DE3586940T2

DE3586940T2 - Polypeptid und dessen Verfahren zur Herstellung.

Info

Publication number: DE3586940T2
Application number: DE85307646T
Authority: DE
Inventors: Hidenari Adachi; Sachio Central Research Hirose; Tamotsu Central Research Honma; Takashi Central Resea Kurihara; Sk-Kopo-Harinakano Sako; Makiko Shibata
Original assignee: Sanyo Fine Co Ltd; Mitsubishi Kasei Corp; Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Current assignee: Sanyo Fine Co Ltd; Mitsubishi Kasei Corp; Mitsubishi Petrochemical Co Ltd
Priority date: 1984-11-06
Filing date: 1985-10-23
Publication date: 1993-09-30
Anticipated expiration: 2005-10-24
Also published as: JPH051798B2; EP0181121A2; US4703106A; EP0181121B1; JPS61112099A; DE3586940D1; EP0181121A3; DK510885D0; CA1253299A; DK510885A

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein neues Polypeptid und auf ein Verfahren zur Herstellung desselben, insbesondere auf ein neues Polypeptid, welches die Wirkung einer Erniedrigung der Ca²&spplus;-Konzentration im Blut hat,sowie auf ein Verfahren zur Herstellung desselben.
Calcitonin (nachfolgend "CT" benannt) ist bisher als ein Polypeptid bekannt, welches die Wirkung einer Erniedrigung der Ca²&spplus;-Konzentration im Blut hat. CT kann durch eine Extraktion von den Schilddrüsen von verschiedenen Säugetieren, wie bspw. des Menschen, oder von ultimobranchialen Drüsen von Fischen, Cyclostomata, Vögeln gesammelt werden, wobei seine Primärsequenz der Aminosäure geklärt worden ist, und es liegen auch Schilderungen vor über eine Anzahl von synthetischen CT'en mit ähnlichen Strukturen, die auf dieser Sequenz basieren. Diese von Tieren abgeleiteten CT sind alles Polypeptide, die aus 32 Bestandteil-Aminosäuren bestehen und alle darin gemeinsam sind, daß die erste und die siebte? Aminosäuren L-Cystein sind, wobei die Mercapto- Gruppen von beiden eine Disulfid-Bindung bilden und das Carboxyl-Gruppe-Ende (nachfolgend "C-Ende" benannt) Prolinamid ist.
Die jetzigen Erfinder haben vor kurzem CT von den ultimobranchialen Drüsen von Hühnern extrahiert und gereinigt und haben seine Struktur bestimmt, wobei gefunden wurde, daß es eine Struktur hat, die völlig unterschiedlich von den bisher bekannten Strukturen ist, welche durch die folgende Formel (I) dargestellt sind:
H-Cys-Ala-Ser-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Gly-Lys- Leu-Ser-Gln-Glu-Leu-His-Lys-Leu-Gln-Thr-Tyr- Pro-Arg-Thr-Asp-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Pro-NH&sub2;
wobei: Cys=Cystein, Ala=Alanin, Ser=Serin, Leu=Leucin, Thr=Threonin, Val=Valin, Gly=Glycin, Lys=Lysin, Gln=Glutamin, Glu=Glutaminsäure, His=Histidin, Tyr=Tyrosin, Pro=Prolin, Arg=Arginin, Asp=Aspartinsäure.
Dieses CT hat eine biologische Aktivität, die gleich oder höher ist als die CT von Cyclostomata und Fischen und wurde auch bereits veröffentlicht in der Japanischen Hilfs-Patentveröffentlichung No. 123500/1985 (welche der USSN 679,465 und der Europäischen Patentanmeldung Nr. 84 114 768.9 entspricht).
Es wird erwartet, daß das CT von Hühnern pharmazeutisch für verschiedene Symptome neu nützlich sein wird, wie bspw. die Paget-Krankheit, Osteoporosis oder Hypercalcemia, bei denen die Ca²&spplus; -Konzentration im Blut abnormal hoch ist. Um dieses als ein Arzneimittel akzeptieren zu können, ist es jedoch erforderlich, das Problem zu überwinden, welches durch die Disulfid-Bindung verursacht wird, welche bei dem CT von Hühnern vorliegt und welche als sehr unstabil in Lösungen eingeschätzt wird und seine physiologische Aktivität erniedrigen kann. Die jetzigen Erfinder haben daher sehr extensive Untersuchungen mit dem Ziel durchgeführt, eine stabiles CT-Derivat zu erhalten, und zwar selbst in einem Lösungsstadium und auf der Basis der Struktur des Hühner-CT, und sie haben daher auch gefunden, daß das vorerwähnte Ziel erreichbar ist, wenn anstelle des ersten und des siebten Cysteins in dem Hühner-CTα-Aminosa-ure der folgenden Formel(II) verwendet wird:
wobei n eine Ganzzahl von 3 bis 7 darstellt, und dabei eine Ringschließung zwischen der Seitenkette- Carboxylgruppe der Aminosäure und der Aminosäure an dem Aminogruppenende (nachfolgend "N-Ende" benannt) bewirkt wird, nämlich der Aminogruppe von Alanin, um dadurch die vorliegende Erfindung zu erhalten.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Polypeptid, dargestellt durch die folgende Formel (III), oder sein Säurezusatzsalz oder Komplex:
worin Ala, Ser, Leu, Thr, Val, Gly, Lys, Gln, Glu, His, Tyr, Pro, Arg, Asp und n dieselben Bedeutungen haben wie vorstehend angegeben und nachfolgend weiterhin gültig.
Das neue Polypeptid der vorliegenden Erfindung oder sein Säurezusatzsalz oder Komplex kann wie nachfolgend beschrieben hergestellt werden.
Es kann dadurch hergestellt werden, daß ein Peptid oder ein Polypeptid gebildet wird, welche die durch die vorstehende Formel (III) dargestellte Aminsäurefolge haben, und daß die strukturellen Einheiten, welche einen Peptidrest enthalten, dargestellt durch die folgende Formel:
wobei R einen aktiven Esterrest bedeutet und nachfolgend beibehalten wird,
in jeder Reaktionsstufe einer Cyclisierungsreaktion unterworfen werden.
Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen
Das Verfahren kann allgemein dadurch praktiziert werden, daß die aktive Gruppe mit einer geeigneten Schutzgruppe geschützt wird und die Schutzgruppe in jeder beliebigen Stufe der Reaktion entfernt wird.
Als die durch die vorstehende Formel (II) dargestellte α-Aminosäure werden diejenigen der Formel für eine Einfachheit der Reaktion bevorzugt, bei denen n die Werte 4 bis 6 hat, vorzugsweise eine solche, wo n = 5. Obwohl als α-Aminosäure auch D-Isomer oder L-isomer zur Verfügung stehen, wird bevorzugt das L-Tsomer verwendet.
Die Reaktion selbst wird durchgeführt durch eine Wiederholung der Entfernung der Schutzgruppe und durch eine Kondensationsreaktion, wobei in Bezug auf die Peptid- Synthese wie herkömmlich vorgegangen wird. Als die bei der Herstellung des Ausgangsmaterials verwendeten verschiedenen Schutzgruppen und als alle Zwischenprodukte bei dem Herstellungsverfahren der vorliegenden Erfindung können daher Schutzgruppen eingesetzt werden, die in der Peptid-Synthese bekannt sind, nämlich solche, die unmittelbar durch herkömmliche Verfahren entfernt werden können, wie bspw. die Hydrolyse, die Säurezerlegung, die Reduktion, die Aminolyse oder die Hydrazinolyse.
Als die Schutzgruppe zur Verwendung für die Aminogruppe können bspw. verwendet werden die Formylgruppe; Acetylgruppen, wie bspw. die Trifluoracetylgruppe, die Phthaloylgruppe, die Benzol-Sulfonyl-Gruppe, die Tosyl-Gruppe (nachfolgend "Tos" benannt), die o-Nitrophenylsulphenylgruppe, die 2,4-Dinitrophenyl-Gruppe, usw.; Aralkylgruppen wie bspw. die Benzyl-Gruppe (nachfolgend "Bz" benannt), die Diphenylmethyl-Gruppe, die Triphenyl-Methyl-Gruppe (diese Gruppen können auch mit niedrigeren Alkoxygruppen substituiert sein, wie bspw. die o-Methoxygruppe, die P-Methoxygruppe, usw.); Benzyloxycarbonylderivat-Gruppen, wie bspw.
die Benzyloxycarbonyl-Gruppe (nachfolgend "Cbz" genannt), die o- oder p-Brombenzyloxycarbonyl-Gruppe, die o-Chlorbenzyloxycarbonyl-Gruppe (nachfolgend "Cbz (o-Cl)" benannt), die m- oder p-Chlorbenzyloxycarbonyl-Gruppe, die p-Nitrobenzyloxycarbonyl-Gruppe, die p-Methoxybenzyloxycarbonyl- Gruppe, die p-Phenylazo-Benzyloxycarbonyl-Gruppe, die p-(p'-Methoxyphenylazo)-Benzyloxycarbonyl-Gruppe, usw.; aliphatische Oxycarbonyl-Gruppen, wie die Cyclopentyloxycarbonyl-Gruppe, Trichlorethyloxycarbonyl-Gruppe, t-Amyloxycarbonyl-Gruppe (nachfolgend "AOC" benannt), t-Butoxycarbonyl-Gruppe (nachfolgend "BOC" benannt), Diisopropylmethoxycarbonyl-Gruppe, usw; Aralkyloxycarbonyl-Gruppen, wie die 2-Phenylisopropoxycarbonyl-Gruppe, 2-Tolylisopropoxycarbonyl Gruppe, 2-p-Diphenylisopropoxycarbonyl-Gruppe, usw.
Eine Carboxylgruppe wird allgemein durch eine Amidierung, Hydrazidierung oder Veresterung geschützt. Eine Amid-Gruppe wird allgemein substituiert mit einer 3,4-Dimethoxybenzyl- Gruppe, bis- (p-Methoxyphenyl)Methyl-Gruppe, usw. Eine Hydrazid-Gruppe wird allgemein substituiert mit einer Cbz- Gruppe, Trichlorethyloxycarbonyl-Gruppe, Trifluoracetyl- Gruppe, BOC-Gruppe, Trityl-Gruppe, Diphenylisopropoxycarbonyl-Gruppe, usw. Für eine Veresterung können allgemein verwendet werden Alkanole, wie Methanol, Ethanol, t-Butanol, Cyanmethylalkohol u. dgl.; Alkanole, wie Benzylalkohol, p-Brombenzylalkohol, p-Chlorbenzylalkohol, p-Methoxybenzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, 2,4,6-Trimethylbenzylalkohol, Benzhydrylalkohol, Benzoylmethylalkohol, p-Brombenzoylmethylalkohol, p-Chlorbenzoylmethylalkohol u. dgl.; Phenole, wie 2,4,6-Trichlorphenol, 2,4,5-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol, 2,4-Dinitrophenol, p-Cyanphenol, p-Methansulfonylphenol u. dgl.; Thiophenole, wie Thiophenol, Thiocresol, p-Nitrothiophenol u. dgl.; usw.
Als nächstes wird der Schutz von verschiedenen Aminosäuren beschrieben. Hydroxyl-Gruppen der vorstehenden Ser, Thr, Tyr können bspw. durch eine Veresterung oder eine Veretherung geschützt werden. Die für die Veresterung geeigneten Gruppen können bspw. sein: niedrigere Alkanoylgruppen, wie die Acetylgruppe, usw., Aroylgruppen, wie die Benzoylgruppe, usw., Gruppen, die von Kohlensäure abgeleitet sind, wie die Cbz-Gruppe, Ethoxycarbonylgruppe, usw. Andererseits können die für die Veretherung geeigneten Gruppen bspw. die Bzl- Gruppe, Tetrahydropyranyl-Gruppe, t-Butylgruppe, usw. umfassen. Zum Schutz dieser Hydroxylgruppen sind auch die 2,2,2-Trifluor-1-t-Butoxycarbonylaminoethyl-Gruppe, 2,2,2- Trifluor-1-Benzyloxycarbonylaminoethyl-Gruppe geeignet. Diese Hydroxylgruppen müssen jedoch nicht zwingend geschützt werden.
Die α-Aminogruppe des vorstehenden Lys kann mit der Cbz- Gruppe, der o,m,p-Chlorbenzyloxycarbonyl-Gruppe, der Tos- Gruppe, usw. geschützt werden. Die Seitenketten-Carboxylgruppe der vorstehenden Glu und Asp kann mit einer Benzylester-Gruppe (nachfolgend "OBz" benannt) geschützt werden. Die Iminogruppe des vorstehenden His kann bspw. mit einer Bzl-Gruppe, Trityl-Gruppe, Cbz-Gruppe, Tos-Gruppe, Adamantyloxycarbonyl-Gruppe, 2,2,2-Trifluor-1-t-Butoxycarbonylaminoethyl-Gruppe, 2,2,2-Trifluor-1-Benzyloxycarbonylaminoethyl- Gruppe, usw. geschützt werden. Diese iminogruppe muß jedoch nicht zwingend geschützt werden. Als die Schutzgruppe für die Guanidino-Gruppe des vorstehenden Arg kann bspw. eine Nitro-Gruppe, Tos-Gruppe, Cbz-Gruppe verwendet werden, jedoch muß diese Guanidino-Gruppe nicht zwingend geschützt werden.
