DE3144818A1 - C-terminales fragment von menschlichem choriongonadotropin - Google Patents
C-terminales fragment von menschlichem choriongonadotropinInfo
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Description
-Z-
Beschreibung
Die Erfindung betrifft ein C-terminales Fragment von
menschlichem Choriongonadotropin (HCG) bzw.- ein endständiges C-Fragment von menschlichem chorialem Godanotropin.
Die Erfindung betrifft insbesondere ein Peptid der Formel
127 128 129- 130 131 132 R - Ser - Leu - Pro - Ser - Pro - Ser 133
134 135 136 137 138 139 Arg - Leu - Pro - GIy - Pro - Ser - Asp 140
141 142 143 144 145 Thr - Pro - He - Leu - Pro - Gin - OH
worin
R für H oder eine R^-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Gruppe
steht,
wobei R1 H oder eine R^R-^-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Gruppe
bedeutet,
wobei R2 H oder eine R^-Asp-His-Pro-Leu-Thr-Gruppe
darstellt,
wobei R/ für eine H-Rc-Gly-Gly-Pro-Lys-Gruppe
steht,
worin R5 eine Cys- oder Tyr-Gruppe bedeutet,
und wobei
R, eine Cys- oder S-Acetamidmethyl-Cys-Gruppe
darstellt,
oder seine Salze.
oder seine Salze.
HCG ist ein Glycoproteinhormon, welches von der Placenta
bei der Schwangerschaft abgeschieden wird, und es besitzt für die Aufrechterhaltung der Schwangerschaft eine wichtige
Rolle. Die quantitative oder qualitative Analyse von HCG kann für die Diagnose der Schwangerschaft, der ektopischen
Schwangerschaft oder des Choriocarcinoma verwendet werden. In dem gonadotropen Hormon kommen jedoch das
luteinisierende Hormon (LH), das follikelstimulierende Hormon (FSH) und das choreale Gonadotropin (CG) vor, und
ihre Molekülstrukturen ähneln sich sehr und sie sind
3U4818
Glycoproteine. Weiterhin enthalten sie zwei Sub-Einheiten von α- und ß-Ketten. Der Austausch der α-Kette in jedem
gonadotropen Hormon beeinflußt ihre Aktivität nicht, und die Strukturen der α-Kette ähneln sich somit sehr. Die ß-Kette
ist für jedes Gonadotropin spezifisch, und die
ß-Ketten von LH und CG sind sehr ähnlich. Jedoch kann die Aminosäure-Sequenz um das endständige C-Atom der ß-Kette von CG unterschieden werden, und daher kann ein genaues und verläßliches CG-Analysesystem zur Verfügung gestein, werden, ohne daß,die anderen gonadotropen Hormone, insbesondere LH, stören bzw. ohne Kreuzung der anderen Gonadotropen Hormonen insbesondere LH.
ß-Ketten von LH und CG sind sehr ähnlich. Jedoch kann die Aminosäure-Sequenz um das endständige C-Atom der ß-Kette von CG unterschieden werden, und daher kann ein genaues und verläßliches CG-Analysesystem zur Verfügung gestein, werden, ohne daß,die anderen gonadotropen Hormone, insbesondere LH, stören bzw. ohne Kreuzung der anderen Gonadotropen Hormonen insbesondere LH.
Die vorliegende Erfindung wurde auf der obigen Grundlage entwickelt, und der Antikörper, der aus dem Antigen erhalten
wird, das das neue Peptid der Formel (i) aufweist, besitzt die Immun-Kreuzaktivität. Das Peptid (i) ist nützlich
für die Herstellung eines Antikörpers für die Analyse von HCG oder als Markierungsmittel. Die Synthese des erfindungsgemäßen
Peptide (I) kann wie folgt durchgeführt werden.
Eine Aminosäure und/oder ein niedriges Peptid werden, durch
Kondensation in der Reihenfolge der Aminosäure-Sequenz der Formel (I) hergestellt und die Schutzgruppe für die reaktive
Gruppe wird bei der letzten Stufe der Reaktion abgespalten. Die Kondensationsreaktion kann nach an sich bekannten
Peptid-Syntheseverfahren durch wiederholtes Anbringen und Entfernen der Schutzgruppen und Kondensation
durchgeführt werden. Die Schutzgruppen für die Synthese der Ausgangsmaterialien oder Zwischenprodukte sind an
sich bekannte Schutzgruppen für die Peptidsynthese und sie sind leicht durch Hydrolyse, Säurezersetzung, Reduktion? Aminolyse oder Hydrazinolyse entfernbar.
sich bekannte Schutzgruppen für die Peptidsynthese und sie sind leicht durch Hydrolyse, Säurezersetzung, Reduktion? Aminolyse oder Hydrazinolyse entfernbar.
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Beispielsweise kann die Aminogruppe in an sich bekannter Weise durch eine Acylgruppe, wie Fonnyl, Trifluoracetyl,
Phthaloyl, Benzolsulfonyl, p-Toluolsulfonyl, o-Nitrophenylsulfonyl
oder 2,4-Dinitrophenylsulfonyl; eine Aralkylgruppe,
wie Benzyl, Diphenylmethyl oder Triphenylmethyl (diese Gruppen können gegebenenfalls durch niedrige AIkoxygruppen,
wie o-Methoxy oder p-Methoxy, substituiert sein); eine Benzyloxycarbonylgruppe, wie Benzyloxycarbonyl,
o-Brombenzyloxycarbonyl, p-Brombenzyloxycarbonyl,
o-Chlorbenzyloxycarbonyl, p-Nitrobenzyloxycarbonyl, p-Methoxybenzyloxycarbonyl,
p-Phenylazobenzyloxycarbonyl oder p-(p'-Methoxyphenylazo)-benzyloxycarbonyl; eine aliphatische
Oxycarbonylgruppe, wie Cyclopentyloxycarbonyl, Trichloräthyloxycarbonyl,
t-Amyloxycarbonyl, t-Butoxycarbonyl
oder Diisopropylmethoxycarbonyl; oder eine Aralkyloxycarbonylgruppe,
wie 2-Phenylisopropoxycarbonyl, 2-Tolylisopropoxycarbonyl
oder 2-p-Diphenylisopropoxycarbonyl, geschützt sein. Diese Aminogruppen können geschützt werden,
indem man das Enamin durch Umsetzung mit einem 1,3-Diketon,
wie Benzoylaceton, Acetylaceton oder Dimedon, bildet.
Die Carboxylgruppe kann durch Amidbildung, Hydrazidbildung oder Veresterung geschützt werden. Die Amidgruppe
kann mit einer 3|4-Dimethoxybenzyl- oder Bis-(p-methoxyphenyl)-methyl-Gruppe
substituiert sein. Die Hydrazidgruppe kann mit Benzyloxycarbonyl, Trichloräthyloxycarbonyl,
Trifluoracetyl, t-Butoxycarbonyl, Trityl oder 2-p-Diphenyl-isopropoxycarbonyl substituiert sein. Die
Estergruppe kann mit einem Alkanol, wie Methanol, Äthanol, t-Butanol oder Cyanomethylalkohol; einem Aralkanol, wie
Benzylalkohol, p-Brombenzylalkohol, p-Chlorbenzylalkohol,
p-Methoxybenzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol, 2,4,6-Trimethy!benzylalkohol,
Benzhydrylalkohol, Benzoylmethylalkohol, p-Brombenzoylmethy!alkohol oder p-Chlorbenzoyl-
methylalkohol; einem Phenol, wie 2,4,6-Trichlorphenol,
2,4s5-Trichlorphenol, Pentachlorphenol, p-Nitrophenol,
2,4-Dinitrophenol, p-Cyanophenol oder p-Methansulfonylphenol;
oder einem Thiophenol, wie Thiophenol, Thiocresol oder p-Nitrothiophenol, substituiert sein. Die Hydroxygruppe
im Serin, Threonin oder Tyrosin kann gegebenenfalls durch Veresterung oder Verätherung geschützt sein. Eine
durch Veresterung geschützte Gruppe ist z. B. eine niedrige Alkanoylgruppe, wie eine Acety!gruppe; eine Aroylgruppe,
wie eine Benzoylgruppe; oder eine sich von Carbonyl ableitende Gruppe, wie Benzyloxycarbonyl oder Äthyloxycarbonyl.
Eine durch Verätherung geschützte Gruppe ist beispielsweise eine Benzyl-, Tetrahydropyranyl- oder
t-Butylgruppe. Der Schutz der Hydroxygruppe kann durch
eine 2,2,2-Trifluor-1-t-butyloxycarbonyl-aminoäthyl- oder
2 j 2,2-Trifluor-1-benzyloxycarbonyl-aminoäthyl-Gruppe erfolgen.
Es ist jedoch nicht immer erforderlich, diese Hydroxygruppe zu schützen. Die Aminogruppe in der Guani-,
dinogruppe im Arginin kann durch eine Nitro-, Tosyl- oder Benzyloxycarbonylgruppe geschützt sein. Es ist jedoch
nicht immer erforderlich, daß die Guanidinogruppe geschützt
ist.
Die Iminogruppe im Histidin kann durch eine Benzyl-, Trityl-, Benzyloxycarbonyl-, Tosyl-, Adamantyloxycarbonyl-,
2,2,2-Trifluor-1-t-butyloxycarbonylaminoäthyl- oder
2,2,2-Trifluor-1-benzyloxycarbonylaminoäthyl-Gruppe geschützt
sein, obgleich die Iminogruppe nicht immer geschützt sein muß.
Die Mercaptogruppe in dem Cystein kann durch eine Benzyl-,
p-Methoxybenzyl-, p-Nitrobenzyl-, Trityl-s Benzylthiomethyl-s,
Äthylcarbamoyl- oder Acetamidmethyl-Gruppe geschützt sein»
3UA818
Das Peptid (i) wird: durch Kondensation von Aminosäuren
oder einem niedrigen Peptid hergestellt. Beispielsweise kann eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer geschützten
a-Aminogruppe und einer aktivierten, endständigen
Carboxylgruppe mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien oc-Aminogruppe und geschützten endständigen
Carboxylgruppe umgesetzt werden. Andererseits kann eine Aminosäure oder ein Peptid mit einer akti-\derten
a-Aminogruppe und einer geschützten endständigen Carboxylgruppe
mit einer Aminosäure oder einem Peptid mit einer freien endständigen Carboxylgruppe und einer geschützten
a-Aminogruppe umgesetzt werden.
Die Carboxylgruppe kann z.B. aktiviert sein als Säureazid, Säureanhydrid, Säureimidazolid oder aktiver Ester,
wie durch Umwandlung in einen Cyanomethylester, Thiophenylester, p-Nitrophenylester, p-Nitrothiophenylester,
p-Methansulfonylphenylester, Thiodylester, 2,4-Dinitrophenylester,
2,4,5-Trichlorphenylester, 2,4,6-Trichlorphenylester,
Pentachlorphenylester, N-rHydroxysuccinimidester, N-Hydroxyphthalimidoester, 8-Hydroxychinolinester
oder N-Hydroxypiperidinester, Carbodiimid, Ν,Ν'-Carbonyldiimidazol
oder ein Isoxazoliumsalz, wie Woodward-Reagens.
Die bevorzugten Kondensationsreaktionen sind das Carbodiimid-, Azid-, aktiver Ester- und Säureanhydrid-Verfahren.
Bei der Kondensationsreaktion sollte die Racemisierung sorgfältig vermieden werden, und die bevorzugten Verfahren
sind das Azid-, aktiver Ester-Verfahren, das Wünsch-Verfahren [Z.Naturforsch., 216, 426 (1966)] oder das Geiger-Verfahren
[Chem.Ber., 103, 788 (197O)], insbesondere unter
Verwendung von N-Äthyl-N'-3-dimethylaminopropyl-carbodiimid
(WSCI) als Kondensationsmittel. .
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Dem erfindungsgemäßen Verfahren geht eine Kondensationsreaktion in der Aminosäure-Sequenz der Formel (I) voraus,
und bevorzugt beginnt die Synthese vom endständigen C-Atom aus.
Das geschützte HCG [127-145] wird bevorzugt gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI
mit Kondensation des C-terminalen Fragments 132-145 und
des N-terminalen Fragments 127-131 synthetisiert. Das C-terminale Fragment 132-145 wird bevorzugt durch Kondensation
des Fragments 132-137 und des Fragments 138-144 gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung
von WSCI synthetisiert. Das N-terminale Fragment 127-131
wird bevorzugt durch Kondensation des Fragments 127-129. und des Fragments 130-131 gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren
unter Verwendung von WSCI synthetisiert.
Das geschützte HCG [118-145] wird bevorzugt durch Kondensation
des C-terminalen Fragments 127-145» d.h. geschütztem
HCG [127-145], und des N-terminalen Fragments 118-126 gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung
von WSCI synthetisiert. Die C-endständigen Fragmente 118-126 werden bevorzugt durch Kondensation des Fragments
118-121 und des Fragments 122-126 gemäß dem Azid-Verfahren synthetisiert.
Das geschützte HCG [105-145] wird bevorzugt durch Kondensation des C-terminalen Fragments 112-145 und des N-terminalen
Fragments 105-111 gemäß einem modifizierten Geiger-Verfahren unter Verwendung von WSCI synthetisiert. Das
C-terminale Fragment 112-145 wird bevorzugt durch aufeinanderfolgende
Kondensation des geschützten GCG [118-145] und des Fragments 116-117, des Fragments 113-115 und der
112. Aminosäure gemäß dem aktiven Ester-Verfahren synthetisiert. Das N-terminale Fragment 105-111 wird bevorzugt
31U818
gemäß dem Azid-Verfahren mit dem Fragment 110-111 und
dem Fragment 105-109 kondensiert.
Geschütztes HCG [100-145] wird bevorzugt gemäß dem aktiven
Ester-Verfahren mit dem C-terminalen Fragment 112-145
und N-terminalen Fragment 100-111 kondensiert. Das N-terminale
Fragment 100-111 wird bevorzugt mit dem Fragment
100-104 und dem Fragment 105-111 gemäß dem Azid-Verfahren kondensiert.
Geschütztes [Tyr100J-HCG [100-145] wird bevorzugt gemäß
Kondensation des C-terminalen Fragments 112-145 und des N-terminalen Fragments 100-111 gemäß dem aktiven Ester-Verfahren
synthetisiert. Das N-terminale Fragment 100-111
wird bevorzugt mit dem Fragment 100-104 und dem Fragment 105-111 gemäß dem Azid-Verfahren kondensiert.
Bei dem oben beschriebenen Peptid-Syntheseverfahren ist
die C-terminale Carboxylgruppe nicht immer geschützt. Beispielsweise
ist es-bei der Kondensationsreaktion gemäß dem Azid- oder aktiven Ester-Verfahren nicht erforderlich,
eine Schutzgruppe einzuführen. Die Carboxylgruppe kann durch Veresterung, wie zu einem Methyl-, Äthyl- oder Benzylester,
geschützt werden. Die Estergruppe, wie die des Methylesters, kann mit verdünnter Natriumhydroxidlösung
oder durch Umwandlung in das Hydrazid entfernt werden, und die Benzylestergruppe kann mit wasserfreiem Fluorwasserstoff
oder durch katalytische Hydrierung entfernt werden.
Die cc-Amino gruppe des Peptids wird mit einer an sich bekannten Schutzgruppe, wie einer Benzyloxycarbonyl-, t-Butoxycarbonyl-
oder t-Amyloxycarbonylgruppe, geschützt. Die
Benzyloxycarbonylgruppe kann durch katalytische Hydrierung entfernt werden, und die t-Butoxycarbonyl- und
t-Amyloxycarbonylgruppe kann mittels Trifluoressigsäure
entfernt werden. Bevorzugte Schutzgruppen sind die Hydroxylgruppe von Serin und Threonin mit einer Benzylgruppe; die
Hydroxylgruppe von Tyrosin mit einer 2,6-Dichlorbenzylgruppe;
die £-Aminogruppe von Lysin mit einer o-Chlorbenzyloxycarbonylgruppe;
die Aminogruppe in der Guanidinogruppe von Arginin durch eine Tosylgruppe; und die Mercaptogruppe
von Cystein mit einer p-Methoxybenzylgruppe.
Diese Schutzgruppen können mittels wasserfreiem Fluorwasserstoff
entfernt werden. Die Acetamidmethylgruppe kannals Schutzgruppe für die Mercaptogruppe des Cysteine verwendet
werden. Da diese Gruppe gegenüber wasserfreiem Fluorwasserstoff stabil ist, kann sie mittels Quecksilber(II)-acetat
bei pH 4 zum Zeitpunkt der Entfernung der anderen Gruppen entfernt werden.
Geschütztes HCG [127-145], geschütztes HCG [118-145], geschütztes
HCG [105-145], geschütztes HCG [100-145] und geschütztes [Tyr1 ]-HCG [100-145] werden so erhalten. Diese
Schutzgruppen werden bevorzugt durch Säurezersetzung gemäß einem einstufigen Erifernungsverfahren mittels wasserfreiem
Fluorwasserstoff entfernt, wobei man die Verbindung der Formel (I) erhält.
Wenn die Mercaptogruppe des 110. und/oder 100. Cysteins
mit einer Acetamidmethylgruppe geschützt ist, kann sie mit Quecksilber(II)-acetat bei pH 4 nach Entfernung der
anderen Schutzgruppen mittels wasserfreiem Fluorwasserstoff entfernt werden.
Die obige Verbindung (I) kann nach an sich bekannten Reinigungsverfahren
für Peptide gereinigt werden. Beispielsweise kann sie durch Säulenchromatographie unter Verwendung
von Sephadex LH-20 (Warenzeichen), Sephedex G-50 (Warenzeichen), Dowex 1 (Warenzeichen) und Carboxymethylcellulose
gereinigt werden.
31U818
• · «ν *
- 10 -
Das Peptid (i) kann in Form der Base oder des Salzes erhalten
werden. Im allgemeinen kann es mittels einer Salzform mit einer organischen Säure, wie Essigsäure, konserviert
werden.
HCG kann durch Immunreaktion analysiert werden, wobei man
den Antikörper, -den man aus dem Peptid (I) erhält, als Antigen verwendet, oder das Peptid (I) selbst als Antigen
verwendet, wobei man als Technik ein Enzymimmunoverfahren,
ein Radioimmunoanalyseverfahren, eine Hämagglutinations-Inhibierungsreaktion, eine Hämagglutinationsreaktion
oder einen Latexfixierungstest verwendet.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. ■
(Herstellung des Antiserums)
Beispiel 1
Beispiel 1
[110-145], [Cys(Acm)110]-
Je 500/Ug HCG [118-145), HCG
HCG[11O-145], [Cys(Acm)110]-HCG[i05-i45] und [Cys(Acm)110]-HCG[1OO-145]
werden in physiologischer Salzlösung gelöst und mit gleichen Mengen Freund's complete Adjuvans unter
Herstellung einer Emulsion vermischt. Jede dieser Lösungen wird in fünf männliche Meerschweinchen mit einem Gewicht
von 280 bis 350 g beim ersten Mal in die Pfoten der Glieder und in den Rumpf injiziert und beim zweiten Mal subkutan
in den Nacken bei jeder Verabreichung. Blut wurde am 10. Tag durch Herzpunktion gesammelt.
