschützte Amino-endständige Tetradecapeptid H-C-CO-Ser(BzI)-Asp(OBzI)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH aus einem acetylierten Tetra-

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peptidfragment, einem Hexapeptid und einem weiteren Tetrapeptid unter Verwendung allgemein bekannter Methoden hergestellt.

Zur Herstellung des Amino-endständigen acetylierten Tetrapeptids wurde H₃C-CO-Ser(BzI)-OBzI aus H₃c-CO-Ser-(BzI)-OH und Benzylbromid nach der Cäsiumsalzmethode gewonnen. Die Hydrazinolyse von H_.C-C0-Ser (BzI)-OBzI lieferte H-. C-CO-Ser (BzI)-HNNH₂ in reiner kristalliner Form und in guter Ausbeute. Abspaltung der Schutzgruppe aus Boc-Ala-AIa-OH lieferte das Dipeptid-hydrochlorid HCl · H-Ala-Ala-OH. Die Kupplung dieses Dipeptids mit Boc-Asp(OBzI)-OSu lieferte das geschützte Tripeptid Boc-Asp(OBzI)-Ala-Ala-OH, das als Dicyclohexylamxnsalz isoliert wurde. Entfernung der Aminoschutzgruppe und Kondensation mit H^C-CO-Ser(BzI)-HNNH₂ nach der Azidmethode von Honzl und Rudinger, Collection Czech. Chem. Commun. 26.' ²³³³ (1961), lieferte das teilweise geschützte Tetrapeptid H₃C-C0-Ser(BzI)-Asp(OBzI)-Ala-Ala-OH, das mit einer äquivalenten Menge von Hydrazin in Gegenwart von DCC und HOBT das gewünschte H₃C-CO-Ser-(BzI)-ASp(OBzI)-AIa-AIa-HNNH₂ lieferte.

Zur Herstellung des geschützten Hexapeptids Boc-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-HNNH₂ wurde das Verfahren der stufenweisen Kettenverlängerung vom C-terminalen Ende her angewendet. So wurde H-GIu(OBzI)-OH mit Boc-Ser(BzI)-OSu zu dem geschützten Dipeptid Boc-Ser-(BzI)-GIu(OBzI)-OH gekoppelt, das, nach Entfernung der Boc-Schutzgruppe und Umsatz mit Boc-Ser(BzI)-OSu das Tripeptid Boc-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH lieferte. Abspaltung der Amino-Schutzgruppe und anschliessende Kondensation des erhaltenen Tripeptidssalzes HCl «■ H-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH mit Boc-Thr(BzI)-OSu lieferte das geschützte Tetrapeptid Boc-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH, von dem durch Behandlung mit HCl in THF die Boc-Schutzgruppe abgespalten wurde und das mit Boc-Asp(OBzI)-OSu zu dem geschützten Pentapeptid Boc-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser-(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH umgesetzt v/urde. Die Boc-Schutz-

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- tr-

gruppe dieser Verbindung wurde ebenfalls durch Behandlung mit HCl entfernt und das erhaltene Produkt HCl· H-Asp-(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH wurde anschliessend mit Boc-Val-OSu zu Boc-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH gekoppelt. Die Verbindung wurde in reiner kristalliner Form erhalten.

Die α-Carboxylgruppe des terminalen Glutaminsäurerestes im erhaltenen geschützten Hexapeptid wurde dann in eine Hydrazidfunktion durch Umsetzung mit einer äquivalenten Menge Hydrazin unter Verwendung von DCC als Kopplungsreagenz in Gegenwart von HOBT umgewandelt. Das gewünschte geschützte Hexapeptidhydrazid Boc-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-HNNH₂ wurde in reiner kristalliner Form in guter Ausbeute erhalten.

Das geschützte Tetrapeptid Boc-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH wurde ebenfalls stufenweise nach der N-Hydroxysuccinimidester-Methode von Anderson et al., J. Amer. Chem. Soc. 86, 1839 (1964), hergestellt.

Die Umsetzung von Boc-Thr(BzI)-OSu mit H-Lys(Z)-OH lieferte das Dipeptid Boc-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH in Form eines Oeles, das nach Abspaltung der σ-Aminoschutzgruppe mit Boc-Thr(BzI)-OSu weiter zu dem Tripeptid Boc-Thr(BzI)-Thr-(Bzl)-Lys(Z)-OH, einem kristallinen Produkt, umgesetzt wurde. Entfernung der Boc-Schutzgruppe und Umsetzung des · erhaltenen Materials, HCl* H-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH, mit Boc-Ile-OSu lieferte das gewünschte geschützte Tetrapeptid Boc-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH in reiner, kristalliner Form nach Chromatographie an einer Kieselgelsäule. Dieses geschützte Tetrapeptid wurde dann nach Abspal- '■ tung der Amino-endständigen Schutzgruppe mit dem geschützten Hexapeptid Boc-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI) GIu(OBzI)-HNNH₂ nach der Azidmethode kondensiert, wodurch das geschützte Decapeptid Boc-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser-(BzI) -Ser (BzI)-GIu (OBzI) -Ile-T.hr (BzI) -Thr (BzI) -Lys (Z)-OH

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in guter Ausbeute erhalten wurde.

Die Entfernung der Boc-Schutzgruppe aus dem Decapeptid mit TFA und anschliessende Kopplung an das N-terminale geschützte Tetrapeptid H C-CO-Ser(BzI)-Asp(OBzI)-AIa-AIa-HNNH₂ nach der Azidmethode lieferte das gewünschte geschützte Tetradecapeptid H₃C-CO-Ser(BzI)-Asp(OBzI)-Äla-Ala-Val-Asp-(OBzI) -Thr (BzI) -Se'r (BzI) -Ser (BzI) -GIu (OBzI) -Ile-Thr (BzI) Thr(BzI)-Lys(Z)-OH. In einer letzten Kopplungsreaktion wurde dieses Acetyltetradecapeptxd aktiviert mit DCC und HOBT und der erhaltene aktivierte Ester wurde dann mit TFA* Η-Asp(OBzI)-Leu-Lys(Z)-GIu(OBzI)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzI)-VaI-VaI-GIU(OBZI)-GIU(OBZl)-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI, das aus dem entsprechenden, an der endständigen Aminogruppe geschützten Tetradecapeptid durch Behandlung mit TFA gewonnen wurde, zu dem geschützten Acetyloctacosapeptid H₃C-C0-Ser-(BzI)-Asp(OBzI)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser-(BzI)-GIu(OBzI)-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-Asp(OBzI)-Leu-Lys(Z)-GIu(OBzI)-Lys(Z)-Lys(Z)-Glu(OBzI)-Val-Val-Glu(OBzI) GIu(OBzI)-Ala-Glu(OBzI)-Asn-OBzl umgesetzt. Nach Abspaltung aller Schutzgruppen mit wasserfreiem Fluorwasserstoff und Reinigung durch Ionenaustauschchromatographie wurde das Thymosin cc-, erhalten.

In ähnlicher Weise wurde aus dem geschützten Tetradecapeptid H₃C-C0-Ser(BzI)-Asp(OBzI)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzI) Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)- Lys(Z)-OH das freie Tetradecapeptid H-^C-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-OH gewonnen.

Nach dem gleichen Schema wie für das Thymosin α-, be-

2 schrieben, erfolgte die Synthese von [Asn ]-Thymosin α-,.

