CH640217A5

CH640217A5 - Polypeptides, their preparation and pharmaceutical preparations

Info

Publication number: CH640217A5
Application number: CH206378A
Authority: CH
Inventors: Gideon Goldstein; David H Schlesinger
Original assignee: Sloan Kettering Inst Cancer
Priority date: 1977-11-15
Filing date: 1978-02-24
Publication date: 1983-12-30
Also published as: JPS6149320B2; FR2408581B1; DE2804567A1; SE446866B; SE7801031L; BE864122A; JPS5476522A; JPH0137400B2; FR2408581A1; JPS6150999A; CA1105923A; DE2804567C2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Polypeptide, Verfahren zur Herstellung derselben und pharmazeutische Präparate, welche diese Polypeptide als Wirkstoff enthalten. The present invention relates to new polypeptides, processes for producing the same and pharmaceutical preparations which contain these polypeptides as active ingredients.

Bekanntlich sind aus verschiedenen tierischen Organen viele Polypeptide isoliert worden. Allerdings wusste man bis zum letzten Jahrzent sehr wenig über den Thymus, ein Organ, welches beim Menschen zum Zeitpunkt der Geburt etwa 0,8% des Körpergewichts darstellt. Zwar ist früher die Hypothese aufgestellt worden, dass im Thymus eine Substanz mit neuromuskulär blockierender Wirkung vorliegt und dass ein Thymushormon die Entwicklung des Immunitätssystems beeinflusst. Trotz dem lebhaften Interesse für mögliche Funktionen des Thymus und trotz frühen Hypothesen und Experimenten wusste man bis vor kurzem sehr wenig über die Funktion des Thymus. Man hat aber jetzt eingesehen, dass der Thymus ein komposites Organ ist, das sowohl epitheliale (endokrine) als auch lymphoide (immunitäre) Komponenten beinhaltet, und dass der Thymus daher in den Immunitätsfunktionen des Organismus eine Rolle spielt. Der Thymus ist also ein komposites Organ, As is known, many polypeptides have been isolated from various animal organs. However, until the last decade, very little was known about the thymus, an organ that represents around 0.8% of body weight in humans at the time of birth. It was previously hypothesized that there is a substance with a neuromuscular blocking effect in the thymus and that a thymus hormone influences the development of the immune system. Despite the keen interest in possible functions of the thymus and early hypotheses and experiments, until recently very little was known about the function of the thymus. However, it has now been recognized that the thymus is a composite organ that contains both epithelial (endocrine) and lymphoid (immune) components, and that the thymus therefore plays a role in the immune functions of the organism. So the thymus is a composite organ,

welches aus einem epithelialen, von dem dritten Branchialbogen abgeleiteten Stroma und aus von Stammzellen, welche in den hämato-poetischen Geweben entstehen, abgeleiteten Lymphozyten besteht (Goldstein et al., „The Human Thymus", Heinemann, London, 1969). Die Lymphozyten werden im Thymus differenziert und verlassen ihn in Form von reifen, vom Thymus abgeleiteten und T-Zellen genannten Zellen, welche sich dann im Blut, in der Lymphe und in den Lymphknoten verteilen. Die Herbeiführung der Differenzierung der Stammzellen im Thymus scheint unmittelbar auf Sekretionen der epithelialen Zellen des Thymus zurückzugehen, aber Schwierigkeiten bei den biologischen Versuchen haben früher die vollständige Isolierung und Strukturaufklärung jegliches allfällig vorhandenen Hormons verunmöglicht. which consists of an epithelial stroma derived from the third branchial arch and lymphocytes derived from stem cells which arise in the hematopoietic tissues (Goldstein et al., "The Human Thymus", Heinemann, London, 1969). The lymphocytes become differentiates in the thymus and leaves it in the form of mature cells derived from the thymus and called T cells, which are then distributed in the blood, in the lymph and in the lymph nodes Thymus cells decline, but difficulties in biological experiments previously made it impossible to fully isolate and structure-clarify any hormone that might be present.

Man weiss seit einiger Zeit, dass der Thymus in Verbindung mit den Immunitätseigenschaften des Organismus steht und deshalb haben aus dem Thymus isolierte Substanzen grösseres Interesse errungen. So sind in den letzten Jahren eine ziemlich grosse Zahl von Berichten über wissenschaftliche Arbeiten an im Rinderthymus vorhandenen Stoffen veröffentlicht worden. Die Anmelderin selber hat mehrere Beiträge erscheinen lassen, welche von ihren Untersuchungen auf diesem Gebiet handeln. Solche Publikationen finden sich beispielsweise in „The Lancet", 20. Juli 1968, S. 119 bis 122; „Triangle", Bd. 11, Nr. 1, S. 7 bis 14,1972; „Annais of the New York Academy of Sciences", Bd. 183, S. 230 bis 240,1971 ; „Clinical and Expérimental Immunology", Bd. 4, Nr. 2, S. 181 bis 189,1969; „Nature", Bd. 247, S. 11 bis 14,1974; „Proceedings of the National Academy of Sciences", USA, Bd. 71, S. 1474 bis 1478,1974; „Cell", Bd. 5, S. 361 bis 365 und S. 367 bis 370,1975; „The Lancet", Bd. 2, S. 256 bis 259, 1975; „Proceedings of the National Academy of Sciences", USA, Bd. 72, S. 11 bis 15, 1975; „Biochemistry", Bd. 14, S. 2214 bis 2218,1974; und „Nature", Bd. 255, S. 423 bis 424,1975. It has been known for some time that the thymus is connected to the immunity properties of the organism and therefore substances isolated from the thymus have attracted greater interest. In recent years, a fairly large number of reports on scientific work on substances present in the cattle thymus have been published. The applicant has published several articles dealing with her research in this area. Such publications can be found, for example, in "The Lancet", July 20, 1968, pp. 119 to 122; "Triangle", Vol. 11, No. 1, pp. 7 to 14, 1972; "Annais of the New York Academy of Sciences", vol. 183, pp. 230 to 240.1971; "Clinical and Experimental Immunology", vol. 4, No. 2, pp. 181 to 189.1969; "Nature", vol. 247, pp. 11 to 14, 1974; "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA, vol. 71, pp. 1474 to 1478, 1974; "Cell", vol. 5, pp. 361 to 365 and pp. 367 to 370, 1975; "The Lancet", vol. 2, pp. 256 to 259, 1975; "Proceedings of the National Academy of Sciences", USA, vol. 72, pp. 11 to 15, 1975; "Biochemistry", vol. 14, pp. 2214 to 2218, 1974; and "Nature", Vol. 255, pp. 423 to 424, 1975.

In dem Beitrag von Goldstein und Manganaro in „Annais of the New York Academy of Sciences", Bd. 183, S. 230 bis 240,1971, In the contribution by Goldstein and Manganaro in "Annais of the New York Academy of Sciences", vol. 183, pp. 230 to 240, 1971,

wird über das Vorliegen eines Polypeptids im Thymus berichtet, welches beim Tier eine der Myasthenia gravis beim Menschen ähnliche, myasthenische neuromuskuläre Blockierung bewirkt. Es wird dort auch erwähnt, dass zwei verschiedene Wirkungen durch unterschiedliche Polypeptide des Rinderthymus erzeugt werden. In der Veröffentlichung wird angenommen, dass eines dieser Polypeptide — Thymotoxin genannt — eine Myositis bewirkt, und es wird ferner angeführt, dass dieses Polypeptid nicht isoliert wurde, dass es sich aber dabei offenbar um ein Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ca. 7000, einer (im Endeffekt) starken positiven Ladung und einer Adsorption an Carboxymethyl-Sephadex bei einem pH von 8,0 handelt. reports on the presence of a polypeptide in the thymus which causes myasthenic neuromuscular blocking similar to that of myasthenia gravis in humans. It is also mentioned there that two different effects are produced by different polypeptides of the bovine thymus. The publication assumes that one of these polypeptides - called thymotoxin - causes myositis, and it is also stated that this polypeptide has not been isolated, but that it is apparently a polypeptide with a molecular weight of approximately 7000, a ( in the end) strong positive charge and adsorption on carboxymethyl Sephadex at a pH of 8.0.

In „Nature", 247,11,4. Januar 1975, werden unter den Namen Thymin I und Thymin II Polypeptide beschrieben, welche neue, aus dem Rinderthymus isolierte Polypeptide sind und besondere Verwendungen in verschiedenen therapeutischen Gebieten haben. Wegen des Gebrauches ähnlicher Namen für andere, aus dem Thymus In "Nature", January 24, 11, 4, 1975, under the names Thymin I and Thymin II, polypeptides are described which are new polypeptides isolated from the bovine thymus and have particular uses in various therapeutic fields. Because of the use of similar names for others, from the thymus

640 217 640 217

4 4th

früher isolierte Produkte werden diese Thymin I und Thymin II jetzt Thymopoietin I und Thymopoietin II genannt. Diese Produkte und Verfahren werden in der US-Anmeldung Nr. 606843 vom 22.8.1975 beschrieben, welche eine continuation-in-part der US-Anmeldung Nr. 429202 vom 28.12.1973 (jetzt fallengelassen) ist. Products previously isolated are called thymine I and thymine II, now thymopoietin I and thymopoietin II. These products and methods are described in US Application No. 606843 dated August 22, 1975, which is a continuation-in-part of US Application No. 429202 dated December 28, 1973 (now dropped).

In dem US-Patent Nr. 4002602 vom 11.1.1977, welches eine con-tinuation-in-part der US-Anmeldung Nr. 449686 vom 11.3.1974 ist, werden unter dem Namen Ubiquitous Immunopoietic Polypeptide (UBIP) langkettige Polypeptide beschrieben. Dieses Polypeptid wurde später in Ubiquitin umbenannt; es besteht aus 74 Aminosäuren und zeichnet sich durch seine Fähigkeit aus, in vitro in ng-Konzentrationen die Differenzierung sowohl der T-Zellen als auch der B-Zellen aus Vorläufern herbeizuführen, welche im Knochenmark und in der Milz vorhanden sind. Dieses Polypeptid ist daher bei der therapeutischen Behandlung von Thymus- oder Immunitätsinsuffizienz usw. wertvoll. Long-chain polypeptides are described under the name Ubiquitous Immunopoietic Polypeptides (UBIP) in US Patent No. 4002602 from January 11, 1977, which is a continuation-in-part of US Application No. 449686 from March 11, 1974. This polypeptide was later renamed Ubiquitin; It consists of 74 amino acids and is characterized by its ability to differentiate both T cells and B cells from precursors, which are present in the bone marrow and spleen, in ng concentrations in vitro. This polypeptide is therefore valuable in the therapeutic treatment of thymic or immune deficiency, etc.

Im US-Patent Nr. 4002740 vom 11.1.1977 werden Präparate eines synthetischen Tridecapeptids beschrieben, welches die Differenzierung der T-Lymphozyten, jedoch nicht jene der B-Lymphozy-ten mit komplementärem Rezeptor herbeizuführen vermag. Dieses Polypeptid zeigt also viele Eigenschaften des gemäss der oben erwähnten US-Anmeldung Nr. 606843 isolierten und Thymopoietin genannten langkettigen Polypeptids. In US Pat. No. 4002740 dated January 11, 1977, preparations of a synthetic tridecapeptide are described which are able to induce the differentiation of T-lymphocytes, but not that of B-lymphocytes with a complementary receptor. This polypeptide thus exhibits many properties of the long-chain polypeptide isolated according to the above-mentioned US application No. 606843 and called thymopoietin.

Die vorliegende Erfindung stellt zur Verfügung ein synthetisches Polypeptid aus mindestens 5 Aminosäuren mit einer bestimmten Reihenfolge von aktiven Stellen, welches mehrere charakteristische Eigenschaften des bereits isolierten und in den oben erwähnten Veröffentlichungen und dem US-Patent Nr. 4002602 vom 11.1.1977 Ubiquitous Immunopoietic Polypeptide (UBIP) genannten langkettigen Polypeptids aufweist. The present invention provides a synthetic polypeptide of at least 5 amino acids with a specific order of active sites, which has several characteristic properties of the already isolated and Ubiquitous Immunopoietic Polypeptide (U.S. Patent No. 4002602 dated January 11, 1977). UBIP) called long-chain polypeptide.

Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, neue Polypeptide von biologischer Bedeutung zur Verfügung zu stellen. It is therefore an object of the present invention to provide new polypeptides of biological importance.

Es ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung, neue Polypeptide zur Verfügung zu stellen, welche in ng-Konzentrationen die Differenzierung sowohl der T-Zellen Vorläufer als auch der B-Zellenvor-Iäufer herbeizuführen vermögen und dadurch für das Immunitäts-system bei Mensch und Tier wertvoll sind. It is a further object of the invention to provide new polypeptides which, in ng concentrations, are able to differentiate both the T-cell precursors and the B-cell precursors and are therefore valuable for the immunity system in humans and animals are.

