DE2544348A1

DE2544348A1 - L-leucin-13-motilin, verfahren zu dessen herstellung und dasselbe enthaltendes mittel

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Publication number: DE2544348A1
Application number: DE19752544348
Authority: DE
Inventors: Ernst Dr Jaeger; Gerhard Dr Wendlberger; Erich Prof Dr Wuensch
Original assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Current assignee: Max Planck Gesellschaft zur Foerderung der Wissenschaften eV
Priority date: 1975-10-03
Filing date: 1975-10-03
Publication date: 1977-04-07
Also published as: IT1068299B; CH615904A5; FR2326202B2; JPS5246068A; FR2326202A2; DE2544348B2; GB1507243A; DE2544348C3; SU593659A3

Description

DR. ALFRED RIEDEL

PATENTANWALT MÜNCHEN 22 THIERSCHSTRASSE 8

M 110

Max-Planck-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e. V.

Göttingen

L-Leucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel

(Zusatz zu Patent Fr. 2 315 271)

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Ii-Iieucin-13-Motilin, Verfahren zu dessen Herstellung und dasselbe enthaltendes Mittel

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung und weitere Ausgestaltung des Hauptpatents, aus dem L-Norleucin-13-Motilin bekannt ist, welches sich von dem natürlich vorkommenden Mo tilin dadurch unterscheidet, daß es als 13· von insgesamt 22 die Polypeptidkette aufbauenden Aminosäuren statt eines L-Methioninrestes der Formel

-NH-CH-CO- I	2
CH I	2
CH I
I S	3
CH

einen L-Hbrleucinrest der Formel

-NH-CH-CO-I
CH₂

CH₂

enthält· Das synthetische Motilinderivat hat praktisch die gleiche biologische Aktivität wie das natürliche Motilin (vgl· J. C· Brown in Demling et al "Die Oberbaucheinheit The Upper Gastro-Intestinal Tract, a Functional Entity" Schattauer Verlag, Stuttgart - New York, 1974, Seiten 11 - 13).

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Es wurde nun gefunden, daß entsprechend vorteilhafte Ergebnis se erzielbar sind, wenn in 13-Stellung des Motilins statt des L-Norleueinrestes ein L-Leucinrest der Formel

-NH-CH-CO-I

CH-CH₀

I ³

CH₃

eingebaut wird. Gegenüber dem bekannten Norleucin-Motilin hat das Leucin-Motilin den Vorteil, daß es bei gleich guter biologischer Aktivität mit geringerem Kostenaufwand hergestellt werden kann, weil L-Leucin billiger ist als L-Norleucin, und daß es im Körper besonders leicht abgebaut wird, weil L-Leucin eine am Proteinaufbau maßgebend beteiligte, natürlich vorkommende Aminosäure ist.

Motilin ist bekanntlich ein die motorische Aktivität sowohl in den Antrum- als auch in den Fundus-Drüsenarealen des Magens stimulierendes Polypeptid _} das aus der Duodenalschleimhaut des Dünndarms von Sehweinen isoliert wurde (vgl. z. B. "Can. J. Phyaiol. Pharmacol." Bd. 49, 1971, Seiten 399 - 405, "Gastroenterology" Bd. 62, 1972, Seiten 401 - 404 und "Can. J. Biochem." Bd. 51, 1973, Seiten 533 - 537), die Pepsinausschüttung ohne eine Änderung der H -Sekretion stimuliert, und sich sowohl chemisch als auch physiologisch von den inzwischen aufgeklärten gastrointestinalen Hormonen unterscheidet. Dem Motilin kommt daher sowohl als Therapeutikum als auch als Diagnostikum eine besondere Bedeutung zu, da mit seiner Hilfe z. B. eine gesteuerte Pepsinaussehüttung, beispielsweise mit dem Ziele der Bestimmung oder Isolierung des Pepsins oder der Regulierung des Pepsinspiegels, sowie eine gezielte Antikörperbildung bewirkt werden kann.

Die ursprüngliche Strukturaufklärung des Motilins ergab die Aminosäuresequenz -Met—Glu-Glu- in 13-14-15-Stellung, die an dem dem Hauptpatent zugrundeliegenden Prioritätstag als zu-

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treffend angesehen wurde« Inzwischen wurde über eine Korrektur dieser Aminosäure se quenz "berichtet, wonach in 14-Stellung GIutamin statt Glutaminsäure vorliegen soll, so daß obige iDeilsequenz -Met-Gln-Glu- heißen müßte (vgl. "Oan. J. Biochem." Bd. 52, 1974, Seiten 7-8). Demnach wäre das aus dem Hauptpatent bekannte Motilinderivat mit 13-l-Norleucin-14-<lesamido-Motilin und das nunmehr beanspruchte Motilinderivat mit 13-L-Leucin-14-desamido-Motilin zu bezeichnen. Solange jedoch nicht mit Sicherheit feststeht, daß weitere Korrekturen der Aminosäuresequenz überflüssig sind, werden die bisherigen Bezeichnungen L-Norleucin-13-Motilin und L-Leucin-13-Motilin für die in 14-Stellung einen Glutaminsäurerest aufweisenden Motilinderivate beibehalten, noch dazu, wo sich gezeigt hat, daß die Amidgruppe in der Seitenkette der 14*-Glutaminsäure auf die biologische Aktivität keinen Einfluß hat (vgl. z. B. die rechte Spalte von Seite 8 der oben genannten Druckschrift "Oan. J. Biochem." Bd. 52, 1974).

Gemäß Hauptpatent wurde das bei allen Naturstoffen bestehende Problem, daß die Isolierung aus beispielsweise tierischen Organen unerhört zeit- und kostenaufwendig ist und.nur in minimalen Ausbeuten gelingt, dadurch gelöst, daß eine Totalsynthese des Motilins durchgeführt wurde unter Ersatz des in 13-Stellung befindlichen Methioninrestes durch einen Norleucinrest, aus der Überlegung heraus, daß nach dem heutigen Stand der Peptidsynthese die mittelständige Arginyl-methionyl-Bindung (Aminosäuren 12 und 13 des Motilins) praktisch kaum synthetisierbar ist, andererseits jedoch das dem Motilin entsprechende Norleucin-13-Dokosapeptid auf synthetischem Wege leichter zugänglich ist, eine vergleichsweise rasche Strukturermittlung gewährleistet und wichtige Aufschlüsse über die biologische Wirkungsspezifität des Methionins zu geben vermag.

Das in hohen Ausbeuten vollsynthetisch hergestellte L-HOrleucin-13-Motilin besitzt nach der Reinigung praktisch die glei-

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ehe Aktivität wie natürlich vorkommendes Motilin, was als Indiz dafür anzusehen ist, daß der Sequenzplatz des Methionine auch von Norleucin eingenommen werden kann. Dieser Befund war insofern überraschend, als der Ersatz von Methionin durch Norleucin in natürlich vorkommendem Human-Gastrin I zu einem Syntheseprodukt führt, das nur etwa 10 fo G-astrin-Aktivität besitzt<

Gemäß vorliegender Erfindung wird eine weitere Verbesserung dadurch erzielt, daß ein gleich vorteilhaftes Motilinderivat wie nach dem Hauptpatent zur Verfügung gestellt wird, das jedoch billiger herstellbar und biologisch leichter abbaubar ist.