Die so erhaltenen Antikörper werden als Lot A-2, Lot B-3»
Lot C-2, Lot D-1 und Lot E-1 bezeichnet*
ViSCI (200 mg) wird in eine Lösung von BSA (Rinderserumalbumin)
(30 mg) und HCG [127-145] (60 mg), gelöst in
0,1 M Phosphatpuffer (pH 8,0, 1 ml), gegeben und dann,
wird 30 min bei Zimmertemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wird durch eine Säule aus Sephadex G-50 (1,5 χ
50 cm) mit destilliertem Wasser für die Gelfiltration geleitet. Die BSA-HCG[I27-145] enthaltende Fraktion wird
gesammelt und lyophilisiert; man erhält BSA-HCG[I27-145]
(34 mg).
Das Produkt (1 mg), gelöst in physiologischer Salzlösung (2 ml) wird in Meerschweinchen auf gleiche Weise wie in
Beispiel 1 injiziert und das Blut gesammelt. Die erhaltenen. Antikörper werden als Lot F-1 bezeichnet.
BSA (60 mg) und 2,2'-Dithiobenzothiazyl-propionsäure
(0,2 mg) werden in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5, 2 ml) gelöst und 10 min bei O0C gerührt. Eine Lösung aus 2,2'-Dithiobenzothiazyl-propionsäure-succinimidester
(6 mg) in DMF (0,3 ml) wird zugesetzt und man rührt 1 h bei 0°C. Der pH des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von 1N HCl auf
5 eingestellt, und dann wird die Lösung durch eine Säule aus Sephadex G-50 (1,5 x 50 cm) unter Verwendung von 0,1 M
Phosphatpuffer (pH 7,5) durch die Gelfiltration geleitet. Die Fraktionen von 27 bis 35 ml werden gesammelt. 3,2 ml
davon (enthaltend 20 mg BSA) werden gesammelt, mit HCG [100-145] (20 mg) versetzt und 1 h bei 0°C gerührt. Nach
der Dialyse gegenüber destilliertem Wasser während eines Tages wird das Dialysat lyophilisiert. Man erhält BSA-HCG
[100-145] (36 mg).
Das Produkt (1 mg), gelöst in physiologischer Salzlösung (2 ml), wird in Meerschweinchen auf gleiche Weise wie in
Beispiel 1 injiziert und das Blut gesammelt. Der so erhaltene Antikörper wird als Lot G-1 bezeichnet.
(Diagnose des Urins von Schwangeren durch den Hämagglutinations-Inhibierungstest)
Die Diagnose des Urins von Schwangeren wird gemäß dem Hämagglutinations-Inhibierungstest
mittels des Verfahrens, wie es in Acta Endocrinol., ;55, 261 (1960) beschrieben
ist, durchgeführt. Positive Ergebnisse werden erhalten,
wenn die Urinproben von Schwangeren (IOwöchige Schwanger^-
schaft) unter Verwendung des vorbeschriebenen Antikörpers diagnostiziert werden. Negative Häagglutinations-Inhibierungen
werden durch die Diagnose normaler Urinproben bestätigt.
Bei der vorliegenden Erfindung werden die folgenden Abkürzungen verwendet:
BOC = t-Butoxycarbonyl AOC = t-Amyloxycarbonyl Z = Benzyloxycarbonyl Z-Cl = o-Chlorbenzyloxy-
BOC = t-Butoxycarbonyl AOC = t-Amyloxycarbonyl Z = Benzyloxycarbonyl Z-Cl = o-Chlorbenzyloxy-
carbonyl
BzI = Benzyl Tos = Tosyl
Bzl-Cl2=2,6-Dichlorbenzyl OMe = Methy'lester
OEt = Äthylester ONP = o-Nitrophenylester
OBzI = Benzylester Cys = L-Cystein
OSU = N-Hydroxysuccinimidester
Ser = L-Serin Thr = L-Threonin
MBzI = p-Methoxybenzyl Aem = Acetamidmethyl
Leu = L-Leucin . Pro = L-Prolin
Asp = L-Asparaginsäure
Arg = L-Arginin GIy = Glycin
AIa = L-Alanin GIn = L-Glutamin
Lys = L-Lysin His = L-Histidin
Tyr = L-Tyrosin He = L-Isoleucin
Phe= L-Phenylalanin TEA = Triäthylamin
TPA = Trifluoressigsäure DCHA = Dicyclohexylamin
CHA = Cyclohexylamin DMF = Dimethylformamid THF = Tetrahydrofuran TBA = Tribenzylamin
NMM = N'-Methylmorpholin HOBT = 1-Hydroxybenzotriazol
WSCI = N-Äthyl-N'-dimethylaminopropyl-carbodiimid.
3ΊΑ4818
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen werden die folgenden Träger und Entwicklungslösungsmittel für die Dünnschichtchromatographie (TLC)
verwendet.
Träger: Silikagel G
Entwickler:
Entwickler:
(1) Chloroform-Methanol-Essigsäure (95:5:3)
(2) dito (85:15:5)
(3) dito (85:10:5)
(4) dito (80:25:2)
(5) dito (24:6:1)
(6) Chloroform-Äthanol-Äthylacetat (5:2:5)
(7) Äthylacetat
(8) Äthylacetat-Methanol (10:1)
(9) Äthylacetat-Benzol (1:1)
(10) Butanol-Essigsäure-Wasser (3:1:1)
Träger: Merck-Cellulose
Entwickler:
(11) Butanol-Fyridin-Essigsäure-Wasser (15:10:3:12).
B e i ,spiel 1
HCG [127 - 145]: H ~ S CY
— Pro - Ser - Pro - S^y ~ A
?ro- Q-Iy- Pyo -So- Asf- Thy- Pro
-Ik- Lea- ?γο-
1) P(143 - 144): BOC-Leu-Pro-OBzl [I]:
THF (300 ml) werden zu B0C-Leu-0H.H20 (149,59 g, 0,6 M)
gegeben. THF (150 ml) und DMF (100 ml) werden unter Herstellung
einer Lösung zugesetzt. Weiter werden H-Pro-OBzI (152,28 g, 0,63 M), tropfenweise WSCI (120,8 ml,
0,66 M) bei -100C und erneut DMF (100 ml) zugefügt. An-
schließend wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt.
Nach Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum wird Äthylacetat (600 ml) zu dem Rückstand gegeben und dann wird
dreinal mit einer 5%igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung, zweimal mit 1N HCl und zweimal mit Wasser gewaschen. Die
Äthylacetatschicht wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das ölige Material
wird in Benzol (1 l) gelöst und im Vakuum konzentriert; man erhält eine ölige Substanz [1]; TLC: Rf1 = 0,89.
2) P6i42-i44):B0C-Ile-Leu-Pro-0Bzl [2]
TFA (300 ml) wird zu der Substanz [1] (192 mM) , gelöst in
Methylenchlorid (100 ml) zugegeben und dann wird 30 min bei Zimmertemperatur gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert.
Hexan wird zugegeben und dann wird im Vakuum abdestilliert. Der ölige Rückstand wird in THF (200 ml)
gelöst und mit NMM (56,1 ml) bis zu pH 7 unter Eiskühlung neutralisiert. BOC-IIe-OH.H2O (38,33 g, 159,5 mM) und HOBT
(21,55 g, 159,5 mM) werden zugesetzt. Das Gemisch wird in DMF (100 ml) gelöst und tropfenweise mit WSCI (34,1 ml)
unter Eiskühlung versetzt und dann wird über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum
abdestilliert und Äthylacetat (500 ml) werden zu dem Rückstand zugegeben, dann wird dreimal mit 5?6iger Natriumbicarbonatlösung,
einmal mit gesättigter Natriumchloridlösung, zweimal mit 1N HCl, zweimal mit gesättigter Natriumchloridlösung
und einmal mit Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die gewaschene Lösung wird über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Hexan wird zu dem Rückstand zugesetzt und dann wird durch Abdekantieren
ausgefällt. Die Umkristallisation erfolgt aus Äthylacetat-Hexan. Bei der Filtration löst sich ein kleiner
Teil und der restliche Teil wird in Benzol gelöst und lyophilisiert; man erhält die Substanz [2] (Ausbeute =
90,9%); Fp. 60 bis 64°C; [a]^4 = -66,34° (c = 1, DMF);
TLC: Rf. = 0,63.
3) P(142-144): BOC-Ile-Leu-Pro-OH [3] Die Substanz [2]
(76,98g, 145 mM) wird in 20 ml n-Butanol und 300 ml Äthanol
gelöst. 5% Pd/C (15 g) werden zugegeben, und dann erfolgt die katalytische Hydrierung während 3 h. Nach Entfernung
des Katalysators wird die Mutterlauge im Vakuum konzentriert. 300 ml Diäthyläther werden zu dem Rückstand
zugegeben und dann wird mit 500 ml bzw. 200 ml einer 5%igen
wäßrigen Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Durch Zugabe von 1N HCl unter Eiskühlung wird der pH-Wert des Extrakts
auf 4 eingestellt, wobei das Produkt kontinuierlich ausfällt. Es wird mit Äthylacetat extrahiert und zweimal mit
Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Lösung im Vakuum konzentriert. Der
Rückstand wird durch Zugabe von Äther-Hexan verfestigt. Die Umkristallisation aus Äthylacetat-Äther-Hexan liefert
die Substanz [3] (60,33 g, Ausbeute 94,2%); Fp.1i4 bis
119°C; [α]β4 = -61,98° (c = 1, DMF); TLC: Rf1 = 0,53, Rf6=
0,47.
Elementaranalyse: für C22H39°6N3
berechnet: C 59,8490 H 8,90% N 9,52% gefunden : 59,82 9,42 9,56.
berechnet: C 59,8490 H 8,90% N 9,52% gefunden : 59,82 9,42 9,56.
4) P(142-145): BOC-Ile-Leu-Pro-Gln-OBzl
150 ml TFA werden zu BOC-Gln-OBzl (36,41 g, 108 mM), gelöst
in 100 ml Methylenchlorid, gegeben, und dann wird 30 min bei Zimmertemperatur gerührt. TFA wird im Vakuum
abdestilliert, und der Rückstand wird in 100 ml THF gelöst, dann wird der pH durch Zugabe von FNMM (40 ml) unter Kühlen
mit einem Gefriergemisch auf 7 eingestellt. Eine Lösung (100 ml) der Substanz [3] (47,69 g, 108 mM) in THF-
und DMF-Lösung von HOBT (14,50 g, 108 mM) wird zugesetzt. WSCI (19,76 ml, 108 mM) wird tropfenweise unter Kühlen
mit einem Gefriergemisch innerhalb von 10 min zugegeben
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- 16 -
und dann wird über Nacht gerührt. 500 ml Äthylacetat werden
zu dem Reaktionsgemisch zugesetzt und dann wird mit einer 5%igen Natriumbicarbonatlösung gewaschen. Die wäßrige
Schicht wird mit 300 ml Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatschichten werden vereinigt und mit einer 5%igen
wäßrigen Natriumbicarbonatlösung, gesättigter Natriumchloridlösung, 1N HCl (zweimal) ,--gesättigter Natriumchloridlösung
(zweimal) und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet
und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird durch Zugabe von Äther-Hexan verfestigt. Die Umkristallisation erfolgt
aus Äthylacetat (400 ml); man erhält die Substanz [4] (56,98 g, Ausbeute 80,0%); Pp. 141 bis 143°C.
Elementaranalyse: für C-z^Hc^OqN,-
berechnet: C 61,89% H 8,10% N 10,61%
gefunden : 61,76 8,41 10,84.
5) P(14O-141): BOC-Thr(Bzl)-Pro-OBzl [5]
BOC-Thr(BzI)-OH (32,88 g, 0,15 M) werden in 100 ml THF gelöst.
HOBT (20,94 g, 0,155 M) und Η-Pro-OBzI.HCl (37,47 g,
0,155 M) und ferner 200 ml DMF werden zur Herstellung einer Lösung zugegeben. VSCI (28,37 ml, 0,155 M) wird
tropfenweise innerhalb von 10 min unter Kühlen mit einem Gefriergemisch zugesetzt und dann wird über Nacht bei Zimmertemperatur
gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert. 500 ml Äthylacetat werden zu dem Rückstand
zugegeben und dann wird mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung (zweimal), gesättigter Natriumchloridlösung,
1N HCl (zweimal), gesättigter Natriumchloridlösung (zweimal) und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen
über wasserfreiem Natriumsulfat wird abdestilliert und im Vakuum getrocknet; man erhält eine ölige Substanz [5]
(57,41 g, Ausbeute 77,1%); TLC: Rfg = 0,85; Rf1 = 0,03-
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; JVAOMCsiEREICHT
6) P(i40-i4i):BQC-Thr(Bzl)-Pro-0H [6]
Die Substanz [5] (52,78 g, 106,29 mM) wird in 300 ml
Methanol gelöst. 1N NaOH (150 ml, 1,4 molarer Überschuß) wird tropfenweise innerhalb von 20 min zugesetzt und dann
wird bei Zimmertemperatur gerührt. 1N HCl (43,71 ml, 0,4
molarer Überschuß) wird unter Eiskühlung zur Einstellung des pH auf 7 zugegeben, dann wird das Methanol im Vakuum
abdestilliert. Die wäßrige Schicht wird mit 150 ml Äther gewaschen und der pH-Wert der wäßrigen Schicht wird auf
durch Zugabe von 1N HCl (110 ml) eingestellt. Die Lösung
wird zweimal mit Äthylacetat (300 ml und 150 ml) extrahiert.
Der Extrakt wird durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert.
Äther und Hexan werden zu dem Rückstand gegeben; man erhält ein Präzipitat. Der gleiche Vorgang wird wiederholt,
der Niederschlag wird in Äthylacetat gelöst und dann im Vakuum getrocknet; man erhält eine schäumende, feste Substanz
[6] (32,27 g, Ausbeute 77,75%); Fp. 50 bis 55°C; [a]ß4 = -36,64° (c = 1, DMF); TLCs Rf6 = 0?34.
Elementaranalyse: für C21H30°5N2*H2°
berechnet: C 61,75% H 7,90% N 6,86% gefunden % 62,12 7,62 6,67.
7) P(14O-145); BOC-Thr(Bzl)-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBzl [7]
Die Substanz[6] (54,77 g, 83 mMol) wird in 80 ml Methylenchlorid
gegeben. 240 ml TFA werden unter Eiskühlung zugesetzt und dann wird 25 min bei Zimmertemperatur gerührt.
TFA wird im Vakuum bei O0C abdestilliert und Äther zu dem
Rückstand gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert und die filtrierte Lösung im Vakuum konzentriert. Äther wird
zu dem Konzentrat zur Ausfällung des Materials zugesetzt. Die Niederschläge werden vereinigt und in einem Exsikkator
über Alkali über Nacht getrocknet. Der Niederschlag wird ■0 unter Eiskühlung
++) und zweimal mit wäßrigem NaCl und einmal mit Wasser
gewaschen
in 200 ml DMF gelöst, dann wird der pH durch Zugabe von 9,5 ml NMM unter Kühlen mit einem Gefriergemisch auf 7
eingestellt. HOBT (11,21 g, 83 mM) und BOC-Thr(BzI)-Pro-OH
(32,27 g, 83 mM) und DMF (40 ml) werden zur Herstellung einer Lösung zugegeben. WSCI (15,19 ml, 83 mM) wird
tropfenweise innerhalb von 10 min unter Kühlen mit einem Gefriergemisch zugegeben. Nach 2stündiger Reaktion wird
das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum abdestilliert.. Eine 5#ige wäßrige Natriumbicarbonatlösung (300 ml) wird zu dem Rückstand
zugesetzt, welcher zweimal mit Äthylacetat (800 ml und 300 ml) extrahiert wird. Die Äthylacetatschicht wird
zweimal mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösung, gesättigter Natriumchloridlösung, zweimal mit 1N HCl, zweimal
mit gesättigter Natriumchloridlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Äthylacetatschicht
wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Vakuum konzentriert. Das ausgefallene Material wird
durch Zugabe von Äther abgetrennt. Die Umkristallisation erfolgt aus Äthylacetat und Äther wird zugesetzt; man erhält
die Substanz [7] (63,98 g, Ausbeute 81,3%); Fp.101 bis 1030C; M^ = -61,78° (c = 1, DMF).
Elementar analyse: für C50Hy^O11NyH2O
berechnet: C 62,16% H 7,82% N 10,15% gefunden : 62,21 7,89 10,03.
Aminosäure-Analyse (1,330 mg/HCl 0,3 ml, Essigsäure 0,3 ml,
Anisol 0,1 ml, 105°C, 24 h): Thr 0,84 (1), Pro 2, lie
0,97 (1), Leu 1,00 (1), GIn 0,98 (1).
8) P(139-145); BOC-Asp(Bzl)-Thr(BzI)-PrO-IIe-LeU-PrO-GIn-OBzI
[8]
Die Substanz [7] (63,98 g, 67,48 mM), gelöst in 150 ml Methylenchlorid, wird unter Eiskühlen zu 300 ml TFA gege-
ben und dann rührt man 30 min bei Zimmertemperatur. TFA wird im Vakuum bei 0°C abdestilliert und Äther wird zu
dem Rückstand gegeben. Das Präzipitat wird abfiltriert,
mit der zweiten Charge Kristalle, die aus der Mutterlauge erhalten wird, vereinigt und über Alkali in einem Exsikkator
über Nacht getrocknet (Ausbeute 67,1 g). Der Niederschlag wird in 350 ml DMF gelöst, und dann wird der pH
durch Zugabe von NMM (7,42 ml) unter Kühlen mit einem Gefriergemisch auf 7 eingestellt. BOC-Asp(OBzI)-OH
(29,77 g, 87,72 mM) und HOBT (11,85 g, 87,72 mM) werden zugegeben. WSCI (16,05 ml, 87,72 mM) wird tropfenweise unter
Kühlen mit einem Gefriergemisch zugesetzt. Nach 2 h wird die Temperatur bei Zimmertemperatur gehalten und dann
wird über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und Wasser wird zu dem Kickstand zugegeben. Es bildet
sich ein Niederschlag, der durch Abdekantieren unter Eiskühlung abgetrennt wird. Der Niederschlag wird in 1,5
Äthylacetat gelöst und mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung (zweimal), gesättigter Natriumchloridlösung (einmal), 1N
HCl (einmal), gesättigter Natriumchloridlösung (zweimal) und Wasser (einmal) in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach
dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird das Gemisch im Vakuum konzentriert. Das Konzentrat wird stehengelassen
und der gebildete Niederschlag abfiltriert. Die Umkristallisation erfolgt zweimal aus Äthyläther; man
erhält die Substanz [8] (Ausbeute 94,8%); Fp. 99 bis 103°C; [a]^4 = -82,44° (c = 1, DMF), TLC: Rf3 = 0,62; Rf2=O,79-Elementaranalyse:
für C6H84°14N8
berechnet; C 63,52% H 7,34% N 9,72% gefunden j 63,38 7,56 9,80.
berechnet; C 63,52% H 7,34% N 9,72% gefunden j 63,38 7,56 9,80.