Bei der vorliegenden Erfindung kann eine Kondensation der ?Aminosäuren entweder durch eine einzeln aufeinanderfolgende Kondensierung der Aminosäuren durchgeführt werden oder durch eine Kondensierung der Peptide oder Polypeptide, die zwei oder mehr Aminosäuren aufweisen. Eine solche Kondensation kann bspw. dadurch durchgeführt werden, daß einer Aminosäure oder einem Polypeptid, welche eine geschützte α-Aminogruppe und eine aktivierte Carboxyl-Endgruppe haben, eine Reaktion mit einer Aminosäure oder einem Peptid oder einem Polypeptid erlaubt wird, das eine freie α-Aminogruppe und eine schützende Carboxyl-Endgruppe hat, oder daß einer Aminosäure oder einem Peptid oder einem Polypeptid, das eine aktivierte α-Aminogruppe und eine geschützte Carboxyl-Endgruppe hat, eine Reaktion mit einer Aminosäure, oder einem Peptid oder einem Polypeptid erlaubt wird, das eine freie Carboxyl-Endgruppe und eine geschützte α-Aminogruppe hat.
In diesem Fall kann die Carboxylgruppe aktiviert werden durch eine Umwandlung bspw. in ein Säureazid, ein Säureanhydrid, ein Säureimidazolid oder einen aktiven Ester, wie einen Cyanmethylester, Thiophenylester, p-Nitrothiophenylester, p-Methansulfonelphenylester, Thiodiester, p-Nitrophenylester (nachfolgend "ONP" benannt), 2,4-Dinitrophenylester, 2,4,5-Trichlorphenylester, 2,4,6-Trichlorphenylester, Pentachlorphenylester, N-Hydroxysuccinimidester (nachfolgend "OSU" benannt), N-Hydroxyphthalimidester, 8-Hydroxyquinolinester oder N-Hydroxypiperizinester, usw., oder durch eine Behandlung mit Carbodiimid, N,N'-Carbonyl-Diimidazol oder Isooxazoliumsalz, bspw. Woodward-Reagenz.
Bei der vorliegenden Erfindung kann das bevorzugte Kondensierungsverfahren das Carbodiimid-Verfahren, das Azid- Verfahren, das aktive Ester-Verfahren und das Misch-Säureanhydrid-Verfahren umfassen. Unter diesen wird das Verfahren bevorzugt, bei welchem die Racemisierung in jeder Stufe ein Minimum wird, bspw. das Azid-Verfahren, das aktive Ester- Verfahren, N-Hydroxysuccinimid (nachfolgend "HOSU" benannt)- N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (nachfolgend "DCC" benannt) - Verfahren oder das 1-Hydroxybenzotriazol-(nachfolgend "HOBT" benannt)-DCC-Verfahren.
Die Struktureinheiten enthaltend:
des so vorbereiteten Peptids werden in jeder beliebigen Stufe der Synthese einer Zyklisierungs-Reaktion unterworfen, und diese Zyklisierung wird durch eine Kondensationsreaktion zwischen der Seitenkette-Carboxylgruppe der α-Aminosäure durchgeführt, die durch die Formel (II) dargestellt ist und durch das vorstehend beschriebene Verfahren aktiviert worden ist, und der freien Aminogruppe der N-Endaminosäure (Ala). Während dieser Reaktion sollten die Hydroxylgruppen von Ser und Thr vorzugsweise geschützt sein.
Das bevorzugte Verfahren der vorliegenden Erfindung wird durch die Kondensierung eines zyklischen Peptids oder Polypeptids mit geschützten oder ungeschützten aktiven Gruppen, welche die durch die vorstehende Formel (II) dargestellte α-Aminosäure enthalten, mit einem anderen Polypeptid mit geschützten oder ungeschützten aktiven Gruppen durchgeführt sowie einer nachfolgenden Eliminierung der Schutzgruppen, sofern solche vorhanden sind. Insbesondere wird das N-Endfragment, welches Aminosäuren von der No. 1 an dem N-Ende bis zu den No. 6- No. 9 umfassen, mit dem Polypeptid der gesamten verbleibenden Sequenz von No. 7 - No. 10 bis No. 31 kondensiert, wobei in diesem Fall Gly vorteilhaft eine C-Endaminosäure sein sollte im Hinblick auf die Reaktivität bei der Kondensation der Fragmente und der Verhinderung einer Racemisierung.
Bei der vorliegenden Erfindung wird es daher am meisten bevorzugt, ein Peptid zu kondensieren, welches eine Aminosäuresequenz von No. 1 bis No. 9 hat, mit einem Polypeptid, welches eine Aminosäuresequenz von No. 10 bis No. 31 umfaßt. Diese Kondensation kann mit dem Azid-Verfahren durchgeführt werden, welches mit dem Azid oder Hydrazid anfängt, oder mit dem aktiven Esterverfahren, dem Misch-Säureanhydrid- Verfahren, usw.
Als nächstes wird die Herstellung des N-Endfragments näher beschrieben unter Bezugnahme auf die Synthese von Nonapeptid 1-9, jedoch können mit genau demselben Verfahren auch Hexapeptid 1-6, Heptapeptid 1-7 und Octapeptid 1-8 hergestellt werden.
Die Herstellung von Nonapeptid wird durch eine aufeinanderfolgende Kondensierung von einzelnen Aminosäuren oder niedrigeren Peptiden durchgeführt, die zwei oder mehr Aminosäuren enthalten, mit einer C-Endaminosäure (Gly) oder einem C-Endfragment, welches der Aminosäuresequenz nachfolgt. Einzelne Aminosäuren, wie bspw. Gly, Leu, Val, ω-Carboxyα-Aminosäure, Thr, Ser, Ala sollten vorteilhaft mit dem aktiven Esterverfahren kondensiert werden. Niedrigere Peptide, wie bspw. Dipeptid 2-3, sollten vorteilhaft mit dem HOBT-DCC-Verfahren kondensiert werden. Auch Hexapeptid 1-6 sollte vorteilhaft durch eine Kondensation von Tripeptid 1-3 mit einem weiteren Tripeptid 4-6 nach dem Azidverfahren hergestellt werden.
Während der Synthese von Nonapeptid muß seine Carboxylendgruppe nicht zwingend geschützt werden. Wenn die Kondensierung bspw. mit dem Azidverfahren, dem aktiven Esterverfahren oder dem Misch-Säureanhydrid-Verfahren durchgeführt wird, muß seine Endcarboxylsäure nicht geschützt werden, jedoch ist es erwünscht, daß diese Gruppen, wie vorstehend beschrieben, durch eine Veresterung geschützt werden sollten. Bspw. können sie durch eine Veresterung mit Methanol, Benzylalkohol geschützt werden. Diese Estergruppen, bspw. Methylestergruppen, können innerhalb kurzer Zeit mit einer verdünnten Natriumhydroxidlösung, vorzugsweise einer 1 N- 2 N-Natriumhydroxidlösung, zerlegt werden, oder ihre Zerlegung erfolgt nach der Umwandlung zu Hydrazid. Auf der anderen Seite können Benzylestergruppen durch eine Hydrierung zerlegt werden. Die Aminogruppen dieser Zwischenprodukte werden mit herkömmlichen Schutzgruppen geschützt, wie bspw. einer Cbz-Gruppe, Trityl-Gruppe, BOC-Gruppe, Diphenylisopropoxycarbonyl-Gruppe. Auch können die Carboxylgruppen dieser Zwischenprodukte falls erwünscht in einer herkömmlichen Art und Weise verestert werden. Die Hydroxylgruppen von Ser, Thr und Tyr können durch eine Veretherung mit T-Butanol, Benzylalkohol usw. geschützt werden, falls erwünscht.
Bei den vorerwähnten Gruppen können die Cbz-Gruppe, p-Nitrobenzylester-Gruppe und OBzl-Gruppe durch eine Hydrierung in Anwesenheit von Palladium/Kohlenstoff eliminiert oder zerlegt werden, die N-Trityl-Gruppe kann eliminiert werden durch eine wäßrige Essigsäure, die BOC-Gruppe durch eine Trifluoressigsäure (nachfolgend "TFA" benannt), die o-Nitrophenylsulphenyl-Gruppe durch ein organisches Lösungsmittel, welches Wasserstoffchlorid enthält, oder durch Blausäure oder schwefelige Säure, und die Diphenylisopropoxycarbonyl- Gruppe durch ein Gemisch von Eisessig-Ameisensäure-Wasser (7:1:2). Auf der anderen Seite wird der t-Butylester ähnlich dem t-Butylether mit TFA zerlegt.
Es wird nun weiter die Synthese des C-Endfragments von No. 7 - No. 10 bis No. 31 näher beschrieben, welche mit dem N-Endfragment kondensiert wird.
Es wird bevorzugt, einzelne Aminosäuren oder niedrigere Peptide, welche 2 bis 4 Aminosäuren umfassen, aufeinanderfolgend mit einer C-Endaminosäure (Aminosäure der No. 31) (Pro) zu kondensieren oder mit einem C-Endfragment, bspw. den Peptiden 30-31, 28-31, 26-31, 25-31, 24-31 oder 23-31, nachfolgend zu der Aminosäuresequenz. Bspw. kann das C-Endfragment 10-31 durch eine Kondensierung von den einzelnen Aminosäuren der C-Endseite oder der niedrigen Peptide kondensiert werden, bspw. Dipeptid 28-29, Dipeptid 26-27, Tripeptid 20-22, Dipeptid 17-18, Dipeptid 15 - 16, Tripeptid 10-12, in Übereinstimmung mit dem aktiven ster-Verfahren, dem HOBT-DCC-Verfahren, usw. Der Schutz der α-Aminogruppen und der funktionalen Gruppen der entsprechenden Aminosäuren ist der gleiche wie vorstehend beschrieben.
Die Schutzgruppe für das vorstehende C-Endfragment von No. 7- No. 10 bis No. 31, welches die geschützte α-Aminogruppe hat, bspw. Docosapeptidamid 10-31, kann mit dem vorstehend beschriebenen Verfahren eliminiert werden.
Die beiden erhaltenen Peptide, nämlich das N-Endfragment von No. 1 bis No. 6 - No. 9 und das C-Endfragment von No. 7
- No. 10 bis No. 31, werden mit dem vorbeschriebenen Verfahren kondensiert, um ein geschütztes Polypeptid zu erhalten. Die Schutzgruppen bei dieser geschützten Verbindung gönnen mit den vorbeschriebenen Verfahren eliminiert werden, vorzugsweise mit dem Verfahren der Säurezerlegung, wie bspw. dem Verfahren unter Verwendung von wasserfreiem Wasserstoffluorid, wodurch die durch die vorstehende Formel (III) dargestellte Zielsubstanz erhalten wird.
Das neue Polypeptid der vorliegenden Erfindung kann in der Form einer Base oder seines Salzes erhalten werden, abhängig von den Bedingungen des Verfahrens. Eine solche Base oder seine Base ist nach den bekannten Verfahren wechselseitig konvertibel. Eine solche Base kann auch zur Reaktion mit einer Säure gebracht werden, die zur Bildung eines pharmazeutisch zulässigen Salzes geeignet ist, bspw. anorganischen Säuren, wie Hydrochlorsäure, Hydrobromsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure, Perchlorsäure, usw; organischen Säuren, wie Ameisensäure, Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Benztraubensäure, Oxalsäure, Succinsäure, Apfelsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzosäure, Salicylsäure, niedrigere Alkansulfonsäure, Benzolsulfonsäure, Toluolsulfonsäure (nachfolgend "TosOH" benannt), usw. rum ein entsprechendes Salz zu bilden.
Das vorstehende neue Peptid kann durch Hinzufügung bestimmter Arten von anorganischen Substanzen oder organischen Substanzen ein Komplex bilden. Solche Substanzen können anorganische Verbindungen umfassen, die von Metallen, wie Kalzium, Magnesium, Aluminium, Kobalt oder Zink abgeleitet sind, besonders leicht wasserlösliche Salze oder Hydroxide dieser Metalle, wie Phosphate, Pyrophosphate oder Polyphosphate, und Polyphosphate von Alkalimetallen. Als die organische Substanz, die in der Wirkung fortbesteht, können bspw. nichtantigenische Gelatine, Carboxymethylzellulose, Sulfonsäureester oder Phosphorsäureester von Alginsäure, Dextran, Polyalkohole, wie Polyethylenglykol, Phytinsäure, Polyglutaminsäure, Protamin, usw. verwendet werden.
Gemäß der vorliegenden Erfindung kann ein CT-Derivat geliefert werden, welches selbst in einem Lösungszustand stabil ist.
Die vorliegende Erfindung wird jetzt unter Bezugnahme auf Ausführungsbeispiele näher beschrieben, durch welche die vorliegende Erfindung nicht beschränkt wird.
Das biologische Nachweisverfahren, der Träger und die Lösungssysteme für eine Dünnschicht-Chromatographie sowie die Bedingungen für eine Aminosäure-Analyse sind nachfolgend beschrieben.