Mit Ausnahme des N-terminalen Acetyltetrapeptidhydrazids H₃C-C0-Ser(Bzl)-Asn-AIa-AIa-HNNH₂ wurden die gleichen Zwischenprodukte verwendet. Dieses Tetrapeptidhydrazid wurde folgendermassen erhalten: Zunächst wurde Boc-Ala-Ala-OH in Boc-Ala-Ala-OBzl übergeführt, das durch selektive Entfernung der Boc-Schutzgruppe. mit HCl das Dipeptidestersalz

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HCl · H-Ala-Ala-OBzl lieferte- Dieses wurde dann mit Boc-Asn-OH under Verwendung der DCC/HOBT-Methode von König und Geiger (Chem. Ber. 103, 788 (197O)) zu dem geschützten Tripeptidester Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl umgesetzt, von dem dann die Boc-Schutzgruppe durch Behandlung mit HCl in THF entfernt wurde. Das erhaltene Produkt,HCl· H-Asn-Ala-Ala-OBzI,wurde dann nach der DCC/HOBT- Methode mit H₃C-C0-Ser-(BzI)-OH * DCHA gekoppelt zu dem gewünschten geschützten Tetrapeptid H₃C-C0-Ser(BzI)-Asn-Ala-Ala-OBzl. Durch Hydrazinolyse dieser Verbindung wurde das entsprechende Hydrazid, H₃C-C0-Ser(BzI)-Asn-Ala-AIa-HNNH₂,erhalten, das mit dem Decapeptidsalz TFA · H-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH zu dem geschützten Tetradecapeptid H₃C-CO-Ser(BzI)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-Ile- Thr (BzI) -Thr (BzI) -Lys (Z)-OH kondensiert wurde. Diese Verbindung wurde dann mit dem an der endständigen Aminogruppe ungeschützten C-terminalen Tetradecapeptid-TFA-Salz zu

2
dem geschützten [Asn ]-Thymosin σ·, gekoppelt. Entfernung aller Schutzgruppen durch Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff und anschliessende Ionenaustausch-Säulenchro-

2
matographie lieferte reines [Asn ]-Thymosin α-,. Das gleiche Prozedere mit dem geschützten Tetradecapeptid H₃C-C0-Ser-(BzI)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI) GIu(OBzI)-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH lieferte das acetylierte Tetradecapeptid H^C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-OH.

Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung wurde ebenfalls gefunden, dass einige der in geschützter Form als Zwischenprodukte bei der beschriebenen Synthese von

2
Thymosin α-, und [Asn ] -Thymosin α-, auftretenden Peptide selber eine Aktivität bezüglich der Regulierung, Differenzierung und Funktion der T-Zellen aufweisen und zwar die folgenden Peptide:

GIu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn; Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn;

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- te -

Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-GIu-Asn ;

!!.,C-CO-Ser-Asn-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys und

lUC-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys.

Thymosin a-, , [Asn ] -Thymosin a, sowie die vorstehend

genannten neuen Octa-, Undeca- und Tetradecapeptide, die ebenfalls Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind, und ihre pharmazeutisch verträglichen Salze, können an warmblütige Sauger parenteral verabreicht werden, das heisst intravenös, subcutan oder intramuskulär. Diese Verbindungen wirken stark immunopotenzierend bei einer täglichen Dosierung von etwa 1-100 mg pro kg Körpergewicht bei intravenöser Verabreichung. Natürlich hängt die erforderliche Dosis ab von der speziellen Verfassung in der sich das zu behandelnde Individuum befindet, dem Grad der Erkrankung oder der Behandlungsdauer. Eine geeignete Dosierungseinheit zur pharmazeutischen Verwendung ist 1 mg von lyophilisiertem Thymosin α, , [Asn ]-Thymosin α-, oder einem der vorstehend genannten Peptide. Unmittelbar vor der Verab- ·:'.■:>>. reichung kann das lyophilisierte Präparat durch Zusatz von sterilem Wasser oder Kochsalzlösung rekonstituiert werden.

Die vorliegende Erfindung umfasst auch die pharma-

2 zeutisch verträglichen Salze von Thymosin α-, , [Asn ]-Thymosin cu und den vorstehend genannten Peptiden. Geeignete Salze sind das Natrium- und Kaliumsalz oder Salze mit einer starken organischen Base wie Guanidin. Ausserdem können die Präparate die Gegenionen zu den genannten Kationen enthalten, wie beispielsweise Chlorid, Bromid, Sulfat, Phosphat, Maleat, Acetat, Citrat, Benzoat, Succinat, Malat oder Ascorbat.

Von den im Text verwendeten Abkürzungen bedeuten: Boc = tert.-Butyloxycarbonyl; BzI = Benzyl; DCC = Dicyclohexylcarbodiimid; DMF = Dimethylformamid; THF = Tetra-

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- 12. -

hydrofuran; HOSu = N-Hydroxysuccinimid; Triton B = 40% methanolische Lösung von Trimethylbenzylammoniumhydroxid; NMM = N-Methylmorpholin; CHA = Cyclohexylamin; DCHA = Dicyclohexylamin; Z = Benzyloxycarbonyl; DMSO = Dimethylsulfoxidj TFA = Trifluoressigsäure; DC = Dünnschichtchromatographie; Et^N = Triäthylamin; HOBT = 1-Hydroxybenzotriazol.

Die folgenden Beispiele beschreiben die Synthese von

2
Thymosin cu und [Asn ]-Thymosin σ-, im Detail. Die bei der Synthese verwendeten spezifischen Schutzgruppen können durch andere, dem Fachmann geläufige äquivalente Gruppen ersetzt ." werden. I

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A.a) 11.0 g Boc-Asn-OH wurden in 200 ml Methanol und 20 ml Wasser gelöst. Die Lösung wurde mit einer 20%igen wässri gen Lösung von Cäsiumcarbonat (ca. 55 ml) auf ein pH von 7.0 eingestellt. Das Gemisch wurde zur Trockene eingeengt, der Rückstand noch zweimal bei 45°C aus je 120 ml DMF eingeengt und der so erhaltene weisse Rückstand mit 8.9 g Benzyl bromid in 120 ml DMF 6 Stunden gerührt. Nach Einengen zur Trockene und Behandlung mit einer grossen Menge Wasser verfestigte sich das Produkt. Es wurde abfiltriert, in Aethylacetat aufgelöst, mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene gebracht und aus Aethylacetat/ Petroläther umkristallisiert. Ausbeute: 13.8 g (90.3%) Boc-Asn-OBzl, F. 12O-122°C, [a]^⁵= -17.29° (c = 1, DMF).

13.7 g Boc-Asn-OBzl wurden in 80 ml THF gelöst und mit 500 ml 4N HCl in THF behandelt. Das Gemisch wurde 45 Minuten stehengelassen, während welcher Zeit sich ein Niederschlag zu bilden begann. Behandlung mit 1000 ml Aether lieferte ein weisses festes Material, das abfiltriert, mit Aether gewaschen und über Natriumhydroxid im Vakuum getrocknet wurde. Ausbeute: 10.3 g (94%) HCl-H-Asn-OBzl, F. 122-126°C, [a]p⁵= + 6.82°.

b) 7.0 g fein zerriebenes H-GIu(OBzI)-OH und 8.8 g Boc-Ala-OSu wurden 48 Stunden in 250 ml DMF und 6 ml NMM gerührt. Es wurde weiteres NMM zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Dann wurde das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand zwischen 300 ml Aethylacetat und 500 ml Wasser mit einem Gehalt von 2 ml 10%iger Schwefelsäure verteilt. Die organische Phase wurde dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene gebracht. Der Rückstand wurde in einer geringen Menge Aether aufgenommen und mit einem grossen Volumen Petroläther behandelt. Es bildete sich ein weisser amorpher Niederschlag, der dunnschichtchromatographisch einheitlich war. Ausbeute:

11.0 g (91.5%) Boc-Ala-Glu(OBzI)-OH, F. 84-88°C, [a]^⁵= 8.08°

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(c = 1, DMF).

