DE1518133B1

DE1518133B1 - Verfahren zur Herstellung eines neuen hypotensiv wirkenden Hendekapeptids

Info

Publication number: DE1518133B1
Application number: DE19621518133
Authority: DE
Inventors: Francesco Chillemi
Original assignee: Farmaceutici Italia SpA
Current assignee: Pfizer Italia SRL
Priority date: 1961-10-05
Filing date: 1962-10-01
Publication date: 1970-08-20
Also published as: SE302617B; FR2822M; ES281304A1; DK104307C; DK108976C; GB984810A; CH429754A

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung des neuen Hendekapeptids L - Glutaminyl - l - proly 1 - l - seryl - L - lysy 1 - L - aspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid (I), das eine hohe gefäßerweiternde und blutzuckersenkende Wirkung aufweist.

Das Hendekapeptid der Formel I zeichnet sich durch eine hohe peripher gefäßerweiternde Wirkung aus, die besonders bei Menschen und Hunden nach-. weisbar ist, weshalb es bei der therapeutischen Behandlung von Hypertonie Verwendung finden kann. Das Verfahren zur Herstellung des neuen Hende-5 kapeptids L-Glutaminyl-L-propyl-L-seryl-L-lysyl-L-aspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid der Formell

CONH₂
CH₂
CH₂
H₂N-CH-CO-N

/CH₃
CH

CH₂-NH₂ CH₂

OH CH₂

CH₂ CH₂ CH₂

-CH-CO—NH-CH-CO—NH-CH-CO

CO—CH-NH-CO—CH-NH-CO—CH-NH-CO—CH-NH

I I I

C^ri.2 {-Ή.3 CH.2

QH₅ COOH

NH-CH₂-CO-NH-CH —CO—NH-CH -CO-NH₂

CH₂ CH₂

/CH₃

CH S-CH₃

CH₂

ist dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem Hexapeptid L-Alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid der Formel II

/CH₃
CH

CO -CH —NH- CO-CH —NH-CO—CH -NH₂

CH₂ CH₃

QH₅
NH-CH₂-CO-NH-CH-CO-Nh-CH-CO-NH₂

CH,

/CH,

CH CH₂
CH₃
S-CH₃

(ID

und Asparaginsäure, deren Amino- und /S-Carboxylgruppen geschützt sind, das Heptapeptidx-Aspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid der Formel III

3 /CH₃

CH

CO -CH —NH--CO—CH —NH-CO—CH -NH-CO-CH-NH₂

CH₂ CH₃ CH₂

C₆H₅ COOR³

NH-CH₂CO NH CH — CO—NH-CH -CO-NH₂

CH₂ CH₂

/^CH3 CH₂

CH I

S-CH₃

dessen Carboxylgruppe durch den Rest R³ geschützt ist, aufbaut und dieses mit dem Tetrapeptid L-Glutaminyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysin, von welchem zwei Aminogruppen geschützt sind, der Formel IV

CONH₂
CH₂
CH₂
R²—N—CH- CO-N

CH₂-NR²
CH₂

CH₂-CH₂ OH CH₂

CH₂ CH₂ CH₂

—CH- CO—NH- CH- CO—NH- CH- COOH

in welcher R² eine schützende Gruppe bedeutet, oder einem zur Bildung der Peptidbindung geeigneten Derivat davon umsetzt und hierauf die schützenden Gruppen abspaltet.

Beispiele von schützenden Gruppen R² zum Schutz der Aminogruppen sind die Tosyl-, Carbobenzoxy-, Carbo-t-butoxy-, Trifluoraeetyl-, Tritylgruppe und andere in der Polypeptidchemie übliche Schutzgruppen. Beispiele von schützenden Gruppen R³ zum Schutz der Carboxylgruppe sind die Methyl-, Äthyl-, t-Butyl-, Benzyl-, p-Nitrobenzylgruppe.

Als Säurederivate des Tetrapeptide, die mit Aminogruppen reagieren können, verwendet man z. B. das Säurechlorid, Säureazid oder den p-Nitro-phenylester; die Kondensation kann auch in Gegenwart von Dizyklohexyicarbodiimid ausgeführt werden.