Biologisches Aktivitäts-Nachweisverfahren

Nachdem eine Testprobe mit einer 1% Natriumacetatlösung (pH 4.0, enthaltend 0.1% Rinderserum Albumin) geeignet verdünnt worden war, wurde sie weiterhin zu verschiedenen Arten von Lösungen verdünnt, die intravenös durch den Schwanz von jungen männlichen Ratten (Gewicht etwa 100 g) mit einer Dosis von 0.1 ml je Ratte gespritzt wurden. Nach einer Stunde wurden die Ratten durch eine Punktion des Herzens mit Wegwerfspritzen abgelassen. Das Serum wurde durch Zentrifugierung erhalten, und es wurde die Ca²&spplus; Konzentration in dem Serum spektroskopisch gemessen (Reagens: Wako-kit (Warennamen, hergestellt von Wako Junyaku K.K.) für eine Messung von Kalzium), und es wurde die Menge, die für eine Erniedrigung der Ca²&spplus; -Konzentration um 10% nötig war, mit 10 mMRCU (Medical Research Council Unit) definiert.

Dünnschicht-Chromatographie (nachfolgend "TLC" benannt)

Träger: Silicagel G (hergestellt von Merck Co.)
Lösungssystem:
1. Chloroform-Methanol-Essigsäure
95 : 5 : 3
2. Chloroform-Methanol-Essigsäure
85 : 10 : 5
3. Chloroform-Ethanol-Ethylacetat
5:2:5
4. Chloroform-Methanol-Essigsäure-Wasser
wäßrige Schicht von 10 : 10 : 1 : 10
5. n-Butanol-Essigsäure-Wasser
obere Schicht von 60 : 20 : 20

Aminosäure-Analyse

Eine Testprobe (etwa 5.0 µg) wurde unter Verwendung von 50 µl von 6 N Hydrochlorsäure - 0.1% Phenol bei 110ºC für 22 Stunden hydrolisiert, dann in 300 ul Zitronensäurelösung (pH 2.25) gelöst, und die Lösung wurde mittels eines Aminosäure-Analysators (HITACHI Model 835F; Warennamen, hergestellt von Hitachi, Ltd.) analysiert.

Ausführungsbeispiel

Herstellung von
303 Milligram (83.5 uM) von BoC-Lys(Cbz)-Leu-Ser(Bzl) Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys [Cbs(o-Cl)]-Leu-Gln-Thr(Bzl)- Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-GlY- Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; wurden mit einer Kühlung gelöst mit der Hinzufügung von 3 ml von TFA, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 40 Minuten umgerührt. Nach der Reaktion wurde das Produkt unter einem verringerten Druck konzentriert, um TFA zu verdampfen, und der Rest wurde mit Diethylether verdünnt. Die gebildeten Abscheidungen wurden durch ein Dekantieren gesammelt und über Nacht in einem Trockner über Natriumhydroxid getrocknet.
Das getrocknete Produkt wurde dann in 2 ml Dimethylformamid < nachfolgend DMF benannt) gelöst, mit Triethylamin (nachfolgend TEA benannt) auf pH von etwa 7 eingestellt, und es wurden dann 10,0.3 mg (87.7 uM) von
und 19.0 mg von HOSU hinzugefügt, gefolgt weiterhin von einer Hinzufügung von 34.0 mg DCC unter einer Kühlung und einem Umrühren, und das Gemisch wurde dann für 2 Tage umgerührt.
Dem Reaktionsgemisch wurden 20 ml einer 1 M Essigsäure hinzugefügt, und die gebildeten Abscheidungen wurden gesammelt, zweimal mit 1 M Essigsäure gewaschen, dreimal mit Wasser und getrocknet, wodurch 393 mg des kondensierten Rohprodukts erhalten wurden.
Dieses Pulver (393 mg) wurde zur Reaktion in einem Gemisch von 20 ml Wasserstoffluorid und 1 ml Anisol bei 0ºC für 60 Minuten zur Reaktion gebracht. Nach der Reaktion wurde das Wasserstofffluorid abgedampft und der Rest wurde mit Etyhlacetat gewaschen, nachgefolgt von einem Trocknen, wodurch 270 mg Pulver erhalten wurden.
Von diesem Pulver wurden 10 mg in 1 ml 1 N Essigsäure gelöst, durch eine Sephadex-Säule G-50 (hergestellt von Pharmacia Fine Chemicals AB, Schweden) (1.6·83 cm) eluiert (6 ml/Stunde), und das Eluat wurde zu Fraktionen von jeweils 3 ml zusammengefaßt. Die aktiven Fraktionen (26-30) wurden gesammelt und gefriergetrocknet, wodurch 2.2 mg (2400 MRCU/mg) des aktiven Pulvers erhalten wurden.
Das aktive Pulver (2.2 mg) wurde in 1 N Essigsäure gelöst und durch die flüssige Hochleistungschromatographie gereinigt (nachfolgend HPLC genannt) (umgekehrte Phase), wodurch 1.7 mg (6500 MRCU/mg) des aktiven Pulvers erhalten wurden. Die Bedingungen für HPLC sind die folgenden:
Säule: Chemcosorb 5 ODS-H (hergestellt von Chemco
Scientific Co., Ltd., Japan) (4.6·150 mm);
Eluant: Wasser:Acetonitril:10% TFA
100:0:1 (Lösung A) - 40:60:1 (Lösung B);
Eluierungsverfahren: linearer Gradient von der Lösung A zu der Lösung B (40 Minuten);
Fließrate: 1 ml/Min.
Ein Teil des erhaltenen aktiven Pulvers wurde derselben HPLC-Beaufschlagung (umgekehrte Phase) unterworfen unter Verwendung einer Chemcosorb 3 ODS-H-Säule (hergestellt von Chemco Scientific Co., Ltd., Japan) (4.6·75 mm) zur Untersuchung der Reinheit, und es wurde durch die Aminosäure- Analyse bestätigt, daß es sich dabei um das Polypeptid der vorliegenden Erfindung handelte. Aminosäure-Analyse: Lys His Arg Asp Thr Ser Glu
1.93(2) 0.88(1) 0.96(1) 0.99(1) 3.84(4) 3.00(3) 3.06(3)
Pro Gly Ala Val Leu Tyr
2.12(2) 3.02(3) 1.81(2) 2.00(2) 5.10(5) 0.90(1)
α-Aminosuberinsäure 1.01(1)
Die vorstehenden Ausgangsmaterialien wurden wie folgt hergestellt.
Herstellung des Polypeptids 10-31:BOC-Lys (Cbz)-Leu- Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys [Cbz(o-Cl)]-Leu-Gln- Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val- Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl) -Pro-NH&sub2;

(1) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2;:

Einer Lösung von 3.09 g BOC-Thr(Bzl)-OH, 2.03 g H-Pro-NH&sub2;HCL und 1.35 g HOBT, gelöst in 30 ml Tetrahydrofuran (nachfolgend abgekürzt als THF) wurden unter Kühlung bei W5C 1.82 ml N-Ethyl-N'-Dimethylaminopropylcarbodiimid (nachfolgend abgekürzt als WSC) tröpfchenweise hinzugefügt, und das Gemisch wurde für eine Stunde bei -5ºC und dann bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter reduziertem Druck konzentriert, der Rest wurde mit Ethylacetat verdünnt und zweimal mit 1 N Hydrochlorsäure gewaschen, zweimal mit 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und mit Wasser, in der angegebenen Reihenfolge. Nach der Trocknung über wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde das Produkt unter verringertem Druck konzentriert. Eine Kristallisation des öligen Rests von Ethylacetat-n-Hexan ergab 3.60 g (Ausbeute: 85.3% ) von weißem Pulver von BOC-Thr(Bzl)- Pro-NH&sub2;. Rf&sub2; 0.63.
Elementaranalyse (für C&sub2;&sub1;H&sub3;&sub1;N&sub3;O&sub5;)
C% H%
gefunden 62.10 8.05 10.01
berechnet 62.20 7.71 10.36

(2) Herstellung von BOC-Ala-Gly-OBzl:

Einer Lösung von 5.68 g BOC-Ala-OH, 10.12 g H-Gly-OBzITosOH und 4.0 g HOBT, gelöst in 50 ml THF, wurden unter Kühlung bei -5ºC 5.5 ml WSC hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei -5ºC für eine Stunde und dann bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck konzentriert, und der Rest wurde in Ethylacetat gelöst. Die Ethylacetatschicht wurde nacheinander zweimal mit 1 N Hydrochlorsäure gewaschen, zweimal mit 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und mit Wasser. Nach der Trocknung über wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde das Produkt unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde von n-Hexan kristallisiert, dann zweimal von Ethylacetat-n-Hexan rekristallisiert, wodurch 9.32 g (Ausbeute: 92.3% ) BOC-Ala- Gly-OBzl mit einem Schmelzpunkt bei 85-87ºC erhalten wurden. Rf&sub1; = 0.54.