10.4 g Boc-Ala-Glu(OBzl)-OH, 6.56 g HCl'H-Asn-OBzl und 5.9 g HOSu wurden in 250 ml DMF bei 0°Cgelöst. Es wurden 5.7 g DCC und 3.5 ml Triäthylamin zugesetzt. Das Gemisch wurde dann 2 Stunden bei O⁰C und 40 Stunden bei 25°C gerührt, unter weiterem Zusatz von Triäthylamin_;um die Reaktion leicht basisch zu halten. Die unlöslichen Nebenprodukte wurden abfiltriert, während das Filtrat zur Trockene eingeengt wurde. Der erhaltene ölige Rückstand verfestigte sich bei Behandlung mit Wasser. Das Rohprodukt wurde in Chloroform aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Ein sich bildender Niederschlag wurde abfiltriert und das Filtrat wurde mit Petroläther behandelt. Es wurde ein kristallines Produkt

erhalten. Ausbeute: 8.0 g (51.4%) BoC-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI, F. 1O2-1O5°C, [a]J⁵ = 12.5° (c = 1, DMF).

c) 4.74 g fein verriebenes H-GIu(OBzI)-OH und 0.7 g Boc-Glu(0Bzl)-0Su wurden in DMF in Gegenwart von 3.6 ml NMM 36 Stunden gerührt. Die erhaltene Lösung wurde eingeengt und der zähflüssige Rückstand mit Wasser behandelt. Der Niederschlag wurde in Aethylacetat aufgenommen, mit 5%ige Essigsäure und dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Es wurden 14.03 g eines klaren Oeles erhalten, das unter Petroläther stehengelassen wurde. Schliesslich wurden 10.2 g (90%) öliges Boc-Glu(OBzl)-Glu(OBzI)-OH erhalten, [a]^⁵ = -7.59° (c = 1, DMF). Das Produkt war dünnschichtchromatographisch einheitlich.

d) 28.2 g Boc-Ala-Glu(OBzI)-Asn-OBzl wurden 1 Stunde lang mit 1.1 Liter 4N HCl in THF behandelt. Durch Einengen wurde ein OeI erhalten, das noch zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt wurde. Bei Behandlung mit einer grossen Menge Aether ging das OeI in festes HCl-H-Ala-Glu(OBzI)-Asn-OBzl über, das mit 25.6 g Boc-Glu(OBzI)-GIu(OBzI)-OH, 10.6 g HOSu und 10.9 g DCC in 540 ml DMF eine Stunde bei 0°C und

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dann 48 Stunden bei 25 C gerührt wurde. Es wurde Triäthylamin zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Die unlöslichen Nebenprodukte wurden abfiltriert, während das Filtrat zur Trockene eingeengt wurde. Das Rohprodukt wurde in Chloroform aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Bei Behandlung mit Petroläther verfestigte sich das Produkt, ümkristallisation aus Isopropanol lieferte 28.9 g (59.8%) Boc-Glu(OBzI)-GIu(OBzI)-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI, F. 169-175°C, [a]^⁵ =

-11.78° (c = 1, DMF).

3.9 g BOC-GIU(OBZI)-GIU(OBZl)-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI wurden 30 Minuten lang mit 15 ml 4N HCl in THF behandelt. Dann wurden 210 ml Aether zugesetzt. Der Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser gewaschen und aus Aethanol und Aether umkristallisiert. Ausbeute: 2.58 g (75.1%) HCl-H-GIu(OBzI)-GIU(OBZl)-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI, F. 148-151°C, [a]^⁵ = -3.65° (c = 1, DMF).

e) 12.6 g Boc-Val-OSu und 4.68 g Valin wurden 96 Stunden lang in 250 DMF in Gegenwart von 2 ml Triäthylamin miteinander umgesetzt. Es wurde weiteres Triätyhlamin zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Das unlösliche Material wurde abfiltriert, während das Filtrat bei 45°C eingeengt wurde. Der Rückstand wurde zwischen Aether und verdünnter Schwefelsäure (ca. 1%) verteilt und die organische Phase dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das erhaltene Produkt wurde aus Aether und Petroläther umkristallisiert. Ausbeute: 12.2 g (96.4%) Boc-Val-Val-OH, F. 155-158°C, [σ]ρ⁵ = +1.10° (c = 1, DMF).

40.5 g Boc-Val-Val-OH wurden eine Stunde lang mit 1.8 Liter 4N HCl in THF behandelt. Einengen und Behandlung mit Aether lieferte 34.5 g HCl'H-VaI-VaI-OH in Form eines weissen amorphen Pulvers, das mit 55.6 g Boc-Glu(OBzI)-OSu in 1 Liter DMF während 24 Stunden in Gegenwart von 54 ml Triäthylamin umgesetzt wurde. Das Gemisch wurde von unlös-

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lichein Material befreit und zur Trockene eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in 1.5 1 Aethylacetat aufgenommen, die Lösung zweimal mit 5%iger Essigsäure und dreimal mit Wasser gewaschen, die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Es wurde ein farbloses klares OeI erhalten, das nicht kristallisierte. Es wurde in 3.2 1 Aether gelöst und mit 17 ml CHA auf pH eingestellt. Der erhaltene feste Rückstand wurde abfiltriert und aus Methanol und Aether umkristallisiert. Aus-'

beute: 58.9 g (72,7%) BoC-GIu(OBzI)-VaI-VaI-OH-CHA, F. 158-16O°C, [a]p⁵ = 33.41° (c = 1, MeOH).

Zu einer Suspension von 1.69 g Boc-Glu(OBzI)-VaI-VaI-OH-CHA in 40 ml Wasser und 40 ml Aethylacetat wurden in einem Schütteltrichter 4 ml 1 M Schwefelsäure gegeben.

Nach starkem Schütteln löste sich das Produkt und die organische Phase wurde mehrmals mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einem OeI eingeengt. Das so erhaltene freie Tripeptid wurde mit 2.58 g HCl-H-GIu-(OBZI)-GIU(OBZl)-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI in 15 ml DMF in Gegenwart von 0.612 g HOSu, 0.3 ml NMM und 0.63 g DCC kondensiert, wobei das Reaktionsgemisch 1 Stunde bei 0 C und Stunden bei 25 C gehalten wurde. Es wurde weiteres NMM zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Unlösliche Nebenprodukte wurden abfiltriert, während das Filtrat bei 45°C eingeengt wurde. Der erhaltene ölige Rückstand verfestigte sich bei Zusatz von Wasser. Das Rohprodukt wurde in 50 ml DMF gelöst und mit 300 ml Methanol wieder ausgefällt. Ausbeute: 2.25 g (58.7%) Boc-Glu(OBzI)-VaI-VaI-GIU(OBZI)-GIU(OBZl)-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI, F. 277-

28O°C, [a]p⁵ = -12.43° (c = 1, DMF).

0.72 g dieses Produktes wurden über 0.5 g eines 5%-igen Pd/BaS0₄~Katalysators 3 Stunden bei 3.4 Atmosphären in einem Gemisch aus 40 ml DMF, 30 ml Methanol und 2 ml Wasser hydriert. Das Gemisch wurde filtriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Anschliessend wurde während 30 Minuten mit 5 ml TFA behandelt und der nach Einengen erhaltene

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Rückstand wurde mehrere Male mit Aether behandelt. Der resultierende weisse Rückstand wurde in 20 ml Wasser aufgenommen und lieferte nach Lyophilisation 0.47 g eines Rohprodukts, das auf eine Säule (3 χ 32 cm) eines stark basischen Polystyrolharzes (Bio-Rad AGl-X 2), equilibriert mit Ammonacetatpuffer vom pH 8.1 (2%ige Essigsäure, die mit Ammoniak auf pH 8.1 eingestellt wurde) gegeben wurde. Die Säule wurde sukzessive mit jeweils 200 ml 0.025 M Ammoniumacetat (pH 5.5), 0.025 M HOAc, 0.05 M HOAc, 0.1 M HOAc, 0.25 M HOAc, 0.5 M HOAc, 0.75 M HOAc und 1 M HOAc eluiert. Es wurden Fraktionen von jeweils 12 ml gesammelt und jede Fraktion wurde dünnschichtchromatographisch untersucht. Die Fraktionen, die das gewünschte Produkt enthielten (Fraktionen 225-229) wurden vereinigt und lieferten nach zweimaliger Lyophilisation 0.223 g (48.1%) reines Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn, das dünnschichtchromatographisch und papierelektrophoretisch einheitlich war.

f) 15 g Boc-Lys(Z)-OH wurden mit 5.8 g HOSu und 8.66 g DCC in 200 ml THF 3 Stunden gerührt. Ein unlösliches Nebenprodukt wurde abfiltriert und das Filtrat wurde zur Trokkene eingeengt. Der zurückbleibende Sirup (24.2 g) wurde mit 150 ml Isopropanol und 150 ml Petroläther behandelt und lieferte 21 g Boc-Lys(Z)-OSu in öliger Form. Es wurde mit 10.6 g H-Lys(Z)-OH in 250 ml DMF in Gegenwart von 5.5 ml Triäthylamin 72 Stunden lang umgesetzt. Während der Reaktion wurde weiteres Triäthylamin zugesetzt,um das Reaktionsgemisch leicht basisch zu halten. Das Gemisch wurde dann filtriert und das Filtrat bei 45°C eingeengt. Der erhaltene ölige Rückstand wurde mit einem Liter 5%iger Essigsäure behandelt. Der gebildete Niederschlag wurde mit Aethylacetat extrahiert und die organische Phase wurde mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt zu einem OeI, das aus 300 ml Aethylacetat und 10 ml DCHA kristallisiert wurde. Umkristallisation aus Methanol und Aether

lieferte 22.7 g (72.5%) Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH-DCHA, F. 160-162°C, [a]£⁵ = -2,21° (c = 1, MeOH).