Die Abspaltung der Schutzgruppen kann nach bekannten Verfahren ausgeführt werden und je nach den Fällen durch Behandlung mit Alkalihydroxyden oder mit Natrium in flüssigem Ammoniak oder mit Chlorwasserstoff oder Bromwasserstoff oder durch katalytische Hydrierung.

Die Isolierung und die Reinigung des erfindungsgemäß hergestellten Hendekapeptids kann vorteilhaft durch Chromatographie an basischer Tonerde oder an Ionenaustauschern oder durch Gegenstromverteilung durchgeführt werden.

Die Herstellung der Ausgangsstoffe und das erfindungsgemäße Verfahren kann beispielsweise wie folgt ausgeführt werden: ...

Tosyl-L-pyroglutamyl-chlorid wird mit Prolin kon40

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densiert, und das erhaltene Dipeptid wird durch Behandlung mit konz. Ammoniak in Tosyl-L-glutaminyl-L-prolin übergeführt. Dieses Dipeptid wird weiter mit L-Seryl-(e-N-tosyl)-L-lysin-äthylester-chlorhydrat kondensiert (das durch Umsetzung von Carbobenzoxy-L-seryl-azid mit ε-N-Tosyl-L-lysin-äthylester und darauffolgende Abspaltung der Carbobenzoxygruppe erhalten wurde), wobei N-Tosyl-L-glutaminyl-L-prolyl-L-seryl-(e-N-tosyl)-L-lysin-äthylester erhalten wird, woraus nach Abspaltung der Äthylgruppe das Tetrapeptid IV (R² = Tosyl) gewonnen wird.

Das Tetrapeptid kann in guten Ausbeuten auch durch Kondensation des N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-prolins (erhalten durch Umsetzung vonL-Prolin mit N-Carbobenzoxy-L-pyroglutamyl-chlorid und darauffolgende Behandlung mit Ammoniak) mit L-Seryle-N-carbobenzoxy-L-lysin-methylester (erhalten durch Umsetzung des N-Trityl-L-serins mit ε-N-carbobenzoxy-L-lysin und darauffolgende Hydrolyse mit wäßriger Essigsäure) erhalten werden. Das L-Phenylälanyl -L- isoleucyl - methylesterchlorid (hergestellt durch Kondensation des Carbobenzoxy-L-phenylalanine mit L-Isoleucyl-methy lester und darauffolgende Abspaltung der Carbobenzoxygruppe des erhaltenen Dipeptide) wird mit Carbobenzoxy-L-alanin kondensiert, um Carbobenzoxy-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucin-methylester zu erhalten, der durch Abspaltung der Methylgruppe in das entsprechende Carbobenzoxy-L-alanyl-L-phenyl-alanyl-L-isoleucin übergeführt wird.
Dieses Tripeptid wird mit Glycyl-t-leucyl-L-methio-

55

60

ninamid kondensiert (erhalten durch Kondensation des Carbobenzoxyglycyl-L-leucins mit Methioninmethylester und durch Umsetzung des erhaltenen Tripeptids mit gesättigter Ammoniaklösung in Methanol, wobei das Carbobenzoxy-glycyl-L-leucyl-methioninamid erhalten wird, von dem die Carbobenzoxygruppe entfernt wurde), wobei das entsprechende Carbobenzoxy-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucylglycyl-L-leucyl-L-methioninamid entsteht, von dem durch Entfernung der Carbobenzoxygruppe das Hexapeptid(II) gewonnen wird.

Das mit Benzyl-carbobenzoxy-^-aspartat umgesetzte Hexapeptid ergibt das entsprechende Heptapeptid (JIL).

Durch Kondensation des Heptapeptids (HI) mit dem Tetrapeptid (IV) wird das entsprechende Hendekapeptid erhalten; z. B. erhält man durch Kondensation des jS-Benzyl-L-aspartyl-L-alanyl-L-phenylalany 1 r L - isoleucy 1 - gly cyl - L - leucyl -L- methioninamids mitN-Tosyl-L-glutaminyl-L-prolyl-L-seryl-(e-N-tosyl)-L-lysin das Hendekapeptid N-Tosyl-L-glutaminyl-L-propyl-L-seryl-(£-N-tosyl)-L-lysyl-(/S-benzyl)-L-aspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid.

