DE2010759C3 - Eckige Klammer auf beta- Ala hoch 1- eckige Klammer zu -ACTH (1- 18>NH tief 2, seine Salze mit Säuren und Komplexe mit Schwermetallen und Polyaminosäuren, sowe diese Verbindungen enthaltende Arzneimittel - Google Patents

Description

2. Verbindung der allgemeinen Formel

Ri-0-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methiony]-

y-Ri-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenyialanyl-

L-argmyl-L-tryptophyl-glycyl-N*-R₃-L-lysyl-

L-prolyl-L-valyl-glycyl-N*-R₃-L-lysyl-

N^£-R₃-L-lysyl-L-arginyl-L-argininamid,

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in der R₁ und R₃ Aminoschutzgruppen darstellen und R₂ eine Carboxylschutzgruppe ist.

3. Verbindung nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß R₁ und R₃ jeweils eine tert.-Butyloxycarbonyl-, tert-Amyloxycarbonyl-, 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl-, Benzyloxycarbonyl-, p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, p-Nitro-benzyloxycarbonyl-, Formyl-, Tosyl- oder Tritylgruppe und R₂ ein niederer Alkylester- oder _J0 niederer Arylalkylesterrest ist.

4. Arzneipräparate, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1 und übliche Trägerstoffe und bzw. oder Verdünnungsmittel und bzw. oder Hilfsstoffe.

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Aus verschiedenen Laboratorien sind Synthesen einer großen Anzahl von Corlicotropin(ACTH)-Peptidanalogen berichtet worden. Bei den Peptidanalogen sind einzelne Aminosäuren der natürlichen Sequenz gegen andere Aminosäuren ausgetauscht, z. B. die erste Aminosäure Serin gegen Glycin oder D-Serin, die vierte Aminosäure Methionin gegen Valin oder Norleucin, die fünfte Aminosäure Glutaminsäure gegen Glutamin, die 17. und 18. Aminosäure Arginin gegen Lysin oder Ornithin oder die 25. Aminosäure Asparaginsäure gegen Valin. Obwohl viele corticotrope Peptide mit einer geringfügig veränderten Aminosäuresequenz bisher synthetisiert worden sind, <,₀ zeigte bis auf ein paar Ausnahmen keines dieser Peptide eine größere Aktivität als das natürliche Corticotropin. Von besonderem Interesse ist das Peptid D-Ser'-NLe'-Val^-ACTHd^-NH;,, das einen D-Serinrest am Aminoende an Stelle des naliven L-Serins, einen Valinamidrest am Carboxylende an Stelle des Asparaginsäurerestes und in Stellung 4 an Stelle des Methioninrestes beim Corticotropin einen Norleucinrest enthält. Dieses Peptid ist nach den Angaben der Literatur biologisch aktiver als das native Corticotropin; vgl. Experientia, 22, 526 (1966). Es scheint sehr wahrscheinlich, daß das beim p-Se^-NLe*-VaI²⁵-ACTH(I^S)-NH₂ beobachtete Anwachsen der Aktivität eine Folge der verringerten Anfälligkeit des. Peptides gegenüber der Wirkung von Aminopeptidase und Carboxypeptidase ist. Dies ist auf die Gegenwart einer D-Aminosäure am Aminoende und eines Valinamids am Carboxylende und auf die Tatsache zurückzuführen, daß die Oxydation von Methionin in Stellung 4 zu Methioninsulfoxid bei Inaktivierung nicht auftreten kann, da der Methioninrest durch einen Norleucinrest ersetzt ist D-SeH-NLe^VaF-ACTHU^SJ-NHa ist zwar ein ausgezeichnetes corticotropes Peptid mit hoher biologischer Aktivität, es ist nicht das Idealmittel, da es einige Probleme bei seiner Anwendung in der Humanmedizin mit sich bringt. Da D-Ser¹-NLe⁴-Val²⁵-ACTH(l-25)-NH₂ drei modifizierte Aminosäuren, d. h. D-Serin-, Norleucin- und Valinreste enthält, besteht die Gefahr einer anaphylaktischen Reaktion beim Verabreichen an Menschen wegen dieses Unterschiedes in der Aminosäuresequenz zwischen menschlichem Corticotropin und dem synthetischen Peptid. Es ist bekannt, daß die anaphylaktische Reaktion häufig auftritt, wenn im Handel erhältliches, aus Hypophysen von Tieren, wie Schweinen, Rindern oder Schafen, stammendes Corticotropin Menschen verabreicht wird. Diese unerwünschte Erscheinung kann eine Folge der strukturellen Unterschiede in den Aminosäuresequenzen in den Stellungen 25 bis 33 zwischen menschlichem und tierischem Corticotropin sein und kann auch auf bestimmte proteinähnliche Verunreinigungen, die nicht vollkommen aus dem natürlichen, aus den genannten tierischen Quellen stammenden Corticotropin entfernt werden können, zurückzuführen sein. Weiter weiß man, daß die Reaktivität der Hydroxylgruppe des Serins, die Labilität der Seryl-Peptidbindung unter alkalischen Bedingungen, die Neigung zu ß-Eliminationsreaktionen unter Bildung von Dehydro-Peptiden und die N — O-Acyl-Verschiebung die Herstellung von Serin enthaltenden Peptiden sehr erschweren, die wegen Labilität unter alkalischen Bedingungen oft von Racemisierungsprodukten begleitet sind. Außerdem erfordert die Synthese einer langen Peptidkette einen großen Aufwand an Arbeitszeit und Arbeitskraft. Deswegen ist . es sehr wünschenswert, ein hochaktives corticotropes Peptid herzustellen, dessen Aminosäuresequenz so kurz wie möglich ist.

In der Zeitschrift J. Am. Chem. Soc, 87,2696 (1965) und J. Biochem. (Tokio), 58. 512 (1965) ist die Synthese eines corticotropen, hochaktiven Octadekapeptidamids beschrieben, das den ersten 18 Aminosäureresten des Corticotropins entspricht, mit der einen Ausnahme, daß das Carboxylende in das Amid übergeführt wurde. Außerdem gelang es, ein Ocladekapeptid zu synthetisieren, in dem das aminoterminale Serin des Corticotropins durch einen Glycinrest ersetzt und dessen Carboxylende in das Amid übergeführt ist; vgl. Bull. Chem. Soc. Japan., 43, 196 (1970). Beide Peptide weisen eine hohe corticotrope Aktivität auf. In vivo entsprechen die steroidgenelischen Aktivitäten bei intravenöser Verabreichung an Ratten denen von Schafcorticotropin. Jedoch ist die steroidgenetische Aktivität in vitro etwas geringer als die von Schafcorticotropin.

Aufgabe der Erfindung war es daher, neuecorticotrope Peptide zu schaffen, die ausgeprägte biologische Eigenschaften, stimulierende Wirkung auf die Nebennierenrinde, Jipolytische Aktivität und melanozytenstimulierende Aktivität aufweisen, die alle höher sind als die Aktivitäten von natürlichem Corticotropin und von bisher bekannten synthetischen Corticotropin-Peptiden. Diese Aufgabe wird durch die Erfindung gelöst.

Gegenstand der Erfindung ist somit das Octadekapeptid der Formel I

0-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-L-lysyl-L-prolyl-L-valylglycyl-L-lysyl-L-lysyl-L-arginyl-L-aigininamid

(abgekürzt mit FjS-AIa¹I-ACTH(I-IS)-NH₂ bezeichnet), seine Salze mit Säuren und Komplexe mit Zink, Kobalt, Nickel, Kupfer, Eisen, Poly-L-glutaminsäure, Poly - D - glutaminsäure, Poly - dl - glutaminsäure, Poly - L - asparaginsäure, Poly - dl - asparaginsäure, Copoly-L-glutamyl-tyrosin oder deren Gemische.

Wenn nichts anderes angegeben ist, so weisen alle im folgenden beschriebenen Aminosäuren die L-Konfiguration auf. Die Abkürzungen für Aminosäuren, Peptide und ihre Derivate stimmen mit den Empfehlungen der IUPAC-IUB-Nomenklaturkommission überein.

Das Octadekapeptid der Erfindung hat eine länger anhaltende corticotrope Aktivität, was wahrscheinlich auf die Widerstandsfähigkeit gegen die Wjkung von Aminopeptidase zurückzuführen ist. Weiterhin wurde festgestellt, daß die Komplexe des Octadekapeptids eine langanhaltende Aktivität aufweisen.

Im allgemeinen werden Polypeptide nach verschiedenen Verfahren hergestellt, indem die Aminosäurereste nacheinander oder vorher synthetisierte Peptidbruchstücke zu einer angegebenen Sequenz verknüpft werden. Dabei können die Aminosäure oder die Peptideinheit durch bekannte Verfahren mit weiteren Aminosäuren oder Peptidbruchstücken verknüpft werden.

Zur Herstellung des Octadekapeptids der Erfindung und seiner Zwischenprodukte werden alle freien, funktioneilen, an der Reaktion nicht teilnehmenden Gruppen vorteilhaft durch Reste geschützt, die leicht durch z. B. Säurehydrolyse, spaltende Hydrierung oder Hydrolyse entfernt werden können. Die Carboxylgruppe wird vorzugsweise durch Veresterung, z. B. mit einem niederen aliphatischen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol oder tert.-Butanol, oder einem niederer. Arylalkylalkohol, wie Benzylalkohol, p-Nitrobenzylalkohol oder p-Methoxybenzylalkohol, oder durch Amidbildung geschützt. Die Aminogruppe wird vorzugsweise durch Gruppen, wie die tert.-Butyloxycarbonyl-, die tert.-Amyloxycarbonyl-, die p-Methoxybenzyloxycarbonyl-, die Benzyloxycarbonyl-, die p-Nitrobenzyloxycarbonyl-, die Trityl-, die 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonyl- oder die Formylgruppe geschützt. Zum Schutz der Guanidinogruppe im Arginin wird verzugsweise die Nitro- oder Tosylgruppe verwendet, jedoch ist es nicht immer notwendig, die Guanidinogruppe des Arginins während der Reaktion zu schützen. Ebenso wird die t-Aminogruppe des Lysins vorzugsweise durch die tert.-Butyloxycarbonyl-, die tert.-Amyloxycarbonyl-, die Benzyloxycarbonyl- oder die 2-(p-Diphenyl)-isopropyloxycarbonylgruppe geschützt. Außerdem wird die y-Carboxylgruppe der

Glutaminsäure vorzugsweise in Form eines niederen

Esters, wie den Methyl-, Äthyl-, Propyl- oder tert.-Bu-

tylester oder eines niederen Arylalkylesters, wie den

S Benzyl-, p-Nitrobenzyl- oder p-Methoxybenzylester oder durch Amidbildung geschützt. Die Iminogruppe

von Histidin kann z. B. durch die Benzyloxycarbonyl- oder die Benzylgruppe geschützt werden.