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10 g Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH-DCHA wurden zwischen einem Liter Aethylacetat und einem Liter 0.1 N H₃SO₄ verteilt. Die organische Phase wurde dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Die erhaltene freie Säure, Boc-Lys(Z)-Lys(Z)-OH, wurde während 30 Minuten mit frisch bereiteter 4N HCl in THF behandelt. Das Lösungsmittel und überschüssige Säure wurden durch Einengen bei 30 C abgezogen, während der Rückstand zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt wurde. Der erhaltene Rückstand, HC1*H-Lys(Z)-Lys(Z)-OH, verfestigte sich bei Behandlung mit Aether, wurde abfiltriert und mehrere Male mit Aether gewaschen- Das erhaltene Produkt, 6.7 g, wurde in 70 ml DMF gelöst, in einem Eisbad abgekühlt, mit 1.63 ml Triäthylamin und 5.54 g Boc-Glu(OBzI)-OSu versetzt. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 0⁰C und 24 Stunden bei 25°C gerührt. Es wurde weiteres Triäthylamin zugesetzt, um ein pH von 7.5 aufrecht zu erhalten. Schliesslich wurde mit einigen ml Essigsäure angesäuert (pH 3.5) und das Lösungsmittel wurde abgedampft. Der erhaltene Rückstand wurde in Aethylacetat aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Nach Behandlung mit Aether und Ümkristallisation aus Aethylacetat wurden 7.26 g (69.5%) Boc-Glu(OBzI)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH, F. 153-155°C, [a]p⁵ = -2.71° (c = 1, THF), erhalten.

g) 1^gBOC-GIU(OBZI)-VaI-VaI-GIU(OBZl)-GIu(OBzI)-AIa-GIu-(OBzI)-Asn-OBzl wurden während 30 Minuten mit 24 ml TFA behandelt. Nach Entfernung der überschüssigen Säure durch Eindampfen bei 30⁰C wurde der Rückstand mit Aether behandelt. Das erhaltene Pulver wurde sorgfältig mit Aether und Petroläther gewaschen, im Vakuum über Natriumhydroxid getrocknet und lieferte 1.71 g des Trifluoracetats des Octapeptids. Dann wurde der aktivierte Ester Boc-Glu(OBzI)-Lys(Z) Lys(Z)-OSu in situ durch Umsetzung von 0.995 g Boc-Glu-(OBzI)-Lys(Z)-Lys(Z)-OH mit 0.16 g HOSu und 0.274 g DCC in

15 ml DMF während 3 Stunden bei 0°C erzeugt. Dieser Lösung wurden 1.71 g des Octapeptidsalzes CF COOH-H-GIu(OBzI)-VaI-VaI-GIU(OBZI)-GIU(OBZl)-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI zusammen mit

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0.2 ml Triäthylamin zugesetzt. Nach Zusatz einiger weiterer Tropfen Triäthylamin und 15 ml DMF wurde das Gemisch 3 Tage bei 25°C gerührt, mit Essigsäure angesäuert und dann mit Wasser behandelt. Der weisse Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser, Methanol und Aether gewaschen, so dass 2.25 g eines Rohproduktes mit dem Schmelzpunkt 31O-313°C erhalten wurden, das in DMF gelöst und mit Methanol wieder ausgefällt wurde. Ausbeute: 1.75 g (68.3%) Boc-Glu(OBzI)-Lys(Z)-Lys(Z)-GIu(OBzI)-Val-Val-Glu(OBzI)-GIu(OBzI)-AIa- Glu(0Bzl)-Asn-0Bzl, F. 314-316°C, [a]^⁵ - 13.68° (c = 1, DMSO). Das Material war dünnschichtchromatographisch einheitlich.

0.5 g BOC-GIu(OBzI)-LyS(Z)-LyS(Z)-GIu(OBzI)-VaI-VaI-GIU(OBZI)-GIU(OBZl)-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI wurden in 2 ml TFA gelöst und während 15 Minuten mit 15 ml Flusssäure bei 0 C gerührt. Nach Verdampfen überflüssiger Säure bei 0°C wurde der Rückstand in 5%iger wässriger Essigsäure gelöst, die Lösung dreimal mit Aether gewaschen, eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 0.34 g rohes Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn erhalten, das durch Chromatographie an einer Jonenaustauschersäule gereinigt wurde. Ausbeute: 0.13 g (42.1%). [a]^⁵ = -85.65° (c = 1, H₂O).

h) 4.0 g Boc-Leu-OSu und 3.42 g H-Lys(Z)-OH wurden in 75 ml DMF in Gegenwart von 1.7 ml Triäthylamin während 48 Stunden kondensiert. Durch periodischen Zusatz von Triäthylamin wurde das pH auf 7.5 gehalten. Unlösliches Material wurde abfiltriert und das FiItrat zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde in 200 ml Aether gelöst, die Lösung mit 3 ml DCHA behandelt, der kristalline Niederschlag mit Aether gewaschen und aus Methanol und Aether umkristallisiert. Ausbeute: 5.7 g (69.5%) Boc-Leu-Lys(Z)-OH-DCHA, F. 14O-142°C, [a]^⁵ = -7.20° (c = 1, MeOH).

2.97 g Boc-Leu-Lys(Z)-OH-DCHA wurden in die freie Säure überführt (verteilt zwischen Aethylacetat und 0.1 N H₂SO₄) und das erhaltene farblose OeI (2.2 g) wurde während

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- ae. -

30 Minuten mit 4N HCl in 40 ml THF behandelt. Ueberschüssige Säure und Lösungsmittel wurden durch Erwärmen auf 30⁰C abgezogen und der Rückstand wurde mit Aether behandelt. Das verbleibende OeI wurde in Aether gelöst, eingeengt und noch zweimal jeweils nach Zusatz von Aether eingeengt. Der Rückstand wurde schliesslich mit 1.85 g Boc-Asp(OBzI)-OSu in Gegenwart von 1.85 ml Triäthylamin über Nacht gerührt. Das Gemisch wurde zur Trockene eingeengt und lieferte einen öligen Rückstand, der in Aethylacetat aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt wurde. Das so erhaltene Rohprodukt wurde aus Aethylacetat und Petroläther kristallisiert und lieferte 1.52 g (49.6%) reines Boc-Asp(OBzI)-Leu-Lys(Z)-OH, F. 109-111°C, [aj^⁵ = -16.14° (c = 1, DMF).

1.2 g Boc-Glu(OBzl)-Lys(Z)-Lys(Z)-GIu(OBzI)-VaI-VaI-GIu(OBzI)-GIU(OBZl)-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI wurden während 30 Minuten mit 35 ml TFA behandelt, üeberschüssige Säure wurde schnell abgezogen und der Rest mehrere Male mit Aether behandelt, so dass 1.2 g des ündecapeptid TFA-Salzes in Form eines weissen Pulvers erhalten wurde. Das Salz wurde in

einem Gemisch aus 5 ml DMF und 2 ml DMSO gelöst und mit in situ durch Rühren von 0.381 g Boc-Asp(OBzI)-Leu-Lys(Z)-OH während 3 Stunden bei 0°C mit 0.126 g HOSu und 0.124 g DCC in 3 ml DMF erzeugtem Boc-Asp(OBzI)-Leu-Lys(Z)-OSu behandelt.

Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0°C und dann 3 Tage bei 25°C gerührt, während welcher Zeit periodisch Triätyhlamin zugesetzt wurde, um ein leicht basisches Milieu aufrecht zu erhalten. Die sich bildende gelatinöse Substanz wurde mit 5%-iger Essigsäure behandelt und der resultierende weisse Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser, Methanol und Aether gewaschen und lieferte 1.28 g rohes Boc-Asp(OBzI)-Leu-Lys(Z) GIu (OBzO)-LyS (Z) -Lys (Z)-GIu (OBzI) -Val-Val-Glu (OBzI) -GIu (OBzI) Ala-Glu(OBzI)-Asn-OBzl, F. 325-326°C. Umfällung aus DMF/DMSO

reines Material, F. 326-327°C, fet]" = -15.71° (c = 1, DMF/

(10 ml/5 ml) und Methanol (230 ml) lieferte 1.22 g (80.2%) reines

DMSO).