Ein anderer Weg ist die Kondensation des N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-prolyl-L-seryl-e-N-carbobenzoxy-L-lysin-azids mit L-Aspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid, wobei das N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-prolyl-L-seryl-e-N-carbobenzoxy-L-lysyl-L-aspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid entsteht. Das Hendekapeptid(I) wird durch Entfernung der Schutzgruppen erhalten.

Das erfindungsgemäß erhaltene Hendekapeptid hat wie gesagt eine starke peripher gefäßerweiternde Wirkung, die besonders an Menschen und Hunden nachweisbar ist. Beim Hund sind Dosen von 0,001 bis 0,005 y/kg reines Polypeptid, bei intravenöser Verabreichung, wirksam; bei der Injektion in die femorale Arterie beobachtet man Gefäßerweiterungen im Gelenk des Hundes bis zu Dosen von 0,001 y. In der glatten isolierten Darmmuskulatur von Kaninchen, Hunden und Meerschweinchen ist das Polypeptid bis zu Dosen von 0,001 bis 0,002 y wirksam.

In der folgenden Tabelle sind Ergebnisse von Vergleichsversuchen zwischen Hendekapeptid und Bradykinin angebracht.

Vergleichbare Wirkungen von gefäßerweiternden Arzneimitteln auf die periphere Durchblutung

Kontrolle Hendekapeptid gemäß Erfindung
g/kg

₁₀-I2 j Q-II JQ-IO

Bradykinin, g/kg

10"

Durchblutung, m}/Min. ..
Prozentuelle Veränderung ,

40

+33

47
+ 58

62
+108

35 + 16

47 +46

Das erfindungsgemäß erhaltene Polypeptid oder seine pharmazeutisch verwendbaren Salze können in der Therapie von hypertensiven Anfällen oder jedenfalls bei dringender Behandlung von sehr schwerer Hypertension, bei krampfartigen Gefäßsyndfomen', besonders im Oberflächenmuskelb"ereich (Bürgersche Krankheit,, Reynaudsche Krankheit, Ulcera torpida usw.), der Netzhautgefäße (spastische Blindheit durch zentrale Spasmen der Netzhaut), der Hirnhautgefäße (spastische Kopfschmerzen und Migräne) und der Coronargefäße (Anginaanfälle) angewendet werden.

Das erwähnte Polypeptid kann subkutan, intramuskulär, intravenös (Injektion oder Infusion) verabreicht werden.

Die geeigneten Lösungsmittel dafür sind' Wasser oder "physiologische Salzlösung.'

Bei subkutaner oder intramuskulärer Verabreichung kann es mit absorptionsverzögernden Substanzen gemischt werden. Der Prozentgehält an aktiven Bestandteilen kann sich nach den besonderen pharmazeutischen Formen und nach der gewünschten hypotensiven' Wirkung ändern, doch ist er gewöhnlich sehr niedrig.

Beim Menschen kann die tägliche Dosis des wirksamen.Bestandteiles 0,005 bis 5 mg Betragen.

Das neue Polypeptid besitzt weder akute noch chronische Toxizitäf.

Die Ausgangsstoffe, können wie folgt hergestellt werden:

• Tosyl-L-pyroglutaminyl.-L-prolin

Eine Lösung von 5,04 g L-Prolin in 40 ml Wasser wird mit 4 g Magnesiumoxyd versetzt, und das Gemisch wird durch eine Eis-Kochsalz-Mischung abgekühlt. 12 g Tosylpyroglutamylchlorid (Coll. Cz. Chem. Comm, 19, 1954, S. 365) werden innerhalb von '20 Minuten unter kräftigem Rühren eingetragen.