Es ist noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung, neue Zwischenprodukte, Verfahren zur Herstellung der neuen erfindungsge-mässen Polypeptide und letztere enthaltende pharmazeutische Prä- ' parate zur Verfügung zu stellen. It is yet another object of the invention to provide new intermediates, processes for producing the new polypeptides according to the invention and pharmaceutical preparations containing the latter.

Zur Erzielung der vorgenannten Erfindungsgegenstände und Vorteile werden erfindungsgemäss neue Polypeptide hergestellt, welche als wirksamen Bestandteil die folgende Sequenz aufweisen: To achieve the abovementioned objects of the invention and advantages, new polypeptides are produced according to the invention which have the following sequence as an effective constituent:

R-NH-X-Y-Z-GLN-LYS-CO-R' R-NH-X-Y-Z-GLN-LYS-CO-R '

worin X TYR oder ALA, Y ASN oder ALA und Z ILE oder ALA bedeuten und R und R' die weiter unten genannten Bedeutungen haben. wherein X is TYR or ALA, Y ASN or ALA and Z ILE or ALA and R and R 'have the meanings given below.

Es werden auch neue Polypeptidharzzwischenprodukte geschaffen, welche bei der Herstellung der erfindungsgemässen Polypeptide gebildet werden, wobei diese Zwischenprodukte der folgenden Formel entsprechen: New polypeptide resin intermediates are also created, which are formed in the production of the polypeptides according to the invention, these intermediates corresponding to the following formula:

Ri R2 Ri R2

I I I I

<x-R3-X-Y-Z-GLN-LYS-harz worin X, Y und Z die obigen Bedeutungen besitzen und R1; R2 und R3 Schutzgruppen an den angegebenen Aminosäuren bedeuten, sofern solche Gruppen erforderlich sind, wobei das in Frage kommende Harz ein festes Polymer darstellt, welches als Träger für die Reaktion wirkt. Es wird auch ein Verfahren für die Herstellung der erfindungsgemässen Polypeptide durch Peptidsynthese in fester Phase geschaffen. Die Erfindung bezieht sich ferner auf therapeutische Präparate, welche solche Polypeptide enthalten. <x-R3-X-Y-Z-GLN-LYS-resin wherein X, Y and Z have the above meanings and R1; R2 and R3 are protective groups on the amino acids given, if such groups are required, the resin in question being a solid polymer which acts as a carrier for the reaction. A method for the production of the polypeptides according to the invention by peptide synthesis in the solid phase is also created. The invention further relates to therapeutic preparations which contain such polypeptides.

Beschreibung bevorzugter Ausführungsformen Description of preferred embodiments

Wie bereits erwähnt bezieht sich die vorliegende Erfindung auf neue Polypeptide, welche in verschiedener Hinsicht therapeutisch wertvoll sind, ferner auf bei der Herstellung dieser Polypeptide anfallende Zwischenprodukte, sowie auf therapeutische Präparate und schliesslich auf ein Verfahren zur Herstellung solcher Polypeptide. As already mentioned, the present invention relates to new polypeptides which are therapeutically valuable in various respects, further to intermediates obtained in the production of these polypeptides, as well as to therapeutic preparations and finally to a method for producing such polypeptides.

Zur Hauptsache bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Polypeptide, welche als wirksamen Bestandteil die folgende Aminosäuresequenz aufweisen: For the most part, the present invention relates to polypeptides which have the following amino acid sequence as an active ingredient:

I. X-Y-Z-GLN-LYS I. X-Y-Z-GLN-LYS

worin X TYR oder ALA, Y ASN oder ALA und Z ILE oder ALA bedeuten, wobei X vorzugsweise TYR, Y vorzugsweise ASN und Z vorzugsweise ILE darstellen. wherein X is TYR or ALA, Y ASN or ALA and Z ILE or ALA, where X is preferably TYR, Y is preferably ASN and Z is preferably ILE.

Gemäss einer weiteren Ausführungsform bezieht sich die vorliegende Erfindung auf Pentapeptide, welche als wirksamen Bestandteil die vorgenannte Sequenz aufweisen und der folgenden allgemeinen Formel entsprechen: According to a further embodiment, the present invention relates to pentapeptides which have the aforementioned sequence as an active ingredient and correspond to the following general formula:

II. R-NH-X-Y-Z-GLN-LYS-COR' II. R-NH-X-Y-Z-GLN-LYS-COR '

worin X, Y und Z die obigen Bedeutungen haben und R und R' die weiter unten genannten Substituenten an der Pentapeptidsequenz darstellen, welche die biologische Wirksamkeit der zugrundeliegenden wirksamen Sequenz im wesentlichen nicht beeinträchtigen. Dies will besagen, dass die endständigen Aminosäuren an dieser Penta-peptidkette gemäss der Bedeutung von R und R' modifiziert sein können, ohne dass dadurch vom Erfindungsgedanken Abstand genommen wird. Daraus ergibt sich, dass die endständigen Amino-und Carbonsäuregruppen für die biologische Wirksamkeit der Polypeptide nicht wesentlich sind, dies im Gegensatz zu gewissen anderen Polypeptiden. Somit umfasst die vorliegende Erfindung ebenfalls diese Pentapeptide, welche endständig unsubstituiert und/ oder endständig durch eine Gruppe R und/oder R' substituiert sind, welche die biologische Wirksamkeit der hier beschriebenen Art nicht wesentlich beeinflussen. wherein X, Y and Z have the meanings given above and R and R 'represent the substituents on the pentapeptide sequence mentioned below which do not substantially impair the biological activity of the underlying active sequence. This is to say that the terminal amino acids on this penta-peptide chain can be modified in accordance with the meaning of R and R ', without thereby departing from the inventive concept. It follows from this that the terminal amino and carboxylic acid groups are not essential for the biological activity of the polypeptides, in contrast to certain other polypeptides. The present invention thus also encompasses these pentapeptides which are unsubstituted at the end and / or substituted at the end by a group R and / or R 'which do not significantly affect the biological activity of the type described here.

Aus diesen Darlegungen geht hervor, dass diese Gruppen Substitutionen umfassen, wie die Acylierung an der freien Aminogruppe und die Amidierung an der freien Carboxylgruppe, sowie die Substitution von zusätzlichen Aminosäuren und Polypeptiden. Diesbezüglich sind die erfingungsgemässen Pentapeptide einzigartig, weil die Pentapeptide die gleiche biologische Wirksamkeit wie die langkettigen natürlichen Peptide aufweisen, in welchen diese Pentapeptidsequenz nur einen Teil bildet oder darin vorkommt. Man darf daher annehmen, dass die Wirksamkeitserfordernisse des Moleküls durch deren Stereochemie entstehen, d.h. durch eine besondere „Faltung" des Moleküls. In diesem Zusammenhang sei daraufhingewiesen, From these statements it appears that these groups include substitutions such as acylation on the free amino group and amidation on the free carboxyl group, as well as the substitution of additional amino acids and polypeptides. In this regard, the pentapeptides according to the invention are unique because the pentapeptides have the same biological activity as the long-chain natural peptides in which this pentapeptide sequence forms only part of or occurs in it. It can therefore be assumed that the effectiveness requirements of the molecule arise from its stereochemistry, i.e. through a special "folding" of the molecule. In this context it should be pointed out

dass Polypeptidbindungen nicht starr, sondern flexibel sind und in Form von Blättern, in Schneckenform usw. vorliegen können. Demzufolge ist das gesamte Molekül flexibel und lässt sich in gewissem Masse „falten". Bei der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, dass die Pentapeptide sich in gleicher Weise „falten" wie die langkettigen natürlichen Polypeptide, weswegen sie auch die gleichen biologischen Eigenschaften aufweisen. Aus diesem Grunde kann man die Pentapeptide durch verschiedene Gruppen R und/oder R' substituieren, weil diese Gruppen die biologische Wirksamkeit nicht im wesentlichen beeinträchtigen oder mit den natürlichen „Faltungen" des Moleküls nicht interferieren. that polypeptide bonds are not rigid, but flexible and can be in the form of leaves, snails, etc. As a result, the entire molecule is flexible and can be "folded" to a certain extent. In the present invention, it was found that the pentapeptides "fold" in the same way as the long-chain natural polypeptides, which is why they also have the same biological properties. For this reason, the pentapeptides can be substituted by different groups R and / or R ', because these groups do not essentially impair the biological activity or do not interfere with the natural "folds" of the molecule.

Die Fähigkeit des Moleküls, seine biologischen Eigenschaften und die natürliche Faltung beizubehalten, ergibt sich eindeutig aus dem Umstände, dass die Pentapeptidsequenz dieser Erfindung die gleichen biologischen Eigenschaften wie das natürliche, 74 Aminosäuren enthaltende Peptid, welches unter der Bezeichnung Ubiquitin im amerikanischen Patent Nr. 4002602 beschrieben ist, aufweist. In diesem langkettigen Polypeptid lässt sich das erfindungsgemässe Pentapeptid innerhalb des Moleküls identifizieren, dies aber nur in Kombination mit den anderen hier beschriebenen Aminosäuren. Das genannte Patent ist aber ein direkter Hinweis darauf, dass die erfindungsgemässen Pentapeptide als wirksamer Bestandteil anzusehen sind, weil die biologischen Wirkungen die gleichen sind und die Aminosäuren und die an den endständigen Aminosäuren haftenden Peptidketten die biologischen Eigenschaften des zugrundeliegenden Pentapeptidfragmentes nicht beeinflussen. The ability of the molecule to maintain its biological properties and natural folding clearly arises from the fact that the pentapeptide sequence of this invention has the same biological properties as the natural 74 amino acid peptide, which is called Ubiquitin in American Patent No. 4002602 is described. The pentapeptide according to the invention can be identified within the molecule in this long-chain polypeptide, but only in combination with the other amino acids described here. However, the patent mentioned is a direct indication that the pentapeptides according to the invention are to be regarded as an effective constituent because the biological effects are the same and the amino acids and the peptide chains adhering to the terminal amino acids do not influence the biological properties of the underlying pentapeptide fragment.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

5 5

640 217 640 217

In der obigen Formel haben R und R' unabhängig voneinander die folgenden Bedeutungen: In the above formula, R and R 'independently have the following meanings:

R R

R' R '

Wasserstoff oh Hydrogen oh

C1 bis C,-Alkyl nh2 C1 to C, alkyl nh2

Cs bis C12-Aryl nhr7 Cs to C12 aryl nhr7

C6 bis C20-Alkaryl n(r,)2 C6 to C20 alkaryl n (r,) 2

C6 bis C20-Aralkyl or7 C6 to C20 aralkyl or7

Cj bis C,-Alkanoyl Cj to C, -alkanoyl

C2 bis C7-Alkenyl C2 to C7 alkenyl

C2 bis C,-Alkinyl C2 to C, alkynyl

worin R7 einen Alkylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, einen Alkenylrest mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, einen Alkinylrest mit 2 bis 7 Kohlenstoffatomen, einen Arylrest mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen, einen Alkarylrest mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen oder einen Aralkylrest mit 6 bis 20 Kohlenstoffatomen bedeuten. wherein R7 is an alkyl group with 1 to 7 carbon atoms, an alkenyl group with 2 to 7 carbon atoms, an alkynyl group with 2 to 7 carbon atoms, an aryl group with 6 to 20 carbon atoms, an alkaryl group with 6 to 20 carbon atoms or an aralkyl group with 6 to 20 carbon atoms .

Wie bereits erwähnt, können die Symbole R und R' auch die folgenden neutralen Aminosäuregruppen und die folgenden Reste von Polypeptidketten mit 1 bis 20 Kohlenstoffatomen darstellen: As already mentioned, the symbols R and R 'can also represent the following neutral amino acid groups and the following residues of polypeptide chains with 1 to 20 carbon atoms:

R R' R R '

ASP GLU ASP GLU

SER SER SER SER

LEU THR LEU THR

SER-ASP LEU SER-ASP LEU

LEU-SER-ASP HIS LEU-SER-ASP HIS

LEU-ASP VAL LEU-ASP VAL

LEU-SER ARG LEU-SER ARG

GLU-SER GLU-SER

R' R '

GLU-THR GLU-THR

GLU-SER-LEU GLU-SER-LEU

GLU-SER-THR GLU-SER-THR

GLU-SER-THR-LEU GLU-SER-THR-LEU

glu-ser-thr-leu-his glu-ser-thr-leu-his

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG-LEU GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG-LEU

glu-ser-thr-leu-his-leu-val-leu-arg-leu-arg glu-ser-thr-leu-his-leu-val-leu-arg-leu-arg

Gemäss einer spezifischeren Ausführungsform der Erfindung werden neue Pentapeptide der folgenden Sequenz geschaffen. According to a more specific embodiment of the invention, new pentapeptides of the following sequence are created.