(3) Herstellung von BOC-Ala-Gly-OH:

Eine Lösung von 8.00 g BOC-Ala-Gly-OBzl, gelöst in 60 ml THF, wurde in Anwesenheit von 5% Palladium/Kohlenstoff hydrogenisiert.
Nach 24 Stunden wurde der Katalysator entfernt und das Reaktionsgemisch unter verringertem Druck konzentriert, und der Rest wurde mit n-Hexan behandelt, um verfestigt zu werden wodurch 5.71 g (Ausbeute: 97.4% ) BOC-Ala-Gly-OH mit einem Schmelzpunkt bei 120-122ºC erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub1;&sub0;H&sub1;&sub8;N&sub2;O&sub5;)
C% H%
gefunden 48.70 7.15 11.32
berechnet 48.77 7.37 11.38

(4) Herstellung von BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2;:

2.00 g BOC-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; wurden unter Kühlung bei -5ºC 6 ml TFA hinzugefügt, und das Gemisch wurde für 30 Minuten umgerührt, gefolgt von einer Konzentration unter verringertem Druck. Der Rest wurde mit Diethylether behandelt, und das abgeschiedene Produkt wurde durch Filtration gesammelt und über Natriumhydroxid unter Vakuum über Nacht getrocknet, wodurch H-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; TFA erhalten wurde.
Das vorerwähnte Produkt wurde zusammen mit 1.21 g BOC-Ala- Gly-OH und 0.66 g HOBT 15 ml DMF hinzugefügt, und es wurden dazu unter Kühlung bei -5ºC 1.06 ml WSC hinzugefügt. Das Gemisch wurde dann für eine Stunde bei -5ºC umgerührt und danach bei Raumtemperatur über Nacht, und das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde in Ethylacetat gelöst und aufeinanderfolgend mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid gewaschen, zweimal mit wäßrigem 5% Natriumhydrogencarbonat, 1 N Hydrochlorsäure (gesättigt mit Natriumchlorid) und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid. Nachdem die Ethylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet worden war, wurde das Lösungsmittel unter verringertem Druck verdampft, und der Rest wurde mit n-Hexan für eine Kristallisation ergänzt, wodurch 1.64 g (Ausbeute: 62.4% ) BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro- NH&sub2; mit einem Schmelzpunkt bei 110-120ºC erhalten wurden. Rf&sub3; = 0.21, Rf&sub4; = 0.45
Elementaranalyse (für C&sub2;&sub6;H&sub3;&sub9;N&sub5;O&sub7;·1/4H&sub2;O) C% H%
gefunden 58.17 7.26 12.76
berechnet 58.03 7.40 13.01

Aminosäure-Analyse:

Thr 0.91(1), Gly 1.01(1), Ala 1.00(1), Pro 0.96(1).

(5) Herstellung von Boc-Val-Gly-OEt:

Einer Lösung von 3.21 g H-Gly-OEt·HCl, gelöst in 10 ml DMF, wurden unter Kühlung bei -5ºC 5.00 g Boc-Val-OH, 3.10 g HOBT und 4.79 g WSC·HCL hinzugefügt, und das Gemisch wurde für eine Stunde bei -5ºC und bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck konzentriert, und der Rest wurde in Ethylacetat gelöst, aufeinanderfolgend dreimal mit 1 N Hydrochlorsäure gewaschen, einmal mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, dreimal mit 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat, dreimal mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, gefolgt von einer Konzentration unter verringertem Druck. Der Rest wurde von Ethylacetat-n-Hexan rekristallisiert, wodurch 5.93 g (Ausbeute: 85.2% ) Boc-Val-Gly-OEt mit einem Schmelzpunkt bei 91.5 bis 93ºC erhalten wurden.

(6) Herstellung von BOC-Val-Gly-OH:

Einer Lösung von 5.80 g BOC-Val-Gly-OEt, gelöst in 10 ml Methanol, wurden unter Kühlung 23 ml 1 N wäßriges Natriumhydroxid hinzugefügt, und das Gemisch wurde für eine Stunde umgerührt, gefolgt von einer Einstellung des pH auf 8.0 mit 1 N Hydrochlorsäure. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck konzentriert, um Methanol zu verdampfen, und die wäßrige Schicht wurde mit Diethylether gewaschen und dann auf pH 2.0 mit 1 N Hydrochloridsäure eingestellt. Die wäßrige Schicht wurde mit Ethylacetat extrahiert, und der Extrakt wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, gefolgt durch eine Konzentration unter verringertem Druck. Der Rest wurde mit n-Hexan behandelt und von Ethylacetat-n- Hexan rekristallisiert, wodurch 4.76 g (Ausbeute: 90.5% ) BOC-Val-Gly-OH mit einem Schmelzpunkt bei 101 bis 107ºC erhalten wurden. Rf&sub1; = 0.20.
Elementaranalyse (für C&sub1;&sub2;H&sub1;&sub2;N&sub2;O&sub5;)
C% H%
gefunden 52.24 7.94 10.05
berechnet 52.54 8.08 10.21

(7) Herstellung von BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2;:

1.53 g BOC-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; wurden unter Kühlung 7 ml TFA hinzugefügt, und nach einem Umrühren für 50 Minuten wurde das Gemisch unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Diethylether behandelt, und das abgeschiedene Produkt wurde durch Filtration gesammelt und über Natriumhydroxid unter Vakuum getrocknet, wodurch H-Ala-Gly- Thr- (Bzl) -Pro-NH&sub2;TFA erhalten wurde.
Dem vorerwähnten Produkt wurden 15 ml DMF hinzugefügt, und das Gemisch wurde dann unter Kühlung bei -5ºC auf pH von etwa 7.0 mit der Hinzufügung von TEA eingestellt. Nachdem zu diesem Gemisch 0.79 g BOC-Val-Gly-OH und 0.39 g HOBT hinzugefügt worden waren, wurden 0.61 g WSC·HCL und 0.44 ml TEA hinzugefügt, gefolgt von einem Umrühren bei -5ºC für eine Stunde und bei Raumtemperatur über Nacht. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck konzentriert, und der Rest wurde in Chloroform gelöst. Die erhaltene Lösung wurde aufeinanderfolgend zweimal mit 1 N Hydrochloridsäure, gesättigt mit Natriumchlorid, gewaschen, zweimal mit 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat, gesättigt mit Natriumchlorid und mit gesättigtem Natriumchlorid, dann getrocknet über wasserfreiem Natriumsulfat und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde zweimal von Methanol- Diethylether rekristallisiert, wodurch 1.41 g (Ausbeute: 71.2% ) BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; mit einem Schmelzpunkt bei 148ºC erhalten wurden (zerlegt).
Elementaranalyse (für C&sub3;&sub3;H&sub5;&sub1;N&sub7;O&sub9;·1/2H&sub2;O)
C% H% N%
gefunden 56.59 7.33 13.84
berechnet 56.72 7.50 14.03
Aminosäure-Analyse: Thr 0.82(1), Gly 1.98(2), Ala 1.00(1), Val 0.96(1) Pro 1.08(1)

(8) Herstellung von BOC-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly- Thr(Bzl) -Pro-NH&sub2;:

1.41 g BOC-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl) -Pro-NH&sub2; wurden unter Kühlung 7 ml TFA hinzugefügt, und nach einem Umrühren für 30 Minuten wurde das Gemisch unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Diethylether behandelt, und das abgeschiedene Produkt wurde über Natriumhydroxid unter Vakuum über Nacht getrocknet. Dem vorstehenden Produkt wurden 15 ml DMF hinzugefügt, eingestellt auf pH von etwa 7.0 mit TEA, und nach der Hinzufügung von TEA und 0.86g BOC-Asp-(OBzl)-OSU wiederholt auf pH von etwa 7.0 eingestellt, gefolgt von einem Umrühren für 2 Tage. Während dieses Ablaufs wurde der pH-Wert des Gemisches auf etwa 7.0 mit TEA eingestellt. Eine große Menge Wasser wurde hinzugefügt, und die abgeschiedene Viskosesubstanz wurde durch ein Dekantieren abgetrennt und durch eine Behandlung mit Diethylether kristallisiert. Die wäßrige Schicht wurde mit Chloroform extrahiert, das Extrakt wurde unter verringertem Druck konzentriert und zu dem Rest wurde Wasser hinzugefügt. Die abgeschiedene Viskosesubstanz wurde mit Diethylether behandelt, um kristallisiert zu werden. Dieses Kristall wurde dem vorhergehenden Kristall hinzugefügt und viermal von Methanol-Diethylether rekristallisiert, gefolgt von einem Waschen mit heißem Ethylacetat-Diethylether und einem Trocknen, wodurch 1.48 g (Ausbeute: 80.9% ) BOC-Asp(OBzl)- Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; mit einem Schmelzpunkt bei 190 bis 200ºC erhalten wurden. Rf&sub4; = 0.44.
Elementaranalyse (für C&sub4;&sub4;H&sub6;&sub2;N&sub8;O&sub1;&sub2;·1/2H&sub2;O)
C% H%
gefunden 58.48 6.95 12.33
berechnet 58.46 7.02 12.40 Aminosäure-Analyse: Asp 1.02(1), Thr 0.90(1), Gly-1.96(2) Ala 0.92(1), Val 1.00(1), Pro 0.99(1)

(9) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala- Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2;:

1.46 g BOC-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; wurden unter Kühlung 8 ml TFA hinzugefügt, und das Gemisch wurde nach einem Umrühren für 60 Minuten unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Diethylether behandelt, und das abgeschiedene Produkt wurde über Natriumhydroxid über Nacht getrocknet. Zu dem vorerwähnten Produkt wurden 10 ml DMF zugefügt und es wurde dann unter Kühlung bei -5ºC der pH-Wert auf 7.0 mit TEA eingestellt. Hierzu wurden dann 0.66 g BOC-Thr-(Bzl)-OSU hinzugefügt, und das Gemisch wurde auf pH 7.0 mit TEA eingestellt und bei Raumtemperatur für 2 Tage umgerührt.
Nach Vollendung der Reaktion wurde eine große Wassermenge zu dem Reaktionsgemisch hinzugefügt, und die Abscheidungen wurden gesammelt, gefolgt von einer dreimaligen Rekristallisation von Methanol-Diethylether, wodurch 1.16 g (Ausbeute: 65.5% ) BOC-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr- (Bzl)-Pro-NH&sub2; erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub5;&sub5;H&sub7;&sub5;N&sub9;O&sub1;&sub4;·1/2 H&sub2;O)
C% H%
gefunden 60.20 6.88 11.54
berechnet 60.31 6.99 11.51
Aminosäure-Analyse: Asp 1.01(1), Thr 1.69(2), Gly 2.00(2), Ala 1.01(1), Val 1.00(1), Pro 1.08(1)

(10) Herstellung von AOC-Arg(Tos)Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val- Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl) -Pro-NH&sub2;:

1.10 g BOC-Thr(Bzl)-Asp(ÖBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr-(Bzl)- Pro-NH&sub2; wurden unter Kühlung 5 ml TFA hinzugefügt? und das Gemisch wurde nach einem Umrühren für 30 Minuten unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Diethylether behandelt, und das abgeschiedene Produkt wurde über Natriumhydroxid unter Vakuum über Nacht getrocknet. Dem vorerwähnten Produkt wurden 5 ml DMF hinzugefügt, und das Gemisch wurde mit TEA unter Kühlung bei -5ºC auf pH 7.0 eingestellt. Zu diesem Gemisch wurden 160 mg HOBT und 0.57 g AOC-Arg(Tos)-OH hinzugefügt sowie unter Kühlung 0.23 g WSC'HCI und 0.17 ml TEA, gefolgt von einem Umrühren bei - 5ºC für eine Stunde und bei Raumtemperatur über Nacht.
Nach Vollendung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch unter verringertem Druck konzentriert, der Rest wurde mit Ethylacetat aufgefüllt, und das abgeschiedene Produkt wurde zweimal mit heißem Methanol-Diethylether behandelt, wodurch 1.07 g (Ausbeute: 74.8% ) AOC-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp-(OBzl)- Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; mit einem Schmelzpunkt bei 198ºC (zerlegt) erhalten wurden. Rf&sub2; = 0.49.
Elementaranalyse (für C&sub6;&sub9;H&sub9;&sub5;N&sub1;&sub3;O&sub1;&sub7;S H&sub2;O)
C% H%
gefunden 58.30 6.76 12.83
berechnet 58.01 6.84 12.75
Aminosäure-Analyse:
Asp 1.00(1), Thr 1.85(2), Gly 1.96(2), Ala 0.91(1), Val 1.00(1), Arg 1.01(1), Pro 0.96(1).

(11) Herstellung von BOC-Tyr(Bzl) -Pro-OBzl:

Eine Lösung von 10.00 g BOC-Tyr(Bzl)-OH, gelöst in 50 ml Dichlormethan, wurde mit 6.53 g H-Pro-OBzl HCl vermischt. Diesem Gemisch wurde unter Kühlung bei -5ºC 4.93 ml WSC hinzugefügt, gefolgt von einem Umrühren bei -5ºC für eine Stunde und bei Raumtemperatur über Nacht. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck konzentriert, der Rest wurde durch ein Schütteln mit Ethylacetat und 1 N Hydrochlorsäure vermischt und in flüssige Schichten getrennt. Die Ethylacetatschicht wurde zweimal aufeinanderfolgend mit 1 N Hydrochlorsäure gewaschen, zweimal mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, dreimal mit 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und zweimal mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, getrocknet über wasserfreiem Natriumsulfat und konzentriert unter verringertem Druck, wodurch 14.46 g (Ausbeute: 96.1% ) BOC-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl als ein öliges Produkt erhalten wurden. Rf&sub1; = 0.71.