Das Reaktionsgemisch, wird nochmals IV₂ Stunden bei Raumtemperatur gerührt und dann mit konzentrierter Salzsäure angesäuert. Nach 30 Minuten Stehenlassen wird der Niederschlag abfiltriert. Ausbeute 10,5 g; Fp. '= 250 bis 252° C (ausÄthanol), la\f = -80° (c = 0,5 in Äthanol). ' '

Tosyl-L-glutamyl-L-prolin

8 g Tosyl-L-pyroglutamyl-L-prolin werden in 4,0 ml konzertriertem Ammoniak gelöst, und die Mischung wird 60 Minuten sich selbst überlassen. Der Überschuß an Ammoniak wird im Vakuum entfernt, und die !unterbliebene Lösung wird mit Salzsäure angesäuert.

Das Produkt wird aus wäßrigem Äthanol umkristallisiert.

Ausbeute 7,6 g;. Fp. = 216 bis 218° C; '

[a]r ==' -18° (c = 1 in Äthanol)., '

■ Carböbenzöxy-L-seryHg-N-tosyty-L-lysinäthylester .·

Eine" Lösung von Carbobenzoxy-L-seryl-azid (aus 5,06 g Carbobenzoxy-L-seryi-hydräzid hergestellt j J.BipLChem, 146.[1942], S.463) in Äthylazetat wird rhit einer Losung von e-N-Tosyl-L'-lysin-ätiiyl· ester (aus 8,6 g Chlorhydrat hergestellt; J. Am. Chem. Sod, 78^; [1956], S. .5886) in Äthylazetat Hingesetzt. Nach 24 Stunden Stehenlassen bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch mit verdünnter Salz-

säure (1 η), Natriumbicarbonat (1 m) und Wasser ausgeschüttelt und daraufhin über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.

Das Lösungsmittel wird im Vakuum abdestilliert, wobei 8 g öliger Rückstand hinterbleiben.

L-Seryl-(£-N-tosyl)-L-lysin-äthylester-chlorhydrat

Zu einer Lösung von 8 g Carbobenzoxy-L-seryl-(E-tosyl)-L-lysin-äthylester in 100 ml Äthanol werden 2,5 g 10%iges Palladium auf Kohle gegeben, und die Mischung wird innerhalb von 4 Stunden bei Atmosphärendruck hydriert.

Der Katalysator wird abfiltriert und die Lösung auf kleines Volumen konzentriert, worauf 200 ml wasserfreier Äther hinzugefügt werden und die Lösung mit Chlorwasserstoff angesäuert wird. Das Lösungsmittel wird dekantiert, und der Rückstand wird mehrmals mit wasserfreiem Äther verrieben und schließlieh im Vakuum getrocknet.

Ausbeute 6,6 g; Fp. = 65 bis 67° C (unter Zersetzung);

[α]» = 7,5° (c = 3 in Äthanol).

N-Tosyl-L-glutamyl-L-propyl-L-seryl-(e-N-tosyl)-L-lysin-äthylester

6,4 g L-Seryl-(e-N-tosyl)-L-lysin-äthylester-chlorhydrat werden in 80 ml Acetonitril gelöst und mit 2,1 ml Triäthylamin versetzt, worauf eine Lösung von 4,7 g Tosyl-L-glutamyl-L-prolinin40 ml Dimethylformamid und 3,5 g Dizyklohexylcarbodiimid eingetragen und das Reaktionsgemisch 24 Stunden bei Raumtemperatur und unter Rühren gehalten wird. Der Dizyklohexylharnstoff wird abfiltriert; das Lösungsmittel wird im Vakuum verdampft; der Rückstand wird einige Male mit Petroläther verrieben, in 100 ml Äthylazetat gelöst, und die Lösung wird mit verdünnter Salzsäure (1 n), Natriumbicarbonat (1 m) und Wasser ausgeschüttelt. Nach Trocknen über wasserfreiem Natriumsulfat wird das Lösungsmittel im Vakuum entfernt, wobei 5,6 g klebriger Rückstand hinterbleiben.