-ZQ-
9) P(138-145); BOC-Ser(Bzl)-Asp(OBzl)-Thr(BzI)-Pro-Leu-Pro-Gln-OBzl
[9]
100 ml Methylenchlorid werden zu der Substanz [8](73,88 g,
63,97 mM) zugesetzt. 300 ml TFA werden unter Eiskühlen zugegeben und man rührt 30 min bei Zimmertemperatur. TFA
wird im Vakuum bei O0C abdestilliert. Äther wird zu dem
Rückstand zugefügt, und der so gebildete Niederschlag wird über Kaliumhydroxid in einem Exsikkator über Nacht getrocknet.
Der Niederschlag wird in 200 ml DMF gelöst und dann wird der pH durch Zugabe von 5 ml NMM unter Kühlen
mit einem Gefriergemisch auf 7 eingestellt. BOC-Ser(BzI)-OH
(24,56 g, 83,16 mM), HOBT (11,23 g, 83,16 mM) und DMF (50 ml) werden zugegeben. Ferner wird WSCI (15,22 ml)
tropfenweise unter Kühlen mit einem Gefriergemisch zugesetzt und erneut werden 2,03 ml NMM zur Einstellung des
pH-Werts auf 6 zugefügt. Nach 2 h wird die Temperatur auf Zimmertemperatur geändert und dann wird über Nacht gerührt.
DMF wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand wird in 2 1 kaltes Wasser gegossen. Der so gebildete Niederschlag
wird abfiltriert und dann wird mit 5 1 CHCl, und 2 1 einer
5%igen wäßrigen Natriumbicarbonatlösung extrahiert. Nach dem Waschen der Chloroformschicht mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung,
gesättigter Natriumchloridlösung, 1N HCl, gesättigter Natriumchloridlösung und Wasser in dieser Reihenfolge
wird die organische Schicht durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Lösungsmittelschicht
wird im Vakuum getrocknet und zu dem Rückstand Äthylacetat-Äther-Hexan gegeben. Der gebildete Nieder-,
schlag wird in 300 ml Chloroform gelöst, 1 1 Äthylacetat wird zugesetzt und dann wird das Chloroform abdestilliert.
Die so erhaltene Suspension wird mit Äther-Hexan gemischt; man erhält einen Niederschlag. Die Umkristallisation wird
auf gleiche Weise wiederholt, wobei man die Substanz [9] erhält (Ausbeute 95,196, 80,95 g)j Fp. 120 bis 122°C, TLC:
Rf2 = 0,70.
3H4818
Elementaranalyse: für Cy1HgJ-O1 gNg
berechnet: C 64,09% H 7,20% N 9,47% gefunden : 63,87 7,38 9,62.
10) P(136-137); BOC-Gly-Pro-OBzl [10]
THF (100 ml), DMF (100 ml) und HOBT (20,94 g, 0,155 M)
werden zu BOC-GIy-OH (26,28 g, 0,15 M) zugesetzt. 20 ml
einer DMF-Lösung von H-Pro-OBzl.HCl (37,47 g, 0,155 M)
werden zugegeben, man kühlt auf -10°C und gibt tropfenweise
im Verlauf von 10 min WSCI (28,37 ml, 0,155 M) zu. Nach Zugabe von 30 ml DMF wird das Gemisch über Nacht bei
Zimmertemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert, dann werden 500 ml Äthylacetat zugesetzt
und dann wird zweimal mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung,
gesättigter Natriumchloridlösung, zweimal mit 1N HCl,
zweimal mit gesättigter Natriumchloridlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Äthylacetatschicht wird
über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert; man erhält ein öliges Material (67 g), das
in 100 ml Benzol gelöst wird. Die Lösung wird auf eine Säule (7 x 33 cm) aus Silikagel (500 g), die mit Benzol gepackt
ist, gegeben und dann wird sie unter Verwendung von 300 ml Benzol durchgeleitet. Die Eluierung erfolgt
mit Benzol-Äthylacetat (10:1 -s 5;1 -* 2:1 -*l:1) zu Äthylacetat.
Fraktionen, die bei der TLC einen Rf1 von 0,86
aufweisen, werden gesammelt und im Vakuum getrocknet; man erhält ein öliges Material [9] (46,16 g). Die verbleibenden
Fraktionen werden im Vakuum konzentriert und auf eine Säule (4,5 x 16 cm) aus Silikagel (100 g) gegeben und auf
gleiche Weise, wie oben beschrieben, chromatographyert.
Man erhält das ölige Material [10] (8,78 g); Gesamtmenge= 54,94 g| TLCs Rf1 = 0,86.
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11) Ρ(134-135); BOC-Leu-Pro-OH [11]
BOC-Leu-Pro-OBzl (82,76 g, 0,252 mM) wird in 600 ml Methanol
gelöst. Man gibt 1N NaOH (327,6 ml, 1,3 molarer Überschuß) tropfenweise unter Eiskühlung zu und rührt 1 h bei
Zimmertemperatur 1N HCl (6 ml) wird unter Eiskühlung zu dem
Reaktionsgemisch zugesetzt und das Methanol wird im Vakuum abdestilliert. Nach dem Waschen der Wasserschicht mit Benzol
und Äthylacetat wird 1N HCl (260 ml) unter Eiskühlen
zugesetzt; man erhält ein öliges Material, das mit Äthylacetat extrahiert wird. Der Extrakt wird mit gesättigter
Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen und über wasser-, freiem Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird im Vakuum
getrocknet und der Rückstand in Benzol gelöst und lyophilisiert; man erhält die Substanz [11] (58,57 g, Ausbeute
70,8%); Fp. 63 bis .670C; [oc]^4 = -66,42° (c = 1, DMF).
Elementar analyse: für C-IgH28OcN2
berechnet: C 58,52% H 8,59% N 8,53%
gefunden : 58,29 8,87 8,59.
12) P(134-137); BOC-Leu-Pro-Gly-Pro-OBzl [12]
Methylenchlorid (100 ml) und TFA (200 ml) werden zu der Substanz [10] (54,36 g, 0,15 M) gegeben und dann wird
25 min bei Zimmertemperatur gerührt. TFA wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand über Kaliumhydroxid in einem
Exsikkator getrocknet. Nach Auflösen in THF (100 ml) und Zugabe von Triäthylamin (48 ml) zur Einstellung des pH auf
7 unter Kühlen bei -10°C wird eine THF-Lösung (100 ml) der
Substanz [11] (49,26 g, 0,15 M) und HOBT (20,27 g, 0,15 M) zugesetzt. Ferner werden 50 ml THF zugegeben und WSCI
(27,45 ml) wird tropfenweise im Verlauf von 10 min bei -10°C zugefügt. Nach 2 h wird die Temperatur auf Zimmertemperatur
geändert und man rührt über Nacht. Das Lösungsmittel wird abdestilliert, der Rückstand in Äthylacetat (700 ml) ge-
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löst und dann mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung (500 ml)
gewaschen. Die wäßrige Schicht wird erneut mit Äthylacetat (300 ml) extrahiert, mit der Äthylacetatschicht
vereinigt und mit 5%iger wäßriger Natriumbicarbonatlösune;,
gesättigter Natriumchloridlösung, zweimal mit 1N HCl,
zweimal mit gesättigter Natriumchloridlösunß und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen über
wasserfreiem Natriumsulfat wird im Vakuum konzentriert. Man gibt Benzol zu dem Rückstand zu und konzentriert im
Vakuum. Das Konzentrat wird auf eine Säule (6,5 x 20 cm) aus Silikagel (300 g), die mit Benzol gepackt ist, gegeben
und mit Benzol -> Benzol - Äthylacetat (3:1 -*2:1) -*'
Äthylacetat eluiert. Die Fraktionen mit einem Rf1-Wert
von 0,57 werden gesammelt und im Vakuum getrocknet; man erhält-die Substanz [12], die sich unter Schäumen verfestigt
(45,73 g)· Die verbleibenden Fraktionen werden gesammelt, im Vakuum konzentriert und auf die oben beschriebene
Weise chromatographiert; man erhält die Substanz [12] (18 g). Die verbleibenden Fraktionen werden
weiterhin im Vakuum konzentriert, auf eine Säule (4,5 x 15 cm) aus Silikagel (100 g) gegeben und auf die obige
Weise eluiert; man erhält die Substanz [12] (7,11 g); Gesamtmenge 70,84 g (Ausbeute 82,64%); Fp. 65 bis 69°C;
[oc]^4 = -93,64° (c = 1, DMF); TLC: Rf1 = 0,57, Rf5= 0,54.
Elementaranalyse: für C^qH^aO,-^
berechnet: C 62,92% H 7,74% N 9,78
gefunden : 62,98 7,94 10,07.
13) P(133-137); BOC-Arg(Tos)-Leu-Pro-Gly-Pro-OBzl [13]
TFA (220 ml) werden zu der Substanz [12] (68,72 g,120 mM),
gelöst in 100 ml Methylenchlorid, gegeben und man rührt 20 min bei Zimmertemperatur. TFA wird bei 0°C im Vakuum
abdestilliert, dann wird Hexan zugegeben und im Vakuum ge-
U 4 8 1 8
trocknet. Der Rückstand wird über Kaliumhydroxid in einem Exsikkator getrocknet, in 200 ml DMF gelöst und der pH
wird durch Zugabe von NMM (59,4 ml) bei -100C auf 6 eingestellt.
DMF-Lösung (50 ml) von BOC-Arg(Tos)-OH (53 g,
123 mM) und HOBT (16,89 g, 125 mM) werden zur Auflösung
zugegeben und WSCI (22,86 ml, 125 mM) wird tropfenweise im Verlauf von 10 min bei -100C zugesetzt. Nach 2 h wird
das Reaktionsgemisch über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. Ferner wird WSCI (3,66 ml, 0,2 mM) bei -100C zu dem
Reaktionsgemisch zugegeben und dann wird 4 h bei Zimmertemperatur gerührt. DMF wird im Vakuum abdestilliert und
5%ige Natriumbicarbonatlosung (600 ml) wird zu dem Rückstand
zugegeben. Der Niederschlag wird zweimal mit Äthylacetat (500 ml) extrahiert. Der Extrakt wird mit 5i#iger
Natriumbicarbonatlosung, gesättigter Natriumchloridlösung, zweimal mit 1N HCl, dreimal mit gesättigter Natriumchloridlösung
und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und
im Vakuum konzentriert. Äther-Hexan wird zu dem Rückstand gegeben und das so ausgefallene Material wird filtriert.
Die Umkristallisation erfolgt aus Äthylacetat-Äther-Hexan; man erhält die Substanz [13] (100,77 g, Ausbeute 95,1%);
Fp. 107 bis 112°C (Zers.); [a]^4 = -64,84° (c = 1, DMF);
TLC: Rf1 = 0,19.
Aminosäure-Analyse (0,709 mg/HCl 0,3 ml, Essigsäure 0,3 ml,
Anisol 0,1 ml, 1050C, 24 h); Pro (2), GIy 0,95 (D, Leu
1,01 (1) und Arg 0,90 (1).
14) P(132-137); BOC-Ser(Bzl)-Arg(Tos)-Leu-Pro-Gly-Pro-OBzI
[14]
Methylenchlorid (100 ml) und TFA (400 ml) werden zu der
Substanz [13] (100,77 g, 114 mM) gegeben und man rührt 35 min bei Zimmertemperatur. TFA wird im Vakuum bei 0°C
abdestilliert, Äther wird zu dem Rückstand gegeben und
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der Niederschlag abfiltriert. Die Mutterlauge wird im Vakuum konzentriert; man erhält ein zweites Prazipitat.
Die Niederschläge werden vereinigt und über Kaliumhydroxid
über Nacht getrocknet und dann in 200 ml DMF-gelöst. NMM
(10 ml) wird bei -10°C zur Einstellung de;; pll-Werle;; ;\uV H
zugegeben und dann werden HOBT (16,94 g, 121;,Λ inM) und
BOC-Ser(BzI)-OH (37,03 g, 125,4 mM) tropfenweise bei pH
zugesetzt. Nach 2 h wird das Reaktionsgemisch bei Zimmertemperatur über Nacht gerührt. DMF wird im Vakuum abdestilliert
und der Rückstand in Eis-Wasser (1,5 l) gegossen. Man erhält ein Prazipitat, das zweimal mit Äthylacetat
(1 1 und -500 ml) extrahiert wird. Die Äthylacetatschicht wird mit 1N HCl, gesättigter Natriumchloridlösung, zweimal
mit 1N NaOH, gesättigter Natriumchloridlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen
über wasserfreiem Natriumsulfat wird im Vakuum konzentriert. Äther.wird zu dem Rückstand gegeben und der Niederschlag
durch Filtration gesammelt. Die Umkristallisation
erfolgt aus Äthylacetat-Äther (zweimal); man erhält die Substanz [14] (107,34 g, Ausbeute 87,0^); Fp. 101 bis
105°C; TLC: Rf6 = 0,71, Rf3 = 0,49.
Aminosäure-Analyse (1,818 mg/HCl 0,3 ml, Essigsäure 0s3 ml, Anisol 0,1 ml, 105°C, 24 h); Ser 0,72 (1), Arg
0,95 (1), Leu 1,03 (1), Pro (2).
15) P(132-137); BOC-Ser(BzI)-Arg(Tos)-Leu-Pro-Gly-Pro-OH
[15]
Die Substanz [14] (105,44 g, 97,43 mM) wird in 350 ml Methanol gelöst. Man gibt 1N NaOH (125,36 ml, 1,3 molarer
Überschuß) tropfenweise unter Eiskühlen hinzu und rührL
2 h bei Zimmertemperatur. Dann fügt man 1N NaOH (20 ml) zu dem Reaktionsgemisch zu und rührt 1,5h bei Zimmertemperatur.
Durch Zugabe von 1N HCl (49 ml) zu dem Reaktionsgemisch
wird der pH auf 6 eingestellt und Methanol wird im Vakuum abdestilliert. Wasser wird zu der wäßrigen
3Η48Ί8
Schicht zugegeben und dann wird mit Äther (100 ml) gewaschen. 1N HCl (50 ml) wird tropfenweise unter Eiskühlung
zu der wäßrigen Schicht gegeben. Da, bedingt durch die Bildung eines Niederschlags aus viskosem Material, das
Rühren unmöglich wird, wird Äthylacetat (300 ml) zugegeben und 1N HCl (60 ml) wird tropfenweise zur Einstellung
des pH-Werts der wäßrigen Schicht auf pH 2 zugesetzt. Die wäßrige Schicht wird mit Äthylacetat (11 und 500 ml)
extrahiert und zweimal mit gesättigter Natriumchloridlösung
und Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Äthylacetatschicht im Vakuum konzentriert;
man erhält ein öliges Material, das durch Zugabe von Äther verfestigt wird. Die Umkristallisation aus
Äthylacetat-Äther liefert die Substanz [15] (95,12 g, Ausbeute 100%); TLC: Rf2 = 0,10, Rf4 = 0,32.
16) R(132-145); BOC-Ser(BzI)-Arg (Tos)-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser
(BzI) -Asp (OBzI )-Thr (Bzl) -Pro-lie-Leu-Pro-GIn-OBzI
[16]
Die Substanz'[9] (49,66 g, 37,32 mM) wird in 130 ml Methylenchlorid
gelöst. 220 ml TFA werden zugesetzt und man rührt 45 min bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch
wird im Vakuum konzentriert und Äther wird zu dem Rückstand gegeben. Der Niederschlag wird gesammelt und über
Kaliumhydroxid über Nacht getrocknet, das in 220 ml DMF gelöst war. Nach Einstellung des pH auf 7 .durch Zugabe von
NMM (4,10 ml) bei -100C werden die Substanz [15] (43,72 g,
44,79 mM) und HOBT (6,56 g, 48,52 mM) zugesetzt. Man gibt nach dem Auflösen WSCI (8,88 ml, 48;52 mM) tropfenweise bei
-100C zu und rührt 2 Tage bei Zimmertemperatur. DMF wird
im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in .2 1 eiskaltes Wasser gegossen. Das Präzipitat wird filtriert, suspendiert
(in Wasser), gewaschen und filtriert. Dieser Vorgang wird fünfmal bei pH 6 wiederholt. Dann wird im Exsikkator
getrocknet (im Vakuum); man erhält einen. Feststoff (109 g),
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der in Methanol gelöst, im Vakuum konzentriert und azeotrop durch Zugabe von Benzol zur Entfernung von restlichem
Wasser destilliert wird. Dieser Vorgang wird dreimal wiederholt. Die Umkristallisation erfolgt.aus Äthylacetat-Äther;
man erhält ein Material (90,09 g), das in Chloroform (270 ml) gelöst, auf eine mit Chloroform bepackte
Säule aus Silikagel (600 g) gegeben und dann mit Chloroform-Methanol (20:1) eluiert wird. Die Fraktionen,
die bei der TLC einen Flecken zeigen, werden gesammelt und im Vakuum getrocknet; man erhält die Substanz [15].
Die verbleibenden Fraktionen werden im Vakuum konzentriert und auf eine Säule aus Silikagel (220 g) gegeben, wobei
man auf die obige Weise eluiert. Die Fraktionen, die bei der TLC einen Flecken zeigen, werden gesammelt und im
Vakuum getrocknet. Der obige rechromatographische Vorgang wird viermal wiederholt; man erhält die Substanz [16]
(Gesamentmenge 64,26 g, Ausbeute 78,950; TLC: Rf7 = 0,40,
Rf2 = 0,60; Fp. 120 bis 125°C; M^= -63,3° (c ~ 1, DMF)-Elementaranalyse:
berechnet: C 60,63% H 7,09% N 11,36 '
gefunden : 60,66 7,20 11,50.
17) P(13O-131);- BOC-Ser(Bzl)-Pro-OBzl [17]
THF (100 ml), Η-Pro-OBzI.HCl (31,5 g, 0,13 M) und HOBT
(17,5 g, 0,13 M) werden zu B0C-Ser(Bzl)-0H (35,4 g»0,12 M) gegeben. Weiterhin werden 50 ml DMF zugesetzt, um eine
Lösung herzustellen. 24,8 ml WSCI werden tropfenweise zugefügt und man rührt 1 h bei O0C und über Nacht bei Zimmertemperatur.
Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert j Benzol wird zu dom Rückstand gegeben und dann wird
dreimal mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung, dreimal mit
1N HCl und dreimal mit Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Lösung im
Vakuum getrocknet; man erhält die Substanz [17] als
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- 28 öliges Material (58 g, Ausbeute 100%); TLC: Rf. = 0,68.
