CH615904A5

CH615904A5 - Process for the preparation of L-leucine-13-motilin

Info

Publication number: CH615904A5
Application number: CH547476A
Authority: CH
Inventors: Erich Prof Dr Wuensch; Gerhard Dr Wendlberger; Ernst Dr Jaeger
Original assignee: Max Planck Gesellschaft
Priority date: 1975-10-03
Filing date: 1976-04-30
Publication date: 1980-02-29
Also published as: IT1068299B; GB1507243A; JPS5246068A; FR2326202B2; DE2544348C3; SU593659A3; DE2544348A1; FR2326202A2; DE2544348B2

Description

Die Erfindung betrifft eine Verbesserung und weitere Ausgestaltung des Hauptpatents, aus dem ein Verfahren zur Herstellung von L-Norleucin-13-Motilin bekannt ist, welches sich von dem natürlich vorkommenden Motilin dadurch unterscheidet, dass es als 13. von insgesamt 22 die Polypeptidkette aufbauenden Aminosäuren statt eines L-Methioninrestes der Formel The invention relates to an improvement and further development of the main patent, from which a process for the production of L-norleucine-13-motiline is known, which differs from the naturally occurring motiline in that it is the 13th of a total of 22 amino acids that build up the polypeptide chain instead of an L-methionine residue of the formula

-nh-ch-co- -nh-ch-co-

» »

ch_ ch_

1 2 1 2

ch0 ch0

I 1 I 1

s einen L-Norleucinrest der Formel s an L-norleucine residue of the formula

-nh-ch-co-Ì -nh-ch-co-Ì

ch0 I 2 ch0 I 2

ch„ ch "

I 2 I 2

ch_ ch_

I 2 ch3 I 2 ch3

enthält. Das synthetische Motilinderivat hat praktisch die gleiche biologische Aktivität wie das natürliche Motilin (vgl. J. C. Brown in Demling et al. «Die Oberbaucheinheit — The Upper Gastro-Intestinal Tract, a Functional Entity », Schattauer Verlag, Stuttgart —New York, 1974, Seiten 11—13). contains. The synthetic motilin derivative has practically the same biological activity as the natural motilin (cf. JC Brown in Demling et al. “Die Oberbaucheinheit - The Upper Gastro-Intestinal Tract, a Functional Entity”, Schattauer Verlag, Stuttgart — New York, 1974, pages 11-13).

Es wurde nun gefunden, dass entsprechend vorteilhafte Ergebnisse erzielbar sind, wenn in 13-Stellung des Motilins statt des L-Norleucinrestes ein L-Leucinrest der Formel It has now been found that correspondingly advantageous results can be achieved if, in the 13-position of the motiline, an L-leucine residue of the formula instead of the L-norleucine residue

-NH-GH-CO- -NH-GH-CO-

I I.

CH« CH «

I * I *

CH-CH, CH-CH,

I 3 I 3

eingebaut wird. Gegenüber dem bekannten Norleucin-Motilin hat das Leucin-Motilin den Vorteil, dass es bei gleich guter biologischer Aktivität mit geringerem Kostenaufwand hergestellt werden kann, weil L-Leucin billiger ist als L-Norleucin, und dass es im Körper besonders leicht abgebaut wird, weil L-Leucin eine am Proteinaufbau massgebend beteiligte, natürlich vorkommende Aminosäure ist. is installed. Compared to the well-known norleucine motilin, leucine motilin has the advantage that it can be produced at a lower cost with the same good biological activity, because L-leucine is cheaper than L-norleucine, and that it is particularly easily broken down in the body because L-leucine is a naturally occurring amino acid that plays a key role in protein building.

Motilin ist bekanntlich ein die motorische Aktivität sowohl in den Antrum- als auch in den Fundus-Drüsenarealen des Magens stimulierendes Polypeptid, das aus der Duodenal-schleimhaut des Dünndarms von Schweinen isoliert wurde (vgl. z. B. «Can. J. Physiol. Pharmacol.», Bd. 49, 1971, Seiten 399—405, «Gastroenterology», Bd. 62, 1972, Seiten 401 bis 404 und «Can. J. Biochem.», Bd. 51, 1973, Seiten 533 bis 537), die Pepsinausschüttung ohne eine Änderung der ^-Sekretion stimuliert, und sich sowohl chemisch als auch physiologisch von den inzwischen aufgeklärten gastrointestinalen Hormonen unterscheidet. Dem Motilin kommt daher sowohl als Therapeutikum als auch als Diagnostikum eine besondere Bedeutung zu, da mit seiner Hilfe z. B. eine gesteuerte Pepsinausschüttung, beispielsweise mit dem Ziele der Bestimmung oder Isolierung des Pepsins oder der Regulierung des Pepsinspiegels, sowie eine gezielte Antikörperbildung bewirkt werden kann. As is known, motilin is a polypeptide which stimulates motor activity in both the antral and fundus gland areas of the stomach and has been isolated from the duodenal mucosa of the small intestine of pigs (cf., for example, «Can. J. Physiol. Pharmacol. ", Vol. 49, 1971, pages 399-405," Gastroenterology ", Vol. 62, 1972, pages 401 to 404 and" Can. J. Biochem. ", Vol. 51, 1973, pages 533 to 537) , which stimulates pepsin release without changing the ^ secretion, and is chemically and physiologically different from the gastrointestinal hormones that have now been elucidated. The Motilin is therefore of particular importance both as a therapeutic and as a diagnostic, since with its help z. B. a controlled release of pepsin, for example with the aim of determining or isolating pepsin or regulating the level of pepsin, and targeted antibody formation can be effected.

Die ursprüngliche Strukturaufklärung des Motilins ergab die Aminosäuresequenz -Met-Glu-Glu- in 13-14-15-Stellung, die an dem dem Hauptpatent zugrunde liegenden Prioritätstag als zutreffend angesehen wurde. Inzwischen wurde über eine Korrektur dieser Aminosäuresequenz berichtet, wonach in 14-Stellung Glutamin statt Glutaminsäure vorliegen soll, so dass obige Teilsequenz -Met-Gln-Glu- heissen müsste (vgl. «Can. J. Biochem.» Bd. 52, 1974, Seiten 7—8). Demnach wäre das aus dem Hauptpatent bekannte Motilinderivat mit 13-L-Norleucin-14-desamido-Motilin und das nunmehr beanspruchte Motilinderivat mit 13-L-Leucin-14-desamido-Motilin zu bezeichnen. Solange jedoch nicht mit Sicherheit feststeht, dass weitere Korrekturen der Aminosäuresequenz überflüssig sind, werden die bisherigen Bezeichnungen L-Norleucin-13-Motilin und L-Leucin-13-Motilin für die in 14-Stellung einen Glutaminsäurerest aufweisenden Motilinderivate beibehalten, noch The original structure of motilin revealed the amino acid sequence -Met-Glu-Glu- in the 13-14-15 position, which was considered to be correct on the priority date on which the main patent is based. In the meantime, a correction of this amino acid sequence has been reported, according to which glutamine should be present in the 14-position instead of glutamic acid, so that the above partial sequence should be called Met-Gln-Gluhe (see “Can. J. Biochem.” Vol. 52, 1974, Pages 7-8). Accordingly, the motiline derivative known from the main patent with 13-L-norleucine-14-desamido-motilin and the now claimed motilin derivative with 13-L-leucine-14-desamido-motilin would be designated. However, as long as it is not certain that further corrections to the amino acid sequence are superfluous, the previous names L-norleucine-13-motiline and L-leucine-13-motiline for the motiline derivatives having a glutamic acid residue in the 14-position will still be used

5 5

10 10th

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20 20th

25 25th

30 30th

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40 40

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dazu, wo sich gezeigt hat, dass die Amidgruppe in der Seitenkette der 14-Glutaminsäure auf die biologische Aktivität keinen Einfluss hat (vgl. z. B. die rechte Spalte von Seite 8 der oben genannten Druckschrift «Can. J. Biochem.», Bd. 52, 1974). where it has been shown that the amide group in the side chain of 14-glutamic acid has no influence on the biological activity (see, for example, the right column on page 8 of the above-mentioned publication "Can. J. Biochem.", Vol. 52, 1974).

Gemäss Hauptpatent wurde das bei allen Naturstoffen bestehende Problem, dass die Isolierung aus beispielsweise tierischen Organen unerhört zeit- und kostenaufwendig ist und nur in minimalen Ausbeuten gelingt, dadurch gelöst, dass eine Totalsynthese des Motilins durchgeführt wurde unter Ersatz des in 13-Stellung befindlichen Methioninrestes durch einen Norleucinrest, aus der Überlegung heraus, dass nach dem heutigen Stand der Peptidsynthese die mittelständige Arginyl-methionyl-Bindung (Aminosäuren 12 und 13 des Motilins) praktisch kaum synthetisierbar ist, anderseits jedoch das dem Motilin entsprechende Norleucin-13-Dokosapeptid auf synthetischem Wege leichter zugänglich ist, eine vergleichsweise rasche Strukturermittlung gewährleistet und wichtige Aufschlüsse über die biologische Wirkungsspezifität des Methio-nins zu geben vermag. According to the main patent, the problem with all natural products that isolation from animal organs, for example, is incredibly time-consuming and costly and can only be achieved in minimal yields, was achieved by carrying out a total synthesis of motiline, replacing the methionine residue in the 13-position with a norleucine residue, based on the consideration that, according to the current state of peptide synthesis, the medium-sized arginyl-methionyl bond (amino acids 12 and 13 of motiline) is practically hardly synthesizable, but on the other hand the norleucine-13 docosapeptide corresponding to motilin is easier to synthesize is accessible, a comparatively quick structure determination is guaranteed and is able to provide important information about the biological effects specificity of methionine.

Das in hohen Ausbeuten vollsynthetisch hergestellte L-Nor-leucin-13-Motilin besitzt nach der Reinigung praktisch die gleiche Aktivität wie natürlich vorkommendes Motilin, was als Indiz dafür anzusehen ist, dass der Sequenzplatz des Methio-nins auch von Norleucin eingenommen werden kann. Dieser Befund war insofern überraschend, als der Ersatz von Methio-nin durch Norleucin in natürlich vorkommendem Human-Gastrin I zu einem Syntheseprodukt führt, das nur etwa 10% Gastrin-Aktivität besitzt. After purification, L-nor-leucine-13-motiline, which is fully synthetically produced in high yields, has practically the same activity as naturally occurring motilin, which is an indication that the sequence position of methionine can also be taken by norleucine. This finding was surprising in that the replacement of methionine with norleucine in naturally occurring human gastrin I leads to a synthesis product which has only about 10% gastrin activity.

