DE2633976A1 - Tripeptidderivate, verfahren zu ihrer herstellung sowie diese enthaltende arzneimittel - Google Patents

Description

PATENTANWÄLTE

DR.-ING. WOLFRAM BUNTE DR. WERNER KINZEBACH

D-8OOO MÜNCHEN AO. BAUERSTRASSE 22 · FERNRUF (089) 37 65 83 · TELEX 3215208 ISAR D POSTANSCHRIFT: POSTFACH 78O. D-8OOO MÜNCHEN A3

München, 28. Juli 1976 M/17159

AYERST, MCKENNA & HARRISON LIMITED

1025 Laurentien Boulevard, St. Laurent, Quebec (Kanada)

Tripeptidderivate_f Verfahren zu ihrer Herstellung sowie diese enthaltende Arzneimittel

Die Erfindung betrifft Tripeptidderivate mit Wirkung auf das Zentralnervensystem, ein Verfahren zu ihrer Herstellung sowie die hierfür geeigneten Zwischenprodukte und diese enthaltende Arzneimittel. -

Das Haupthindernis für die Anwendung vieler biologisch aktiver Peptide ist ihre kurze Wirkungsdauer, die teilweise auf ihrer Entaktivierung durch proteolytische Enzyme beruht. Ein Beispiel für ein derartiges Peptid ist das Tripeptid, das den Faktor darstellt, der die Freisetzung des Melanozy- · tenstimulierenden Hormons inhibiert (KIF oder KRIK).

Dieses Tripeptid wurde aus dem Hypothalamusgewebe von Rindern von R.M.G.Nair et al., Biochem.Biophys.Res.Cominun., 43, 1376 (1971) isoliert und es erwies sich in seiner Struktur als ein sit C endendes Tripeptid von Oxytocin: H-L-Prolyl-L-leucyl-glycinaniid.

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Es zeigte sich, dass dieses Tripeptid eine Wirkung auf das Zentralnervensystem (ZNS) ausübte. Das Tripeptid potenziert die Auswirkungen von (3,4~Dihydroxyphenyl)-L-alanin (L-BOPA) auf das Verhalten, was von N.P.Plotnikoff et al., Life Sciences 10, part 1, 1279 (1971) und Ξ.Friedman et al., Science, 1S2, 831 (1973) gezeigt wurde. Das Tripeptid antagonisiert die Effekte von Oxotremorin /N.P.Plotnikoff et al., Proc.Scc.Exp. Biol.Ked., 140, 811 (1972)7 und wirkt den sedativen Wirkungen des Deserpidins bei Mäusen u. Eseln entgegen /N.F.Plotnikoff et al., Neurcendocrinology, 11, 67 (1973)/. Auf der Grundlage der vorstehenden biologischen Wirksamkeiten haben A.V.Scnally et al., Science 179, 341 (1973) vorgeschlagen, dass das Tripeptid H-Pro-Leu-Gly-NHp nützlich bei der Behandlung von Patienten sein könnte, die an Depressionen oder Parkinsonisnius leiden.

Seit der Strukturaufklärung des vorstehenden Tripeptids wurde eine begrenzte Anzahl Analoger dieses Peptids von K.S.Celis et al., Febs Letters, 27, 327 (1972) und S.Castensson et al., Febs Letters, 44, 101 (1974) synthetisch hergestellt. Jedoch weisen das natürliche Tripeptid und die bisher bekannten Analoga den Nachteil einer kurzen Wirkungsdauer aufgrund der raschen Entaktivierung im Körper von Säugetieren auf und T.W. Redding et al., Neuroendocrinolcgy, 11, 92 (1973) haben gezeigt, dass die erste Stufe der Entaktivierung des natürlichen Tripeptids in einer proteolytischen Spaltung der Pro-Leu-Bindung unter Bildung von Prolin und Leucyl-glycinamid zu bestehen scheint.

Daher besteht ein Bedürfnis nach Analoga des natürlichen Tripeptids mit einer grösseren Widerstandsfähigkeit gegen die Hydrolyse durch Protease, wobei die ZNS-Wirksamkeit des natürlichen Tripeptids beibehalten wird. Die vorliegende Erfindung betrifft neue Analoga des natürlichen Tripeptids, in denen die Leucyl- und Glycyl-aminosäurereste ersetzt werden können und die Peptidkette und das endständige Amid substituiert sein können.

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Darüberhinaus wird ein neues und einfaches bzw. direktes Verfahren zur Herstellung dieser Tripeptidderivate geschaffen.

Die erfindungsgemässen Peptidderivate entsprechen der allgemeinen Formel

H-L-Pro-N-CH-C-Y-R³ (I)

R^! F. 0

1 4 5 4

worin R = Wasserstoff, niedrig-Alkyl oder NR R , worin R und R⁵ = jeweils niedrig-Alkyl; R^ = Wasserstoff oder niedrig-Alkyl; R-' = Aiaino, niedrig-Alkylamino, Di-(niedrig)-alkylamino oder Amino-(niedrig)-alkylamino und Y = einer der Aminosäure-

1 4 5 reste GIy oder D-AIa mit der Massgabe, dass, falls R = NR R ,

4 5 2

worin R und R wie vorstehend definiert sind und R und Y wie vorstehend definiert sind, l\r - niedrig-Alkylaaiino, Di-(niedrig)· alkylamino oder Amino-(niedrig)-alkylamino.

Eine Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens verläuft über eine Reihe von Zwischenprodukten der Formel

R⁶-L-Pro-N(R¹)CH(R²)CO-GIy-R⁷ (II)

1 4 5 4 5

worin R = niedrig-Alkyl oder IiR R , worin R und R = jeweils

Q f.

niedrig-Alkyl, R = Wasserstoff oder niedrig-Alkyl, R = eine Aminoschutzgruppe wie sie in der Peptidsynthese verwendet wird und R = Hydroxy, niedrig-Alkoxy, Amino, niedig-Alkylamino, Di-(niedrig)-alkylamino, Amino-(niedrig)-alkylamin© oder geschütztes Anino-(niedrig)-alkylamino.

Das erfindungsgenässe Verfahren unifasst die Kondensation eines Enamins oder Kydrazons der Formel

R¹N = CHR² . (Ill)

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1 2
worin R und R wie unmittelbar vorstehend definiert sind, mit einer Aminosäure der Formel R -L-Pro-OH, worin R wie unmittelbar vorstehend definiert ist, in Anwesenheit eines Iso-

7 7 nitrils der Formel CNCHpCOR , worin R = niedrig-Alkoxy, unter Bildung des entsprechenden Zwischenprodukts der Formel II,

1 ? fi
worin R , R und R wie unmittelbar vorstehend definiert sind,

•7

und R = niedrig-Alkoxy. Die Umwandlung dieser letztgenannten Verbindung durch für die Umwandlung von niedrig-Alkylestern in das entsprechende Amid oder substituierte Amid als wirksam bekannte Standardmethoden führt zu der entsprechenden Verbin-

7
dung der Formel II, worin R = Amino, niedrig-Alkylamino, Di-(niedrig)-alkylamino oder geschütztes Amino-(niedrig)-alkylamino und durch Entfernen der Schutzgruppe (n) erhält man die entsprechende Verbindung der Formel I.

Das in der vorstehenden Ausführungsform bevorzugte Verfahren besteht in der Kondensation einer Verbindung der Formel III mit einem Amino-geschützten Prolin der Formel R -L-Pro-OH, worin R wie vorstehend definiert ist, in Anwesenheit eines

7 7

Isonitrils der Formel CNCH₂CCR , worin R wie vorstehend definiert ist, zur Erzielung der entsprechenden Zwischenverbindung der Formel II, worin R , R , R und R wie unmittelbar vorstehend definiert sind, worauf dieses Zwischenprodukt II mit Ammoniak behandelt wird, um das entsprechende Amid zu ergeben, sowie in der Entfernung der Schutzgruppe R zur Erzielung des

1 ?

entsprechenden Peptidderivats der Formel I, worin R und R

wie unmittelbar vorstehend definiert sind, R^ = Amino und Y « der AminosEurerest GIy.

Alternativ wird das Zwischenprodukt der Formel II, worin R , R , R und R wie unmittelbar vorstehend definiert sind, mit einem hydrolysierenden Mittel zur Erzielung der entsprechenden

1 ? ft

Säure der Formel II, worin R ,R und R wie unmittelbar vorstehend definiert sind, und R = Hydroxy, behandelt. Die letztgenannte Säure wird mit eines is allgemeinen in der Peptidche-• mie zur Aktivierung einer Carboxylgruppe geeigneten Mittel be-

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handelt und durch Kondensieren der aktivierten Verbindung mit einem niedrig-Alkylamin, Di -(niedrig)-alkylamin oder mono-geschützten Amino-(niedrig)-alkylamin erhält man das entsprechende

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Zwischenprodukt der Formel II, worin R , R und R wie unmittelbar vorstehend definiert sind und R' = niedrig-Alkylamino, Di-(niedrig)-alkylamino oder geschütztes Amino-(niedrigj-alkylamino. Die Schutzgruppe η) in der letztgenannten Verbindung wird bzw. werden entfernt unter Erzielung des entsprechenden Tripeptid-

1 2

derivate der Formel I, worin R und R wie unmittelbar vorstehend definiert sind, R = Alkylainino, Di-(niedrig)-alkylainino oder Amino-(niedrig)-alkylamino und Y = der Aminosäurerest GIy»

Eine weitere alternative Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht in der Herstellung von Tripeptidderivaten der Formel I durch stufenweise Addition von Aminosäuren_o Bevorzugte Verbindungen der Formel I_s die gemäss dieser alternativen

; i

Ausführungsform erhalten werden» sind jsolche _p worin R = Wasser»

2
stoff oder niedrig=Alkyl _P R = Wasserstoff oder niedrig·= Alkyl, vorzugsweise eine Aminosäurenseitenkette, R = Amino_p niedrig-Alkylainino s, Di=-(niedrig)-alkylaminö oder Amino-(niedrig)»alkylamino und Y = der Aminosäurerest GIy oder D-AIa<»

' 1 P Das Tripeptidderivat der Formel I, worin R = CH_x ν R s

CHpCH(CH^)₂S dch. die Aminosäurenseitenkette von L-Leucin_D R^ s NHg und Y = der Aminosäurerest D-AIa wird einfach durch Kuppel! eines aktivierten Esters von Benzyl-oxycarbonyl~J>(N-methyl) leucin mit D-Alanin-methylester unter Erzielung des Dipeptids der Formel Z-L-(N-He)Leu-D-AIa-OMe hergestellt. Die Aminoschutzgruppe Z der letztgenannten Verbindung wird entfernt, worauf man mit einem aktivierten Ester von Benzyl-oxycarbonyl-L-proXiB kuppelt unter Bildung des Tripeptids der Formel Z-L-PrO=L-(N-Me)LeU-D-AIa-OMe. Wird die letztgenannte Verbindung der Einwirkung von Ammoniak in einem in e rten organischen Lösungsmittel unterzogen» so erhält man das Tripeptid der Formel Z=L=PrO-L-= ()O Die Äminoschutzgruppe 2 der letztgenannten 09886/121Ü

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Verbindung wird unter Bildung des entsprechenden Tripeptidderivats der Formel I entfernt, worin R = CH,, nämlich H-L-Pro-L-(N-Me)Leu-D-Ala-NH₂.

Das Tripeptidderivat der Formel I, worin R = Wasserstoff, R² = CH₂CH(CH^)₂, R³ = NH(CH₂)^NH₂ ¹^ ^Y = ^der Aminosäurerest GIy, kann leicht durch Unterziehen des Tripeptids der Formel Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OEt einer Hydrolyse unter Bildung der entsprechenden Säure der Formel Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OH hergestellt werden. Die Carboxylgruppe der letztgenannten Verbindung wird aktiviert und mit einem mono-geschützten Amino-1,4-diaminobutan, beispielsweise H₂N(CH₂)^NHBoC unter Bildung des entsprechenden Tripeptids der Formel Z-L-PrO-L-LeU-GIy-NH(CH₂)^NH-BoC kondensiert. Die Aminoschutzgruppen der letztgenannten Verbindung " erdeE. unter Erzielung des entsprechenden Tripeptidderivats der Formel 1, nänlich L-Pro-L-Leu-Gly-NH(CH₂)^NH₂ entfernt.

Der hier versandete Ausdruck "niedrig-Alkyl" bezeichnet geradksttlge Alkylreste mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen und verzweigtks-ttige Alkylrest mit 3 bis 4 Kohlenstoffatomen, ausgenommen t-Butyl und uinfasst Methyl (Ke), Äthyl (Et), Propyi, Isopröpyl, ₉ IsoButyls Pentyl usw.

!& ellgenieinen basieren die hier verwendeten Abkürzungen ei:;" Bezeichnung der Aminosäuren und Schutzgruppen auf den Smpfeh-'lungeii der IUPAC-IUE Commission on Biochemical Nomenclature, vgl.Biochemistry, 11, 1726-1732 (1972). Beispielsweise stellen ?ro₅ Leu„ £la und GIy ^Rests'³ von Prolin, Leucin, Alanin bs^_a ^-lyeia dar« Der Ausdruck Rest bedeutet einen Rest, der sich von der entsprechenden oi-Aminosäure durch Eliminieren des CH-Teils U3T Carboxylgruppe unä äss H-Teils der ei-Aminogruppe herleitet. Der Ausdrwc-":: "Aainosaurenseitenkette" stellt den Teil einer ;u.äln3säur'?- äar.- d3r man unter Ausschluss des Teils —CH(NK«) ."OQK ■■srhs.lt_ff v?'_t-"5 von n_;!?oKc:?ple ^KPeptides and Amino Acids^ir, W.A, ?'3nO£Ela ΐΓ,-Γ-cj !T-r York und Arast^rdaa, 1965, Seiten 2 und ?'*, dsfialerti Bslspisle für sclcha Seitenlcetten der r-släufiger

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Aminosäuren sind -CH₂CH(CiO₂ (die Seitenkette von Leucin), oder H- (die Seitenkette von Glycin).