III. R-HN-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COR' III. R-HN-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COR '

worin R das Wasserstoffatom, einen Alkylrest mit 1 bis 7 Kohlenstoffatomen, z.B. den Methyl- oder Äthylrest, einen Arylrest mit 5 bis 12 Kohlenstoffatomen, z.B. einen Phenylrest, oder einen Alkan-oylrest mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, z.B. den Acetyl- oder Pro-pionylrest, und R' OH, NH2, NHR7 oder N(R,)2 bedeuten. Die am meisten bevorzugten Polypeptide sind jene, in welchen R das Wasserstoffatom und R' die Hydroxylgruppe bedeuten. wherein R is the hydrogen atom, an alkyl group with 1 to 7 carbon atoms, e.g. the methyl or ethyl radical, an aryl radical with 5 to 12 carbon atoms, e.g. a phenyl radical, or an alkano-oyl radical having 1 to 6 carbon atoms, e.g. the acetyl or propionyl radical, and R 'is OH, NH2, NHR7 or N (R,) 2. The most preferred polypeptides are those in which R represents the hydrogen atom and R 'represents the hydroxyl group.

Unter die vorliegenden Erfindungen fallen auch die pharmazeutisch zulässigen Salze solcher Pentapeptide. Als salzbildende Säuren mit Pentapeptiden kann man anorganische Säuren, z.B. Salz-, Bromwasserstoff-, Perchlor-, Salpeter-, Thiocyan-, Schwefel-, Phosphorsäure usw., und organische Säuren, z.B. Ameisen-, Essig-, Propion-, Glycol-, Milch-, Brenztrauben-, Oxal-, Malon-, Bernstein-, Malein-, Fumar-, Anthranil-, Zimt-, Naphthalensulfon- oder Sulf-anilsäure, als Beispiele nennen. The present inventions also include the pharmaceutically acceptable salts of such pentapeptides. As salt-forming acids with pentapeptides, there can be used inorganic acids, e.g. Hydrochloric, hydrobromic, perchloric, nitric, thiocyanic, sulfuric, phosphoric, etc., and organic acids, e.g. Formic, vinegar, propionic, glycolic, lactic, pyruvic, oxalic, malonic, amber, maleic, fumaric, anthranilic, cinnamon, naphthalenesulfonic or sulfanic acid as examples.

In den obigen Formeln werden die Aminosäurekomponenten der Peptide zweckmässigkeitshalber in abgekürzter Form wiedergegeben. Diese Abkürzungen sind die folgenden: In the formulas above, the amino acid components of the peptides are expediently given in abbreviated form. These abbreviations are as follows:

Aminosäure amino acid

Abkürzung abbreviation

L-Tyrosine L-tyrosine

TYR TYR

L-Asparagine L-asparagine

ASN ASN

L-Aspartic acid L-Aspartic acid

ASP ASP

L-Isoleucine L-isoleucine

ILE ILE

L-Serine L-serine

SER SER

L-Glutamine L-glutamine

GLN GLN

L-Leucine L-leucine

LEU LEU

L-Lysine L-lysine

LYS LYS

L-Glutamic L-glutamic

GLU GLU

L-Threonine L-threonine

THR THR

L-Histidine L-histidines

HIS HIS

L-Valine L-Valine

VAL VAL

L-Arginine L-arginine

ARG ARG

L-Alananine L-alananine

ALA ALA

Die erfindungsgemässen Polypeptide weisen ähnliche Eigenschaften auf, wie das 74 Aminosäuren enthaltende Polypeptid Ubiquitin (auch UBIP genannt), welches sich vom Rinderthymus nach den Angaben im amerikanischen Patent Nr. 4002602 isolieren lässt. Die erfindungsgemässen Peptide zeichnen sich insbesondere dadurch aus, dass sie die selektive Differenzierung von T-Zellenvorläufern und von B-Zellenvorläufern in ng-Konzentrationen herbeizuführen vermögen. The polypeptides according to the invention have similar properties to the ubiquitin (also called UBIP) polypeptide containing 74 amino acids, which can be isolated from the bovine thymus according to the information in American Patent No. 4002602. The peptides according to the invention are distinguished in particular by the fact that they are able to bring about the selective differentiation of T cell precursors and of B cell precursors in ng concentrations.

Es wurde gefunden, dass die erfindungsgemässen Polypeptide die Differenzierung der Vorläuferzellen der Immunozyten in vitro auf derselben Weise herbeiführen, wie die in dem US-Patent Nr. 4002602 beschriebenen langkettigen Polypeptide. Es hat sich also erwiesen, dass die erfindungsgemässen Polypeptide sogar in ng-Konzentrationen die Differenzierung sowohl der T-Zellenvorläufer, wie durch die Anschaffung der Thymusdifferenzierungsantigene TL und THY-1 (0) gezeigt wird, als auch der B-Zellenvorläufer herbeiführen, wie durch die Anschaffung von Komplementärrezeptoren, ein besonderes Kennzeichen der B-Zellen, gezeigt wird. It has been found that the polypeptides according to the invention induce the differentiation of the progenitor cells of the immunocytes in vitro in the same way as the long-chain polypeptides described in US Pat. No. 4002602. It has thus been found that the polypeptides according to the invention even in ng concentrations bring about the differentiation both of the T cell precursors, as shown by the acquisition of the thymus differentiation antigens TL and THY-1 (0), and of the B cell precursors, as by the acquisition of complementary receptors, a special characteristic of the B cells, is shown.

Um die Bedeutung der charakteristischen, differenzierenden biologischen Eigenschaften der erfindungsgemässen Polypeptide richtig zu verstehen, muss die Funktion des Thymus für die Immunität des Organismus dargelegt werden : Sie besteht im grossen in der Erzeugung von vom Thymus abgeleiteten Zellen, oder Lymphozyten, die T-Zellen genannt werden. Die T-Zellen bilden einen grossen Anteil der Gesamtmenge von rezirkulierenden kleinen Lymphozyten. Die T-Zellen haben eine immunologische Spezifität und sie greifen, als Effektorzellen, direkt in die zellulär übermittelten Immunitätsreaktionen (wie die Reaktionen auf Homotransplantation) ein. Die T-Zellen sondern jedoch keine humoralen Antikörper ab; solche werden durch direkt von dem Knochenmark abgeleitete Zellen, In order to correctly understand the meaning of the characteristic, differentiating biological properties of the polypeptides according to the invention, the function of the thymus for the immunity of the organism must be explained: It largely consists in the production of cells derived from the thymus, or lymphocytes, which are called T cells will. The T cells make up a large proportion of the total amount of recirculating small lymphocytes. The T cells have an immunological specificity and, as effector cells, they directly intervene in the cellularly transmitted immunity reactions (such as the reactions to homotransplantation). However, the T cells do not secrete humoral antibodies; such are caused by cells derived directly from the bone marrow,

ohne Beeinflussung durch den Thymus, erzeugt und diese zuletzt erwähnten Zellen werden B-Zellen genannt. Immerhin müssen bei vielen Antigenen T-Zellen von geeigneter Reaktivität nebst den B-Zellen vorhanden sein, damit letztere Antikörper erzeugen können. Der Mechanismus dieser Zusammenarbeit zwischen verschiedenen Zellarten ist heute noch nicht vollständig aufgeklärt. without being influenced by the thymus, and these last-mentioned cells are called B cells. After all, many antigens must have T cells of suitable reactivity in addition to the B cells so that the latter can produce antibodies. The mechanism of this collaboration between different cell types has not yet been fully elucidated.

Aus den oben stehenden Erläuterungen geht hervor, dass der Thymus für die Ausbildung der zellulären Immunität und zahlreicher humoraler Antikörperreaktionen .unerlässlich ist und dass für diese Systeme, im und durch den Thymus, die Differenzierung der hämatopoietischen Stammzellen zu T-Zellen herbeigeführt wird. Diese Vorgänge werden durch Sekretionen der epithelialen Zellen des Thymus, d.h. durch die Thymus-Hormone, gesteuert. The above explanations show that the thymus is indispensable for the development of cellular immunity and numerous humoral antibody reactions and that for these systems, in and through the thymus, the differentiation of the hematopoietic stem cells into T cells is brought about. These processes are caused by secretions of the epithelial cells of the thymus, i.e. controlled by the thymus hormones.

Zum Verständnis der Rolle des Thymus und des Zellensystems der Lymphozyten und zum Verständnis der Lymphozytenzirkula-tion im Körper muss ferner hervorgehoben werden, dass die Stammzellen im Knochenmark entstehen und in den Thymus durch die Blutbahn gelangen. Im Thymus erfolgt die Differenzierung der Stammzellen zu immunologisch kompetenten T-Zellen, welche dann in die Blutbahn übergehen und zusammen mit den B-Zellen zwischen den Geweben, dem lymphatischen System und der Blutbahn zirkulieren. In order to understand the role of the thymus and the cell system of the lymphocytes and to understand the lymphocyte circulation in the body, it must also be emphasized that the stem cells originate in the bone marrow and enter the thymus through the bloodstream. In the thymus, the stem cells are differentiated into immunologically competent T cells, which then pass into the bloodstream and circulate together with the B cells between the tissues, the lymphatic system and the bloodstream.

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

640 217 640 217

6 6

Die Körperzellen, welche Antikörper erzeugen, entwickeln sich auch aus den hämatopoietischen Stammzellen, ihre Differenzierung wird aber nicht durch den Thymus gesteuert. Weil sich diese Zellen von dem Knochenmark ableiten, werden sie B-Zellen genannt. Bei den Vögeln erfolgt ihre Differenzierung in einem dem Thymus ähnlichen Organ, welches Bursa von Fabricius genannt wird. Bei den Säugetieren hat man kein entsprechendes Organ gefunden und man nimmt an, dass sich die Differenzierung zu B-Zellen im Knochenmark vollzieht. Die physiologischen Substanzen, welche diese Differenzierung herbeiführen, sind noch völlig unbekannt. The body cells that produce antibodies also develop from the hematopoietic stem cells, but their differentiation is not controlled by the thymus. Because these cells are derived from the bone marrow, they are called B cells. In birds, they are differentiated in an organ similar to the thymus, which is called Bursa by Fabricius. No corresponding organ has been found in mammals and it is believed that the differentiation to B cells takes place in the bone marrow. The physiological substances that cause this differentiation are still completely unknown.