Gemäss vorliegender Erfindung wird eine weitere Verbesserung dadurch erzielt, dass ein gleich vorteilhaftes Motilinderivat wie nach dem Hauptpatent zur Verfügung gestellt wird, das jedoch billiger herstellbar und biologisch leichter abbaubar ist. According to the present invention, a further improvement is achieved in that an equally advantageous motilin derivative is made available as in the main patent, but which is less expensive to produce and more readily biodegradable.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von L-Leucin-13-Motilin gemäss Hauptpatent Nr. 602 598, dadurch gekennzeichnet, dass man ein im Hauptpatent definiertes Peptid erzeugt, worin in 13-Stellung ein Leucin statt Norleucin verwendet wird. Das L-Leucin-13-Motilin hat die Kurzformel The invention relates to a process for the preparation of L-leucine-13-motiline according to main patent no. 602 598, characterized in that a peptide defined in the main patent is produced, in which a leucine is used in the 13-position instead of norleucine. The L-leucine-13-motiline has the short formula

H-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr—Tyr-Gly-Glu-Leu-GIn-Arg- H-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr — Tyr-Gly-Glu-Leu-GIn-Arg-

(1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) (1) (2) (3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12)

Leu-Glu-Glu-Lys-Glu-Arg—Asn-Lys-Gly-Gln-OH (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22) Leu-Glu-Glu-Lys-Glu-Arg — Asn-Lys-Gly-Gln-OH (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22 )

worin die in Klammern angegebenen Zahlen die von 1 bis 22 durchnumerierte Stellung der Aminosäurereste (ausser Glycin alle Aminosäuren in L-Konfiguration) in der Peptidkette angeben und worin die Bezeichnung der Aminosäurereste in üblicher bekannter Weise abgekürzt ist. in which the numbers given in brackets indicate the position of the amino acid residues numbered from 1 to 22 (apart from glycine, all amino acids in the L configuration) in the peptide chain and in which the name of the amino acid residues is abbreviated in the usual known manner.

Das Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man die Teilsequenzen The process is characterized in that the partial sequences

Fragment I, bestehend aus Arginyl-(hydrobromid)-aspara-ginyl-Ne-tert.-butyloxy-carbonyl-lysyl-glycyl-glutamin-tert.-butylester (Aminosäuren 18—22), Fragment I, consisting of arginyl (hydrobromide) asparaginyl-Ne-tert-butyloxy-carbonyl-lysyl-glycyl-glutamine-tert-butyl ester (amino acids 18-22),

Fragment II, bestehend aus Na-Benzyloxycarbonyl-glut-amyl-(y-tert.-butylester)-glutamyl (y-tert.-Butylester)-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-lysyl-glutaminsäure-y-tert.-butylester (Aminosäuren 14-17), Fragment II, consisting of Na-benzyloxycarbonyl-glutamyl- (y-tert-butyl ester) -glutamyl (y-tert-butyl ester) -Ne-tert-butyloxycarbonyl-lysyl-glutamic acid-y-tert-butyl ester ( Amino acids 14-17),

Fragment III, bestehend aus Na-Benzyloxycarbonyl-Nó ,Nw -di-benzyloxycarbonyl-arginyl-leucin (Aminosäuren 12-13), Fragment III, consisting of Na-benzyloxycarbonyl-Nó, Nw -di-benzyloxycarbonyl-arginyl-leucine (amino acids 12-13),

Fragment IV, bestehend aus Nß-Benzyloxycarbonyl-Glut-amyl-(y-tert.-butylester)-leucyl-glutamin (Aminosäuren 9-11), Fragment IV, consisting of Nß-benzyloxycarbonyl-glutamyl- (y-tert-butyl ester) -leucyl-glutamine (amino acids 9-11),

Fragment V, bestehend aus O-tert.-Butyl-threonyl-O-tert.-butyltyrosyl-glycin (Aminosäuren 6-8) und Fragment V, consisting of O-tert-butyl-threonyl-O-tert-butyltyrosyl-glycine (amino acids 6-8) and

Fragment VI, bestehend aus Na-tert.-butyloxycarbonyl-phenylalanyl-valyl-propyl-isoleucyl-phenylalanin (Aminosäuren 1-5), Fragment VI, consisting of Na-tert-butyloxycarbonyl-phenylalanyl-valyl-propyl-isoleucyl-phenylalanine (amino acids 1-5),

in denen alle Seitenkettenfunktionen der polyfunktionellen Aminosäuren leicht abspaltbare Gruppen tragen und die komplexen Funktionen des Argins entweder durch Nó,o»-Diacylie-rung oder durch eine durch Salzbildung mit Bromwasserstoff bewirkte Protonierung maskiert ist, kondensiert, die Schutzgruppen abspaltet und das rohe L-Leucin-13-Motilin isoliert. in which all side chain functions of the polyfunctional amino acids carry easily cleavable groups and the complex functions of argin are masked either by Nó, o »-diacylation or by protonation caused by salt formation with hydrogen bromide, condenses, cleaves the protecting groups and the crude L-leucine -13-Motilin isolated.

Die Reinigung des erhaltenen L-Leucin-13-Motilin erfolgt analog dem Verfahren des Hauptpatentes vorteilhaft säulen-chromatographisch an einem stark basischen Anionenaus-tauscherharz und danach an einem stark sauren Kationenaustauscherharz. The L-leucine-13-motiline obtained is advantageously column-chromatographically analogously to the process of the main patent on a strongly basic anion exchange resin and then on a strongly acidic cation exchange resin.

Die Anwendung dieses Mittels erfolgt in der Regel in solchen Dosierungen, dass pro kg Körpergewicht etwa 0,05-0,5 y, entsprechend 50—500 ng Motilinderivat, entfallen. Als Trägermittel dient vorwiegend physiologische Kochsalzlösung. Die Applikation ist intravenös, intramuskulär oder subkutan. So kann z. B. lyophylisiertes Motilinderivat je nach beabsichtigter Applikation in Mengen von 1-100 ylml physiologische Kochsalzlösung, die z. B. durch Mannit stabilisiert werden kann, gelöst werden. Zur intravenösen Verabreichung an einen etwa 80 kg schweren Menschen ergeben 2 ml Injektionslösung, die 8 y Motilinderivat enthalten, eine Dosierung von 0,1 yl kg Körpergewicht. Zur Infusion an einen Menschen des angegebenen Gewichts können 8 y Motilinderivat in 30 ml physiologischer Kochsalzlösung gelöst und 0,5 ml dieser Lösung pro Minute appliziert werden, was etwa 0,1 y Motilinderivat/kg Körpergewicht/Std. entspricht. Im Tierversuch erwiesen sich vergleichbare Dosierungen als geeignet, und so wurde z. B. natürlich vorkommendes Motilin in Mengen von 0,05 ylkg Körpergewicht intravenös an Hunde verabreicht, wodurch ein kräftiger motorischer Aktivitätsanstieg bewirkt wurde (vgl. z. B. die angegebene Druckschrift «Can. J. Biochem.», 51 [1973], 533, linke Spalte, Absatz 1). This agent is usually used in such doses that about 0.05-0.5 y, corresponding to 50-500 ng of motilin derivative, is omitted per kg of body weight. Mainly physiological saline is used as a carrier. The application is intravenous, intramuscular or subcutaneous. So z. B. lyophilized Motilinderivat depending on the intended application in amounts of 1-100 ylml physiological saline, the z. B. can be stabilized by mannitol. For intravenous administration to a person weighing approximately 80 kg, 2 ml of solution for injection containing 8 y motilin derivative gives a dosage of 0.1 yl kg body weight. For infusion into a human of the specified weight, 8 y motilin derivative can be dissolved in 30 ml of physiological saline and 0.5 ml of this solution applied per minute, which is about 0.1 y motilin derivative / kg body weight / hour. corresponds. Comparable dosages have been found to be suitable in animal experiments. B. Naturally occurring Motilin in amounts of 0.05 ylkg body weight administered intravenously to dogs, which caused a strong increase in motor activity (see, for example, the specified publication "Can. J. Biochem.", 51 [1973], 533 , left column, paragraph 1).

Zur Herstellung des Leucin-13-Motilins konnte der für das Norleucin-13-Motilin entworfene Syntheseplan herangezogen werden. Die Synthese der Fragmente I, II, IV, V und VI erfolgte daher nach dem im Hauptpatent beschriebenen Verfahren, ebenso wie die Kondensation der Fragmente I und II zur Teilsequenz (14-22b) sowie der Fragmente V und VI zur Teilsequenz (1-8). For the production of leucine-13-motiline, the synthesis plan designed for norleucine-13-motiline could be used. The synthesis of fragments I, II, IV, V and VI was therefore carried out according to the method described in the main patent, as was the condensation of fragments I and II to the partial sequence (14-22b) and fragments V and VI to the partial sequence (1-8 ).

Das Fragment III (Aminosäuren 12—13) mit C-endständi-gem Leucin wurde synthetisiert und mit der kondensierten Peptidfraktion I—II (14—22b) umgesetzt zur kondensierten Peptidfraktion I—II-III (12-22a), woraus nach hydrogenoly-tischer Abspaltung der Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe das entsprechende Undecapeptid (12-22b) in Form des Hydro-bromids isoliert wurde. Die weitere Umsetzung mit Fragment IV (9-11) lieferte die kondensierte Peptidfraktion I-II-III-IV (9—22a), welche durch katalytische Hydrogenolyse in Gegenwart von Bromwasserstoffsäure zum Hydrobromid des Tetra-decapeptids (9—22b) entacyliert und schliesslich kondensiert wurde mit der kondensierten Peptidfraktion V-VI (1-8) zum vollkommen geschützten Verfahrensprodukt I-II-III-IV-V-VI (1—22a), aus dem schliesslich nach Entfernung der Schutzgruppen mittels Trifluoressigsäure und nachfolgender Ionenaustauscherbehandlung und Lyophilisation das gewünschte Leucin-13-Motilin (1—22b) als Rohprodukt erhalten wurde. The fragment III (amino acids 12-13) with C-terminal leucine was synthesized and converted with the condensed peptide fraction I-II (14-22b) to the condensed peptide fraction I-II-III (12-22a), from which hydrogenol- The corresponding undecapeptide (12-22b) was isolated in the form of the hydrobromide after the benzyloxycarbonyl protective group had been split off. Further reaction with fragment IV (9-11) yielded the condensed peptide fraction I-II-III-IV (9-22a), which was deacylated by catalytic hydrogenolysis in the presence of hydrobromic acid to the hydrobromide of tetra-decapeptide (9-22b) and finally condensation was carried out with the condensed peptide fraction V-VI (1-8) to the completely protected process product I-II-III-IV-V-VI (1-22a), from which the protective groups were removed by means of trifluoroacetic acid and subsequent ion exchange treatment and lyophilization desired leucine-13-motilin (1-22b) was obtained as a crude product.

Die Erfindung wird durch die beigefügte Zeichnung näher erläutert, in der darstellen: The invention is explained in more detail by the accompanying drawing, in which:

Fig. 1 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments I, 1 shows the synthesis scheme for the production of fragment I,

Fig. 2 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments II, 2 shows the synthesis scheme for the production of fragment II,

Fig. 3 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments VI, 3 shows the synthesis scheme for the production of fragment VI,

Fig. 4 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments III sowie zur Verknüpfung der Fragmente I + II + III und Fig. 4 shows the synthesis scheme for the production of fragment III and for linking fragments I + II + III and

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

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Fig. 5 das Syntheseschema zur Herstellung des Fragments IV sowie zur Verknüpfung der Fragmente IV mit (I—III), VI mit V und (I-IV) mit (V-VI). Fig. 5 shows the synthesis scheme for the preparation of fragment IV and for linking fragments IV with (I-III), VI with V and (I-IV) with (V-VI).