Die Konfiguration der Aminosäuren und Aminosäurereste wird hier durch die entsprechenden Symbole, D, L oder DL bezeichnet, wird jedoch die Konfiguration nicht bezeichnet, so kann die Aminosäure oder der Rest die Konfiguration D, L oder DL aufweisen. Es sei bemerkt, dass die Struktur einiger der erfindungsgemässen Verbindungen asymmetrische Kohlenstoffatome enthält. Es versteht sich von selbst, dass die Isomeren, die sich aus einer derartigen Symmetrie ergeben, in den Rahmen der vorliegenden Erfindung fallen. Solche Isomere werden in im wesentlichen reiner Form durch klassische Trenntechniken und durch sterisch gesteuerte Synthese erhalten und werden willkürlich als Isomere A bzw. B bezeichnet.

Eine Zahl von Arbeitsweisen oder Techniken zur Herstellung von Peptiden hat sich bisher eingebürgert und ist in allgemeinen Veröffentlichungen bzw. Fachbüchern der Peptidchemie beschrieben, beispielsweise von K.D.Kopple, a.a.O., Seiten 33=51 ₀ und E.Schröder und K.L.Lübke, "The Peptides", Band I, Academic Press, New York, 1965, Seiten 3-128. Beispielsweise können die funktionellen Gruppen, die nicht an delr Reaktion zur Bildung der Peptidbindung beteiligt sind, gegebenenfalls durch eine Schutzgruppe oder Schutzgruppen vor der Kondensationsreaktion geschützt werden. Beispiele für Schutzgruppen für eine Aminofunktion eines Peptids oder einer Aminosäure, die nicht an der Bildung der Peptidbindung beteiligt ist, sind: Die Alkoxycarbonyle einschliesslich Benzyloxycarbonyl (dargestellt durch Z), t-Butoxycarbonyl (Boc) oder oi_foi -Dimethyl-3s4~dimethoxy-benzyl~ oxycarbonyl (Ddz); die Schutzgruppen vom Acyltyp, wie Tripheny!methyl oder Benzyl -umfassen. Die bevorzugten Schutzgruppen sind Benzyloxycarbonyl und t-Butoxycarbonyl₀ Die Carbonsäurefunktion eines Peptids oder einer Aminosäure kann als durch , einen niedrig-Alkyl- oder niedrig-Aralkyl~ester geschützt betrachtet werden, der Methyl (dargestellt durch OMe)₉ Äthyl (OEt),

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Benzyl (OBzI) oder tert-Butyl (OBu ) umfasst.

Zur Beschleunigung bzw. Förderung einer erleichterten Kondensation einer Peptidcarboxylgruppe mit einer freien Aminogruppe eines anderen Peptide unter Bildung einer neuen Peptidbindung muss die endständige Carboxylgruppe aktiviert werden. Beschreibungen derartiger Carboxyl-aktivierender Gruppen finden sich in der allgemeinen, die Peptidchemie betreffenden Literatur von Kopple oder Schröder und Lübke, wie vorstehend genannt. Beispiele für die aktivierte Form einer endständigen Carboxylgruppe sind das Säurechlorid, -anhydrid, -azid, -imidazolid, oder der aktivierte Ester oder O-Acyl-hamstoff eines Dialkylcarboxydiimids. Die folgenden aktivierten Ester erwiesen sich als besonders geeignet für das erfindungsgenässe Verfahren: 2,4,5-Trichlorphenyl (dargestellt durch OTcp), Pentachlorphenyl (OPcp), p-Nitrophenyl (OMp) oder 1-Benzotriazolyl; das Succinimidoderivat ist für diesen Zweck ebenfalls geeignet.

Die Ausdrücke "Peptid* Dipeptid, Tripeptid und dergleichen", die hier verwendet werden₉ beschränken sich nicht auf die entsprechenden Stamapeptide, sondern werden auch im Hinblick auf modifizierte Peptide mit funktionalisierten Gruppen oder Schutzgruppen angewendet. Der hier verwendete Ausdruck "Peptid" bezieht sich auf ein Peptid mit einem bis drei Aminosäureresten.

Der hler verwendete Ausdruck "Mineralsäure" bezeichnet starke anorganische Säuren und umfasst Chlorwasserstoffsäure, Bromwasserstoff säure, Schwefelsäure und Phosphorsäure. Wird dieser Ausdruck in Verbindung mit einem wasserfreien System '/erwendet, so ist die bevorzugte Mineralsäure wasserfreie Chlorwasserstoffsäure bzw« Chlorwasserstoff.

Der hisr verwendete Ausdruck "milde saure Bedingungen" bezeichnet Bedingungen,bei denen sine verdünnte wässrige Lösung einer ■ organischen Säurs., beispielsweise 3Ο-9ΟΛ, vorzugsweise 70-8Oy,,

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wässrige Ameisensäure, Essigsäure oder Propionsäure oder 1-wässrige Trifluoressigsäure einen Hauptbestandteil des Reakti» onsmediuins, gewöhnlich bei 20-50⁰C, bildet.

Der hier verwendete Ausdruck "massig saure Bedingungen" bezeich net Bedingungen„ bei denen konzentrierte organische Säuren oder wässrige Lösungen der Mineralsäuren als Hauptbestandteil des Reaktionssediums bei Temperaturen von etwa -30 bis 30 C verwendet werden. Beispiele für bevorzugte Bedingungen umfassen in diesem Falle die Anwendung von 50 bis 100$ Trifluoressigsäure bei 0 bis 30⁰C, 0,1 bis 12 n-Chlorwasserstoffsäure bei -30 bis

10⁰C oder O₅I bis 6 ^Chlorwasserstoff in einem wasserfreien inerten, organischen Lösungsmittel.

Der hier verwendete Ausdruck "organische Base⁵⁵ umfasst Triäthyi~ amin_P N-Äthylmorpholin und N-Äthyldiisopropylamin«,

Der hier verwendete Ausdruck "starke Base⁹⁰ bezeichnet sowohl organische Basen wie vorstehend beschrieben als auch starke anorganische Basen einschliesslich den Hydroxiden und Carbonaten und Kaliumο

Die erfindungsgemässen Tripeptide werden in Form der freien Base oder eines Säureadditionssalzes direkt durch das erfindungs= geraässe Verfahren erhalten. Die Tripeptide werden in Form der freien Base bequem aus dem entsprechenden Säureadditionssals durch übliche Methoden erhalten_s beispielsweise wird die freie Base bequem aus dem Essigsäureadditionssalz durch wiederholtes Lyophilisieren des letztgenannten Salzes aus wässriger Lösung enthaltene Das Essigsäure-Additionssals wird bequem aus einem anderen Säureadditionssalz durch Behandeln mit dem entsprechenden Ionenaustauscherharz in der hier nachfolgend beschriebenen Weise hergestellt. Die erfindungsgemässen Tripeptide werden in Form eines pharmazeutisch verträglichen bzw» verwendbaren Säureadditionssalzes entweder direkt durch das erfindungsgemässe Verfahren oder durch Umsetzen des Tripeptläs mit einem oder raeh«

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reren Äquivalenten der entsprechenden Säure hergestellt. Beispiele für bevorzugte nicht-toxische Salze sind die mit pharmazeutisch verträglichen bzw_o verwendbaren organischen Säuren, z.B. Essigsäure , Milchsäure, Bernsteinsäure, Benzoesäure, Salicylsäure, Methansulfonsäure, Toluolsulfonsäure oder Pamoasäure sowie polymere Säuren wie Gerbsäure oder Carboxymethylcellulose und Salze mit anorganischen Säuren wie Halogenwasserstoffsäuren, z.B. Chlorwasserstoffsäure oder Schwefelsäure oder Phosphorsäure. Es sei festgestellt, dass die erfindungsgeiaässen Tripeptide ein oder zwei basische Stickstoffatome aufweisen, die zu Additionssalzen mit ein oder möglicherweise zwei Äquivalenten an Säure führen können_o Falls gewünscht wird ein spezielles Säureadditionssalz in ein anderes Säureadditionssalz, ZvB.ein Salz mit einer nicht~toxischen₅ pharmazeutisch verträglichen Säure durch Behandeln mit dem geeigneten lonenaustauscherharz in der von RoAeBoissonas et al., Helv.Chim.Acta 43_S 1349 (1960) beschrie« benen Weise umgewandelt«, Geeignete Ionenaustauscherharze sind Kationenaustsuscher auf der Basis von CeIIuIoSe₁ beispielsweise Carboxymethylcellulose oder chemisch modifizierte quervernetrste Dextran»Kationenaustauscher_s beispielsweise vom Sephadex C-Typ, und stark basische Anionenaustauscherharze, beispielsweise die von JoPoßreenstein und MoWinitz in "Chemistry of "the Amino Acids⁸⁵C John Wiley and Sons Inc₉ New York und London, 1961, FoIo 3α Seite 1456, aufgeführten.

Die durch das erfindungsgemasse Verfahren hergestellten Tripeptidderivate sowie ihre entsprechenden pharmazeutisch verträglichen hzw» verwendbaren Salze sind nützlich, da sie die pharmakologischen Wirkungen auf das ZNS von Warmblütertieren aufweisen, die das natürliche Tripeptid H-L-Prolyl-L-leucyl-glycinainid besitzt und mindestens eine der erfindungsgemässen Verbindungen zeigt eiern natürlichen Tripeptid überlegene Wirksamkeiten. Beispielsweise potenzieren die erfindungsgemässen Verbindungen die 'Wirkungen von L-BCPA bei der Untersuchung nach der Methode von • G₀MoEverett_s P^oc»First Internat,Sympos.Antidepr.Drugs, Excerpta Medica Internat.Congr»Series Nr. 122₅ 164 (1966) in der von

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N.P.Olotnikoff et al., Life Sciences Vol. 10, Teil 1, Seite 1279 (1971) beschriebenen Modifikation. Die Tripeptidderivate der Formel I antagonisieren auch die durch Flu-phenazin indu-" zierte Katalepsie von Ratten, ein Tierversuch, der sich beson- ' ders für die Auswahl von Verbindungen eignet, die zur Behandlung von Parkinson-ähnlichen Erkrankungen brauchbar sind,und sie wirkenden? Deserpidin bedingten sedativen Effekt entgegen bzw. kehren ihn um. Die erfindungsgemässen Tripeptidderivate weisen eine verlängerte Wirkungsdauer auf und sind nützlich zur Behandlung oder Beeinflussung von Erkrankungen des Zentralnervensystems, insbesondere dem Parkinsonismus oder der Gemütsdepression bei Warmblütern. Wird ein erfindungsgemässes Tripeptid oder sein Salz für eine derartige Behandlung oder Beeinflussung verwendet, so wird es systemisch, vorzugsweise parenteral in Kombination mit einer pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeit oder einem festen Träger verabreicht. Die Peptide der Formel I weisen ein geringeres Toxizitätsausmass aufο Der Anteil des Tri» peptids oder seines Salzes wird durch beine Löslichkeit in einem gegebenen Träger, durch den gegebenen Träger, durch den gewählten Verabreichungsweg und nach biologischer Standardpraxis bzw. üblicher biologischer Praxis bestimmte Zur parenteralen Verabreichung an Tiere wird das Tripeptid oder sein Salz in einer sterilen wässrigen Lösung verwendet₉ die auch andere gelöste.Substanzen wie Puffer oder Konservierungsmittel sowie ausreichend pharmazeutisch verträgliche Salze oder Glukose enthalten kann, um die Lösung isotonisch zu machen„ Die Dosierung variiert mit der Verabreichungsform und mit der jeweiligen zu behandelnden Tierspezies und wird vorzugsweise bei einem Niveau von 0,05 mg bis 20 mg/kg Körpergewicht gehalten. Jedoch ist es besonders erwünscht, eine Dosierung im Bereich von etwa 0_s05 mg bis etwa 2 mg/kg Körpergewicht anzuwenden, um wirksame Ergebnisse zu erzielen«

Zur oralen Verabreichung an Tiere wird die Dosierung des Tripeptids oder seines Salzes vorzugsweise bei 0₉25 mg bis 100 mg/ 'kg Körpergewicht gehalten und die Verbindung wird inDosisein-

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heitsform mit pharmazeutisch verträglichen Trägern formuliert. Das Tripeptid oder sein Salz kann auch direkt auf die innere Oberfläche des Mundes aufgebracht werden, beispielsweise in einer der in der der US-Patentanmeldung S.N.567,788 vom 14.April 1975 entsprechenden Patentschrift beschriebenen Dosierungsformen.

Das Tripeptid oder sein Salz kann auch in einer der lang-wirksamen, langsam freisetzenden oder Depot-Dosierungsformen verabreicht werden, die nachfolgend beschrieben werden, und zwar vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion oder Implantation. Derartige Dosierungsformen sind derart gestaltet, dass sie etwa 0,05 mg bis etwa 2 mg/kg Körpergewicht pro Tag freisetzen.