Als Kondensationsverfahren für die Bildung der

ίο Peptidbindung können z. B. folgende Verfahren Verwendung finden: das Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, das Azidverfahren, das Aktivesterverfahren, z. B. mit dem Cyanomethyl-, p-Nitrophenylthiot-, p-Nitrophenyl-, N-Hydroxysuccinimid-, 8-Chinolyl- oder

1-Piperidylester, das gemischte Anhydridverfahren, das N-Carboxyanhydridverfahren, das Tetraäthylpyrophosphitverfahren, das Äthylchlorphosphitverfahren, eine Kombination dieser Verfahren und andere, auf dem Gebiet der Peptidchemie üblicherweise verwendete Verfahren. Das Octadekapeptid kann auch nach der sogenannten Synthese in fester Phase hergestellt werden, bei der die Synthese vom Carboxylende des Peptids ausgeht, das esteräbnlich an ein Polymer gebunden ist und die Aminosäuren nacheinander angehängt werden. Alle genannten Verfahren können zur Bildung aller Peptidbindungen des Octadekapeptids der Erfindung und seiner Zwischenprodukte verwendet werden.

Wie vorstehend erwähnt, gibt es eine Reihe von verschiedenen Wegen zur Herstellung des Octadekapeptids aus Aminosäuren oder Peptideinheiten. Zum Beispie! kan-n nach einem Verfahren das Octadekapeptid dadurch hergestellt werden, daß man ein Dekapeptid der allgemeinen Formel Il

Ri-ZJ-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-V-R₂-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycin

in der R₁ eine Aminoschutzgruppe und R₂ eine Carboxylschutzgruppe ist. mit einem Octapeptid der allgemeinen Formel III

N^£-R₃-L-Lysyl-L-prolyl-L-valyl-glycyl-N^£-R₃-L-lysyl-N^£-R₃-L-lysyl-L-arginyl-

argininamid

in der R₃ eine Aminoschutzgruppe ist, in einem inerten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid, Dimelhylsulfoxyd, Pyridin, Dimethoxyäthan, Hexamethylphosphortriamid, Dioxan oder einem Gemisch dieses Lösungsmittels 2 bis 96 Stunden bei Temperaturen von — 20 bis 50° C in an sich bekannter Weise kondensiert und die Schutzgruppen aus dem erhaltenen

ss Octadekapeptid der allgemeinen Formel IV

Rj'/i-i.-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyly-R₂-L-glutamy]-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl-L-tryptophyl-glycyl-NMlj-L-lysyl-(10 L-prolyl-i-valyl-glycyl-N^e-R₃-L-lysyl-

N'-Rj-L-lysyl-arginyl-argininamid (IV

in der R₁, R₂ und R₃ die oben angegebene Bedeutunj haben, in an sich bekannter Weise, wie Säurehydro fts lyse. hydrierende Spaltung oder Hydrolyse, entfernt.

Im folgenden Syntheseschema ist ein bevorzugte Verfahren Tür die Herstellung des Octadekapeplid angegeben.

Syntheseschema für das Octadekapeptid

BOC-/3-Ala · OH + H · Tyr · OMe BOC-Ser · OH + H · Met · OMe (V)

BOC- /9-Ala · Tyr · OMe (VI)

NH₂NH₂ · H₂O

BOC — Ser · Met · OMe (VII)

H⁺

BOC — j3-Ala · Tyr ■ NHNH₂ (VIII)

BOC- ß-Ala · Tyr · Ser · Met ■ OMe

NH₂NH₂ · H₂O

BOC- /S-AIa · Tyr · Ser · Met · NHNH₂ (XI)

+ H · Ser · Met ■ OMe (IX)

NO₂

BOC—Arg · Trp · GIy · OMe

(XII)

HCOOH.

NO₂

BOC — Phe · OH + H · Arg · Trp · GIy · OMe (XIII)

NO₂

BOC — Phe · Arg · Trp · GIy ■ OMe (XIV)

HCOOH

Z NO₂

Z —His · ONP + H · Phe · Arg · Trp · GIy · OMe (XV)

Z NO₂

Z —His · Phe · Arg · Trp · GIy · OMe (XVI)

(i) OH" (ü)

OBu*

ι i

Z — Glu — ONP + H · His · Phe · Arg · Trp · GIy ■ OH

(XVII)

OBu'

Z—GIu · His · Phe Arg · Trp · GIy · OH (XVIII)

H₂/Pd OBu¹

^l . '

H-GIu- His · Phe · Arg · Trp · GIy · OH (XIX)

PCI) + (XDC)

OBu¹

BOC — /3-Ala · Tyr · Ser ■ Met · GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy · OH
(XX)

NHS, DCCI
OBu¹ BOC

BOCBOC

BOC-|9-Ala·Tyr·Ser·Met·Glu·His·Phe·AΓg·TΓp·Gly■ONHS^-H■Lys·Pro■Val·Gly·Lys·Lys·Arg·AΓg·R'

(XXI)

OBu¹

- (XXII)

BOC

BOC BOC

BOC — /3-Ala · Tyr · Ser ■ Met ■ GIu · His · Phe ■ Arg · Trp · GIy · Lys · Pro · VaI · GIy · Lys · Lys ■ Arg · Arg · R'

(XXIII)

(i) saure Hydrolyse (ii) Chromatographie an CMC

H — /J-AIa · Tyr · Ser · Met · GIu · His · Phe · Arg · Trp · GIy · Lys · Pro · VaI · GIy · Lys · Lys · Arg · Arg · R' (XXIV)

In obigem Schema werden folgende Abkürzungen verwendet:

CMC = Carboxymethylcellulose,

DCCI = N^'-Dicyclohexylcarbodiimid,

NHS = N-Hydroxysuccinimid,

BOC = tert.-Butyloxycarbonyl,

OBu' = tert.-Butylester,

R' = NH₂,

Z = Benzyloxycarbonyl,

ONP = p-Nitrophenylester.

Wie aus obigem Syntheseschema hervorgeht, kann das typische N-terminale Dekapeptid der Formel XX tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosyl - serylmethionyl - γ - tert. - butyl - glutamyl - histidyl - phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin, das eine neue Verbindung darstellt und als Zwischenprodukt für die Herstellung des Octadekapeptids der Erfindung ist, hergestellt werden, indem tert.-Butyloxycarbonyl-0-alanyl-tyrosyl-seryl-methionin-hydrazid PCI) mit γ - tert. - Butyl - glutamyl - histidyl - phenylalanylarginyl-tryptophyl-glycin PCIX) nach dem Azidverfahren umgesetzt wird. Das Tetrapeptidhydrazid tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosyl - serylmethionin-hydrazid PCI) ist ebenfalls eine neue Verbindung und als Zwischenprodukt bei der Herstellung des Octadekapeptids der Erfindung wertvoll. Es kann hergestellt werden, indem die tert-Butyloxycarbonylgruppe mit Hilfe eines Agens, das die tert.-Butyloxycarbonylgruppe einführt, wie tert-Butylaadformiat, tert.-Butyl-p-nitrophenylcarbonat oder Chlorameisensäure-tert.-butylester, in 0-Alanin eingeführt wird, das erhaltene tert-Butyloxycarbonyl-jS-alanin (V) mit Tyrosinmethylester kondensiert wird, der erhaltene Dipeptidmethylester (VI) mit Hydrazinhydrat in das entsprechende Hydrazid (VIII) übergeführt wird, das tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosin - hydrazid nach dem Azidverfahren mit Seryl-methionin-methylester (DC) umgesetzt und der Tetrapeptidester (X) mit Hydrazinhydrat in das entsprechende Hydrazid PCI) übergeführt wird. Das entsprechende tert.-Butyloxycarbonyl-^-alanyl-tyrosyl-serylmethionin kann auf ähnliche Weise, wie oben beschrieben, erhalten werden.

Das Hexapeptid y-tert-Butyl-glutamyl-histidylphenyJalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin PCDC) ist in Bull. Chem. Soc. Japan., 38, 1148 (1965) beschrieben. Dieses Hexapeptid kann nach einem verbesserten Verfahren synthetisiert werden, was in hohem Maße zur Steigerung der Ausbeute und des Reinheitsgrades bei der Herstellung des Octadekapeptids beiträgt. Das verbesserte Verfahren zur Herstellung des Hexapeptids PCDC) umfaßt die Verwendung von Ameisensäure zur Entfernung der tert-Butyloxycarbonylgruppe von den geschützten Tryptophanpeptiden ohne Zersetzung von Tryptophan und die Verwendung von Fluorwasserstoff zur Entfernung der Nitrogruppe vom Nitroargininrest ohne Beeinträchtigung des säurelabilen Tryptophanrestes. Es ist bekannt, daß in saurem Medium tryptophanhaltige Peptide oft nur in sehr geringer Ausbeute erhalten werden, was auf die Bildung von Nebenprodukten zurückzuführen ist; vgl. HeIv. Chim. Acta, 41, 1867 (1958). und J. Am. Chem. Soc, 82, 2062 (1960). Es ist ebenfalls bekannt, daß die Reduktion eines Nitroargininrestes in einer Peptidkette häufig eine lange Hydrierungszeit erfordert — vgl. Can. J. Chem., 38, 1946 (1960) — und daß die katalytische Reduktion häufig auf der Stufe von Aminoguanidin stehenbleibt; vgl. HeIv. Chim.