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. In den Figuren und Beispielen werden die folgenden, in der Peptidchemie üblichen Abkürzungen und Symbole verwendet: The following examples are intended to explain the invention in more detail. The following abbreviations and symbols, which are common in peptide chemistry, are used in the figures and examples:

Aminosäureabkürzungen, gebildete aus 3 Buchstaben, bei denen es sich in der Regel um die 3 Anfangsbuchstaben handelt, Amino acid abbreviations made up of 3 letters, which are usually the 3 first letters,

Zahlenangaben in Klammern, die die Stellung innerhalb der Polypeptidkette wiedergeben, und die keinen weiteren Zusatz erhalten, wenn die betreffende Verbindung kein weiteres Derivat bildet, die jedoch fortlaufend mit dem Zusatz a, b, c usw. versehen werden, wenn von a ausgehend weitere Derivate hergestellt werden, Numbers in brackets which represent the position within the polypeptide chain and which do not receive any further addition if the compound in question does not form another derivative, but which are continuously provided with the addition a, b, c etc., if further derivatives starting from a getting produced,

L als Angabe der Konfiguration, L as an indication of the configuration,

Z für den Benzyloxycarbonylrest (vgl. z. B. Z for the benzyloxycarbonyl radical (cf. e.g.

Bergmann et al. in «Berichte d. Dtsch. Chem. Ges.» Bd. 65, 1932, 1192ff.), BOC für den tert.-Butyloxycarbonylrest (vgl. z. B. Bergmann et al. in «Reports d. German Chem. Ges. » Vol. 65, 1932, 1192ff.), BOC for the tert-butyloxycarbonyl radical (cf. e.g.

McKay et al. in «J. Am. Chem. Soc.» Bd. 79, 1957, S. 4686 und Anderson et al. in «J. Am. Chem. Soc.» Bd. 79,1957, S. 6180), McKay et al. in «J. At the. Chem. Soc. » 79, 1957, p. 4686 and Anderson et al. in «J. At the. Chem. Soc. » 79.1957, p. 6180),

DCCD für das N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid-Ver- DCCD for the N, N'-dicyclohexylcarbodiimide process

fahren (vgl. z. B. Sheehan et al. in «J. Am. Chem. Soc.» Bd. 77,1955, S. 1067), DCCD/HOSU für das N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hy-droxysuccinimid-Verfahren (vgl. z. B. Wünsch et al. in «Berichte d. Deutschen Chem. Ges.» Bd. 99,1966, S. 110 und Weygand et al. in «Zeitschr. f. Naturforschg.» Bd. 216, 1966, S. 426 sowie König et al. in «Berichte d. Dtsch. Chem. Ges.» Bd. 103, 1970, S. 788), DCCD/HOBt für das N,N-Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hy-droxybenzotriazol-Verfahren (vgl. z. B. König et al. in «Ber. d. Dtsch. Chem. Ges.»"Bd. 103, 1970, S. 788), drive (cf. e.g. Sheehan et al. in "J. Am. Chem. Soc." Vol. 77, 1955, p. 1067), DCCD / HOSU for the N, N'-dicyclohexylcarbodiimide-N-Hy- droxysuccinimide method (cf., for example, Wünsch et al. in "Reports of the German Chem. Ges." Vol. 99, 1966, p. 110 and Weygand et al. in "Zeitschr. f. Naturforschg." Vol. 216, 1966, p. 426 and Koenig et al. In “Reports of Dtsch. Chem. Ges.” Vol. 103, 1970, p. 788), DCCD / HOBt for the N, N-dicyclohexylcarbodiimide-N-Hy- droxybenzotriazole process (see, for example, Koenig et al. in "Ber. d. Dtsch. Chem. Ges." "Vol. 103, 1970, p. 788),

PAM für die Phosphorazo-Methode (vgl. z. B. PAM for the phosphorazo method (see e.g.

Goldschmidt in «Angew. Chem.» Bd. 62, 1950, S. 538 und Goldschmidt et al. in «Liebigs Ann.» Bd. 580, 1953, S. 68), SU für den N-Hydroxysuccinimidrest, Goldschmidt in «Angew. Chem. » Vol. 62, 1950, p. 538 and Goldschmidt et al. in "Liebigs Ann." 580, 1953, p. 68), SU for the N-hydroxysuccinimide residue,

NP für den p-Nitrophenylrest, NP for the p-nitrophenyl radical,

tBu für den tert.-Butylrest, tBu for the tert-butyl radical,

DBSI für Dibenzolsulfimid als Salzbildner, DBSI for dibenzene sulfimide as salt former,

Me für den Methylrest, Me for the methyl residue,

TFE für Trifluoressigsäure, TFE for trifluoroacetic acid,

i.V. für «im Vakuum», i.V. for «in vacuum»,

Ausb. für Ausbeute, Educ. for yield,

d.Th. (nach Ausbeuteangaben in %) für «der i.e. the (according to yield data in%) for «der

Theorie», Theory",

F für «Fliesspunkt» und F for «floating point» and

(Z) (nach der Fliesspunktangabe) für «unter (Z) (after the pour point) for «under

Zersetzung». Decomposition".

Im folgenden wird zunächst die Herstellung der für die Synthese verwendeten Fragmente beschrieben. The production of the fragments used for the synthesis is first described below.

Herstellung des Fragments I (Teilsequenz 18—22) Preparation of fragment I (partial sequence 18-22)

Gemäss Hauptpatent wurde H-Gln-OtBu (22b), das aus Z-Gln-OH (22a) durch Veresterung mit Essigsäure-tert.-butylester unter Schwefelsäure-Katalyse und nachfolgender hydrogenolytischer Entfernung der Benzyloxycarbonyl-Schutz-gruppe hergestellt worden war, mit Z-Gly-OSU (21) zum Benzyloxycarbonyl-Dipeptidester (21—22a) verknüpft; die nach hydrogenolytischer Entfernung der N-Schutzgruppe erhaltene Verbindung H-Gly-Gln-OtBu (21-22b) wurde mit According to the main patent, H-Gln-OtBu (22b), which had been prepared from Z-Gln-OH (22a) by esterification with tert-butyl acetate with sulfuric acid catalysis and subsequent hydrogenolytic removal of the benzyloxycarbonyl protective group, was also used Z-Gly-OSU (21) linked to the benzyloxycarbonyl dipeptide ester (21-22a); the compound H-Gly-Gln-OtBu (21-22b) obtained after hydrogenolytic removal of the N-protecting group was also used

Z-Asn-Lys(BOC)-OH (19—20) nach dem von Wünsch und Weygand in den genannten Literaturstellen beschriebenen N,N'-Carbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Verfahren oder nach dessen von König et al. in der angegebenen Literaturstelle beschriebenen Modifikationen zum Benzyloxycarbonyl-tetrapeptid-tert.-butylester (19-22a) verknüpft. Die verwendete Kopfkomponente (19-20) wurde durch Aminoacylie-rung von H-Lys(BOC)-OH (20) mit Z-Asn-ONP (19) unter üblichen bekannten Bedingungen gewonnen. Z-Asn-Lys (BOC) -OH (19-20) according to the N, N'-carbodiimide-N-hydroxysuccinimide method described by Wünsch and Weygand in the cited references or according to that described by Koenig et al. modifications to the benzyloxycarbonyl-tetrapeptide-tert-butyl ester (19-22a) described in the cited literature reference are linked. The head component (19-20) used was obtained by aminoacylation of H-Lys (BOC) -OH (20) with Z-Asn-ONP (19) under customary known conditions.

Aus Z-Asn-Lys(BOC)-Gly-Gln-OtBu (19-22a) wurde die Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppe durch katalytische Hydrierung entfernt unter Bildung des Tetrapeptid-Ester-Derivats (19-22b), das mit Z-Arg(ó,co-Z2)-ONP (18) zum Z-Arg-(ó,w-Z2)-Asn-Lys(BOC)-Gly-Gln-OtBu (18—22a) vereinigt wurde. The benzyloxycarbonyl protecting group was removed from Z-Asn-Lys (BOC) -Gly-Gln-OtBu (19-22a) by catalytic hydrogenation to give the tetrapeptide ester derivative (19-22b), which was treated with Z-Arg (ó , co-Z2) -ONP (18) to form Z-Arg- (ó, w-Z2) -Asn-Lys (BOC) -Gly-Gln-OtBu (18-22a).

Die experimentelle Durchführung war wie folgt: The experimental procedure was as follows:

A. L-Glutamin-tert.-butylester-dibenzolsuIfimidsalz 103 g Benzyloxycarbonyl-glutamin-tert.-butylester (erhalten nach dem von Schnabel et al. in «Liebigs Ann.», Bd. 686, 1965, S. 229 beschriebenen Verfahren) in 2 1 Methanol wurden unter Zutropfen von 91 g Dibenzolsulfimid in 500 ml Methanol bei pH = 3,5 in üblicher bekannter Weise katalytisch (Palladiumschwarz) hydriert. A. L-glutamine-tert-butyl ester-dibenzene sulfimide salt 103 g of benzyloxycarbonyl-glutamine-tert-butyl ester (obtained by the method described by Schnabel et al. In "Liebigs Ann.", Vol. 686, 1965, p. 229) in 2 l of methanol were hydrogenated catalytically (palladium black) with the dropwise addition of 91 g of dibenzenesulfimide in 500 ml of methanol at pH = 3.5.

Das Filtrat wurde i. V. eingedampft, zum Schluss unter azeotroper Destillation mit Benzol; aus der Essigesterlösung des öligen Rückstandes trat beim Versetzen mit Diäthyläther Kristallisation ein. Aus Methanol/Diäthyläther resultierten Kristalle von F = 135-136°; [a]D20 = + 10,78° (c = 1,0; in Methanol). Ausb. = 146 g (97% d. Th.). The filtrate was i. V. evaporated, finally with azeotropic distillation with benzene; crystallization from the ethyl acetate solution of the oily residue occurred upon addition with diethyl ether. Crystals of F = 135-136 ° resulted from methanol / diethyl ether; [a] D20 = + 10.78 ° (c = 1.0; in methanol). Educ. = 146 g (97% of theory).

B. Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester 115 g L-Glutamin-tert.-butylester-dibenzolsulfimidsalz suspendiert in 800 ml Dichlormethan wurden mit 32,2 ml Tri-äthylamin und danach mit 70,5 g Benzyloxycarbonyl-glycin-N-hydroxysuccinimidester unter Rühren versetzt. 24 Std. Rühren bei Raumtemperatur, Einengen i.V., Aufnehmen des Öls in Essigester, Waschen dieser Lösung wie üblich mit Zitronensäure-, Kaliumhydrogencarbonatlösung und Wasser, Trocknen über Natriumsulfat und Eindampfen i.V. führten zu einem Öl. Ausb. = 87 g (93% d. Th.). B. Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-glutamine tert-butyl ester 115 g of L-glutamine tert-butyl ester-dibenzenesulfimide salt suspended in 800 ml of dichloromethane were treated with 32.2 ml of triethylamine and then with 70.5 g of benzyloxycarbonyl-glycine -N-hydroxysuccinimide ester added with stirring. Stirring at room temperature for 24 hours, evaporating down in vacuo, taking up the oil in ethyl acetate, washing this solution as usual with citric acid, potassium hydrogen carbonate solution and water, drying over sodium sulfate and evaporating down in vacuo. resulted in an oil. Educ. = 87 g (93% of theory).