Häufig ist es erwünscht, ein Tripeptid der Formel I kontinuierlich während längerer Zeiträume in lang-wirksamen langsam freisetzenden oder Depot-Dosisformen zu verabreichen. Derartige Dosierungsformen können entweder ein pharmazeutisch verträgliches bzw. verwendbares Salz des Tripeptide mit einem geringen Löslichkeitsausmass in Körperflüssigkeiten, beispielsweise eines der nachfolgend beschriebenen Salze, enthalten, oder sie kennen das Tripeptid in Form eines wasserlöslichen Salzes zusammen mit einem schützenden Träger enthalten, der die rasche Freisetzung verhindert. Im letztgenannten Falle kann das Tripeptid beispielsweise mit einer nicht-antigenen, teilweise hydrolysierten Gelatine in Form einer viskosen Flüssigkeit formuliert werden, oder das Tripeptid kann an einem pharmazeutisch verträglichen bzw. verwendbaren festen Träger, beispielsweise Zinkhydroxid, absorbiert werden und in Suspension in einem pharmazeutisch verträglichen bzw. verwendbaren flüssigen Vehikel verabreicht werden, oder das Tripeptid kann in Gels oder als Suspensionen mit einem schützenden, nicht-antigenen Kydrokolloid, beispielsweise Katrium-carboxymethylcellulose, Polyvinylpyrrolidon, Katriumal-'^: ginat, Gelatine, Polygalakturonsäuren, beispielsweise Pektin oder gewissen Mucopolysaccharide^ zusammen mit einer wässrigen oder nicht-wässrigen pharmazeutisch verträglichen Flüssigkeit, Vehikeln, Konservierungsmitteln oder oberflächenaktiven Mitteln

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formuliert werden«, Beispiele für solche Formulierungen finden sich in der pharmazeutischen Standardliteratur, z.B, in Remington's Pharmaceutical Sciences, 14. Auf lage, Mack Publishing Cc, "Easton* Pennsylvania_? 1970, Lang-wirksame,, langsam freisetzende Präparate des erfindungsgemäss hergestellten Tripeptids können auch durch Mikroeinkapselung in pharmazeutisch verträgliche bzw* verwendbare Umhüllungen, beispielsweise Gelatine, Polyvinylalkohol oder Äthylcellulose erhalten werden. Weitere Beispiele für Uberzugsmateriallen- und zur Mikroeinkapselung verwendbare Verfahren sind von J.AoHerbig in "Encyclopedia of Chemical Technology", Vol. -1.3,. 2.Auflage ρ Wiley, New York 1967, Seiten 436-456, beschrieben. Derartige Formulierungen sowie Suspensionen von Salzen des Tripeptids, die lediglich gering löslich in Körperflüssigkeiten sind, beispielsweise das Salz mit der Pamoasäure ,τ werden derart hergestellt, dass sie etwa 0,05 ag bis etwa 2 mg der aktiven Verbindung pro kg Körpergewicht pro Tag freisetzen und werden vorzugsweise durch intramuskuläre Injektion verabreicht. Alternativ können einige der festen Dosierungsformens, die vorstehend aufgeführt wurden, beispielsweise gewisse massig in Wasser lösliche Salze oder Dispersionen in oder Ad·= sorbate an festen Trägern von Salzen des Mittels, beispielsweise Dispersionen in einem neutralen Hydrogel eines Polymeren von A'thylenglykolmethacrylat oder ähnlichen quervernetzten Monomeren, wie in der US-Patentschrift 3j551_s556 beschrieben» auch in der Form von Pellets formuliert werden, die etwa die gleichen Mengen wie vorstehend aufgezeigt freisetzen und können subkutan oder intramuskulär implantiert werden.

Die erfindungsgemässen Tripeptidderivate potenzieren die therapeutische Wirksamkeit von Arzneimitteln, die zur Behandlung von Parkinsonerkrankungen verwendet werden, beispielsweise Laevodopa_t Procyclidin, l~Hyoseiamin oder Trihexyphenidyl-Hydrochloric.

Es sei erwähnt, dass gefunden wurde, dass Laevodopa in Kombination mit einem erfindungsgemässen Tripeptidderivat eine stärkere Verbesserung der Kotilität und der intellektuellen Funktion

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manifestiert als Laevodopa allein.

Werden die Derivate der Formel I zur Potenzierung der Wirkungen von Laevodopa beim Menschen verwendet, so werden das Derivat und Laevodopa systemisch entweder getrennt oder in der gleichen Dosiseinheitsforrn verabreicht; die Kombination ist oral oder parenteral wirksam. Die gewöhnliche tägliche Dosis für das Derivat liegt bei 50 bis 2000 mg und die tägliche Dosis für das Laevodopa liegt im Bereich von 0,5 bis 8,0 g.

Typische pharmazeutische Zusammensetzungen, die in der vorstehend für das Tripeptidderivat allein beschriebenen Art hergestellt wurdenρ umfassen eine Kombination des Tripeptidderivats der Formel I und von Laevodopa in fester Form oder in steriler Lösung in einem Gewichtsverhältnis von 1:4 bis 1:16O.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird durch die folgende Beschreibung von bevorzugten Ausführungsformen veranschaulicht.

Gemäss der Praxis einer Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens wird die erste Gruppe der benötigten Ausgangsmaterialien, die Enamine oder Hydrazone der Formel III,

R¹W a CHR²J worin R = niedrig-Alkyl oder NR R⁵, worin R und

κ 2

R^ = niedrig-Alkyl und R - Wasserstoff oder niedrig-Alkyl, durch Kondensieren eines entsprechend substituierten Amins der

1 4 5

Formel R NH« oder eines Hydrazins der Formel R R^NNH₀, worin

14 5
R , R und R^ wie unmittelbar vorstehend definiert sind, mit

2 2

einem Aldehyd der Formel R CHO, worin R wie vorstehend definiert ist, hergestellt.

•1

Die Amine der Formel R NH₀ oder die Hydrazine der Formel

4 5
R R NNH₂ sind ent^-zeder bekannt oder werden nach bekannten bzw. üblichen Verfahren hergestellt. In gleicher Weise sind die Al-

dehyde der Formel R CHO bekannt und sind meistens im Handel erhältlich»

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- ■ 1 Die Kondensation des Amins der Formel R NH^ oder des Hydrazins

4 5 <: ■ ο ■ -

der Formel R R NNH₂ mit dem Aldehyd der Formel R CHO wird vorzugsweise in einem inerten Lösungsmittel bei erhöhter Temperar tür'bei oder nahe der Rückflusstemperatur der Mischung durchgeführt. Es kann entweder ein wasserfreies, mit Wasser nicht mischbares Kohlenwasserstofflösungsmittel, beispielsweise Benzol oder Toluol, unter gleichzeitiger physikalischer Entfernung von Wasser im Masse seiner Bildung, beispielsweise mittels eines Dean-Stark-Wasserabscheiders, oder ein niedrig-Alkanol-Lösungsmittel, beispielsweise Äthanol, Propanol oder Isopropanol verwendet werden. Nach der Verdampfung des Lösungsmittels und der Reinigung des Rückstands, beispielsweise durch Destillation oder Kristallisation, erhält man das entsprechende Enamin oder Hydrazon der Formel III. Alternativ kann das gewünschte Enamin oder Hydrazon in situ im Verlauf der Schlüsselreaktion, wie nachstehend beschrieben, hergestellt werden.

Die zweite Gruppe der benötigten Ausgangsmaterialien, die geschützten Aminosäuren der Formel R -L-Pro-OH, worin R wie vorstehend definiert ist, ist bekannt. Beispielsweise werden t-Butoxycarbonyl-L-prolin (Boc-L-Pro-OH) und Benzyloxycarbonyl-L-prolin (Z-L-Pro-OH) von G.R.Anderson und A.C.McGregor, J.Amer. Chem.Soc, 79, 6180 (1957) bzw. W. Grassmann und E. Wünsch, Chem. Ber., 91, 462 (1958) beschrieben.

Die dritte Grupne der benötigten Ausgangsmaterialien, die Isoni-

7 7
trile der Formel CNCH₂COR'_t worin R' = niedrig-Alkoxy mit 1 bis 3 Kohlenstoffatomen, ist entweder bekannt, zum Beispiel wird Ä'thyl-isocyanoacetat von R.Appel et al., Angew.Chem., Int.ed., 10, 132 (1972) beschrieben oder kann leicht nach bekannten Methoden hergestellt werden.

Anschliessend wird in einer Schlüsselreaktion des erfindungsgemässen Verfahrens das vorstehende Enamin oder Hydrazon der Formel III oder alternativ das gewünschte Enamin oder Hydrazon, in situ mis dem jeweiligen Amin oder Hydrazin und dem Aldehyd herge-

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stellt, mit der Säure der Formel R -L-Pro-OH und dem Isonitril

der Formel CNCK_?COR unter Bildung des entsprechenden Zwischenprodukts der Formel II R⁶-L-Pro-N(R¹J-CH(R^)CO-GIy-R⁷, worin R , R , R^J und R wie unmittelbar vorstehend definiert sind, kondensiert.

Obwohl dies nicht kritisch ist, werden vorzugsweise etwa äquimolare Mengen der benötigten Ausgangsniateriallen für diese Kondensation verwendet. Die Kondensation wird am zweckmässigsten in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise in halogenierten Kohlenwasserstoffen, einschliesslich Methylenchlorid, Chloroform und Tetrachlorkohlenstoff, in Äthern und zyklischen A'thern, einschliesslich Dioxan, Diäthylather und Tetrahydrofuran oder in niedrigen aliphatischen Alkoholen einschliesslich Methanol, Äthanol und Propanol durchgeführt. Sind jedoch die Ausgangsmaterialien ineinander löslich oder wird ihre Mischung im Verlauf der Kondensation flüssig, so kann das Lösungsmittel weggelassen werden, ohne dass sich hieraus schädliche Effekte ergeben.

Die Temperatur und die Dauer der Kondensation sind ebenfalls nicht kritisch. Die Umsetzung kann bei Temperaturen von -20 bis 100⁰C durchgeführt werden, doch ist ein Bereich von 10 bis 40°C besonders zweckmässig. Die Reaktionszeit kann variieren und hängt von der Reaktivität der verschiedenen Ausgangsmaterialien ab; jedoch werden im allgemeinen Reaktionszeiten von 15 Minuten bis zu mehreren Tagen angewendet, wobei sechs Stunden bis zwei Tage bevorzugt sind.

Anschliessend wird das Zwischenprodukt der Formel II, worin

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R , R , R und R' wie unmittelbar vorstehend definiert sind, isoliert und nach Standardverfahren gereinigte Beispielsweise wird das Produkt mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel extrahiert und falls nötig durch Chromatographie und Kristallisation gereinigt.

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Für den Fachmann ist ersichtlich, dass der in der Formel II

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durch -N(R- )CH(R )C0- dargestellte Aminosäurerest, der bei dieser Umsetzung erhalten wird, razeinisch sein muss und er. wird daher in der vorliegenden Beschreibung mit DL bezeichnet,

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mit der Ausnahme,.-falls R ^Wasserstoff und der vorstehende Aminosäurerest -.der Aminosäurerest von Glycin. Es ist auch ersichtlich, dass das Zwischenprodukt jder Formel II in der Form von zwei geometrischen Isomeren vorkommt, die beispielsweise durch Chromatographie an Siliziumdioxidgel getrennt werden können. Zur Vereinfachung werden diese beiden Isomeren willkürlich als Isomere A und B bezeichnet. Anschliessend werden entweder die getrennten Isomeren oder deren Mischungen in die entsprechenden Peptidderivate der Formel I in der nachfolgenden Weise umgewandelt.

Das Zwischenprodukt der Formel II wird einer Amidbildung unterzogen, wobei man das Amidzwischen-produkt der Formel II erhält, worin R _f R , R wie unmittelbar vorstehend definiert sind

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R = NHp ο Bevorzugte Bedingungen für diese Amidierung umfassen die Behandlung des Zwischenprodukts mit einer im wesentlichen gesättigten Lösung von Ammoniak in einem inerten Lösungsmittels, beispielsweise Methanol, Äthanol oder Tetrahydrofuran bei 0 bis 20⁰C, während sechs Stunden bis vier Tagen» Falls gewünscht kann das so erhaltene Amid in dieser Stufe in die zwei Isomeren aufgespalten werden. Diese Trennung wird zweckmässig durch Chromatographie an Siliciumdioxidgel bewirkt.

Das vorstehende Amid wird anschliessend mit einem Schutzgruppen-entfernenden Mittel behandelt, wobei man das entsprechende Tripeptidderivat der Formel I erhält, worin R = niedrig-Alkyl oder KR R"⁷, worin R und R-^ = jeweils niedrig-Alkyl_s R=.-Wasserstoff oder niedrig-Alkyl _s R = Amino und Y = der Amino-

säurerest GIy. Das TriDeptidderivat. der Formel I, worin R =

L 5 Zl R* 2

NR R , worin R und R^ = jeweils niedrig=Alkyl, R = Wasserstoff oder niedrig-Alkyl j R^ =s Ar.ino und Y = der Aminosäurerest GIy₅ wurde in der der US-Patentanmeldung S.N»330,352 vom 7»Februar¹

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1973 entsprechenden Patentschrift beschrieben.