Infolge dieser Eigenschaften eignen sich die erfindungsgemässen Polypeptide zur therapeutischen Anwendung bei Mensch und "Tier: Sie eignen sich nämlich zur Herbeiführung der Differenzierung der in den hämatopoietischen Geweben entstehenden, lymphopoieti-schen Stammzellen zu vom Thymus abgeleiteten Zellen, auch T-Zellen genannt, welche sich an den Immunitätsreaktionen des Organismus beteiligen und auch die Differenzierung der B-Zellen herbeiführen können. Daraus folgen für die Produkte gemäss der Erfindung eine Vielzahl therapeutischer Verwendungen. Da die Verbindungen zuerst gewisse der erwähnten Thymusfunktionen erfüllen können, können sie bei verschiedenen Thymusfunktionen und Immunitätsgebieten angewendet werden. Ein erstes Anwendungsgebiet besteht in der Behandlung des DiGeorge-Syndroms, einer durch angeborenes Fehlen des Thymus gekennzeichneten Krankheit. Die Verabreichung der Polypeptide kann diesen Mangel beheben. Eine andere Anwendung findet sich in der Agammaglobulinämie, welche durch einen Fehler des in Organismus vermuteten, die B-Zellen differenzierenden Hormons verursacht ist. Die Verabreichung der Polypeptide kann die Folgen dieses Fehlers beheben. Infolge ihrer äusserst starken Wirkung bei niedriger Konzentration können sie der Gesamtimmunität des Körpers auf nützlicher Weise beitragen, indem sie die therapeutsiche Stimulierung der zellularen und humoralen Immunität erhöhen oder verstärken; dadurch können sie zur Behandlung von Krankheiten verwendet werden, welche mit einer chronischen Infektion in vivo einhergehen, wie z.B. Pilz- oder Myko-plasmainfektionen, Tuberkulosios, Lepra, akute und chronische Virusinfektionen usw. Ferner können die Verbindungen auf jedem Gebiet verwendet werden, in welchem die zellulare oder humorale Immunität eine Rolle spielt und insbesondere dort, wo Insuffizienzen der Immunität bestehen, wie bei dem bereits erwähnten DiGeor-ge-Syndrom. Dank ihrer Eigenschaften können die Polypeptide ferner in vitro verwendet werden, um die Entwicklung von Oberflä-chenantigenen der T-Zellen und die Entwicklung der funktionellen Fähigkeit zur Abwehr gegen Mitogene und Antigene und zum Zusammenwirken der Zellen bei der Förderung der Eignung der B-Zellen zur Antikörpererzeugung herbeizuführen. Sie erweisen sich in vitro wertvoll, indem sie die Entwicklung der B-Zellen herbeiführen, wie durch die Bildung von Oberflächenrezeptoren für das Komplement gezeigt wird. Die Polypeptide sind auch zur Hemmung der unkontrollierten Proliferation von unter dem Einfluss des Ubiquitins entstehenden Lymphozyten wertvoll. Eine wichtige Eigenschaft der Polypeptide ist ihre Fähigkeit,, in vivo Zellen mit den charakteristischen Wirkungen der T-Zellen und in vitro auch Zellen mit den charakteristischen Wirkungen der B-Zellen wiederherzustellen. As a result of these properties, the polypeptides according to the invention are suitable for therapeutic use in humans and animals: namely, they are suitable for bringing about the differentiation of the lymphopoietic stem cells formed in the hematopoietic tissues into cells derived from the thymus, also called T cells, which are called participate in the immune reactions of the organism and can also bring about the differentiation of the B cells. This results in a multitude of therapeutic uses for the products according to the invention. Since the compounds can first fulfill certain of the thymus functions mentioned, they can be used in various thymus functions and areas of immunity A first application is in the treatment of DiGeorge syndrome, a disease characterized by congenital absence of the thymus. The administration of the polypeptides can remedy this deficiency. Another application is found in agammaglobulinemia, which he is caused by an error in the hormone suspected in the organism that differentiates the B cells. The administration of the polypeptides can correct the consequences of this error. As a result of their extremely potent action at low concentration, they can contribute to the overall immunity of the body in a useful way by increasing or strengthening the therapeutic stimulation of cellular and humoral immunity; thereby they can be used to treat diseases associated with chronic infection in vivo, such as Fungal or mycoplasmic infections, tuberculosis, leprosy, acute and chronic viral infections, etc. Furthermore, the compounds can be used in any field in which cellular or humoral immunity plays a role and in particular where there are insufficiency of immunity, such as that DiGeor-ge syndrome already mentioned. Thanks to their properties, the polypeptides can also be used in vitro to develop surface antigens of the T cells and to develop the functional ability to defend against mitogens and antigens and to interact with the cells in promoting the suitability of the B cells To produce antibodies. They prove valuable in vitro by inducing the development of B cells, as evidenced by the formation of surface receptors for the complement. The polypeptides are also valuable for inhibiting the uncontrolled proliferation of lymphocytes that arise under the influence of ubiquitin. An important property of the polypeptides is their ability to restore cells with the characteristic effects of T cells in vivo and cells with the characteristic effects of B cells in vitro.

Eine weitere bedeutungsvolle Eigenschaft der erfindungsgemässen Peptide ist ihre hohe Aktivität in sehr niedrigen Konzentrationen. Wirksam sind sie nämlich sind sie nämlich in Konzentrationen ab 10 ng/ml, und ihre maximale Aktivität findet sich bei Konzentrationen ab etwa 0,05 bis 1 ng/ml. Als Träger kann jeder für diesen Zweck bekannte Träger verwendet werden, einschliesslich normale Kochsalzlösungen, vorzugsweise mit einem Protein, wie Rinderserumalbumin, als Verdünnungsmittel, um bei derart niedrigen Konzentrationen Verluste durch Adsorption an dem Glasmaterial vorzubeugen. Die erfindungsgemässen Peptide entfalten ihre Wirkung bei einer Dosierung von etwa 0,1 mg/kg Körpergewicht. Bei der Behandlung des DiGeorge-Syndroms können die Polypeptide in einer Dosis von etwa 0,1 bis 10 mg/kg Körpergewicht verabreicht werden. Im allgemeinen können Dosierungen derselben Grössenordnung zur Behandlung der anderen zuvor erwähnten Zustände oder Erkrankungen verwendet werden. Another important property of the peptides according to the invention is their high activity in very low concentrations. They are effective at concentrations from 10 ng / ml and their maximum activity is found at concentrations from around 0.05 to 1 ng / ml. Any carrier known for this purpose can be used as carrier, including normal saline solutions, preferably with a protein such as bovine serum albumin, as a diluent in order to prevent losses due to adsorption on the glass material at such low concentrations. The peptides according to the invention develop their effect at a dosage of about 0.1 mg / kg body weight. In the treatment of DiGeorge syndrome, the polypeptides can be administered in a dose of about 0.1 to 10 mg / kg body weight. In general, dosages of the same order of magnitude can be used to treat the other conditions or diseases mentioned above.

Erfindungsgemäss werden die Polypeptide nach dem Verfahren gemäss einem der Ansprüche 25 oder 28, d.h. nach der von Merri-field in „Journal of American Chemical Society", 85, S. 2149 bis 2154,1963 beschriebenen Methode ähnlichen Verfahren hergestellt. Die.Synthese erfolgt durch stufenweise Addition von geschützten Aminosäuren zu einer wachsenden Peptidkette, welche an feste Harzteilchen durch kovalente Bindungen gebunden war. Bei dieser Arbeitsweise wurden die Reagenzien und die Nebenprodukte durch Filtrieren entfernt und das Umkristallisieren der Zwischenprodukte fiel weg. Ganz allgemeinen beruht diese Methode auf der Bindung der ersten Aminosäure der Kette an ein festes Polymere durch eine kovalente Bindung und der stufenweise Zugabe der weiteren Aminosäuren nacheinander, bis die gewünschte Aminosäuresequenz bewerkstelligt worden ist. Schliesslich wird das Peptid von dem festen Trägermaterial freigesetzt und die Schutzgruppen werden abgespalten. Diese Methode ergibt eine wachsende, an völlig unlösliche feste Teilchen gebundene Peptidkette, so dass letztere jeweils in zum Filtrieren und Wegwaschen der Reagenzien und Nebenprodukte geeigneter Form vorliegt. According to the invention, the polypeptides are processed by the process according to one of claims 25 or 28, i.e. by the method similar to that described by Merri-field in "Journal of American Chemical Society", 85, pp. 2149 to 2154, 1963. The synthesis is carried out by stepwise addition of protected amino acids to a growing peptide chain, which binds to solid resin particles In this procedure, the reagents and the by-products were removed by filtration and the recrystallization of the intermediate products was eliminated. In general, this method is based on the binding of the first amino acid of the chain to a solid polymer by means of a covalent bond and the gradual addition of the further amino acids one after the other until the desired amino acid sequence has been achieved. Finally, the peptide is released from the solid support material and the protective groups are cleaved off. This method results in a growing peptide chain which is bound to completely insoluble solid particles, so that the latter in each case for filtration and d Wash away the reagents and by-products in a suitable form.

Die Aminosäuren können an einem beliebigen geeigneten Polymer haften, welches allerdings in den verwendeten Lösungsmitteln unlöslich sein und eine beständige physikalische Form aufweisen muss, um ein leichtes Filtrieren zu ermöglichen. Es muss überdies eine funktionelle Gruppe enthalten, an welcher die erste geschützte Aminosäure durch eine kovalente Bindung sich fest verankern lässt. Verschiedene Polymere eignen sich für diese Zwecke, so z.B. Cellulose, Polyvinylalkohol, Polymethacrylat und sulfoniertes Polystyrol, doch wird man für die erfindungsgemässe Synthese mit Vorteil ein chlormethyliertes Copolymer von Styrol und Divinyl-benzol verwenden. The amino acids can adhere to any suitable polymer which, however, must be insoluble in the solvents used and must have a stable physical form in order to enable easy filtration. It must also contain a functional group to which the first protected amino acid can be firmly anchored by means of a covalent bond. Various polymers are suitable for these purposes, e.g. Cellulose, polyvinyl alcohol, polymethacrylate and sulfonated polystyrene, but a chloromethylated copolymer of styrene and divinyl benzene will advantageously be used for the synthesis according to the invention.

Die verschiedenen funktionellen Gruppen an der Aminosäure, welche aktiv sind, jedoch an den Reaktionen nicht teilzunehmen haben, werden durch übliche Schutzgruppen, wie sie üblicherweise in der Polypeptidchemie Verwendung finden, geschützt. Solche funktionelle Gruppen am Tyrosin und Lysin werden durch Schutzgruppen geschützt, welche nach dem Aufbau der Sequenz sich entfernen lassen, ohne das Polypeptidendprodukt nachteilig zu beeinflussen. Die Synthese erfolgt durch eine Modifikation der Synthese in fester Phase insofern, als man Fluorescamin verwendet, um damit festzustellen, wann die Kupplung beendet ist. Dies wird durch die positive Fluoreszenz (vgl. Felix et al., „Analyt. Biochem.", 52, 377, 1973) nachgewiesen. Hat die Kupplung nicht vollständig stattgefunden, so wird der Kupplungsvorgang erneut mit der gleichen geschützten Aminosäure vor der Entfernung der Schutzgruppe wiederholt. The various functional groups on the amino acid which are active but do not have to take part in the reactions are protected by customary protective groups, as are usually used in polypeptide chemistry. Such functional groups on the tyrosine and lysine are protected by protective groups which can be removed after the construction of the sequence without adversely affecting the end product of the polypeptide. The synthesis is accomplished by modification of the solid phase synthesis in that fluorescamine is used to determine when the coupling is complete. This is demonstrated by the positive fluorescence (cf. Felix et al., "Analyt. Biochem.", 52, 377, 1973). If the coupling has not taken place completely, the coupling process is repeated with the same protected amino acid before the removal of the Protection group repeated.

Das allgemeinen Verfahren erfordert anfänglich eine Veresterung von L-Lysin, welches an seinen Aminogruppen Schutzgruppen aufweist, und zwar mit dem Harz in einem Amin enthaltenden, absoluten Alkohol. Das gekuppelte Aminosäureharz wird hierauf abfiltriert, mit Alkohol und mit Wasser gewaschen und getrocknet. Die Schutzgruppe an der a-Aminogruppe der Lysin-Aminosäure, z.B. t-BÖC, d.h. tert.-Butyloxycarbonyl, wird hierauf ohne Beeinflussung der anderen Schutzgruppen beseitigt. Das so erhaltene gekuppelte Aminosäureharz, welches die freie Aminogruppe aufweist, wird hierauf mit einem geschützten L-Glutamin, vorzugsweise a-t-BOC-L-Glutamin umgesetzt, um das L-Glutamin zu kuppeln. Die Umsetzungen werden hierauf erneut mit geschütztem L-Isoleucin, L-Aspa-ragin und L-Tyrosin so lange wiederholt, bis das vollständige Molekül zustande gekommen ist. Die Sequenz der Reaktionen erfolgt in folgender Weise: The general procedure initially requires esterification of L-lysine, which has protecting groups on its amino groups, with the resin in an amine containing absolute alcohol. The coupled amino acid resin is then filtered off, washed with alcohol and with water and dried. The protecting group on the a-amino group of the lysine amino acid, e.g. t-BÖC, i.e. tert-butyloxycarbonyl, is then removed without influencing the other protective groups. The coupled amino acid resin thus obtained, which has the free amino group, is then reacted with a protected L-glutamine, preferably a-t-BOC-L-glutamine, in order to couple the L-glutamine. The reactions are then repeated again with protected L-isoleucine, L-Asparagin and L-tyrosine until the complete molecule has been obtained. The sequence of the reactions is as follows:

Harz resin

R.2 I R.2 I

a-BOC-Lys-COOH a-BOC-Lys-COOH

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

7 7

640 217 640 217

Rz I Margin no

a-BOC-Lys-Harz a-BOC-Lys resin

| Entfernung der a- Aminoschutzgruppe r2 | Removal of the a-amino protecting group r2

I I.

H2N-Lys-Harz a-BOC-L-Gln H2N-Lys resin a-BOC-L-Gln

R2 R2

a-BOC-Gln-Lys-Harz a-BOC-Gln-Lys resin

Entfernung der a-Aminoschutzgruppe r, Removal of the a-amino protecting group r,

H2N-Gln-Lys-Harz a-BOC-Ile-COOH H2N-Gln-Lys resin a-BOC-Ile-COOH

r2 r2

I I.

a-BOC-Ile-Gln-Lys-Harz a-BOC-Ile-Gln-Lys resin

Entfernung der a-Aminoschutzgruppe Removal of the a-amino protecting group

R2 I R2 I

H2N-Ile-Gln-Lys-Harz a-BOC-Asn-COOH R2 H2N-Ile-Gln-Lys resin a-BOC-Asn-COOH R2

I I.

a-BOC-Asn-Ile-Gln-Lys-Harz a-BOC-Asn-Ile-Gln-Lys resin

Entfernung der a-Aminoschutzgruppe r2 Removal of the a-amino protecting group r2

I I.