C. Glycyl-L-glutamin-tert.-butylester-dibenzolsulfimidsalz 80 g Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester (gem. B.) in 900 ml Methanol wurden, wie unter A beschrieben, hydrogenolytisch entacyliert (60 g Dibenzolsulfimid) und aufgearbeitet. Es resultierte ein öliger Rückstand, der beim Verreiben mit Petroläther kristallisierte; F = 92° (Z); [a]D20 = -8,5° (c = 1,0; in Methanol). Ausb. = 110 g (98% d. Th.). C. Glycyl-L-glutamine-tert.-butyl ester-dibenzenesulfimide salt 80 g of benzyloxycarbonyl-glycyl-L-glutamine-tert.-butyl ester (according to B.) in 900 ml of methanol were deacylated by hydrogenolysis as described under A (60 g Dibenzenesulfimide) and worked up. The result was an oily residue which crystallized on trituration with petroleum ether; F = 92 ° (Z); [a] D20 = -8.5 ° (c = 1.0; in methanol). Educ. = 110 g (98% of theory).

D. Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin 51g Ne-tert.-Butyloxycarbonyl-L-lysin wurden in üblicher bekannter Weise in das Benzyltriäthylammoniumsalz übergeführt und danach in 700 ml Dimethylformamid mit 81 g Ben-zyloxycarbonyl-L-asparagin-4-nitrophenylester unter Zugabe von 1 Äquiv. Pyridin 48 Std. lang bei 20° gerührt. Der Vakuumverdampfungsrückstand wurde mit Essigester und Kaliumhydrogensulfatlösung gleichzeitig behandelt; der gebildete dicke Niederschlag wurde abfiltriert und dann aus Äthanol/ Petroläther umkristallisiert. F = 174—175° (Z); [a]D20 = + 13,8° (c = 1,0; in Pyridin). Ausb. = 70 g (71% d. Th.). D. Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-Nf-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine 51 g of Ne-tert-butyloxycarbonyl-L-lysine were converted into the benzyltriethylammonium salt in a conventional manner and then in 700 ml of dimethylformamide with 81 g of benzyloxycarbonyl -L-asparagin-4-nitrophenyl ester with the addition of 1 equiv. Pyridine stirred at 20 ° for 48 hours. The vacuum evaporation residue was treated with ethyl acetate and potassium hydrogen sulfate solution at the same time; the thick precipitate formed was filtered off and then recrystallized from ethanol / petroleum ether. F = 174-175 ° (Z); [a] D20 = + 13.8 ° (c = 1.0; in pyridine). Educ. = 70 g (71% of theory).

E. Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-Ne-tert.-butyloxy- E. Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-Ne-tert-butyloxy-

carbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester 61,5 g Glycyl-L-glutamin-tert.-butylester-dibenzolsulfimid-salz und 54,5 g Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-Ne-tert.- carbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamine tert-butyl ester 61.5 g glycyl-L-glutamine tert-butyl ester dibenzenesulfimide salt and 54.5 g benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-Ne-tert.-

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

«0 «0

65 65

5 5

615 904 615 904

butyloxycarbonyl-L-lysin in 700 ml Dimethylformamid wurden unter Rühren bei 0° C zunächst mit 15,5 ml Triäthylamin und nach 15 Min. mit 13 g N-Hydroxysuccinimid sowie 23 g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Nach 3 Std. wurde weitere 24 Std. bei Raumtemperatur gerührt. Das Filtrat vom N,N'-Di-cyclohexylharnstoff wurde i.V. eingedampft; der Rückstand kristallisierte beim Behandeln mit Essigester. Umkristallisiert wurde aus Methanol/Wasser und Isopropanol/Essigester. F = 155-156°; [a]D20 = -20,8° (c = 1,0; in Äthanol). Butyloxycarbonyl-L-lysine in 700 ml of dimethylformamide was initially mixed with stirring at 0 ° C. with 15.5 ml of triethylamine and after 15 minutes with 13 g of N-hydroxysuccinimide and 23 g of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide. After 3 hours, the mixture was stirred at room temperature for a further 24 hours. The filtrate from the N, N'-di-cyclohexylurea was i.V. evaporated; the residue crystallized when treated with ethyl acetate. The product was recrystallized from methanol / water and isopropanol / ethyl acetate. F = 155-156 °; [a] D20 = -20.8 ° (c = 1.0; in ethanol).

Ausb. = 63 g (78% d. Th.). Educ. = 63 g (78% of theory).

F. L-Asparaginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester-hydrochlorid 47,5 g Benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-Ne-tert.-butyl-oxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester (gem. E) in 800 ml Methanol wurden unter Konstanthaltung des pH-Werts wie üblich hydriert (pH = 5,5; 25,2 ml 2,5 N-Chlor-wasserstofflösung in Methanol). Das i. V. eingedampfte Filtrat ergab ein Öl; farbloses Pulver entstand nach Verreiben mit Diäthyläther. F = 98°, [a]D20 = +9,5° (c = 1,0 in Methanol). Ausb. = 40 g (97% d. Th.). F. L-asparaginyl-Ne-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamine-tert-butyl ester hydrochloride 47.5 g benzyloxycarbonyl-L-asparaginyl-Ne-tert.-butyl-oxycarbonyl-L- Lysyl-glycyl-L-glutamine tert-butyl ester (according to E) in 800 ml of methanol was hydrogenated as usual while keeping the pH constant (pH = 5.5; 25.2 ml of 2.5 N-chlorine hydrogen solution in methanol). The I. V. evaporated filtrate gave an oil; colorless powder was formed after trituration with diethyl ether. F = 98 °, [a] D20 = + 9.5 ° (c = 1.0 in methanol). Educ. = 40 g (97% of theory).

G. Na,Nó,Ncj-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-asparaginyl-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl- G. Na, Nó, Ncj-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-asparaginyl-Nf-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-

L-glutamin-tert.-butylester 31,9 g L-Asparaginyl-Nf -tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester-hydrochlorid (gem. F) und 33,68 g Na,Nó,Nw-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginin-N-hy-droxysuccinimidester in 11 Dimethylformamid wurden bei 0° C mit 7 ml Triäthylamin versetzt; nach 24stündigem Rühren bei Raumtemperatur, Eindampfen i. V., Umfällen des Rückstandes aus Methanol/Wasser und danach Umkristallisieren aus Methanol resultierte ein farbloses Pulver; [cc]d20 = -7,6° (c = 1,0; in Eisessig). Ausb. = 46,5 g (80% d. Th.). L-glutamine tert-butyl ester 31.9 g L-asparaginyl-Nf -tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamine tert.-butyl ester hydrochloride (according to F) and 33.68 g Na, Nó, Nw-tris-benzyloxycarbonyl-L-arginine-N-hy-hydroxysuccinimide ester in 11 Dimethylformamide was mixed with 0 ml of triethylamine at 0 ° C; after stirring for 24 hours at room temperature, evaporating i. V., reprecipitation of the residue from methanol / water and then recrystallization from methanol resulted in a colorless powder; [cc] d20 = -7.6 ° (c = 1.0; in glacial acetic acid). Educ. = 46.5 g (80% of theory).

H. L-Arginyl(hydrobromid) -L-asparaginyl-Ne -tert. -butyloxy-carbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester-hydrobromid-dihydrat 45,5 g Na,Nó,Nai-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-asparaginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glut-amin-tert.-butylester (gem. G) in 1,5 1 Dimethylformamid/ Methanol (2:1) wurden unter Konstanthaltung des pH-Werts in üblicher bekannter Weise hydrogenolytisch entacyliert (pH = 1,5; 80 ml 1 N-Bromwasserstoffsäure). Eindampfen des Filtrats i. V. und Umfällen des Rückstandes aus Äthanol/ Diäthyläther führte zu einem amorphen Pulver: [a]D20 = —4,8° (c = 1,0; in 80%iger Essigsäure). Ausb. = 37 g (98% d. Th.). H. L-arginyl (hydrobromide) -L-asparaginyl-Ne -tert. -butyloxy-carbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamine-tert.-butyl ester-hydrobromide dihydrate 45.5 g Na, Nó, Nai-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-asparaginyl-Ne-tert.- butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamine-tert.-butyl ester (in accordance with G) in 1.5 l of dimethylformamide / methanol (2: 1) were hydrogenolytically deacylated while maintaining the pH in a customary known manner ( pH = 1.5; 80 ml of 1 N-hydrobromic acid). Evaporation of the filtrate i. V. and reprecipitation of the residue from ethanol / diethyl ether resulted in an amorphous powder: [a] D20 = —4.8 ° (c = 1.0; in 80% acetic acid). Educ. = 37 g (98% of theory).

Ausbeute 55 % über alle Stufen, bezogen auf H-Gln-OtBu (22b) als Startmaterial; Yield 55% over all stages, based on H-Gln-OtBu (22b) as starting material;

[«1d20 = -7,6 ±1° bzw. [a]S4620 = -9,4° (c = 1; in Essigsäure); [«1d20 = -7.6 ± 1 ° or [a] S4620 = -9.4 ° (c = 1; in acetic acid);

chromatographisch rein in n-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1 und n-Heptan/tert.-Butanol/Eisessig 5:1:1 ; chromatographically pure in n-butanol / glacial acetic acid / water 3: 1: 1 and n-heptane / tert-butanol / glacial acetic acid 5: 1: 1;

Analyse: Analysis:

ber.: C 57,98 H 6,69 N 13,29 O 22,02 gef.: C 57,70 H 6,56 N 13,29 O 22,45 Durch nachfolgende Entfernung der drei Benzyloxy-carbo-nyl-Maskierungen durch katalytische Hydrogenolyse unter Zusatz von zwei Äquivalenten Bromwasserstoff wurde das gewünschte Fragment I, nämlich H-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-Gly-Gln-OtBu-HBr (18—22b), erhalten. calc .: C 57.98 H 6.69 N 13.29 O 22.02 found: C 57.70 H 6.56 N 13.29 O 22.45 by subsequent removal of the three benzyloxy-carbonyl masks The desired fragment I, namely H-Arg (HBr) -Asn-Lys (BOC) -Gly-Gln-OtBu-HBr (18-22b), was obtained by catalytic hydrogenolysis with the addition of two equivalents of hydrogen bromide.