Die vorstehende Schutzgruppenabspaltungsreaktion wird, falls R = Benzyloxycarbonyl (Z) zweckmässig durch Unterziehen des Amids einer Hydrierung in Anwesenheit eines Edelmetallkatalysators bewirkt. Bevorzugte Edelmetallkatalysatoren zur Erzielung der vorstehenden und anderer Hydrierungen beim erfindungsgemässen Verfahren umfassen solche von Palladium und Platin, beispielsweise 5% Palladium auf Kohle bzw. Aktivkohle oder 5% Platin auf Kohle bzw. Aktivkohle. Die Hydrierung selbst wird in einem inerten Lösungsmittel, beispielsweise Essigsäure, Methanol, Äthylacetat und dergleichen durchgeführt, Im vorliegenden Falle wird die Hydrierung vorzugsweise mit 5% Palladium auf Kohle bzw. Aktivkohle in Methanol durchgeführt, wobei das. Hydrierungsprodukt, das entsprechende Tripeptidderivat der Formel I in Form der freien Base durch Abtrennen des Katalysators aus der Reaktionsmischung und Verdampfen des Lösungsmittels erhalten wird. Die Schutsgruppenabspaltungsreaktion wird, falls R = t-Butoxycarbonyl, zweckmässig durch Behandeln des Amids unter massig sauren Bedingungen zur Erzielung der entsprechenden ungeschützten Verbindung bewirkt. Bei der Durchführung der vorstehenden Schutzgruppenabspaltungsreaktion löst man zv/eckraässig das Amid in einem überschuss von Trifluoressigsäure oder in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Äthylacetat oder Tetrahydrofuran, die im wesentlichen mit wasserfreiem Chlorwasserstoff gesättigt sind. Nach Vollendung der Reaktion erhält man durch Verdampfen direkt das vorstehend erwähnt© ungeschützte Tripeptidderivat der Formel I in Form des Säureadditionssalzes der entsprechenden Säure. Dieses Säureadditionssalz kann in das entsprechende Tripeptidderivat der Formel I in Form der freien Base durch Standardmethoden bzw. in üblicher Weise umgewandelt werden.

14 5 4 Das Tripeptidderivat der Formel I, worin R = 1 R , worin R

und R⁵ = jeweils niedrig-Alkyl, R² = CH₂CH(CHy₂, R³ =

NH(CHp)AKH₅ und Y = der Aminosäurerest GIy, wird durch Behan-

14 5 dein des Zwischennrodukts der Formel II. worin R ^ NR R-\ werin

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R^ und R⁵ = jeweils niedrig-Alkyl und R² = CH-CH(CH,)-, R⁶ = eine Aminoschutzgruppe und R = niedrig-Alkoxy, mit einem hydrolysierenden Mittel hergestellt, wobei man die entsprechende Säure des Zwischenprodukts der Formel II erhält, in der R , R und R die angegebene Definition aufweisen und R' = Hydroxy. Zur basischen Hydrolyse wird gemäss einer bevorzugten Methode der niedrig-Alkylester der Einwirkung einer starken Base, beispielsweise Natrium- oder Kaliumhydroxid, in Anwesenheit von ausreichend Wasser zur Bewirkung der Hydrolyse des Esters unterzogen. Die Hydrolyse wird unter Anwendung eines geeigneten Lösungsmittels, beispielsweise Methanol oder Äthanol, durchgeführt. Die Reaktionsmischung wird bei einer Temperatur von 0 bis 5O⁰C", vorzugsweise 20 bis 30⁰C gehalten, bis die Hydrolyse verläuft. Gewöhnlich reichen 10 bisj 30 Stunden für die Hydrolyse aus. DieReaktionsmischung wird anschliessend mit einer Säure, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und dergleichen, angesäuert und mit einem im wesentlichen mit Wasser" nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Chloroform, extrahiert. Das organische Lösungsmittel wird verdampft und man erhält die entsprechende Säure.

Die vorstehende entsprechende Säure wird mit einem Reagens zur Umwandlung einer Aminosäure oder einer Peptidsäure in eine entsprechende Verbindung mit einer aktivierten Carboxylgruppe behandelt und mit Mono(t-butoxycarbonyl)-1,4-di-aminobutan kondensiert. Vorzugsweise wird diese Reaktion durch Umsetzung der entsprechenden Säure mit einer etwa äquimolaren Menge an N₈N'-Carbonyldiimidazol in einem inerten organischen Lösungsmittels, vorzugsweise Dimethylformamid, bei etwa -20 bis -10°C während etwa 20 bis 50 Minuten durchgeführt. Die Verbindung mit einer aktivierten Carboxylgruppe wird mit einer Lösung einer im wesentlichen äquimolaren Menge von Mono(t-butoxycarbonyl)-1,4-di-aminobutan-hydrochlorid, beschrieben von R„Geiger, Annalen, 750, 165 (1S71) und einer organischen Base, vorzugsweise Triäthylamin, in einem inerten organischen Lösungsmittel _s vorzugsweise Dimethylformamid, behandelt« Die Mischung wird bei etwa

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20 bis 3O⁰C während etwa 15 bis 30 Stunden gerührt und verdampft. Der Rückstand wird in einem im wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, vorzugsweise Äthylacetat, aufgenommen, gewaschen und verdampft. Der Rückstand wird an Siliciumdioxidgel chromatographiert, wobei man Mischungen von halogenierten Kohlenwasserstoffen, niedrigen Alkanolen und organischen Basen, vorzugsweise Chloroform-Methanol-Pyridin zum Eluieren verwendet, wobei die beiden Isomeren A und B des Amino-geschützten Zwischenprodukts der Formel II Z-L-Pro-K(m^Z|R⁵)CH/CH₂CH-(CH_x)2/CC-GIy-NH(CH₂}₄-NH-Boc erhält, worin R^ und R⁵ wie vorstehend definiert sind.

Anschliessend werden die Schutzgruppen Z und Boc von der letztgenannten Verbindung entfernt, wobei man das Tripeptidderivat von H-L-Pro-N(NR⁴R⁵)CH/CHpCH(CH_T)^CO-GIy-NH(CH_?) _L NH_P erhält, d.h. die Verbindung der Formel I, worin R = Mr¹TP, worin R und R⁵ = jeweils niedrig-Alkyl, R² = CH₂CH(CH^)₂, R³ = und Y = der Aminosäurerest GIy.

Die beiden Aminoschutzgruppen Z und Boc können gleichzeitig entfernt werden, beispielsweise unter Anwendung einer starken Säure, d.h. Bromwasserstoffsäure in Essigsäure oder Fluorwasser stoffsre. oder wird die Schutzgruppenentfernung vorzugsweise stufenweise erzielt. Das vorstehend beschriebene Amino-geschütz te Zwischenprodukt wird wie vorstehend gezeigt in Anwesenheit eines Edelmetallkatalysators in einem inerten Lösungsmittel, vorzugsweise von 5% Palladium auf Aktivkohle in Essigsäure hydriert, um die Aminoschutzgruppe Benzyloxycarbonyl (Z) zu entfernen. Die Mischung wird filtriert und auf etwa 0 bis 10°C gekühlt und mit einer massig starken Saure zur Entfernung der verbleibenden Aminoschutzgruppe t-Butoxycarbonyl (Eoc) behandelt. Ein Beispiel für eine derartige Säure ist Chlorwasserstoff. Die wasserfreie Säure wird entweder direkt zu dem vorstehenden Filtrat gefügt oder wird eine Lösung der Säure in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Athyl-.acetat, Tetrahydrofuran .-and dergleichen zugefügt. Die Mischung

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wird bei etwa O bis 25°C während etwa ein bis drei Stunden gerührt und verdampft. Der Rückstand wird an einer Säule von quervernetztem Dextranabsorbens (Sephadex LH-20) unter Anwendung von Methanol als Eluiermittel chromatographiert, wobei man das letztgenannte Tripeptidderivat der Formel I in Form seines Chlorwasserstoffsäureadditionssalzes erhält. Die freie Base des letztgenannten Tripeptidderivats der Formel I wird in üblicher Weise, beispielsweise durch Umwandlung in das Acetatsalz, gefolgt von Lyophilisieren, erhalten.

Geraäss einer alternativen Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens werden die Tripeptidderivate der Formel I durch stufenweise Addition von Aminosäuren hergestellt.

Das vorstehende Zwischenprodukt Boc-L-Pro-L-(N-Me)Leu-Gly-OEt,

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d.h. die-Verbindung der Formel II, worin R = CH_x, R =

CH₂CH(CH^)₂ und R' = OSt wird ebenfalls bequem durch stufenweise Addition von Aminosäuren hergestellt.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform dieser alternativen Herstellung des letztgenannten Zwischenprodukts der Formel II wird das Ausgangsinaterial Benzyloxycarbonyl-Ir{N-methyl) leucin, beschrieben von J.R.Coggins und N.L.Benoiton, Can.J.Chem., 49, 1968 (1971), durch Behandlung mit im wesentlichen einem Mol-Äquivalent 2,4,5-Trichlorphenol in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise in Methylenchlorid oder Tetrahydrofuran, in Anwesenheit von 1,1 bis 1,5 Mol-Äquivalenten Bicyclohexyl-carbodiimid bei -20 bis 0⁰C während etwa 45 bis 75 Minuten und anschliessend bei 20 bis 30°C während ein bis drei Stunden in seinen aktivierten 2,4,5-Trichlorphenylester umgewandelt. Der aktivierte Ester, d.h. der 2,4,5-Trichlorphenylester von Z-L-(N-Me)LeU-OH wird anschliessend mit einer im wesentlichen äquimolaren Menge von Glycinäthylester-hydrochlorid in Anwesenheit einer organischen Base, vorzugsweise von N-Athylmorphor= lin, in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid, bei 0 bis 30⁰C während 10 bis 24 Stunden ge-

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kuppelt, wobei man das Dipeptid der Formel Z-L-(K-Me)Leu-Gly-OEt erhält, Anschliessend wird die Aminoschutzgruppe Z der letztgenannten Verbindung entfernt, vorzugsweise durch Auflösen der Verbindung in Essigsäure, die etwa 3 Mol-Äquivalente Bromwasserstoffsäure enthält und Rühren bei 20 bis 3O°C während vier bis fünf Stunden unter Erzielung des Dipeptids der Formel H-L(N-Me)Leu-Gly-OEt in Form des Bronrwasserstoffsäureadditionssalzes. Das letztgenannte Dipeptid wird mit dem 1-Benzotriazolylester von Boc-L-Pro-OH gekuppelt, mit der durch Kombination von Boc-Pro-OH mit ein oder zwei Mol-Äquivalenten 1-Hydroxybenzotriazol und 1,1 bis 1,5 Mol-Äquivalenten Dicyclohexylcarbodiimid in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Tetrahydrofuran, bei etwa -5 bis 0⁰C hergestellt wird. Die Mischung wird bei etwa -5 bis 0⁰C während etwa einer Stunde und anschliessend bei 20 bis 30⁰C während einer weiteren Stunde gerührt. Diese Lösung, die den 1-Benzotriazolylester von Boc-L-Pro-OH enthält, wird anschliessend bei etwa -5 bis 5 C mit einer Lösung kombiniert, die im wesentlichen eine äquimolare Menge des vorstehenden Dipeptids K-L-(N-Me)Leu-Gly-OEt in Form seines Bromwasserstoff säureadditiorissalzes und eine organische Base, vorzugsweise N-Athylmorpholin, in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Tetrahydrofuran, enthält, kombiniert. Die Mischung wird während etwa 30 Minuten bei etwa -5 bis 5 C und anschliessend etwa 30 bis 50 Stunden bei etwa 20 bis 30⁰C unter Bildung von Boc-L-Pro-L-(N-Me)LeU-GIy-CSt, d.h. das Zwischenprodukt der Formel II, worin R¹ = CH₃, R² = CK₂CH(CH^)₂ und R⁷ = OEt, gerührt. Das letztgenannte Zwischenprodukt der Formel II ist in jeder Hinsicht mit dem Isomeren B des Zwischenprodukts der Formel II, erhalten wie vorstehend beschrieben, identisch.

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Das Tripet>tidderivat der Formel I, worin R = CH_x,, R = CH₂CH(CH^)₂» R = NH₂ und Y = der Apinosäurerest D-AIa, wird bequem durch Kondensieren eines aktivierten Esters von Benzyloxycarbonyl-L-iK-methyl)-leucin, vorzugsweise des 1-Benzotriazolylesters, mit D-Alaninirethylester unter Bildung des Dipeptido

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der Formel Z-L-(N-Ke)Leu-D-AIa-OMe hergestellt. Die Aminoschutzgruppe Z der letztgenannten Verbindung wird entfernt, worauf mit einem aktivierten Ester von Benzyloxycarbonyl-L-prolin, vorzugsweise dem p-Nitrophenylester, kondensiert wird, unter Bildung des Tripeptids der Formel Z-L-Pro-L-(N-Me)Leu-D-AIa-OHe. Auf die letztgenannte Verbindung lässt man Ammoniak in einem inerten organischen Lösungsmittel unter Bildung des Tripeptidamids der Formel Z-L-PrO-L-(N-Me)LeU-D-AIa-NH₂? einwirken. Die Aminoschutzgruppe Z der letztgenannten Verbindung wird unter Bildung des entsprechenden Tripeptidderivats der Formel I Z-L-Pro-L-(N-Me)Leu-D-Ala-NH₂ entfernt.

Gemäss einer bevorzugtezi Ausführungεform der Herstellung des letztgenannten Tripeptidderivats der Formel I werden im wesentlichen äquimolare Mengen von Z-L-(N-Me)Leu-OH, beschrieben von J.R.Coggins, a.a.O., und H-D-AIa-OMe in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid, bei etwa O bis 10⁰C mit 0,2 bis 1,0 Mol-Äquivalenten 1-Hydroxybenzotriazol und einer im wesentlichen äquimolaren Menge einer organischen Base, vorzugsweise N-äthylmorpholin, kombiniert» Eine Lösung von im wesentlichen äquiinolaren Mengen von Dicyclo-hexylcarbodiimid in einem inerten organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Tetrahydrofuran, wird langsam zugesetzt. Nach vollendeter Zugabe wird die Mischung bei etwa 0 bis 10⁰C während etwa einer Stunde und bei 20 bis 30⁰C während einer weiteren Stunde gerührt. Nach üblicher Reinigung wird das Dipeptid der Formel Z-L-(N-Me) Leu-D-AIa-OMe erhalten.