Acta, 44, 2042 (1961). Bei der Herstellung des Hexapeptids PCDC) mit den genannten Aminosäureresten gelangt man zu einer hohen Ausbeute ohne Nebenreaktionen, wenn man das verbesserte Verfahren anwendet Das Hexapeptid (XDC) wird dadurch hergestellt, daü man die tert-Butyloxycarbonylgruppe de! N" - tert. - Butyloxycarbonyl - N^G - nitroarginyl - trypto phyl-glycin-methylesters PQI) mit Ameisensäure ab spaltet, das erhaltene Tripeptid PQII) mit tert-Butyl oxycarbonyl-phenylalanin nach dem Dicyclohexyl

*>s carbodiimidverfahren kondensiert, die tert-Butyloxy carbonylgruppe aus dem entstandenen Tetrapeptii tert. - Butyloxycarbonyl - phenylalanyl - N^G - nitro arginyl-tryptophyl-glycin-methylester PQV) mit Ame!

sensäure abspaltet, das entstandene Tetrapeptid (XV) mit N^a,N'^m - Dibenzyloxycarbonyl - histidin - ρ - nitrophenylester zum entsprechenden Pentapeptid N",N'^m - Dibenzyloxycarbonyl - histidyl - phenylalanyl-N^G-nitro-arginyl-tryptophyl-glycin-methylester (XVI) umsetzt, diesen verseift, dann mit Fluorwasserstoff behandelt und hierauf das erhaltene Pentapeptid (XVII) mit N'-Benzyloxycarbonyl-y-tert.-butyl-glutaminsäure-p-nitrophenylester kondensiert, und das entstandene N" - Benzyloxycarbonyl - γ - tert. - butylglutamyl - histidyl - phenylalanyl - arginyl - tryptophylglycin (XVIII) hydriert.

Bei der vorstehend geschilderten Reaktion wird die Abspaltung der tert.-Butyloxycarbonylgruppe mit Ameisensäure während etwa 2 bis 4 Stunden bei Temperaturen von etwa 20 bis 60° C unter Verwendung von etwa der 5- bis 1 Sfachen Gewichtsmenge Ameisensäure, bezogen auf das tert-Butyloxycarbonylpeptid, durchgeführt. Die Nitrogruppe wird durch Lösen des Nitroarginylpeptids in Fluorwasserstoff (etwa der 5- bis lOfachen Gewichtsmenge des Peptids) und 30-bis 60minutiges Stehenlassen der Lösung bei Temperaturen von etwa 0 bis 25° C entfernt.

Das typische C-terminale Octapeptid der allgemeinen Formel

N'-tert.-Butyloxycarbonyl-lysyl-prolyl-valyl-

glycyl-N'-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-N*-

tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y,

in der Y ein Argininamidrest ist, kann nach dem in Bull. Chem. Soc. Japan., 39, 882 (1966), beschriebenen Verfahren hergestellt werden. So kann das Octadekapeptid dadurch hergestellt werden, daß man tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosyl - serylmethionyl -γ- tert. - butyl - glutamyl - histidyl - phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin mit N^e-tert.-Butyloxycarbonyl - lysyl - prolyl - valyl - glycyl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl - lysyl - N^£ - tert. - butyloxycarbonyl - lysylarginyl-Y, in dem Y die oben angegebene Bedeutung hat, nach dem Dicyclohexylcarbodiimidverfahren, dem N-Hydroxysuccinimidesterverfahren oder einer Kombination dieser Verfahren während 2 bis 96 Stunden bei Temperaturen von — 20 bis 50° C umsetzt und alle Schutzgruppen aus dem erhaltenen geschützten Octadekapeptid tert. - Butyloxycarbonyl - ß- alanyl - tyrosylseryl - methionyl -γ- tert. - butyl - glutamyl - histidylphenylalanyl-arginyl-iryptophyl-glycyl-N'-tert.-butyloxycarbop yl - prolyl - valyl - glycyl - Ν^ε - tert. - butyloxycarbonyl - lysyl - lysyl - N^E - tert. - butyloxycarbonyllysyl-arginyl-Y, in dem Y die oben angegebene Bedeutung hat, in einem sauren Medium, wie einem Halogenwasserstoff, einer Halogenwasserstoffsäure, Trifluoressigsäure, Ameisensäure, Essigsäure oder einem Gemisch derselben bei Temperaturen von etwa -10 bis 40⁰C in einer Reaktionszeit von 10 bis 90 Minuten entfernt.

Nach einem anderen Verfahren kann das Ocladekapeptid durch Kondensation des Tetrapeptide tert. - Butyloxycarbonyl - β - alanyl - tyrosyl - serylmethionin mit einem Tetradekapeptid der allgemeinen Formel γ - tert. - Butyl - glutamyl(oder glutaminyl)-histidyl - phenyl - alanyl - arginyl - tryptophyl - glycyl-N¹ - tert. - butyloxycarbonyl - lysyl - prolyl - valylglycyl-NMert-butyloxycarbonyl-rysyl-NMert-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y, in der Y die oben angegebene Bedeutung hat, in bekannter Weise hergestellt werden.

Ebenso erhält man das Octadekapeptid der Erfindung, indem man tert-Butyloxycarbonyl-jS-alanyltyrosyl - seryl - methionyl -γ- tert. - butyl - glutamylhistidyl - phenylalanyl - arginyl - tryptophyl - glycyl-N^E - tert. - butyloxycarbonyl -lysyl -prolyl - valyl -glycin mit N^£-tert.-Butyloxycarbonyl-lysyl-N^e-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-arginyl-Y, in dem Y die oben angegebene Bedeutung hat, in bekannter Weise kondensiert.

ίο Alle bei diesen Verfahren verwendeten Schutzgruppen können durch katalytische Reduktion, Reduktion mit Natrium in flüssigem Ammoniak, Hydrolyse oder Behandlung mit einem sauren Medium, wie Trifluoressigsäure, Essigsäure, Ameisensäure, einem Halogenwasserstoff, z. B. Fluorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Chlorwasserstoff, einer Halogenwasserstoffsäure, z. B. Fluorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure oder Chlorwasserstoffsäure, oder ein Gemisch dieser Verbindungen, entfernt werden.

Das nach den vorstehenden Verfahren hergestellte Octadekapeptid kann nach bekannten Verfahren, wie Säulenchromatographie mit Ionenaustauscherharzen, Ionenaustauschercellulose oder Sephadexionenaustauscher oder Gegenstromverteilungsverfah-

ren gereinigt werden.

Je nach den verwendeten Reaktionsbedingungen erhält man das Octadekapeptid der Erfindung in Form der freien Base oder seines Salzes mit einer Säure. Diese Salze können hergestellt werden, indem man das Octadekapeptid mit einer anorganischen Säure, wie einer Halogenwasserstoffsäure, z. B. Fluorwasserstoffsäure, Bromwasserstoffsäure oder Chlorwasserstoffsäure, einem Halogenwasserstoff, z. B. Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff oder Fluorwasserstoff, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, oder mit einer organischen Säure, wie Essigsäure, Ameisensäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure, Oxalsäure, Malonsäure, Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Citronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure, Methansulfonsäure, Benzolsulfonsäure oder Toloulsulfonsäure in bekannter Weise umsetzt.

Das Octadekapeptid zeigt ausgeprägte biologische Aktivität, z. B. eine stimulierende Wirkung auf die

Nebennierenrinde, lipolytische und melanozytenstimulierende Wirkung, die höher ist, als die von natürlichem Corticotropin und von verwandten, bekannten Peptiden.
Das Octadekapeptid der Erfindung ist deshalb

besonders bei der Behandlung von akutem und chronischem Gelenkrheumatismus und allergischen Krankheiten verschiedener Organe von Tieren und Menschen wertvoll. Verschiedene pharmakologische Eigenschaften des Octadekapeptids sowie dessen biologische

Daten sind nachstehend angegeben.

Die corticotrope Aktivität des Octadekapeptids der Erfindung wurde nach fünf verschiedenen Verfahren bestimmt, wobei als Vergleichssubstanzen native Schafcarticotropin (O₅-ACTH), ACTH(I-18>NH₂ unt

GIy^ACTH(I-IS)-NH₂ dienten. Die ascorbinsäure entziehende Aktivität der Nebennierenrinde von hypo physenektomierten Ratten wurde nach dem in Unit« States Pharmacopeia XVII, 147 {1965), beschriebener Verfahren bestimmt. Die in vitro-steroidbildend< Aktivität wurde nach dem Verfahren von Saffrai und S c h a 11 y (EndocrinoL, 56,523 [1955]) bestimml Die in vivo-steroidbildende Aktivität bei intravenöse Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten wur

ie nach dem Verfahren von L i ρ s c ο m b und Sf eis ο η (Endocrinol., 71, 13 [1962]) mit einer Kleineren Modifikation (A. Tanaka und C. H. Li, Endocrinol. Japonica, 13, 180 [1966]) bestimmt. Die in vivo-steroidbildende Aktivität wurde auch an der mit Dexamethason-Pentobarbital betäubten Maus bestimmt (A. T a η a k a und N. Nakamura, »Integrative mechanism of neuroendocrine system«, Hokkaido University Medical Library Series, Vol. 1, 49 [1968]), Zusätzlich wurde die steroidbildende Aktivität bei intramuskulärer Verabreichung an hypophysenektomierte Ratten bestimmt, wobei ein Präparat von 0,05 ml/Ratte in den Rattenschenkelmuskel injiziert wurde und 30 Minuten nach der Injektion eine Blutprobe aus der abdominalen Aorta entnommen wurde.

Während des ganzen Experimentes wurde der »Third USP Corticotropin Reference Standard« als Standard verwendet und die Bildung von 11-Hydroxycarticosteroiden (11-OHCS) nach dem fluoreometrischen Verfahren von Peterson (J. Biol. Chem., 225, 25 [1957]) bestimmt. Bei jedem Bestimmungsverfahren wurden üblicherweise mehrere Messungen durchgeführt, und die unabhängig voneinander erhaltenen Werte wurden nach dem statistischen Verfahren von Sheps und Moore ausgewertet (J. Pharmacol. Extl. Therap., 128, 99 [I960]). Die Ergebnisse dieser Bestimmungen mit dem Octadekapeptid der Erfindung werden im folgenden mit den Ergebnissen von bekannten Corticotropinpeptiden und von natürlichem Corticotropin verglichen.