Ausbeute: 98%; [a]D20 = —4,8 ±1° bzw. [a]54620 =-6,05° (c = 1 ; in 80%iger Essigsäure); Yield: 98%; [a] D20 = —4.8 ± 1 ° or [a] 54620 = -6.05 ° (c = 1; in 80% acetic acid);

chromatographisch rein in n-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1 und tert.-Amylalkohol/Pyridin/Wasser 35:35:30; Analyse: chromatographically pure in n-butanol / glacial acetic acid / water 3: 1: 1 and tert-amyl alcohol / pyridine / water 35:35:30; Analysis:

ber.: C 40,21 H 6,85 N 16,12 Br 1672 gef.: C 40,46 H 6,93 N 15,89 Br 16,51 calc .: C 40.21 H 6.85 N 16.12 Br 1672 found: C 40.46 H 6.93 N 15.89 Br 16.51

Herstellung des Fragments II (Teilsequenz 14-17) Gemäss Hauptpatent wurden Z-Lys(BOC)-OSU (16) und H-Glu(OtBu)-OMe (17) ohne Schwierigkeiten zum Benzyl-oxycarbonyl-dipeptidester (16-17a) vereinigt. Die nachfolgende alkalische Esterverseifung und anschliessende katalytische Entacylierung führte über das Dipeptid-Derivat (16-17b) zu H-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-OH (16-17c). Diese Verbindung wurde zweimal nacheinander mit Z-Glu(OtBu)-OSU (15 bzw. 14) umgesetzt, wobei jeweils das Glutaminsäurederivat als Kopfkomponente verwendet wurde. Auf diese Weise wurde das Fragment II, nämlich Z-Glu(OtBu)-Glu-(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-OH (14-17a) erhalten. • Die experimentelle Durchführung erfolgte in analoger Weise wie bei der Herstellung des Fragments I beschrieben. Preparation of Fragment II (Partial Sequence 14-17) According to the main patent, Z-Lys (BOC) -OSU (16) and H-Glu (OtBu) -OMe (17) were combined without difficulty to give the benzyloxycarbonyl dipeptide ester (16-17a) . The subsequent alkaline ester saponification and subsequent catalytic deacylation led to H-Lys (BOC) -Glu (OtBu) -OH (16-17c) via the dipeptide derivative (16-17b). This compound was reacted twice in succession with Z-Glu (OtBu) -OSU (15 and 14), the glutamic acid derivative being used as the top component in each case. In this way, fragment II, namely Z-Glu (OtBu) -Glu- (OtBu) -Lys (BOC) -Glu (OtBu) -OH (14-17a) was obtained. • The experimental procedure was carried out in an analogous manner to that described for the preparation of fragment I.

Ausbeute: 48% über alle Stufen, bezogen auf H-Glu(OtBu)-OMe (17); F = 147-149°; Yield: 48% over all stages, based on H-Glu (OtBu) -OMe (17); F = 147-149 °;

Md20 = -9,8 ±1° bzw. [«W20 = 12,3° (c = 1; in Dimethylformamid) ; Md20 = -9.8 ± 1 ° or [«W20 = 12.3 ° (c = 1; in dimethylformamide);

chromatographisch rein in Cyclohexan/Chloroform/Eis-essig 45:45:10; chromatographically pure in cyclohexane / chloroform / glacial acetic acid 45:45:10;

Analyse: Analysis:

ber.: C 59,02 H 7,86 N 7,48 gef.: C 58,70 H 8,04 N 7,72 calc .: C 59.02 H 7.86 N 7.48 found: C 58.70 H 8.04 N 7.72

Herstellung des Fragments III (Teilsequenz 12-13) Zur Herstellung von N« ,Nó ,Nai -Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-leucin wurden 30 g Z-Arg(ó,w-Z2)-OSU (12) und 11,6 g Leucin (13) in Dioxan/Wasser (1000:500 ml) Preparation of fragment III (partial sequence 12-13) 30 g of Z-Arg (ó, w-Z2) -OSU (12) and. Were used to prepare N «, Nó, Nai-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-leucine 11.6 g leucine (13) in dioxane / water (1000: 500 ml)

nach Zugabe von 89 ml N-Natriumhydroxidlösung unter 18stündigem Rühren umgesetzt. Nach Zusatz von 89 ml N-Salzsäure wurde das Reaktionsgemisch in Essigsäureäthylester aufgenommen, die erhaltene Lösung mit verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel i.V. entfernt. Der Rückstand wurde aus Wasser/Äthanol und Essigsäureäthylester/Diäthyläther/ Petroläther umgefällt. after adding 89 ml of N-sodium hydroxide solution with stirring for 18 hours. After addition of 89 ml of N-hydrochloric acid, the reaction mixture was taken up in ethyl acetate, the solution obtained was washed with dilute hydrochloric acid and water, dried over sodium sulfate and the solvent i.V. away. The residue was reprecipitated from water / ethanol and ethyl acetate / diethyl ether / petroleum ether.

Ausbeute: 26,6 g (86,6% d. Th.); F = 126-128°; [a]D20 = —5,8 ±1° bzw. [a]s4620 = —7,1°. (c = 1; in Essigsäure); Yield: 26.6 g (86.6% of theory); F = 126-128 °; [a] D20 = - 5.8 ± 1 ° or [a] s4620 = - 7.1 °. (c = 1; in acetic acid);

chromatographisch rein in n-Heptan/tert.-Butanol/Essig-säure (5:1:1); chromatographically pure in n-heptane / tert-butanol / acetic acid (5: 1: 1);

Analyse: Analysis:

ber.: C 62,69 H 6,28 N 10,15 gef.: C 62,59 H 6,41 N 9,94 Aminosäureanalyse: Arg 1,00 Leu 1,00. calc .: C 62.69 H 6.28 N 10.15 found: C 62.59 H 6.41 N 9.94 amino acid analysis: Arg 1.00 Leu 1.00.

Herstellung des Fragments IV (Teilsequenz 9-11) Gemäss Hauptpatent wurde das nach dem in «Berichte d. Dtsch. Chem. Ges.», Bd. 104, 1971, S. 2430 beschriebenen Verfahren synthetisierte Dipeptid H-Leu-Gln-OH als Sequenzteilstück (10—11) verwendet und mit Z-Glu(OtBu)-OSU (9) in 74%iger Ausbeute zum Fragment IV, nämlich Z-Glu-(OtBu)-Leu-Gln-OH (9-11), umgesetzt. Production of Fragment IV (Partial Sequence 9-11) According to the main patent, this was carried out according to the method described in «Reports d. German Chem. Ges. », Vol. 104, 1971, p. 2430, synthesized the dipeptide H-Leu-Gln-OH synthesized as a sequence section (10-11) and used with Z-Glu (OtBu) -OSU (9) in 74% yield to fragment IV, namely Z-Glu- (OtBu) -Leu-Gln-OH (9-11), implemented.

Die experimentelle Durchführung erfolgte in analoger Weise wie bei der Herstellung des Fragments I beschrieben. The experimental procedure was carried out in an analogous manner to that described for the preparation of fragment I.

F = 146-148° ; [a]D20 = -31,6 ± 1° bzw. [al54620 = -38,1° (c = Ì; in Methanol); F = 146-148 °; [a] D20 = -31.6 ± 1 ° or [al54620 = -38.1 ° (c = Ì; in methanol);

chromatographisch rein in n-Heptan/tert.-Butanol/Eisessig 5:1:1 und n-Butanol/Eisessig/Wasser 3:1:1; chromatographically pure in n-heptane / tert-butanol / glacial acetic acid 5: 1: 1 and n-butanol / glacial acetic acid / water 3: 1: 1;

Analyse: Analysis:

ber.: C 58,12 H 7,32 N 9,68 gef.: C 58,05 H 7,24 N 9,48 calc .: C 58.12 H 7.32 N 9.68 found: C 58.05 H 7.24 N 9.48

Herstellung des Fragments V (Teilsequenz 6-8) Production of fragment V (partial sequence 6-8)

(gemäss Hauptpatent) (according to main patent)

Das nach dem in «Zeitschr. f. Physiol. Chem.», Bd. 353, 1972, Seite 1246 beschriebene Verfahren synthetisierte Dipeptid H-Tyr(tBu)-Gly-OH wurde als Sequenzteilstück (7—8) verwendet. Verknüpfung von H-Tyr(tBu)-Gly-OH (7-8) mit That after the in «Zeitschr. f. Physiol. Chem. », Vol. 353, 1972, page 1246 described methods synthesized dipeptide H-Tyr (tBu) -Gly-OH was used as a sequence section (7-8). Linking H-Tyr (tBu) -Gly-OH (7-8) with

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

615 904 615 904

Z-Thr(tBu)-OSU (6) lieferte das Benzyloxycarbonyl-tripep-tid (6-8a), das durch katalytische Hydrogenolyse das gewünschte Fragment V, nämlich H-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH (6-8b) ergab. Z-Thr (tBu) -OSU (6) gave the benzyloxycarbonyl tripep-tid (6-8a), which, by catalytic hydrogenolysis, gave the desired fragment V, namely H-Thr (tBu) -Tyr (tBu) -Gly-OH ( 6-8b) resulted.

Ausbeute: ca. 81 % über beide Stufen, bezogen auf eingesetztes Dipeptid (7—8); F = 126-127°; Yield: approx. 81% over both stages, based on the dipeptide used (7-8); F = 126-127 °;

[«1d20 = +7.9 ± 1° bzw. [a]s4620 = +8,9° (c = 1; in Methanol); [«1d20 = +7.9 ± 1 ° or [a] s4620 = + 8.9 ° (c = 1; in methanol);

chromatographisch rein in tert.-Amylalkohol/Pyridin/ Wasser 35:35:30; chromatographically pure in tert-amyl alcohol / pyridine / water 35:35:30;

Analyse: Analysis:

ber.: C 60,88 H 8,30 N 8,88 calc .: C 60.88 H 8.30 N 8.88

gef.: C 60,69 H 8,31 N 8,91 bezogen auf ein Dipeptid mit V4 Mol Kristall-Essigester. Found: C 60.69 H 8.31 N 8.91 based on a dipeptide with V4 mol crystal ethyl acetate.

Herstellung des Fragments VI (Teilsequenz 1-5) Preparation of fragment VI (partial sequence 1-5)

(gemäss Hauptpatent) (according to main patent)

Nach dem angegebenen Carbodiimid-Verfahren wurde Z-Ile-OH (4) mit H-Phe-OtBu (5) verknüpft. Durch anschliessende katalytische Hydrogenolyse des intermediären Benzyloxycarbonyl-Dipeptid-Esters (4-5a) konnte H-IIe-Phe-OtBu (4-5b) in über 90%iger Ausbeute isoliert werden. Z-Ile-OH (4) was linked to H-Phe-OtBu (5) by the carbodiimide method given. Subsequent catalytic hydrogenolysis of the intermediate benzyloxycarbonyl dipeptide ester (4-5a) enabled H-IIe-Phe-OtBu (4-5b) to be isolated in over 90% yield.

Gleichzeitig wurden BOC-Val-OH (2a) und H-Pro-OMe (3a) nach der angegebenen Phosphorazo-Methode zum tert.-Butyloxycarbonyl-Dipeptid-Ester (2-3a) vereinigt; nachfolgende alkalische Esterverseifung ergab in über 70%iger Ausbeute BOC-Val-Pro-OH (2-3b). Einfacher und in hoher Ausbeute (83 %) verlief die Herstellung von (2-3b) durch Umsetzung von BOC-Val-OSU (2b) mit zwei Äquivalenten Prolin (3b). At the same time, BOC-Val-OH (2a) and H-Pro-OMe (3a) were combined to the tert-butyloxycarbonyl dipeptide ester (2-3a) according to the specified phosphorazo method; Subsequent alkaline ester hydrolysis gave BOC-Val-Pro-OH (2-3b) in over 70% yield. The preparation of (2-3b) was easier and in high yield (83%) by reacting BOC-Val-OSU (2b) with two equivalents of proline (3b).