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1.128 g dieses Produkts wurden mit 7 ml Anisol gemischt und 15 Minuten mit 25 ml wasserfreier Flussäure bei O C behandelt. Ueberschüssige Säure wurde bei O C abgezogen und der verbleibende Rückstand zwischen Wasser und Aether verteilt. Die wässrige Phase wurde 2 mal mit Aether gewaschen, auf die Hälfte des ursprünglichen Volumens eingeengt und lyophilisiert. Es wurden 0.69 g Rohmaterial erhalten das in der oben für das Octapeptide beschriebenen Weise chromatographiert wurde. Das in den Fraktionen 101-120 eluierte Material wurde vereinigt, lyophilisiert und lieferte 0.25 g eines Produkts, das noch leicht verunreinigt war. Es wurde daher an der gleichen Säule rechromatographiert und lieferte 0.155 g (22%) reines Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn., [a] ^⁵ = -86.27°

(c=l, 0.1 N HCl). Das Material war papierelektrophoretxsch einheitlich.

B.a) Eine Lösung von 18.6 g H-Ser(BzI)-OH in 45 ml Triton B wurde zur Trockene eingeengt, der Rückstand zweimal mit jeweils 100 ml DMF aufgenommen und wieder eingeengt und schliesslich 20 Stunden mit 16.9 g AcOSu in 150 ml DMF gerührt. Von Zeit zu Zeit wurde N-Methylmorpholin zugesetzt, um das Reaktionsmedium leicht basisch zu halten. Es wurde das Lösungsmittel entfernt und mit Aethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit einer geringen Menge 10%iger Essigsäure und Wasser (da das Produkt wasserlöslich ist, wurde ein sehr geringes Volumen Wasser verwendet) gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Es wurden 14.5 g Ac-Ser(BzI)-OH in Form eines klaren Oeles erhalten, das nicht kristallisierte. Die Verbindung wurde in einem Gemisch aus 300 ml Methanol und 30 ml Wasser gelöst, die Lösung mit 20%igem Cs„CO auf pH 7.0 titriert und dann bis zur Trockene eingeengt. Das erhaltene Salz wurde noch zweimal mit DMF aufgenommen und wieder eingeengt und schliesslich mit 15.4 g Benzylbromid in 250 ml DMF während 18 Stunden gerührt. Nach Abziehen des Lösungsmittels wurde der Rückstand in 600 ml Wasser aufgenommen und die erhaltene ölige Lösung mit Aethylacetat extrahiert. Der Extrakt wurde mit

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Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Die Kristallisation aus Aethylacetat und Petroläther lieferte 10.42 g (32.2%) HgC-CO-Ser(BzI)-OBzI, F. 89-91°C.

Eine Lösung von 2.2 g H₃C-CO-Ser(BzI)-OBzI in 75 ml Aethanol wurde über Nacht mit 5 ml Hydrazin gerührt. Unlösliches Material wurde abfiltriert und das Filtrat zu einem OeI, das sich bei Behandlung mit Aether verfestigte, eingeengt. Umkristallisation aus einer geringen Menge Aethanol und Aether lieferte 1.40 g (82.8%) H₃C-C0-Ser(BzI)-HNNH₂, F. 128-13O°C, [a]^⁵ = +5.80° (c = 1, MeOH).

b) Eine Lösung von 3.57 g L-Alanin in 18.8 ml Triton B wurde zur Trockene eingeengt und der ölige Rückstand zweimal mit jeweils 30 ml DMF aufgenommen und wieder eingeengt. Das erhaltene Salz wurde 20 Stunden mit 11.45 g Boc-Ala-OSu in 40 ml DMF und 4 ml NMM gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und der Rückstand in 100 ml lO%iger Essigsäure aufgenommen. Das Reaktionsprodukt wurde in Essigester extrahiert (4 χ 100 ml), der Extrakt zweimal mit einem geringen Volumen Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrokknet, auf ein kleines Volumen eingeengt und mit Petroläther solange behandelt bis die Lösung wolkig wurde. Beim Stehenlassen über Nacht bildete sich im Kühlschrank ein kristallines Produkt. Ausbeute: 8.2 g (76.3%) Boc-Ala-Ala-OH, F. 115-118°C.

36.2 g Boc-Ala-Ala-OH wurden 30 Minuten lang mit 3 4 N HCl in THF behandelt. Einengen und Aufarbeitung in der üblichen Weise lieferten ein öliges Produkt, das sich bei Behandlung mit Aether verfestigte. Umkristallisation aus Methanol mit Aether lieferte 9.1 g (33.3%) HCl-H-AIa-AIa-OH, F. 2O9-211°C.

Eine in einem Eisbad gekühlte Lösung von 2.36 g HCl* H-Ala-Ala-OH in 20 ml DMF wurde mit 1.68 ml (12 mmol) Tri-

äthylamin behandelt und mit 12 mmol Boc-Asp(OBzI)-OSu verwurde 2 Stunden

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setzt. Das Gemisch wurde 2 Stunden bei 0°C und dann über

-ZT-

Nacht bei 25°C gerührt unter Zusatz eines weiteren Aequivalents Triäthylamin (12 mmol) um das pH auf etwa 8.0 zu halten. Nach Zusatz einiger ml Essigsäure wurde das Gemisch zur Trockene eingeengt, mit Aethylacetat extrahiert, der Extrakt dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einem öligen Rückstand eingeengt. Dieser wurde in Aethylacetat aufgelöst und mit DCHA auf pH 8.0 titriert. Es fiel ein kristallines Salz aus, das aus Isopropanol und Petroläther umkristallisiert wurde. Ausbeute: 5.1 g (65.7%) BoC-ASp(OBzI)-AIa-AIa-OH-DCHA, F. 138-141°C, [σ]^⁵ = -13.33° (c = 1, MeOH).

3.5 g BOC-ASp(OBzI)-AIa-AIa-OH-DCHA wurden zwischen 500 ml Aethylacetat und 350 ml Wasser, enthaltend 10 ml 10%-ige Schwefelsäure, verteilt. Die wässrige Phase wurde mit 250 ml Aethylacetat extrahiert und die vereinigten Aethylacetatphasen wurden zweimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet, zur Trockene eingeengt und lieferten 2.5 g rohes BOC-ASp(OBzI)-AIa-AIa-OH. Dieses Material wurde während 30 Minuten mit 200 ml frisch hergestelltem 4 N HCl in THF behandelt. Nach Einengen bei 32 C zu einer sirupösen Flüssigkeit, zweimaliger Wiederaufnahme und Einengung mit THF wurde HCl-H-ASp(OBzI)-AIa-AIa-OH in Form eines öligen Rückstandes erhalten, der sich bei Behandlung mit Aether verfestigte. Ein Gemisch aus 1.24 g H₃C-CO-Ser(BzI)-HNNH₂ in

25 ml DMF wurde bei -25°C mit 7.42 ml 3.3 N HCl in THF und 0.99 ml Isoamylnitrit 30 Minuten gerührt. Die Azidlösung wurde auf -35°C abgekühlt, mit 4.1 ml Triäthylamin vermischt und dann mit 1.93 g HCl-H-ASp(OBzI)-AIa-AIa-OH versetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -20°C und dann 2 Tage bei 4 C gerührt. Weiteres Triäthylamin wurde zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Aufarbeitung in üblicher Weise lieferte eine kristalline Substanz, die aus THF und Petroläther umkristallisiert wurde. Ausbeute: 1.85 g (65.6%) H₃C-CO-Ser(BzI)-ASp(OBzI)-AIa-AIa-OH, F. 167-17O°C,

[a]J⁵ = -18.91° (c = 1, DMSO).