L-Tosyl-L-glutamyl-L-propyl-L-seryl-(6-N-tosyl)-L-lysin (IV: R² = Tosyl)

Eine Lösung von 4,7 g N-Tosyl-L-glutamyl-L-propyl-L - seryl - (ε - N - tosyl) - L - lysin - äthylester in 15 ml Methanol wird mit 9 ml 2 n-Natriumhydroxyd versetzt und 30 Minuten bei Raumtemperatur stehengelassen; das Methanol wird daraufhin im Vakuum bei Raumtemperatur verdampft, der Rückstand wird mit Wasser aufgenommen und angesäuert. Das ausgefallene Produkt wird in Äthylalkohol und Äthylazetat gelöst, und die Lösung wird über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Nach Eindampfen des Lösungsmittels werden 4 g Substanz in Form von Schaum erhalten.

[a] I⁶ = 22,4° (c = 5 in Äthanol).

N-Carbobenzoxy-L-pyroglutamyl-L-prolin

Zu einer eisgekühlten Lösung von 2,5 g L-Prolin in 40 ml Wasser werden 2 g Magnesiumoxyd und feingepulvertes N - Carbobenzoxy - L - pyroglutamylchlorid (Annalen, 640, 1961, S. 151) zugegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 0° C und eine weitere bei 2O⁰C gerührt. Nach Ansäuern mit Salzsäure wird der Niederschlag abfiltriert, mit Wasser gewaschen und aus Wasser—Alkohol umkristallisiert. Ausbeute 5 g; Fp. = 177 bis 178°C; [a]² ₀ ² = -84° (c = 2 in Äthanol),
[α]» = -106° (c = 2 in 95%iger Essigsäure).

N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-prolin

4,8 g N- Carbobenzoxy -L- pyroglutamyl - L - prolin werden in 30 ml konzentriertem Ammoniak gelöst, und die Lösung wird über Nacht stehengelassen.

Der Großteil des Ammoniaks wird im Vakuum to entfernt, und die hinterbleibende Lösung wird mit Salzsäure angesäuert. Das ausgeschiedene öl wird mit Äthylazetat extrahiert, die resultierende Lösung über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird mit Petroläther verrieben und über Phosphorpentoxyd getrocknet.

Ausbeute 4,5 g des amorphen Produkts.

[α] f = -45° (c = 4 in Äthanol).

N-Trityl-L-serin-methylester

15,5 g L-Serin-chlorhydratester (HeIv. Chim. Acta, 41, 1958, S. 1858) werden in 150 ml wasserfreiem Chloroform gelöst, und zu dieser eisgekühlten Lösung werden 28 ml Triäthylamin und 27,8 g Tritylchlorid unter Rühren zugesetzt. Nach 6 Stunden bei Raumtemperatur wird die Lösung dreimal mit Wasser gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet, im Vakuum eingedampft, und der Rückstand wird aus Benzol—Petroläther umkristallisiert.

Ausbeute 29 g; Fp. = 145° C.

N-Trityl-L-serin

25 g N-Trityl-L-serin-methylester werden in einer heißen Mischung von 40 ml Äthanol und 80 ml alkoholischer 1 η-Kalilauge gelöst. Nach 1 Stunde bei Raumtemperatur wird die Lösung mit 250 ml Wasser verdünnt und mit Essigsäure unter Eiskühlung angesäuert; der Niederschlag wird abfiltriert, gewaschen und aus Methyläthylketon—Petroläther umkristallisiert.

Ausbeute 15 g; Fp. = 154 bis 157°C; [α]« = +24° (c = 3 in Äthanol).

N-Trityl-L-seryl-e-N-carbobenzoxy-L-lysinmethylester

13,1 g ε - N - Carbobenzoxy - L - lysin - methylesterchlorhydrat (HeIv. Chim Acta, 41, 1958, S. 1878) werden in 100 ml Dimethylformamid und 100 ml Acetonitril gelöst; dann werden 5,6 ml Triäthylamin, 13,2 g N-Trityl-L-serin und unter Kühlung 8,4 g Dizyklohexylcarbodiimid hinzugefügt.

Der Dizyklohexylharnstoff wird nach 20 Minuten abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum eingedampft. Der Rückstand wird in 350 ml Äthylacetat gelöst, und die Lösung wird mit ln-Salzsäure (bei 0° C), lmolarem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird das Äthylacetat abdestilliert, und der Rückstand wird zweimal aus Äthylacetat—Petroläther umkristallisiert.