H2N-Asn-Ile-Gln-Lys-Harz Ri H2N-Asn-Ile-Gln-Lys resin Ri

I I.

a-R3-Tyr-COOH a-R3-Tyr-COOH

r, r,

a-R3-Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys-Harz a-R3-Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys resin

| Entfernung sämtlicher Schutzgruppen | Removal of all protective groups

H2N-Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys-COOH H2N-Tyr-Asn-Ile-Gln-Lys-COOH

In der obigen Sequenz der Reaktionen sind Rj und R2 Schutzgruppen an den verschiedenen reaktionsfähigen Seitenketten der Aminosäuren. a-R3 stellt eine Schutzgruppe der a-Aminogruppe dar. Bei den obigen Pentapeptidharzzwischenprodukten bedeuten das Symbol R[ vorzugsweise eine Schutzgruppe, z.B. die 0-2,6-Dichlorbenzylgruppe, R2 vorzugsweise den e-2-Chlorbenzyloxy-carbonylrest und R3 vorzugsweise den tert.-Butoxyloxycarbonylrest. Das Harz kann ein beliebiges Harz der oben erwähnten Art sein, soweit es sich für dieses Verfahren eignet. In der obigen Reaktionsfolge werden die Peptide, bei welchen ALA durch TYR, ASN oder ILE ersetzt ist, in der gleichen Weise hergestellt. In the above sequence of reactions, Rj and R2 are protecting groups on the various reactive side chains of the amino acids. a-R3 represents a protecting group of the a-amino group. In the above pentapeptide resin intermediates, the symbol R [preferably means a protecting group, e.g. the 0-2,6-dichlorobenzyl group, R2 preferably the e-2-chlorobenzyloxycarbonyl radical and R3 preferably the tert-butoxyloxycarbonyl radical. The resin can be any resin of the type mentioned above, as far as it is suitable for this process. In the above reaction sequence, the peptides in which ALA is replaced by TYR, ASN or ILE are produced in the same way.

Nach der Herstellung des letzten Zwischenproduktes wird das Peptidharz aufgespalten, um die Schutzgruppen Rl5 R2 und R3 und das Harz abzuspalten. Die Schutzgruppen werden in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Behandlung mit wasserfreiem Fluorwasserstoff, entfernt und das so erhaltene freie Peptid hierauf isoliert. After the last intermediate product has been prepared, the peptide-resin is split up in order to split off the protective groups R1, R2 and R3 and the resin. The protective groups are removed in a manner known per se, for example by treatment with anhydrous hydrogen fluoride, and the free peptide thus obtained is isolated thereon.

Wenn auch das bevorzugte Verfahren zur Herstellung der erfindungsgemässen Polypeptide auf der Verwendung eines unlöslichen festen Polymers, wie in der Methode von Merrifield beschrieben wurde, beruht, so soll es doch klar sein, dass andere Herstellungsver-s fahren ebenfalls verwendet werden können. Beispielsweise kann ein anderer fester Trägerstoff, wie ein N-Methylbenzydrylaminharz oder Benzhydrylaminharz, verwendet werden, was sich unter gewissen Bedingungen als vorteilhaft erweist. In diesem Verfahren ist die C-terminale Aminosäure direkt an das Harz gebunden und das fertige io Peptid kann von dem Trägerstoff unter Bildung von C-terminalen Amiden mittels Fluorwasserstoff abgespalten werden. Die Methoden, nach welchen ein N-Methylbenzhydrylaminharz verwendet werden kann, werden durch Mohahan et al. in „Biochemical and Biophysical Research Communications", 48,1100-1105 (1972), be-15 schrieben. Die Art und Weise, wie ein Benzhydrylaminharz verwendet werden kann, ist durch J. Rivier et al. in „Journal of Médicinal Chemistry", 16, 545-549 (1973), beschrieben. Although the preferred method of making the polypeptides of the present invention is based on the use of an insoluble solid polymer as described in the Merrifield method, it should be understood that other methods of preparation can also be used. For example, another solid carrier such as an N-methylbenzydrylamine resin or benzhydrylamine resin can be used, which is advantageous under certain conditions. In this process, the C-terminal amino acid is bound directly to the resin and the finished io peptide can be cleaved from the carrier to form C-terminal amides using hydrogen fluoride. The methods by which an N-methylbenzhydrylamine resin can be used are described by Mohahan et al. in "Biochemical and Biophysical Research Communications", 48, 1100-1105 (1972), 15. The manner in which a benzhydrylamine resin can be used is described by J. Rivier et al. in the "Journal of Medical Chemistry" , 16, 545-549 (1973).

Verschiedene Derivate des basischen Pentapeptides können auch nach anderen bekannten Methoden hergestellt werden. Selbstver-20 ständlich wird es zur Herstellung der gewünschten Derivate notwendig sein, funktionelle Gruppen, welche mit der Reaktionsfolge interferieren können, zu blockieren. Beispielsweise sollte während der Herstellung dieser Derivate die a-Carboxylgruppe der Asparagin-säure oder die a-Aminogruppe des Lysins blockiert sein. 25 Wie bereits erwähnt worden ist, ist es bei der Durchführung des Verfahrens erforderlich, die Aminogruppen entweder zu schützen oder zu blockieren, um die Reaktion richtig zu steuern und die gewünschten Produkte zu erhalten. Geeignete Schutzgruppen für die Aminogruppen, welche man mit Vorteil verwenden kann, umfassen 30 die Salzbildung für das Schützen stark basischer Aminogruppen, Various derivatives of the basic pentapeptide can also be prepared by other known methods. Of course, in order to produce the desired derivatives, it will be necessary to block functional groups which can interfere with the reaction sequence. For example, the a-carboxyl group of aspartic acid or the a-amino group of lysine should be blocked during the preparation of these derivatives. 25 As already mentioned, in order to carry out the process it is necessary to either protect or block the amino groups in order to control the reaction properly and to obtain the desired products. Suitable protecting groups for the amino groups, which can be used with advantage, include salt formation for protecting strongly basic amino groups,

oder Urethanschutzsubstituenten, wie Benzyloxycarbonyl und tert.-Butyloxycarbonyl. Vorzugsweise braucht man tert.-Butyloxycarbon-yl (t-BOC) oder tert.-Amyloxycarbonyl (AOC) zum Schützen der a-Aminogruppe in den Aminosäuren, welche am endständigen Carb-35 oxylrest des Moleküls eine Reaktion eingehen, weil die BOC- und AOC- (tert.-Amyloxycarbonyl)-Schutzgruppen sich anschliessend an eine solche Reaktion und für die sich anschliessende Stufe (worin eine solche a-Aminogruppe selbst eine Reaktion eingeht) durch die Einwirkung von schwachen Säuren, wie Trifluoressigsäure, welch 40 letztere Behandlung die zum Schützen anderer reaktionsfähiger Seitenketten verwendeten Gruppen nicht beeinträchtigt, leicht entfernt werden. Daraus ergibt sich, dass die a-Aminogruppen durch Reaktion mit einer beliebigen Verbindung geschützt werden können, welche die Aminogruppen für die anschliessende Reaktion bzw. die 45 anschliessenden Reaktionen schützt, jedoch unter Bedingungen, welche das Molekül anderweitig nicht zu beeinflussen vermögen, anschliessend entfernt werden kann. Beispiele solcher Verbindungen sind organische Carbonsäurederivate, welche die Aminogruppe acy-lieren. or urethane protective substituents such as benzyloxycarbonyl and tert-butyloxycarbonyl. It is preferable to use tert-butyloxycarbon-yl (t-BOC) or tert-amyloxycarbonyl (AOC) to protect the a-amino group in the amino acids which react at the terminal carb-35 oxyl radical of the molecule because the BOC and AOC (tert-amyloxycarbonyl) protective groups follow such a reaction and for the subsequent step (in which such an a-amino group itself undergoes a reaction) by the action of weak acids such as trifluoroacetic acid, the latter 40 the treatment of which Protecting other reactive side chains used groups are not compromised, easily removed. It follows from this that the a-amino groups can be protected by reaction with any compound which protects the amino groups for the subsequent reaction or the 45 subsequent reactions, but are subsequently removed under conditions which cannot otherwise influence the molecule can. Examples of such compounds are organic carboxylic acid derivatives which acylate the amino group.

so Im allgemeinen kann man die verschiedenen Aminogruppen durch Umsetzung mit einer Verbindung schützen, welche eine Gruppierung der folgenden Formel enthält: In general, the various amino groups can be protected by reaction with a compound which contains a group of the following formula:

O O

II II

55 R-O-C- 55 R-O-C-

worin R einen beliebigen Rest darstellt, welcher die Aminogruppe davor schützt, die anschliessende Kupplungsreaktion einzugehen, und welcher ohne Zerstörung des Moleküls sich beseitigen lässt. 60 Somit ist R ein geradkettiger oder verzweigter Alkylrest, welcher ungesättigt sein kann und vorzugsweise 1 bis 10 Kohlenstoffatome enthält, ein vorzugsweise 6 bis 15 Kohlenstoffatome enthaltender Arylrest, ein vorzugsweise 5 bis 8 Kohlenstoffatome aufweisender Cycloalkylrest, ein vorzugsweise 7 bis 18 Kohlenstoffatome aufwei-65 sender Aralkylrest, ein vorzugsweise 7 bis 18 Kohlenstoffatome aufweisender Alkarylrest oder ein heterocyclischer Rest, z.B. der Isoni-cotinylrest. Der Aryl-, Aralkyl- und Alkarylteil kann weitere Substi-tuenten und zwar eine oder mehrere Alkylgruppen mit 1 bis unge- where R represents any radical which protects the amino group from entering into the subsequent coupling reaction and which can be removed without destroying the molecule. 60 Thus, R is a straight-chain or branched alkyl radical which may be unsaturated and preferably contains 1 to 10 carbon atoms, an aryl radical preferably containing 6 to 15 carbon atoms, a cycloalkyl radical preferably having 5 to 8 carbon atoms, a transmitter having preferably 7 to 18 carbon atoms Aralkyl radical, an alkaryl radical preferably having 7 to 18 carbon atoms or a heterocyclic radical, for example the isoni-cotinyl residue. The aryl, aralkyl and alkaryl part can have further substituents, namely one or more alkyl groups with 1 to 1

640 217 640 217

8 8th

fähr 4 KohlenstofFatomen aufweisen. Bevorzugte Reste R umfassen die tert.-Butyl-, tert.-Amyl-, Phenyl-, Tolyl-, Xylyl- und Benzylreste. Besonders bevorzugte, spezifische, die Aminogruppe schützende Gruppen umfassen die Benzyloxycarbonylgruppe, substituierte Benzyloxycarbonylgruppen, worin der Phenylrest durch mindestens ein Halogenatom, z.B. Chlor oder Brom, substituiert ist, Nitrogrup-pen, niedere Alkoxyreste, z.B. Methoxyreste, niedere Alkylreste, tert.-Butyloxycarbonylreste, tert.-Amyloxycarbonylreste, Cyclo-hexyloxycarbonylreste, Vinyloxycarbonylreste, Adamantyloxycar-bonylreste, Diphenylisopropoxycarbonylreste usw. Andere verwendbare Schutzgruppen umfassen die Isonicotinyloxycarbonyl-, Phtha-loyl-, p-Tolylsulfonyl- und Formylreste usw. have about 4 carbon atoms. Preferred radicals R include the tert-butyl, tert-amyl, phenyl, tolyl, xylyl and benzyl radicals. Particularly preferred, specific groups protecting the amino group include the benzyloxycarbonyl group, substituted benzyloxycarbonyl groups in which the phenyl radical is substituted by at least one halogen atom, e.g. Chlorine or bromine, substituted, nitro groups, lower alkoxy, e.g. Methoxy groups, lower alkyl groups, tert-butyloxycarbonyl groups, tert-amyloxycarbonyl groups, cyclo-hexyloxycarbonyl groups, vinyloxycarbonyl groups, adamantyloxycarbonyl groups, diphenylisopropoxycarbonyl groups, etc.