Gegenstand der Erfindung ist L-Leucin-13-Motilin der Kurzformel

H-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-L eu-Gln-(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9)(1O)(11) Arg-Leu-Glu-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln-OH

worin die in Klammern angegebenen Zahlen die von 1 bis 22 durchnumerierte Stellung der Aminosäurereste (außer Glycin alle Aminosäuren in L-Konfiguration) in der Peptidkette angeben und worin die Bezeichnung der Aminosäurereste in üblicher bekannter Weise abgekürzt ist.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung des L-Leucin-13-Motilins gemäß Hauptpatent, bei dem

(a) die miteinander verknüpfbaren Teilsequenzen

Fragment I bestehend aus Arginyl(hydrobromid)-asparaginyl-ΕΤε -tert · butyloxycarbonyl-lysyl-glycyl-glutamin-tert · butylester (Aminosäuren 18 - 22),

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-*. 2S4A348

40

Fragment II bestehend aus Να-Benzyloxycarbonyl-glutamyl-(^-tert«butylester)-glutamyl-(/-tert.butylester)-N£-tert. butyloxycarbonyl-lysyl-glutaminsäure-^-tert · butylest er (Aminosäuren 14 - 17),

Fragment III bestehend aus der N-endständig einen Να, ΪΤ5, Nb-Tris-benzyloxycarbonyl-arginylrest aufweisenden Aminosäure 13 (Aminosäuren 12 - 13),

Fragment IV bestehend aus Fcc-Benzyloxycarbonyl-glutamyl-(y-tert.butylester)-leucyl-glutamin (Aminosäuren 9 - 11),

Fragment V bestehend aus O-tert-Butyl-threonyl-0-tert. butyl -tyrosyl-glyein (Aminosäuren 6-8) und

Fragment VI bestehend aus Na-tert.butyloxycarbonyl-phenylalanyl-valyl-prolyl-isoleucyl-phenylalanin (Aminosäuren 1 - 5)

separat aufgebaut werden, in denen alle Seitenkettenfunktionen der polyfunktionellen Aminosäuren acidolytisch leicht abspaltbare Schutzgruppen auf tert.Butylalkohol-Basis tragen und die komplexe Funktion des Arginine entweder durch Η&,ω -Diaeylierung oder durch Protonisierung durch Salzbildung mit Bromwasserstoff maskiert ist,

(b) die Fragmente I bis VI mit Hilfe des bekannten N,N'-Dicyelohexylcarbodiimid—IT-Hydroxysucciniraid-Verfahrens oder einer bekannten Modifikation desselben miteinander verknüpft werden,

(c) aus dem erhaltenen, allseits maskierten, die Gesamtsequenz der Aminosäuren 1-22 aufweisenden Polypeptid alle Schutzgruppen mit Hilfe von Trifluoroessigsäure abgespalten werden,

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AA

(d) die bei der Abspaltung der Schutz gruppen gebildeten Trifluoroacetat- und Bromidionen mit Hilfe eines Anionenaustauscherharzes entfernt werden, und

(e) das erhaltene Motilinderivat isoliert und gereinigt wird,

das dadurch gekennzeichnet ist, daß man als das die Aminosäureteilsequenz (12 - 13) bildende Fragment III Na, Νέ, No -Trisbenzyloxycarbonyl~L-arginyl-L-leucin aufbaut und weiterverarbeitet·

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Mittel mit Motilinwirkung, das gekennzeichnet ist durch einen Gehalt an L-Leucin-13-Motilin als wirksame Komponente.

Die Anwendung dieses Mittels erfolgt in der Regel in solchen Dosierungen, daß pro kg Körpergewicht etwa 0,05 - 0,5 ^ _t entsprechend 50 - 500 ng Motilinderivat entfallen. Als Trägermittel dient vorwiegend physiologische Kochsalzlösung. Die Applikation ist intravenös, intramuskulär oder subkutan. So kann z. B. lyophylisiertes Motilinderivat je nach beabsichtigter Applikation in Mengen von 1 - 100 ^/ml physiologische Kochsalzlösung, die z. B. durch Mannit stabilisiert werden kann, gelöst werden. Zur intravenösen Verabreichung an einen etwa 80 kg schweren Menschen ergeben 2 ml Injektionslösung, die 8 χ Motilinderivat enthalten, eine Dosierung von 0,1 ^/kg Körpergewicht, Zur Infusion an einen Menschen des angegebenen Gewichts können 8 # Motilinderivat ±i 30 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und 0,5 nü. dieser Lösung pro Minute appliziert werden, was etwa 0,1 ^ Motilinderivat/kg Körpergewicht/Std. entspricht. Im Tierversuch erwiesen sich vergleichbare Dosierungen als geeignet und so wurde z. B. natürlich vorkommendes Motilin in Mengen von 0,05 y/kg Körpergewicht intravenös an Hunde verabreicht, wodurch ein kräftiger motorischer Aktivitätsanstieg bewirkt wurde (vgl. z. B. die angegebene Druckschrift "Can. J, Biochem." 51 *

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_*_ 25A4348

(1973), 533, linke Spalte, Absatz 1)·

Zur Herstellung des Leucin-13-Motilins konnte der für das ITorleucin-13-Motilin entworfene Syntheseplan herangezogen werden. Die Synthese der Fragmente I, II, IV, V und VI erfolgte daher nach dem im Hauptpatent beschriebenen Verfahren, ebenso wie die Kondensation der Fragmente I und II zur Teilsequenz (14 - 22b) sowie der Fragmente V und VI zur Teilsequenz (1-8).

Das Fragment III (Aminosäuren 12 - 13) nri.t C-endständigem Leucin wurde synthetisiert und mit der kondensierten Peptidfraktion I - II (14 - 22b) umgesetzt zur kondensierten Peptidfraktion I - II - III (12 - 22a), woraus nach hydrogenolytischer Abspaltung der Benzyloxycarbonyl-Schutζgruppe das entsprechende Undecapeptid (12 - 22b) in Form des Hydrobromids isoliert wurde. Die weitere Umsetzung mit Fragment IV ( 9 - 11) lieferte die kondensierte Peptidfraktion I - II - III - IV (9 - 22a), welche durch katalytische Hydrogenolyse in Gegenwart von Bromwasserstoffsäure zum Hydrobromid des Tetradecapeptids (9 - 22b) entacyliert und schließlich kondensiert wurde mit der kondensierten Peptidfraktion V-VI ( 1 -8) zum vollkommen geschützten Verfahrensprodukt I-II-III-IV-V-VI (1 - 22a), aus dem schließlich nach Entfernung der Schutzgruppen mittels Trifluoressigsäure und nachfolgender Ionenaustauscherbehandlung und Lyophilisation das gewünschte Leucin-13-Motilin (1 - 22b) als Rohprodukt erhalten wurde.

Die Erfindung wird durch die beigefügte Zeichnung näher erläutert, in der darstellen:

Fig. 1 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments I, Fig. 2 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments II,

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Fig· 3 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments VI,

Fig. 4 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments III sowie zur Verknüpfung der Fragmente I + II + III, und

Fig. 5 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments IV sowie zur Verknüpfung der Fragmente IV mit (I - III), VI mit V, und (i - IV) mit (V - Vl).