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Zu einer im Eisbad auf O C abgekühlten Lösung von 0.825 g H₃C-CO-Ser (BzI)-ASp(OBzI)-AIa-AIa-OH in 4 ml DMF wurden 54.3 mg Hydrazin, 0.475 g HOBT-H₃O und 0.32 g DCC gegeben. Das Gemisch wurde mit NMM auf pH 7.5 eingestellt und 2 Stunden bei O⁰C sowie anschliessend 17 Stunden bei 25°C gerührt. Es verfestigte sich zu einem Gel und wurde mit Methanol verdünnt. Das feste Material wurde abfiltriert und sorgfältig mit Methanol, Aether und Petroläther gewaschen. Es wurde eine Substanz vom Schmelzpunkt 229-232 C erhalten, die umgefällt wurde aus DMF und Methanol und 0.51 g(61.0%) H₃C-C0-Ser(OBzI)-Asp(OBzI)-AIa-AIa-HNNH₂, F. 23O-232°C, [oc]p⁵ = -17.94° (c = 1, DMSO), lieferte.

c) Eine Lösung von 39.4 g H-GIu(OBzI)-OH und 65.Og Boc-Ser(BzI)-OSu in 900 ml DMF und 2.3 ml Triäthylamin wurde über Nacht gerührt, wobei weiteres Triäthylamin zugesetzt wurde, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Die Lösung wurde zur Trockene eingeengt und der ölige Rückstand zwischen 1.5 Liter Aethylacetat und 2 Liter Essigsäure verteilt. Die organische Phase wurde zweimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einem klaren OeI eingeengt (90.0 g), das in 3 Litern Aether aufgenommen und mit 25 ml Cyclohexylamin behandelt wurde. Der gebildete Feststoff wurde aus Methanol und Aether umkristallisiert. Ausbeute: 76.2 g (74.8%) Boc-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH-CHA, F. 154-156.5⁰C,

[a]p⁵ = +6.32° (c = 1, MeOH).

76.2 g Boc-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH«CHA wurden in einem Gemisch aus 1.5 Litern Wasser und 1.5 Litern Aethylacetat suspendiert. Diesem Gemisch wurde 10%ige Schwefelsäure bis zu einem pH von etwa 2.5 zugesetzt, wobei Lösung eintrat. Die organische Phase wurde zweimal mit Wasser gewaschen, getrocknet, zur Trockene eingeengt und lieferte 68.5 g eines klaren Oeles, das mit 3 1 frisch hergestellter 4.1 N HCl in THF 45 Minuten behandelt und zur Trockene eingeengt wurde. Nach weiterem zweimaligem Aufnehmen mit THF und Einengen wurde als Rückstand HCl-H-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH erhalten, das in 500 ml DMF aufgenommen, auf 0°C abgekühlt und mit 48.66 g

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Boc-Ser(BzI)-OSu sowie 27 ml Triäthylamin versetzt wurde. Das Gemisch wurde über Nacht bei 25°C gerührt unter weiterem Zusatz von Triäthylamin, um ein leicht basisches Milieu zu gewährleisten. Kleine Mengen unlöslicher Substanz wurden durch Filtration abgetrennt und das Filtrat wurde eingeengt, der Rückstand in Aethylacetat aufgenommen, mit 5%ige Essigsäure und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Nach Kristallisation aus Aethylacetat mit Petroläther wurden 71.8 g (83.7%) Boc-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH, F. 112-113°C, [a]p⁵ = +17.91° (c = 1, THF), erhalten.

71.6 g Boc-Ser(BzI)-Ser(Bzl)-GIu(OBzI)-OH wurden Minuten mit 3.7 Litern frisch bereiteter 3.9 N HCl in THF behandelt und dann zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde noch zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt. Der erhaltene feste Rückstand (59.3 g) , F. 161-165°C, wurde mit Aether gewaschen und in 500 ml DMF in Gegenwart von 25 ml Triäthylamin mit 38.2 g Boc-Thr(BzI)-OSu eine Stunde bei 0°C und dann 15 Stunden bei 25°C gerührt unter Zusatz von weiteren 14.5 ml Triäthylamin, um ein leicht basisches Reaktionsmilieu zu gewährleisten. Unlösliches Material wurda abfiltriert, das Filtrat zu einem OeI eingeengt, in Litern Aethylacetat gelöst, mit 5%iger Essigsäure und zweimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Kristallisation aus Aethylacetat mit Petroläther lieferte 64.8 g (78.1%) Boc-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu-(OBzI)-OH, F. 115-118°C, [a]^⁵ = +11.64° (c = 1, DMSO).

54.5 g Boc-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH wurden mit 1.5 1 4.1 N HCl in THF behandelt und lieferten nach der übliche Aufarbeitung 46.3 g HClΉ-Thr (BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH in Form eines weissen Pulvers, das dann in 500 ml DMF mit 23.7 g Boc-Asp(OBzI)-OSu in Gegenwart von 16 ml Triäthylamin zunächst 2 Stunden bei 0°C und dann 15 Stunden bei 25°C unter weiterem Zusatz von 7.4 ml Triäthylamin gerührt wurde. Uebliche Aufarbeitung und Kristallisation aus CH₂Cl₂ und Petroläther lieferte 50.35 g

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(82.7%) Boc-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH, F. 111-113°C, [a]p⁵ = +7.21° (c = 1, DMSO).

50.0 g Boc-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu (OBzI)-OH wurden mit 4.15 N HCl in THF behandelt und in üblicher Weise aufgearbeitet. Es wurden 45.4 g einer weissen Substanz erhalten, die in 1.5 1 THF gelöst und mit 7 Litern Aether behandelt wurden. Nach Stehen über Nacht bei O⁰C wurden 44.0 g HCl-H-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu-(OBzI)-OH, F. 179-184°C, erhalten. 43.7 g dieses Materials wurden in 500 ml DMF gelöst, die Lösung wurde auf O⁰C abgekühlt und mit 15.4 Boc-Val-OSu und 10 ml Triäthylamin behandelt. Das Gemisch wurde 15 Stunden gerührt unter Zusatz von weiteren 7.9 ml Triäthylamin, um die Reaktion leicht basisch zu halten, ünslösliches Material wurde abfiltriert und das Filtrat zur Trockene eingeengt. Der ölige Rückstand wurde in CH„C1₂ gelöst, mit 5%iger Essigsäure und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und auf ein Volumen von 0.5 1 eingeengt. Nach Zusatz von Petroläther kristallisierte über Nacht langsam Boc-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser-(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-OH aus. ümkristallisation aus THF

und Isopropanol lieferte eine Ausbeute von 26.3 g (51.4%); F. 174-177°C, [cc]^⁵ = +0.84° (c = 1, THF).

Eine auf O⁰C gekühlte Lösung von 13.0 g Boc-Val-Asp-(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-OH in 50 ml DMF wurde mit 0.421 g Hydrazin, 3.688 g HOBT und 2.48 g DCC behandelt. Mit NMM wurde ein pH von 7.5 eingestellt. Das Gemisch wurde 18 Stunden gerührt, filtriert, das Filtrat zur Trockene eingeengt und der Rückstand mit Wasser behandelt. Der erhaltene Feststoff wurde aus DMF und Isopropanol umkristallisiert und lieferte 8.7 g (66.4%) Boc-Val-Asp(OBzI) Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH₂, F. 215-218°C, [a]p⁵ = +7.62° (c = 1, DMSO).

d) Eine Lösung von 14.0 g Boc-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH in ml 4 N HCl in THF wurde zur Trockene eingeengt und der Rückstand noch zweimal mitTHF aufgenommen und wieder eingeengt.

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Der ölige Rückstand verfestigte sich bei Behandlung mit Aether. Das getrocknete Material (11.4 g) wurde in 140 ml DMF gelöst, die Lösung auf O°C abgekühlt und mit 8.8 g Boc-Thr(BzI)-OSu sowie 3.5 ml Triäthylamin behandelt. Es wurde 24 Stunden bei 25°C unter Zusatz einiger weniger Tropfen Triäthylamin, um die Reaktion leicht basisch zu halten weitergerührt, dann mit 5 ml Essigsäure angesäuert und mit einem grossen Volumen Wasser verdünnt. Das ausgefallene Produkt wurde in Aethylacetat gelöst, die Lösung mit Wasser gewaschen, über Natiumsulfat getrocknet und zur Trockene eingeengt. Umkristallisation aus Aethylacetat und Petrolather lieferte 13.8 g (83.7%) Boc-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH, F. 110-112⁰C, [a]p⁵ = +19.45° (c = 1, Aethylacetat).