Beide Dipeptid-Derivate Hessen sich mit Hilfe der angegebenen Carbodiimid-Methode zum BOC-Val-Pro-Ile-Phe-OtBu, (2—5a) verknüpfen; Trifluoressigsäure-Einwirkung auf (2—5a) führte zum freien Tetrapeptid H-Val-Pro-Ue-Phe-OH (2—5b), an das in üblicher bekannter Weise BOC-Phe-OSU (1) zum BOC-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-OH (l-5a) (Fragment VI) angebaut wurde. Both dipeptide derivatives are linked using the carbodiimide method given to form the BOC-Val-Pro-Ile-Phe-OtBu, (2-5a); Trifluoroacetic acid exposure to (2-5a) led to the free tetrapeptide H-Val-Pro-Ue-Phe-OH (2-5b), on which BOC-Phe-OSU (1) in the usual known manner leads to BOC-Phe-Val -Pro-Ile-Phe-OH (1-5a) (fragment VI) was grown.

Ausbeute: 63% über die letzten drei Stufen, bezogen auf (4—5b); F = 218°; Yield: 63% over the last three stages based on (4-5b); F = 218 °;

[«1d20 = 64,2 ±1° bzw. [als4620 = -75,82° (c = 1; in Essigsäure); [«1d20 = 64.2 ± 1 ° or [als4620 = -75.82 ° (c = 1; in acetic acid);

ber.: C 64,88 H 7,64 N 9,70 calc .: C 64.88 H 7.64 N 9.70

gef.: C 64,72 H 7,70 N 9,61 Found: C 64.72 H 7.70 N 9.61

Beispiel 1 example 1

Kondensation der Fragmente I bis VI (Gesamtsequenz 1—22) Condensation of fragments I to VI (total sequence 1-22)

Mit dem carboxylendständigen Fragment I (18-22b) wurde mit Hilfe des angegebenen Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hy-droxysuccinimid-Verfahrens das Fragment II (14-17a) durch Kondensation vereinigt und der erhaltene N-Benzyloxycarbo-nyl-nonapeptid-tert.-butylester (14—22a) wurde durch katalytische Hydrogenolyse in H-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-Gly-Gln-OtBu (14—22b) überführt. With the carboxyl-terminated fragment I (18-22b), fragment II (14-17a) was combined by condensation with the aid of the indicated dicyclohexylcarbodiimide-N-hydroxysuccinimide method and the N-benzyloxycarbonyl-nonapeptide tert-butyl ester obtained (14-22a) was obtained by catalytic hydrogenolysis in H-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Lys (BOC) -Glu (OtBu) -Arg (HBr) -Asn-Lys (BOC) -Gly-Gln-OtBu ( 14-22b).

Die Vereinigung mit Fragment III wiederum mit Hilfe des genannten Verfahrens führte zur Bildung von Z-Arg(<3,&>-Z2)-Leu-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Arg-(HBr)-Asn-Lys(BOC)-Gly-Gln-OtBu (12-22a). The combination with fragment III again with the aid of the mentioned method led to the formation of Z-Arg (<3, &> - Z2) -Leu-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Lys (BOC) -Glu (OtBu) - Arg- (HBr) -Asn-Lys (BOC) -Gly-Gln-OtBu (12-22a).

Durch katalytische Hydrierung wurden aus dem Unde-capeptid (12—22a) die drei Benzyloxycarbonyl-Schutzgruppen entfernt und durch Neutralisation der freigewordenen Guanido- The three benzyloxycarbonyl protective groups were removed from the unde-capeptide (12-22a) by catalytic hydrogenation and by neutralization of the released guanido

Funktion mit Bromwasserstoffsäure während der Hydrierung resultierte H-Arg(HBr)-Leu-Glu(OtBu)-Blu(OtBu)-Lys-(BOC)-Glu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-Gly-Gln-OtBu (12—22b) in Form des Hydrobromids. Function with hydrobromic acid during the hydrogenation resulted in H-Arg (HBr) -Leu-Glu (OtBu) -Blu (OtBu) -Lys- (BOC) -Glu (OtBu) -Arg (HBr) -Asn-Lys (BOC) -Gly -Gln-OtBu (12-22b) in the form of the hydrobromide.

Der erhaltene Undecapeptidester wurde mit Fragment IV (9—11) nach dem angegebenen Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxybenzotriazol-Verfahren durch Kondensation vereinigt, und aus dem erhaltenen Tetradecapeptid-Derivat (9-22a) wurde nach hydrogenolytischer Abspaltung der Benzyloxy-carbonyl-Schutzgruppe H-Glu(OtBu)-Leu-Gln-Arg(HBr)-Leu-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Arg-(HBr)-Asn-Lys(BOC)-Gly-Gln-OtBu (9—22b) erhalten. The undecapeptide ester obtained was combined with fragment IV (9-11) according to the specified dicyclohexylcarbodiimide-N-hydroxybenzotriazole method by condensation, and the tetradecapeptide derivative (9-22a) obtained after hydrogenolytic cleavage of the benzyloxycarbonyl protective group H- Glu (OtBu) -Leu-Gln-Arg (HBr) -Leu-Glu (OtBu) -Glu (OtBu) -Lys (BOC) -Glu (OtBu) -Arg- (HBr) -Asn-Lys (BOC) -Gly -Gln-OtBu (9-22b) obtained.

Während des Ablaufs vorstehender Reaktionen wurden die Fragmente V (6—8a) und VI (1—5a), letzteres nach Überführung in den (N-Hydroxysuccinimid)-ester (l-5b), vereinigt. Es gelang jedoch nicht, BOC-Phe-Val-Pro-Ue-Phe-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-OH (1—8) rein zu gewinnen, und die Aminosäureanalyse zeigte eine Verunreinigung mit etwa 10% (l-5a) oder (1—5b) an. Versuche zur Auftrennung dieses Gemisches verliefen ohne Erfolg. During the course of the above reactions, fragments V (6-8a) and VI (1-5a), the latter after being converted into the (N-hydroxysuccinimide) ester (1-5b), were combined. However, BOC-Phe-Val-Pro-Ue-Phe-Thr (tBu) -Tyr (tBu) -Gly-OH (1-8) could not be obtained in pure form, and amino acid analysis showed an impurity of about 10% ( 1-5a) or (1-5b). Attempts to separate this mixture have been unsuccessful.

Das erhaltene «rohe» Teilstück (1-8) wurde mit dem obigen Teilstück (9-22b) wiederum nach dem angegebenen Dicyclohexylcarbodiimid-N-Hydroxysuccinimid-Verfahren zum BOC-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr(tBu)-Tyr(tBu)-Gly-Glu(OtBu)-Leu-Gln-Arg(HBr)-Leu-Glu(OtBu)-Glu(OtBu); Lys(BOC)-Glu(OtBu)-Arg(HBr)-Asn-Lys(BOC)-Gly-Gln-OtBu (1—22a) verknüpft. The obtained "raw" section (1-8) was again with the above section (9-22b) according to the specified dicyclohexylcarbodiimide-N-hydroxysuccinimide method for BOC-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr (tBu) - Tyr (tBu) -Gly-Glu (OtBu) -Leu-Gln-Arg (HBr) -Leu-Glu (OtBu) -Glu (OtBu); Lys (BOC) -Glu (OtBu) -Arg (HBr) -Asn-Lys (BOC) -Gly-Gln-OtBu (1-22a).

Nach Abspaltung aller Schutzgruppen mittels wasserfreier Trifluoressigsäure und anschliessendem Austausch der Tri-fluoracetat- und Bromidionen durch Ionenaustauschchromato-graphie an einem unter der Bezeichnung «Dowex 44» bekannten, schwach basischen Ionenaustauscherharz (Acetat-Form) wurde ein «Roh-Leucin-13-Motilin» (1—22b) erhalten, das aufgrund des Einsatzes von «unreinem» Teilstück (1-8) mit einer «Fehlsequenz» behaftet sein musste, was sich bei der Reinigungsoperation auch bestätigte. After cleavage of all protective groups using anhydrous trifluoroacetic acid and subsequent exchange of the trifluoroacetate and bromide ions by ion exchange chromatography on a weakly basic ion exchange resin (acetate form) known as “Dowex 44”, a “crude leucine-13-motiline was obtained »(1—22b), which, due to the use of« impure »section (1-8), had to have a« wrong sequence », which was also confirmed during the cleaning operation.

Die experimentelle Durchführung der Fragmentkondensation war wie folgt: The experimental procedure for fragment condensation was as follows:

A. Kondensation I mit II A. Condensation I with II

Gemäss Hauptpatent wurden 9,2 g Fragment I (gem. Bsp. 1 H), 9,36 g Fragment II (gem. Bsp. 2) und 1,4 ml Triäthylamin in 200 ml Dimethylformamid bei 0° C mit 2,3 g N-Hy-droxysuccinimid und anschliessend mit 3,1g N,N'-Dicyclo-hexylcarbodiimid versetzt; die Reaktionsmischung wurde 24 Std. lang bei 5° C und 4 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt, worauf das Filtrat i. V. eingedampft wurde. Der Rückstand wurde mehrmals mit Wasser digeriert und schliesslich zweimal aus Methanol/Essigester umgefällt. According to the main patent, 9.2 g of fragment I (according to example 1 H), 9.36 g of fragment II (according to example 2) and 1.4 ml of triethylamine in 200 ml of dimethylformamide were mixed at 2.3 ° C. with 2.3 g N-hydroxysuccinimide and then 3.1 g of N, N'-dicyclo-hexylcarbodiimide; the reaction mixture was stirred at 5 ° C. for 24 hours and at room temperature for 4 days, whereupon the filtrate i. V. was evaporated. The residue was digested several times with water and finally reprecipitated twice from methanol / ethyl acetate.

Es resultierte BenzyIoxycarbonyl-L-glutamyl(y-tert.-butyI-ester ) -L-glutamyl(y -tert. -butylester) -Nf -tert. -butyloxycarbo-nyl-L-lysyl-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-arginyl(hydro-bromid)-L-asparaginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-glutamin-tert.-butylester in Form eines amorphen Pulvers. The result was benzyloxycarbonyl-L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -Nf -tert. -butyloxycarbo-nyl-L-lysyl-L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -L-arginyl (hydro-bromide) -L-asparaginyl-Ne-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-glutamine-tert .-Butyl ester in the form of an amorphous powder.

Md2° = —14,6° (c = 1; in Dimethylformamid). Md2 ° = -14.6 ° (c = 1; in dimethylformamide).

Ausb. 14,8 g (84% d.Th.). Educ. 14.8 g (84% of theory).