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. In den Figuren und Beispielen werden die folgenden, in der Peptidchemie üblichen Abkürzungen und Symbole verwendet:

Aminosäureabkürzungen, gebildet aus 3 Buchstaben, bei denen es sich in der Regel um die 3 Anfangsbuchstaben handelt,

Zahlenangaben in Klammern, die die Stellung innerhalb der Polypeptidkette wiedergeben, und die keinen weiteren Zusatz erhalten, wenn die betreffende Verbindung kein weiteres Derivat bildet, die jedoch fortlaufend mit dem Zusatz a, b, c usw. versehen werden, wenn von a ausgehend weitere Derivate hergestellt werden,

L als Angabe der Konfiguration,

Z für den Benzyloxycarbonylrest (vgl. z. B. Bergmann et al in "Berichte d. Dtsch. Chem. Ges." Bd. 65, 1932, 1192 ff),

BOC für den tert.Butyloxycarbonylrest (vgl. z. B. McKay et al in ¹¹J. Am.Chem. Soc." Bd. 79, 1957, S. 4686 und Anderson et al in "J.Am.Chem.Soc." Bd. 79, 1957, S. 6180),

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DCCD für das N^-Dicyclohexylcarbodiimid-Verfahren (vgl, z. B. Sheehan et al in ¹¹J. Am.Chem.Soc·" Bd. 77, 1955, S. 1067),

DCCD/HOSU für das N^-Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Verfahren (vgl· z. B. Wünsch et al in "Berichte d. Deutschen Chem. Ges." Bd, 99, 1966, S. 110 und Weygand et al in "Zeitschr. f. Naturforschg." Bd, 216, 1966, S, 426, sowie König et al in "Berichte d. Dtsch. Chem. Ges." Bd. 103, 1970, S. 788)

N-DCCD/HOBt für das !!,IP-Dicyclohexylcarbodiimid-TOydroxybenzotriazol-Verfahren (vgl. z. B. König et al in "Ber. d. Dtsch. Chem. Ges." Bd. 103, 1970, 5. 788)

PAM für die Phosphorazo-Methode (vgl. z. B. Goldschmidt in "Angew. Chem." Bd. 62, 1950, S. 538 und Goldschmidt et al in "Liebigs Ann." Bd. 580, 1953, S. 68)

STJ für den F-Hydroxysuccinimidrest

MP für den p-Hitrophenylrest

tBu für den tert. Butylrest

DBSI für Dibenzolsulfimid als Salzbildner

Me für den Methylrest

3!FE für Trifluoroessigsäure

i.V. für "im Vakuum"

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Ausb. für Ausbeute *

d.Th. (nacli Ausbeuteangaben in $) für "der Theorie"

F für "Fließpunkt¹» und

(Z) (nach der Fließpunktsangabe) für "unter Zersetzung".

Beispiel 1 Herstellung des Fragments I (ffeilsequenz 18 - 22)

Gemäß Hauptpatent wurde H-GIn-OtBu (22b), das aus Z-GIn-OH (22a) durch Veresterung mit Essigsäure-tert.butylester unter Schwefelsäure-Katalyse und nachfolgender hydrogenolytischer Entfernung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe hergestellt worden war, mit Z-Gly-OSÜ (21) zum Benzyloxycarbonyl-Dipeptidester (21 - 22a) verknüpftj die nach hydrogenolytischer Entfernung der N-Schutzgruppe erhaltene Verbindung H-GIy-GIn-OtBu (21- - 22b) wurde mit Z-Asn-Lys(BOC)-OH (19 - 20) nach dem von Wünsch und Weygand in den genannten Literaturstellen beschriebenen HjK'-Carbodiimid-IT-Hydroxysuccinimid-Verfahren oder nach

.et al

dessen von König /in der angegebenen Literatur st eile beschriebenen Modifikationen zum Benzyloxycarbonyltetrapeptid-tert.-butylester (19 - 22a) verknüpft. Die verwendete Kopf komponente (19 - 20) wurde durch Aminoacylierung von H-Lys(BOC)-OH (20) mit Z-Asn-OKP (19) unter üblichen bekannten Bedingungen gewonnen.

Aus Z-Asn-Lys(BOC)-GIy-GIn-OtBu (i9-22a) wurde die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung entfernt unter Bildung des Tetrapeptid-Ester-Derivats (19 - 22b), das mit Z-Arg(<£,<^-Zg)-OHP (18) zum Z-Arg(cS ,u) -Z₂)-Asn-Lys(BOC)-GIy-GIn-OtBu (18 - 22a) vereinigt wurde.

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Die experimentelle Durchführung war wie folgt:

A. L-G-lutarr.in-tcrt.butylester-dibenzolaulfJmJdSaI₁Z

103 g Benzyloxycarbonyl-glutamin-tert.butylester (erhalten nach dem von Schnabel et al in "Liebigs Ann." Bd. 686, 1965, S. 229 beschriebenen Verfahren)in 2 1 Methanol wurden unter Zutropfen von 91 g Dibenzol3ulfimid in 500 ml Methanol bei pH = 3,5 in üblicher bekannter Weise katalytisch (Palladium schwarζ) hydriert.

Das Piltrat wurde i. V. eingedampft, zum Schluß unter azeotroper Destillation mit Benzol; aus der Essigesterlösung des öligen Rückstandes trat beim Versetzen mit Diäthyläther Kristallisation ein. Aus Methanol/Diäthyläther resultierten Kristalle von P = 135 - 136°; C*Jj? ^m ⁺ 1O»78° (c = 1,0; in Methanol). Ausb. = 146 g (97 i» d. Th.).

B. Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-glutamin-tert.butyleater

145 g L-Glutarain-tert.butylester-dibenzolsulfimidsalz suspendiert in 800 ml Dichlormethan wurden mit 32,2 ml Triäthylamin und danach mit 70,5 g Benzyloxycarbonyl-glycin-N-hydroxyauccinimidester unter Rühren versetzt. 24 Std. Rühren bei Raumterap., Einengen i.V., Aufnehmen des Öle in Essigester, Waschen dieser Lösung wie üblich mit Zitronensäure-, Kaliumhydrogencarbonatlöaung und Wasser, Trocknen über Natriumaulfat und Eindampfen i.V. führteazu einem Öl'. Ausb. « $7 g (93 ^d. Th.).

C. Glycyl-L-glutaBdn-tert.butyleater-dibensolaulfimidaalg

80 g Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-glutamin-tert.butylester (gem. B.) in 900 ml Methanol wurden wie unter A beochriebon hydrogenolytisch ontacyliert (60 g Dibensolaulfimid) und aufgearbeitet. Es resultierte ein öliger Rückstand, der bein Verrei ben mit Petroläther kristallisierte! F · 92°(Z); ^\7p°- -β|5°

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(c a 1,0; in Methanol). Auob. = 110 g (98 # d. Th.).