Bei der Durchführung des Verfahrens dieser Erfindung wird das Peptid durch Umsetzung der freien a-Aminogruppe mit einer Verbindung, welche geschützte Aminogruppen aufweist, aufgebaut. Für die Umsetzung oder die Kupplung wird die anzugreifende Verbindung an ihrer Carboxylgruppe so aktiviert, dass die Carboxylgruppe hierauf mit der freien a-Aminogruppe an der anhaftenden Peptidkette reagieren kann. Um diese Aktivierung zu bewirken, kann man die Carboxylgruppe in eine beliebige, reaktionsfähige Gruppe, z.B. in einen Ester, in ein Anhydrid, Azid, ein Säurechlorid oder dgl., überführen. In practicing the method of this invention, the peptide is constructed by reacting the free a-amino group with a compound having protected amino groups. For the reaction or the coupling, the compound to be attacked is activated on its carboxyl group such that the carboxyl group can then react with the free a-amino group on the adhering peptide chain. To effect this activation, the carboxyl group can be divided into any reactive group, e.g. convert to an ester, an anhydride, azide, an acid chloride or the like.

Dabei ist zu verstehen, dass während dieser Umsetzungen die Aminosäurebestandteile sowohl Aminogruppen als auch Carboxyl-gruppen aufweisen, wobei gewöhnlich eine Gruppierung an der Reaktion teilnimmt, während die andere oder die anderen geschützt sind. Vor der Kupplungsstufe wird die Schutzgruppe an der a-Aminogruppe bzw. an der endständigen Aminogruppe des zu reagierenden Peptids unter Bedingungen entfernt, welche die übrigen Schutzgruppen, z.B. die Gruppe an der Aminogruppe des Lysinmo-leküls, im wesentlichen nicht beeinträchtigen. Das bevorzugte Verfahren zur Durchsetzung dieser Stufe besteht in einer schwachen Acidolyse, beispielsweise durch Umsetzung bei Zimmertemperatur mit Trifluoressigsäure. It is to be understood that during these reactions the amino acid components have both amino groups and carboxyl groups, usually one group taking part in the reaction while the other or the others are protected. Before the coupling step, the protective group on the a-amino group or on the terminal amino group of the peptide to be reacted is removed under conditions which the other protective groups, e.g. essentially does not affect the group on the amino group of the lysine molecule. The preferred method for enforcing this step is weak acidolysis, for example by reaction at room temperature with trifluoroacetic acid.

Wie aus den obigen Darlegungen hervorgeht, erzielt man nach der oben beschriebenen Reihe von Verfahrensstufen die Herstellung des spezifischen Pentapeptids der folgenden Formel: As can be seen from the above, the specific pentapeptide of the following formula is obtained after the series of process steps described above:

H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOH H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOH

Dieses Pentapeptid umfasst ebenfalls die zugrundliegende, reaktionsfähige Sequenz des erfindungsgemässen Polypeptids. Das substituierte Pentapeptid der Formel II, worin die endständigen TYR-und LYS-Aminosäuregruppen in der oben beschriebenen Weise weiter substituiert sein können, werden hierauf dadurch erhalten, dass man dieses zugrundeliegende Pentapeptid mit einem geeigneten Reaktionsmittel umsetzt, um zu den gewünschten Derivaten zu gelangen. Reaktionen solcher Art, wie z.B. Acylierung, Veresterung, Amidierung usw., sind für den Fachmann durchaus bekannt. Ferner werden andere Aminosäuren, d.h. Aminosäuregruppen, welche die biologische Wirksamkeit des zugrundeliegenden Pentapeptidmole-küls nicht beeinträchtigen, der Peptidkette mit der gleichen Reaktionssequenz zugesetzt, gemäss welcher das Pentapeptid synthetisiert worden ist. Dies kann an einem beliebigen Ende der Peptidgruppe geschehen. This pentapeptide also comprises the underlying, reactive sequence of the polypeptide according to the invention. The substituted pentapeptide of the formula II, in which the terminal TYR and LYS amino acid groups can be further substituted in the manner described above, are then obtained by reacting this underlying pentapeptide with a suitable reactant in order to obtain the desired derivatives. Reactions of this kind, e.g. Acylation, esterification, amidation etc. are well known to those skilled in the art. Furthermore, other amino acids, i.e. Amino acid groups which do not impair the biological effectiveness of the underlying pentapeptide molecule are added to the peptide chain with the same reaction sequence according to which the pentapeptide was synthesized. This can be done at any end of the peptide group.

Die folgenden Beispiele erläutern die vorliegende Erfindung, The following examples illustrate the present invention.

ohne sie irgendwie einzuschränken. Sowohl in den Beispielen als auch in der Beschreibung bedeuten die Teile jeweils Gewichtsteile, sofern nichts anderes' ausgesagt wird. without restricting them in any way. In the examples as well as in the description, the parts mean parts by weight, unless otherwise stated.

Beispiel 1: Example 1:

Bei der Herstellung des erfindungsgemässen Polypeptids wurden die folgenden Materialien in Handel gekauft. a-BOC-L-Glutamin-O-nitrophenylester a-BOC-e-2-chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin a-BOC-Asparagin a-BOC-L-Isoleucin a-BOC-0-2,6-dichlorbenzyl-L-tyrosin In the preparation of the polypeptide according to the invention, the following materials were purchased commercially. a-BOC-L-glutamine-O-nitrophenyl ester a-BOC-e-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine a-BOC-asparagine a-BOC-L-isoleucine a-BOC-0-2,6-dichlorobenzyl-L- tyrosine

Bei diesen Reaktionsmitteln stellt BOC den tert.-Butyloxycarb-onylrest dar. Auch Reagenzien des Reinheitsgrades zur Aminosäuresequenzbestimmung, das Dicyclohexylcarbodiimid, das Fluoresca-min und das Harz wurden käuflich erworben. Als Harz wurde ein Polystyroldivinylbenzolharz mit einer Maschenweite von 0,037 bis 0,074 mm („200-400 mesh") verwendet, welches 1 % Divinylbenzol und 0,75 mmol Chlorid/g Harz enthielt. With these reactants, BOC represents the tert-butyloxycarb-onyl residue. Reagents of the degree of purity for the determination of the amino acid sequence, the dicyclohexylcarbodiimide, the fluoresca-min and the resin were also purchased. A polystyrene-divinylbenzene resin with a mesh size of 0.037 to 0.074 mm (“200-400 mesh”) was used as the resin, which contained 1% divinylbenzene and 0.75 mmol chloride / g resin.

Bei der Herstellung des Polypeptids wurden 2 mmol a-BOC-s-2-Chlorbenzyloxycarbonyl-L-lysin mit 2 mmol chlormethyliertem Harz in 1 mmol Triäthylamin enthaltendem, absolutem Alkohol während 24 h bei 80° C verestert. Das erhaltene, gekuppelte Aminosäureharz wurde abfiltriert, mit absolutem Alkohol gewaschen und getrocknet. Hierauf wurden die anderen a-Aminosäuren in ähnlicher Weise mit der von der Schutzgruppe befreiten a-Aminogruppe des Peptidharzes in der richtigen Reihenfolge gekuppelt, um zum erfindungsgemässen Polypeptid zu gelangen, wobei man äquivalente Mengen an Dicyclohexylcarbodiimid verwendete, mit Ausnahme allerdings für den a-BOC-L-Glutamin-O-nitrophenylester, welcher direkt gekuppelt wurde. Nach jeder Kupplungsreaktion wurde ein Teil des Harzes mit Fluorescamin getestet, wobei in jenen Fällen, in denen man eine positive Fluoreszenz feststellte, die Kupplung als unvollständig anzusehen hatte, so dass der Vorgang mit der gleichen geschützten Aminosäure erneut vorgenommen wurde. Auf Grund der verschiedenen Kupplungsreaktionen erhielt man als Zwischenprodukt das Pentapeptidharz. In the preparation of the polypeptide, 2 mmol of a-BOC-s-2-chlorobenzyloxycarbonyl-L-lysine were esterified with 2 mmol of chloromethylated resin in absolute alcohol containing 1 mmol of triethylamine at 80 ° C. for 24 h. The coupled amino acid resin obtained was filtered off, washed with absolute alcohol and dried. The other a-amino acids were then similarly coupled to the deprotected a-amino group of the peptide resin in the correct order to arrive at the polypeptide of the invention, using equivalent amounts of dicyclohexylcarbodiimide, except for the a-BOC -L-glutamine-O-nitrophenyl ester, which was coupled directly. After each coupling reaction, part of the resin was tested with fluorescamine, and in those cases where positive fluorescence was found, the coupling was considered incomplete, so that the procedure was repeated with the same protected amino acid. Due to the various coupling reactions, the pentapeptide resin was obtained as an intermediate.

Dieses Peptidharz wurde gespalten und die Schutzgruppen wurden in einer Kelf-Aufspaltungsapparatur (Peninsula Laboratories, Inc.) unter Verwendung von wasserfreiem Fluorwasserstoff bei 0°C während 60 min mit Hilfe von 1,2 ml Anisol/g Peptidharz als Spülmittel beseitigt. Das Peptidgemisch wurde lyophilisiert und mit wasserfreiem Äther gewaschen. Dann wurde das Peptid über P-6-Bio-Gel in lN-Essigsäurelösung chromatographiert. Das erhaltene Polypeptid hatte einen Reinheitsgrad von 94% und entsprach der folgenden Sequenz: This peptide resin was cleaved and the protecting groups were removed in a Kelf splitting apparatus (Peninsula Laboratories, Inc.) using anhydrous hydrogen fluoride at 0 ° C for 60 min using 1.2 ml anisole / g peptide resin as a rinse aid. The peptide mixture was lyophilized and washed with anhydrous ether. Then the peptide was chromatographed over P-6 bio-gel in 1N acetic acid solution. The polypeptide obtained had a purity of 94% and corresponded to the following sequence:

H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOH H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOH

Beispiel 2: Example 2:

Die Aktivität und die Eigenschaften des Polypeptides sind bei gesunden, 5 bis 6 Wochen alten nu/nu-Mäusen beiderlei Geschlechts, welche auf einem BALB-/c-Hintergrund (thymocytes expressing Thy-1.2 surface antigen) grossgezogen und unter üblichen Bedingungen gehalten wurden. Was die Antisera betrifft, so wurden die Thy-1,2-Antisera mit Hilfe von Mäusen desselben Thy-1-Stamms hergestellt. The activity and properties of the polypeptide are in healthy, 5 to 6 week old nu / nu mice of both sexes, which were raised on a BALB / c background (thymocytes expressing Thy-1.2 surface antigen) and kept under normal conditions. As for the antisera, the Thy-1,2 antisera were made using mice of the same Thy-1 strain.

In bezug auf die Herbeiführung in vitro der Differenzierung der Thy-1 + T-Zellen oder der CR+ B-Zellen, die Differenzierung der Thymozyten aus Prothymozyten in vitro wurde nach der Methode von Komuro und Boyse, („The Lancet", 1, 740, 1973) herbeigeführt, wobei als Kriterium der T-Zellen-Differenzierung die Anschaffung von Thy-1,2 benutzt wurde. Die Herbeiführung der Differenzierung der CR+ B-Zellen aus den CR- B-Zellen-Vorläufern in vitro wurde unter ähnlichen Bedingungen durchgeführt, wobei als Kriterium die Fähigkeit der CR+ B-Zellen zur Bindung von mit sub-agglutinieren-den Mengen von Kaninchen-Antikörpern und nichtlytischem Komplement überzogenen Schaferythrozyten verwendet wurde. Als Quelle der beiden Vorläuferarten (Thy-1 - und CR-) wurden Milzellen von gesunden nu/nu-Mäusen gebraucht, welche Zellen zuvor mit Hilfe von diskontinuierlichen Gradienten von Rinderserumalbumin fraktioniert worden waren, da sich darunter nur wenige oder keine Thy-T +-Zellen und nur ein kleiner Anteil von CR+-Zellen befindet. Regarding the in vitro differentiation of the Thy-1 + T cells or the CR + B cells, the differentiation of the thymocytes from prothymocytes in vitro was carried out according to the method of Komuro and Boyse, ("The Lancet", 1, 740 , 1973) using the acquisition of Thy-1,2 as the criterion for T cell differentiation The induction of differentiation of CR + B cells from the CR-B cell precursors in vitro was carried out under similar conditions The criterion used was the ability of the CR + B cells to bind sheep erythrocytes coated with sub-agglutinating amounts of rabbit antibodies and non-lytic complement. Milk cells from. were used as the source of the two precursor types (Thy-1 - and CR-) healthy nu / nu mice, which cells had previously been fractionated with the aid of discontinuous gradients of bovine serum albumin, since there were only a few or no Thy-T + cells and only a small proportion of v on CR + cells.