Eine Lösung von 41.5 g Boc-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z) OH in 500 ml frisch hergestellter 3.55 N HCl in THF wurde eingeengt, zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt und schliesslich mit Aether behandelt. Es wurden 37.4 g des rohen Hydrochloridsalzes erhalten, das in 500 ml DMF gelöst, auf O⁰C abgekühlt und mit 17.4 g Boc-Ile-OSu sowie 16 ml Triäthylamin versetzt wurde. Das Gemisch wurde über Nacht bei 25 C gerührt, unter Zusatz von weiteren 6.2 ml Triäthylamin, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Dann wurde filtriert und das FiItrat eingeengt, mit Aethylacetat extrahiert, der Extrakt mit 5%iger Essigsäure und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Kristallisation aus Aethylacetat und Petroläther lieferte 39.6 g eines Rohproduktes, das noch einige Verunreinigungen enthielt und daher chromatographisch an einer Kieselgelsäule gereinigt wurde, unter Verwendung von Chloroform/Methanol (95:5, v/v) als Elutionsmittel. Die das gewünschte Produkt enthaltenden Fraktionen, die durch Dünnschichtchromatographie festgestellt wurden, wurden vereinigt und eingeengt. Kristallisation aus Chloroform und Petroläther lieferte 19.1 g (41.2%) Boc-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH, F. 144-

146°C, [a]J⁵ = +2.40° (c = 1, CHCl₃).

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39,

0.493 g Boc-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH wurden durch Behandlung mit 4 N HCl in THF während 30 Minuten und üblicher Aufarbeitung in 0.39 g HCl-H-Ile-Thr(BzI) Thr(BzI)-Lys(Z)-OH übergeführt. Eine Lösung von 0.59 g Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-HNNH₂ in 6 ml DMF wurde auf -25°C gekühlt und mit 0.57 ml 4.3 N HCl in 2.46 mmol THF sowie 0.1 ml Isoamylnitrit versetzt. Nach 30-minütigem Rühren bei -20 - -25 C wurde die Temperatur auf -35 C gesenkt und 0.42 ml Triäthylamin sowie 0.39 g HCl«H-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH zugesetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -20⁰C und dann 48 Stunden bei 4°C unter Zusatz von weiterem Triätylamin/um ein pH von etwa 7.5 aufrecht zu erhalten,gerührt. Dann wurde mit 250 ml 5%iger Essigsäure verdünnt und das gebildete feste Produkt abfiltriert, mit Wasser, Methanol und Aether gewaschen, über Natriumhydroxid getrocknet und unter vermindertem Druck eingeengt. Das erhaltene Rohmaterial wurde in DMSO gelöst und durch Zusatz von Methanol wieder ausgefällt. Ausbeute: 0.698 g (81.7%) Boc-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI)-GIu-(OBzI)-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH, F. 268-271°C.

Eine auf -20°C abgekühlte Suspension von 0.408 g H₃C-CO-Ser(BzI)-Asp(OBzI)-AIa-AIa-HNNH₂ in 10 ml DMF wurde mit 0.627 ml einer frisch hergestellten Lösung von 5.43 N HCl in THF sowie 1.39 ml einer lO%igen Lösung von Isoamylnitrit in DMF versetzt. Nach 30-minütigem Rühren wurde auf -30 C abgekühlt und mit 0.476 ml Triäthylamin sowie 1.334 g TFA-SaIz des Decapeptids H-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser-(BzI)-GIu(OBzI)-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH versetzt. Das Gemisch wurde 30 Minuten bei -20°C gerührt und dann 5 Tage bei 4°C unter weiterem Zusatz von Triäthylamin und DMSO, um ein basisches Milieu aufrecht zu erhalten und Gelbildung zu verhindern, gerührt. Das Gemisch wurde dann in 300 ml 5%ige Essigsäure gegossen und der gebildete Niederschlag abfiltriert, mit Wasser, Methanol und Aether gewä-¹ sehen und getrocknet. Das Rohprodukt wurde durch Ausfällung mit Methanol aus DMSO gereinigt. Ausbeute: 1.40 g (85.37%) H₃C-CO-Ser(BzI)-Asp(OBzI)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser-

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(BzI)-Ser(BzI)-GIu(OBzI)-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-OH, [cc] ^⁵ = +6.37° (c = 1, DMSO).

1.35 g des so erhaltenen geschützten Tetradecapeptids wurden mit 0.188 g HOBT-H-O einige Minuten in einem Gemisch aus jeweils 15 ml DMF und DMSO gerührt. Das Gemisch wurde in einem Eisbad abgekühlt, mit 0.126 g DCC versetzt und weitere 24 Stunden unter Kühlung gerührt. Durch Behandlung von 4.0 g Boc-Asp(OBzl) -Leu-Lys (Z)-GIu(OBzI)-Lys (Z) -Lys (7,)-GIu(OBzI)-VaI-VaI-GIu(OBzI)-GIu(OBzI)-Ala-Glu(OBzI)-Asn-OBzl mit 40 ml TFA wurde das TFA-SaIz des Tetradecapeptids gebildet, das durch Zusatz eines grösseren Volumens Aether ausgefällt wurde. Nach Waschen des abgetrennten Niederschlages wurden 3.74 g des TFA-Salzes des C-terminalen Tetradecapeptids erhalten. 1.567 g dieser Verbindung wurden mit dem aus dem Amino-terminalen Tetradecapeptid in DMF-DMSO hergestellten aktivierten Ester umgesetzt. Durch Zusatz einiger Tropfen NMM wurde das pH auf 7.5-8.0 gebracht. Es wurde eine Stunde bei 0°C und 5 Tage bei 25°C gerührt. Dann wurde das Reaktionsgemisch in 1.5 Liter 5%ige Essigsäure gegossen und der gebildete Niederschlag abfiltriert und mit Wasser, Methanol, DMF, Methanol und Aether gewaschen. Ausbeute: 2.21 g H₃C-CO-Ser(BzI)-Asp(OBzI)-Ala-Ala-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser (BzI)-Ser(BzI)-Thr(BzI)-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-Asp-(OBZI)-LeU-LyS(Z)-GIu(OBzI)-LyS(Z)-LyS(Z)-GIu(OBzI)-VaI- VaI-GIU(OBZI)-GIU(OBZl)-AIa-GIu(OBzI)-ASn-OBzI, F.>300°C.

Das erhaltene geschützte Octacosapeptid (2.21 g) wurde in 8 ml TFA gelöst, die Lösung mit 4 ml Anisol versetzt und mit wasserfreier Flussäure 30 Minuten bei O⁰C gerührt. Durch Vakuumdestillation bei 0⁰C wurden die flüchtigen Säuren entfernt und der Rückstand in 200 ml Wasser gelöst, die Lösung zweimal mit Aether gewaschen, auf 100 ml eingeengt und lyophilisiert. Das erhaltene Rohprodukt (1.1 g) wurde zunächst an einer Sephadex ™ G-10-Säule (3 χ 80 cm·, 0.2 MHOAc) und dann an einer DEAE-Sephadex^-Säule (3 χ 75 cm) gereinigt, wobei mit Ammoniumacetat steigender Konzentration (pH 7.0, O.O25M, O.25M) und anschliessend mit verdünnter Essig-

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säure eluiert wurde. Die Fraktionen, die das gewünschte Material enthielten,wurden vereinigt und lieferten nach Lyophilisation 0.281 g H^-CO-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn [Thymosin oc, ] in Form eines amorphen weissen Pulvers.

Die Identität des erhaltenen synthetischen Materials mit natürlichem, aus Rinder-Thymusdrüsen isoliertem Thymosin cc. wurde durch Acrylamidgel-Isoelektrofokussierung bestätigt (Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 74, 725 (1977)).

7.23 g Boc-Ala-Ala-OH wurden in einem Gemisch aus 200 ml Methanol und 20 ml Wasser gelöst. Es wurde eine 20%-ige wässrige Cs_C0 -Lösung zugesetzt, bis ein pH von 7.0 erreicht war (ca. 30 ml) und das erhaltene Gemisch wurde zur Trockene eingeengt. Der Rückstand wurde zweimal mit je 150 ml DMF aufgenommen und wieder eingeengt und der gelatinöse Rückstand mit 7.2 g Benzylbromid in 120 ml DMF während 15 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wurde verdampft und der Rückstand mit 500 ml Wasser behandelt. Das sich zunächst als OeI abscheidende Material verfestigte sich beim Stehen, wurde in 400 ml Aethylacetat aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einem Sirup eingeengt, der bei Behandlung mit Petroläther zu kristallisieren begann, ümkristallisation aus Aethylacetat und Petroläther lieferte 7.2 g (73.8%) Boc-Ala-Ala-OBzI, F. 71-73°C.