D. Benzyloxycarbonyl-L-asnaraginyl-N£ -tert.butyloxycarbonyl-L-lysin

■51 g Ni. -tert.Butyloxycarbonyl-L-lysin wurden in üblicher bekannter Y/eise in das .Benzyltriäthylammoniumsalz übergeführt und danach in 700 ml Dimethylformamid mit 81 g Benzyloxycarbonyl-L-acparaGin-4-nitrophonylester unter Zugabe von 1 Aquiv. Pyridin 48 Stdn. lang bei 20° gerührt. Der Vakuumverdampfungsruckstand wurde mit Essigester und Kaliumhydrogensulfatlösung gleichzeitig behandelt; der gebildete dicke Niederschlag wurde abfiltriert und dann aus Äthanol/Petroläther umkristallisiert. P = 174 - 175°(Z); ^x_7q°= + 13,8° (c = 1,0; in Pyridin). Ausb. = 70 g (71 ^ d. Th.).

E, Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-Nfc' -tert.butyloxycarbonyl— L-l.ysyl-^lyc.yl-L-glutamin-t ert. butylester

61»5 g Glycyl-L-glutamin-tert.butylester-dibenzolsulfiraid— salz und 54,5 g Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-Nt tert.butyloxycarbonyl-L-Iysin in 700 ml Dimethylformamid wurden unter Rühren bei O⁰G zunächst mit 15,5 ml Triäthylamin und nach 15 Min. mit 13 g N-Hydroxysuccinimid sowie 23 g N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 3 Stdh. wurde

/•ratur weitere 24 Stdn. bei Raumtemp/ gerührt. Daa Filtrat vom NjN'-Dicyclohexylharnstoff wurde i.V. eingedampft} der Rückstand kristallisiert beim Behandeln mit Essigeater. Umkristal lisiert wurde aus Methanol/Wasser und Isopropanol/Essigester. P « 155 - 156°; Ζ\7§°= -20,8° (c = 1,0; in Äthanol). Ausb. =» 63 g (78 "A d. Th.).

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F, L-Asparaginyl-N£ -tert.butyloxycarbonyl-L-lysyl-Klycyl-L-filutamin-tert.butylester-h.ydrochlorid

47,5 g Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-N£. -tert.butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.butylester (gem. E) in 800 ml Methanol wurden unter Konstanthaltung des pH-Wert· wie üblich hydriert (pH a 5,5J 25,2 ml 2,5 N-Chlorwasserstofflösung in Methanol). Da3 i.V. eingedampfte Filtrat ergab ein

/entstand
01 j farbloses Pulver/nach Verreiben mit Diäthyläther. P = 98°; Z\7d°= + 9,5° (c =* 1,0 in Methanol). Ausb. = 40 g ( 97 £ d. Th. Η

G. Hoi.N^ .N^ -Tris-benzyloxycarbonyl-L-arflinyl-L-asparafiinyl-Νί. -tert.butyloxycarbonyl^L-lyayl-ftlycyl-L^fflutamin-tert. butylester

31,9 g L-Asparaginyl-Nt -tert.butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.butylester-hydrochlorid (gem. P) und 33,68 g N'* ,N <i .Nu, -Tria-benzyloxycarbonyl-L-arginin-N-hydroxysuccinimideater in 1 1 Dimethylformamid wurden bei O⁰G mit 7 ml Triäthylamin versetzt; nach 24 3tünd. Rühren bei Räumtemp., Eindampfen i.V., Umfallen dO3 Rückstandes aus Methanol/Wasser und danach Umkristallisieren au3 Methanol resultierte ein farbloses Pulver; £\j\ = - 7,6° (c = 1,0; in Eisessig). Ausb. a 46,5 g (80 Jt d. Th.).

H. L~Arfiinyl(hydrobromid)-L-asparaflinyl-N L »tert.butyloxycarbonyl~L-lysyl-^lycyl-L-glutamin-tert,butyleBter-hydrobromid-dihydrat

45,5 g Na ,N <i .N w -Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-asparaginyl-N £ -tert.butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamintert.butylester (gem. G) in 1,5 1 Dimethylformamid/Methanol (2:1) wurden unter Konstanthaltung des/in üblicher beknnnter Wcioo hydvoßonolytioch entncyliort (pH β 4,'j; UO ml 1 N-liromwa3serstoffsäure). Eindampfen des Filtrate i.V. und Umfallen dea Rückstandes aus Athanol/Diäthyläther führte zu einem amor- \

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phen Pulver: /*7π = -4,8° (c =» 1,0; in 80 #iger Essigsäure). Ausb. = 37 g (98 £ d. Th.).

Ausbeute 55 "/> über alle Stufen, bezogen auf H-GIn-OtBu (22b) als Startniaterial;

20 <-» /* .O ι /—. t20 r\ a O /

= -7,6 + 1 bzw. ^ Ii/c^g = -9,4 (c =

chroraatographi3ch rein in n-Butanol/Eise33ig/Wasaer 3:1:1 und n-Heptan/tert.Butanol/Eiaessig 5t1s1»

Analyse ber./gef. C 57,93/57,70,· H 6,69/6,56j

N 13,29/13,29; 0 22,02/22,45

Durch nachfolgende Entfernung der drei Benzyloxy-carbonyl-Maskierungen durch katalytiache Hydrogenolyse unter Zusatz von zwei Äquivalenten Bromwasserstoff wurde das gewünschte Fragment I₁ nänaich H-Arg(HBr)-ASn-LyS(BOG)-GIy-GIn-OtBu.HBr (I8_r22b), erhalten.

Ausbeute: 98 ^; l\7^°- -4,8 + 1° bzw. ^\7??₆ - -6,05° (c = 1;in 30 5^iger Essigsäure);

chromatographisch rein in n-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1 und tert.Amylalkohol/Pyridin/V/asser 35:35:30;

Analyse ber./gef. G 40,21/40,46; H 6,85/6,93;

N 16,12/15,89; Br 16,72/16,51

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to

Beispiel 2 Herstellung des Fragments II (Teilsequenz 14 - 17)

Gemäß Hauptpatent wurden Z-Lys(BOC)-OSU (16) und H-GIu(OtBu)-OMe (17) ohne Schwierigkeiten zum Benzyloxycarbonyl-dipeptidester (i6-17a) vereinigt. Die nachfolgende alkalische Esterverseifung und anschließende katalytische Entacylierung führte über das Dipeptid-Derivat (16-I7b) zu H-Lys(BOC)-GIu(OtBu)-OH (16-17c). Diese Verbindung wurde zweimal nacheinander mit Z-GIu(OtBu)-OSU (15 bzw. 14) umgesetzt, wobei jeweils das GIutaminsäurederivat als Kopf komponente verwendet wurde. Auf diese Weise wurde das Fragment II, nämlich Z-GIu(OtBu)-GIu(OtBu)-Lys(BOC)-GIu(OtBu)-OH (i4-17a) erhalten.

Die experimentelle Durchführung erfolgte in analoger Weise wie in Beispiel 1 beschrieben.

über
Ausbeute: 48 $/alle Stufen, bezogen auf H-GIu(OtBu)-OMe (17); F = 147 - 149 °;

[a]p° a -9,8 + 1° bzw. Ca]^₆ = -12,3° (c = 1; in Dimethylformamid) ;

chromatographisch rein in Cyclohexan/Chloroform/Eisessig 45:45:10;

Analyse ber./gef. C 59,02/58,70; H 7,86/8,04; N 7,48/7,72

Beispiel 3

Herstellung des Fragments III (Teilsequenz 12 - 13)

7098U/107?