Ausbeute 15 g; Fp. = 128⁰C; [a]f = -38° (c = 5 in Äthanol).

L-Seryl-8-N-carbobenzoxy-L-lysin-methylester

8,4 g N-Trityl-L-seryl-8-N-carbobenzoxy-L-lysinmethylester in 50 ml Essigsäure und 50 ml Wasser werden auf dem Wasserbad 30 Minuten erwärmt.

Dem Reaktionsgemisch werden weitere 50 ml Wasser zugegeben, und daraufhin wird auf 0°C abgekühlt.

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ίο

Nach Filtrieren wird die klare Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird wieder mit 80 ml 2%igem wäßrigem Ammoniak aufgenommen, und die Mischung wird mit Chloroform extrahiert. Die Extrakte werden über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum eingedampft, wobei ein sirupartiger Rückstand gewonnen wird.

Ausbeute 4,2 g.

Das Produkt zeigt sich einheitlich bei der Papierchromatographie.

N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-prolyl-L-seryl-ε-N-carbobenzoxy-L-lysin-methylester

In eine auf 0° C abgekühlte Lösung von 4,1 g N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-prolin und 4,2 g L - Seryl - ε - N - carbobenzoxy -L- lysin - methylester in 70 ml Methylenchlorid werden 2,5 g Dizyklohexylcarbodiimid eingetragen. Nach 16 Stunden bei 20⁰C wird die Mischung abfiltriert, und das Filtrat wird mit ■ 1 n-Salzsäure,l molarem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Die Lösung wird über Natriumsulfat getrocknet, das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert und der Rückstand aus Äthylacetat—Petroläther umkristallisiert.

Ausbeute 5 g; Fp. = 58 bis 6O⁰C; [_a]» = - 50° (c = 2 in Äthanol).

N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-prolyl-L-seryle-N-carbobenzoxy-L-lysin-hydrazid

In eine Lösung von 3 g N-Carbobenzoxy-L-glutaminyl-L-prolyl-L -seryl- ε-Ν-carbobenzoxy-L -lysinmethylester in 30 ml Methanol werden 7 ml Hydrazinhydrat eingetragen.

Die Lösung wird über Nacht bei 20° C stehengelassen und daraufhin im Vakuum zur Trockne eingedämpft. Der Rückstand wird mehrmals mit wasserfreiem Äthyläther verrieben und aus Äthanol umkristallisiert.

Ausbeute 2 g; Fp. = 163 bis 165° C; [α]» = -30° (c = 2 in Dimethylformamid).

N-Trityl-glycyl-L-leucin-methylester

In eine Lösung von 31,7 g N-Trityl-glycin (J. A. C. S., 78, 1956, S. 1359) und 15,9 g L-Leucin-methylester (HeIv. Chim. Acta, 29, 1946, S. 784) in 300 ml Tetrahydrofuran werden 22,6 g Dizyklohexylcarbodiimid eingetragen. Das Gemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt, der Dicyclohexylharnstoff dann abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Der Rückstand wird in 300 ml Äthyläcetat gelöst, und die Lösung wird mit 1 n-Salzsäure (bei 0⁰C), ln-Ammoniak und Wasser gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert.

Ausbeute 35 g eines sirüpartigen Produkts.

L-Methioninamid

Eine Lösung von 38,5 g L-Methionin-methylester (HeIv. Chim. Acta, 34,1951, S. 2091) in 250 ml wasserfreiem Methanol wird bei 5° C mit gasförmigem Ammoniak gesättigt. Nach 4 Tagen, Stehenlassen bei +5⁰C wird die Lösung im Vakuum zur Trockne eingedampft und der' Rückstand einige Male mit wasserfreiem Äthyläther verrieben.

Ausbeute 33 g; Fp. = 50 bis 51°C; ' [a] 'J = 2,0° (c = 5 in Äthanol).