6.0 g Boc-Ala-Ala-OBzl wurden während 30 Minuten mit 380 ml frisch bereiteter 4 N HCl in THF behandelt. Ueberschüssige Säure und Lösungsmittel wurden abgezogen und der verbleibende Sirup zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt. Bei Behandlung mit Aether verfestigte sich der Rückstand, der aus Methanol und Aether umkristallisiert 4.30 g

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(76.4%) HCl-H-Ala-Ala-OBzl, [α]^⁵ = -38.86° (c = 1, MeOH), lieferte.

Eine auf O°C abgekühlte Lösung von 4.25 g HCl-H-AIa-Ala-OBzl in 60 ml DMF wurde mit 3.45 g Boc-Asn-OH, 4.02 g HOBT, 2 ml NMM und 3.37 g DCC 2 Stunden bei O°C und dann 20 Stunden bei 25 C gerührt. Von Zeit zu Zeit wurde weiteres NMM zugesetzt, um die Reaktion leicht basisch zu halten. Unlösliche Nebenprodukte wurden abfiltriert und das-FiItrat wurde zur Trockene eingeengt. Der erhaltene ölige Rückstand verfestigte sich bei Behandlung mit Wasser, wurde in Aethylacetat aufgenommen, dreimal mit Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und bis zur beginnenden Kristallisation eingeengt. Nach Zusatz einer gleich grossen Menge Petroläther wurde das Gemisch über Nacht stehengelassen. Das erhaltene Rohprodukt wurde aus THF und Petroläther umkristallisiert. Ausbeute: 5.2 g (75.6%) Boc-Asn-Ala-Ala-OBzl, F. 153-155°C, [a]^⁵ = -55.61° (c = 1, MeOH).

2.2 g Boc-Asn-Ala-AIa-OBz1 wurden während 30 Minuten mit 220 ml 4.0 N HCl in THF behandelt. Ueberschüssige Säure und Lösungsmittel wurden abgezogen und der Rückstand zweimal mit THF aufgenommen und wieder eingeengt. Der ölige Rückstand verfestigte sich bei Behandlung mit Aether. Das so erhaltene Hydrochloridsalz (1.85 g) wurde in 40 ml DMF gelöst, die Lösung auf 0°C abgekühlt und mit 1.97 g H₃C-C0-Ser-

(BzI)-OH-DCHA versetzt. Nach 30-minütigem Rühren bei 0°C wurden 1.19 g HOBT und 1.08 g DCC zugesetzt. Das Gemisch wurde durch Zusatz von einigen Tropfen NMM auf pH 7.5 gebracht, 2 Stunden bei 0°C und dann über Nacht bei 25°C gerührt. Nach Abtrennung der unlöslichen Nebenprodukte wurde das Filtrat zur Trockene eingeengt, der Rückstand mit Wasser und Aethylacetat gewaschen und aus 40 ml.DMF und 500 ml Isopropanol kristallisiert. Ausbeute: 1.57 g (56.9%) H^C-CO-Ser(Bzl)-Asn-Ala-Ala-OBzl, F. 213-215°C, [α]!?⁵ = -23.11° (c = 1, DMSO).

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Eine Lösung von 1.57 g H₃C-CO-Ser(BzI)-Äsn-Ala-Ala-OBzI in 20 ml DMF wurde 18 Stunden mit 2 ml Hydrazin gerührt. Der sich bildende Niederschlag wurde abgetrennt und mit DMF, Aethanol und Aether gewaschen. Ausbeute: 1.22 g (89.6%) H₃C-CO-Ser(BzI)-ASn-AIa-AIa-HNNH₂, F. 262-264°C, [cc]^⁵ = -26.7° (c = 1, DMSO).

0.698 g Boc-Val-Asp(OBzl)-Thr(Bzl)-Ser(BzI)-Ser(BzI) GIu(OBzI)-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-LyS(Z)-OH wurden 30 Minuten lang mit 10 ml TFA behandelt. Durch Zusatz von Aether wurde das Peptidsalz ausgefällt, mit Aether gewaschen und getrocknet. Ausbeute: 0.652 g. In einem separaten Kolben wurden 0.17 g H₃C-CO-Ser(BzI)-Asn-Ala-Ala-HNNH₂ in 7 ml DMF suspendiert und mit 0.27 ml 6.18 N HCl in THF bei -20°C behandelt. Dem Gemisch wurden 0.68 ml einer Lösung von 10% Isoamylnitrit in DMF zugesetzt. Es wurde 30 Minuten bei -20 C gerührt, dann die Temperatur auf -30 C gesenkt und 0.2344 ml Triäthylamin sowie 0.652 g des oben erhaltenen TFA-Salzes des Decapeptids zugesetzt. Das Gemisch wurde bei -20°C mit 3 ml DMSO verdünnt, durch Zusatz einiger Tropfen Triäthylamin auf pH 7.5 gebracht, 30 Minuten bei -20°C und 5 Tage bei +4⁰C gerührt. Während dieser Zeit wurden weitere 5 ml DMSO und etwas Triäthylamin zugesetzt, um ein leicht basisches pH zu gewährlexsten und die Gelbildung zu verhindern. Dann wurde die Lösung in 250 ml 5%ige Essigsäure gegössen, der gebildete weisse Niederschlag wurde abfiltriert, mit Wasser, Methanol und Aether gewaschen und getrocknet. Das erhaltene Rohprodukt (0.702 g) wurde in DMSO gelöst und mit Methanol wieder ausgefällt. Ausbeute: 0.348 g (42.0%) H₃C-CO-Ser(BzI)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI) Ser(Bzl)-Glu(OBzl)-Ile-Thr(Bzl)-Thr(Bzl)-Lys(Z)-OH, F. 296-298°C (Zers.), [a]^⁵ = +3.77° (c = 1, DMSO).

Das erhaltene Produkt (0.866 g) wurde mit 0.126 g HOBT-H₂O in einem Gemisch aus 8 ml DMSO und 6 ml DMF gelöst, die Lösung in einem Eisbad abgekühlt und mit 0.085 g DCC versetzt und 24 Stunden bei O⁰C gerührt. Es wurde dann mit 1.05 g des TFA-Salzes des gemäss Beispiel 1 B.d) hergestellten

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Tetradecapeptids und 2 ml DMSO vermischt. Durch Zusatz einiger Tropfen NMM wurde das pH auf 7.5-8.0 eingestellt. Es wurde 1 Stunde bei O⁰C und 5 Tage bei 25 C gerührt und wie in Beispiel 1 B.d) aufgearbeitet. Ausbeute: 1.5775 g H-C-CO-Ser(BzI)-Asn-Ala-Ala-Val-Asp(OBzI)-Thr(BzI)-Ser(BzI)-Ser(BzI) · GIu(OBzI)-Ile-Thr(BzI)-Thr(BzI)-Lys(Z)-Asp(OBzI)-Leu-Lys(Z)-GIU(OBZI)-LyS(Z)-LyS(Z)-GIU(OBZI)-VaI-VaI-GIu(OBzI)-GIu(OBzI)' Ala-Glu (OBzI) -Asn-OBzl".

Das erhaltene, vollständig geschützte Octacosapeptid (1.5775 g) wurde in 10 ml TPA und 3 ml Anisol gelöst. Nach Zusatz von 45 ml Fluorwasserstoff wurde das Gemisch 30 Minuten bei O⁰C gerührt und dann wie in Beispiel IB.d) aufgearbeitet. Die Reinigung an einer Sephadex ^v^ G-IC- und einer DEAE-Sephadex^-Säule wie vorstehend beschrieben,lieferte 0.283 g reines H^-CO-Ser-Asn-Ala^Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-

2
Glu-Glu-Äla-Glu-Asn [(Asn )-Thymosin α, ] in Form eines weissen amorphen Pulvers, in Uebereinstimmung mit dem Struktur-

o
unterschied wanderte das [Asn*"]-ThynDsin σ. bei der Acrylamidgel-Isoelektrofokussierung an eine etwas weniger saure Position.

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