Zur Herstellung von Na,N<S,No> -Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-leucin wurden 30 g Z-Arg(<S ,^ -Zp)-OSTJ (12) und 11,6 g Leucin (13) in Dioxan/Wasser (1000 : 500 ml) nach Zugabe von 89 ml F-Hatriumhydroxidlösung unter 18 stündigem Rühren umgesetzt. Fach Zusatz von 89 ml N-Salzsäure wurde das Reaktionsgemisch in Essigsäureäthylester aufgenommen, die erhaltene Lösung mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel i.V. entfernt. Der Rückstand wurde aus Wasser/Äthanol und Essigsäureäthylester/Diäthyläther/Petroläther umgefällt· '

Ausbeute: 26,6 g (86,6 $ d.Th.);

F a 126 - 128 ⁰Gj

[α]|° = - 5,8 + 1° bzw. Ca]^₆ = - 7,1° (c = 1; in Essigsäure);

chromatographisch rein in n-Heptan/tert.Butanol/Essigsäure (5 : 1 : 1)

Analyse ber./gef. C 62,69/62,59; H 6,28/6,41; N 10,15/9,94 Aminosäureanalyse: Arg 1,00 Leu 1,00

Beispiel 4 Herstellung des Fragments IV (Teilsequenz 9 - 11)

Gemäß Hauptpatent wurde das nach dem in "Berichte d. Dtsch. Chem. Ges." Bd. 104, 1971, S. 2430 beschriebenen Verfahren synthetisierte Dipeptid H-Leu-Gln-OH als Sequenzteilstück (10-11) verwendet und mit Z-GIu(OtBu)-OSU (9) in 74 J&Lger Ausbeute zum Fragment IV, nämlich Z-GIu(OtBu)-LeU-GIn-OH (9-11), umgesetzt. ^

7098U/1077

ix'

F = 146 - 148 °; [a]{j° = - 31,6 + 1° bzw. U]₅^₆ = - 38,1° (c = 1; in Methanol);

chromatographisch rein in n-Heptan/tert.Butanol/Bisessig 5:1:1 und n-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1

Analyse ber./gef. C 58,12/58,05; H 7,32/7,24; N 9,68/9,48

Beispiel 5

Herstellung des Fragments V (Teilsequenz 6-8) ( gemäß Hauptpatent)

Das nach dem in "Zeitschr. f. Physiol. Ghem." Bd. 353, 1972, Seite 1246 beschriebenen Verfahren synthetisierte Dipeptid H-!Dyr(tBu)-GIy-OH wurde als Sequenzteilstück (7-8) verwendet. Verknüpfung von H-Tyr(tBu)-GIy-OH (7-8) mit Z-Thr(tBu)-OSU (6) lieferte das Benzyloxycarbonyl-tripeptid (6-8a), das durch katalytische Hydrogenolyse das gewünschte Fragment V, nämlich H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-GIy-OH (6-8b) ergab.

Ausbeute: ca. 81 $ über beide Stufen, bezogen auf eingesetztes Dipeptid (7-8); F « 126 - 127 ⁰J

[a]|° = + 7,9 + 1° bzw. [a]^ = + 8,9° (c » 1; in Methanol);

Chromatographisch rein in tert.Amylalkohol/Pyridin/Wasser 35 : 35 : 30;

Analyse ber./gef. C 60,88/60,69; H 8,30/8,31; N 8,88/8,91

bezogen auf ein Dipeptid mit 1/4 Mol Kristall

«3

Beispiel 6

Herstellung des Fragments VI (Teilsequenz 1-5) (gemäß Hauptpatent)

Nach dem angegebenen Carbodiimid-Verfahren wurde Z-IIe-OH (4) mit H-Phe-OtBu (5) verknüpft· Durch anschließende katalytisch^ Hydrogenolyse des intermediären Benzyloxycarbonyl-Dipeptid-Eaters (4-5a) konnte H-Ile-Phe-OtBu (4-5b) in über 90 #Lger Ausbeute isoliert werden.

Gleichzeitig wurden BOC-VaI-OH (2a) und H-Pro-OMe (3a) nach der angegebenen Phosphorazo-Methode zum tert.Butyloxycarbonyl-Dipeptid-Ester (2-3a) vereinigt; nachfolgende alkalische Esterverseifung ergab in über 70 folger Ausbeute BOO-Val-Pro-OH (2-3b). Einfacher und in hoher Ausbeute (83 $) verlief die Herstellung von (2-3b) durch Umsetzung von BOG-VaI-OSU (2b) mit zwei Äquivalenten Prolin (3b)·

Beide Dipeptid-Derivate ließen sich mit Hilfe der angegebenen Carbodiimid-Methode zum BOC-Val-Pro-Ile-Phe-OtBu (2-5a) verknüpf enj iErifluoressigsäure-Einwirkung auf (2-5a) führte zum freien Tetrapeptid H-Val-Pro-Ile-Phe-OH (2-5b), an das in üblicher bekannter Weise BOC-Phe-OSU (1) zum BOG-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-OH (i-5a) (Fragment VI) angebaut wurde.

Die experimentelle Durchführung erfolgte in analoger Weise wie in Beispiel 1 beschrieben,

Ausbeute 63 $> über die letzten drei Stufen, bezogen auf (4-5b); F = 218 °;

[cc]|° = 64,2 + 1° bzw. Ca]₅^₆ = - 75,82° (c = 1; in Essigsäure);

chromatographisch rein in n-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1 und tert.-Aniylalkohol/Pyridin/Wasser 35 : 35 : 30;

Analyse ber./gef. C 64,88/64,72; H 7,64/7,70; N 9,70/9,61

ι«

Beispiel 7 Kondensation der Fragmente I "bis VI (Gesamtsequenz 1-22)

Mit dem carboxylendständigen Fragment I (i8-22b) wurde mit Hilfe des angegebenen Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Verfahrens das Fragment II (14-17a) durch Kondensation vereinigt und der erhaltene N-Benzyloxycarbonyl-nonapeptid-tert.butylester (i4-22a) wurde durch katalytische Hydrogenolyse in H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(BOσ)-Glu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-GIy-GIn-OtBu (i4-22b) überführt.

Die Vereinigung mit Fragment III wiederum mit Hilfe des genannten Verfahrens führte zur Bildung von Z-Arg(-s,<-J -Zp)-NIe-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-LyS(BOC)-GIu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-GIy-GIn-OtBu (i2-22a).

Durch katalytische Hydrierung wurden aus dem Undecapeptid (i2-22a) die drei Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppen entfernt und durch Neutralisation der freigewordenen Guanido-Funktion mit Bromwasserstoffsäure während der Hydrierung resultierte H-Arg(HBr)-Nle-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-GIy-GIn-OtBu (i2-22b) in Form des Hydrobromids.