Anschliessend wird die Aminoschutzgruppe Z des letztgenannten Dipeptids vorzugsweise durch Hydrieren in Anwesenheit eines Edelmetallkatalysators, vorzugsweise 5% Palladium auf Aktivkohle, in einem inerten Lösungsmittel, vorzugsweise Essigsäure, das im wesentlichen eine äquimolare Menge an einer Mineralsäure, vorzugsweise Chlorwasserstoffsäure, enthält, entfernt. Durch Entfernen des Katalysators und Verdampfen des Lösungsmittels erhält man das Dipeptid der Formel H-L-(N-Me)Leu-D-AIaOKe in Form sei-

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nes Chlorwasserstoffsäureadditionssalzes. Die letztgenannte Verbindung wird mit einem aktivierten Ester von Z-L-Pro-OH kondensiert. Eine praktische und zweckinässige Methode für diese Kondensation umfasst das Einbringen von im wesentlichen äquiirolaren Mengen des letztgenannten Dipeptid -Säureadditionssalzes, 1-Kydroxybenzotriazol, Benzyloxycarbonyl-L-prolin-p-nitrophenylester und N-Athylmorpholin in ein inertes organisches Lösungsmittel, vorzugsweise Dimethylformamid, bei einer Temperatur von etwa 0 bis 10⁰C. Die Mischung wird etwa zwei bis vier Tage bei 0 bis 10⁰C gerührt. Nach dem Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in einem im wesentlichen mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel, vorzugsweise Äthylacetat, gelöst, gewaschen, getrocknet und verdampft. Der Rückstand wird gereinigt, vorzugsweise durch Chromatographie an Siliciumdioxidgel und man erhält das Tripeptid der Formel Z-L-Pro-L-(N-Ke)Leu-D-Ala-OMe.

Die letztgenannte Verbindung wird einer Amidierung bzw. einer Amidbildung unterzogen. Bevorzugte Bedingungen umfassen die Behandlung der letztgenannten Verbindung mit einer im wesentlichen gesättigten Lösung von Ammoniak in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Methanol oder Äthanol, bei 0 bis 10⁰C während zwei bis vier Tagen. Das Lösungsmittel wird verdampft und der Rückstand kristallisiert, wobei man das Tripeptid der Formel Z-L-Pro-L-(N-Ke)LeU-D-AIa-KH₂ erhält.

Die Aminoschutzgruppe Z der letztgenannten Verbindung wird vorzugsweise durch Hydrieren in Anwesenheit eines Edelmetallkatalysators in Anwesenheit von Chlorwasserstoffsäure wie unmittelbar vorstehend beschrieben entfernt, wobei man das Tripeptidderivat H-L-Pro-L-(N-Me)LeU-D-AIa-NK₂ erhält, d.h. die Verbindung der Formel I, worin R¹ = CH-,, R² = CH₀CH(CH,)_O1 R = NH₂ und Y = der Aisinosäurerest D-AIa, und zwar in Form des Chlorwasserstoff säure-Additionssalzes. Das Essigsäureadditie^.i-salz des letztgenannten Tripeptidderivats der Formel I erhält

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man vorzugsweise durch unterziehen des Chlorwasserstoffsaureadditicnssalzes einer Ionenaustauscherchromatographie an einer Säule mit einem Carboxymethylcelluloseabsorbens (V/hatrnann CM-23) unter Anwendung von Ammoniumacetatpuffer als BIuiersittel. Falls gewünscht wird das Sssigsäureadditionssalz des letztgenannten Tripeptidderivats der Formel I wiederholt von Wasser lyophilisiert, wobei man das Tripeptidderivat der Formel I in Form der freien 3ase erhält.

Das Tripeptidderivat der Formel I, worin R = Wasserstoff, R² = CH₂CH(CH₃;₂ , R³ = NH(CH₂)^NH₂ und Y = der Amincsäurerest GIy, wird bequem durch Hydrolysieren der Verbindung der Formel Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OSt unter Bildung dejr entsprechenden Säure der Formel Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OH hergestellt. Die letztgenannte Säure wird in einen aktivierten Ester umgewandelt und dieser wird mit Mono(t - butoxycarbor;.yl)-1 ,4-di-aminobutan unter Bildung des Zwischenprodukts der Formel II Z-L-PrO-L-LeU-GIy-NH(CH₂)^NH-BoC kondensiert. Die Aminoschutzgruppen dieser Verbindung werden entfernt, wobei man das entsprechende Tripeptid-derivat der Formel I erhält, worin R¹ = Viasserstoff, R² = CH₂CH(CH,)^ P? = () und Y = der Aminosäurerest GIy.

Gemäss einer bevorzugten Ausführungsform der Herstellung des letztgenannten Tripeptidderivats der Formel I wird das Ausgangsmaterial ₉ das Tripeptid der Formel Z-L-Pro-L-Leu-Gly~OEt, das von W.D.Cash, J.Org.Chem., 26, 2136 (1961) beschrieben wurde, mit einem hydrolisierenden Mittel behandelt, wobei man die entsprechende Säure der Formel Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OH erhält. Eine bevorzugte Methode zur basischen Hydrolyse umfasst die Behandlung des Tripeptidesters mit einer starken Base, beispielsweise Natrium- oder Kaiiumhydroxid, in Anwesenheit von ausreichend Wasser zur Bewirkung der Hydrolyse des Esters. Die Hydrolyse wird unter Anwendung eines geeigneten Lösungsmittels, beispielsweise Methanol oder Äthanol durchgeführt. Die Reaktionsmischung wird während 15 bis 30 Minuten bei einer Temperatur von etwa 10 bis 3O⁰C gehalten. Die Reaktionsmischung wird an-

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schliessend mit einer Säure, beispielsweise Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure und dergleichen angesäuert. Die Ausfällung wird gesammelt und kristallisiert, wobei man die entsprechende Säure der Formel Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OH erhält.

Die vorstehende Säure wird mit einem Reagens zur Umwandlung einer Amino- oder Peptidsäure in den entsprechenden aktivierten Ester behandelt, vorauf die Kondensation des aktivierten Esters mit einem Mono-geschützten Amino-(niedrig)-alkylamin folgt. Die Reaktion wird durch Umsetzen der entsprechenden Säure mit 1,1 bis 1,5 Kol-Xquivalenten Dicyclc-hexyl-carbodiimid und 1,1 bis 2,1 Mol—Äquivalenten 1-Hydroxybenzotriazol, gefolgt von der Addition von etwa äquimolaren Mengen an Kono-(t-butoxycarbonyl)-i^-di-aminobutan-hydrochlorid und einer organischen Base, vorzugsweise K-Athylmorpholin, in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Äthylacetat, Dimethylformamid oder Tetrahydrofuran, bei einer Temperatur von etwa 0 bis 30⁰C und bei Reaktionszeiten von drei bis zehn Stunden, durchgeführt. Die Ausfällung wird entfernt, das FiI-trat verdampft und der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst. Die Lösung wird gewaschen, getrocknet, verdampft und der Rückstand gereinigt, vorzugsweise durch Chromatographie an Siliciumdioxid, wobei man das Zwischenprodukt der Formel II Z-L-Pro-L-LeU-GIy-NH(CH₂)^NH-BoC erhält.

Die Aminoschutzgruppen Z und Boc werden von dieser Verbindung entfernt, wobei man das Tripeptidderivat H-L-Pro-L-Leu-Glv-MH(CH₂)^KH₂ erhält, d.h. die Verbindung der Formel I, worin R = H, R² = CH₂CH(CH₃)₂, R³ = NH(CH₂)^NH₂ und Y = der Aminosäurerest GIy. Die beiden Aminoschutzgruppen können gleichzeitig entfernt werden, beispielsweise unter Anwendung einer starken Sauret d„h. Bromwasserstoffsäure in Essigsäure oder Fluorwasserstoffsäure, oder können die Aminoschutzgruppen vorzugsweise stufenweise wie folgt abgespalten werden* Das vorstehende Affine· geschützte Tripeptid wird einer Hydrierung wie vorstehend beschrieben in Anwesenheit eines Edelmetallkatalysators in einen

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inerten Lösungsmittel, vorzugsweise von 5% Palladium auf Aktivkohle in Essigsäure unterzogen, um die Aminoschutzgruppe Benzyloxycarbonyl (Z) zu entfernen. Die Mischung wird filtriert und das Filtrat wird auf etwa 0 bis 10 C gekühlt und mit einer massig starken Säure zur Entfernung der verbleibenden Aminoschutzgruppe t-Butoxycarbonyl (3oc) behandelt. Ein Beispiel für eine derartige Säure ist wasserfreier Chlorwasserstoff, der entweder direkt zu dem vorstehenden gekühlten Filtrat gefügt wird, oder wird eine Lösung der Säure in einem inerten organischen Lösungsmittel, beispielsweise Äthylacetat oder Tetrahydrofuran zugesetzt. Die Mischung wird etwa ein bis vier Stunden bei etwa 0 bis 30°C gerührt und verdampft, wobei man das Tripeptidderivat der Formel I H-L-PrO-L-LeU-GIy-NH(CH₂)^NH₂ in Fora des Chlorwasserstoffsäureadditionssalzes erhält. Man erhält das Essigsäureadditionssalz dieses Tripeptidderivats der Formel I durch Unterziehen des Chlorwasserstoffsäureadditionssalzes einer lonenaustauscherchromatographie, vorzugsweise an einem Anionenaustauscherharz (Baker CGA-540) in der Acetatform. Falls gewünscht lyophilisiert man dieses Essigsäureadditionssalz des letztgenannten Tripeptidderivats der Formel I wiederholt von Wasser, um das Tripeptidderivat der Formel I in Form der freien Base zu erhalten.

Es sei erwähnt, dass es für den Fachmann ersichtlich ist, dass gemäss der vorliegenden Erfindung äquivalente Amino- oder Carboxyl-Schutzgruppen, äquivalente Methoden zur Kupplung von Peptidbruchstücken und äquivalente Methoden zur Entfernung der Schutzgruppen angewendet werden können, die sich von den beschriebenen unterscheiden, ohne dass der Rahmen der Erfindung verlassen wird. Derartige Ausführungsformen werden von der Erfindung umfasst.

Die folgenden Formeln und Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung.

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.Beispiel 1

Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-dime-thylamino)leucyl-glycinäthylester (Z-Pro-N/N(CK ₃)^/CH/CHqCH(CH^)^CO-GIy-OSt)

a) 12,45 g (50 mMol) Benzyloxycarbonyl-L-prolin in 50 ml trockenem Methylenchlorid werden zu einer Lösung von 7,05 g (55 mMol) Isovaleraldehyd-K^T,N-dimethylhydrazon und 6,21 g (55 mMol) Äthylisocyanoacetat in 50 ml trockenem Methylenchlorid bei 0⁰C gefügt. Die Mischung wird bei Raumtemperatur vier Tage gerührt, mit 5$iger Natriuinbicarbonatlösung und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, getrocknet, filtriert und das Filtrat wird verdampft. Der Rückstand wird einer Säulenchromatographie an Siliciumdioxidgel unter Anwendung von Chloroform-Methanol (98:2) als Eluiermittel unterzogen. Durch Verdampfen des Lösungsmittels erhält man die Titelverbindung.

b) Man geht in gleicher Weise vor, ersetzt jedoch das Benzyloxycarbonyl-L-prolin durch t-Butoxycarbonyl-L-prolin und das Isovaleraldehyd-N,N-dimethylhydrazon durch Methylamino-N-isopentyliden und erhält die beiden Isomeren A und B von t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-methyl)leucyl-glycin-äthylester (Boc-L-Prc— N(CH₃ )CH/CH₂CH(CH₃) 27cC-GIy-OEt); Isomeres A /Oe /^⁵ = + 31,8° (c = 1 , Dimethylformamid, NMR (CDCl₃K 1,0 (m, 6H) 1,3 (t, J = 7 Hz, 3H), 1,4 (s, 9H), 3,1 (s, 3H), 4,2 (q, J = 7Hz). Isomeres B, /oc/^ = - 76,7° (c = 1, Dimethylformamid), Massenspektrum (m/e): 427 (M⁺).

c) Man geht in gleicher Weise vor, ersetzt jedoch das Benzyloxycarbonyl-L-prolin durch t°Butoxycarbonyl-L~prolin. und das Isovaleraldehyd-N,N-dimethylhydrazon durch eine Mischung von Formaldehyd und Isobutylamin und erhält t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-(N-isobutyl)-glycyl-glycin-äthylester (Boc-L-Pro-N/CHo-CH(CHj)₂ZCH₂CO-GIy-OEt); KMR (CDCl₃)S 0,9 (6H), 1,25 (3H), 1^40 (9H), 2,0 (5H), 3-5 (11H), 7,8 (1H).

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d) Man geilt in gleicher Weise vor, ersetzt jedoch das Isovaleraldehyd-N,N-dimethylhydrazon durch eine Mischung von 1,1-Diäthyl hydrazin und Acetaldehyd und erhält Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diäthylamino)-alanyl-glycin-äthylester (Z-L-PrO-NZN(C₂Hc;) ₂ CH(CH,)CO-,Gly-OEt'). ;

e) Man geht in gleicher Weise vor, ersetzt jedoch das Isovaleraldehyd-N,N-dimethylhyarazon durch eine Mischung von 1,1-Di(n~ propyl)-hydrazin und Isobutyraldehyd und erhält Benzylcarbonyl L-prolyl-DL-ZN-di-(n-propyl)-amino_7-valyl-glycin-äthylester (Z-L-Pro-N/K(CH₂CH₂CH^7-CH/CH(C_iH₃)₂7C0-Gly-0Et).