N-Trityl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid

In einer Lösung von 17,2 g N-Trityl-glycyl-L-leucin und 6,0 g L-Methioninamid in 180 ml Methylenchlorid werden 8,6 g Dizyklocarbodiimid unter Kühlung eingetragen. Nach Stehenlassen über Nacht bei Raumtemperatur wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Filtrat mit 1 η-Salzsäure (bei 0⁰C), 1 molarem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert und der Rückstand aus Äthylacetat umkristallisiert.

Ausbeute 15 g; Fp. = 214 bis 216⁰C; [α]!? = -20° (c = 1,6 in Äthanol).

Glycyl-L-leucyl-L-methioninamid

Eine Lösung von 9,5 g N-Trityl-glycyl-L-leucylmethioninamid in 50 ml Essigsäure wird mit 50 ml Wasser versetzt und 30 Minuten am Wasserbad erhitzt. Nach Zufügen von weiteren 50 ml Wasser wird die Mischung auf O⁰C abgekühlt und das Triphenylcarbinol abfiltriert. Die so erhaltene klare Lösung wird im Vakuum zur Trockne konzentriert. Der Rückstand wird aus Äthanol umkristallisiert; Fp.= 134 bis 136° C.

Die wäßrige Lösung von Tripeptid-acetat wird an einer Chromatographiekolonne mit Ionenaustauscherharz »Dowex2« (eingetragene Schutzmarke) in basischer Form chromatographiert, und das Eluat wird im Vakuum zur Trockne konzentriert.

Ausbeute 4,6 g; Fp.= 156 bis 158°C; [a]I' = -50° (c = 2 in Wasser).

Beispiel

L-Glutaminyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl-L-aspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-

L-methioninamid (I)

N-Trityl-glycyl-L-leucin

35 g N-Trityl-glycyl-L-leucin-methylester werden in 90 ml lnormaler alkoholischer Kalilauge und 50 ml Äthanol erwärmt. Die Lösung wird IV₂ Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, dann mit 300 ml Wasser versetzt und filtriert. Das klare Filtrat wird abgekühlt, mit Essigsäure angesäuert, der ausgefallene Niederschlag wird abfiltriert und mit Wasser gewaschen.

Ausbeute 20 g; Fp. = 75 bis 85° C.

0,36 g L-Alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamidbromhydrat in 7 ml Dimethylformamid werden mit 0,071 ml Triäthylamin versetzt. Dann werden 0,178 g Carbobenzoxy-jö-benzylaspartat (J. Chem. Soc, 1959, S. 3870) und 0,123 g Dizyklohexylcarbodiimid hinzugefügt.

Die Lösung wird nach 2 Tagen Stehenlassen bei Raumtemperatur filtriert, auf kleines Volumen konzentriert, und das Heptapeptid wird mit Äther ausgefällt.

Ausbeute 0,5 g.

0,5 g Carbobenzoxy-ß-benzyl-L-aspartyl-L-phenylalänyl -L - isoleucyl - glycyl -L -leucyl -L -methioninamid werden in einem mit Bromwasserstoff gesättigten Gemisch von 2,8 ml Essigsäure und 1,2 ml Diäthylphosphit gelöst. Nach 15 Minuten werden 100 ml wasserfreier Äther hinzugefügt, der Niederschlag wird

mehrmals mit Äther gewaschen und schließlich im Vakuum über Kaliumhydroxyd und Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute von ß-Benzyl-L-aspartyl-L - alanyl -L - phenylalanyl -L- isoleucyl -glycyl-L - leucyl-L-methioninamidbromhydrat (R³ = Benzyl) 0,42 g. 0,42 g β - Benzyl -L- aspartyl - L - alanyl - L - phenylalanyl-L -isoleucyl - glycyl-L - leucyl-L -methioninamidbromhydrat in 4 ml Dimethylformamid werden mit 0,063 ml Triäthylamin versetzt. Zu dieser Lösung werden 0,35 g N-Tosyl-L-glutaniinyl-L-prolyl-L-seryl-(fi-N-tosyl)-L-lysin und 0,11 g Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird 2 Tage bei Raumtemperatur . sieh selbst überlassen. Nach Abfiltrieren des Dicyclohexylharnstofifes wird die Lösung auf kleines Volumen konzentriert, und das geschützte Peptid wird durch Zusatz von Äther ausgefällt. Ausbeute von N-Tosyl-L-glutaminyl-Lrprolyl-L - seryl - (e - N - tosyl) -l - lysyl -(ß- benzyl) -L- aspartyl-L - alanyl -L -phenylalanyl -L- isoleucyl -glycyl -L - leucyl-L-methioninamid (R² = Tosyl;. R³ = Benzyl) 0,68 g.