Der erhaltene Undecapeptidester wurde mit Fragment IV (9—11) nach dem angegebenen Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxybenzotriazol-Verfahren durch Kondensation vereinigt und aus dem erhaltenen Tetradecapeptid-Derivat (9-22a) wurde nach hydrogenolytischer Abspaltung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe H-Glu(OtBu)-Leu-Gln-Arg(HBr)-Nle-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-Gly-Gln-OtBu (9-22b) erhalten.

7098U/1077

Während des Ablaufs vorstehender Reaktionen wurden die Fragmente V (6-8a) und VI (i-5a), letzteres nach Überführung in den (N-Hydroxysuccinimid)-ester (i-5b), vereinigt. Es gelang jedoch nicht, BOC-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr( tBu)-Tyr( tBu)-GIy-OH (1-8)rein zu gewinnen und die Aminosäureanalyse zeigte eine Verunreinigung mit etwa 10 $ (i-5a) oder (i-5b) an. Versuche zur Auftrennung dieses Gemisches verliefen ohne Erfolg.

Das erhaltene "rohe" Teilstück (I-8) wurde mit dem obigen Teilstück (9-22b) wiederum nach dem angegebenen Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Verfahren zum BOG-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-GluC0tBu)-Leu-Gln-Arg(HBr)-Nle-Glu( OtBu)-Glu( OtBu)-Lys ( BOC )-GIu(O tBu)-Arg( HBr )-Asn-Iiys-(BOC)-GIy-GIn-OtBu (i-22a) verknüpft.

Nach Abspaltung aller Schutzgruppen mittels wasserfreier Trifluoressigsäure und anschließendem Austausch der Trifluoracetat- und Bromidionen durch lonenaustauschchromatographie an einem unter der Bezeichnung "Dowex 44" bekannten schwach basischen Ionenaustauscherharz (Acetat-Form) wurde ein "Roh-NOrleucin-13-Motilin" (i-22b) erhalten, das aufgrund des Einsatzes von "unreinem" Teilstück (I-8) mit einer "Fehlsequenz" behaftet sein mußte, was sich bei der Reinigungsoperation auch bestätigte.

Die experimentelle Durchführung der Fragmentkondensation war wie folgt:

A. Kondensation I mit II

Gemäß Hauptpatent wurden 9,2 g Fragment I (gem. Bsp. 1 H), 9,36 g Fragment II (gem. Bsp. 2) und 1,4 ml Triäthylamin in 200 ml Dimethylformamid bei O⁰C mit 2,3 g IT-Hydroxysuccinimid und anschließend mit 3,1 g NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt; die Reaktionsmischung wurde 24 Stdn. lang bei 5⁰C

7098U/1Ö77

- Vr-

und 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt, worauf das FiItrat i.V. eingedampft wurde. Der Rückstand wurde mehrmals mit Wasser digeriert und schließlich zweimal aus Methanol/Essigester umgefällt.

Es resultierte Benzyloxycarbonyl-L-glutamylijf-tert. butylester )-L-glutamyl Q-tert. butylester )-N£-tert.butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl (^ -tert · -butylester) -L-arginyl (hydrobromid) -L-asparaginyl-Ni-t ert · butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-glutamin-tert.-butylester in Form eines amorphen Pulvers.

[a]|j⁰ = - 14,6° (c = 1; in Dimethylformamid) Ausb. s 14,8 g (84 fo d.Th.).

12,3 g der erhaltenen Verbindung in 800 ml Methanol wurden unter Konstanthaltung des pH-Werts in üblicher bekannter Weise katalytisch hydriert (pH =5*5; 7 ml 1 N-Bromwasserst off säure). Das FiItrat wurde i.V. eingedampft, der Rückstand aus Äthanol/Essigester zweimal umgefällt.

Es resultierte L-Glutamyl(^-tert.butylester)-L-glutainyl-(^-tert .-butylester )-N£-tert.butyloxycarbonyl-L-lysyl -L-glutamyl ( #-tert · butylester) -L-arginyl (hydrobromid) -L-asparaginyl-Ne-tert.butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-glutamintert.butylester-hydrobromid als das gewünschte Kondensationsprodukt (i4-22b).

[a]^° a - 21,5° (c = 1,0; in Methanol) Ausb. s 11,4 g (96 f° d.Th.)

709814/1077

B. Kondensation (i-II) mit III

Eine Lösung von 1,7 g Peptid (14-22b), 1,4 g Z-Arg(5,O -Z₂)-Leu-OH (12-13), 0,3 g N-Hydroxysuccinimid und 0,14 ml Iriäthylamin in 100 ml Dimethylformamid wurde bei -10° mit 0,412 g NjN'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 24 Std· lang bei 4°C gerührt· Nach weiterem 24-stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abfiltriert, das Lösungsmittel i.V. entfernt, und der Eindampfrückstand aus Methanol/Essigsäureäthylester umgefällt· Das erhaltene Produkt wurde sorgfältig mit Wasser digeriert, abfiltriert und getrocknet.

Es resultierte Να,Κ^,ϊϊω -Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-leucyl-L-glutamyl (κ -tert · -butylester) -L-glutamylfy -tert · butylester)-N£-tert«-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl (j/-tert»-butylester)-L-arginyl(hydrobromid)-L-asparaginyl-Ήί—tert·—butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert·- butylester (i2-22a).

Äusb. 1,94 g (85 fo d.Th.).

chromatographisch rein in n-Heptan/tert.-Butanol/Essigsäure (3:2:1) und n-Butanol/Essigsäure/Wasser (3 s 1 s 1)

Aminosäureanalyse: Lys 2,02 Arg 2,01 Asp 1,00 GIu 3,98

GIy 1,01 Leu 1,00

1,8 g Peptid in 500 ml Methanol wurden unter Zutropfen von 15,70 ml 0,1 K-Bromwasserstoffsäure bei pH 4,5 durch katalytische Hydrierung entacyliert. Das vom Katalysator befreite FiItrat wurde i.V. eingedampft und der erhaltene Rückstand wurde aus Methanol/Essigsäureäthylester umgefällt.

7098U/1ö7t

Es resultierte L-ArginylihydrobromidJ-L-leucyl-L-glutamyl (^-tert.-butylester)-L-glutamyl(^-tert.-butylester)-N£- tert · -butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl (jf-tert · -butylest er ) -L-arginyl (hydrobromid) -L-asparaginyl-ΙΤε -tert·- butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutainin-tert · -butylest er-hydrobromid-Dihydrat (12-22b)·

Ausb. 1,61 g (98 # d.Ih.)

Analyse ber./gef. C 47,12/47,20; H 7,43/7,50; N 14,07/14,00

C. Kondensation (I-II-III) mit IV

1,56 g Peptid (i2-22b) und 0,87 g Peptid (9-11) in 100 ml Dimethylformamid wurden nach Zusatz von 0,105 ml Triäthylamin mit 0,210 g N-Hydroxybenzotriazol· und 0,320 g Dicyclohexylcarbodiimid wie unter (B) beschrieben kondensiert.

Es resultierte N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl(^-tert.-butylester)-L-leucyl-L-glutaminyl-L-arginyl(hydrobromid)-L-leucyl-L-glutamyl (j( -tert · -butylest er ) -L-glutamyl( ^-tert · butylester)-H£-tert·-butyloxycarbonyl-I-lysyl-L-glutamyl (^-tert.-butylester)-L-arginyl(hydrobromid)-L-asparaginyl-Νε-tert·-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert·- butylester- Dihydrat (9-22a).