(12) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl:

7.06 g BOC-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl wurden unter Kühlung 20 ml TFA hinzugefügt, und das Gemisch wurde nach einem Umrühren bei Raumtemperatur für eine Stunde unter verringertem Druck konzentiert. Der ölige Rest wurde über Natriumhydroxid unter Vakuum über Nacht getrocknet, aufgefüllt mit 15 ml DMF und unter Kühlung bei -5ºC auf pH von etwa 7.0 mit TEA eingestellt. Diesem Gemisch wurden 1.76 g HOBT hinzugefügt sowie 4.02 g BOC-Thr(Bzl)-OH, 2.74 g WSC.HCl und 2.00 ml TEA, gefolgt von einem Umrühren bei -5ºC für eine Stunde und bei Raumtemperatur über Nacht. Nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch unter verringertem Druck konzentriert, der Rest wurde durch ein Schütteln mit Wasser und Ethylacetat vermischt und in flüssige Schichten getrennt. Die wäßrige Schicht wurde reextrahiert mit Ethylacetat. Beide Ethylschichten wurden gesammelt, aufeinanderfolgend gewaschen mit 1 N Hydrochlorsäure, mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, dreimal mit 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, getrocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und konzentriert unter verringertem Druck. Der Rest wurde kristallisiert durch eine Behandlung mit Diethylether-n-Hexan und rekristallisiert von Diethylether-n-Hexan, wodurch 7.75 g (Ausbeute: 81.8% ) Boc-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl erhalten wurden. Rf&sub2; = 0.79.

(13) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OH:

Eine Lösung von 3.60 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OBzl, gelöst in 20 ml THF, wurde mit 5.83 ml 1 N Natriumhydroxid unter Kühlung und Umrühren vermischt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden umgerührt. Dann wurde 1 N Hydrochlorsäure hinzugefügt, um den pH-Wert auf 7 einzustellen, und das Gemisch wurde dann unter verringertem Druck konzentriert, um THF zu verdampfen. Die restliche wäßrige Lösung wurde mit Wasser verdünnt, gewaschen mit Diethylether, dann auf pH 2 mit der Hinzufügung von 1 N Hydrochlorsäure eingestellt und zweimal mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit Wasser ausgewaschen, getrocknet über wasserfreiem Magnesiumsulfat und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde von Diethylether-n-Hexan kristallisiert, um ein Rohprodukt zu erhalten. Die Rekristallisation dieses Produktes von Ethylacetat-Diethylether-n-Hexan ergaben 2.15 g (Ausbeute: 67.8% ) BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-OH mit einem Schmelzpunkt bei 134 bis 137ºC. Rf&sub1; = 0.46, Rf&sub3; = 0.24.
Elementaranalyse (für C&sub3;&sub7;H&sub4;&sub5;N&sub3;O&sub8;)
C% H%
gefunden 67.29 6.91 6.37
berechnet 67.36 6.87 6.37

(14) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)- Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2;:

1.0 g AOC-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBz)-Val-Gly-Ala-Gly- Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; wurden unter Kühlung 5 ml TFA hinzugefügt, und das Gemisch wurde nach einem Umrühren für 30 Minuten unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Diethylether behandelt und über Natriumhydroxid unter Vakuum getrocknet. Dem Produkt wurden 5 ml DMF hinzugefügt und unter Kühlung bei -5ºC auf pH 4.5 mit TEA eingestellt. Zu diesem Gemisch wurden 120 mg HOBT und 0.56 g BOC-Thr(Bzl)- Tyr(Bzl)-Pro-OH hinzugefügt sowie unter Kühlung bei -5ºC tröpfchenweise 0.16 ml WSC&sub1;gefolgt von einem Umrühren bei -5ºC für eine Stunde und bei Raumtemperatur über Nacht. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck konzentriert, der Rest wurde mit Methanol und Diethylether vermischt, und das abgeschiedene Produkt wurde durch Filtration abgetrennt. Dieses Produkt wurde aufeinanderfolgend dreimal von Methanol-Diethylether rekristallisiert, mit DMF-Diethylether und mit Methanol-Diethylether, wodurch 0.99 g (Ausbeute: 71.7% ) BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)- Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; mit einem Schmelzpunkt bei 185 bis 191ºC erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub1;&sub0;&sub0;H&sub1;&sub2;&sub8;N&sub1;&sub6;O&sub2;&sub2;S)
C% H%
gefunden 61.91 6.64 11.55
berechnet 61.97 6.68 11.56
Aminosäure-Analyse:
Asp 1.01(1), Thr 2.60(3), Gly 1.91(2), Ala 0.89(1), Val 1.00(1), Tyr 0.96(1), Arg 1.03(1), Pro 2.06(2)

(15) Herstellung von BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg- (Tos) -Thr(Bzl) -Asp(OBzl) -Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl) - Pro-NH&sub2;:

0.90 g BOC-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)- Val-Gly-Ala-G4y-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; wurden 5 ml TFA unter Kühlung hinzugefügt, und das Gemisch wurde nach einem Verrühren für 30 Minuten unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Diethylether behandelt und über Natriumhydroxid unter Vakuum über Nacht getrocknet. Dem vorerwähnten Produkt wurden 5 ml DMF hinzugefügt, und das Carboxyl-Gruppe-Ende (nachfolgend "C-Ende" benannt) Prolinamid ist.
Gemisch wurde mit TEA unter Kühlung bei -5ºC auf pH 7.0 eingestellt. Danach wurden 17 mg HOBT und 0.20 g BOC-Gln- ONP hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Tage umgerührt. Während dieses Ablaufs wurde der pH-Wert des Gemisches TEA auf 7.0 eingestellt. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Gemisch unter verringertem Druck konzentriert, und dem Reaktionsgemisch wurde dann eine große Wassermenge hinzugefügt. Das abgeschiedene Produkt wurde durch Filtration gesammelt und dann von Methanol-Diethylether dreimal rekristallisiert, wodurch 0.85 g (Ausbeute: 88.5% ) BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro- Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp-(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro- NH&sub2; mit einem Schmelzpunkt bei 174 bis 180ºC erhalten wurden. Rf&sub2; = 0.61.
Elementaranalyse (für C&sub1;&sub0;&sub5;H&sub1;&sub3;&sub6;N&sub1;&sub8;O&sub2;&sub4;S)
C% H% N%
gefunden 60.99 6.62 12.13
berechnet 61.03 6.63 12.20 Aminosäure-Analyse:
Asp 1.02(1), Thr 2.68(3), Glu 1.02(1), Gly 1.97(2), Ala 0.91(1), Val 1.00(1), Tyr 0.97(1), Arg 1.00(1), Pro 2.10(2) .

(16) Herstellung von BOC-Lys [Cbz(o-Cl)]-Leu-OEt:

Eine Suspension von 6.0Ö g BOC-Lys [Cbz(o-Cl)]-OH·(t- Butylamin) in 50 ml Ethylacetat wurde mit Hydrochlorsäure auf pH 2 eingestellt, dann dreimal mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet, gefolgt von einer Verdampfung von Ethylacetat. Danach wurde der Rest in 50 ml Dichlormethan gelöst, und es wurden unter Kühlung bei -5ºC 2.40 g HCl·Leu-OEt und 1.82 g HOBT hinzugefügt, gefolgt weiterhin von einer Hinzufügung von 2.57 g WSC·HCl und 3.59 ml TEA unter Kühlung. Nach einer Stunde wurde das Gemisch auf Raumtemperatur geregelt und bei derselben über Nacht umgerührt. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Gemisch unter verringertem Druck konzentriert, um Dichlormethan zu verdampfen. Der Rest wurde in Ethylacetat gelöst und aufeinanderfolgend mit 1 N Hydrochlorsäure, mit 5% wäßriger Natriumhydrogencarbonat-Lösung und mit Wasser gewaschen. Nach einer Trocknung über wasserfreiem Magnesiumsulfat wurde das Produkt unter verringertem Druck konzentriert und von Ethylacetat-n-Hexan rekristallisiert, wodurch 5.47 g (Ausbeute: 80.7% ) BOC-Lys [Cbz(o-Cl)]-Leu-OEt mit einem Schmelzpunkt von 77-80ºC erhalten wurden.

(17) Herstellung von BOC-Lys [Cbz (o-Cl)]-Leu-OH:

Eine Lösung von 3.70 g BOC-Lys [Cbz(o-Cl-)]-Leu-OEt in 20 ml Ethanol wurde bei 0ºC mit 7.98 ml 1 N Natriumhydroxid vermischt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden umgerührt. Nach der Einstellung von pH auf 7 mit 1 N Hydrochlorsäure wurde das Gemisch unter verringertem Druck konzentriert, und der Rest wurde mit Diethylether gewaschen, gefolgt von einer Einstellung der wäßrigen Schicht auf pH 3. Danach wurde die wäßrige Schicht dreimal mit Ethylacetat extrahiert, und die Ethylacetatschicht wurde nach einem einmaligen Waschen mit Wasser über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und dann unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde dann in Diethylether gelöst, und der Diethylether wurde unter verringertem Druck verdampft, gefolgt von einem Trocknen, wodurch 3.50 g (Ausbeute: 99.7% ) eines Pulvers von BOC-Lys [Cbz(o-Cl)]- Leu-OH mit einem Schmelzpunkt von 45-65ºC erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub8;N&sub3;O&sub7;Cl)
C% H% N%
gefunden 56.75 7.18 8.07
berechnet 56.87 7.25 7.96

(18) Herstellung von BOC-Leu-His-OH:

Zu einer Lösung von 3.00 g (14.3 mM) His·H&sub2;O·HCl, gelöst in 30 ml Wasser, wurden unter Kühlung 2 ml TEA hinzugefügt, um den pH-Wert auf 7.0 einzustellen, und danach wurden 6.57 g BOC-Leu-OSU hinzugefügt. Das Reaktionsgemisch wurde so gesteuert, daß es mit der Hinzufügung von THF und Wasser immer homogen blieb. Nach einem Umrühren bei Raumtemperatur für 2 Tage wurde das Reaktionsgemisch unter verringertem Druck konzentriert, die in der wäßrigen Schicht abgeschiedenen Kristalle wurden abgefiltert und das Filtrat wurde unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde in n-Butanollösung, gesättigt mit Wasser, gelöst, dreimal mit Wasser, gesättigt mit n-Butanol, gewaschen, und die n-Butanollösung (gesättigt mit Wasser) wurde unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Diethylether aufgefüllt, um kristallisiert zu werden, und die Rekristallisation wurde von Methanol-Diethylether wiederholt, wodurch 4.46 g (Ausbeute: 85.8% ) des gewünschten Produkts mit einem Schmelzpunkt von 173 bis 174.5ºC erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub1;&sub7;H&sub2;&sub8;N&sub4;O&sub5;)
C% H% N%
gefunden 55.52 7.62 15.12
berechnet 55.42 7.66 15.21

(19) Herstellung von BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH:

Zu 4.53 g (15.3 mM) BOC-Ser(Bzl)-OH wurden unter Kühlung 15 ml TFA hinzugefügt, und die Lösung wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten umgerührt, gefolgt von einer Konzentration unter verringertem Druck. Der Rest wurde über Natriumhydroxid unter Vakuum über Nacht getrocknet. Das vorerwähnte Produkt wurde in 10 ml Wasser gelöst und unter Kühlung auf pH von etwa 7.0 mit der Hinzufügung von TEA eingestellt. Zu diesem Gemisch wurde eine Lösung von 4.20 g (12.3 mM) BOC-Leu-OSU, gelöst in 200 ml THF, hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Tage umgerührt. Während dieses Ablaufs wurde der pH-Wert mit der Hinzufügung von TEA auf etwa 7.0 gesteuert. Nach der Reaktion wurde das Gemisch unter verringertem Druck konzentriert, der Rest wurde in Ethylacetat gelöst, zweimal gewaschen mit 1 N Hydrochlorsäure, dreimal mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Das Ethylacetat wurde unter verringertem Druck verdampft, und der Rest wurde wiederholt von Ethylacetat-n- Hexan rekristallisiert, wodurch 3.25 g (Ausbeute: 64.7% ) BOC-Leu-Ser-(Bzl)-OH mit einem Schmelzpunkt von 78-82ºC erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub2;&sub1;H&sub3;&sub2;N&sub2;O&sub6;)
C% H% N%
gefunden 61.93 7.87 6.88
berechnet 61.75 7.90 6.86