I ■f.) "Man geht in gleicher Weise vor, ersetzt jedoch das Isovaler aldehyd-N^K-diraethylhydrazon durch eine Mischung von Äthylamin und Isobutyralaehyd und erhält Benzylcarbonyl-L-prolyl-DL~(N-athyli-valyl-glycin-athylester (Z-L-PrO-N(C₂H₅)CHZCH(CH₃)₂/C0-GIy-OEt).

Beispiel 2

Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-dimethylainino)-leucyl-glycinamid (Z-PrO-NZN(CH ₃)₂7CH/CH₂ CH(CH _?)₂ 7C0-Glv-NH ₂)

a) Kän löst 8,33 g (17 mMol) des in Beispiel 1 a) beschriebenen Zwischenprodukts Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL- (N-dimethylamino) · leucyl-glyein-äthylester bei O⁰C in 150 ml einer gesättigten Lösung von wasserfreiem Ammoniak in trockenem Methanol und lasst drei Tage bei O⁰C stehen. Die Mischung wird unter vermindertem Druck verdampft und der Rückstand einer Chromatographie an Siliciumdioxidgel unter Anwendung von Chloroform-Methanol (95:5) als Eluiermittel unterzogen. Die beiden Isomeren A und B der Titelverbindung werden getrennt eluiert.

Isomeres A₈... NMR (CDCl₃) <f 0,97 (d_s J = 6Hz) _P 2_S28. (s, 6H) ₉ 5,00 (s₉ 2H)₉. 7V29 (Sj5H)o ;".■■.

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K/17159 - 30 -

Isomeres B, NMl (CDCl₅) 0,95 (t, J = 6Hz, 6H), 2,25 (s,.6H), 5,10 (s, 2H), 7,29 (s, 5H).

b) Man geht in gleicher Weise vor, ersetzt jedoch den Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-iN-dirnethylasinoj-leucyl-glycinäthylester durch eine äquivalente Menge des Isomeren A t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-BL-Oi-methyli-leucyl-glycin-äthylester (beschrieben in Beispiel 1 b) und erhält das Isomere A von t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-DL-iN-methylJ-leucyl-glycinamid (Boc-L-PrO-N(CHx)CHZCH₀CH(CHx)-JCO-GIy-NH₀), F = 13O°-132°C, /öl/^p = +50,2 (c = 2, Dimethylformamid).

Man geht in gleicher Weise vor, ersetzt jedoch den Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(K-dimethylaraino)-leucyl-glycin-äthylester durch eine äquivalente Menge des Isomeren B von t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-methyl)-leucyl-glycin-äthylester (beschrieben in Beispiel 1b) und erhält das Isomere B von t-Butoxycarbonyl-L prolyl-DL-(N-methyl)-leucyl-glycinamid (BoC-L-PrO-N(CH₃)CH-ZCH₂CH(CH₃)2/-GIy-NH₂, Massenspektrum (m/e): 398 (M⁺).

c) Man geht in gleicher ¥eise vor, ersetzt jedoch den Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-dinethylamino)-leucyl-glycin-äthylester durch eine äquivalente Menge von t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-(K-isobutyl)-glycyl-glycin-äthylester (beschrieben in Beispiel 1c) und erhält t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-iN-isobutylJ-glycyl-glycinamid (BoC-L-PrO-NZCH₂CH(CH₃J₂ZCH₂CO-GIy-NH₂); F = 92°-95°C, NMR (CDCl₃) «f 0,9 und 1,03 (Dublette, J = 2,5 Hz, 6 H), 1,4 (s, 9H).

Beispiel 3

L-Prolyl°DL-(N-diaethylamino)-leucyl.--glycinamid-hydrochlorid

Ij R* = N(CK,)₂, R² = CH₂CHjCH₇J).yj^sJUY = GIy;

. HCl

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Öl) Eine Mischung von 1,595 g (3,46 mMol) Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-dimethylainino)-leucyl--glycinamid, des Isomeren A, beschrieben in Beispiel 2 a), und 0,207 g eines Katalysators von 5% Palladium auf Aktivkohle in Methanol wird unter einer Wasserstoffatmosphäre während 17 Stunden gerührt, wobei das Hydrierungsgefäss mit einem Kolben verbunden ist, der 100 ml gerührte 4n-Natriunihydroxidlösung enthält. Der Katalysator wird abfiltriert. Man fügt 3,7 ml. (3,47 mMol) 0,94 n-methanolische Chlorwasserstoffsäure zu dem Filtrat und dieses wird unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wird mit Aktivkohle in wasserfreiem Methanol entfernt, filtriert und das Filtrat wird unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wird mit. Diäthyläther, Äthylacetat und Diäthyläther trituriert und unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxid getrocknet, wobei man das Isomere A der Titelverbindung erhält; / q£/fp = -43,9° (c = 2, Dimethylformamid, NMR (DMSO-dg) S 0,9 (d, J = 5Hz, 6H)_t 2,57 (s, 6H). '

Man geht in gleicher Weise vor, ersetzt jedoch das Isomere A durch eine äquivalente Menge des entsprechenden Isomeren B von Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-CN-dimethylaminoJ-leucyl= glycinamid (beschrieben in Beispiel 2 a) und erhält das entsprechende Isomere B der Titelverbindung: /ac/i? - - 33 (c - 2, Dimethylformamid).

b) 55 ml (82,5 mMol) einer 1,5 n-LÖsung von wasserfreiem Chlorwasserstoff in trockenem Äthylacetat werden während 40 Minuten in eine durch ein Eisbad gekühlte Suspension von 6,56 g (16,5 mMol) des Isomeren A von t-Butoxycarbonyl-L<-prolyl-(N-methyl)-leucyl-glycinamid (beschrieben in Beispiel 2b) getropft. Die Mischung wird bei Sisbadtemperatur während 30 Minuten und bei Raumtemperatur während 17 Stunden gerührt«, Das Lösungsmittel wird abdekantiert, der Feststoff mit trockenem Äthylacetat trituriert und das Lösungsmittel dekantiert. Der Rückstand wird in wasserfreiem Methanol gelöst, die Lösung wird filtriert und das Filtrat unter vermindertem Druck verdampft, Der Rückstand wird mit

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Ä'thylacetat-Petroläther (1:1), Diäthyläther-Petroläthyer (1:1) und Diäthyläther trituriert. Der Rückstand wird unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxid und Kaliurchydroxid getrocknet, wobei man das Isomere A von L- ProlylDL--(N-methyl)-leucylglycinamid-hydrochlorid (1; R¹ = CH₃, R² = CH₂CH(CK₃)₂, R^ = NH₂, Y = GIy; H-L-PrO-N(CH₃)CHZCH₂CH(CH^)₂ZCO-GIy-NK₂) erhält. Kassenspektrum (ra/^e): 298 (M⁺).

Man geht in gleicher "Weise vor, ersetzt jedoch das Isomere A von t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-DL-iN-raethylJ-leucyl-glycinamid durch eine äquivalente Menge des Isomeren B von t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-methyl)-leucyl-glycinamid (beschrieben in Beispiel 2b) und erhält das Isomere B von L-Prolyl-DL-(N-inethyl)-leucyl-glyclnamid-hydrochlorid /Ϊ; R¹ = CH,, R² = CH₂CH(CH,)₂, R³ = NH₂, Y = GIy; H-L-Pro-Ii(CH₃)CE/CH₂CH(CH₃)₂/C0-Gly-NH₂7 Massenspektrum (m/e): 298 (M⁺).

c) Man geht in gleicher Weise vor vie in Beispiel 3b) beschrieben, ersetzt jedoch das Isomere A von t-Butoxycarbonyl-L-prolyi-DL-(N-methyl)-leucyl-glycinamid durch eine äquivalente Menge von t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-(N-isobutyl)-glycyl-glycinamid und erhält L-Prolyl-iN-isobutylJ-glycyl-glycinamid-hydrochlorid /I; R¹ = CH₂CH(CH₃)₂, R² = H, Y= GIy, R³ = NH₂; H-L-Prο-NfCK₂- CH(CH₃)₂/CH₂CO-Gly-im₂J> Kassenspektrum (m/e): 284 (M⁺).

Beispiel 4

L-Prolyl-DL°(N"dimethyla.mino)-«leucyl-glycin-4-aniino-n-butyl-amiddihydrochlorid; I; R¹ = N(CH ₃),,, R² = CH ₂CH(CH₃)O, R³ = NH(CH„);,NH_n , Y = GIy; (K-L-PrO-N^N(CH,)o7CH/CHnCH(CH,)o7CO-Glv-. 2 HCl

a) Eine Lösung von 4,45 g (9,07 mMol) Benzyloxycarbcnyl-L-prolyl-DL-(N-dimethylaaino)-leucyl-glycin-äthylester (beschrieben in Beispiel 1 a) und 12,25 ml In-Natriumhydroxid in 23 ml Methanol

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M/17159 - 33 ~

wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. 50 ml gesättigte Natriumchloridlösung werden zugesetzt und die Ausfällung wird durch Fi-ltrieren entfernt. Das Filtrat wird auf O⁰C gekühlt und mit 13,3 ml ΐη-Chlorwass er stoff säure angesäuert. Di·=' Mischung wird mit Chloroform extrahiert. Der organische ExtraVt wird mit Wasser bis zur Neutralität gewaschen, über Magr«si:.;:.-sulfat getrocknet und unter vermindertem Druck verdampft, vo'oei man BenzyloxycarbGnyl-L-prolyl-DL-(N-dimethylaKino)-leucyl-glyciri erhält; NMR (CDCl^K 0,93 (6H), 2. 53 (6H), 8,6 (1K).

b) 1,19g (7>5 BiKoI) Ν,Ν'-Carbonyldiimidazol werden zu einer gerührten Lösung von 3,4-77 g (7,5 mMol) Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-dimethylamino)-leucyl-glycin (beschrieben in Beispiel 4a) in 14 ml trockenem Dimethylformamid bei - 15°C gefügt, wobei man eine "trockene Atmosphäre beibehält. Die Mischung wird 30 Minuten bei - 15⁰C gerührt. Sine Lösung von 1,685 g (7,5 mMol) Kono-(t-butoxycarbonyl)=1,4-diaminobutan~ hydrochlorid (hergestellt wie von FUGeiger, Annalen, 750, 165 (1971) beschrieben) und 1,26 ml Triäthylamin in 6 ml trockenem Dimethylformamid wird zugefügt. Die Mischung wird 20 Stunden bei Raumtemperatur gerührt und verdampft. Der Rückstand wird in 200 ml Äthylacetat aufgenommen und mit 10% Natriunabicarbonatlösung,20^ Natriumchloridlösung, 10% Zitronensäurelösung und 2054 Natriumchloridlösung gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft. Der Rückstand wird einer Chromatographie an Siliciumdioxidgel unter Anwendung von Chloroform-Methancl-Pyridin (95:5:1) zur getrennten Eluierung der beiden Isomeren A und B von Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-dimethylamino)-leucyl-glycin-4-t-"butoxycarbonyl-amino-nbutylamid unterzogen.

Isomeres A; NMl (CDCl₃) ξ0,99 (d, J = 6Hz, 6H)„ 1,42 (s, 9H)

s>

2,65 (6h), 5 (s, 2H), 7,25 (5H).

Isomeres B_s NMR (CDCl,) «i O₉95 (t₅ J = 6Hz_s 6H)₉ 1,43 (s, 9H) 5,10 (s_? 2H),-7,30 (s_s 5H),

609886/1210 BAD

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c5 Eine Mischung von 2,26 g (3,53 mMol) des Isomeren A von Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-dimethylamino)-leucyl-glycin-4-t-butoxycarbonylamino-n-butyl-a.mid (beschrieben in Beispiel 4b) und 0,250 g eines Katalysators von 5% Palladium auf Aktivkohle in 50 ml Essigsäure wird unter einer Yfasserstoffatmosphäre 21 Stunden gerührt, wobei das Hydriergefäss mit einem Kolben verbunden ist, der 100 ml einer gerührten Lösung von 4n-Natriumhydroxid enthält. Der Katalysator wird abfiltriert, das Filtrat wird in Eiswasser gekühlt und 12 ml einer 1,6n-Lösung von Chlorwasserstoff in trockenem Äthylacetat wird zugetropft. Die Mischung wird bei Raumtemperatur zwei Stunden unter Ausschluss von Feuchtigkeit gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck verdampft und Spuren von Essigsäure werden durch azeotropes Verdampfen mit trockenem Benzol entfernt. Der Rückstand wird einer Chromatographie an einer ■ Säule eines quervernetzten Dextran-Absorbens (Sephadex-LH-20) unter Verwendung von Methanol unterzogen. Das Sluiermittel wird mit Aktivkohle entfärbt, filtriert und verdampft. Der Rückstand wird mit wasserfreiem Diäthyläther trituriert und unter vermindertem Druck über Phosphorpentoxid getrocknet, wo-

25

bei man das Isomere A der Titelverbindung erhält, /öl/^r =

- 43„6° (c = 2₉ Dimethylformamid);

yse

C1

9H33N6

47

,70;

2 HCl:

8,

52;

N

17

,60;

Cl

1

4

,86

ber

C

47

,10;

H

8,

55;

N

17

,55;

Cl

1

5

,24

gef

« ■

C

K

Man geht in gleicher Weise vor, ersetzt jedoch das Isomere A von Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-dimethylamino)-leucyl-glycin-4-t-butoxycarbonylarnino-n-butyl-amid durch das entsprechende Isomere B (beschrieben in Beispiel 4b) und erhält das entsprechende Isomere B der Titel verbindung: /od/^ = - 18,6° (c = 2, Bimethylf ormarnid);