Ausbeute 1,6 g (83 # d.Th.)

Analyse: ber./gef. G 51,41/51,28; H 7,57/7,55; N 13,63/13,57

Br 6,22/6,15

1,6 g Peptid (9-22a) in 600 ml Methanol wurden unter Eonstanthaltung des pH-Werts wie unter (B) beschrieben durch katalytisch^ Hydrierung entacyliert. Das vom Katalysator be-

709814/1077

freite Filtrat wurde i.V. eingedampft und der Rückstand wurde aus Methanol/Essigsäureäthylester umgefällt.

Es resultierte L-Glutamyl^-tert·—butylester)-L-leucyl--L-glutaminyl-L-arginyl(hydrobromid) -L-leucyl-L-glutamyl ( ^-tert .-butylester)-L-glutamyl( v-tert. -butylester )-N£- tert·-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl Qf -tert·-butylester )-L-arginyl(hydrobromid)-L-asparaginyl-Nfc-tert·-butyl-oxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert·-butylester-hydrobromid-Tetrahydrat (9-22b). Ausb. 1,5 g (96 £ d.Th.)
[a]S⁰= -5,3+1 und Ca]^₆ = - 7,2° (c = 0,7; in Methanol)

chromatographisch rein in n-Butanol/Essigsäure/Wasser (3 : 1 : 1)

Aminosäureanalyse: Lys 2,04 Arg 2,01 Asp 0,98 Gin 6,05

GIy 1,01 Leu 2,00

D. Kondensation V mit VI

Gemäß Hauptpatent wurden 21,6 g Fragment VI und 6,9 g N-Hydroxysuccinimid in 400 ml Dimethylformamid bei -5⁰C mit 6,3 g U,ir^f-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stdn. lang bei O⁰G und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Filtration wurde das Filtrat i.V. eingedampft; der ölige Rückstand kristallisierte aus Isopropanol.

Es resultierte tert.Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoleucyl-L-phenylalanin-N-hydroxysuccinimidester,

Ausbeute 21,3 g (88 % d.Th.)

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F = 190-192°; [α]ρ = + 59,28° (c = 1,0; in Dioxan)

12,2 g Fragment V und 3,8 ml Triäthylamin in 400 ml Dimethylformamid wurden mit 14,8 g des obigen, aus Fragment VI gewonnenen Succinimidesters versetzt; das Reaktionsgemisch wurde nach 24-stündigem Rühren bei Raumtemperatur i.V. eingedampft und der ölige Rückstand wurde zwischen Essigester und Zitronensäurelösung verteilt. Die Essigesterphase wurde in üblicher bekannter Weise gewaschen, getrocknet und i.V. zur Trockene gebracht. Aus Essigester/Petroläther wurden farblose Kristallenen aus tert»Butyloxycarbonyl-L -phenyl alanyl-L -valyl-L -pr olyl-L -i s öl eucyl-L -phenylalanyl-O-tert · butyl-L-threonyl-0-tert · butyl -L-tyrosylglycin (1-8) erhalten.

Ausb. 18,2 g (87 fo d.Th.)

[a]l° = - 44,0° (c = 1,0; in Äthanol)

E. Kondensation (I-II-III-IV) mit (V-Vl)

1,28 g Peptid (9-22b) gemäß (C), 1,17 g Peptid (1-8) gemäß (D), 0,07 ml Triäthylamin und 0,115 g N-Hydroxysuccinimid/in 100 ml Dimethylformamid wurden bei — 10 mit 0,206 g li,lT^t-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Tage lang bei O⁰C und 3 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels i.V. wurde der Rückstand sorgfältig mit heißem Essigester digeriert, das harzartige Produkt aus Methanol/Essigester umgefällt, nach Verreiben mit Essigester getrocknet und danach 5 Stdn. lang erschöpfend mit Wasser behandelt. Es wurde aus Methanol/Wasser umgefällt·

/ (bzw. in weiteren Versuchen 0,20 g F-Hydroxybenzotriazol)

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Es resultierte N-tert.-Butyl oxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoleueyl-L-phenylalanyl-O-tert·-butyl-L-threonyl-O-tert · -butyl-L-tyrosyl-glycyl-L-glutamyl (ytert·-butyle sterJ-L-leucyl-L-glutaminyl-L-arginyl(hydrobromid) -L-I eucyl-L -glutamyl ()(-tert · -butylester ) -L-glutamyl (j( -tert · -butylester) -Nt -tert · -butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl (^-tert.-butylest er)-L-arginyl(hydrobromid) -L-asparaginyl-N£-tert·-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert·-butylester-Hexahydrat (1-22a).

Ausb. 1,65 g (91 $ d.Th.)

Analyse: ber./gef. C 54,03/54,13; H 7,82/7,80,· N 12,68/12,67;

Br 4,38/4,6

1 g geschütztes Peptid (i-22a) gemäß (E) wurde mit 40 ml eiskalter Trifluoressigsäure Übergossen und 2 Stdn. lang bei Raumtemperatur stehen gelassen. Danach wurde überschüssige Trifluoressigsäure i.V. bei möglichst tiefer Temperatur entfernt, das verbleibende Material in verdünnter Essigsäure aufgenommen, die erhaltene Lösung zweimal mit 4 g eines schwach basischen Anionenaustauschers in der / .-Form (z. B. "Dowex 44") behandelt, worauf das Austauscher-Eluat lyophilisiert wurde.

Es resultierte L-Phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoleucyl-L-phenylalanyl-L—threonyl-L-tyrosyl-glycyl—L—glutamyl -L-leucyl-L-glutaminyl-L-arginyl-L-leucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-lysyl-L-glutamyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-lysylgly cyl-L -glut amin ·

Ausb. 0,74 g

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Beispiel 8 Reindarstellung und Aminosäureanalyse

Gemäß Hauptpatent erfolgte die Reinigung in Anlehnung an die Reindarstellung von natürlichem Motilin durch Ionenaustausch-Chromatographie mit Hilfe eines stark basischen Anionenaustauscherharzes, z. B. des in der Acetatform vorliegenden, unter der Bezeichnung "QAE-Sephadex A-25" bekannten Harzes auf der Basis eines modifizierten Dextrans mit Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylresten als funktionelle Gruppen, und danach mit Hilfe eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, z· B. des in der Ammoniumform vorliegenden, unter der Bezeichnung "SP-Sephadex C-25" bekannten Harzes auf der Basis eines modifizierten Dextrans mit Sulfopropylresten als funktionellen Gruppen.

Eine Aminosäureanalyse wurde nach saurer Hydrolyse (6F-HCl) durchgeführt, wobei sich zeigte, daß praktisch dieselben Werte bei 20 und bei 72 Std. Hydrolysezeit erzielt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I aufgeführt.

lys Arg Asp Thr GIu Pro GIy VaI He

Tabelle	I	berechnet
gefunden		2
2,00		2
1,93		1
1,00		1
0,97		6
6,18		1
0,98		2
1,99		1
0,90		1
0,90

709814/1077

Portsetzung Tabelle

1,94	2
0,93	1
1,82	2

gefunden berechnet

Leu Tyr Phe

Die biologische Aktivität des gefriergetrockneten L-Leucin-13-Motilins war praktisch, gleich derjenigen des L-Forleucin-13-Motilins und unterschied sich somit kaum von derjenigen des natürlichen Motilins.