Tabelle I
Adrenocorticotrope Aktivitäten von Schafcorticotropin und verwandten, synthetischen Octadekapeptiden

Verfahren

Verabreichungsart

Peptid

la

Ib

α,-ACTH

Adrenale ascorbinsäureentziehende Wirkung

In vitro-Steroidgenese

In vivo-Steroidgenese

In vivo-Steroidgenese bei
mit Dexamethason-Nembutal betäubter Maus

subkutan

in vitro

intravenös

intravenös 45,4
13,7
92,0

peripherem Blut von hypophysenektomierter Ratte

25,6
20,8
167

70 bis 168

35,4

135

237

125 bis 285

259

124

120

120

100 bis 180

intramuskulär

Anmerkung: Die Aktivitäten werden ausgedrückt in USP-Einheiten/mg, in bezug auf den »Third USP Corticotropin Reference Standard«. Die Abkürzungen bedeuten: I a = ACTHU-IS)-NH₂₁Ib = Gly¹ — ACTH(1-18)—NH₂.1 = 1/-AIa¹)- ACTH(1-18)—NH₂, α, = natives Schafcorticotropin.

Wie aus Tabelle I hervorgeht, hat das Octadekapeptid I der Erfindung in jeder Beziehung eine hohe nebennierenstimulierende Aktivität. Die in vivosteroidbildende Aktratät von Peptid I liegt bei intravenöser Verabreichung in der gleichen Größenordnung wie Ia und Ib und a_s-ACTH. Jedoch weist das Peptid I eine auffallend höhere Aktivität als I a und Ib auf, wenn sie durch die in vitro-Steroidgenese und den adrenalen Ascorbinsäureentzug bestimmt wird. Außerdem ist es bemerkenswert, daß das Verhältnis von subkutaner Verabreichung oder bei in vitro-Bestimmung zur intravenösen Verabreichung für das Peptid I den Wert 1:0,5 ist, während die Verhältnisse für die Peptide Ia und I b den Wert 1:7 bzw. 1:8 haben. Peptid I gleicht in dieser Hinsicht mehr als Ia und Ib dem nativen Hormon (a_s-ACTH), welches das Verhältnis 1:1 aufweist

Fig. 1 zeigt, daß (/S-Ala^ACTHil-lSJ-NHi (I) länger aktiv bleibt als Ον-Α^ΤΗίΙ-ΙδνΝΗΐ (Ib) und natürliches ACTH, wenn die Peptide I und Ib in einer Dosis von 5 μ§^8Με (1 mg Peptid/ml) und natürliches ACTH (125 Millieinheiten) intramuskulär in den Schenkelmuskel von hypophysenektomierten Ratten injiziert werden, wobei die steroidbildende Aktivität durch den 11-Hydroxycorticosteroid-(11-OHCS)-Spiegel im Plasma ausgedrückt wird.

Das Octadekapeptid 09-AIaM-ACTH(I-IS)-NH₂ (I) weist eine ausgeprägt hohe lipolytische Aktivität auf, die in Tabelle II mit den Aktivitäten von synthetischen Peptiden verglichen wird: ACTH(1-18)-NH₂ (Ia). Giy-ACTHtl-lSVNHz (Ib) und Schafcorticotropin (α,-ACTH).

Tabelle II

In vitro-lipolytische Aktivität von natürlichem

Corticotropin und verwandten synthetischen

Octadekapeptiden

	Minimale wirksame Dosis	la	h mg/50 mg Gewebe)	1	«.-ACTH
	(10		Ib
	3,0		0,62	6,0
Adipöses		6,3
Rattengewebe....	0,004		0,065	7,1
Adipöses		0,35
Kaninchengewebe
Verhältnis	750		10	1
Ratte/Kaninchen	20
(annähernd)

Anmerkung: Die lipolytische Aktivität wurde nach dem von T a η a k a et al beschriebenen Verfahren (Arch. Biochem. Biophys., 99, 294 [1962]) mit Rattenepididymal- und Kaninchenperircnalfcttgewebe bestimmt. Das Ansteigen der Konzentration von freien Fettsäuren im Medium und im Gewebe dient als Parameter. Die Aktivität wird ausgedrückt durch die minimale wirksame Dosis pro 50 mg Gewebe.

Wie aus Tabelle II hervorgeht, ist die lipolytische Aktivität des Octadekapeptids I der Erfindung ungefähr lOmal größer als die von la, Ib und O₁-ACTH, wenn sie an der Ratte bestimmt wird. Im Vergleich zur Ratte kann beim Kaninchen eine geringere Menge von Peptid I die gleiche Aktivität ausüben. Dasselbe Verhältnis wird bei den anderen Peptiden Ia und Ib beobachtet. Es ist jedoch festzustellen, daß das Ver-

aältnis der minimalen wirksamen Dosis beim Fettgewebe der Ratte zur Dosis beim Fettgewebe des Kaninchens für das Peptid I kleiner ist als für Ib und Ia. Dies bedeutet, daß das Peptid I der Erfin ""ung dem natürlichen Hormon verwandter ist als die Peptide Ia und Ib.

Die Fig. 2 und 3 geben die Inaktivierung von Peptid I und Ib als lipolytische Mittel in frischem Plasma und in Puffer, der Bruchstücke von Rattenmuskulator enthält, wieder. Dabei wurde im Fall von Plasma kein signifikanter Unterschied zwischen Peptid I und Ib festgestellt, während im Gewebe die Inaktivierung von Peptid I gegenüber der von Ib merklich verzögert war. Die Inaktivierung der lipolytischen Aktivität durch Plasma und durch Gewebe wurde auf folgende Weise durchgeführt Eine Peptidprobe wurde in frischem Plasma von betäubten Ratten oder in Krebs-Ringer-Bicarbonatpuffer gelöst, der Rinderserumalbumin, Bruchstücke von Rattenschenkelmuskulatur und Glucose enthielt. Das Gemisch

wurde dann bei 37° C inkubiert und dk liporytische Aktivität nach dem oben angegebenen Verfahren nach Inkubationszeiten von 0,5, 1, 2 und 4 Stunden bestimmt ,

Die biologische Halbwertszeit von {ß-AWy ACTH(1-18)-NH₂ α), das intravenös hypopbysenektomierten Ratten mit einem Gewicht von 200 bis 250 g injiziert worden war, wurde bestimmt Zu verschiedenen Zeiten nach der Injektion wurden Blutproben aus der abdominalen Aorta entnommen. Das abgetrennte Plasma wurde auf einen pH-Wert von 4 bis 5 mit 1 η-Salzsäure eingestellt, und als Parameter für die verbleibende biologische Aktivität im Plasma wurde die in vitro-lipolytische Aktivität unter Verwendung von epidymalem Rattenfettgewebe, wie oben erwähnt, bestimmt. Die Ergebnisse sind im Vergleich zu den lipolytischen Aktivitäten von natürlichem Corticotropin (ACTH) und GV-ACTH(IIS) NH₂ (Ib) in folgender Tabelle wiedergegeben.

Tabelle III

In vitro-lipolytische Aktivität von (/3-AIa¹VACTH(I-IS)-NH₂, Gly^l-ACTH(1-18)-NH₂
und natürlichem Corticotropin (intravenöse Injektion)

Zeit nach	natürl. ACTH	(100%)	Erzeugung von freien	Fettsäuren, μ Aq'100 mg	(39%)	0,179	±	I	(100%)
Injektion,	0,129 ± 0,028	(83%)			(53%)	2,148	±	0,076	(49%)
Minuten	3,082 ± 0,447	(77%)		Ib	(24%)	1,140	±	0,228	(29%)
0	2,587 ± 0,556	(77%)		0,016	(5%)	0,751	±	0,099	(32%)
0,5	2,409 ± 0,337	(33%)			(5%)	0,815	±	0,053	(13%)
1	2,396 ± 0,364				(6%)	0,431	±	0,090	(16%)
2	1,108 ± 0,180	(9%)				0,487	±	0,079	(17%)
4	—	(3%)		0,236 (100%)		0,512	±	0,180
8	0,380 ± 0,056		0,139				0,055
12	0,212 ± 0,028		0,239				—
16			0,113
32		0,087
		0,063
		0,079
	0,094 ±	—
	3,004 ±
1,217 ±
1,622 ±
0,777 ±
0,243 ±
0,252 ±
0,263 ±

Anmerkung: Die Zahlen in Klammern sind die relativen Aktivitäten in bezug auf den 0,5-Minuten-Wert für jedes Hormon.

Aus den oben angegebenen Werten wurde die Halbwertszeit von natürlichem ACTH, Ib und 1 der lipolytischen Aktivität zu 266 Sekunden, 117 Sekunden bzw. 188 Sekunden bestimmt. Eine Darstellung der lipolytischen Aktivität dieser Peptide ist in Fi g. 4 gegeben. Es ist ersichtlich, daß (/3-Ala')-ACTH(l-18)-NH₂ (I) im Plasma signifikant länger als Gly^l-ACTH(1-18)-NH₂ (Ib) beständig ist.

In ähnlicher Weise wurde die biologische Halbwertszeit von I bei intramuskulärer Injektion an hypophysen- ektomierten Ratten gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV und in F i g. 5 wiedergegeben.