18) P(127-129); B0C-Ser(Bzl)-Leu-Pro-0Bzl [18]
Methylenchlorid (30 ml) wird zu BOC-Leu-Pro-OBzl (71,27 g,
156 mM) gegeben. TFA (350 ml) werden bei O0C zugefügt und
man rührt 30 min bei Zimmertemperatur. TFA wird im Vakuum
unter Bildung eines öligen Materials abdestilliert, das 3 h über Kaliumhydroxid getrocknet wird. Das ölige Material
wird in 170 ml DMF gelöst, das bei O0C unter Zugabe von
NMM (60 ml) neutralisiert wird. BOC-Ser (BzI)-OH (46,0 g, 156 mM) und HOBT (21,1 g, 156 mM) werden zur Bildung einer
Lösung zugesetzt. WSCI (28,6 ml, 156 mM) wird tropfenweise bei O0C zugegeben, dann rührt man 1 h bei O0C und über Nacht
bei Zimmertemperatur. DMF wird abdestilliert. Dann gibt man 500 ml Äthylacetat zu dem Rückstand und wäscht mit
5%iger Natriumbicarbonatlösung (dreimal), 1N HCl (dreimal)
und Wasser (dreimal) in dieser Reihenfolge. Nach dem Trocknen der Äthylacetatschicht über wasserfreiem Natriumsulfat
wird die'organische Schicht im Vakuum konzentriert. Das ölige Material wird in einer geringen Menge Benzol gelöst,
auf eine mit Benzol gepackte Säule aus Silikagel (500 g) gegeben und dann unter Verwendung von Benzol (1 l), Benzol-Äthylacetat
(10:1; 2 l), Benzol-Äthylacetat (5:1; 1 l) und Benzol-Äthylacetat (1:1; 2 1) in dieser Reihenfolge
eluiert. Die entsprechenden, durch TLC geprüften Fraktionen werden gesammelt und im Vakuum konzentriert. Der
Rückstand wird in Benzol gelöst und lyophilisiert; man erhält die Substanz [18] (81 g, Ausbeute 87,0%); TLC: Rf1 =
0,81.
Elementaranalyse: für C^H^cOyN,
berechnet: C 66,53% H 7,61% N 7,05% gefunden : 66,34 7,81 6,80.
19) P(127-129); BOC-Ser(Bzl)-Leu-Pro-OH [19]
Die Substanz [18] (81 g, 135,5 mM) wird in 300 ml Äthanol
gelöst. Man gibt 1N NaOH (176,15 ml, 1,3 molarer Überschuß) tropfenweise bei 0 C während 30 min zu und rührt
3 h bei Zimmertemperatur. Das Reaktionsgemisch wird durch Zugabe von 1N HCl bei O0C neutralisiert und Äthanol im
Vakuum abdestilliert. 300 ml Wasser werden zu der wäßrigen Schicht gegeben, man wäscht zweimal mit AtIier, gibt 1N
HCl (150 ml) bei O0C zu und extrahiert mit Äthylacetat
(400 ml). Die Äthylacetatschicht wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum
konzentriert. Das so erhaltene, ölige Material wird im Vakuum getrocknet. Das Pulver wird erneut unter Verwendung
von Äther-Hexan ausgefällt, wobei man die Substanz [19]
(65,0 g, Ausbeute 94,5%) erhält; Fp.56 bis 630C; TLC:
Rf1 = 0,58; [a]ß2 = -47,1° (c = 1, DMF).
Elementaranalyse: für CpgH^qOyN,
berechnet: C 61,76% H 7,78% N 8,31% gefunden : 61,52 7,71 8,50.
20) P(127-131); BOC-Ser(BzI)-Leu-Pro-Ser(BzI)-Pro-ODzl [20]
30 ml Methylenchlorid werden zu der Substanz [17] (58 g,
0,12 M) gegeben. Man fügt 350 ml TFA bei O0C zu und rührt
30 min bei Zimmertemperatur. TFA wird im Vakuum abdestilliert
und der Rückstand in 150 ml DMF gelöst. 50 ml NMM werden zur Neutralisierung bei O0C zugegeben. Dann gibt
man die Substanz' [19] (61,1 g, 0,12 Mol) und HOBT (16,2 g, 0,12 M) und-ferner tropfenweise WSCI (22 ml, 0,12 M) bei
0°C zu und rührt 1 h bei O0C und über Nachtbei Zimmertemperatur.
DMF wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand wird 400 ml Äthyläther versetzt. Nach dreimaligem
Waschen mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung, dreimaligem Waschen mit 1N HCl und dreimaligem Waschen mit Wasser und
Trocknen über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird die Lö
im Vakuum konzentriert. Das so erhaltene, ölige Material wird in einer geringen Menge Benzol gelöst und auf eine
mit Benzol gepackte Säule aus Silikagel (500 g) gegeben. Die Eluierung erfolgt unter Verwendung von Benzol (500 ml),
Benzol-Äthylacetat (10:1; 2 l), Benzol-Äthylacetat (10:1;
2 1), Benzol-Äthylacetat (3:1;2 l), Benzol-Äthylacetat
(1:1; 4 l) und Äthylacetat (3 l). Die durch TLC geprüften,
entsprechenden Fraktionen werden gesammelt und -im Vakuum betrocknet; man erhält die Substanz [20] (84,07 g, Ausbeute
80,8%); Fp. 58 bis 650C; TLC: Rf1 = 0,51; [>]D =
-63,7° (c = 1, DMF).
Elementaranalyse: für c48H63°ioN5
berechnet: C 66,26% H 7,30% N 8,05% gefunden : 66,31 7,25 8,09 Aminosäure-Analyse: Ser 1,42 (2), Pro (2), Leu 1,01 (1).
berechnet: C 66,26% H 7,30% N 8,05% gefunden : 66,31 7,25 8,09 Aminosäure-Analyse: Ser 1,42 (2), Pro (2), Leu 1,01 (1).
21) P(127-131); BOC-Ser(BzI)-Leu-Pro-Ser(BzI)-Pro-OH [21]
Die Substanz [20] (74,4 g, 85,4 mM) wird in 300 ml Methanol gelöst. Man gibt tropfenweise 1N NaOH (110 ml, 1,3 molarer
Überschuß) bei O0C zu und rührt 3 h bei Zimmertemperatur.
Nach Neutralisieren bei O0C durch Zugabe von 1N HCl(26 ml)
wird Methanol im Vakuum abdestilliert. Die wäßrige Schicht wird zweimal mit Äther gewaschen, 1N HCl (86 ml) werden bei
O0C zugesetzt und dann wird mit Äthylacetat extrahiert.Die
Äthylacetatschicht wird zweimal mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Mangesiumsulfat getrocknet und im Vakuum
konzentriert. Hexan wird zu dem Rückstand gegeben und der so gebildete Niederschlag filtriert. Der Niederschlag wird
in einer geringen Menge Chloroform gelöst und auf eine mit Chloroform gepackte Säule aus Silikagel gegeben. Die
Eluierung erfolgt unter Verwendung von Chloroform, Chloroform-Äthylacetat (1:1) und Chloroform-Äthanol-Äthylacetat
(5:1:5). Die Fraktionen, die der durch TLC geprüften Sub-
stanz entsprechen, werden gesammelt und im Vakuum getrocknet.
Man erhält die Substanz [21] (53,75 g, Ausbeute 81%); TLC; Rf1. = 0,34; [cc]D: -66,4° (c = 1 , DMF)
Elementaranalyse: für c4i%7°-]oNio
berechnet: C 63,14% H 7,37% N 8,98%
gefunden : 63,11 7,66 8,85
Aminosäure-Analyse (0,77 mg/6N HCl 0,3 ml, 1050C, PO h):
Ser 1,84 (2), Pro 2,06 (2), Leu (1).
22) P(127-145); BOC-Ser(Bzl)-Leu-Pro-Ser(BzI)-Pro-Ser(BzI)-Arg(Tos)-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser(BzI)-Asp(OBzl)-Thr(BzI)-Pro-Ile-Leu-Pro-Gln-OBzl
[22]
Methylenchlorid wird zu der Substanz [16] (63,66 g,
29,17 mM) zugefügt. Dazu gibt man 260 ml TFA und rührt 40 min bei Zimmertemperatur. TFA wird im Vakuum abdestilliert
und der Rückstand wird mit Äther versetzt. Das so gebildete Präzipitat wird filtriert und über Kaliumhydroxid
über Nacht getrocknet (67,6 g) und'dann in 200 ml DMF (pH 4) gelöst. 4,21 ml NMM werden zur Einstellung de.·; pll-Wertes
auf 7 bei -100C zugesetzt. HOBT (A,73 c, 35 mM),
Substanz [21] (27,30 g, 35 mM) und DMF (100 ml) werden zugegeben. Man setzt tropfenweise WSCI (6,41 ml, 35 mM)
bei -100C zu und rührt 2 h bei -100C.und über Nacht bei
Zimmertemperatur. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in Eis-Wasser (1,5 l) gegossen.
Das so gebildete Präzipitat wird in Wasser suspendiert und filtriert. Dieser Vorgang der Suspension und
Filtration wird fünfmal bei pH 6 wiederholt. Der Niederschlag wird 2 Tage im Vakuum getrocknet, in Methanol gelöst
und im Vakuum konzentriert. Man gibt Benzol zu dem Rückstand und konzentriert. Die Benzo.lbehandlung wird
zweimal wiederholt. Äther wird zu dem Konzentrat gegeben und das so gebildete Präzipitat filtriert. Die Vorgänge
- 32 -
der obigen Methanolbehandlung bis- zur Ätherbehandlung
werden achtmal wiederholt; man erhält die Substanz [22] (79,85 g, Ausbeute 96,2%); Fp. 127 bis 13O0C; TLC: Rf2 =
0,61; OJq2 = -67,58° (c = 1, DMF).
Elementaranalyse: für c-i4qH207036N23S
berechnet: C 60,95% H 7,15%- N 11,05%
gefunden : 61,05 6,96 11,03
Aminosäure-Analyse (1,893 mg/6N. HCl 0,5 ml, 105°C, 21 h): Asp 0,99 (1), Thr 0,96 (1), Ser 3,74 (4), GIn 1,04 (1),
Pro 6,00 (6), lie 0,95 (1) Leu (3), Arg 0,94 (1), GIy
0,98 (1).
23) HCG [127-145]
Anisol (5 ml) wird zu der Substanz [22] (1 g, 0,34 mM) gegeben. Dazu fügt man30 ml wasserfreien Fluorwasserstoff
(HF bei 0°C und rührt während 1 h. HF wird schnell im Vakuum entfernt. 100 ml Äther und 50 ml 0,1N Essigsäure
werden zu dem Rückstand gegeben und geschüttelt. Die wäßrige Schicht wird auf eine Säule (3,3 x 18 cm) aus Dowex-1
(Acetatform) gegeben und unter Verwendung von 0,1N Essigsäure eluiert. Das Eluat und die Waschlösung werden vereinigt
und lyophilisiert; man erhält das Rohprodukt
(660 mg). Dieses Rohprodukt wird in 8 M wäßrigem Harnstoff (30 ml) gelöst, der pH wird durch Zugabe von wäßrigem
Ammoniak auf 9 eingestellt, das Produkt wird auf eine Säule (4,5 x 120 cm) aus Sephadex LH-20 gegeben und unter Verwendung
von 0,1N Essigsäure eluiert.' Das Eluat wird zu jeweils 10 ml fraktioniert, die Fraktionen Nr. 58 bis 64
werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält das Produkt (540 mg). Das Produkt wird in 0,1N Essigsäure (30 ml) gelöst,
auf eine Säule (5 x 13 cm) aus Carboxymethylcellulose gegeben, mit 0,01 M Ammoniumacetat-Puffer (pH 4,5) gewaschen
und allmählich unter Verwendung von 0,01 bis 0,1 M
H 4818
Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5) (jeweils 400 ml) eluiert. Das Eluat wird zu jeweils 6 ml fraktioniert, Die Fraktionen
Nr. 79 bis 86 werden gesammelt und lyophiliüiort; man
erhält das Material (180 mg). Dieses wird in 0,1N Essigsäure
gelöst, auf eine Säule (3 x 17 cm) aus Sephadex LH-20
gegeben und unter Verwendung von 0,1N Essigsäure eluiert.
Das Eluat wird zu jeweils 10,5 ml fraktioniert und die gesammelten
Fraktionen Nr. 25 bis 30 werden lyophilisiert; man erhält HCG[127-145] (136,4 mg); Fp. 215 bis 225°C;
[oc]^8 = +65° (c = 0,1, 0,1N Essigsäure); TLC: Rf11 = 0,71.
Aminosäure-Analyse: Asp 1,05 (1), Thr 0,97 (1), Ser 3,44(4), GIn 1,10 (1), Pro 6,50 (6), GIy 1,04 (1), He
0,89 (1), Leu 3 (3), Arg 1,02 (1).
HCG [118- 1453: H -
- A k - Pro - Pro _ pv0
Pvo - IU - L-e^ - Pro - 6rU - OH
1) P(125-126); BOC-Pro-Pro-OBzI [23]
THF (180 ml), H-Pro-OBzl.HCl (43,5 g, 0,18 M) und HOBT
(24,3 g, 0,18 M) werden zu BOC-Pro-OH (36,6 g, 0,17 M) gegeben. Man setzt DMF (100 ml) und ferner tropfenweise
WSCI (33,0 ml, 0,18 M) bei O0C zu. Man rührt 1 h bei 00C
und über Nacht bei Zimmertemperatur und destilliert das Lösungsmittel im Vakuum ab. 500 ml Benzol werden zu dem
Rückstand gegeben und es wird dreimal mit 5%iger Natrium bicarbonatlösung, dreimal mit 1N HCl und dreimal mit Was
ser gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Lösung im Vakuum konzentriert; man erhält
ein öliges Material [23] (74 g, Ausbeute 100%). Beim Aufbewahren im' Kühlschrank kristallisiert es teilweise und
wird aus Benzol-Hexan umkristallisiert. Es verbleibt jedoch nahezu öliges Material, das für die nächste Reaktion verwendet
wird; Fp. 73 bis 740C; [cc]D = -85,7° (c = 1, DMF).
Elementaranalyse: für CppH^oOrNp
berechnet: C 65,65% H 7,51% N 6,96%
gefunden : 65,98 7,81 6,83; TLC: Rfg = 0,71.
2) P(123-124); BOC-Ala-Pro-OBzI [24]
THF (200 ml), Η-Pro-OBzI.HCl (48,3 g, 0,2 M) und HOBT
(27,0 g, 0,2 M) werden zu BOC-AIa-OH (37,8 g, 0,2 M) gegeben. Fener gibt man DMF (100 ml) und tropfenweise bei
O0C WSCI (36,6 ml, 0,2 M) zu. Man rührt 1 h bei 00C und
über Nacht bei Zimmertemperatur und destilliert dann das
Lösungsmittel im Vakuum ab. Der Rückstand wird in 500 ml Äthylacetat gelöst, dreimal mit 5%iger·Natriumbicarbonat-Hösunft,
dreimal mit 1N HCl und dreimal mit Wasser gewaschen,
über wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand Afird in einer geringen
Menge Benzol gelöst und auf eine mit Benzol gepackte Säule aus Silikagel (250 g) gegeben. Die Elution erfolgt unter
Verwendung von Benzol (1 l), Benzol-Äthylacetat (10:1; 11) und Benzol-Äthylacetat (1:1; 1 l). Die entsprechenden
Fraktionen, die durch TLC geprüft wurden, werden gesammelt und im Vakuum konzentriert; man erhält die ölige Substanz
[24] (75,55 g, Ausbeute 100%); TLC: Rf1 =0,87.
(3) P(123-124); BOC-Ala-Pro-OH [25]
Die Substanz [24] (75 g, 0,2 M) wird in 200 ml "Äthanol gelöst..
1N IMnOlI (2AO ml, 1,2 molarer Überschuß) wird tropfenweise
bei 0 C
3HA818
zugesetzt und es wird bei Zimmertemperatur gerührt. Nach 2 h gibt man 1N NaOH (20 ml) zu und rührt weitere 30 min.
Das Reaktionsgemisch wird mit 1N HCl (60 ml) bei 00C
neutralisiert und das Äthanol im Vakuum abdestilliert. Nach zweimaligem Waschen der wäßrigen Schicht mit Äther
(100 ml) werden 200 ml 1N HCl bei 0°C zugegeben. Das so gebildete Präzipitat wird filtriert, gründlich gewaschen
und im Vakuum getrocknet. Die Umkristallisation erfolgt aus Äthylacetat (450 ml)-Hexan zur Kristallisation der
Substanz [25] (47,92 g, Ausbeute 83,8%); Fp. 159 bis 16O°C;
[cc]D: -72,9° (c =1, DMF); TLC: Rf1 = 0,18.
Elementaranalyse: für C15H22O5N2.2/3H2O
berechnet: C 52,34% H 7,81% N 9,38% gefunden : 52,74 8,13 9,58.
4). P(123-126); BOC-Ala-Pro-Pro-Pro-OBzl [26]
Methylenchlorid (30 ml) wird zu der Substanz [23] (74 g, 0,17 M) gegeben. Man gibt 500 g TFA bei 00C zu und rührt
30 min bei Zimmertemperatur. TFA wird im Vakuum entfernt, der Rückstand in 150 ml DMF gelöst, wobei durch Zugabe
von 60 ml NMM bei O0C. Nach Zusatz der Substanz [25]
(47,9 g, 0,16 M) und HOBT (23 g, 0,17 M) gibt man WSCI (33 ml, 0,17 M) bei 0°C zu und rührt 1 h und über Nacht
bei Zimmertemperatur. DMF wird bis zu einer Menge von etwa 80 ml entfernt. 500 ml Äthylacetat werden zu dem
Rückstand gegeben und dann wird mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung, 1N HCl und Wasser (jeweils dreimal) in dieser
Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen der Äthylacetatschicht über wasserfreiem Magnesiumsulfat wird die Lösung
im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird mit Hexan versetzt, das Präzipitat filtriert und zweimal aus Äthylacetat-Hexan
umkristallisiert; man erhält die Substanz [26] (80,08 g, Ausbeute 88,5%); Fp.116 bis 117°C; TLC: Rf2 =
0,89.
Elementaranalyse: für
berechnet: 63,14% H 7,42% N 9,82%.
gefunden: 63,12% H 7,73% N 9,97%
5) P(122-126); BOC-Lys(Z-Cl)-Ala-Pro-Pro-Pro-ABzl [27].