Es hat sich bei dieser Bestimmung erweisen, dass das Polypeptid dieselbe Wirkungsselektivität wie das Ubiquitin besitzt, indem es die Differenzierung der T-Lymphozyten und jene der (CR+) B-Lymphoiyten mit komplementären Rezeptoren herbeiführt. Das Pentapeptid führt die Differenzierung der Thy-1 + T-Zellen in Konzentrationen von etwa 10 ng bis 1 |ig/ml herbei; in Konzentrationen In this determination, it has been shown that the polypeptide has the same selectivity of action as the ubiquitin by causing the differentiation of the T-lymphocytes and that of the (CR +) B-lymphocytes with complementary receptors. The pentapeptide brings about the differentiation of the Thy-1 + T cells in concentrations of about 10 ng to 1 ig / ml; in concentrations

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

9 9

640 217 640 217

von 10 ng bis 1 ng/ml bewirkt es auch die Differenzierung der CR+ B-Zellen. from 10 ng to 1 ng / ml, it also differentiates CR + B cells.

Beispiel 3: Example 3:

Das in Beispiel 1 hergestellte Pentapeptid wird in der an das Harz gebundenen Form mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan behandelt, um die als Schutzgruppe verwendete tert.-Butoxycarbonyl-gruppe von dem Tyrosinteil abzuspalten. Das erhaltene Peptid wird hierauf mit Acetanhydrid acyliert und von dem Harz freigesetzt und von allen Schutzgruppen befreit mittels Fluorwasserstoff. Dabei wird folgendes acyliertes Derivat hergestellt: The pentapeptide prepared in Example 1 is treated in the form bound to the resin with trifluoroacetic acid in dichloromethane in order to split off the tert-butoxycarbonyl group used as a protective group from the tyrosine part. The peptide obtained is then acylated with acetic anhydride and released from the resin and freed from all protective groups by means of hydrogen fluoride. The following acylated derivative is produced:

a. ch3 conh-tyr-asn-ile-gln-lys-cooh a. ch3 conh-tyr-asn-ile-gln-lys-cooh

Beispiel 4: Example 4:

Zur Herstellung des Amidderivates des Pentapeptides von Beispiel 1 wird unter Verwendung von Benzhydrylaminharz als feste Phase nach der oben angegebenen Methode von J. Rivier et al. das geschützte Pentapeptid hergestellt. Das Amidderivat wird durch Abspaltung des an das Harz gebunden, geschützten Pentapeptides durch Reaktion mit Fluorwasserstoff hergestellt. Das erhaltene Pen-tapeptidamid hat die folgende Formel: To prepare the amide derivative of the pentapeptide from Example 1, using benzhydrylamine resin as the solid phase according to the method given by J. Rivier et al. the protected pentapeptide. The amide derivative is prepared by cleaving the protected pentapeptide bound to the resin by reaction with hydrogen fluoride. The pen tapeptide amide obtained has the following formula:

b. h2n-tyr-asn-ile-gln-lys-conh2 b. h2n-tyr-asn-ile-gln-lys-conh2

Zur Identifizierung wurden die Dünnschichtchromatographie und die Elektrophorese zur Anwendung gebracht, dank welchen man zu den folgenden Daten gelangte: Thin-layer chromatography and electrophoresis were used for identification, thanks to which the following data were obtained:

Dünnschichtchromatographie : Thin layer chromatography:

Probe: 30 (ig Sample: 30 (ig

Kieselgel (Brinkman-Glasplatte, 5 x 20 cm, 0,25 mm Dicke) Rf: n-BuOH : Pyridin : HOAc : H20 30:15:3:12 Rf: EtOAc : Pyridin : HOAc : H20 5:5:1:3 Rj>: EtOAc : n-BuOH : HOAc : H20 1:1:1:1 Sprühmittel: Pauly, Ninhydrin und I2 Silica gel (Brinkman glass plate, 5 x 20 cm, 0.25 mm thick) Rf: n-BuOH: pyridine: HOAc: H20 30: 15: 3: 12 Rf: EtOAc: pyridine: HOAc: H20 5: 5: 1: 3 Rj>: EtOAc: n-BuOH: HOAc: H20 1: 1: 1: 1 spray: Pauly, Ninhydrin and I2

Verbindungen links

Dünnschichtchromatographie Thin layer chromatography

Elektrophorese; das Peptid wanderte zur Kathode Electrophoresis; the peptide migrated to the cathode

Rf r? Rf r?

Rf Rf

Ac-T yr-Asn-Ile-Gln-Lys T yr-Asn-Ile-Gln-Lys-NH2 Ac-T yr-Asn-Ile-Gln-Lys T yr-Asn-Ile-Gln-Lys-NH2

0,47 0,48 0.47 0.48

0,87 0,87 0.87 0.87

0,54 0,37 0.54 0.37

— 1,35 cm —6,60 cm - 1.35 cm - 6.60 cm

Elektrophorese: Electrophoresis:

Whatman 3 mm Papier (11,5 x 56,5 cm) Whatman 3 mm paper (11.5 x 56.5 cm)

Probe: 100 (ig pH 5,6, Pyridinacetatpufferlösung Sample: 100 (pH 5.6, pyridine acetate buffer solution

1000 V,1 h 1000 V, 1 h

Sprühmittel: Pauly und Ninhydrin Spray agents: Pauly and Ninhydrin

Das acetylierte Pentapeptid gemäss Beispiel 3 zeigte bei der Verwendung in einer Konzentration von 1 ng/ml in 14%iger Twomey-Lösung maximale und minimale Aktivitäten, welche mit jenen des gemäss Beispiel 1 erhaltenen Pentapeptids vergleichbar waren. When used in a concentration of 1 ng / ml in 14% Twomey solution, the acetylated pentapeptide according to Example 3 showed maximum and minimum activities which were comparable to those of the pentapeptide obtained according to Example 1.

Das amidierte Pentapeptid gemäss Beispiel 4 zeigte bei der Verwendung in einer Konzentration von 1 ng/ml in 6% Twomey-Lösung eine Wirksamkeit, welche vergleichbar war mit der Wirksamkeit des zugrundeliegenden Pentapeptids, wie es gemäss Beispiel 1 erhalten worden ist. When used in a concentration of 1 ng / ml in 6% Twomey solution, the amidated pentapeptide according to Example 4 showed an activity which was comparable to the activity of the underlying pentapeptide, as obtained in Example 1.

Beispiel 5: Example 5:

Das nach Beispiel 1 hergestellte, an das Harz noch gebundene basiche Pentapeptid wird vom Harz abgespalten, indem man mit Natriummethylat in Methanol unter Umesterungsbedingungen behandelt. Die Entfernung der Schutzgruppen ergibt den Peptidester der folgenden Formel: The basic pentapeptide prepared according to Example 1 and still bound to the resin is split off from the resin by treating with sodium methylate in methanol under transesterification conditions. Removal of the protecting groups gives the peptide ester of the following formula:

H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOCH3 H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOCH3

Beispiel 6: Example 6:

Aus dem gemäss Beispiel 5 hergestellten Methylester wird das Diäthylaminderivat des Pentapeptids von Beispiel 1 hergestellt. The diethylamine derivative of the pentapeptide from Example 1 is prepared from the methyl ester prepared according to Example 5.

Dazu wird der gemäss Beispiel 5 erhaltene Methylester in Dimethyl-formamidlösung mit Diäthylamin umgesetzt, wobei ein disubsti-tuiertes Amid der folgenden Formel erhalten wird: For this purpose, the methyl ester obtained according to Example 5 is reacted with diethylamine in dimethylformamide solution, a disubstituted amide having the following formula being obtained:

H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-CON(C2H5)2 H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-CON (C2H5) 2

Das Diäthylaminderivat kann auch hergestellt werden, indem man das an das Harz noch gebundene basische Pentapeptid von Beispiel 1 durch Reaktion mit Diäthylamin von dem Harz freisetzt. Nach Abtrennung von dem Harz und Entfernung der Schutzgruppen erhält man dasselbe Diäthylamid wie oben. The diethylamine derivative can also be prepared by releasing the basic pentapeptide of Example 1 still attached to the resin by reaction with diethylamine from the resin. After separation from the resin and removal of the protective groups, the same diethylamide as above is obtained.

Beispiel 7 : Example 7:

Durch Reaktion mit Äthylbromid in der festen Phase wird das N-Äthyltyrosinderivat des basischen Pentapeptides von Beispiel 1 hergestellt. Dazu bleibt die a-Aminogruppe des Lysinteils durch eine 8-2-Chlorbenzyloxycarbonylgruppe geschützt, aber die endständige Aminogruppe des Tyrosins wird durch Reaktion mit Trifluoressigsäure in Dichlormethan freigesetzt. Hierauf wird das so geschützte Zwischenprodukt mit der stöchiometrischen Menge Äthylbromid unter alkylierenden Bedingungen behandelt. Die Schutzgruppe wird dann von der Lysin-a-aminosäure entfernt, wobei ein substituiertes Polypeptid der folgenden Formel erhalten wird: The N-ethyltyrosine derivative of the basic pentapeptide from Example 1 is prepared by reaction with ethyl bromide in the solid phase. For this, the a-amino group of the lysine part remains protected by an 8-2-chlorobenzyloxycarbonyl group, but the terminal amino group of the tyrosine is released by reaction with trifluoroacetic acid in dichloromethane. The intermediate thus protected is then treated with the stoichiometric amount of ethyl bromide under alkylating conditions. The protecting group is then removed from the lysine-a-amino acid to give a substituted polypeptide of the following formula:

C2H5-NH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOH C2H5-NH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOH

Beispiel 8: Example 8:

Es wird das Amid des Äthylaminopolypeptides von Beispiel 7 hergestellt. Dazu werden die Umsetzungen von Beispiel 7 durchgeführt, während das basische Pentapeptid an das Harz gebunden bleibt; das N-Äthylderivat wird also ohne Abspaltung des Peptides von der festen Phase hergestellt. Hierauf wird das an das Harz gebundene Zwischenprodukt von diesem mittels wasserfreiem Ammoniak in Dimethylformamidlösung abgespalten; man erhält ein Poly-peptidamid der folgenden Formel: The amide of the ethylaminopolypeptide from Example 7 is prepared. For this purpose, the reactions of Example 7 are carried out while the basic pentapeptide remains bound to the resin; the N-ethyl derivative is thus produced without splitting off the peptide from the solid phase. The intermediate product bound to the resin is then split off from the latter by means of anhydrous ammonia in dimethylformamide solution; a poly-peptide amide of the following formula is obtained:

C2H5NH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-CONH2 C2H5NH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-CONH2

Beispiel 9: Example 9:

Das gemäss Beispiel 3 hergestellte, an das Harz noch gebundene acylierte Pentapeptid wird durch Behandlung mit wasserfreiem Ammoniak unter Amidierungsbedingungen freigesetzt. Nach Entfernung der Schutzgruppen erhält man das folgende Polypeptid: The acylated pentapeptide still prepared according to Example 3 and bound to the resin is released by treatment with anhydrous ammonia under amidation conditions. After removing the protective groups, the following polypeptide is obtained:

CH3CONH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-CONH2 CH3CONH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-CONH2

Beispiele 10 bis 21 : Examples 10 to 21

Unter Anwendung der weiter oben zur Verlängerung der Polypeptidkette erwähnten Reaktionsmassnahmen Hessen sich die folgenden Polypeptide herstellen, welche die reaktionsfähige Aminosäurensequenz enthielten, jedoch an den endständigen Amino- und Carbonsäuregruppen R und R' substituiert waren. Auf diese Weise erhielt man Polypeptide der folgenden Grundformel: Using the reaction measures mentioned above for extending the polypeptide chain, the following polypeptides are produced which contain the reactive amino acid sequence but which are substituted on the terminal amino and carboxylic acid groups R and R '. In this way, polypeptides of the following basic formula were obtained:

R-NH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COR' R-NH-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COR '

diese Polypeptide enthielten die folgenden Substituenten: these polypeptides contained the following substituents:

Beispiel example

Nr. R R' No. R R '

10 ASP OH 10 ASP OH

11 SER-ASP OH 11 SER-ASP OH

5 5

10 10th

15 15

20 20th

25 25th

30 30th

35 35

40 40

45 45

50 50

55 55

60 60

65 65

640 217 640 217

10' 10 '

Beispiel (Fortsetzung) Example (continued)

Nr. No.