	IV	und (0-AIaM-ACTH(I-IS)-NH2 (I)	± 0,032	(48,5%)	bei intramuskulärer	Injektion	Ib	(57,7%)	0,193	±	1	100%)
			± 0,540	(93,9%)	Erzeugung von freien Fettsäuren, μ Aq 100 mg	± 0,033	100%)			0,060	(54,9%)
			•fc 0,356	100%)		—	(50,9%)			—	(97,9%)
			± 0,392	(68,6%)		± 0,322	(56.2%)	3,630	±	—	(92,8%)
			± 0,320	(56,7%)		± 0,229	(64.5%)	2,080	±	0,631	(49,0%)
Tabelle			±.0.396	(22,2%)		dt 0,235	(45,0%)	3,558	±	0,285
Lipolytische Aktivität von natürlichem Corticotropin (ACTH), Gly'-ACTH(1-18)-NH2 (Ib)		± 0,302	(6,6%)		dt 0.429		3,382	±	0.407
	natürl. ACTH	± 0,056		± 0.098		1,876	±	0,542
Zeit nach	0,097			± 0,121			0,337
Injektion.	0,922
Minuten	1,693
0	1,797
2	1,264
5	1,061
10	0,474	0,033
20	0.209
30	1,772
60	3,047
90	1.568
1,727
1,977
1,390

Anmerkung: Die Zahlen in Klammern geben die relative lipolytische Aktivität in bezug auf den 10-Minuten-Werl nach der Injektion für jedes Hormon wieder.

Die Halbwertszeit von ACTH, Ib und I wurde zu 1389,4516 bzw. 4516 Sekunden bestimmt. Es ist festzustellen, daß die Halbwertszeit des Octadekapeplids 1 der Erfindung ungefähr dreimal so lang ist, wie die von natürlichem Corticotropin, vie aus F i g. 5 hervorgeht.

DieAngreilbakitOSAl^ACTHillSJNHil)

durch Schweinenieren-Leucinaminopeptidase (LAP) wurde mit der von ACTH(1-18)-NH₂ (Ia) und GIy₇ACTH(I-Ie)-NH₂ (I b) verglichen.

Fig. 6 zeigt die Wirkung von mit Diisopropylfluorphosphat (DFP)-behandelter Aminopeptidase auf die Peptide I, Ia und Ib. Aus F i g. 6 geht hervor, daß das Octadekapeptid I der Erfindung über einen längeren Zeitraum hinweg als die bekannten Peptide Ia und Ib ohne eine rasche Inaktivierung durch einen Angriff der Aminopeptidase im Gewebe beständig bleibt, weswegen das Peptid I für therapeutische Zwecke sehr wertvoll ist. Die Untersuchungen der Angreifbarkeit der synthetischen Peptide werden im folgenden näher beschrieben.

Es war in Vorversuchen festgestellt worden, daß sin Präparat von handelsüblicher LAP (0-AIa¹)-ACTH(I-IO)-OH, das aus dem entsprechenden geschützten Dekapeptid tert.-Butyloxycarbonal-0-alanyltyrosyl - seryl - methionyl - γ - tert. - butyl - glutamylhistidyl - pheny lalanyl - arginyl - try ptophyl - glycin (X VI) durch Behandlung mit Ameisensäure hergestellt wurde, und (0-AIa¹J-ACTH(I-IS)-NH₂ (I). aber nicht 0-Alanyl-tyrosyl-scryl-methioninhydrazid, das aus tert. - Butyloxycarbonyl - 0 - alanyl - tyrosyl - serylmethionin-hydrazid (Vll)durch Behandlung mit Ameisensäure hergestellt wurde, hydrolytisch spaltet. Durch einen Amiriosäureanalysator wurde in den enzymatischen Spaltprodukten kein /!-Alanin entdeckt. Deshalb muß die beobachtete Hydrolyse auf die Gegenwart einer Endopeptidasenverunreinigung in der LAP-Präparation zurückzuführen sein. Diese scheinbare Empfindlichkeit von 0-Alanylpeptiden gegenüber dem LAP-Präparat verschwand vollständig, wenn das Enzympräparat vorher mit Diisopropylfluorphosphat (DFP) behandelt worden war. Durch die DFP-behandelte LAP wurde das Ser¹ -Peptid (la) schneller als das Gly^Peptid (Ib) hydrolysiert, während am 0-Ala¹ -Peptid (I) innerhalb der Meßgenauigkeit keine Hydrolyse beobachtet wurde.

Die DFP-behandelte LAP wurde dadurch erhalten, daß man eine Suspension des Enzyms in zu 75% gesättigter Ammoniumsulfatlösung bei 4 C gegen eine 0,005-m Magnesiumchloridlösung dialysierte, die 5 mg Enzym enthaltende LAP-Suspension mit 0,0005-m Tris-Puffer auf das fünffache verdünnte, die verdünnte Enzymlösung mit 0,08 ml 1-m Diisopropylfluorphosphat in Isopropanol versetzte, das Gemisch 45 Minuten bei 37 C inkubierte und dann das Gemisch bei 4 C gegen 0,0005-m Tris-Puffer dialysierte.

Die LAP-Aktivitäl der Enzymlösung wurde bei einem pH-Wert von 8,3 und 25 C gemäß T u ρ ρ y et al (Z. Physiol. Chem. 329, 278 [1962]) mit einigen Modifikationen unter Verwendung von L-Leucinp-nitroanilid iLNA) als Substrat bestimmt. Eine LAP-Einheit wurde vorläufig als die Enzymmenge definiert, die bei 400 πΐμ gegenüber einer Leercuvelte einen Extinktionszuwachs von 0,001 pro Minute erzeugt. Es wurden 1-cm-Cuvetten in einem Hitachi-Spektrophotometer verwendet.

Für die Messungen der Spaltung des synthetischen Substrates durch LAP wurde ein Gemisch aus 1 Teil O.lmillimolarer Lösung des Substrates in Wasser, 1 Teü 0,05-m Tris-Puffer vom pH-Wert 8,3 und einem halben Teil Enzym (4,88 Einheiten/ml LNA als Substrat) bei 37° C inkubiert. Aus dem inkubierten Gemisch wurden 0,5 ml Proben entnommen und sofort mit jeweils 0,5 ml Ninhydrin-Reagens vermischt. Das Gemisch wurde dann im kochenden Wasserbad 15 Minuten lang erhitzt. Nach dem Abkühlen und geeigneter Verdünnung mit 50%igem Äthanol wurde die Absorption bei 570 πΐμ mit einem Hitachi-Spektro-

photometer gemessen. Bei jeder Durchführung des Versuchs wurden zur Kontrolle Inkubationsgemische ohne Substrat oder ohne Enzym bestimmt. Bei der Ninhydrinreaktion wurde auch eine Standardlösung von L-Leucin jeweils als Bezug getestet. Die Ergebnisse

is der enzymatischen Spaltung der Peptide I, Ia und Ib durch DFP-behandelte LAP sind in F i g. 6 wiedergegeben, wobei die Aminosäurefreisetzung als Leucinkonzentration angegeben ist.

Die Bestimmung der in vitro-melanozytenstimulierendenAktivitätVOnOi-AIa¹VACTH(I-IS)-NH₂wurde nach einem von K. Shizume,A. B. Lerner und T. B. Fitzpatrick (Endocrinol., 54, 553 [1954]) angegebenen Verfahren unter Verwendung von Rana pipiens als Versuchstier durchgeführt, wobei mit den

is Aktivitäten von GV-ACTH(I-Ie)-NH₂ und ACTH(I-24)-OH (Synacthen®, Ciba Co.,) verglichen wurde. Als Bezugswert wurde natürliches reines a-melanozytenstimulierendes Hormon (a-MSH) verwendet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V wieder-

}o gegeben.

Tabelle V

In vitro-melanozytenstimulierende Aktivität von

(/J-AIaM-ACTH(I-IS)-NH₂, GI^ACTHS)NH

und ACTH(l-24)-OH

Verbindung

(/J-AIa¹ )-ACTH(l-18)-NH₂
Gl^-ACTH(I-IS)-NH₂...
ACTH(l-24)-OH

MSH-Aktivitäl. Einheiten/g

9,6
6,7

2,1

10"
10⁸
10⁸

Die melanozytenstimulierende Aktivität von (0-AIaM-ACTH(I-Ie)-NH₂ ist auffallend höher als die von GV-ACTH(I-IS)-NH₂ und ACTH(l-24)-OH. Da natürliches Schweinecorticotropin nach R. G. S h «* ρ h e r d et al, (J. Am. Chem. Soc, 78,5051 [1956]) eine melanozytenstimulierende Aktivität von 1,7-10⁸ Einheiten/g aufweist, ist die melanozytenstimulierende Aktivität von (0-AIaM-ACTH(I-18)-NH₂ der Erfindung ungefähr 50mal so groß wie die von natürlichem Schweinecorticotropin.

Das Octadekapeptid der Erfindung kann in die entsprechenden Schwermetallkomplexe, z. B. mit Zinkchlorid, Zinkhydroxid, Zinkacetat, Zinksulfat, Kupferchlorid, Nickelchlorid, Kobaltchlorid oder Eisenchlorid, in Komplexe mit Polyaminosäuren, ζ. Β. Poly-L-glutaminsäure, Poly-D-glutaminsäure, PoIy-DL-glutaminsäure, Poly-L-asparaginsäure, PoIy-D-asparaginsäure, Poly-DL-asparaginsäure oder Copoly-L-glutamyl-Tyrosin oder in gemischte Komplexe übergeführt werden, die eine länger anhaltende Aktivität im Blut als das freie Octadekapeptid zeigen. Wenn z. B. ein Zinkkomplex von (0-Ala¹ )-ACTH(1-18)-NH₂, der aus 0,5 mg Peptid, 0,25 ml

ΛΛ

einer 40millimolaren Zinkchloridlösung, 4,5 mg Natriumchlorid und 0,25 ml einer 40miliimolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung besteht durch intramuskuläre Injektion an Ratten in einer Dosis von 5 μΙ/Ratte verabreicht wurde, betrug die Menge an ll-Hydroxycorticosteroid im Plasma 2 Stunden nach der Injektion 80 μg/ml, während im Fall einer Präparation ohne Zinkchlorid nur 6 μg/ml Corticosteroid gefunden wurden. Deshalb ist es vorteilhaft, diese Komplexe für therapeutische Zwecke zu verwenden. Man erhält diese Komplexe, indem man das Octadekapeptid mit einer Schwermetallverbindung oder einer Polyaminosäure oder einem Gemisch derselben in einem Gewichtsverhältnis von etwa 1:0,1 bis 20 unter schwach sauren Bedingungen, insbesondere bei einem pH-Wert von 6,5 bis 7,0, behandelt. Bei der Behandlung von Polyaminosäuren beträgt da? bevorzugte Molekulargewicht der Polyaminosäuren etwa 1000 bis 100000, insbesondere 2000 bis 6000. Bei der Herstellung der Komplexe können gegebenenfalls geeignete Träger, Konservierungsmittel, Puffer, Stabilisatoren und isotonisierende Verbindungen zugesetzt werden.