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Analyse G₁₉H₃₈N₆O₃ · 2 HCl-R₂O:

ber.:	G	46	,62;	H	8	,64;	N	17	,20
gef.t	C	46	,88;	H	8	,50;	N	17	,51

d) Kan geht in gleicher Weise vor, ersetzt jedoch den Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-diinethylaHiino)-leucyl-glycinäthylester durch eine äquivalente Menge von Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-dimethylaroino)-alanyl-glycin-äthylester (beschrieben in Beispiel 1 d) und ersetzt das Mono-(t-butoxycarbonyl)-1^-dianinobutan-hydrochlorid durch eine äquivalente Menge von Diethylamin und erhält L-Pr olyl.-DL-(N-diathylamino}-alanyl~ glycin-diäthylamid-hydrochlorid /Ϊ; R¹ = ⁵ )2, Y = GIy/. '

e) Man geht in gleicher "tieise vor, ersetzt jedoch den Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(K-dimethylamino)-leucyl-glycin-äthylester durch eine äquivalente Menge von Benzyloxycarbonyl-L-prolyi-DL-/^N-di-(n-propyl)-aniino_7-valyl-glycin-äthy!ester (beschrieben in Beispiel 1 e) und ersetzt das Mono-(t-butoxycarbonyl)-1^-diaminobutan-hydrochlorid durch eine äquivalente Menge von n-Propylamin und erhält L-Prolyl-DL-/N-di-(n-propyl)-amino/= valyl-glycin-n-propylamid-hydrochlorid ß.; R = N(CH₂CK₂CHv)₂* R² = CH(ChV)₂, R³ = NH(CH₂CH₂CH₃), Y = GIy; H-L-Pro-Ν/?·Ι{CH

f) Man geht in gleicher Weise vor, ersetzt jedoch den Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-iN-dimethylaminoJ-leucyl-glycin-äthylester durch eine äquivalente Menge von Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-DL-(N-äthyr)-valyl-glycin-äthylester (beschrieben in Beispiel 1 f) und ersetzt das Mono-(t-butoxycarbonyl)~1,4-diaminobutan-hydrochlorid durch eine äquivalente Menge von Methylamin, wobei man L-Prolyl -DL-^-äthylJ-valyl-glycin-methylamid-hydro- ■

R¹ = CH₂CH, R² = CH(CHJ V? -

Chlorid erhält ^; R¹ = CH₂CH₃, R² = CH(CH₃J₂, V? - NHCH₃, Y = GIy; H-L-PrO-N(CH₂CH₃)CH/CH(CH₃)2/C0=Gly»NHCH₃7ο

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Beispiel 5

Alternative Synthese von t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-L-(N-niethyl)-leucyl-glycin-äthylester

_{3 2} GIy-OEt) (Isomeres B, beschrieber, in Beispiel 1b)

Eine Lösung von 4,2 g (15 mMol) Z-L-(K-Me)Leu-0H, beschrieben von J.R.Coggins und K.Leo Benoiton, Can.J.Chem., 49, 1968 (1971), 12,96 g (15 mKol) 2,4,5-Trichlorphenol und 3,09 g (15 mMol) Dicyclohexyl-carbodiimid in 21 ml trockenem Methylenchlorid wird eine Stunde bei - 15°C und anschliessend zwei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Ausfällung wird abfiltriert und das Filtrat wird verdampft, xfobei man Z-L-(N-Me)-Leu-OTcp erhält.

Sine Lösung von 1"5 mKol des vorstehend beschriebenen Z-L-(N-Ke)-Leu-OTcp in 10,5 ml Dimethylformamid wird zu einer Lösung von 2,09 g (15 mKol) Glycinäthylester-hydrochlorid und 1,92 ml (15 mMol) N-Äthylmorpholin in 35 ml Dimethylformamid bei O⁰C gefügt und die Mischung wird bei 0⁰C 30 Minuten und anschliessend bei Raumtemperatur 20 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird durch Verdampfen entfernt und der Rückstand einer Chromatographie an Siliciumdioxidgel unter Verwendung von Chloroform-Äthylacetat (85:15) als Sluiermittel unterzogen. Durch Verdampfen der Eluate erhält man Z-L-(N-Me)Leu-Gly-OSt, NMR (CDCl,) S 0,93 (6H), 1,2? (3H),-2,85 (3H), 3,97 (2H), 4,20 (2H), 5,17 , '7,34

4,9 ml einer 30-32%igen Lösung (24 mMol) von Bromwasserstoffsäure in Essigsäure wird zu 2,9 g (7,96 mMol) einer Lösung von Z-L-(N-Me)Leu-Gly-OEt (vorstehend beschrieben) in 4_e7 ml Essig- '· säure gefügt und die resultierende Mischung wird bei Raumtemperatur während 4,5 Stunden gerührt. Das Lösungsmittel wird durch Verdampfen unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand einer aseotropen Destillation mit Benzol-Methanol unterzo-

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H/17159 -37-

gen. Der resultierende Rückstand wird unter vermindertem Druck überKaiiushydroxid getrocknet, wobei man ^i-L-(N-Me)Leu-Gly-OEt/HBr erhält ο

Eine Lösung von 0,645 g (3 mKol) Boc-L-Pro-GH, 0,810 g (6 mMol) I-Hydroxybenzotriazol und 0,680 g (3,3 mKol) Dicyclohexylcarhodiimid in 15 si trockenem Tetrahydrofuran wird eine Stunde bei - 5 "C"und anschliessend eine Stunde bei 25 C gerührt. Die Mischung-wird auf 0°C gekühlt und sit einer Lösung von 3 mKol /H-L-(N-MejLeu-Gly-OSt/HBr (vorstehend beschrieben) und 0,384 ml (3-iaMol) N-Äthylmorpholin in 14 ml trockenem Tetrahydrofuran bei O⁰C behandelt. Die Mischung wird 30 Minuten bei 0⁰C und anschliessend 40 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Die Ausfällung wird abfiltriert und das Filtrat wird unter vermindertem Druck verdampft. Der Rückstand wird in 100 nil Äthylacetat gelöst. .Die Lösung wird mit eisgekühlter 1n-Zitronensäure_p ¥asser, 5To Natriumbicarbonatlösung und gesättigter Natriurachloridlösung gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft. Der Rückstand wird einer Chromatographie an Siliciumdioxidgel unter Anwendung von Chlöroform-Äthylacetat-Pyridin (5Oi5OsO1) als Eluiermittel unterzogen, vrobei man die Titelverbxndung t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-L-(N-methyl)-leucyl-glycin-äthylester erhält; /otf~. = - 73s1°" (c = 1 ρ Dimethylformamid). Die nach der vorstehenden Methode erhaltene Titelverbindung ist identisch mit dem Isomeren B von t-Butoxycarbonyl-L-prolyl-DL-CN-methylJ-leucyl= glycin-äthylester, erhalten nach der in Beispiel 1 b) beschriebenen Verfahrensweise.

Beispiel 6

L- Prolvl-L-(N-methyl)-leucyl-D^alaninamid (H-Pro-L-(N-Ke)Leu«

,,Y = D-AIa/

»0 g (50 mMol) Benzyloxycarbonyl-L-(N-methyl)-leucin, 7_?0 g

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(50 mMol) D-Alanin-methylester und 13,5 g (10 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol werden in einer Mischung von 300 ml trockenem Tetrahydrofuran und 70 ml Dimethylformamid gelöst. Die Lösung wird auf 0⁰C gekühlt und 6,42 ml (50 nsKol) N-Athylrnorpholin werden zugesetzt, worauf eine Lösung von 10,3 g (50 niKol) Bicyclohexyl-carbodiimid in 80 ml trockenem Tetrahydrofuran zugetropft wird. Die Reaktionsisischung wird eine Stunde bei 0°C und eine weitere Stunde bei Raumtemperatur gerührt, filtriert und die Lösungsmittel v/erden unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird in Äthylacetat aufgenommen und mit Wasser und gesättigter Natriumchioridiosung extrahiert. Der nach dem Trocknen und Verdampfen der Athyiacetatschichten verbliebene Rückstand wird an Siliciumdioxidgei chrornatographiert (1 kg; CHCl,, enthaltend 2% MeOH). Durch Verdampfen der Sluiermittel erhält man Z-L-(N-Me)Leu-D-AIa-OMe; NMR (CDCl,.) S 2,86 (3H, s)., 3_S74 (3H, s), 5,25 (2H, s)_r 7,42 (5H, s) /

Eine Mischung von 10,5 g (28,8 g) Benzyloxycarbonyl-L-(N-methyl)~leucyl~D~alanin-methyie£ter (wie vorstehend beschrieben) und I₁O g 5% Palladium auf Aktivkohle in 120 ml Essigsäure und 14„4 ml (28,8 mMol) 2n-Chlorwasserstoffsäure wird 24 Stunden unter einer Atmosphäre von Wasserstoff gerührt. Der Katalysator wird abfiltriert und das Fiitrat verdampft, wobei man einen Rückstand von H=L-(N-Me)LeU-D-AIa-OMe-HCl erhält. Eine Lösung von 28 _s 8 mMol der letztgenannten Verbindung, 3,9 g (28,8 mMol) 1-Hydroxybenzotriazol, 10,7 g (28,8 mMol) Benzyloxycarbonyl-L-prolin=p-nitrophenylester und 3*7 ml (28,8 mMol) N-Äthylmorpholin in 70 ml Dimethylformamid v/ird drei Tage bei O⁰C gerührt. Nach der Verdampfung der Lösungsmittel unter vermindertem Druck XiTird der Rückstand in Äthylacetat gelöst und mit Wasser, gesättigter Natriumbicarbonatlösung, Wasser und gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen» Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft. Der Rückstand wird an Siliciumdioxidgei unter Anwendung von Chloroform-Methanol is2) chromatographiert« Die Sluiermittel werden verdampft,

609886/1210 oWQ^^AL ^^ö?t- "

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wobei man Benzyloxycarbonyl-L-propyl-L-(N-methyl)-leucyi-D-alanin-methylester (Z-L-Pro-L-(K-Ke)Leu-D-AIa-OMe) erhält; NMR (CDCl₃): S 0,95 (d, 6H), 2,87 und 3,0 (zwei s, 3H), 3,72 (s, 3H), 7,4 (s, 5H).

¹,7 g (3,68 mMol) der letztgenannten Verbindung werden bei O⁰C in 85 ml mit Ammoniak gesättigtem Methanol gelöst und drei Tage bei O⁰C stehen gelassen. Das Lösungsmittel wird'durch Verdampfen entfernt und der Rückstand aus Isopropyläther-Acetonkristallisiert, wobei man Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-(l<I-· methyl)-leucyl-D-alaninaraid (Z-L-Pro-L-(N-Me)LeU-D-AIa-NH₂) vom F = 146-150⁰C erhält.

Analyse C₂₃H₃₄TI₄O₅

ber. :	C	61	,86;	H	7	,67;	N	12	,55
gef.:	C	61	,67;	H	7	,82;.	N	12	,66

Eine Mischung von 1,29 g (2_f9 mMol) Z-L-Pro-L-(N-Me)Leu-D-AIa-NKp (wie vorstehend beschrieben) und 0,13 g 5% Palladium auf Kohle in 20 ml Essigsäure und 2,9 ml In-Chlorwasserstoffsäure wird 20 Stunden unter einer Y/asserstoffatmosphare gerührt. Der Katalysator wird abfiltriert und das Filtrat lyophilisiert, wobei man die Titelverbindung in Form des Chlorwasserstoff säureadditionssalzes erhalte Der Rückstand wird einer lonenaustauscherchromatographie an einer Säule von Carboxymethylcellulose (Whatmann CM-23) unter Verwendung von 0_s04nwässrigem Ammoniumacetat unterzogen. Das Eluiermittel wird lyophilisiert, wobei man die Titelverbindung in Form des Essigsäureadditionssalzes erhält; /oo/q = = 77,6° (c = 1,1% Essigsäure),

Durch wiederholtes Lyophilisieren der letztgenannten Verbindung von Wasser erhält man die Titelverbindung in Form der freien Base; mm (CDCl₃)-/ 0,90 (s, 6H), 1,22 (d_s J = 7Hz, ,3H)₅ 1,45-

809886/1210 . . .- ■

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•2,16 (m,H), 2,82 und 2.90 (Singuletts, 3H), 3,9-5,2 (m, 3H).

Man geht in gleicher Weise vor, verwendet jedoch Benzyloxycarbonyl-D-(N-rnethyl)-leucin als Ausgangsmaterial anstelle des vorstehend beschriebenen L-Znantiomeren und erhält L-Pr ο IyI-D-(N-methyl) -leucyl-D-alaninasid (K-Pro-D- (N-Ke)Leu-D-AIa-KH₂>* Aminosäureanalyse: Pro 0,68, AIa 1,00.