Methylenchlorid (40 ml) werden zu der Substanz [26] (77,84 g, 136 mM) gegeben. Dazu gibt man 350 ml TFA bei
00C und rührt 30 min bei Zimmertemperatur. TFA wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in 200 ml DMF gelöst,
wobei durch Zugabe von NMM (80 ml) bei 0°C neutralisiert wird. Dazu gibt man BOC-Lys(Z-Cl)-OH,"hergestellt aus BOC-Lys(Z-Cl)-OH.TBA,
(80 g, 163 mM) und HOBT (220 g, 163 mM) und ferner tropfenweise WSCI (29,8 ml, 163 mM). Man rührt
1 h bei 00C und über Nacht bei Zimmertemperatur. DMF wird
im Vakuum entfernt; man gibt 600 ml Äthylacetat zu dem Rückstand
und wäscht mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung, 1N
HCl und Wasser (jeweils dreimal) in dieser Reihenfolge. Die Athylacetatschicht wird über wasserfreiem Magnesiumsulfat
getrocknet und im Vakuum konzentriert. Das so erhaltene, ölige Material wird in der geringsten Menge
Chloroform gelöst und auf eine mit Chloroform bepackte·
Säule aus Silikagel (500 g) gegeben. Die Elution erfolgt unter Verwendung von Chloroform (1,5 1) und Chloroform-
. Äthylacetat (1:1; 2 l). Die entsprechenden Fraktionen, die
durch TLC geprüft wurden, werden gesammelt und im Vakuum konzentriert; man erhält die Substanz [27] (90,27 g, Ausbeute
79,0%); TLC: Rf6 = 0,69, Rf2 = 0,95; ΜΏ= -100,8°
| (c = 1, DMF). | : für ( | \ | 4H59° | 16% | CLH2O |
| Elementaranalys e | 68% H | 6 | ,94% | N 9 | ,49% |
| berechnet: C 59, | 62 | 7 | ,07 | 9 | ,39 |
| gefunden : 59, | |||||
Aminosäure-Analyse: AIa 0,94 (1), Lys 0,99 (1), Pro (3).
3U4818
6) P(12O-121); BOC-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-OMe [28]
Man gibt THF (700 ml), B0C-Ser(Bzl)-0H (23,6 g, 0,8 M) und HOBT (108 g, 0,8 M) zu H-Ser(BzI)-OMe.HCl (196,57 g, 0,8 M)
sowie DMF (200 ml) zur Bildung einer Lösung. Dazu gibt man tropfenweise bei O0C WSCI (146 ml, 0,8 M) und rührt 1 h
bei Ö°C und über Nacht bei Zimmertemperatur. Man konzentriert das Reaktionsgemisch im Vakuum, gibt 1 1 Äthylacetat
zu dem Rückstand und wäscht dann mit 5%iger Natri- . umbicarbonatlösung, 1N HCl und Wasser (jeweils dreimal)
in dieser Reihenfolge. Hexan wird zu dem öligen Produkt zugesetzt, das durch Zugabe kristalliner Impfkeime kristallisiert.
Die Umkristallisation aus Äther-Hexan liefert die Substanz [28] (340,4 g, Ausbeute 87,5?0; Fp. 55 bis 560C;
[a]D = +8,1° (c = 1, DMF); TLC: Rf = 0,96.
Elementaranalyse: für C26H34°7N2
berechnet: C 64,18% H 7,04% N 5,76% gefunden : 64,08 7,21 5,43.
berechnet: C 64,18% H 7,04% N 5,76% gefunden : 64,08 7,21 5,43.
7) P(118-119); BOC-Ser(BzI)-Ser(BzI)-NiINTI2 [29]
Die Substanz [28] (191 g, 0,393 M) wird in DMF (500 ml) gelöst. Man gibt tropfenweise 200 ml Hydrazinhydrat (100%)
zu und rührt 3 h bei Zimmertemperatur. DMF wird im Vakuum entfernt und Wasser zugesetzt. Der so gebildete Niederschlag
wird filtriert, getrocknet und zweimal aus Äthylacetat-Hexan umkristallisiert, wobei man die Substanz [29]
(183,6 g, Ausbeute 96,0%) erhält; Fp. 123 bis 124°C; [a]D=
+5,3° (c = 1, DMF); TLC: Rf9 = 0,30 (Substanz [28] Rfg =
0,73).
Elementaranalyse: für C£6H34°7N2
berechnet: C 64,18% H 7,04% N 5,76% gefunden : 64,60 7,34 5,87.
berechnet: C 64,18% H 7,04% N 5,76% gefunden : 64,60 7,34 5,87.
31U818
; BOC-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(BzI)-OMe
[30]
Die Substanz [29] (146 g, 0,3 M) wird in DMF (600 ml) gelöst.
Man gibt 4,49N HCl/Dioxan-Lösung (202 ml, 0,9 M)
tropfenweise bei -50°C und Isoamylnitril (48 ml, 0,33 M) tropfenweise zu und rührt 20 min bei -200C. TEA (126 ml,
0,9 M) werden bei -200C zur Bildung einer azidierten Lösung
zugesetzt. Andererseits gibt man zu TFA bei O0C (350 ml) die Substanz [28] (122 g, 0,25 M), rührt 30 min
bei Zimmertemperatur und entfernt TFA im Vakuum. Der Rückstand wird mit Hexan versetzt. Das so gebildete Präzipitat
wird filtriert, in 300 ml DMF gelöst, und durch Zugabe von TEA bei 00C neutralisiert. Man gibt die neutralisierte
Lösung zu der obigen Azidlösung und rührt über Nacht bei 00C. TEA.HCl wird filtriert und das Filtrat konzentriert.
Zu dem Rückstand gibt man Eis und 1N HCl, sammelt den Niederschlag durch Filtration und wäscht mit.
5%iger Natriumbicarbonatlösung und Wasser. Nach dem Trocknen im Vakuum erfolgt die Umkristallisation aus Methanol;
man erhält die Substanz [30] (223 g, Ausbeute 88,4%); [a]D = +9,6° (c = 1, DMF).
Elementaranalyse: für C^gHjTgO1 ^N^
berechnet: C.65,70% H 6,71% Ν 6,66%
gefunden : 65,81 ' 6,89 6,73.
9) P(118-121); BOC-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-NHNH2
[31]
Die Substanz [30] (98,4 g, 117 mM) wird in DMF (300 ml)
gelöst. Man gibt 117 ml Hydrazinhydrat (100So) tropfenweise
zu und rührt 3 h bei Zimmertemperatur. DMF wird im Vakuum abdestilliert und Eis-Wasser zu dem Rückstand
gegeben. Der so gebildete Niederschlag wird filtriert und getrocknet. Umkristallisation aus Aceton liefert die
31U818
Substanz [31] (97,44 g, Ausbeute 99%); Fp. 176 bis 177°C;
[a]D = +9,8° (c = 1, DMF); TLC: Rf7 = 0,49.
10) P(118-126); BOC-Ser(Bzl)-Ser(BzI)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Pro-Pro-Pro-OBzI
[32]
Die Substanz [30] (60,6 g, 72 mMol) wird in DMF (300 ml)
gelöst und· tropfenweise zu einer 4,32N HCl/Dioxan-Lösunr;
(50 ml, 216 mM) bei -50°C gegeben. Nach der tropferiweir.cn
Zugabe von Isoamylnitril (11,5 ml, 80 mM) führt man 30 min bei -20°C. TEA (30 ml, 216 mM) wird bei -50°C zur Herstellung
einer Azidlösung zugesetzt. Andererseits wird die Substanz [27] (53 g, 60 mM) zu TEA (180 ml) bei O0C zugegeben,
man rührt 30 min bei Zimmertemperatur und entfernt TFA im ■
Vakuum. Der Rückstand wird mit Äther versetzt, der gebildete Niederschlag filtriert, in 100 ml DMF gelöst und
durch Zugabe von 15 ml NMM bei 00C neutralisiert. Diese
neutralisierte Lösung wird zu der obigen Azidlösung gegeben und man rührt über Nacht bei 00C. Das Lösungsmittel
wird im Vakuum abdestilliert und Eis-Wasser zu dem Rückstand gegeben. Das Präzipitat wird durch Filtration gesammelt
und mit 1N HCl, 5%iger Natriumbicarbonatlöüung
und Wasser gewaschen. Umkristallisation aus Methanol-DMF
nach Trocknen im Vakuum liefert die Substanz [32] (Ausbeute 95,9%); Fp. 210 bis 211°C (Zers.); [a]D = -56,0°
(c = 1, DMF)( TLC: Rf6 = 0,31, Rf1 = 0,34.
Elementaranalyse: für Cg^
berechnet: C 63,28% H 6,65% N 8,78% gefunden : 63,42 6,72 8,56.
Aminosäure-Analyse: Ser 3,90 (4), Pro 3 (3), AIa 1,02 (1),
. Lys 1,04 (1).
3H4818
11) P(118-126); BOC-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Ser(Bzl)-Lys(Z-Cl)-Ala-Pro-Pro-Pro-OH
[33]
Man gibt die Substanz [32] (88,51 g, 46,2 mMol, gelöst in
Chloroform (600 ml),zu Kaliumhydroxid (20 g, 360 mM) in
f)0%icem Methanol (500 ml) bei 5°C und rührt 4 h bei Zimmertemperatur.
Das Reaktionsgemisch wird durch Zugabe von 1N HCl'(70 ml) neutralisiert, das Lösungsmittel· im Vakuum'
entfernt und der Rückstand in kalte (5°C) 1N HCl (1,5 l)
gegossen. Der so gebildete Niederschlag wird filtriert, mit 600 ml Äthylacetat versetzt und man wäscht mit 1N HCl
und Wasser (dreimal). Die Äthylacetatschicht wirdüier
wasserfreiem Magnesiumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Äther wird zu dem Rückstand gegeben, das Präzipitat
filtriert und mit Äthylacetat gewaschen; man erhält die Substanz [33] (55 g, 80,1#); Fp. 125 bis 135°C;[a]D =
-56,4° (c = 1, DMF); TLC: Rfg = um die Ausgangslinie,
Rf3 = 0,45.
Aminosäure-Analyse: Ser 3,23 (4), Pro 3 (3), AIa 0,98 (1),
Lys 0,97 (1). .
12)p(118~145): , BOC- B
S*r ( B* I ) - S«r ( I3*l ) -W C
- lys U- Cl)- AU-Py0
Pro - S*.r ( ßz I ) - Leu - Pyo -
- Pro - S-^r ( ß* I ) - Ay^ ( To-S )_
- Pyo - ή-Ι/- Pro S4Lr ( B ζ Γ) -
)- Tkv( \3&\ )- Pyo - I|f
-Uu- Pyo-CtU-OBzI
Asp
31U818
Methylenchlorid (200 ml) wird zu der Substanz [22] (79 g,
28 mMol) von Beispiel 1 gegeben. Man gibt 400 ml TFA bei O0C zu und rührt 50 min bei Zimmertemperatur. TFA wird irn
Vakuum· entfernt, Äther zum Rückstand gegeben, der Niederschlag filtriert und über Nacht im Vakuum über Kaliumhydroxid
getrocknet (85,35 g). Das Produkt wird in DMF (270 ml, pH 3) gelöst und der pH-Wert durch Zugabe von
NMM (4,58 ml) bei -100C auf 6 eingestellt. Die Substanz
[33] (49,93 g, 33,6 mM) wird zugesetzt und ferner DMF (100 ml), um eine Lösung herzustellen. Man gibt WSCI
(6,20 ml) tropfenweise bei -100C (pH 5) zu, rührt 2 h bei
-100C und 2 Tage bei Zimmertemperatur. Das Lösungsmittel
wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in eiskaltes Wasser (1,5 1) gegossen. Der gebildete Niederschlag wird
gesammelt, in Wasser suspendiert, wiederholt gewaschen und 2 Tage getrocknet (130 g)· Man setzt Methanol zu, konzentriert
im Vakuum, gibt Benzol zu dem Rückstand und konzentriert im Vakuum. Die Umkristallisation erfolgt durch
Zugabe von Äther zu dem Rückstand, was zwölfmal wiederholt wird. Nach Zusatz von Methanol wird die Lösung im Vakuum
konzentriert und aus Methanol umkristallisiert; man erhält das Produkt [34] (108,43 g, Ausbeute 91,9%); Fp. 129 bis
131°C; [a]ß4 = -72,76° (c = 1, DMF), TLC: Rf2 = 0,56.
Elementaranalyse: für C220H294°51N33SCl
berechnet: C 61,67% H 6,92% N 10,79% gefunden : 61,49 7,07 11,02
Aminosäure-Analyse (0,978 mg/6N HCl 0,5 ml, 105°C, 21 h): Asp 1,00 (1), Thr 0,96 (1), Ser 6,87 (7), GIn
1,05 (1), Pro 9,63 (9), GIy 1,03 (1), AIa 1,09(1),
lie 0,94 (1), Leu 3(3), Lys 1,09 (D, Arg 0,97(1),
- 42 -
13) HCG [118-145}
Anisol (10 ml) wird zu der Substanz [34] (30 g, 0,71 mM)
zugesetzt. Man leitet 80 ml HF ein und rührt 1 h bei 00C.
Dann wird HF im Vakuum entfernt. Der Rückstand wird mit Äther versetzt und der gebildete Niederschlag filtriert.
Dieses Pulver wird in 0,1N Essigsäure (50 ml gelöst, auf
eine Säule (3,5 x 35 cm) aus Dowex-1 (Acetatform) gegeben und mit 0,1N Essigsäure gewaschen. Das Eluat und die Waschlösung
werden vereinigt und lyophilisiert; man erhält das Produkt (1,46 g), das in 8 M Harnstofflösung (30 ml),
deren pH durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak bei O0C auf
9 eingestellt wurde, gelöst, dann auf eine Säule (4,5- χ 120 cm) aus Sephadex LH-20 gegeben und unter Verwendung
von 0,1N Essigsäure eluiert wird. Das Eluat wird zu jeweils 7 ml fraktioniert, die Fraktionen Nr. 55 bis 83 werden
gesammelt und unter Bildung eines Pulvers (990 mg) lyophilisiert. Das Pulver wird in 0,1N Essigsäure (30 ml)
gelöst und auf eine Säule (5 x 14 cm) von CMC gegeben. Nach dem Waschen mit 0,01 M Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5,
200 ml) wird die Chromatographie mittels linearer Gradientenelution unter Verwendung von Acetatpuffer (0,01 M bis
0,1 M, jeweils 400 ml, pH 4,5) durchgeführt. Die Fraktionen
Nr. 85 bis 115 (eine Fraktion = 6 ml) werden vereinigt
und dann lyophilisiert; man erhält das Pulver (850 mg). Das in 0,1N Essigsäure gelöste Pulver wird auf eine Säule
(4 χ 120 cm) aus Sephadex LH-20 gegeben und unter Verwendung von 0,1N Essigsäure eluiert. Die Fraktionen Nr. 35
bis 43 (eine Fraktion =10,5 ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält das Pulver (650 mg). Dieses
wird in 0,1N Essigsäure (30 ml) gelöst und erneut auf eine Säule (5 x 15 cm) aus CMC gegeben und mit 0,01 M
Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5, 200 ml) gewaschen. Die Chromatographie erfolgt mittels linearer Gradientenelution
unter Verwendung von 0,01 M (400 ml) bis 0,1 M (400 ml)
Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5)· Die Fraktionen Nr, 100
bis 111 (eine Fraktion = 6,5 ml) werden gesammelt und lyophilisiert;
man erhält das Pulver (480 mg). Das in 0,1N Essigsäure gelöste Pulver wird auf eine Säule (3 x 117 cm)
• aus Sephadex LH-20 gegeben und unter Verwendung von 0,1N
Essigsäure eluiert. Die Fraktionen Nr. 24 bio 30 (eine
Fraktion = 10,5 ml) werden vereinigt und lyophilisiert, wobei man HCG [118-145] (320 mg) erhält; Fp.>220°C(Zorc.);
TLC; Rf11 = 0,57.
Aminosäure-Analyse: Asp 1,07 (1>, Thr 0,97 (1), Ser 8,23
(8), GIn 1,13 (1), Pro 9,98 (9), GIy 1,07 (1),
AIa 1,06 (1), lie 0,89 (1), Leu 3 (3), Lys 1,08
(1), Arg 1,07 (1).
. [Cys(Acm)110]-HCG [110 - 145]:
H~ dp (ACYW.)- Asp - A Sp - Pro
Ar1J - pke ~ ^tIw - Asp - JS-er — S-er —
l_v.s — Al Λ - ?yO — Pv-o — pro — S-er
- Pro — S-€r— PrO — 5-^r- ArJ —
Leu- pro ~ £rl/ — Pro — S-cv _ Asp - TKr
- Pro -LU- L^u -Pro- ^U-OH
1) P(116 - 117); BOC-Gln-Asp(OBzl)-OH [35]:
Η-Asp(OBzI)-OH (33,48 g, 150 mM) wird in 400 ml DMF suspendiert.
Dazu gibt man HOBT (2,03 C> 15 mM), BOC-GIn-ONP
(55,10 g, 150 mM) und DMF (100 ml). Der pH des Reaktionsgemisches wird durch Zugabe von NMM (2 ml) bei -100C
auf 7 eingestellt, und dann rührt man über Nacht bei Zim-
mertemperatür. Der pH-Wertes des Gemisches wird dreimal
durch Zugabe von NMM (16 ml) auf 7 eingestellt. Nach der Umsetzung (pH 6) wird DMF im Vakuum entfernt. Citronensäurelösung
(300 ml) und Chloroform (300 ml) werden zugesetzt und geschüttelt. Die wäßrige Schicht wird mit Chloroform
(300 ml und 100 ml) extrahiert. Die Chloroformschichten werden vereinigt und viermal mit gesättigter Natriumchloridlösung,
saurem Wasser (pH 3) und saurem Wasser (pH 4) gewaschen. Die wäßrige Schicht wird über wasserfreiem
Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird mit Äther versetzt und das gebildete Präzipitat
durch Filtration gesammelt. Methanol wird zugegeben, im Vakuum konzentriert und dann zweimal aus Chloroform-Äther
umkristallisiert; man erhält die Substanz [35] (32,31 g, Ausbeute 47,7%). Die Mutterlauge wird im Vakuum
konzentriert und zweimal aus Chloroform-Äther umkristallisiert; man erhält die Substanz [35] (6,3 g)· Ferner wird
die Mutterlauge auf eine Säule aus Silikagel (100 g) gegeben und unter Verwendung von Chloroform-Äthanol-Äthylacetat
(5:1:5) eluiert. Durch TLC geprüfte, entsprechende Fraktionen werden im Vakuum getrocknet; man erhält die Substanz
[35] (2,98 g). Gesamtausbeute 44,12 g (65,1%); Fp. 92 bis 95°C; [oc]ß = -4,9° (c = 1, DMF)", TLC: Rf4=O,27,
Rf2 = 0,56.
Elementaranalyse: für C21H2QOgN^
berechnet: C 55,86% H 6,47% N 9,31% gefunden : 55,86 6,50 9,61.