Das Octadekapeptid der Erfindung, seine Salze mit Säuren und Komplexe kann oral oder parenteral in üblichen Darreichungsformen verabreicht werden, z. B. als Injektionspräparate, Flüssigkeiten, Suspensionen, Emulsionen, Aerosole oder Tabletten, im Gemisch mit Trägern, Stabilisatoren, Emulgatoren, Konservierungsmitteln, Puffern, isotonisierenden Verbindungen und/oder Netzmitteln.

Die wirksame Dosis kann von Ärzten leicht unter Zugrundelegung der hier angegebenen Werte bestimmt werden. Zum Beispiel beträgt eine typische klinische Dosis des Octadekapeptids der Erfindung ungefähr 0,2 bis 0,8 Einheiten/kg für eine normale erwachsene Person. Das Octadekapeptid der Erfindung wird vorzugsweise in Form eines Injektionspräparates verabreicht.

Die Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen verhalten sich Gewichtsteile zu Volumteilen wie Gramm zu Millimeter.

Beispiel 1

Herstellung von

N^a-tert.-Butyloxycarbonyl-/i-alanyl-tyrosylseryl-methionin-hydrazid (Xl)

1. N'-tert.-Butyloxycarbonal-^-alanin' (V)

8,91g ^-Alanin werden in 100 ml 1 n-Natriumhydroxydlösung gelöst. Die Lösung wird mit 21 g Natriumhydrogencarbonat und 70 g Dioxan versetzt. Die Lösung wird bei 50° C gerührt, und eine Lösung von 17,2 g Azidameisensäure-tert.-butylester in 30 ml Dioxan wird tropfenweise zugesetzt. Das Gemisch wird 41,5 Stunden bei der gleichen Temperatur gerührt und hierauf unter vermindertem Druck auf etwa 100 ml eingedampft. Die konzentrierte Lösung wird mit Eis gekühlt und mit 180 ml 4 η-Salzsäure auf pH 2 eingestellt. Die Lösung wird mil ungefähr 100 ml eiskaltem Essigsäureäthylester ausgeschüttelt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und unter vermindertem Druck bis zu einem sirupösen Rückstand eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäureäthylester/Petroläther kristallisiert. Man erhält 12,6 gdes gewünschten Produktes vom F. 77 bis 78' C.

C₈H₁₅NO₄:

Berechnet ... C 50,78, H 7,99, N 7,40; gefunden .... C 50,99, H 8,06, N 7,47.

2. N"-tert-Butyloxycarbonyl-/i-alanyl-

tyrosin-methylester (VI)

3,48 g Tyrosinmethylester-hydrochlorid werden in 15 ml Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 5 ml

to 5ö%iger Kaliumcarbonatlösung unter Eiskühlung versetzt, und das Gemisch wird bei 4° C 40 Minuten stehengelassen. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert, mit kaltem Wasser gewaschen und im Exsikkator getrocknet Man erhält 2,55 g Tyrosinmethylester.

Andererseits werden 1,89 g des oben erhaltenen

N^a-tert-Butyloxycarbonyl-/J-alanins in wasserfreiem

Tetrahydrofuran gelöst Die Lösung wird auf - 10⁰C

; abgekühlt. Diese Lösung wird anschließend langsam

und unter Rühren mit 2,04 g n-tert-Butylamin und . 1,19 g Chlorameisensäureäthylester versetzt. Nach

10 Minuten wird eine Suspension von 1,95 g des oben

erhaltenen Tyrosinmethylesters in 20 ml wasserfreiem

Tetrahydrofuran zugesetzt. Das Gemisch wird 30 Mi-

nuten bei -1O⁰C und 2,5 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Anschließend wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abgedampft. Der erhaltene !Rückstand wird in Essigsäureäthylester gelöst, anschließend mit 1 η-Salzsäure, Wasser, 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck wird der erhaltene Rückstand zur Ausfällung von Kristallen mit Äther versetzt.

Man läßt 20 Stunden stehen, filtriert die gebildeten Kristalle ab und trocknet im Exsikkator. Man erhält 2,99 g des Dipeptidesters. Nach dem Umkristallisieren aus Methanol/Äther erhält man Kristalle vom F. 141 bis 142°C; [a]g = +8,2±0.5° (c = 1,020, Methanol).

C₁₈H₂₀N₂O₆:

Berechnet
gefunden .

C 59,00, H 7,15, N 7,65; C 59.03, H 7,12, N 7,63.

3. N'-tert.-Butyloxycarbonyl -0-alanyl-tyrosinhydrazid (VIII)

2,56 g N^K-tert.-Butyloxycarbonyl-/3-alanyl-tyrosinmethylester (VI) werden in 26 ml wasserfreiem Äthanol gelöst. 1,7 ml Hydrazinhydrat werden der Lösung zugesetzt, und das Gemisch wird 5 Stunden bei Raumtemperatur und 20 Stunden bei 4°C gehalten. Die gebildeten Kristalle werden abfiltriert, mit Äthanol und Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält 2,54 g des gewünschten Dipeptid-hydrazids. Nach dem Umkristallisieren aus heißem Wasser erhält man Kristalle vom F. 213.5 bis 215°C; [α]? = +3,6 ±0,6° (c = 0,978, 50%ige Essigsäure).

C₁₇H₁₆N₄O₅:

Berechnet .
gefunden ..

C 55.72, H 7,15, N 15,29; C 55,74, H 7,11, N 15,30.

4. N^a-tert.-Butyloxycarbonyl-^-alanyl-tyrosylseryl-methionin-methylester (X)

1,10 g N^a-tert.-Butyloxycarbonyl-/3-alanyl-tyrosin hydrazid (VIII) werden in 7,5 ml kalter 1 n-Salzsäun gelöst. Die Lösung wird bei ungefähr — 10⁰C gehaltei

and mit 3,6 ml 2-m kalter Natriumnitritlösung versetzt Man läßt das Gemisch 4 Minuten stehen, schüttelt das entstandene Azid mit Äther aus, wäscht mit 1-m Natriumhydrogencarbonatlösung und trocknet über wasserfreiem Natriumsulfat. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von ungefähr 10⁰C wird der entstandene Rückstand in kaltem Acetonitril gelöst Man gibt 0,756 g Serylmethionin-methylester (EX) zu, der nach den Vorschriften der Literatur: Bull. Chem. Soc. Japan, 39, 1171 (1966), hergestellt wurde, und läßt das Gemisch 48 Stunden stehen. Das Lösungsmittel wird durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt, und der Rückstand wird durch Zugabe von Essigsäureäthylester und portionsweise Zugabe von Wasser gelöst. Die Lösung wird anschließend mit 1-n kalter Sa'zsäure, Wasser, 5%iger Natriumhydrogencarbonatlösung und Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels durch Eindampfen unter vermindertem Druck wird das entstandene gelatinöse Produkt abfiltriert, mit kaltem Essigsäureäthylenester und Äther gewaschen und getrocknet. Man erhält 1,20 g des gewünschten Tetrapeptidmethylesters. Das Produkt wird durch Umfallen aus Essigsäureäthylester gereinigt. F. 121,5 bis 123°C. [α]? = -13,0 ± 0,6° (c = 0,997, Methanol) R_r 0,53 (bei Dünnschichtchromatographie im Lösungsmittelsystem Methanol zu Essigsäure = 15:85).

C₂₆H₄₀N₄O₉S:

Berechnet ... C 52,41, H 6,90, N 9,58, S 5,48; gefunden .... C 52,94, H 6,85, N 9,65, S 5,48.

5. N'-tert.-Butyloxycarbonyl-ß-alanyl-tyrosylseryl-methionin-hydrazid (XI)

0,97 g N'-tert.-Butyloxycarbonyl-jS-alanyl-tyrosylseryl-methionin-methylester (X) werden in 6 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird mit 0,5 ml Hydrazinhydrat versetzt, und das Gemisch wird 43 Stunden bei 4°C stehengelassen. Die Lösung wird mit Essigsäureäthylester versetzt. Es entsteht ein gelatinöses Produkt, das abfiltriert, mit kaltem Essigsäureäthylester gewaschen und getrocknet wird. Man erhält 1,01 g des gewünschten Tetrapeptid-hydrazids. Nach dem Umkristallisieren aus Wasser erhält man Kristalle vom F, 186,5 bis 188^C C; [α] %³ = -20,1 ±0,5° (c = 1,346, 50%iges Methanol).

C₂₅H₄₀O₈N₆S H₂O:

Berechnet ... C 49,82, H 7,02, N 13,94, S 5,32: gefunden .... C 49,72, H 7,05, N 14,50, S 5,15.

Herstellung von

y-tert.-Butyl-glutamyl-histidyl-phenylalanylarginyl-tryptophyl-glycin (XIX)

1. Nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylesterformiat QiUl)

5,77 g tert.-Butyloxycarbonyl-N^G-nitro-arginyltryptophyl-glycin-methylester (XII) werden in 50 ml 98 bis 100%iger Ameisensäure gelöst. Die Lösung wird 3,5 Stunden stehengelassen. Danach wird die Ameisensäure durch Eindampfen bei einer Badtemperatur von 40 bis 45° C entfernt und der Rückstand in Wasser gelöst. Die Lösung wird mit Äther gewaschen und lyophilisiert. Man erhält 4,86 g des gewünschten Produkts vomF. 107bis lll°C;[a]F = + 13,O±O,5° (c = 2,062, Methanol).
Q₀H₂₈N₈O₆ - HCOOH · V₂H₂O:

Berechnet ... C 47,45, H 5,88, N 21,08; gefunden .... C 47,25, H 6,03, N 20,90. 2. tert-Butyloxycarbonyl-phenylalanyl-N^G-nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylester (XTV)

ίο Diese Verbindung wird genau nach den Angaben der Literatur: Bull. Chem. Soc. Japan., 38, 1148 (1965), synthetisiert, mit der Ausnahme, daß das oben erhaltene Tripeptidesterformiat an Stelle des Trifluoracetats verwendet wird. Man erhält 4,06 g der

!5 gewünschten Verbindung, indem man 4,81 gN°-Nitroarginyl-tryptophyl-glycin-methylester-formiat mit 4,42 g tert-Butyloxycarbonyl-phenylalanin-dicyclohexyl-aminsalz in Acetonitril nach dem Dicyclohexylcarbodiimidverfahren umsetzt Man erhält ein

Produkt vom F. 176 bis 177°C; [aj? = -20,4 ±2° (c = 2, Methanol).