12,3 g der erhaltenen Verbindung in 800 ml Methanol wurden unter Konstanthaltung des pH-Werts in üblicher bekannter Weise katalytisch hydriert (pH = 5,5; 7 ml 1 N-Brom-wasserstoffsäure). Das Filtrat wurde i. V. eingedampft, der Rückstand aus Äthanol/Essigester zweimal umgefällt. 12.3 g of the compound obtained in 800 ml of methanol were catalytically hydrogenated (pH = 5.5; 7 ml of 1N-bromo-hydrochloric acid) while keeping the pH constant in the usual manner. The filtrate was i. V. evaporated, the residue from ethanol / ethyl acetate reprecipitated twice.

Es resultierte L-Glutamyl(y-tert.-butylester)-L-gIutamyl-(y-tert.-butylester)-N£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glut-amyl(y-tert.-butylester)-L-arginyl(hydrobromid)-L-asparagi-nyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-glutamin-tert.-butylester-hydrobromid als das gewünschte Kondensationsprodukt (14—22b). The result was L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -L-glutamyl- (y-tert-butyl ester) -N £ -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glut-amyl (y-tert.- butyl ester) -L-arginyl (hydrobromide) -L-asparaginyl-Ne-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-glutamine-tert-butyl ester hydrobromide as the desired condensation product (14-22b).

6 6

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

[a]D20 = —21,5° (c = 1,0; in Methanol). [a] D20 = -21.5 ° (c = 1.0; in methanol).

Ausb. 11,4 g (96% d. Th.). Educ. 11.4 g (96% of theory).

B. Kondensation (I—II) mit III Eine Lösung von 1,7 g Peptid (14-22b), 1,4 g Z-Arg-(ó,cu-Z2)-Leu-OH (12—13), 0,3 g N-Hydroxysuccinimid und 0,14 ml Triäthylamin in 100 ml Dimethylformamid wurde bei -10° mit 0,412 g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt und 24 Std. lang bei 4° gerührt. Nach weiterem 24stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde vom ausgefallenen Dicyclo-hexylharnstoff abfiltriert, das Lösungsmittel i.V. entfernt und der Eindampfrückstand aus Methanol/Essigsäureäthylester umgefällt. Das erhaltene Produkt wurde sorgfältig mit Wasser digeriert, abfiltriert und getrocknet. B. Condensation (I-II) with III A solution of 1.7 g peptide (14-22b), 1.4 g Z-Arg- (ó, cu-Z2) -Leu-OH (12-13), 0 , 3 g of N-hydroxysuccinimide and 0.14 ml of triethylamine in 100 ml of dimethylformamide were mixed with 0.412 g of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide at -10 ° and stirred at 4 ° for 24 hours. After stirring for a further 24 hours at room temperature, the precipitated dicyclo-hexylurea was filtered off, the solvent i.V. removed and the evaporation residue from methanol / ethyl acetate fell over. The product obtained was carefully digested with water, filtered off and dried.

Es resultierte Na,Nó,Nw-Tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-leucyl-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-L-Iysyl-L-glutamyl-(y-tert. -butylester) -L-arginyl (hydrobromid) -L-asparaginyl-Nc-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester (12—22a). The result was Na, Nó, Nw-tris-benzyloxycarbonyl-L-arginyl-L-leucyl-L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -Nf-tert-butyloxycarbonyl -L-Iysyl-L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -L-arginyl (hydrobromide) -L-asparaginyl-Nc-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamine tert-butyl ester (12-22a).

Ausb. 1,94 g (85% d.Th.); chromatographisch rein in n-Heptan/tert.-Butanol/Essigsäure (3:2:1) und n-Butanol/ Essigsäure/Wasser (3:1:1). Educ. 1.94 g (85% of theory); chromatographically pure in n-heptane / tert-butanol / acetic acid (3: 2: 1) and n-butanol / acetic acid / water (3: 1: 1).

Aminosäureanalyse: Amino acid analysis:

Lys 2,02, Arg 2,01, Asp 1,00, Glu 3,98, Gly 1,01, Leu 1,00. 1,8 g Peptid in 500 ml Methanol wurden unter Zutropfen von 15,70 ml 0,1 N-Bromwasserstoffsäure bei pH 4,5 durch katalytische Hydrierung entacyliert. Das vom Katalysator befreite Filtrat wurde i.V. eingedampft, und der erhaltene Rückstand wurde aus Methanol/Essigsäureäthylester umgefällt. Lys 2.02, Arg 2.01, Asp 1.00, Glu 3.98, Gly 1.01, Leu 1.00. 1.8 g of peptide in 500 ml of methanol were deacylated by dropwise addition of 15.70 ml of 0.1 N-hydrobromic acid at pH 4.5 by catalytic hydrogenation. The filtrate freed from the catalyst was i.V. evaporated, and the residue obtained was reprecipitated from methanol / ethyl acetate.

Es resultierte L-Arginyl(hydrobromid)-L-leucyl-L-glut-amyl(y-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-arginyl(hydrobromid)-L-asparaginyl-Ne-tert.-butyloxy-carbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester-hydro-bromid-dihydrat (12-22b). The result was L-arginyl (hydrobromide) -L-leucyl-L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -Ne-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl- L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -L-arginyl (hydrobromide) -L-asparaginyl-Ne-tert-butyloxy-carbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamine-tert-butyl ester hydro-bromide dihydrate (12-22b).

Ausb. 1,61 g (98% d.Th.). Educ. 1.61 g (98% of theory).

Analyse: Analysis:

ber.: C 47,12 H 7,43 N 14,07 gef.: C 47,20 H 7,50 N 14,00 calc .: C 47.12 H 7.43 N 14.07 found: C 47.20 H 7.50 N 14.00

C. Kondensation (I—II—III) mit IV 1,56 g Peptid (12—22b) und 0,87 g Peptid (9-11) in 100 ml Dimethylformamid wurden nach Zusatz von 0,105 ml Triäthylamin mit 0,210 g N-Hydroxybenzotriazol und 0,320 g Dicyclohexylcarbodiimid wie unter (B) beschrieben kondensiert. C. Condensation (I-II-III) with IV 1.56 g peptide (12-22b) and 0.87 g peptide (9-11) in 100 ml dimethylformamide were added after adding 0.105 ml triethylamine with 0.210 g N-hydroxybenzotriazole and 0.320 g of dicyclohexylcarbodiimide condensed as described under (B).

Es resultierte N-Benzyloxycarbonyl-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-leucyl-L-glutaminyl-L-arginyl(hydrobromid)-L-leucyl-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-arginyl(hydrobromid)-L-asparaginyl-Ne-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester-dihydrat (9-22a). The result was N-benzyloxycarbonyl-L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -L-leucyl-L-glutaminyl-L-arginyl (hydrobromide) -L-leucyl-L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -L -glutamyl (y-tert-butyl ester) -Nf-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl- (y-tert-butyl ester) -L-arginyl (hydrobromide) -L-asparaginyl-Ne-tert. -butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamine tert-butyl ester dihydrate (9-22a).

Ausb. 1,6 g (83% d.Th.). Educ. 1.6 g (83% of theory).

Analyse: Analysis:

ber.: C 51,41 H 7,57 N 13,63 Br 6,22 gef.: C 51,28 H 7,55 N 13,57 Br 6,15 1,6 g Peptid (9—22a) in 600 ml Methanol wurden unter Konstanthaltung des pH-Werts, wie unter (B) beschrieben, durch katalytische Hydrierung entacyliert. Das vom Katalysator befreite Filtrat wurde i.V. eingedampft, und der Rückstand wurde aus Methanol/Essigsäureäthylester umgefällt. calc .: C 51.41 H 7.57 N 13.63 Br 6.22 found: C 51.28 H 7.55 N 13.57 Br 6.15 1.6 g peptide (9-22a) in 600 ml of methanol was deacylated by catalytic hydrogenation while maintaining the pH as described under (B). The filtrate freed from the catalyst was i.V. evaporated, and the residue was reprecipitated from methanol / ethyl acetate.

Es resultierte L-Glutamyl(y-tert.-butylester)-L-leucyl-L-glutaminyl-L-arginyl(hydrobromid)-L-leucyl-L-glutamyl-(y-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-arginyI(hydrobromid)-L-asparaginyl-N£-tert.-butyloxy- The result was L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -L-leucyl-L-glutaminyl-L-arginyl (hydrobromide) -L-leucyl-L-glutamyl- (y-tert-butyl ester) -L-glutamyl ( y-tert-butyl ester) -Nf-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -L-arginyI (hydrobromide) -L-asparaginyl-N £ -tert.-butyloxy-

615 904 615 904

carbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butylester-hydro-bromid-Tetrahydrat (9-22b). carbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamine tert-butyl ester hydro-bromide tetrahydrate (9-22b).

Ausb. 1,5 g (96% d.Th.); Educ. 1.5 g (96% of theory);

[alo20 = —5,3 ± 1 und [a]54620 = -7,2° (c = 0,7; in Methanol); [alo20 = -5.3 ± 1 and [a] 54620 = -7.2 ° (c = 0.7; in methanol);

chromatographisch rein in n-Butanol/Essigsäure/Wasser (3:1:1). chromatographically pure in n-butanol / acetic acid / water (3: 1: 1).

Aminosäureanalyse: Amino acid analysis:

Lys 2,04, Arg 2,01, Asp 0,98, Glu 6,05, Gly 1,01, Leu 2,00. Lys 2.04, Arg 2.01, Asp 0.98, Glu 6.05, Gly 1.01, Leu 2.00.

D. Kondensation V mit VI Gemäss Hauptpatent wurden 21,6 g Fragment VI und 6,9 g N-Hydroxysuccinimid in 400 ml Dimethylformamid bei —5° C mit 6,3 g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Std. lang bei 0° C und über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Nach Filtration wurde das Filtrat i. V. eingedampft; der ölige Rückstand kristallisierte aus Iso-propanol. D. Condensation V with VI According to the main patent, 21.6 g of fragment VI and 6.9 g of N-hydroxysuccinimide in 400 ml of dimethylformamide were mixed with 6.3 g of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide at -5 ° C. The reaction mixture was stirred at 0 ° C for 2 hours and at room temperature overnight. After filtration, the filtrate was i. V. evaporated; the oily residue crystallized from isopropanol.

Es resultierte tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoleucyl-L-phenylalanin-N-hydroxysuccini-midester. The result was tert-butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoleucyl-L-phenylalanine-N-hydroxysuccini mid ester.

Ausb. 21,3 g (88% d.Th.); Educ. 21.3 g (88% of theory);

F = 190-192°; [a]D20 = +59,28° (c = 1,0; in Dioxan). 12,2 g Fragment V und 3,8 ml Triäthylamin in 400 ml Dimethylformamid wurden mit 14,8 g des obigen, aus Fragment VI gewonnenen Succinimidesters versetzt; das Reaktionsgemisch wurde nach 24stündigem Rühren bei Raumtemperatur i. V. eingedampft, und der ölige Rückstand wurde zwischen Essigester und Zitronensäurelösung verteilt. Die Essigesterphase wurde in üblicher bekannter Weise gewaschen, getrocknet und i. V. zur Trockene gebracht. Aus Essigester/ Petroläther wurden farblose Kriställchen aus tert.-Butyloxy-carbonyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoleucyl-L-phenylalanyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-O-tert.-butyl-L-tyrosyl-glycin (1-8) erhalten. F = 190-192 °; [a] D20 = + 59.28 ° (c = 1.0; in dioxane). 14.2 g of the above succinimide ester obtained from fragment VI were added to 12.2 g of fragment V and 3.8 ml of triethylamine in 400 ml of dimethylformamide; after stirring for 24 hours at room temperature, the reaction mixture was evaporated down i. V. evaporated, and the oily residue was partitioned between ethyl acetate and citric acid solution. The ethyl acetate phase was washed in a conventional manner, dried and i. V. brought to dryness. Colorless crystals of tert-butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoleucyl-L-phenylalanyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-O-tert were made from ethyl acetate / petroleum ether. -butyl-L-tyrosyl-glycine (1-8) obtained.