2)P(116-145): B OC->
I*-A
- 45 -
C> IAsp
)- S^(BhI)-Lx* ( Z-Ü
-) "" A U ~ Pro - Pvc? - Ϋυο ~ fs*γ (
- Leu - P^0 - S^ ( g2 I ). __ pro _
B? I) - AvJ ( Tos )- Leu- Pro -
5^(;Bj| ) — Asp (OB^i )
U- Py0-IU- Uu-Pro-
Die Substanz [34] des Beispiels 2 (101,10 g, 24 mM) wird
in Methylenchlorid (150 ml) gelöst. TFA (350 ml) wird bei O0C zugegeben und es wird 1 h bei Zimmertemperatur gerührt.
TFA wird im Vakuum abfiltriert, der Rückstand wird mit Äther versetzt, der so gebildete Niederschlag wird filtriert
und über Nacht über Kaliumhydroxid getrocknet (114,14 g). Das Pulver wird in 300 ml DMF (pH 3) gelöst,
wobei der pH der Lösung durch Zugabe von 8,64 ml NMM bei Q°C auf 6 eingestellt wird, und die Substanz [35] (13,0 g,
28,8 mM) und HOBT (3,89 g, 28,8 mM) werden zur Herstellung einer Lösung zugesetzt. Man gibt PCP (7,67 g, 28,8 mM)
und weiterhin DMF (50 ml) und THF (50 ml) zu. NMM (3,17 ml) wird zu der Lösung bei O0C zugegeben (pH 5), gefolgt von
tropfenweiser Zugabe von WSCI (5,27 ml).(pH 6) und man
rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in eiskaltes
Wasser (1,5 l) gegossen. Man erhält einen Niederschlag (pH 4), der in Wasser suspendiert bzw. dreimal mit Wasser
gewaschen wird (pH 5). Das Pulver wird im Vakuum ge-
trocknet, in Methanol gelöst, im Vakuum konzentriert und das Wasser wird durch Zugabe von Benzol azeotrop destilliert.
Äther wird zugesetzt und das ausgefällte, viskose Material abdekantiert. Die Zugabe von weiterem Äther liefert
ein hellbraunes Pulver. Das Pulver wird in Methanol gelöst, Benzol wird zugesetzt und dann wird im Vakuum
konzentriert. Zur Kristallisation der Substanz wird der Rückstand mit Äther versetzt. Dieser Vorgang wird siebenmal
wiederholt; man erhält die Substanz [36] (102,1 g, Ausbeute 93,5%); Fp. 134 bis 1390C; [α]^ = -68,72° (c =
1, DMF); TLC: Rf2 = 0,40., Rf4 = 0,93.
Elementaranalyse: für C2-^gH51 ,-O^N^gSCl.5H2O
berechnet: C 61,15% H 6,85% N 10,88% gefunden : 60,87 6,70 11,00
Aminosäure-Analyse: Asp 2,00 (2), Thr 1,03 (1), Ser 7,16 (8), GIn 2,02 (2), Pro 10,20 (9), GIy 1,09 (1),
AIa 1,13 (1), lie 0,87 (1), Leu 3 (3), Lys 1,16 (1), Arg 1,05 (1).
3) P(114-115); AOC-Arg(Tos)-Phe-OEt [37]
AOC-Arg(Tos)-OH (63,83 g, 150 mM) wird in DMF (200 ml) gelöst.
Dazu gibt man H-Phe-OEt.HCl (36,18 g, 157,5 mM) und HOBT (21,28 g, 157,5 mM). Man setzt WSCI (28,82 ml, 157,5
mM) tropfenweise bei -10°C zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur,
DMF wird im Vakuum entfernt und 5%ige Natriumbicarbonatlösung (500 ml) wird zu dem Rückstand zugegeben.
Der gebildete Niederschlag wird zweimal mit Äthylacetat (500 ml und 300 ml) extrahiert. Die Äthylacetatschicht
wird mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung, zweimal
mit 1N HCl, dreimal mit gesättigter Natriumchloridlösung
und mit Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen. Nach dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Lösung
im Vakuum konzentriert. Hexan wird zu dem Rückstand zugesetzt und der Niederschlag aus Äthylacetat-Benzol-Hexan
31U818
umkristallisiert; man erhält die Substanz [37] (83,52 g,
Ausbeute 92,3%); Fp. 70 bis 73°C; [a]D = -5,12° (c = 1,
DMF); TLC: Rf1 = 0,69.
4) P(11.3-115); B0C-Pro-Arg(Tos)-Phe-0Et [38]
Die Substanz [37] (85,0 g, 138 mM) wird in Methylenchlorid
(150 ml) gelöst. TFA (350 ml) werden bei 0°C zugesetzt und man rührt 25 min bei Zimmertemperatur. TFA wird entfernt,
der Rückstand mit Äther versetzt, der Niederschlag filtriert und dann über Nacht über Kaliumhydroxid getrocknet.
Das Pulver wird in DMF (60 ml) und THF (300 ml) gelöst. Der pH der Lösung wird durch Zugabo von NMM (1^,17
ml) bei -10°C) auf 7 eingestellt. BOC-Pro-OH (29,70 g,
138 mM) und HOBT (18,64 g, 138 mM) werden zugesetzt. Man gibt WSCI (25,25 ml) bei -10°C zu, rührt 2 h bei -100C
und über Nacht bei Zimmertemperatur. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt, der Rückstand in 5%ige Natriumbicarbonatlösung
(600 ml) gegeben und zweimal mit Äthylacetat (300 ml) extrahiert. Die Äthylacetatschicht wird
zweimal mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung, gesättigter Natriumchloridlösung, zweimal mit 1N HCl, dreimal mit gesättigter
Natriumchloridlösung und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat
getrocknet und dann im Vakuum konzentriert. Hexan wird zu dem Rückstand zugesetzt, der Niederschlag abdekantiert
und nach Zugabe von Äthylacetat im Vakuum konzentriert. Zur Umkristallisation wird Hexan zu dem Rückstand
gegeben; man erhält die Substanz [38] (96,25 g, Ausbeute 99,5%); Fp. 99 bis 101°C; [a]^2= -31,8°(c =.1,
DMF); TLC: Rf1 = 0,52, Rfg = 0,54.
Elementaranalyse: für C^H^gNgS
berechnet: C 58,27% H 6,90% N 11,99%
gefunden : 58,40 7,22 11,71.
3U4818
5) P(113-115); BOC-Pro-Arg(Tos)-Phe-OH [39]
Die Substanz [38] (35,04 g, 50 mM) wird in Methanol(200 ml)
gelöst. Man gibt Ln-HCl (60 ml, 60 mM) tropfenweise innerhalb von 20 min bei O0C zu und rührt 90 min bei Zimmertemperatur.
1N HCl (10 ml) wird zu dem Reaktionsgemisch bei O0C gegeben, Methanol wird im Vakuum entfernt und 1N HCl
(55 ml) bei O0C zugefügt (pH 2). Der Niederschlag wird filtriert
und im Vakuum getrocknet (27,95 g). Das Filtrat wird mit Chloroform extrahiert. Die Chloroformschicht wird dreimal
mit gesättigter Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und
im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird mit dem obigen Material vereinigt und zweimal umkristallisiert; man erhält
die Substanz [39] (29,22 g, Ausbeute 86,9#); Fp.118
bis 120°C; [cc]^4 = -27,04° (c = 1 , DMF); TLC: Rfg = 0,14,
Rf4 = 0,25.
6) P(113 - 145):
BOC- Pro - ArJ
(Tos )'-Pht-CtU-Asp (OBaI)-
( ßs U - S-er ( B^ 1 ) - S^r- C B ? I )
Pvo~ ΫΥΟ- Yro -S^r- Cßzl }-
-S-er (B^l )-Pr ο-S^r (. β * | )-(
Tos )- Leu- Pyo - 6r\/— Pro (B*|
) - Asp COBtl)-T
) - Pro -IU - Uu- Pro.-Gr U-O
(4 Oj
Man gibt Methylenchlorid (100 ml) und TFA (350 ml) zu der
Substanz [36] (102,01 g, 22,44 mM) und rührt 1 h bei Raumtemperatur. TFA wird entfernt, Äther zugesetzt, der Niederschlag
filtriert und über Kaliumhydroxid im Vakuum über Nacht getrocknet (120,7 g) und das Material in 300 ml DMF
gelöst (pH 3)· 11,47 ml NMM werden bei 0°C zugesetzt (pH
3). Dazu gibt man HOBT (3,94 g, 29,17 mM),eine Lösung von PCP (7,77 g, 29,17 mM) in einem Gemisch aus 50 ml DMF und
20 ml THF sowie eine DMF-Lösung (40 ml) der Substanz [39] (19,63 g, 29,17 mM). Weiterhin gibt man tropfenweise ViSCI
(16,02 ml) zu.sowie 5 ml NMM, wobei der pH der Lösung durch Zugabe von NMM (5 ml) auf 5 eingestellt wurde, und
rührt 2 h bei O0C und 5 h bei Zimmertemperatur. WSCI (5,34 ml, 1,3 molarer Überschuß; 2,67 ml, 0,65 molarer
Überschuß; und 2,67 ml, 0,65 molarer Überschuß) wird in dieser Reihenfolge innerhalb von 2 Tagen zugegeben; dann
wird weitergerührt. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt, der Rückstand in kaltes Wasser gegossen und das
so ausgefällte Material durch Filtration gesammelt. Der Niederschlag wird in Wasser suspendiert und die Waschvorgänge
werden dreimal wiederholt. Dann trocknet man 3 Tage im Vakuum; man erhält das Rohprodukt (148,49 g). Das
Produkt wird in Methanol-Chloroform (1:1) gelöst, im Vakuum konzentriert und dann aus Äther umkristallisiert
(diese Vorgänge werden zehnmal wiederholt); man erhält das Produkt [40].(105,94 g, Ausbeute 92,56%); Fp. 148 bis
152°C; [cc]j^4=_-67,38° (c = 1, DMF); TLC: Rf2 = 0,42
(Merck Silikagel 5715)j Rf2 = 0,58 (Merck Silikagel 5721).;
Rf4 = 0,89 (Merck Silikagel 5715).
Elementaranalyse: für C2^H,51°63N42S2C1'6HpO
berechnet: C 60,65% H 6,79% N 11,29% gefunden: 60,52 6,78 11,41
- 50 -
Aminosäure-Analyse: (5,422 mg/6N HCl, 0,5 ml, 105°C, 24 h)
Asp 1,88 (2), Thr 0,97 (1), Ser 6,83 (8), GIn 1,93 (2), Pro 10,68 (10), GIy 1,02 (1), AIa
1,08 (1), lie 0,94 (1), Leu 3 (3), Phe 0,75 (1), Lys 1,09 (D, Arg 1,81 (2).
7) P(112 - 145): " " β D C ~ A 5 f (" 0
BzI )- Pvo-Av-aUos) - P^-
AspCOß.l ) - Ser (BeI )-Ser
-Lx*
-Ci ).- Ak - ?ro - Pro - Pro -S*r
\) - UiA. - Pvo -S^r ( B2, I ) -
1 ) - Av3. ( ToS ) - Leu,- PrO -
) -Asp C O 6^I )
- Thr ( B* I ; - Pro - Ll-e - Leu - Pro _
1VL- OBsI C413
Man gibt Methylenchlorid (150 ml) und TFA (450 ml) zu der
Substanz [40] (104,56 g, 20,5 mM) und rührt 1 h bei Zimmertemperatur.
TFA wird im Vakuum entfernt, Äther wird zum Rückstand zugesetzt, das Präzipitat durch Filtration
gesammelt und über Nacht über Kaliumhydroxid getrocknet (125,4 g). Das Pulver wird in 300 ml DMF (pH 2) gelöst
und der pH wird durch Zugabe von 20,25 ml NMM bei -100C
auf 7 eingestellt. HOBT (3,60 g, 26,65 mMol), BOC-Asn(OBzl)-OH
(8,62 g, 26,65 mM) und eine THF-Lösung (20 ml)von PCP
(7,10 g, 26,65 mM) werden zugesetzt, um eine Lösung herzustellen. Man gibt WSCI (8,63 ml, 47,15 mM) tropfenweise
(pH 7) bei -100C zu und rührt über Nacht bei Zimmertempe-
ratur. Das Lösungsmittel wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in kaltes Wasser (1,5 l) gegossen. Das ausgefällte
Material wird filtriert, in Wasser suspendiert, dreimal gewaschen und dann im Vakuum getrocknet. Das getrocknete
Material wird in Chloroform-Methanol (1:1) gelöst und im Vakuum konzentriert. Die Umkristallisation
durch Zugabe von Äther zum Rückstand wird sechsmal wiederholt; man erhält eine Substanz [41] (102,37 g, Ausbeute
94,1%); Fp. 145 Ms 1500C; [a]^2 = -67,6° (c = 1, DMF);
TLC: Rf2 = 0,29, Rf^ = 0,87.
Elementaranalyse: für C274H366°68N43S2C1*8H2°
berechnet: C 60,39% H 6,77% N 11,05% gefunden : 60,28 6,69 11,18.
Aminosäure-Analyse (0,529 mg/6N HCl 0,5 ml, 105°C, 24 h):
Asp 2,63 (3), Thr 0,97 (1), Ser 6,75 (8), GIn 1,92 (2), Pro 10,65 (10), GIy 1,03 (1), AIa 1,08
(1), He 0,93 (1), Leu 3 (3), Phe" 0,77 (1), Lys
1,09 (11), Arg 1,72 (2).
8) P(11O-111); BOC-Cys(Acra)-Asp(OBzl)-OH [42]
BOC-Cys(Acm)-0Su (77,5 g, 198 mM) wird in THF (400 ml) gelöst.
Man gibt H-Asp(OBzI)-OH (44,64 g, 200 mM), durch Zugabe von NMM (18 ml) bei O0C auf pH 7 eingestellt, sowie
DMF (300 ml) zu und rührt über Nacht, wobei man den pH-Wert durch Zugabe von 18 ml NMM auf 7 einstellt. Man entfernt
DMF im Vakuum, gibt eine 5%ige Natriumbicarbonatlösung (150 ml) zu dem Rückstand und wäscht zweimal mit ·
Äther. Die wäßrige Schicht wird durch Zugabe von 1N HCl
(200 ml) auf pH 3 eingestellt, um das ölige Material auszufällen. Dieses wird dreimal mit Äthylacetat (300 ml)
extrahiert und die Athylacetatschxcht wird dreimal mit wäßriger Natriumchloridlösung und Wasser gewaschen. Nach
dem Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird die Lösung im Vakuum konzentriert. Äther und Hexan werden zu
J I
- 52 -
dem Rückstand gegeben, um das Präzipitat zu erhalten. Die Umkristallisation erfolgt aus Äthylacetat-Äther; man erhält
die Substanz [42] (61,98 g, Ausbeute 62,9%); Fp.132 bis 134°C; O]^4 = -9,76° (c = 1, DMF); TLC: Rf2 = 0,27,
Rf4 = 0,30).
Elementaranalyse: für C22H51OgN5S
berechnet: C 53,11% H 6,28% N 8,45% gefunden : 52,95 6,35 8,25.
9) P(IlO - 145):
β 0 C - C/s ( A
) -Asp ( 0 13*1 J) —Asp (0 b*I ) -AvJ
( Tos ) - pk - CfIw- /Vsp ( 0
-5-er ( Bsi) -S-evC 8*1
- Pro -pvo -Pro -3er C 8^1 )-L-eu-Pro
- S^r ( B^\) - pr0 -^r C
82! )- Avj (J0S )- Um-P™ -(k\/~
Pro- 5W (B*t )-Asp( 0 B ^l ) -Thy
.( BzI ) - Pro-IU-L^u-Pro -
Man gibt Methylenchlorid (40 ml) und TFA (80 ml) zu der Substanz [41] (15,92 g, 3 mM) und rührt 90 min bei Zimmertemperatur.
TFA wird im Vakuum entfernt und Äther zu dem Rückstand zugesetzt. Der Niederschlag wird filtriert und
31U.818
über Kaliumhydroxid (17,47 g) getrocknet. Das Pulver wird
in 50 ml DMF (pH 3) gelöst, wobei der pH durch Zugabe von 1,32 ml NMM bei -100C auf 7 eingestellt wird. Dann
werden HOBT (0,53 g, 3,9 mM), DMF-Lösung (20 ml) der Substanz
[42] (1,94 g, 3,9 mM) und THF-Lösung (20 ml) von PCP (1,04 g, 3,9 mM) in dieser Reihenfolge zugesetzt. Man
gibt WSCI (0,71 ml, 3,9 mM) tropfenweise bei -10°C zu, rührt 2 h bei -10°C und 3 h bei Zimmertemperatur. Man gibt
weitere 0,71 ml WSCI bei -100C zu und rührt über Nacht bei
Zimmertemperatur. Das Lösungsmittel wird abdestilliert und der Rückstand in kaltes Wasser (500 ml) gegossen, um den
Niederschlag zu sammeln. Der Niederschlag wird in Wasser Wasser suspendiert, dreimal gewaschen und dann 2 Tage im
Vakuum getrocknet (18,01 g). Man setzt Chloroform-Methanol (1:1) zu, konzentriert im Vakuum und gibt Äther zur Kristallisation
des Materials zu dem Rückstand zu. Diese Vorgänge werden sechsmal wiederholt; man erhält die Substanz [43]
(15,58 g, Ausbeute 91,35%); Fp. 146 bis 148°C; [α]22 =
-66,72° (c = 1, DMF); TLC: Rf2 = 0,62, Rf4 = 0,62.
Elementaranalyse: für C291E591O75
berechnet: C 59,59^ H 6,72% N 1
gefunden : 59,71 6,43 10,70.
Aminosäure-Analyse (0,542 mg/6N HCl, 0,5 ml, 105°C, 22 h):
Asp 3,38 (4), Thr 0,97 (D, Ser 6,51 (8), GIn 1,97 (2), Pro 10,00 (10), GIy 1,03 (D, AIa
1,10 (1), He 0,94 (1), Leu 3 (3), Phe 0,81 (1), Lys.1,11 (1), Arg 1,71 (2), Cys-Cys 0,34 (0,5).
10) [Cys(Acm)110J-HCG [110-145]
Anisol (20 ml) wird zu der Substanz [43] (5,69 g, 1 mil)
gegeben. Dazu gibt man wasserfreien HF (100 ml) bei O0C
und rührt 1 h. HF wird schnell im Vakuum entfernt. Äther wird zu dem Rückstand zugesetzt. Der so gebildete Nieder-
31U818
schlag wird filtriert, wobei man ein Pulver (5,07 g) erhält, das in 0,1N Essigsäure (200 ml) gelöst, mit Äther
(200 ml) versetzt und geschüttelt wird. Die wäßrige Schicht wird durch eine Säule (3 x 44 cm) aus.Dowex-1 (Acetatform)
geleitet und das Eluat wird unter Bildung eines Pulvers (4,08 g) lyophilisiert. Das Pulver wird in 8 M Harnstofflösung
(350 ml), durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf pH 9,5 eingestellt, gelöst und auf eine Säule (4,5 x
14 cm) aus CMC gegeben. 0,01 M Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5, 500 ml) wird durchgeleitet und dann wird unter Verwendung
eines linearen Gradienten aus 0,01 M (1,5 l) und 0,2 M (1,5 l) Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5) eluiert. Die
Fraktionen Nr. 48 bis 59 (eine Fraktion =11,8 ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält das Pulver (800 mg).