C₃₄H₄₅N₉O₉:

Berechnet ... C 56,42, H 6,27, N 17,42; gefunden .... C 56,34, H 6,22, N 17,58.

3. Phenylalanyl-N^G-nitro-arginyl-tryptophyl-

glycin-methylester-formiat (XV) 1,81 g tert.-Butyloxycarbonyl-phenylalanyl-N^G-nitro-arginyl-tryptophyl-glycin-methylester (XIV) werden in 18 ml Ameisensäure gelöst. Die Lösung wird 3,5 Stunden bei Raumtemperatur gehalten. Nach dem Entfernen der Ameisensäure wird der Rückstand aus n-Butanol kristallisiert. Das kristalline Produkt wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Man erhält 1,71 g vom F. 124 bis 125,5°C; [α]? = -9,0 ±0,5° (c = 0,977, Methanol).

C₂₉H₃₇N₉O₇ ■ HCOOH ■ V₂H₂O: Berechnet ... C 54,38, H 6,28, N 17,84; gefunden .... C 53,00, H 6,10, N 17,79.

4. N^a,N' '"-Dibenzyloxycarbonyl-histidyl-phenylalanyl-N^G-nitro-arginyl-tryptophyl-glycin-

methylester (XVI)

Man erhält dieses Peptid nach dem in Bull. Chem. Soc. Japan., 38, 1148 (1965), angegebenen Verfahren, mit der Ausnahme, daß an Stelle des entsprechenden Trifluoracetats das oben erhaltene Tetrapeptidesterformiat verwendet wird. Man stellt den Pentapept<dester aus 2,60 g Phenylalanyl-N^G-nitro-arginyltryptophyl-glycin-methylester-formiat und 1,91 £ N",N' ""-Dibenzyloxycarbonyl-histidin-p-nitrophenyl· ester her. Man erhält 2,70 g [α]!,'= -22,3 ±0,3' 55 (c = 2,084, Dimethylformamid).

C₅₁H₅₁₁N₁₂O₁₂-H₂O:
Berechnet ... C 58,50, H 5,58, N 16,05; gefunden .... C 58,63, H 5,70, N 15,89.

5. Histidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-

glycin-monoacetat (XVII)

1,44 g N^a,N^lm - Dibenzyloxycarbonyl - hislidyl phenylalanyl - N^G - nitro - arginyl - tryptophyl - glycir s methylester (XVl) werden in 90%igem Dioxan hydrc lysiert und aus Essigsäure lyophilisiert. Man erhä 1,35 g Benzyloxycarbonyl - histidyl - phenyl - alany N^G-nitro-arginyl-tryplophyl-glycin entsprechend dei

in Bull. Chem. Soc. Japan., 38, 1148 (1965), angegebenen Verfahren.

0,72 g des oben erhaltenen Pentapeptids und 0,72 Volumteile Anisol werden in 7 bis 8 ml wasserfreiem Fluorwasserstoff bei einer Badtemperatur von Trockeneis/Aceton-Gemisch gelöst. Danach wird das Gemisch 30 Minuten bei 0⁰C gerührt. Nach dem Entfernen des Fluorwasserstoffes durch Eindampfen wird der Rückstand 15 Stunden über Natriumhydroxydplätzchen getrocknet. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser gelöst und die Lösung gründlich mit Essigsäureäthylester gewaschen und dann über eine kleine »Amberlite® CG-400« (Acetatform)-Säule gegeben. Die Säule wird portionsweise mit Wasser gewaschen. Die wäßrigen Eluate werden vereinigt und lyophilisiert. Man erhält 0,64 g /C*""⁰= 279 πΐμ (ΕΓ™66,2), 288 ηΐμ (Ε! «53,5) und λ«",-¹*¹⁰¹¹= 280 πΐμ (Ei°?_m65,0), 288 ηΐμ (E !"an 54,5). Papierchromatographie in n-Butanol zu Essigsäure zu Pyridin zu Wasser = 3C: 6:20:24 Volumieile.

Es treten eine Hauptkomponente vom R_f 0,47 ois 0.5? und zwei Spuren auf, die alle auf Ninhydrin-, ! Pauly- und Ehrlichreagenzien reagieren. Nur die , Hauptkomponente reagiert mit Sakaguchireagens.

6. Benzyloxycarbonyl-y-tert.-butyl-glutamyl-

histidyl-pheriylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycin-

monoacetat (XVIII)

Eine Lösung von 0,83 g der Verbindung (XVII) und0,28 mlTriäthylamin in 10 ml90%igemDimethyl- • formamid wird bei 0⁰C gerührt und mit 0,46 g Benzyloxycarbonyl -γ- tert. - butyl - glutaminsäure - ρ - nitrophenylester versetzt. Das Gemisch wird 15 Stunden bei 4° C gerührt. Eine zusätzliche Menge von 0,46 g des aktiven Esters wird zugegeben, und das Gemisch wird bei 4°C gehalten, bis das Pentapeptid (XVII) sich durch Dünnschichtchromatographie nicht mehr nachweisen läßt. Das Reaktionsgemisch wird dann tropfenweise in 100 ml eiskalten Essigsäureäthylester gegeben. Man erhält einen gelatinösen Niederschlag, der abfiltriert, mit Essigsäureäthylester gewaschen und im Exsikkator getrocknet wird. Das aus Essigsäure/Wasser ausgefällte Produkt ist das gewünschte Hexapeptid. Man erhält 0,84 g [α]? = -26,6 ±0,5° (c = 1,377, 50%ige Essigsäure).

C₅₁H₆₄N₁₂O_n

Berechnet .
gefunden ...

CH₃COOH-7H₂O:

. C 52,86, H 6,74, N 13,98:
. C 52,73, H 6,85, N 13,92.

7. y-tert-Butyl-glutamyl-histidyl-phenylalanylarginyl-tryptophyl-glycin-monoacetat (XIX)

0,265 g der Verbindung XVIII werden in 10 ml 50%iger Essigsäure gelöst und in Gegenwart von Palladiumschwarz 2,5 Stunden hydriert. Nach dem Abfiltneren des Katalysators wird das Filtrat unter vermindertem Druck bei einer Badtemperatur von 45 bis 50⁰C eingedampft. Der Rückstand wird aus Essigsäure lyophilisiert und über Natriumhydroxydplätzchen im Exsikkator getrocknet Man erhält 0,22 g. Das Produkt verhält sich bei der Dünnschichtchromatographie in n-Butanol zu Essigsäure zu Wasser = 4:1:2 einheitlich.

C₄₃H₅₈N₁₂O₉

Berechnet .
gefunden ..

CH₃COOH-SH₂O:

.. C 49,53, H 7,21, N 15,40;
.. C 49,46, H 6,77, N 15,49.

Herstellung von

tert-ButyloxycarbonyU/ii-alanyl-tyrosyl-

seryl-methionyl-y-tert-butyl-glutamyl-histidyl-

phenylalanyi-arginyl-tryptophyl-glycin (XX)

Eine Lösung von 0,45 g der Verbindung XI in 4,5 Volumteilen 90%igem Dimethylformamid wird in einer Kochsalz/Eis-Mischung gekühlt und mit 2,0 ml eiskalter 1 η-Salzsäure und 0,83 ml eiskalter

ίο 1-m Natriumnitritlösung versetzt. Das Gemisch wird 4 Minuten gerührt und dann mit 20 ml eiskalter gesättigter Natriumchloridlösung und eiskaltem Essigsäureäthylester versetzt. Die wäßrige Schicht wird abgetrennt und 2mal mit Essigsäureäthylester ausgeschüttelt. Die organischen Phasen werden vereinigt mit 5%iger kalter Natriumhydrogencarbonatlösung gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und zu einer Lösung von 0,50 gXIX und 0,21 ml Triäthylamin in 15 ml Dimethylformamid gegeben. Das Gemisch wird bei einer Badtemperatur von 10 bis 15° C unter vermindertem Druck zur Entfernung des Essigsäureäthylesters eingedampft. Die erhaltene klare Lösung wird 15 Stunden bei 4⁰C stehengelassen. Eine zusätzliche Menge von Azid, das aus 0,23 g XI nach dem oben beschriebenen Verfahren hergestellt wurde, wird zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wird weitere 24 Stunden bei 4° C gehalten. Anschließend wird das Gemisch tropfenweise in 200 ml eiskalten Essigsäureäthylester gegeben. Man erhält einen amorphen Niederschlag, der abfiltriert, mit Essigsäureäthylester gewaschen und im Exsikkator getrocknet wird. Man erhält 0,69 g. Nach Umfallen aus Dimethylformamid/ Methanol (2:5) erhält man das reine Dekapeptidderivat; [α]? = -19,4 ±0,7° (c = 0,882, Dimethylformamid). Bei der Dünnschichtchromatographie in Dimethylformamid zu Essigsäureäthylester zu Essigsäure = 15:10:2 verhält sich das Produkt einheitlich (R_f = 0,54 bis 0,57).

C₆₈H₉₄N₁₆O_nS-SH₂O:

Berechnet ... C 51,57, H 7,00, N 14,15, S 2,02; gefunden .... C 51,62, H 6,66, N 14,06, S 2,64.