R R

R' R '

12 12

LEU-SER-ASP LEU-SER-ASP

OH OH

13 13

LEU-SER-ASP LEU-SER-ASP

GLU GLU

14 14

LEU-SER-ASP LEU-SER-ASP

GLU-SER GLU-SER

15 15

LEU-SER-ASP LEU-SER-ASP

GLU-SER-THR GLU-SER-THR

16 16

LEU-SER-ASP ■ LEU-SER-ASP ■

GLU-SER-THR-LEU GLU-SER-THR-LEU

17 17th

LEU-SER-ASP LEU-SER-ASP

GLU-SER-THR-LEU-HIS GLU-SER-THR-LEU-HIS

18 18th

LEU-SER-ASP LEU-SER-ASP

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU

19 19th

ASP ASP

GLU GLU

20 20th

ASP ASP

GLU-SER GLU-SER

21 21st

LEU-SER-ASP LEU-SER-ASP

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU- GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-

VAL-LEU-ARG VAL-LEU-ARG

Die gemäss den Beispielen 5 bis 21 hergestellten Polypeptidderi-vate besitzen die gleichen Wirksamkeiten wie die ihnen zugrundeliegende Pentapeptidsequenz. The polypeptide derivatives prepared according to Examples 5 to 21 have the same efficacies as the pentapeptide sequence on which they are based.

Beispiele 22,23 und 24: Examples 22, 23 and 24:

Unter Anwendung der gleichen Reaktionsfolge wie in Beispiel 1 gelangte man zu den folgenden Pentapeptiden: Using the same reaction sequence as in Example 1, the following pentapeptides were obtained:

22 H2N-ALA-ASN-ILE-GLN-LYS-COOH 22 H2N-ALA-ASN-ILE-GLN-LYS-COOH

23 H2N-TYR-ALA-ILE-GLN-LYS-COOH 23 H2N-TYR-ALA-ILE-GLN-LYS-COOH

24 H2N-TYR-ASN-ALA-GLN-LYS-C00H 24 H2N-TYR-ASN-ALA-GLN-LYS-C00H

Zur Untersuchung der pharmakologischen Wirkung und der Eigenschaften dieser Pentapeptide wurden sie in einer Konzentration von 1 ng/ml der Testmethode von Brand et al., „Science", Bd. 1973, To investigate the pharmacological action and the properties of these pentapeptides, they were used in a concentration of 1 ng / ml using the test method of Brand et al., "Science", Vol. 1973,

S. 319 bis 321, Juli 1976, unterworfen; dabei geht es um die Herbeiführung des Th-1-Antigens (T-Zellenantigen) auf Kückenknochenmark. Es wird eine Mischung von Zellen aus dem Femur und dem Tibiotarsus von frisch ausgeschlüpften Kücken des SC-Stammes 5 (Hy-Linie) durch Ultrazentrifugieren auf einem diskontinuierlichen, aus 5 Schichten von Rinderserumalbumin (BSA) bestehenden Gradient (11) fraktioniert. Zellen aus jeder Zwischenfläche werden gewaschen und zum Inkubierenlassen in einer Konzentration von 5 x 106 Zellen/ml mit 0,1 (ig Peptid/ml in dem RPMI-1630-Medium io suspendiert, welchem zusätzlich 15 Millimil Hepes, 5% von Gammaglobulin befreites Serum von Kalbfoeten, 14 bis 18 U Desoxyri-bonuclease/ml, 5 U Heparin/ml, 100 U Penicillin/ml und 100 |ig Streptomycin/ml zugegeben worden sind. Für die Kontrollversuche wird nur mit dem Rinderserumalbumin oder dem RPMI-1630-15 Medium inkubieren gelassen. Nach der Inkubation werden die Zellen auf Zytotoxizität unter Verwendung der komplementären Fraktionen aus Kücken und Meerschweichen geprüft. Das Verhältnis der Bu-1+- oder Th-1+-Zellen in jeder Schicht wird als Zytotoxi-zitätsindex: 100 (a-b)/a berechnet; darin bedeuten a und b die Pro-20 zentwerte an lebensfähigen Zellen in dem komplementären Kon-troll- und Versuchspräparat, respektiv. Der prozentuale Wert an herbeigeführten Zellen wird berechnet, indem der Durchschnittswert der Kontrollinkubationen (ohne herbeiführendes Mittel; im allgemeinen , 1 bis 3%) von jenem der Versuchsinkubationen abgezogen 25 wird. Pp. 319 to 321, July 1976; this involves the production of the Th-1 antigen (T cell antigen) on bone marrow. A mixture of cells from the femur and the tibiotarsus of newly hatched chicks of the SC strain 5 (Hy line) is fractionated by ultracentrifugation on a discontinuous gradient (11) consisting of 5 layers of bovine serum albumin (BSA). Cells from each interface are washed and suspended for incubation at a concentration of 5 x 10 6 cells / ml with 0.1 (ig peptide / ml in the RPMI-1630 medium, which additionally contains 15 millimil Hepes, 5% gamma globulin-free serum veal, 14 to 18 U deoxyri-bonuclease / ml, 5 U heparin / ml, 100 U penicillin / ml and 100% streptomycin / ml have been added in. For the control experiments only bovine serum albumin or RPMI-1630-15 After incubation, the cells are checked for cytotoxicity using the complementary fractions from chickens and seaweed. The ratio of Bu-1 + or Th-1 + cells in each layer is given as the cytotoxicity index: 100 (from ) / a, where a and b represent the percentages of viable cells in the complementary control and experimental preparation, respectively. The percentages of cells produced are calculated by the average value of the control incubations (without inducing agent; generally, 1 to 3%) is subtracted from that of the experimental incubations.

Als Ergebnis dieser Untersuchung zeigen die Pentapeptide der Beispiele 22, 23 und 24 in bezug auf Herbeiführung des Th-1- oder T-Zellenantigens auf Kückenknochenmark die prozentuale Werte: 12%, 15% und 21%. As a result of this study, the pentapeptides of Examples 22, 23 and 24 show percentages of induction of Th-1 or T cell antigen on bone marrow: 12%, 15% and 21%.

R R

Claims

640 217

2nd

claims

1. Polypeptide that has the biological ability to differentiate both T-lymphocytes and B-lymphocytes with complementary receptors (CR +), this fragment containing the following active portion:

R-NH-X-Y-Z-GLN-LYS-COR '

wherein X TYR or ALA, Y ASN or ALA and Z ILE or ALA 5 and R and R 'are terminal groups on said polypeptide which essentially do not impair the biological effect thereof, and the pharmaceutically acceptable salts thereof, the symbols R une R 'have the following meanings:

R

R '

Hydrogen oh

C, to C7-alkyl nh2

Cs to C12 aryl nhr7

C6 to C20 alkaryl n (r7) 2

C6 to C20 aralkyl or7

Ci to C7 alkanoyl

C2 to C7 alkenyl

GLU

C2 to C7 alkynyl

SER

ASP

thr

SER

LEU

his

SER-ASP

VAL

LEU-SER-ASP

ARG

LEU-ASP

GLU-SER

LEU-ASP

GLU-THR

GLU-SER-LEU

GLU-SER-THR

GLU-SER-THR-LEU

GLU-SER-THR-LEU-HIS

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG-LEU

GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG-LEU-AR

wherein R7 to C7 alkyl, C2 to C7 alkenyl, C2 to C, alkynyl, C6 to C20 aryl, C6 to C20 aralkyl or C6 to C20 alkaryl. 40

2. pentapeptides according to claim 1 of the following sequence:

R-HN-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COR '

wherein R is hydrogen, Q to C7 alkyl, C5 to C12 aryl or Q to C7 alkanoyl and R 'OH, NH2, NHR7 or N (R7) 2, and the pharmaceutically acceptable salts thereof.

3. A polypeptide according to claim 1 of the following sequence:

H2N-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS-COOH

and the pharmaceutically acceptable salts thereof. so

4. A polypeptide according to claim 1, wherein R is hydrogen and R 'OH.

5. A polypeptide according to claim 1, wherein R is CH3CO- and R 'OH.

6. A polypeptide according to claim 1, wherein R is CH3 and R 'OH 55.

7. A polypeptide according to claim 1, wherein R represents the hydrogen atom and R 'NH2.

8. A polypeptide according to claim 1, wherein R is hydrogen and R 'is N (C2H5) 2. so

9. A polypeptide according to claim 1, wherein R is CH3CO- and R 'NH2.

10. A polypeptide according to claim 1, wherein R is hydrogen and R '-och3.

11. A polypeptide according to claim 1, wherein R represents the hydrogen atom and R 'OC2Hs.

12. A polypeptide according to claim 1, wherein R is C2HS and R 'OC2H5.

13. A polypeptide according to claim 1, wherein R is CH3 and R '-NH2.

14. A polypeptide according to claim 1, wherein R is ASP and R '-OH.

15. A polypeptide according to claim 1, wherein R is SER-ASP and R '-OH.

16. A polypeptide according to claim 1, wherein R is LEU-SER-ASP and R '-OH.

17. A polypeptide according to claim 1, wherein R is LEU-SER-ASP and R 'GLU.

A polypeptide according to claim 1, wherein R is LEU-SER-ASP and R 'GLU-SER.

19. A polypeptide according to claim 1, wherein R is LEU-SER-ASP and R 'GLU-SER-THR.

20. A polypeptide according to claim 1, wherein R is LEU-SER-ASP and R 'GLU-SER-THR-LEU.

21. A polypeptide according to claim 1, wherein R is LEU-SER-ASP and R 'GLU-SER-THR-LEU-HIS.

22. A polypeptide according to claim 1, wherein R is ASP and R 'is GLU.

23. A polypeptide according to claim 1, wherein R is ASP and R 'is GLU-SER.

24. A polypeptide according to claim 1, wherein R is hydrogen and R'GLU-SER-THR-LEU-HIS-LEU-VAL-LEU-ARG-LEU-ARG.

25. Process for the preparation of a polypeptide of the formula:

R-NH-X-Y-Z-GLN-LYS-COR '

wherein X, Y and Z are as defined in claim 1, R is hydrogen and R 'hydroxy, characterized in that one

3rd

640 217

L-lysine protected from its amino groups by an insoluble resin polymer esterified by covalent bonding, from the L-lysine part which removes the group protecting the a-amino group, the product is reacted with an L-glutamine, the a-amino group of which is protected, to give L - Coupling glutamine with the L-lysine resin, removing the protective group of the a-amino group from the L-glutamine part, reacting the product with an L-isoleucine or L-alanine, the a-amino group of which is protected, in order to convert L-isoleucine or Coupling L-glutamine-L-lysine resin, further removing the group protecting the a-amino group and reacting the product with an L-asparagine io or L-alanine, the a-amino group of which is protected, in order to produce L-asparagine or To couple L-alanine to the L-isoleucine or L-alanine-L-glutamine-L-lysine resin, that the group protecting the a-amino group is then removed and the product is treated with an L-tyrosine or L-alanine, whose a-amino group is protected 15, reacted to L-tyrosine or L-alamin to the L-Aspa to couple ragin or L-alanine-L-isoleucine or L-alanine-L-glutamine-L-lysine resin, and that the protective groups which are located on the other amino groups are finally removed from the peptide and the resin polymer is separated off . 20th

26. The method according to claim 25, characterized in that the reactive side chains on the amino acids to be reacted are protected during the reaction or reactions.

27. The method according to claim 25, characterized in that the resin polymers used are cellulose, polyvinyl alcohol, polymethacrylic 25 at, sulfonated polystyrene or a chloromethylated copolymer of styrene and divinylbenzene.

28. Process for the preparation of a polypeptide of the formula:

R-NH-X-Y-Z-GLN-LYS-COR '

30th

wherein X, Y and Z are as defined in claim 1, R is hydrogen and R 'hydroxyl, characterized in that from a polypeptide of the formula:

Ri R2

I I 35

R3-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS resin in which R j and R2 are protective groups on the reactive side chains and R3 is a protective group on the a-amino group, while the resin is an insoluble polymer which has a stable physical form and is represented by a covalent bond adheres to 40 of the adjacent amino acid, by protecting with anhydrous hydrogen fluoride cleaves the protective groups and the carrier resin.

29. Means for carrying out the method according to claim 28, consisting of a polypeptide of the formula: 45

ri r2

I I

Rj-TYR-ASN-ILE-GLN-LYS resin wherein Rj and R2 are protective groups on the reactive side chains and R3 are a protective group on the a-amino group, while the resin is an insoluble polymer which has a stable physical form and adheres to the adjacent amino acid through a covalent bond.

30. A composition according to claim 29, wherein Rj is 0-2,6-dichlorobenzyl, R2 55 e-2-chlorobenzyloxycarbonyl and R3 is butyloxycarbonyl.

31. Pharmaceutical preparations, characterized in that they contain a therapeutically effective amount of a compound of the formula:

R-NH-X-Y-Z-GLN-LYS-COR '

60

wherein X, Y, Z, R and R 'are as defined in claim 1 contained in a pharmaceutically acceptable carrier.

32. Pharmaceutical preparations according to claim 31, characterized in that the therapeutically effective amount of the polypeptide is in a solution of the concentration 10 ng to 1 | xg / ml.