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Leerseite

Claims

Patentansprüche

1. L-Leucin-13-Motilin der Formel

H-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gln-(D (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9)(1O)(11) Arg-Leu-Glu-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln-OH

2· Verfahren zur Herstellung von L-Leucin-13-Motilin nach Anspruch 1 gemäß deutschem Patent Nr. 2 315 271 durch

(a) separaten Aufbau der miteinander verknüpfbaren Teilsequenzen

Fragment I bestehend aus Arginyl(hydrobromid)-asparaginyl-NE-tert·butyloxycarbonyl-lysyl-glycyl-glutamin-tert· butylester (Aminosäuren 18 - 22),

Fragment II bestehend aus Na-Benzyloxycarbonyl-glutamyl-(jf -tert. butylester )-glutamyl-(^-tert. butylester )-N<£- tert·butyloxycarbonyl-lysyl-glutaminsäure-^-tert·butylester (Aminosäuren 14 - 17)»

Fragment III bestehend aus der IT-endständig einen Η"α,1ϊ<5,1Τω -Tris-benzyloxycarbonyl-arginylrest aufweisenden Aminosäure 13 (Aminosäuren 12 - 13)»

Fragment IV bestehend aus Fa-Benzyloxycarbonyl-glutamyl— (v-tert.butylesterj-leucyl-glutamin (Aminosäuren 9 - 11)»

Fragment V'bestehend aus 0-tert.Butyl-threonyl-O-tert· butyl-tyrosyl-glycin (Aminosäuren 6-8) und

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_ 2 —

Fragment VI "bestehend aus Να-tert. butyloxycarbonylphenylalanyl-valyl-prolyl-isoleucyl-phenylalanin (Aminosäuren 1-5),

in denen alle Seitenkettenfunktionen der polyfunktionellen Aminosäuren acidolytisch leicht abspaltbare Schutzgruppen auf tert. Butylalkohol-Basis tragen und die komplexe Punktion des Arginins entweder durch NJ, ο -Diacylierung oder durch Protonisierung durch Salzbildung mit Bromwasserstoff maskiert ist,

(b) Verknüpfung der Fragmente I bis VI mit Hilfe des bekannten N,N^f-Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Verfahrens oder einer bekannten Modifikation desselben,

(c) Abspaltung aller Schutzgruppen aus dem erhaltenen, allseits maskierten, die Gesamtsequenz der Aminosäuren 1 - 22 aufweisenden Polypeptid mit Hilfe von Trifluoroessigsäure,

(d) Entfernung der bei der Abspaltung der Schutzgruppen gebildeten Trifluoroeeeiacetat- und Bromidionen mit Hilfe eines Anionenaustauscherharzes, und

(e) Isolierung und Reinigung des erhaltenen rohen Motilinderivats,

dadurch gekennzeichnet, daß man als das die Aminosäureteilsequenz (12 - 13) bildende Fragment III Na,Nei,Nu) -Trisbenzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-leucin aufbaut und weiterverarbeitet.

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284*348

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Fragmente I, II, IV, V und VI gemäß Hauptpatent und das Fragment III dadurch herstellt, daß L-Leucin (Aminosäure 13) mit Hilfe von ϊία,Νί,Ν^-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginin-N-hydroxysuccinimidester (Aminosäure 12) aminoacyliert wird.

4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Verknüpfung der Fragmente I bis VI zunächst Fragment I mit Fragment II nach dem bekannten Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Verfahren verknüpft und die erhaltene Verbindung durch katalytische Hydrogenolyse in den Glutamyl-(^-tert. butylester )-glutamyl-(^-tert. butylester )-N£-tert· butyloxycarbonyl-lysyl-glutamyl-(% -tert ·butylester)-arginyl-(hydrobromid) -asparaginyl-Nt-tert. butyl oxycarbonyl-lysylglycyl—glutamin-tert.butylester (Aminosäuren 14 - 22) überführt,

danach an die erhaltene Verbindung das Fragment III nach dem bekannten Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxy-succinimid-Verfahren ankondensiert und aus der erhaltenen Verbindung die drei Benzyloxyearbonyl-Schutzgruppen entfernt durch katalytische Hydrierung unter Neutralisation der frei werdenden Cruanido-Funktion des Arginins mit Bromwasserst off säure unter Bildung des Hydrobromids von Arginyl(hydrobromid)-leucyl— glutamyl-Q-tert.butylester)-glutamyl-(^-tert.butylester)-N£-tert · butyl oxycarbonyl-lysyl-glutamyl-( ^-tert · butylester)-arginyl-(hydrobromid)-asparaginyl-N£-tert· butyl oxy—carbonyllysyl-glycyl-glutamin-tert.butylester (Aminosäuren 12 - 22),

danach an die erhaltene Verbindung das Fragment IV nach dem bekannten Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinimid- oder —Hydroxybenzotriazol-Verfahren ankondensiert und die erhaltene Verbindung durch hydrogenolytische Abspaltung der Benzyl oxy carbonyl -Schutzgruppe in Glut amyl-(^-t ert. butylester )-1 eucyl-glut aminyl-arginyl ( hy dr obr omid ) -no rl eucyl-glut amyl-

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(^-tert.butylester)-glutamyl-()(-tert.butylester)-H£-tert. butyloxycarbonyl-lysyl-glutamyl-i^-tert.butylesiEcO-arginyl-(hydrobromidJ-asparaginyl-Nd-tert.butyloxycarbonyl-lysylglycyl-glutamin-tert.butylester (Aminosäuren 9-22) überführt und in Form des Hydrobromids und Tetrahydrats isoliert,

danach die erhaltene Verbindung nach dem bekannten Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Verfahren mit dem Reaktionsprodukt aus der Umsetzung des Fragments V mit dem Fragment VI, das zuvor in den (iT-Hydroxysuccinimid)-ester überführt worden war, verknüpft, und

schließlich aus der erhaltenen Verbindung (Aminosäuren 1-22) alle Schutzgruppen mit Hilfe von Trifluoressigsäure abspaltet.

5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die bei der Abspaltung der Schutzgruppen gebildeten Trifluoroacetat- und Bromidionen säulenchromatographisch austauscht an einem schwach basischen Anionenaustauscherliarz vom Typ des unter der Bezeichnung "Dowex 44" bekannten Ionenaustauschers.

6. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das L-Leucin-13-Motilin säulenchromatographisch reinigt an einem stark basischen Anionenaustauscherharz vom Typ des unter der Bezeichnung "QAE-Sephadex A-25" bekannten Ionenaustauschers und danach an einem stark sauren Kationenaustauscherharz vom Typ des unter der Bezeichnung "SP-Sephadex C-25" bekannten Ionenaustauschers.

7. Mittel mit Motilinwirkung, gekennzeichnet durch einen Gehalt an L-Leucin-13-Motilin nach Anspruch 1 als wirksame Komponente.

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