Das Pulver wird in 0,1N Essigsäure gelöst und auf eine
Säule (3,5 x 122 cm) aus Sephadex LH-20 gegeben und unter Verwendung einer 0,1N Essigsäurelösung· eluiert. Die Fraktionen
96 bis 100 (eine Fraktion = 64 ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält [Cys(Acm)11O]-HCG[i1O-i45]
(2,6 mg); Fp. > 2300C -(Zers.); [cc]^8 = +81,2° (c = 0,1,
0,1N Essigsäure); TLC: Rf11 = 0,43.
Aminosäure-Analyse: Asp 3,83 (4), Thr 0,95 (1), Ser 6,82 (8),'GIn 2,05 (2), Pro 10,43 (10), GIy 1,01 (1),
AIa 0,96 (1), Cys 0,47 (0,5), He 0,97 (1), Leu (3), Phe 1,00 (1), Lys 1,00 (1), Arg 2,02 (2).
31U818 Ι" '■: -. 1 iy
- 55 Beispiel 4
HCG (110 - 145):
H-C/j -Asp-Asp-Pro
-AvJ- ph« -CtU -Asp
- ,S-er -S-er — £er ~ 5-ev - LvS - /\|ιλ Pro
- Pro - pro -SfLV - Lhlu - p
- Pro - Sjly - Av^ _ L-e.^- Pro -
■Pro -S<Lr-Ας p-Thr- P™ -IU -■- Pro - ft In - O
ro
[Cys(Acm)110]-HCG[110-145] (50 mg) von Beispiel 3 wird in
0,1N Essigsäure (3 ml) gelöst. Man gibt 0,1N Essigsäure-Lösung
(1 ml) von Quecksilber(II)-acetat (50 mg) zu und rührt 4 h bei Zimmertemperatur. Dann wird 2-Mercaptoäthanol
(1 ml) zugegeben und über Nacht gerührt. Die Lösung wird auf eine Säule (2,0 χ 35 cm) aus Sephadex G-25 gegeben und
unter Verwendung von 0,1N Essigsäure eluiert. Die Fraktionen
Nr. 20 bis 30 (eine Fraktion = 5 ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält HCG [110-145] (47,5 mg,
Ausbeute 95%)· In diesem Beispiel werden 51,35% der Mercaptogruppe
mittels des DTNB-Verfahrens festgestellt; Fp. ^2400C; [oOq8 = +1060C (c = 0,1, 0,1N Essigsäure).
Aminosäure-Analyse: Asp 3,33 (4), Thr (0,89 (1), Ser 5,65 (8), GIn 1,77 (2), Pro 9,80' (10, GIy 0,99 (1),
AIa 0,99 (1), Cys-Cys 0,29 (0,5), He 0,98 (1), Leu 3 (3), Phe 0,98 (1), Lys 0,98 (1), Arg 1,68
(2).
Freie Mercaptogruppe: 53,15$ werden gemäß dem "colorimetrischen
Assay von Cystein gemäß dem Ellman-Verfahren festgestellt.
31U818 i ": . Ί ": .X "
- 56 Beispiel 5
t Cys (Ac* )"° J - KCGr ( I 0 5- I t5
J H - /Up - His - Pro - Leu - Tkr -
(/Acth. ) - /Asp - As-p ~ Pro - A^ -
Pke - GK- Asp -5er - 5er - 5er - Se.r
- 5er - Lys - Λ la. - Pro - Pro - Pro -
5er - Leu - Pro — 5er - Pro - 5er - Arfr
~ Leu - Pi-O - Cf\y - Pro - 5er - Asp ~
Tkr - Pro - IU - Leu - Py-o- - QIn - 0 H
1) P(108-109); BOC-Leu-Thr(BzI)-OBzI [44]
II-Trh(Bzl)-OBzI. (COOH)2 (68,88 g, 0,2 M) wird in DMF
(300 ml) gelöst, durch Zugabe von TEA (28 ml, 0,2 M) neutralisiert
und mit HOBT (27,0 g, 0,2 M) und B0C-Leu-0H.H20
(49,86 g, 0,2 M) versetzt. Man gibt WSCI (36,6 ml, 0,2 M> tropfenweise bei O0C zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur.
Man gibt weiteres WSCI (15 ml) zu und rührt über Nacht. DMF wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand
wird in 1,2 1 Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetatschicht wird mit 5%iger Natriumbicarbonatlösung, Wasser,
1N HCl und Wasser in dieser Reihenfolge gewaschen, durch Zugabe von wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im
Vakuum konzentriert. Die so erhaltene, ölige Substanz (99,24 g, Ausbeute 94,2?0 wird längere Zeit für die Kristallisation
stehengelassen; man erhält die Substanz [44]; Fp. 62 bis 64°C; [a]^1'5 = -15,22° (c = 1, DMF); TLC:
Rf1 = 0,91, Rf6 =0,87.
2) P(1O7-1O9); BOC-Pro-Leu-Thr(Bzl)-OBzl [45]
Methylenchlorid (150 ml) wird zu der Substanz [44](97,9 g,'
191 mM) zugefügt. Dazu gibt man TFA (300 ml) und Anisol
(6 ml) bei O0C und rührt 60 min bei Zimmertemperatur. TFA
wird im Vakuum abdestilliert und Äther zugesetzt. Das in 600 ml DMF gelöste, ölige Material wird durch Zugabe von
NMM bei O0C neutralisiert. Man setzt BOC-Pro-OH (41,11 g,
191 mM) und HOBT (25,80 g, 191 mM) und anschließend WSCI
(35,0 ml) tropfenweise bei O0C zu. Das Reaktionsgemisch
wird durch Zugabe von NMM bis zu einem pH-Wert von 7 neutralisiert und dann über Nacht bei Zimmertemperatur ge-.
rührt. DMF wird im Vakuum entfernt, der Rückstand in Äthylacetat (1,5 1) gelöst, mit 5?oiger Natriumbicarbonatlösung,
1N HCl und gesättigter Natriumchloridlösung in dieser Reihenfolge gewaschen und mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert.
Die Lösung wird im Vakuum konzentriert; man erhält eine ölige Substanz [44] (111,16 g, Ausbeute 95,4%);
TLC: Rf1 = 0,78, Rf6 = 0,82.
3) P(1O6-1O9); BOC-His-Pro-Leu-Thr(BzI)-OBzI [45]
Man gibt Methylenchlorid (240 ml), TFA (400 ml) und Anisol (8 ml) zu der Substanz [44] (106,67 g, 175 mM) zu
und rührt 1 h bei Zimmertemperatur. TFA und Methylenchlorid werden im Vakuum entfernt und der Rückstand wird mit
Äther versetzt. Das so ausgefällte Material wird in 800 ml DMF gelöst, wobei man den pH durch Zugabe von NMM auf 7
einstellt; dann gibt man HOBT (23,64 g, 175 mM) und öliges BOC-His(ToS)-OH zu [BOC-His(Tos)-OH.DCHA (124,1 g, 210 mM,
gelöst in 900 ml Chloroform, gewaschen mit 1N Salpetersäure
und Wasser, mit wasserfreiem Natriumsulfat entwässert und im Vakuum konzentriert]. Weiterhin gibt man WSCI
(35,23 ml, 192,5 mM) tropfenweise zu und rührt über Nacht
bei Zimmertemperatur. DMF wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in 900 ml Äthylacetat gelöst. Die Äthylacetat-
3Ί44018
Lösung wird mit 5?oiger Natriumbicarbonatlösung und Wasser
gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert; man erhält ein öliges Material.
Das ölige Material wird in 900 ml DMF gelöst, man gibt 90 g HOBT zu und rührt 2 Tage bei Zimmertemperatur. DMF
wird im Vakuum abdestilliert und der Rückstand in 900 ml Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird mit 5%±ger Natriumbicarbonatlösung
und Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und dann.im Vakuum konzentriert.
Das Konzentrat wird auf eine Säule (6 χ 25 cm) aus Silikagel gegeben und unter Verwendung von Äthylacetat und Äthylacetat-Methanol
(10:1) eluiert. Mittels TLC geprüfte, entsprechende Fraktionen werden gesammelt und im Vakuum
getrocknet; man erhält das Pulver [45] (69,2 g, Ausbeute 52,9?ό); TLC: R% = 0,35.
(4) P(1O6-1O9); BOC-His-Pro-Leu-Thr(BzI)-NHNH2 [46]
Die Substanz [45] (67,22 g, 90 mM) wird in DMF (300 ml) gelöst, mit Hydrazinhydrat (45,6 ml, 0,95 M) versetzt und
über Nacht bei Zimmertemperatur gerührt. DMF wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in 800 ml Äthylacetat gelöst.
Die Lösung wird mit Wasser gewaschen, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert;
man erhält die gepulverte Substanz [46] (55 g, Ausbeute 91,1%).
5) P(106-111); BOC-HiS-PrO-LeU-TlIr(BzI)-CyS(ACnI)-Asp(OBzI)-OH
[47]
Man gibt TFA (180 ml) und Anisol (3 ml) zu der Substanz
[42] (46,59 g, 93,63 mM) und rührt 60 min bei Zimmertemperatur. TFA wird entfernt und Äther zugesetzt. Das Präzipität
wird abgetrennt und in 300 ml DMF gelöst, wobei der pH durch Zugabe von TEA (26,04 ml, 187,29 mM) auf 7 eingestellt
wird; man erhält eine de-BOC-Lösung.
3U4818
Die Substanz [46] (52,44 g, 78,03 mM) wird in DMF (300 ml)
gelöst. Man gibt eine 4,32N HCl/Dioxan-Lösung (54,18 ml, 234,09 mM) und weiterhin Isoamylnitril (11,55 ml,85,83 mM)
zu und rührt 25 min bei -200C. Nach Zugabe von TEA
(32,52 ml, 234,09 mM) setzt man die obige de-Boc-Lösung zu und rührt 3 Tage bei 100C. DMF wird im Vakuum entfernt
und der Rückstand in Chloroform (900 ml) gelöst. Die Lösung wird mit 5%iger Citronensäurelösung und Wasser gewaschen,
über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird auf eine Säule
aus Silikagel gegeben und unter Verwendung von Chloroform-Methanol (5:1) eluiert. Entsprechende, mittels TLC geprüfte
Fraktionen werden gesammelt und im Vakuum getrocknet. Die Umkristallisation erfolgt aus Methanol-Äther und
liefert die Substanz [47] (62,79 g, Ausbeute 77,7%); Fp.
117 bis 120°C; [«Jq3= -24,2° (c = 1, DMF); TLC: Rf4=0,50.
Elementaranalyse: für C50HgQO13NQS-CF3COOH
berechnet: C 54,30% H 6,1396 N 10,96%
gefunden : 54,21 6,29 11,33.
6) P(1O5-111); BOC-Asp(OBzI)-His-Pro-Leu-Thr(BzI)-Cys(Acm)-Asp(OBzI)-OH
[48]
Man gibt Methylenchlorid (200 ml), TFA (300 ml) und Anisol (4 ml) zu der Substanz [47] (62,17 g, 60 mM) und rührt
60 min bei Zimmertemperatur. TFA wird entfernt und der Rückstand mit Äther versetzt. Das Präzipitat wird in
500 ml DMF gelöst, wobei der pH durch Zugabe von NMM auf 7 eingestellt wird. HOBT (8,11 g, 60 mM) und 2,4-Dinitrophenol
(11,05 g, 60 mM) werden zugegeben und anschließend erfolgt die Zugabe von BOC-Asp(OBzI)-OSu (30,27 g, 72 mM)
bei O0C. Der pH-Wert wird auf 7 bis 8 eingestellt und das
Gemisch 2 Tage bei Zimmertemperatur gerührt. DMF wird abdestilliert, der Rückstand in 6OO ml Äthylacetat
gelöst, mit Wasser gewaschen und über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Die Lösung wird im Vakuum konzentriert
und Äther zur Kristallisation zugesetzt. Die ausgefällten Kristalle werden.durch Säulenchromatographie an
einer Säule (6 χ 25 cm) aus Silikagel gereinigt und unter
Verwendung von Chloroform-Methanol (4:1), Chloroform-Methanol-Essigsäure (80:25:2) und Chloroform-Methanol-Essigsäure
(18:15:5) in dieser Reihenfolge eluiert. Die entsprechenden, mittels TLC geprüften Fraktionen werden
gesammelt und im Vakuum konzentriert, wobei für die Kristallisation Äther zugegeben wird; man erhält die Substanz
[48] (65,06 g, Ausbeute 72,890); Fp. 122 bis 125°C;
[α]β3 = -33,22° (c = 1, DMF); TLC: Rf2=O,19, Rf4=0,53·
Elementaranalyse: für C61H80O16N10S-CF3COOH
berechnet: C 55,70% H 6,23Jfi N 10,31%
gefunden : 56,05 6,06 10,36.
7) P (105 - 145):
B 0 C- Asp ( OB
2 I ) - W i s - Pro - Leu - Tkr C B * I ) - Cy,
ov.) -Äs? (OB2 I )~ A sp(Oß2 I)- Pro
Άη C Tos) - PLe- Oi U- Asp ( 0 BzI
- Ser C BaI ) - $er( B2j ) -: £er( ßz
-WCBzI ) -L7S CZ-CI J -/1Ia. Pro
-Pf-o - Pro -5er CB* I ) -"Leu - Pro
(Tos ) - Leu - Pro - (k Iy - Pro - S^r (
Bz i; -Asf ( OBzIj- -Jkr CBzI)-P
Yo - I |e - Leu - Pro - G1 In ~ 0 B*|
Methylenchlorid (50 ml) wird zu der Substanz [41](15,92 g,
3 mM) von Beispiel 3 gegeben und das Ganze 1 h bei Zimmertemperatur quellen lassen. Man gibt 100 ml TFA zu und
rührt 1,5 h bei Zimmertemperatur. TFA wird im Vakuum entfernt und der Rückstand mit Äther versetzt. Das Präzipitat
wird über Kaliumhydroxid im Vakuum über Nacht getrocknet (17,81 g). Das Pulver wird in 60 ml DMF gelöst, wobei der
pH durch Zugabe von 1,98 ml NMM bei -10°C auf 7 eingestellt
wird. Anschließend werden HOBT (0,53 g, 3,9 mM), die Substanz [48] (4,84 g, 3,9 mM) und DMF (20 ml) zugesetzt.
Man gibt eine THF-Lösung (20 ml) aus PCP (1,04 g, 3,9 mM) (pH 6) und anschließend tropfenweise WSCI (0,71 ml,
3,9 mM) bei -100C (pH 6) zu. Man rührt 1 h bei -100C und
2 h bei Zimmertemperatur, gibt weiteres WSCI (0,71 ml, 3,9 mM) tropfenweise (pH 7) bei -100C zu und rührt über
Nacht bei Zimmertemperatur. Das Gemisch wird im Vakuum konzentriert und der Rückstand in kaltes Wasser (600 ml )
gegossen. Der Niederschlag wird in Wasser suspendiert und gewaschen (dieser Vorgang wird dreimal wiederholt) und
im Vakuum getrocknet (20,79 g)· Das Pulver wird in Chloroform-Methanol
(1 :1 ) gelöst und im Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird in Benzol gelöst, erneut im Vakuum konzentriert
und zur Kristallisation wird Äther zu dem Rückstand zugefügt. (Dieser Vorgang wird sechsmal wiederholt.)
Die Gel-Filtration unter Verwendung einer Sephadex LH-60-Säule (3,5 x 125 cm) und Eluieren mit Chloroform-Methanol
(1:1) wird dreimal wiederholt. Das Eluat wird im Vakuum konzentriert; man erhält die Substanz [49] (16,07 g, Ausbeute
83,32%); TLC: Rf^ = 0,86, Rf2 = 0,55.
Elementaranalyse: für C550H^20O75N55S5C
berechnet: C 60,30% H 6,69% N 11,29% gefunden : 60,10 6,48 11,40.
31U818
Aminosäure-Analyse: Asp 4,20 (5), Thr 1,50 (2), Ser 7,05
(8), Gin 2,04 (2), Pro 10,47 (11), GIy 1,07 (1), He 1,00 (1), Leu 4 (4), Phe 0,83 (1), AIa 1,14
(1), Cys-Cys 0,49 (0,5), Lys 1,16 (1), His 0,64 (1).
8) [Cys(Acm) 110J-HCH [105-145]
Anisol (20 ml) wird zu der Substanz [49] (6,4 g, 1 mM)
zugesetzt. Dazu gibt man 100 ml HF, rührt 1 h bei O0C
und entfernt dann schnell den HF im Vakuum. Der Rückstand wird mit Äther versetzt. Der Niederschlag wird in 0,1N
Essigsäure (100 ml) gelöst und unter Zugabe von Äther geschüttelt.
Die wäßrige Schicht wird durch eine Dowex-1-Säule (Acetatform; 4,5 x 17 cm) geleitet und das Eluat
wird lyophilisiert; man erhält das Produkt (4,17 g). Das Pulver wird in 8 M Harnstofflösung (250 ml) gelöst, wobei
der pH durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf 9,5 eingestellt wird,und auf eine Säule (4,5 x 17,5 cm) aus
CMC gegossen. Eine Säule wird mit 0,01 M Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5) gewaschen und allmählich unter Verwendung
von 0,01 M (1,5 1) bis 0,1 M (1,5 l) Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5) eluiert. Die Fraktionen Nr. 63 bis 73 (eine
Fraktion = 12,4 ml) werden gesammelt und lyophilisiert;
man erhält das Material (930 mg). Das Pulver wird in 0,1N
Essigsäure gelöst, durch eine Sephadex LH-20-Säule (3,5 x
120 cm) geleitet und unter Verwendung von 0,1N Essigsäure
eluiert. Die Fraktionen Nr. 45 bis 60 (eine Fraktion = 6,8 ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält das
Pulver (770 mg). Dieses wird in 20 ml Wasser gelöst und auf eine Säule (4,5 x 17,4 cm) aus CMC gegossen, die mit
0,01 M Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5, 500 ml) gewaschen wird. Die Chromatographie erfolgt durch lineare Gradienten-Elution
unter Verwendung von 0,01 M (1 l) bis 0,1 M (1 1) Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5). Die Fraktionen Nr.58
3H4818 ϊ. ^V.:."V ■"'·' :"
bis 77 (eine Fraktion = 9,8 ml) werden gesammelt und lyophilisiert;
man erhält das Pulver (360 mg). Dieses wird auf eine Säule (3,0 χ 120 cm) aus Sephadex LH-20 gegeben und
unter Verwendung von 0,1N Essigsäure eluiert. Das Eluat
wird zu einem Volumen von jeweils 9,3 mü fraktioniert und
die Fraktionen Nr. 37 bis 41 werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält das Pulver (230 mg). Dieses wird in
0,1N Essigsäure gelöst und auf eine Säule (2,5 χ 92 cm)
aus Sephadex G-50 gegeben und mit 0,1N Essigsäure eluiert.