0,68 g Hendekapeptid werden in 20 ml flüssigem Ammoniak gelöst; dann werden 0,13 g metallisches Natrium unter Rühren eingetragen. Das Reaktionsgemisch wird mit 0,45 ml Essigsäure versetzt. Der Ammoniak wird abdestilliert und der Rückstand im Vakuum über Phosphorpentoxyd getrocknet. Ausbeute 0,6 g.

Das Polypeptid (I) kann auch aus den Polypeptiden, worin R² Carbobenzoxy oder Carbo-t-butoxy u. dgl. sein kann und worin R³ p-Nitrobenzyl, t-Butyl u. dgl. sein kann, gewonnen werden.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung des neuen hypotensiv wirkenden Hendekapeptides L-Glutaminyl-L - prolyl - L - seryl - L - lysyl - L - aspartyl - L - alanyl-L - phenylalanyl - L - isoleucyl - glycyl - L - leucyl-L-methiomnamid der Formel I

CH,-NH,

CH₂

CH₂-CH₂ OH CH₂

CH₂ CH₂ CH2

H₇N — CH — CO —N CH — CO —NH-CH — CO —NH-CH — CO

CONH₂
CH₂ .
CH₂

_/CH₃
CH

CO —CH-NH-CO—CH-NH-CO—CH-NH-'CO—CH-NH

/irr r^XJ /"¹TJT

ν^Γΐ2 ν-·Χχ3 \^Γ±2

QH₅ CQOH NH-CH₂-CO-NH-CH-CO-NH-CH-T-Co-NH₂

CH₂

/CH,

CH

CH₂
CH₂
S-CH₃

dadurch gekennzeichnet, daß man aus dem HexapeptidL-Alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid der Formel II

/CH₃
CH

CO-CH-NH-CO-CH-NH-Co-CH-NH₂

CH₂ CH₂

QH₅
NH-CH₂-CO-NH-CH-CO-NH-CH-CO-Nh₂

/CH,

CH

CH₂ S-CH₃ dl)

und Asparaginsäure, deren Amino- und ^-Carboxylgruppen geschützt sind, das Heptapeptid L-Aspartyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid der Formel III

/CH₃ CH

CO-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-NH-CO-CH-Nh₂

CH₂ CH₃ CH₂

QH₅ COOR³

NH-CH₂CO-—NH CH-CO-Nh-CH-CO-NH₂

CH,

/CH,

CH

CH₂
CH₂
S-CH₃

(III)

dessen Carboxylgruppe durch den Rest R³ geschützt ist, aufbaut und dieses mit dem Tetrapeptid L-Glutaminyl-L-propyl-L-seryl-L-lysin, von dem zwei Aminogruppen geschützt sind, der Formel IV

CONH,

CH₂
CH,

CH₉-CH,

CH,

OH
CH₂

CH₂-NR² CH₂
CH₂
CH₂

R²—N—CH-CO—N CH- CO — NH-CH- CO—NH-CH- COOH

(IV)

in der R² eine schützende Gruppe bedeutet, umsetzt und hierauf die schützenden Gruppen abspaltet, wobei der Schutz der Aminogruppen und der Carboxylgruppen, die Abspaltung der Schutzgruppen sowie die Kondensation der Peptide auf eine in der Peptidsynthese üblichen Weise durchgeführt werden.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, daß die Aminogruppen durch die Tosyl-, Carbobenzoxy-, Carbo-t-butoxy-, Trifluoracetyl- oder Tritylgruppe und die /J-Carboxyl-gruppe des Asparaginsäurerestes durch die Methyl-, Äthyl-, t-Butyl-, Benzyl- oder p-Nitrobenzylgruppe geschützt sind.