Ausb. 18,2 g (87% d.Th.); Educ. 18.2 g (87% of theory);

[ct]D20 = -44,0° (c = 1,0; in Äthanol). [ct] D20 = -44.0 ° (c = 1.0; in ethanol).

E. Kondensation (I—II—III-IV) mit (V—VI) 1,28 g Peptid (9-22b) gemäss (C), 1,17 g Peptid (1-8) gemäss (D), 0,07 ml Triäthylamin und 0,115 g N-Hydroxysuccinimid (bzw. in weiteren Versuchen 0,20 g N-Hydroxy-benzotriazol) in 100 ml Dimethylformamid wurden bei —10° mit 0,206 g N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid versetzt. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Tage lang bei 0° C und 3 Tage lang bei Raumtemperatur gerührt. Nach Entfernen des Lösungsmittels i. V. wurde der Rückstand sorgfältig mit heissem Essigester digeriert, das harzartige Produkt aus Methanol/Essigester umgefällt, nach Verreiben mit Essigester getrocknet und danach 5 Std. lang erschöpfend mit Wasser behandelt. Es wurde aus Methanol/Wasser umgefällt. E. condensation (I-II-III-IV) with (V-VI) 1.28 g peptide (9-22b) according to (C), 1.17 g peptide (1-8) according to (D), 0, 07 ml of triethylamine and 0.115 g of N-hydroxysuccinimide (or in further experiments 0.20 g of N-hydroxybenzotriazole) in 100 ml of dimethylformamide were mixed with 0.206 g of N, N'-dicyclohexylcarbodiimide at -10 °. The reaction mixture was stirred at 0 ° C for 2 days and at room temperature for 3 days. After removing the solvent i. V. the residue was carefully digested with hot ethyl acetate, the resinous product from methanol / ethyl acetate was reprecipitated, dried after trituration with ethyl acetate and then treated exhaustively with water for 5 hours. It was reprecipitated from methanol / water.

Es resultierte N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoleucyl-L-phenylalanyl-O-tert.-butyl-L-threonyl-0-tert.-butyl-L-tyrosyl-glycyl-L-glutamyl(y-tert,-butylester)-L-leucyl-L-glutaminyl-L-arginyl(hydrobromid)-L-leucyl-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-Nf-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl(y-tert.-butylester)-L-arginyl(hydrobromid)-L-asparagmyl-N£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin-tert.-butyl-ester-hexahydrat (l-22a). The result was N-tert-butyloxycarbonyl-L-phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoleucyl-L-phenylalanyl-O-tert-butyl-L-threonyl-0-tert-butyl-L-tyrosyl -glycyl-L-glutamyl (y-tert, -butyl ester) -L-leucyl-L-glutaminyl-L-arginyl (hydrobromide) -L-leucyl-L-glutamyl (y-tert.-butyl ester) -L-glutamyl ( y-tert-butyl ester) -Nf-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl (y-tert-butyl ester) -L-arginyl (hydrobromide) -L-asparagmyl-N £ -tert.-butyloxycarbonyl- L-lysyl-glycyl-L-glutamine tert-butyl ester hexahydrate (1-22a).

Ausb. 1,65 g (91% d.Th.). Educ. 1.65 g (91% of theory).

Analyse: Analysis:

ber.: C 54,03 H 7,82 N 12,68 Br 4,38 gef.: C 54,13 H 7,80 N 12,67 Br 4,6 1 g geschütztes Peptid (1—22a) gemäss (E) wurde mit 40 ml eiskalter Trifluoressigsäure übergössen und 2 Std. lang bei Raumtemperatur stehengelassen. Danach wurde überschüssige Trifluoressigsäure i.V. bei möglichst tiefer Tempe7 calc .: C 54.03 H 7.82 N 12.68 Br 4.38 found: C 54.13 H 7.80 N 12.67 Br 4.6 1 g protected peptide (1-22a) according to (E ) was poured with 40 ml of ice-cold trifluoroacetic acid and left to stand at room temperature for 2 hours. Excess trifluoroacetic acid was then added at the lowest possible temperature7

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

615 904 615 904

8 8th

ratur entfernt, das verbleibende Material in verdünnter Essigsäure aufgenommen, die erhaltene Lösung zweimal mit 4 g eines schwach basischen Anionenaustauschers in der Acetat-Form (z. B. «Dowex 44») behandelt, worauf das Austauscher-Eluat lyophilisiert wurde. removed, the remaining material taken up in dilute acetic acid, the solution obtained was treated twice with 4 g of a weakly basic anion exchanger in the acetate form (for example “Dowex 44”), whereupon the exchanger eluate was lyophilized.

Es resultierte L-Phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoleucyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-tyrosyl-glycyl-L-glutamyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L-arginyl-L-Ieucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-lysyl-L-glutamyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamin. The result was L-phenylalanyl-L-valyl-L-prolyl-L-isoleucyl-L-phenylalanyl-L-threonyl-L-tyrosyl-glycyl-L-glutamyl-L-leucyl-L-glutaminyl-L-arginyl-L- Ieucyl-L-glutamyl-L-glutamyl-L-lysyl-L-glutamyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-lysyl-glycyl-L-glutamine.

Ausb. 0,74 g. Educ. 0.74 g.

Beispiel 2 Example 2

Reindarstellung und Aminosäureanalyse Gemäss Hauptpatent erfolgte die Reinigung in Anlehnung an die Reindarstellung von natürlichem Motilin durch Ionenaustausch-Chromatographie mit Hilfe eines stark basischen Anionenaustauscherharzes, z. B. des in der Acetatform vorliegenden, unter der Bezeichnung «QAE-Sephadex A-25» bekannten Harzes auf der Basis eines modifizierten Dextrans mit Diäthyl-(2-hydroxypropyl)-aminoäthylresten als funktionelle Gruppen, und danach mit Hilfe eines stark sauren Kationenaustauscherharzes, z. B. des in der Ammoniumform vorliegenden, unter der Bezeichnung «SP-Sephadex C-25» bekannten Harzes auf der Basis eines modifizierten Dextrans mit Sulfopropylresten als funktionellen Gruppen. Pure representation and amino acid analysis According to the main patent, the cleaning was carried out based on the pure representation of natural Motilin by ion exchange chromatography using a strongly basic anion exchange resin, e.g. B. the present in the acetate form, known under the name "QAE-Sephadex A-25" resin based on a modified dextran with diethyl (2-hydroxypropyl) aminoethyl residues as functional groups, and then with the aid of a strongly acidic cation exchange resin, e.g. B. in the ammonium form, known under the name "SP-Sephadex C-25" resin based on a modified dextran with sulfopropyl radicals as functional groups.

Eine Aminosäureanalyse wurde nach saurer Hydrolyse (6N—HCl) durchgeführt, wobei sich zeigte, dass praktisch dieselben Werte bei 20 und bei 72 Std. Hydrolysezeit erzielt wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden s Tabelle aufgeführt: An amino acid analysis was performed after acidic hydrolysis (6N-HCl), showing that practically the same values were obtained at 20 and 72 hours hydrolysis time. The results obtained are shown in the following table:

Tabelle gefunden berechnet io Lys 2,00 2 Table found calculated io Lys 2.00 2

Arg 1,93 2 Arg 1.93 2

Asp 1,00 1 Asp 1.00 1

Thr 0,97 1 Thr 0.97 1

Glu 6,18 6 Glu 6.18 6

15 Pro 0,98 1 15 per 0.98 1

Gly 1,99 2 Gly 1.99 2

Val 0,90 1 Val 0.90 1

Ile 0,90 1 Ile 0.90 1

Leu 1,94 2 Leu 1.94 2

20 Tyr 0,93 1 20 Tyr 0.93 1

Phe 1,82 2 Phe 1.82 2

Die biologische Aktivität des gefriergetrockneten L-Leucin-13-Motilins war praktisch gleich derjenigen des L-Norleucin-25 13-Motilins und unterschied sich somit kaum von derjenigen des natürlichen Motilins. The biological activity of the freeze-dried L-leucine-13-motiline was practically the same as that of the L-norleucine-25-13-motiline and thus hardly differed from that of the natural motiline.

s s

5 Blatt Zeichnungen 5 sheets of drawings

Claims

615 904 2 CLAIMS Process for the preparation of L-leucine-13-motilin of the formula H-Phe-Val-Pro-Ile-Phe-Thr-Tyr-Gly-Glu-Leu-Gin-Arg - (1) (2) ( 3) (4) (5) (6) (7) (8) (9) (10) (11) (12) Leu-Glu-Glu-Lys-Glu-Arg-Asn-Lys-Gly-Gln-OH (13) (14) (15) (16) (17) (18) (19) (20) (21) (22), characterized in that the partial sequences fragment I, consisting of arginyl (hydrobromide) aspara -ginyl-Ne-tert-butyloxy-carbonyl-lysyl-glycyl-glutamine-tert.-butyl ester (amino acids 18-22), fragment II, consisting of Na-benzyloxycarbonyl-glut-amyl- (y-tert.-butyl ester) -glutamyl (y-tert-butyl ester) -ne-tert-butyloxycarbonyl-lysyl-glutamic acid-y-tert-butyl ester (amino acids 14-17), fragment III, consisting of Na-benzyloxycarbonyl-N <5, N « > -di-benzyloxycarbonyl-arginyl-leucine (amino acids 12-13), fragment IV, consisting of Na-benzyloxycarbonyl-glut-amyl- (y-tert-butyl ester) -leucyl-glutamine (amino acids (9-11), fragment V, consisting of O-tert-butyl-threonyl-O-tert-butyltyrosyl-glycyl (amino acids 6-8) and fragment VI, consisting of Na-tert-butyloxycarbonyl-phenylalanyl-valyl-propyl-isoleucyl-phenylalanine (amino acids 1-5), in which all side chain functions of the polyfunctional amino acids carry easily cleavable groups and the complex functions of the arginine either by Nó, masked by a protonation caused by salt formation with hydrogen bromide, condensed, the protective groups split off and the crude L-leucine-13-motiline isolated. SUB-CLAIMS

1. The method according to claim, characterized in that by aminoacylation of L-leucine (amino acid 13) with the aid of Na, N <3, Na) -Tris ~ benzyloxycarbonyI-L-arginine-N-hydroxy-succinimide ester ( Amino acid 12) available fragment is used.

2. The method according to claim, characterized in that the L-leucine-13-motiline obtained is purified by column chromatography on a strongly basic anion exchange resin and then on a strongly acidic cation exchange resin.