Beispiel 7

L-Prolyl-L-leucyl-^lycin-^-aniinp-n-butyl-amid /I; R = H_T * , R" - HH(CH₂)^NH ₂, Y = Gly7 (K-L-Pro-L-Leu-

3,02 nl 1η-Natriumhydroxid werden zu einer gerührten Suspension von 1,0 g (2,24 mHol) Benzyloxycarbonyl-L-prolyl-L-leucylglycin-äthylester, hergestellt v/ie von ¥.0.Cash, J.Org.Chem., 26_P 2136 (1961) beschrieben, in 5,6 ml Kethanol bei O⁰C getropft und die Lösung vrird 20 Minuten bei 25°C gerührt. Die Lösung wird mit 23 nil gesättigtem Natriumchlorid verdünnt, auf O⁰C gekühlt und mit 3,5 ml In-ChIorwasserstoffsäure angesäuert. Die Mischungvird 20 Minuten bei 0⁰C gerührt. Der Feststoff wird gesammelt, mit .kaltem Wasser gewaschen, unter verminderter; Druck über Phosphorpentoxid getrocknet und aus Methanol-Wasser kristallisiert, wobei man Z-L-Pro-L-Leu-Gly-OH vom F = 163-165⁰C erhält; /te/^⁵ = - 55,8° (c = 2, Dimethylformamid).

Sine Mischung von 9,48 g (22,6 mMol) der letztgenannten Verbindung, 5s06 g (22,6 mMol) Kono-(t-butoxycarbonyl)-1„4-diaminobutan-hydrochlorid, 28^9 ml N-Äthylaorpholin, 6,1 g (45 inKol) 1-Hydroxybenzctriazol und 4,9S g (24,85 mKol) Bicyclohexylcarbodiimid in 225 ml Diirethylforaamid wird bei O⁰C eine Stunde und'anschliessend bei 25 C während vier Stunden gerührt. Die Aus fällung wird abfiltriert und das Lösungsmittel wird verdampft,-Der Rückstand wird in Äthylacetat gelöst, die Ausfällung wird

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entfernt und das Filtrat wird mit 10biger Natriumbicarbonatlösung, Wasser, 10biger Zitronensäureiösung und mit Wasser gewaschen.

Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wird verdampft* Der Rückstand wird an SiIiciusidloxidgel unter Anwendung von Chloroform-Methanol-Pyridin (96:2:1) als Eluiermittel chromatographiert, worauf man das Eluiermittel verdampft und Z-L-PrO-L-LeU-GIy-NH(CH₂)^NK-BoC erhält; NMR(CDCl₃): 'S 0,92 (oH), 1,42 (9H), 5*16 (2H), ■7,36 (5H)..

, , ■■■■-. ;. . " ι

Eine Mischung von 7,4g (12,55 ffiMol) der letztgenannten Verbindung, 0,505 g 5% Palladium auf Aktivkohle in 50 ml Essigsäure wird unter einer Atmosphäre von Viasserstoff während fünf Stunden, gerührt, wobei das Hydriergefäss mit einem Kolben verbunden ist, der 250 ml einer gerührten 4n-Lösung von Natriumhydroxid enthält. Die Mischung wird filtriert und das Flltrat in einem SIsbad gekühlt. 16 ml einer 4,6n-Lösung von Chlorwasserstoff in trockenem Äthylacetat wird zugetropft und die Mischung wird 30 Minuten bei 1O^DC und anschliessend drei Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Das Lösungsmittel wird verdampft und der Rückstand in Benzol gelöst und das Lösungsmittel erneut verdampft. Der Rückstand wird in Methanol gelöst, Aktivkohle wird zugesetzt, es Wird filtriert und das Lösungsmittel aus dem Flltrat verdampft, wobei man die Titelverbindung in Form des Chlorwasserstoffsäureadditionssalzes erhält. Die letztgenannte Verbindung; wird in Ο,ΐη-Chlorvasserstoffsäure gelöst und einer Ionenaüstauscherchromatographle an einem Anionenaustauscherharz (Baker CGA-540) in der Acetatförm unterzogen. Die Elüiermittel werden verdampft, der Rückstand mit Diäthyläther und Petroläther trituriert und getrocknet, wobei man die Titelverbindung als Sssigsäureadditionssalz erhält;

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Analyse C₁₇H₃₃N₅O₃^CH₃CO₂H · 1/2 Η_£0 (484,6)

ber.: C 52,04; H 8,73; N 14,45; CH₃CO₂H 24,78 % gef.: C 52,13; H 8,70; N 14,35; CH₃CO₂H 23,2 %

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Verfahrensschema

R⁶-L-Pro-OH + R¹N = CHR² (III) + CNCH₉COR⁷

■ +

R⁶-L-Pro-N(R¹)CH(R²)C0-Gly-R⁷ (II, R⁷ = niedrig-Alkoxy

^ Hydrolyse

R⁶^L-PrO-K(R¹)CH(R²)CG-Gly-R⁷ (II, R⁷ = CH)

Ι Asidbildung

R⁶-L-Pro-N(R¹)CK(R²)CC-GIy-R⁷ (II-, R⁷ = Amino, usw. wie

definiert)

¥ Schutzgruppenabspaltung H-L-PrO-N(R¹)CH(R²)CO-Gly-R³ (I)

oder

Z-L-(K-Me)-Leu-OH +H-Y-O (niedrig-Alkyl) -^Z-L-(N-Me)LeU-Y-O

(niedrig-Älkyl)

1) Schutζgruppen- (1) Amid-

_z._L.p_ro._L„_(Mle)Leu-Y-0 (niedrig- ^bila

_(M) (g

2) Z-L-Pro-OKp · Alkyl) (2) Schutz-

gruppenabspal; tung

H-L-PrO-L-(N-Me)LeU-Y-KH₂ (1,Y = C-Iy oder D-AIa)

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Claims (1)

1. ft/17159 - 44 -

   Patentansprüche

   VI./ Tripeptidderivate der allgemeinen Formel

   H-L-Pro-N - CH - C - Y - R³

   J₁ I₂ H (D

   R BT 0

   1 4 5

   worin R = Wasserstoff, niedrig-Alkyl oder NR R , worin

   4 5 2

   R und R = jeweils niedrig-Alkyl; R = Wasserstoff oder niedrig-Alkyl; R = Amino, niedrig-Alkylamino, Di-(niedrig)-alkylamino oder Amino -(niedrig)-alkylamino und Y = einer der Aminosäurereste GIy oder D-AIa, mit der Kassgabe, dass, falls R¹ = KR R , R = niedrig-Alkylamino, Di-(niedrig)-alkylamino oder Amino-(niedrig)-alkylamino.

   2. Tripeptidderivate der allgemeinen Formel I gemäss Anspruch 1 in Form eines pharmazeutisch verträglichen bzw. verwendbaren Säureadditionssalzes.

   3. Tripeptidderivate der Formel I gemäss Anspruch 1 mit geschützter Aminogruppe bzw. geschützten Aminogruppen.

   4. L-Prolyl-DL-Cli-methylJ-leucyl-glycinamid, Isomeres A.

   5. L-Prolyl-E'L-(N-methyl;-leucyl-glycinamid, Isomeres B.

   6. L-Prolyl-(N-isobutyl)-glycyl-glycinaisid . .

   7. L-Prolyl -DL- (N-dimethylamine)-leucyl-glycin-A-amino-r.-butyl · amid, Isomeres A.

   8. L-Prolyl -DL-(N-diT?ethYlarr₁ino)-leuc2/.l-glycin-4-arai:;p-r.-b^tyl·

   ^5i'b,_si3___Λ."^ r: .; ...^ _w .■^,,.;_ί^-_>,,_i:^_ΓiΓ;

   6 0 9 8 8 6/1210 _: -.

   2633978

   M/17159 . - h5 —

   9. L-pfoiyl-L~(K-niethyl)-leucyl-D^alaninamid.

   10. L-prolyl-D-(N-methyl)-leuGyl-D-alaninamld*

   11. L-prölyi-L-leucyl-glycin-^-amino-n-butyl-ainid.

   12. Verfahren zur Herstellung von Tripeptidderivaten der Formel I geiftäss Anspruch 1

   H-L-Pro- N --CH - C - Y - R³ (I).

   Ί '2 ^!l

   worin R = niedrig-Alkyl oder NR R- ,"worin R und Rr = je-

   2 " - ■
   weils niedrig-Alkyl; R = Wasserstoff oder niedrig-Alkyl; R =* Amino, niedrig-Alkylaniino, Di-(niedrig)-alkylaniino oder Amino-(niedrig)-alkylamino und Y = der Aminosäurerest GIy, mit der Massgabe, dass, falls R =|NR R , R = niedrige Alkylamino, Di-(niedrig)-alkylamino oder Amino-(niedrig)*· alkylamino, dadurch gekennzeichnet, dass man ein Enamin oder Hydrazon der Formel ι

   R¹N = CHR²

   (ΠΙ)

   12

   worin R und R wie vorstehend definiert sind, mit einer Aminosäure der Formel R ^L-Pro-OH, worin R= eine Aminosehutzgruppe, wie sie in der Peptidsynthese verwendet wird,

   ' 7 ■

   in Anwesenheit eines Isonitrils der Formel CNCH₀COR , worin

   R = niedrig-Älkoxy, unter Bildung des entsprechenden Zwischenprodukts der Formel

   >CH(R²)CO-Gly-R⁷ (11}

   1^6 7

   kondensiert ν vrorin R , R _T R und R wie vorstehend definiert sind* w^fäuf man die letztgenannte \ferbi-jaduiig n&ch

   -6 0/9 8 8 6/1 i

   INSPECTED

   H/17159 - 46 -

   lung von niedrig-Alkylestern wirksam sind, in das entsprechende Amid oder substituierte Amid umwandelt und die Schutzgruppe(n) unter Bildung des Peptidderivats der Formel

   12 3
   I, worin R , R , R und Y wie vorstehend definiert sind, abspaltet.

   13. Verfahren gemäss Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass man die Umwandlung des Zwischenprodukts der Formel

   R⁶-L-Pro-N(R¹)CH(R²)CO-GIy-R⁷ (II)

   1 P fs 7
   worin R , R , R und R^- wie in Anspruch 12 definiert sind, durch Behandlung mit Ammoniak in das entsprechende Ataid · umwandelt und die Schutzgruppe R abspaltet, wobei man das entsprechende Peptidderivat der Formel I erhält, worin R

   2 3

   und R die angegebenen Bedeutungen haben, R = Amino und Y :

   der Aminosäurerest GIy.

   14. Verfahren gemäss Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man das Zwischenprodukt der Formel

   ¹ )CH(R²)C0-Gly-R⁷ (II)

   worin R ,R , R und R die angegebenen Bedeutungen haben, durch Behandeln mit einem hydrolysierenden Kittel in die entsprechende Säure umwandelt, diese mit einem allgemein in der Peptidchemie zur Aktivierung einer Carboxylgruppe geeigneten Mittel behandelt, die aktivierte Verbindung mit einem niedrig-Alkylamin, Di-(niedrig)-alkylamin oder Monogeschützten Amino-(niedrig)-alkylamin zu dem entsprechenden substituierten AmIn kondensiert und die Schutzgruppe(n) von der letztgenannten Verbindung: abspaltet, wobei man das e.ntsprechende Pöptidderivat der Formel I erhält,'worin R und

   2; %

   R die angegebenen Bedeuitüngen "feaben und R = n-iedrig-Alkyl-·

   o<ä@i* Amiiao-'(niedrig)—

   ^7159 ■ - 47 -

   amino und γ = der AmiiiosSurerest GIy. 15.- Verfahren zur Herstellung- eines Tripeptide der Formel \

   H-L-Pro - N- GH-C * Y -R³

   1-1 IO Jl

   R¹ FT O

   1 ?

   gemäss Anspruch 1 , worin R = CH ^, R = CH₂CH(CH₅ )₂, d.h. die Aminosäureseitenkette von L-Leucin R = NHp und Y= der Aminosäurerst D-AIa, dadurch gekennzeichnet,dass man einen aktivierten Ester von Benzyloxycarbonyl-L-(N-methyl)-leucin mit D-Alanin-methylester unter Bildung des Dipeptide der Formel Z-L-(N-Me) Leu-D-Ala-OMe umsetzt, die letztgenannte Verbindung mit Wasserstoff und einem Edelmetallkatalysator behandelt und das Dipeptid der Formel H-L-(N-Me) Leu-D-Alä-OMe isoliert, die Letzgenannte Verbindung mit einem aktivierten Ester von Benzyloxyeartoonyl-L-prolin umsetzt und das Tripeptid der Formel Z-L-Pro-L-(N-Me) Leu-D-Ala-Ome isoliert, die letztgenannte Verbindung mit Ammoniak behandelt und das Tripeptid der Formel Z-L-Pro-L-(N-Me) Leu-D-AIa-NH₂ isoliert, die letztgenannte Verbindung mit. Wasserstoff und einem Edelmetallkatalysator behandelt und das entsprechende Tripeptid der Formel I isoliert, worin R = CH₃, R² = CH₂CH(CH₅)₂, R⁵ = NH₂und Y = der Aminosäurerest D-AIa.

   .16. Arzneimittel tr*-, pharmazeutische^Zusammensetzung, enthal tendein oäureadcitionssalz einer Verbindung tier .Formel I gemäss Anbruch 2 und einen pharmazeutisch verwendbaren Trä- - . ger bzv, _r iibliche -Hilf s- und Trägerstoffe. .' ·'-..

   17. Arzneimittel bzw. pharmazeutische Zusammensetzung, enthal-

   : · —^/fc^¹^«⁶⁵^¹⁰^^.? P^vat einer ,Verbindung :der ' Formel. 1: ^ä^s. Anspruch J-und^einen pharmazeutisch

   K/17159 - 48 -

   •18. Arzneimittel bzw. pharmazeutische Zusammensetzung in Dosiseinheitsforin mit Wirkung zur Behandlung der Parkinson-Erkran kung, enthaltend eine Kombination einer Verbindung der Formel I gemäss Anspruch 1, zusammen mit einer therapeutischen Dosis von Laevodopa und einem pharmazeutisch verwendbaren
   Träger bzw. üblichen Hilfs- und Trägerstoff.

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