(20) Herstellung von BOC-Lys(Cbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH:

BOC-Leu-Ser(Bzl)-OH (3.20 g, 7.83 mM) wurde unter Kühlung 12 ml TFA hinzugefügt, und nach einem Umrühren für 50 Minuten wurde das Gemisch unter verringertem Druck konzentriert. Diethylether wurde dem Rest hinzugefügt, die gebildeten Kristalle wurden durch Filtration gesammelt und über Natriumhydroxid in einem Trockner in Vakuum über Nacht getrocknet. Das Produkt wurde in 10 ml Wasser gelöst,und unter Kühlung wurden 3.10 g (6.53 mM) BOC-Lys(Cbz)-OSU, gelöst in 50 ml THF, hinzugefügt, und das Gemisch wurde mit TEA auf pH 7 eingestellt, gefolgt von einem Umrühren bei Raumtemperatur für 2 Tage. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Gemisch unter verringertem Druck konzentriert, der Rest wurde in Chloroform gelöst, aufeinanderfolgend dreimal gewaschen mit 1 N Hydrochlorsäure, einmal mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, dreimal mit 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und dreimal mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid. Danach wurde die Chloroformschicht unter verringertem Druck auf 5 ml konzentriert und einer Säule ausgesetzt, die mit Silicagel gepackt war. Als Eluant wurde ein Lösungsgemisch von Ethylacetat:Benzol (2 : 1) und danach Ethylacetat verwendet. Das Ethylacetat-Eluant wurde unter verringertem Druck konzentriert, und der Rest wurde von Ethylacetat-n-Hexan rekristallisiert, wodurch 2.64 g (Ausbeute: 60.3% ) eines Pulvers von BOC-Lys(Cbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH mit einem Schmelzpunkt von 50-58ºC erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub3;&sub5;H&sub5;&sub0;N&sub4;O9)
C%
gefunden 62.80 7.55 8.10
berechnet 62.69 7.48 8.36

(21) Herstellung von BOC-Lys [Cbz(o-Cl)]-Leu-Gln-Thr(Bzl)- Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly- Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2;:

BOC-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)-Thr(Bzl)-Asp-(OBzl)- Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; (0.80 g, 0.39 mM) wurde unter Kühlung in 35 ml TFA gelöst und nach einem Umrühren für 30 Minuten wurde die Lösung unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Diethylether behandelt-und das abgeschiedene Produkt wurde durch Filtration gesammelt und über Natriumhydroxid in Vakuum getrocknet. Dieses Produkt wurde dann in 5 ml DMF gelöst, und es wurden dann bei -5ºC 64 mg HOBT, 0.25 g BOC-Lys [Cbz(o-Cl)]-Leu-OH und 0.072 ml WSC der resultierenden Lösung hinzugefügt, gefolgt von einem Umrühren bei -5ºC für eine Stunde und dann bei Raumtemperatur über Nacht. Nach Vollendung der Reaktion (nachgeprüft durch TLC, Solvent System 2) wurde dem Reaktionsgemisch 1 N Hydrochlorsäure hinzugefügt, die gebildete Abscheidung wurde durch Filtration gesammelt, und es wurde eine wiederholte Abscheidung von Methanol-Diethylether zweimal wiederholt, wodurch 0.80 g (Ausbeute: 83.3% ) der vorerwähnten Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 169-172ºC erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub1;&sub2;&sub5;H&sub1;&sub6;&sub4;N&sub2;&sub1;O&sub2;&sub8;SCL·HCl)
C% H%
gefunden 59.85 6.56 11.73
berechnet 59.75 6.62 11.71
Aminosäure-Analyse:
Asp 1.02(1), Thr 2.73(3), Glu 1.04(1), Gly 1.95(2), Ala 0.89(1), Val 1.00(1), Leu 0.91(1), Tyr 0.87(1), Lys 0.94(1), Arg 1.00(1), Pro 2.07(2).

(22) Herstellung von BOC-Leu-His-Lys[(Cbz(o-Cl)]-Leu-Gln- Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg-Tos)-Thr(Bzl)Asp(OBzl) - Val-Gly-Ala-Gly-Thr-Bzl)-Pro-NH&sub2;:

BOC-Lys [Cbz(o-Cl)]-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Pro-Arg- (Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro- NH&sub2; (0.70 g, 0.28 mM) wurde unter Kühlung in 5 ml TFA gelöst und nach einem Umrühren für 30 Minuten wurde die Lösung unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Diethylether behandelt, das abgeschiedene Produkt wurde durch Filtration gesammelt und über Natriumhydroxid unter verringertem Druck getrocknet. Dieses Produkt wurde in 5 ml DMF gelöst und unter Kühlung mit TEA auf pH 7.0 eingestellt. Nach der Hinzufügung von 46 mg HOBT wurden 125 mg BOC-Leu-His-OH hinzugefügt, gefolgt weiterhin von einer Hinzufügung unter Kühlung bei -5ºC von 65 mg WSC HCl und 0.048 ml TEA. Das Gemisch wurde dann für eine Stunde umgerührt, und die Temperatur wurde auf Raumtemperatur geregelt, bei welcher das Gemisch über Nacht umgerührt wurde. Nach Vollendung der Reaktion (überprüft mit TNC, Solvent System 4) wurden dem Reaktionsgemisch 1 N Hydrochlorsäure hinzugefügt, die gebildete Abscheidung wurde durch Filtration gesammelt und wiederholt von Methanol-Diethylether abgeschieden. Die wiederholte Abscheidung von DMF-Diethylether wurde nochmals wiederholt, und die gesammelte Abscheidung wurde dann getrocknet, wodurch 0.70 g (Ausbeute: 92.1%) eines Pulvers der vorerwähnten Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 160-170ºC erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub1;&sub3;&sub7;H&sub1;&sub8;&sub2;N&sub2;&sub5;O&sub3;&sub0;SCl·4H&sub2;O)
C% H% N%
gefunden 58.60 6.55 12.35
berechnet 58.80 6.84 12.51
Aminosäure-Analyse:
Asp 1.01(1), Thr 2.60(3), Glu 0.98(1), Gly 1.92(2), Ala 0.89(1), Val 1.00(1), Leu 1.75(2), Tyr 0.84(1), Lys 0.95(1), His 0.87(1), Arg 1.01(1), Pro 2.10(2).

(23) Herstellung von BOC-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys[Cbz(o-Cl)]- Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg-(Tos)-Thr(Bzl)-Asp (OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2;:

BOC-Leu-His-Lys [Cbz(o-Cl)]-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro- Arg-(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro- NH&sub2; (0.65g, 0.24 mM) wurde in 5 ml TFA gelöst, und die Lösung wurde dann für 40 Minuten umgerührt und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Diethylether behandelt, das Produkt wurde durch Filtration gesammelt und über Natriumhydroxid unter Vakuum getrocknet. Dies wurde in 5 ml DMF gelöst und mit TEA auf pH 7 eingestellt. Es wurden dann unter Kühlung 0.16 g BOC-Glu(OBzl)-OSU hinzugefügt, und der pH-Wert wurde wiederholt mit TEA auf 7 eingestellt, gefolgt von einem Umrühren bei Raumtemperatur für 2 Tage. Nach Vollendung der Reaktion (überprüft von TLC, Solvent System 4) wurde dem Reaktionsgemisch 1 N Hydrochlorsäure hinzugefügt, die gebildete Abscheidung wurde durch Filtration gesammelt, eine wiederholte Abscheidung wurde zweimal wiederholt von Methanol-Diethylether, und die gesammelte Abscheidung würde getrocknet, wodurch 0.55 g (Ausbeute: 73.3% ) des Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 169-175ºC (zerlegt) erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub1;&sub4;&sub9;H&sub1;&sub9;&sub5;N&sub2;&sub6;O&sub3;&sub3;SCl·4H&sub2;O)
C% H% N%
gefunden 59.57 6.57 12.04
berechnet 59.30 6.78 12.07
Aminosäure-Analyse:
Asp 1.03(1), Thr 2.90(3), Glu 2.02(2), Gly 2.00(2), Ala 0.90(1), Val 1.00(1), Leu 1.86(2), Tyr 0.89(1), Lys 0.97(1), His 0.88(1), Arg 1.03(1), Pro 2.04(2).

(24) Herstellung von BOC-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His-Lys[Cbz(o- Cl)3-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg-(Tos)-Thr (Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2;:

BOC-Glu-OBzl)-Leu-His-Lys[Cbz(o-Cl)]-Leu-Gln-Thr(Bzl)- Tyr(Bzl)-Pro-Arg-(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-ValGly-Ala- Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; (0.50 g, 0.17 mM) wurde in 5 ml TFA gelöst, und die Lösung wurde für 45 Minuten umgerührt und unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Diethylether behandelt, das abgeschiedene Produkt wurde durch Filtration gesammelt, getrocknet über Natriumhydroxid unter Vakuum. Dies wurde in 5 ml DMF gelöst und dann mit TEA auf pH 7 eingestellt. Es wurden dann 96 mg BOC-Gln-ONP hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 2 Tage umgerührt. Nach Vollendung der Reaktion wurde dem Reaktionsgemisch 1 N Hydrochlorsäure hinzugefügt, und die gebildete Abscheidung wurde durch Filtration gesammelt. Nach einem Waschen mit Wasser wurde eine wiederholte Abscheidung dreimal wiederholt von Methanol-Diethylether, und die gesammelte Abscheidung wurde getrocknet, wodurch 0.48 g (Ausbeute: 92.3% ) des Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 212-216ºC (zerlegt) erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub1;&sub5;&sub4;H&sub2;&sub0;&sub3;N&sub2;&sub8;O&sub3;&sub5;SCL·4H&sub2;O)
C% H% N%
gefunden 58.62 6.49 12.30
berechnet 58.79 6.76 12.47
Aminosäure-Analyse:
Asp 1.02(1), Thr 2.83(3), Glu 2.95(3), Gly 1.96(2), Ala 0.92(1), Val 1.00(1), Leu 1.80(2), Tyr 0.77(1), Lys 0.93(1), His 0.88(1), Arg 1.00(1), Pro 2.15(2).