Herstellung von

/i-Alanyl-tyrosyl-seryl-methionyl-glutamyl-

histidyl-phenylalanyl-arginyl-tryptophyl-glycyl-

lysyl-propyl-valyl-glycyl-lysyl-lysyl-arginyl-

argininamid (XXIV)

Eine Lösung von 0,37 g der Verbindung XX in

10 ml Dimethylformamid wird bei 0⁰C mit 0,25 ml eiskalter 1 η-Salzsäure versetzt. Die Lösung wird sofort in 200 ml eiskaltes Gemisch aus Essigsäureäthylester und Äther (1:1) gegeben. Der erhaltene Niederschlag wird abfiltriert mit Äther gewaschen

und im Exsikkator getrocknet Die erhaltenen 0,36 g werden in 5 ml Dimethylformamid gelöst, und dazu werden 0,115 g N-Hydroxysuccinimid und 0,21 g N^'-Dicyclohexylcarbodiimid nacheinander zugegeben. Das Gemisch wird 15 Stunden bei 4° C stehengelassen. Nach dem Abfiltrieren der Harnstoflverbindung wird das Filtrat in ein eiskaltes Gemisch aus 200 ml Äthylacetat und Äther (1:1) gegeben. Der Niederschlag wird abfiltriert, mit Äther gewaschen und im Exsikkator getrocknet. Man erhält 039 g des

aktiven Esters des Dekapeptids.

0,23 g des Triacetats von N'-tert-Butyloxycarbonyllysyl-prolyl-valyl-glycyl-N'-tert-butyloxycarbonyllysyl - N* - tert - butyloxycarbonyl - lysyl - arginyl-

2 ΟΙΟ 759

argininamid werden in 3 ml Dimethylformamid gelöst und mit 0,24 ml Triethylamin versetzt. Dazu wird eine Lösung von 0,39 g des oben erhaltenen aktiven Dekapeptidesters in Dimethylformamid gegeben und das Reaktionsgemisch (Gesamtvolumen etwa 5 ml) wird 60 Stunden bei 4°C stehengelassen. Man erhält das Rohprodukt des geschützten Octadekapeptids als amorphen Feststoff, wenn das Reaktionsgemisch zu 100 ml kaltem Essigsäureäthylester gegeben wird. Ausbeute 0,55 g.

0,55 g des geschützten Peptids werden zum Entfernen der Schutzgruppen in 6 ml 90%iger Trifluoressigsäure gelöst. Die Lösung wird 60 Minuten bei Raumtemperatur gehalten. Danach wird das Lösungsmittel durch Eindampfen unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in Wasser gelöst und die Lösung über eine »Amberlite · CG-400« (Acetatform)-Säule (2,2 χ 7 cm) gegeben. Die Säule wird portionsweise mit Wasser gewaschen. Die wäßrigen Lösungen werden vereinigt und unter vermindertem Druck auf 10 bis 15 ml eingedampft. Zu der eingedampften Lösung wird 1 ml 1 m Mercaptoäthanollösung gegeben, und das Gemisch wird 15 Stunden bei 37^rC inkubiert und lyophilisiert. Man erhält 0,51 g Rohpeptid ohne Schutzgruppen, das zur weiteren Reinigung an einer mit Carboxymethylcellulose (CMC. »Serva®« 0,6 Milliäquivalent/g) beschickten Säule Chromatographien wird, wobei 4000 ml eines Ammoniumacetatpuffers vom pH-Wert 6,8 mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,05 bis 0,4 m verwendet werden. Die dem Hauptgipfel entsprechenden Fraktionen 166 bis 245 mit je 15 ml werden vereinigt, und der Hauptteil des Lösungsmittels wird unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird wiederholt bis zur Gewichtskonstanz lyophilisiert. Man erhält 0,22 g des teilweise gereinigten Octadekapeptids. 0,2 g des Produktes werden zur weiteren Reinigung an einer CMC-Säule (2,2 χ 18 cm; »Serva®«, 0,6 Milliäquivalent/g) unter Verwendung von 2000 ml eines Ammoniumacetat puffers vom pH-Wert 6,8 mit einem linearen Konzentrationsgradienten von 0,05 bis 0,8 m chromatographiert. Die dem Hauptgipfel entsprechenden Fraktionen 125 bis 160 von je 7,5 ml werden vereinigt, eingedampft und lyophilisiert. Man erhält 0,17 g des reinen Peptids ^-Alanyl-tyrosyl-seryl-methionyl-glutamyl-histidylphenylalanyl - arginyl - tryptophyl - glycyl - lysyl - prolylvalyl - glycyl - lysyl - lysyl - arginyl - argininamid; \_a]U = -54,0 ± 1,8° (c = 0,515, 0,1 n-Essigsäure), n, NoH 280 (E!*230) §ώϋ^σ= 288,5 ma ^H= 281,5

, „.N„oH₌ 280 πΐμ (E!*,23,0),

(E'^24,3).

Das Produkt verhält sich bei der Papierchromatographie mit n-Butanol zu Essigsäure zu Pyridin zu Wasser = 30:6:20:24 als Laufmittel gegenüber Ninhydrin-, Pauiy-, Ehrlich-, Sakaguchi- und Methioninreagens (PtJ₆) und bei der Papierelektrophorese (600 V/36 cm in 2 η-Essigsäure) einheitlich. Das Verhältnis der Aminosäuren bei saurer Hydrolyse ist folgendes: Ser 0,75, GIu 0,90, Pro 0,91, GIy 1,89, VaI 1,00, Met 0,96, Tyr 1,01, Phe 0,97, /S-AIa 1.00, Lys 2,83, His 0,92, Arg 2,82, Trp 0,55, NH₃ 1,42. Das Trp/Tyr-Verhältnis im intakten Octadekapeplid bestimmt man spektrophotometrisch zu 1,16:1.

Beispiel 2

5 Gewichtsteile (/5-Ala')-ACTH(l-18)-NH₂-acetat werden in 2,5 Gewichtsteilen 40millimolaver Zinkchloridlösung gelöst. Die Lösung wird mit 2,5 Volumteilen einer 45 Gewichtsteile Natriumchlorid enthaltenden 40millimolaren Dinatriumhydrogenphosphatlösung versetzt. Man erhält eine Suspension des Zinkchlorid-Komplexes.

Dieses Präparat wird in Dosen von 5 μΙ/Ralte hypophysektomierten Ratten intramuskulär injiziert. Nach 2 Stunden wurde die 11-Hydroxycorticosteroid-Menge in Plasma zu 80 μg/100 ml bestimmt. Im

ίο Gegensatz dazu erhielt man bei der Verabreichung eines auf die gleiche Weise erhaltenen Präparates, das aber kein Zinkchlorid enthielt, eine 11-Hydroxycorticosteroid-Menge von 6 μg/100 ml.

Die Bestimmung wurde nach dem in Endocrinol.

Japonica, 13, 180 (1966), beschriebenen Verfahren durchgeführt.

Verwendet man Kobaltchlorid, Kupferchlorid, Nickelchlorid oder Eisenchlorid an Stelle von Zinkchlorid, so erhält man die entsprechenden Komplexe.

Beispiel 3

10 Gewichtsteile (/J-AIa¹ J^ werden in 2 Gewichtsteilen destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird unter Rühren mit einer Lösung von 20 Gewichtsteilen Poly-L-asparaginsäure vom Molekulargewicht 3000 versetzt, die vor der Verwendung mit 3 Volumteilen 0,1 n-Natriumhydroxydlösung neutralisiert worden war. So erhält man eine Suspension eines weißen Niederschlags. Die gewünschte Suspension des Komplexes erhält man, wenn man zu der oben erhaltenen Suspension 5 Volumteile einer m/15-Dinatriumhydrogenphosphat/Dikaliumhydrogenphosphatlösung, die 90 Gewichtsteile Natriumchlorid enthält, zusetzt.

Das Präparat wird in einer Dosis von 5 μΙ/Ratte in hypophysektomierte Ratten intramuskulär injiziert. 2 Stunden nach der Injektion wurde die 11-Hydroxycorticosteroidmenge im Plasma zu 45 μg/100 ml bestimmt, während die Menge bei Verabreichung einer auf die gleiche Weise erhaltenen Präparation, die aber keine Poly-L-asparaginsäure enthielt, 6 ug/100 ml be-

^trUg- Beispiel 4

5 Gewichtsteile (

werden in 1,5 Volumteilen destilliertem Wasser gelöst. Die Lösung wird mit 1 Volumteil einer Lösung von 5 Gewichtsteilen einer Poly-L-glutaminsäure vom Molekulargewicht 1500 bis 2000 versetzt, die vorher mit 0,1-n Natriumhydroxydlösung neutralisiert worden war. Man erhält so eine Suspension des Komplexes. Durch Zugabe von 2,5 Volumteilen eines 90 Gewichtsteile Natriumchlorid enthaltender m/30 Phosphatpuffers zu der Suspension erhält mar das gewünschte Präparat des Komplexes.

Beispiel 5

5 Gewichtsteile (^ werden in 15 Volumteilen einer lOOmillimolarei Zinkchloridlösung gelöst. Andererseits werden 5 Ge wichtsteile einer Poly-L-glutaminsäure vom Mole kulargewicht 1500 bis 2000 mit 1 Volumteil 0,1-n Na triumhydroxydlösung neutralisiert und mit 45 Ge wichtsteilen Natriumchlorid und mit 25 Volumteilei

' einer 40millimolaren Dinatriumhydrogenphosphat lösung versetzt. Die so erhaltenen Lösungen de Octadekapeptids und der Polyglutaminsäure werdei vereinigt. Man erhält eine Suspension des gewünschte Komplexes.

~ 409 628/lc

Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

--γ

Claims (1)

Patentansprüche:

1. /ϊ-Alanyl-L-tyrosyl-L-seryl-L-methionyl-L-glutamyl-L-histidyl-L-phenylalanyl-L-arginyl· L - tryptophyl - glycyl - L - lysyl -L- prolyl - l - valylglycyl - L- lysyl - L- lysyl - L - arginyl - L - argini

seine Salze mit Säuren und Komplexe mit Zink, Kobalt, Nickel, Kupfer, Eisen, Poly-L-glutaminsäure, Poly-D-glutaminsäure, Poiy-DL-glutaminsäure, Poly-L-asparaginsäure, Poly-OL-asparaginsäure, Copoly-L-glutamyl-tyrosin oder deren Gemische.