Die Fraktionen Nr. 47 bis 58 (eine Fraktion = 5,1 ml)
werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält [Cyfi(Acm) j-HCG
[150-145] (200,1 mg); Fp. > 2300C (Zers.); [aj£° =
+97,4° (c = 0,1, 0,1N Essigsäure; TLC: Rf11 = 0,42.
Aminosäure-Analyse: Asp 4,44 (5), Thr ·1,34 (2), Ser
5,55 (8), GIn 2,06 (2), Pro 11,76 (11), GIy 0,98 (1), AIa 1,00 (1), Cys-Cys 0,25 (0,5), He
0,97 (1), Leu 4 (4), Phe 1,00 (1), Lys 1,01 (1, His 1,03 (1), Arg 2,12 (2).
31U818
• ·
Bei s ρ i e 1 6 - 64 -
lrys(Acm)110]-lICG [100 - 145J :
H-G7S- GrI7 - Gr I7 - pro ~ Lys ~A
sp- His - Pr* - Leu - TKr - Cys C/lc-nuJ
-Asp ~Asp ~ Pro -/\n _ PK.e - G, In.-Λ
Sj?- S^r ~ S^r - $,e-r- - S ar - L7S - A I cl -
Pr-b - Pro - Υγο ~ Sx^r- Leu - Pro - S<zr
~ Pro - S ^r -Arfr- Leu - pro - G1 I7 Pro
- Ser -/)sp - Tkr - Pro - 11 e - Leu
- Pro - GfK- 0 H
1) P(IOO - 145):
B ο c ~ G7* C Π Β
z\ ) - μ Iy — Giiv — 1 ro ~~ L7S C £ J /J
C OB^ \ ) - His - Pro - Leu - TKr ( B2 I
0 B.2 I ) - ?r0 —Ar^ C Tos ) - PK.C -CrU - As? C OBa I J - Se»- ( Bz) J - Seh
B2) J - Ser CB2 O - Ser C B2)) - L
CZ - cO-/] Ια,- Pro - Pro -Pro C
bz) ) - Leu - Pro- Ser C BzI J- P
-Se-r C BzI J - /)rj CT°s J - Leu- Pn
; - G1Iy - Pro -Ser CBzO - Λί ρ C O B* I.
j ) -TKr C BaI ) - Pro -Ue ~ L^ " ^
- G^l a - 0 Β* I
3U4818 · i 1*1 Α.Ό ■
Die Substanz [41] (8,44 g, 1,5 mM) von Beispiel 3 wird in
DMF (35 ml) gelöst (pH 3) und der pH wird durch Zugabe von 0,48 ml NMM bei -100C auf 7 eingestellt. BOC-Cys(MBzI)-Gly-Gly-Pro-Lys(Z)-Asp(OBzl)-His-Pro-Leu-Thr(BzI)-Cys(Acm)-Asp(OBzI)-OH
[55] (3,78 g, 1,95 iriM) und HOBT (0,26 g, 1,95 mM) und anschließend eine THF-Lösung (5 ml)
von PCP (0,52 g, 1,95 mM) werden zugegeben. Man gibt WSCI (0,35 ml, 1,95 mM) tropfenweise bei -10°C zu, rührt 2 h
bei -10°C und 3 h bei Zimmertemperatur). WSCI (0,36 ml,
1,95 mM) wird tropfenweise bei -100C zu dem Reaktionsgemisch
gegeben und ferner die Substanz [55] (0,25 g, 0,13 mM). Man gibt WSCI (0,11 ml, 0,6 mM) tropfenweise
bei -10°C zu und rührt über Nacht bei Zimmertemperatur.
DMF wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in kaltes Wasser (400 ml) gegeben. Der Niederschlag wird suspendiert,
dreimal gewaschen und 2 Tage im Vakuum getrocknet.' Das getrocknete Material wird in Methanol-Chloroform(1:2)
gelöst und die erneute Ausfällung durch Zugabe von Äther wird sechsmal wiederholt; man erhält die Substanz [56]
(Ii,59 g, Ausbeute 109,9%); Fp. 135 Ms 14O°C; [a]2£'5 =
-59,16° (c = 1, DMF); TLC: Rf2 = 0,21, Rf4 = 0,80.
Elementaranalyse: für C^coH^yyO^N^gS^CLIOH^
berechnet: C 59,82% H 6,67% N 11,27% gefunden : 59,58 6,55 11,53.
2) [Cys(Acm)110]-HCG [100-145]
Thioanisol (10 ml) und L-Methionin (200 mg) werden zu der Substanz [56] (3»51 g, 0,5 nM) gegeben. Man gibt wasserfreien
HF (70 ml) zu, rührt 1 h bei O0C und entfernt HF schnell im Vakuum. Der Rückstand wird mit Äther· versetzt
und der Niederschlag abgetrennt. Das Pulver wird in 0,1N
Essigsäure (150 ml) gelöst und mit Äther geschüttelt. Die wäßrige Schicht wird durch eine Säule (3 x 40 cm) aus
Dowex-1 (Acetatform) geleitet und das Eluat wird lyophi-
31U818 ·..*·..·■ A.
NACHGEREICHT
lisiert; man erhält das Pulver (2,79 g). Dieses wird in 1Obigem Mercapto-äthanol in 8 M Harns to ff lösung (120 ml)
gelöst, wobei der pH durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf
9.5 eingestellt wird;dann wird die Luft durch Stickstoffgas ersetzt
und 30 min gerührt. Die Lösung wird auf eine Säule (4,5 x 12 cm) aus CMC gegossen, die mit 0,01 M Ammoniumacetatpuffer
(pH 4,5) gewaschen wird. Die Elution erfolgt mittels linearer Gradientenelution mit 0,01 M (1 l)
bis 0,1 M (1 l) Ammoniumacetat (pH 4,5). Die Fraktionen Nr. 27 bis 35 (eine Fraktion = 12,6 ml) werden gesammelt,
lyophilisiert, und das Pulver wird erneut auf eine Säule (3 χ 120 cm) aus Sephadex LH-20 gegeben und mit 0,1N
Essigsäure eluiert. Die Fraktionen Nr. 36 bis 47 (eine
Fraktion =6,2 ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält das Pulver (400 mg). Das Pulver wird in 0,1N
Essigsäure-(30 ml) gelöst und auf eine Säule (2,5 x 24 cm)
gegossen, die mit 0,01 M Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5) gewaschen wird. Die Elution erfolgt durch lineare
Gradientenelution mit 0,01 M (500 ml) bis 0,1 M (500 ml) Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5). Die Fraktionen Nr. 61 bis
70 (eine Fraktion = 10,2 ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält das Pulver (270 mg). Das Pulver wird
in 0,1N Essigsäure gelöst, auf eine Säule (3 x 120 cm) aus Sephadex LH-20 gegossen und mit 0,1N Essigsäure eluiert.
Die Fraktionen Nr. 20 bis 27 (eine Fraktion = 9,5ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält das Pulver
(16O mg). Dieses wird in 0,1N Essigsäure gelöst, auf eine Säule (3 x 192 cm) aus Sephadex G-50 gegossen und mit 0,1N
Essigsäure eluiert. Die Fraktionen Nr. 5^ bis 67 (eine
Fraktion = 9 ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält das Pulver (10,22 mg). 100 mg davon werden in 8 M
Harnstofflösung (4 ml) gelöst, durch eine Dowex 1-Säule
geleitet, EDTA (0,48 g), 3 M Tris-HCl-Puffer (pH 0,6,
1.6 ml) und 2-Mercaptoäthanol (0,1 ml) werden zugesetzt
und dann wird 24 h bei Zimmertemperatur unter Stickstoff-
gasatmosphäre gerührt. Nach Einstellen des pH-Wertes durch
Zugabe von Essigsäure auf 5 wird die Lösung auf eine Säule (2,5 x 34 cm) aus Sephadex G-25 gegossen und mit 0,1N Essigsäure
eluiert. Die Fraktionen Nr. 8 bis 12 (eine Fraktion = 6 ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält
das Produkt (92 mg). 35% freies Mercaptoäthanol werden gemäß dem DTNB-Verfahren für die Feststellung von Mercaptogruppen
beobachtet; Fp. > 2200C (Zers.); Ι>]^8 = +127°(c =
0,1, 0,1N Essigsäure); TLC: Rf11 = 0,49.
Aminosäure-Analyse: Asp 4,50 (5), Thr 1,29 (2), 8er 5,43
(8), GIn 2,06 (2), Pro 1?,7ö (12), GIy 2,80 (3),
AIa 0,95 (1), Cys-Cys 0,34 (0,5), He 0,96 (1),
Leu 4 (4), Phe 0,96 (1), Lys 2,06 (2), His 1,07 (1), Arg 2,02 (2).
[Tyr100, Cys (Aon)11C>]-HCG [100 - 145]:
H - lyr - GrIx- Gr I7 -Pr0-L/s
- AsP - His - ?ro -· Leu - Tkr - Lys
L A ck) - A sf - Asp - Yro - At) - FWe. -C-rU-^sp-
Ser - 5er- 5er - S er - L/s
- /AIa - Pro - Pro - Pro - 5er - Leu -
Pro - Sar - Pro - S*r - Aq - Leu - Pro
" Cr I/ - Pro - Ser - AsF - lkr - ?ro -He
- Leu ~ Yr0 - GtIr - Oh]
P C I ο 0 - , 0 *) ; BOC~ lyr (B2|
-CI > ) - Q\y - Cix - Pro - L7S C Z) O
Bz I iS'7 )
1) P(IOO - 145):
B Ό C - T/r ( B
- Ci * ) - Gr Iy - Gr Ix - Ly5 CZ) - /b
0 BzI ) - His - Pro - Leu - Tkr CBzI
) - Cy s C A c*i ) - /J s ρ C 0 β ζ I ) - A s ρ C
OBzI)- Pro -Ar^ C Tos ) - PKe -GIn
-/Up C OBzI ) - Sej- C BzI ) - Ser C
BzI ) - Ser C Bz I ) - £er C Bz I )- Lys
2 - Cl ) - /U o, - pro - pro - prc - W
( BzJ ) - Leu - Pro - Ser ( BzI )·- Pro
C Bz \ ) - A^ C Tos ) - Leu - Pro ,
- Pro - S^r C Bz I ) -"/isp ( 0ß2|
- TKr CBzI) - Pro - IU - "Leu - Pro
-GrIn.- OB* \ I 6o)
Die Substanz [41] (8,44 g, 1,5 mM) des Beispiels 3 wird
in DMF (35 ml) (pH 3) gelöst und der pH durch Zugabe von 0,48 ml bei -100C auf 7 eingestellt. Man gibt HOBT (0,26 g,
1,95 mM) und B0C-Tyr(Bzl-Cl2)-Gly-Gly-Pro-Lys(Z)-Asp(OBzI)-His-Pro-Leu-Thr(BzI)-Cys(Acm)-Asp(0Bzl)-0H
[59] (3,97 g, 1,95 mM) und anschließend eine THF-Lösung (5 ml)
von PCP (0,52 g, 1,95 mM) zu. WSCI (0,36 ml, 1,95 mM) wird tropfenweise bei -100C zugesetzt und man rührt 2 h
bei -100C und 3 h bei Zimmertemperatur. Zu dem Reaktions-
3UA818 'j. j- : I/O J-
gemisch gibt man bei -1O0C tropfenweise WSCI (0,36 ml,
1,95 mM), rührt ü^er Nacht bei Zimmertemperatur und gibt
weiterhin die Substanz [59] (0,31 g, 0,15 mM) zu. WSCI (0,11 ml, 0,6 mM) wird tropfenweise bei -10°C zugesetzt
und man rührt über Nacht bei Zimmertemperatur. DMF wird im Vakuum entfernt und der Rückstand in 400 ml kaltes
Wasser gegossen. Die Vorgänge des Suspendierens des Präzipitats in Wasser und des Waschens werden dreimal wiederholt
und dann wird 2 Tage im Vakuum getrocknet. Das getrocknete Material wird in Chloroform-Methanol (2:1) gelöst
und erneut mit Äther ausgefällt. Dieser Vorgang wird sechsmal wiederholt, wobei man die Substanz [60] (12,03 g,
Ausbeute 112,590) erhält; Fp. 139Ms 144°C; [a]^0'5 =
-55,22° (c = 1, DMF); TLC: Rf2 = 0,18, Rf4 = 0,89.
Elementaranalyse: für £364^477° a.oN58S3C13 *10H2°
berechnet: C 59,83% H 6,58% N 11,12% gefunden : 59,60 6,47 11,16
2) [Tyr100, Cys(Acm)110]-HCG [100-145]
Anisol (15 ml) wird zu der Substanz [60] (3,56 g, 0,5 mM)
gegeben. Dazu gibt man 70 ml wasserfreien HF, rührt 1 h bei 0°C und entfernt den HF schnell im Vakuum. Der Rückstand
wird mit Äther versetzt. Das ausgefällte, weiße Pulver wird in 0,1N Essigsäure (200 ml) gelöst und durch eine
Säule (4,5 x 16 cm) aus Dowex-1 (Acetatform) geleitet.
Das. Eluat wird lyophilisiert; man erhält das Pulver (2,42g). Weiterhin wird die Substanz [60] (3,56 g) auf die oben
beschriebene Weise behandelt, wobei man das Pulver (2,38 g) erhält. Die kombinierten Pulver (4,80 g), gelöst in 8 M
Harnstofflösung (250 ml), deren pH durch Zugabe von wäßrigem Ammoniak auf 9 eingestellt wird, werden auf eine Säule
(3,5 x 17 cm) aus CMC gegeben. Die Säule wird mit 0,01 M Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5, 500 ml) gewaschen und die
lineare Gradienten-Elution erfolgt mit 0,01 M (1,2 l) bis
0,1 M (1,2 1) Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5). Die Fraktionen
Nr. 52 bis 60 (eine Fraktion = 12 ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält das Pulver (1,72 g).
Dieses wird in 0,1N Essigsäure gelöst und auf eine Säule
(3,5 x 120 cm) aus Sephadex LH-20 gegossen und.mit 0,1N
Essigsäure eluiert. Die Fraktionen Nr. 25 bis 31 (eine Fraktion = 12,4 ml) werden gesammelt und lyophilisiert;
man erhält das Pulver (0,63 g). Dieses wird in 0,05N Essigsäure (20 ml) gelöst und auf eine Säule (2 χ 32 cm),
aus CMC gegossen. Eine Säule wird mit 0,01 M Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5, 200 ml) gewaschen. Die lineare
Gradienten-Elution erfolgt mit 0,01 M (1 1) bis 0,05 M (1 1) Ammoniumacetatpuffer (pH 4,5). Die Fraktionen Nr.89
bis 96 (eine Fraktion = 9»4 ml) werden, gesammelt und lyophilisiert;
man erhält das Lyopftlisat (350 mg). Dieses wird in 0,1N Essigsäure gelöst, auf eine Säule (3>5 x
120 cm) aus Sephadex LH-20 gegossen und mit 0,1N Essigsäure
eluiert. Die Fraktionen Nr. 24 bis 29 (eine Fraktion = 12,4 ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man
erhält das Lyophilisat (180 mg). Dieses wird in 0,1N
Essigsäure gelöst, auf eine Säule (2 χ 74 cm) aus Sephadex G-50 gegeben und mit 0,1N Essigsäure eluiert. Die
Fraktionen Nr. 18 bis 23 (eine Fraktion = 6 ml) werden gesammelt und lyophilisiert; man erhält [Tyr100, Cys(Acm)110]-HCG
[100-145] (141,1 mg); Fp. > 2350C (Zers.); [a]^8 =
-25° (c = 0,1, 0,1N Essigsäure); TLC: Rf11 =0,45.
Aminosäure-Analyse (unter Bedingungen der Zersetzung des geschützten Peptids): Asp 4,96 (5), Thr 1,15 (2), Ser
6,26 (8), GIn 2,04 (2), Pro 12,14 (12), GIy 2,93 (3), AIa 0,93 (1), Cys-Cys 0,45 (0,5), He
0,93 (1), Leu 4 (4), Tyr 0,99 (1), Phe 1,00 (1), Lys 1,98 (2), His 0,97 (1), Arg 2,05 (2).
Ende der Beschreibung.
Claims (1)
- KRAUS & WEISERT'PATENTANWÄLTEDR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER ■ DR.-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE yIRMGARDSTRASSE 15 -' D-8CXX) MÜNCHEN 71 ■ TELEFON 089/797077-797078 · TELEX O5-212156 kprat d ■ 'TELEGRAMM KRAUSPATENT **3121AW/MyTOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA Tagata, JapanC-terminales Fragment von menschlichem ChoriongonadotropinPatentanspruchPeptid der Formel IR - Ser - Leu - Pro - Ser - Pro - Ser - "*Arg - Leu- Pro - GIy - Pro - Ser - Asp Thr - Pro - He - Leu - Pro - Gin - OHworin ■ ·R für H oder eine R.-Ser-Ser-Ser-Ser-Lys-Ala-Pro-Pro-Pro-Gruppe steht, wobei R1 H oder Rp-R-,-Asp-Asp-Pro-Arg-Phe-Gln-Asp-Gruppe bedeutet, in der R2 für H oder . R^-Asp-His-Pro-Leu-Thr-Gruppe [R^ = H-Rc-Gly-Gly-Pro-Lys-Gruppe (R,- = Cys- oder Tyr-Gruppe) ] und R, für eine Cys- oder S-Acetamidmethyl-Cys-Gruppe stehen,
.oder ein Salz davon.
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| US5968513A (en) * | 1996-06-24 | 1999-10-19 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Method of promoting hematopoiesis using derivatives of human chorionic gonadotropin |
| US6319504B1 (en) | 1996-06-24 | 2001-11-20 | University Of Maryland Biotechnology Institute | Treatment and prevention of HIV infection by administration of derivatives of human chorionic gonadotropin |
| US5997871A (en) * | 1996-06-24 | 1999-12-07 | University Of Maryland Biotechnology Insitute | Treatment and prevention of cancer by administration of derivatives of human chorionic gonadotropin |
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| US7994278B1 (en) | 1999-08-06 | 2011-08-09 | Nobel Biosciences Llc | Biologically active polypeptides derived from a novel early stage pregnancy factor designated maternin (MA) |
| PL206255B1 (pl) * | 2000-07-21 | 2010-07-30 | Dendreon Corporationdendreon Corporation | Inhibitor proteazy wirusa zapalenia wątroby C, zawierająca go kompozycja farmaceutyczna i zastosowanie inhibitora do wytwarzania leku do leczenia chorób związanych z HCV oraz zastosowanie do wytwarzania kompozycji do stosowania w kombinowanej terapii |
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