(25) Herstellung von BOC-Lys(Cbz)-Leu-Ser-(Bzl)-Gln-Glu- (OBzl)-Leu-His-Lys [Cbz(o-Cl)]-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr (Bzl)-Pro-Arg-(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly-Ala- Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2;:

BOC-Gln-Glu-(OBzl)-Leu-His-Lys [Cbz(o-Cl)]-Leu-Gln-Thr (Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg-(Tos)-Thr(Bzl)-Asp(OBzl)-Val-Gly- Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; (0.45 g, 0.15 mM) wurden unter Kühlung in 3 ml TFA gelöst-und die Lösung, welche weiterhin 0.2 ml 4 N Hydrochlorsäure/Dioxan hinzugefügt wurde, wurde bei Raumtemperatur für 45 Minuten umgerührt. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch unter verringertem Druck konzentriert. Diethylether wurde dem Rest hinzugefügt, die gebildete Abscheidung wurde durch Filtration gesammelt, intensiv mit Diethylether gewaschen und über Natriumhydroxid in einem Trockner unter Vakuum über Nacht getrocknet. Danach wurde das getrocknete Produkt in 4 ml DMF gelöst, mit TEA auf pH 7.0 bei -5ºC eingestellt, aufgefüllt mit 20 mg HOBT und 0.10 g BOC-Lys(Cbz)-Leu-Ser(Bzl)-OH. Weiterhin wurden 32 mg WSC·HCl und 0.023 ml TEA hinzugefügt, gefolgt von einem Umrühren für eine Stunde, die Temperatur wurde auf Raumtemperatur geregelt und dabei wurde das Umrühren über Nacht fortgesetzt. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Rekationsgemisch unter verringertem Druck konzentriert, dem Rest wurde 1 N Hydrochlorsäure hinzugefügt-und die gebildete Abscheidung wurde durch Filtration gesammelt. Eine wiederholte Abscheidung wurde dreimal von Methanol- Diethylether wiederholt,und die gesammelte Abscheidung wurde getrocknet, wodurch 0.37 g (Ausbeute: 69.8% ) des Pulvers mit einem Schmelzpunkt von 170-180ºC (zerlegt) erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub1;&sub8;&sub4;H&sub2;&sub4;&sub3;N&sub3;&sub2;O&sub4;&sub1;SCL·HCl·5H&sub2;O)
C% H% N%
gefunden 58.74 6.58 12.22
berechnet 58.88 6.82 11.94 Herstellung des Peptids 1-9
(1) Herstellung von
Ein Gemisch von 10.0 g (0.03 M) Cbz
1,38 g p-Formaldehyd, 0.3 g TosOH und 130 ml Benzol wurden unter einem Rückfluß für 4 Stunden in einem Kolben des Eierfrucht- Typs erwärmt. Nach Vollendung der Reaktion wurde die Benzollösung auf Raumtemperatur abgekühlt, dreimal mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, gefolgt von einer Verdampfung des Benzols unter verringertem Druck, wodurch ein öliger Rest erhalten wurde.
Das ölige Produkt wurde in 60 ml Methanol gelöst, und es wurde dann unter Kühlung Natriummethylat hinzugefügt, gebildet durch eine Lösung von 0.7 g metallischem Natrium in 60 ml Methanol. Das Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt.
Nachdem das Reaktionsgemisch mit Hydrochlorsäure auf pH 5 eingestellt war, wurde Methanol unter verringertem Druck verdampft, und der erhaltene ölige Rest wurde in Ethylacetat gelöst. Die Lösung wurde mit 1 N Hydrochlorsäure gewaschen, dann viermal mit Wasser und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet, gefolgt von einer Verdampfung des Ethylacetats, wodurch 10.2 g eines öligen Produkts erhalten wurden, welches die vorerwähnte Titelverbindung enthielt.

(2) Herstellung von BOC-Thr(Bzl)

Ein öliges Produkt (10.2 g) mit Cbz wurde in 60 ml Methanol und 30 ml Wasser gelöst, und es wurde dann mit der Hinzufügung von Palladium-Kohlenstoff eine Hydrierung für 48 Stunden durchgeführt. Nachdem der Katalysator abgefiltert war, wurde das Filtrat unter verringertem Druck konzentriert. Zu dem Rest wurden 100 ml Methanol hinzugefügt, die unlösbaren Stoffe wurden abgefiltert und das Filtrat wurde unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde mit Dietethylether vermischt, um kristallisiert zu werden so daß 4.12 g (Ausbeute: 67.6% )
erhalten wurden. Dieses Produkt wurde in 80 ml DMF suspendiert, eingestellt auf einen pH-Wert von etwa 7.0 unter Kühlung mit einer Hinzufügung von 2.84 ml TEA und 9.06 g BOC-Thr(Bzl)-OSU, gefolgt von einer Umrührung bei Raumtemperatur für 2 Tage.
Nach der Reaktion wurde DMF unter verringertem Druck verdampft, und der Rest wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde zweimal aufeinanderfolgend gewaschen mit 1 N Hydrochlorsäure, einmal mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, zweimal mit 2% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und dreimal mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Das durch Verdampfung von Ethylacetat unter verringertem Druck erhaltene ölige Produkt wurde in 20 ml Diethylether gelöst und mit 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat extrahiert. Das Extrakt wurde auf pH 7.0 eingestellt und mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Eine Verdampfung des Ethylacetats ergab 5.90 g eines öligen Produkts, welches die Titelverbindung enthielt.

(3) Herstellung von BOC-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)-

Zu 5.90 g BOC-Thr(Bzl)- wurden unter Kühlung 18 ml TFA hinzugefügt, um eine Lösung herzustellen, die bei Raumtemperatur für 30 Minuten umgerührt wurde. Dann wurde TFA unter verringertem Druck verdampft, und der Rest wurde über Natriumhydroxid in einem Trockner in Vakuum über Nacht getrocknet.
Das ölige Produkt wurde in 15 ml DMF gelöst, eingestellt auf pH 7.0 unter Kühlung mit der Hinzufügung von 1.67 ml TEA, Hinzufügung von 4.69 g BOC-Ser(Bzl)-OSU und fortgesetztes Umrühren bei Raumtemperatur für 2 Tage. Nach der Reaktion wurde DMF unter verringertem Druck verdampft, und der Rest wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde aufeinanderfolgend mit 1 N-Hydrochlorsäure, gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid gewaschen und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
Danach wurde der Ethylacetatextrakt unter verringertem Druck auf etwa 10 ml konzentriert und unter Kühlung wurde eine äquivalente Menge Cyclohexylamin (C&sub6;H&sub1;&sub1;NH&sub2;) hinzugefügt. Das Gemisch wurde dann unter verringertem Druck konzentriert, und das erhaltene ölige Produkt wurde von Diethylether und n-Hexan verfestigt und wiederholt abgeschieden von Ethylacetat-Diethylether-n-Hexan, wodurch 5.56 g (Ausbeute: 51.1% ) des Titelprodukts mit einem Schmelzpunkt von 71-74ºC erhalten wurden.

(4) Herstellung von BOC-Ser(Bzl)-Leu-OEt:

Zu einer Suspension von 4.30 g H-Leu-OEt·HCl in 70 ml THF wurde unter Kühlung bei-5ºC eine äquivalente Menge TEA hinzugefügt, um eine Neutralisierung zu bewirken. Diesem Gemisch wurden 5.90 g BOC-Ser(Bzl)-OH und 2.70 g HOBT hinzugefügt. Weiterhin wurden 4.33 g DCC, gelöst in 30 ml THF, hinzugefügt, und das Gemisch wurde als solches für eine Stunde umgerührt und danach bei Raumtemperatur über Nacht. Nach Vollendung der Reaktion wurde DCU (Dicyclohexylurea) entfernt und THF unter verringertem Druck verdampft. Der Rest wurde mit Ethylacetat extrahiert, die Ethylacetatschicht wurde aufeinanderfolgend gewaschen mit Wasser, 1 N Zitronensäurelösung, gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, und dann über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Danach wurde Ethylacetat verdampft, und der Rest wurde von Ethylacetat-n-Hexan rekristallisiert, wodurch 7.10 g (Ausbeute: 81.3% ) der Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 75-77ºC erhalten wurden.

(5) Herstellung von BOC-Ala-Ser(Bzl)-Leu-OEt:

Zu 6.00 g (13.74 mM) BOC-Ser(Bzl)-Leu-OEt wurden unter Kühlung 10 ml TFA hinzugefügt. Nachdem die Reaktion bei Raumtemperatur für 30 Minuten ausgeführt war, wurde TFA unter verringertem Druck verdampft, und der Rest wurde über Natriumhydroxid in einem Trockner unter Vakuum über Nacht getrocknet. Das Produkt wurde dann in 20 ml DMF gelöst, eingestellt auf pH von etwa 7.0, dann mit 4.33 g BOC-Ala-OSU vermischt-und anschließend wurde das Gemisch bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt.
Nach Vollendung der Reaktion wurde DMF unter verringertem Druck verdampft, und der Rest wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde aufeinanderfolgend gewaschen mit 1 N Hydrochlorsäure, gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, 5% wäßrigem Natrimhydrogencarbonat und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid. Nach einem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat und einem Verdampfen von Ethylacetat unter verringertem Druck wurde eine Kristallisation durch Hinzufügung von Diethylether-n-Hexan bewirkt, so daß 6.43 g (Ausbeute: 92.2% ) der Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 98-99ºC erhalten wurden.

(6) Herstellung von BOC-Ala-Ser(Bzl)-Leu-NHHNH&sub2;:

Eine Lösung von 10.98 g (22.0 mM) BOC-Ala-Ser(Bzl)-Leu-OEt, gelöst in 40 ml Methanol wurde mit 13.8 ml von 80% NH&sub2;NH&sub2;·H&sub2; O vermischt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht stehen gelassen. Dem resultierenden Gemisch wurde Diethylether hinzugefügt, um vollständig abzuscheiden, und die Abscheidungen wurden durch Filtration gesammelt, ausgewaschen mit Diethylether und dann wiederholt abgeschieden von Methanol-Diethylether, wodurch 9.61 g (Ausbeute: 90.0% ) der vorerwähnten Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 174-176ºC erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub2;&sub4;H&sub3;&sub9;N&sub5;O&sub6;·1/4H&sub2;O)
C% H% N%
gefunden 57.86 7.87 13.95
berechnet 57.87 7.99 14.06

(7) Herstellung von BOC-Ala-Ser(Bzl)-Leu-Ser(Bzl)-

BOC-Ser(Bzl)-Thr(Bzl)
·C&sub6;H&sub1;&sub1;NF&sub2; 83.87 g) mit 1 N Hydrochlorsäure in Ethylacetat behandelt, um in eine freie Säure umgewandelt zu werden, die über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann unter verringertem Druck konzentriert wurde. Zu dem öligen Rest wurde unter Kühlung 10 ml TFA hinzugefügt, das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten umgerührt, gefolgt von einer Verdampfung von TFA unter verringertem Druck, und dann wurde der Rest über NaOH in einem Trockner unter Vakuum über Nacht getrocknet.
Eine Lösung von 2.73 g BOC-Ala-Ser(Bzl)-Leu-NHNH&sub2;, gelöst in 20 ml DMF, wurde gekühlt auf -15ºC, und dann wurden 2.76 ml 6 N Hydrochlorsäure-Dioxan hinzugefügt. Während dieselbe Temperatur beibehalten wurde, wurden 0.74 ml Isoamylnitrit hinzugefügt, um eine Azidierung zu bewirken.
Auf der anderen Seite wurde das wie vorstehend erhaltene trockene TFA-Salz in 30 ml DMF gelöst, neutralisiert mit TEA, und dieses Gemisch wurde allmählich unter Kühlung bei -20ºC der Lösung hinzugefügt, welche die vorerwähnte azidierte Verbindung enthielt. Nach Vollendung der Hinzufügung wurde das Gemisch auf einen pH-Wert von etwa 7 mit TEA eingestellt, und die Reaktion wurde als solche bei 4ºC über Nacht durchgeführt.
Nach Vollendung der Reaktion wurde DMF unter reduziertem Druck verdampft, und der Rest wurde mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatschicht wurde aufeinanderfolgend gewaschen mit 1 N Hydrochlorsäure und gesattigtem wäßrigem Natriumchlorid, und danach über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nachdem das Ethylacetat unter verringertem Druck verdampft war, wurde eine Kristallisation mit der Hinzufügung von n-Hexan bewirkt, wodurch 4.31 g (Ausbeute: 83.1% ) der Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 170-177ºC (zerlegt) erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub5;&sub4;H&sub7;&sub6;N&sub6;O&sub1;&sub4;)
C% H% N%
gefunden 62.58 7.32 8.24
berechnet 62.77 7.41 8.13

(8) Herstellung von

Eine Lösung von 2.21 g (2.14 mM) BOC-Ala-Ser(Bzl)-Leu- Ser(Bzl)-Thr(Bzl)- gelöst in 20 ml trockenem Pyridin, wurde mit 3.5 g TFA-ONP vermischt und bei 45ºC für 4 Stunden umgerührt. Nach der Reaktion wurde das Gemisch unter verringertem Druck konzentriert und zu dem Rest wurde Diethylether hinzugefügt. Die gebildeten Abscheidungen wurden durch Filtration gesammelt, gewaschen mit Diethylether und getrocknet, wodurch 2.1 g eines gelblich-braunen Pulver erhalten wurden.
Zu diesem Pulver wurden unter Kühlung 14.5 ml TFA hinzugefügt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 30 Minuten umgerührt. TFA wurde unter verringertem Druck verdampft, und der Rest wurde über Natriumhydroxid in einem Trockner unter Vakuum über Nacht getrocknet. Das Produkt wurde dann in 14.5 ml DMF gelöst, und die resultierende Lösung wurde tropfenweise 1.8 Liter trockenen Pyridins von 45ºC unter Umrühren für eine Stunde hinzugefügt. Nach Vollendung der tropfenweise Hinzufügung wurde das Umrühren über Nacht bei einer Flüssigkeitstemperatur von 50ºC fortgesetzt, gefolgt durch ein weiteres Umrühren bei Raumtemperatur für 2 Tage. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Gemisch unter verringertem Druck auf etwa 10 ml konzentriert, die dann in 500 ml Chloroform gelöst wurden, gewaschen aufeinanderfolgend mit gesättigtem wäßrigem Natriumchloridg, N Hydrochlorsäure, gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, und dann über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet, gefolgt von einer Verdampfung des Chloroforms. Zu dem Rest wurde n-Hexan hinzugefügt, und die gebildeten Abscheidungen wurden durch Filtration gesammelt, wodurch 1.60 g (Ausbeute: 81.9% ) der vorerwähnten Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 185ºC (zerlegt) erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub4;&sub9;H&sub6;&sub6;N&sub6;O&sub1;&sub1;)
C% H% N%
gefunden 63.99 7.20 9.05
berechnet 64.31 7.27 9.18

(9) Herstellung von

Eine Lösung von 0.85 g
gelöst in 6 ml DMF und 30 ml Methanol, wurde mit 13.3 ml von 80% NH&sub2;NH&sub2;·H&sub2;O vermischt, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt.
Nach Vollendung der Reaktion wurde das Gemisch mit Wasser gewaschen-und die gebildeten Abscheidungen wurden durch Filtration gesammelt. Nach dem Waschen mit Wasser wurde das Produkt unter einem Rückfluß mit der Hinzufügung von 20 ml Methanol erwärmt. Danach wurde das Gemisch auf Raumtemperatur abgekühlt, und die Abscheidungen wurden durch Filtration gesammelt, so daß 0.51 g (Ausbeute: 60% ) der vorerwähnten Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 245-250ºC (zerlegt) erhalten wurden.
Elementaranalyse (für CHN101/2HO)AC% H%
gefunden 62.56 7.32 12.13
berechnet 62.39 7.31 12.13
Aminosäure-Analyse:
Thr 0.89(1), Ser 1.75(2), Ala 0.89(1), Leu 1.00(1), α-Aminosuberinsäure 1.08 (1)

(10) Herstellung von BOC-Leu-Gly-OBzl:

Zu einer Lösung von 6.00 g BOC-Leu-OHtH&sub2;O, 3.49 g HOBT und 9.59 g H-Gly-OBzl·TosOH, gelöst in 30 ml DMF, wurde unter Kühlung bei -5ºC und Umrühren eine Lösung von 4.97 ml WSC, gelöst in 10 ml DMF, tropfenweise hinzugefügt, und nach einer Stunde wurde die Temperatur auf Raumtemperatur geregelt, bei welcher das Umrühren über Nacht fortgesetzt wurde. Das Reaktionsgemisch wurde unter verringertem Druck konzentriert, um DMF zu verdampfen, und der Rest wurde in Ethylacetat gelöst. Die Ethylacetatschicht wurde aufeinanderfolgend gewaschen mit 1 N Hydrochlorsäure, Wasser, 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und Wasser, dann getrocknet über wasserfreiem Natriumsulfat und unter verringertem Druck konzentriert, wodurch 9.2 g BOC-Leu-Gly-OBzl als ein öliges Produkt erhalten wurden. Rf&sub1; = 0.59.
Elementaranalyse (für C&sub2;&sub0;H&sub2;&sub0;N&sub2;O&sub5;)
C% H% N%
gefunden 65.50 5.40 7.58
berechnet 65.21 5.47 7.60

(11) Herstellung von BOC-Val-Leu-Gly-OBzl:

Zu 9.2 g BOC-Leu-Gly-OBzl wurden unter Kühlung 45 ml TFA hinzugefügt, und das Gemisch wurde nach einem Verrühren für 30 Minuten unter verringertem Druck konzentriert. Der Rest wurde über Natriumhydroxid im Vakuum getrocknet. Es wurden dann 75 ml DMF hinzugefügt, und das Gemisch wurde auf pH 7.0 mit TEA unter Kühlung bei -5ºC eingestellt, gefolgt von einer Hinzufügung von 5.54 g BOC-Val-OH, 3.45 g HOBT, 5.37 g WSC·HCL und 3.93 ml TEA, und die Reaktion wurde für eine Stunde durchgeführt. Das Gemisch wurde dann bei Raumtemperatur über Nacht umgerührt. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Gemisch unter verringertem Druck konzentriert und mit Ethylacetat extrahiert. Nach einem Waschen aufeinanderfolgend mit gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid, 1 N Hydrochlorsäure, 5% wäßrigem Natriumhydrogencarbonat und gesättigtem wäßrigem Natriumchlorid wurde das Gemisch über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet. Ethylacetat wurde verdampft und das Produkt wurde von n-Hexan kristallisiert, wodurch 10.2 g (Ausbeute: 80.3% ) BOC-Val-Leu-Gly-OBzI mit einem Schmelzpunkt von 125-129ºC erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub2;&sub5;H&sub3;&sub9;N&sub3;O&sub6;)
C% H% N%
gefunden 62.87 8.21 8.79
berechnet 62.87 8.23 8.80

(12) Herstellung von BOC-Val-Leu-Gly-OH:

BOC-Val-Leu-Gly-OBzl (5 g, 10 mM) wurde in 25 ml Methanol gelöst, gemischt unter Kühlung mit 6 ml 2 N Natriumhydroxid, und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur für 3 Stunden umgerührt.
Mit der Einstellung des pH-Wertes auf etwa 7 mit 1 N Hydrochlorsäure wurde dann das Gemisch mit Ethylacetat extrahiert, und die Ethylacetatschicht wurde mit 1 N Hydrochlorsäure und mit Wasser gewaschen, gefolgt von einem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat. Dann wurde das Ethylacetat unter verringertem Druck verdampft, und der Rest wurde von Diethylether-n-Hexan rekristallisiert, so daß 3.59 g (Ausbeute: 92.5% ) der vorerwähnten Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 106-115ºC erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub1;&sub8;H&sub3;&sub3;N&sub3;O&sub6;·1/4H&sub2;O)
C% H% N%
gefunden 54.96 8.48 10.56
berechnet 55.16 8.61 10.72

(13) Herstellung von H-Val-Leu-Gly-OH:

Eine Lösung von 1.40 g (3.61 mM) BOC-Val-Leu-Gly-OH, gelöst in 17 ml Ethylacetat, wurde unter Kühlung vermischt und mit 9 ml Ethylacetat umgerührt, welches 3.5 N Hydrochlorsäure enthielt, und die Reaktion wurde bei Raumtemperatur für 2 Stunden durchgeführt. Nach Vollendung der Reaktion wurde das Ethylacetat unter verringertem Druck verdampft, und der Rest wurde in 3.5 ml Wasser : Methanol (1:5) gelöst, neutralisiert mit TEA, und dann unter Hinzufügung von Diethylether in einem Kühler stehengelassen. Die abgeschiedenen Kristalle wurden durch Filtration gesammelt, so daß 0.78 g (Ausbeute: 75.0% ) der vorerwähnten Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 239-241ºC (zerlegt) erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub1;&sub3;H&sub2;&sub5;N&sub3;O&sub4;)
C% H% N%
gefunden 54.11 8.74 14.41
berechnet 54.34 8.77 14.62

(14) Herstellung von

Eine Suspension von 0.25 g (0.27 mM)
in 5 ml DMF wurde unter Kühlung bei -5ºC mit 0.14 ml 6 N Hydrochlorsäure/Dioxan vermischt und vollständig gelöst durch eine Erhöhung der Temperatur auf 10ºC.
Danach wurde die Lösung auf -5 bis -10ºC gekühlt, wurden 0.036 ml Isoamylnitrit allmählich hinzugefügt und wurde die Reaktion bei derselben Temperatur für 20 Minuten durchgeführt.
Nach Vollendung der Reaktion wurde das Gemisch auf -50ºC gekühlt, und es wurden dann 0.23 g H-Val-Leu-Gly-OH hinzugefügt, gefolgt von einer weiteren Einstellung des pH-Wertes auf etwa 7 mit TEA, und die Reaktion wurde in einem Eisbad für 2 Tage durchgeführt. Das Reaktionsgemisch wurde dann unter Kühlung allmählich in 20 ml 0.5 N Hydrochlorsäure eingebracht, die gebildeten Abscheidungen wurden durch Filtration gesammelt, gewaschen mit 0.5 N Hydrochlorsäure und Wasser und schließlich getrocknet, so daß 0.22 g (Ausbeute: 69.6% ) der vorerwähnten Titelverbindung mit einem Schmelzpunkt von 255-264ºC (zerlegt) erhalten wurden.
Elementaranalyse (für C&sub6;&sub1;H&sub8;&sub7;N&sub9;O&sub1;&sub4;H&sub2;O)
C% H% N%
gefunden 61.31 7.11 10.51
berechnet 61.65 7.55 10.61
Aminosäure-Analyse:
Thr 0.88(1), Ser 1.77(2), Gly 1.01(1), Ala 0.91(1), Val 1.00(1), Leu 2.00(2), α-Aminosuberinsäure 1.05(1).

Claims

1. Polypeptid, dargestellt durch die folgende Formel, oder sein Säurezusatzsalz oder Komplex:

wobei: Ala = Alanin, Ser = Serin, Leu = Leucin, Thr = Threonin, Val = Valin, Gly = Glycin, Lys = Lysin, Gln = Glutamin, Glu = Glutaininsaure, His = Histidin, Tyr = Tyrosin, Pro = Prolin, Arg = Arginin, Asp = Asparginsäure und n = Ganzzahl von 3 bis 7.

2. Verfahren zur Herstellung von Polypeptid, dargestellt durch die folgende Formel, oder sein Säurezusatzsalz oder Komplex:

wobei: Ala = Alanin, Ser = Serin, Leu = Leucin, Thr = Threonin, Val = Valin, Gly = Glycin, Lys = Lysin, Gln = Glutamin, Glu = Glutaminsaure, His = Histidin, Tyr = Tyrosin, Pro = Prolin, Arg = Arginin, Asp = Asparginsäure und n = Ganzzahl von 3 bis 7, bei welchem ein Peptid oder Polypeptid gemäß der vorstehenden Formel gebildet wird und die einen Peptidrest gemäß der folgenden Formel

wobei R einen aktiven Esterrest bedeutet und die Bedeutungen von Ala, Ser, Leu, Thr und n gleich sind wie die vorstehenden Angaben,

enthaltenden strukturellen Einheiten, die in einer beliebigen Reaktionsstufe ausgebildet werden, einer Zyklisierungsreaktion unterworfen werden.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß n eine Ganzzahl von 4 bis 6 ist.

4. Verfahren nach Anspruch 2 oder 3, dadurch gekennzeichnet, daß der Aminosäureanteil, der von der Säure der folgenden Formel

erhalten wird, das L - Isomer ist.

5. Verfahren zum Herstellen eines Peptids der folgenden Formel

dadurch gekennzeichnet, daß ein Reaktionsprodukt von BOC-Lys (Cbz)-Leu-Ser(Bzl)-Gln-Glu(OBzl)-Leu-His- Lys/Cbz(o-Cl)/-Leu-Gln-Thr(Bzl)-Tyr(Bzl)-Pro-Arg(Tos)- Thr(Bzl)-ASp(OBzI)-Val-Gly-Ala-Gly-Thr(Bzl)-Pro-NH&sub2; und Fluoressigsäure mit

in Dimethylformamid in Anwesenheit von N-Hydroxy- Succinimid reagiert wird.

6. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein Polypeptid gemäß Anspruch 1 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger aufweist.

7. Polypeptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung der Paget-Krankheit.

8. Polypeptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung von Osteoporosis.

9. Polypeptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Behandlung von digestiver Hypercalcemia.

10. Polypeptid nach Anspruch 1 zur Verwendung bei der Absenkung der Kalziumkonzentration im Blut.