DE1518343A1

DE1518343A1 - Verfahren zur Herstellung eledoisinwirksamer Undekapeptide

Info

Publication number: DE1518343A1
Application number: DE19641518343
Authority: DE
Inventors: Schroeder Dr Eberhard; Luebke Dr Klaus; Hempel Dr Reinhard
Original assignee: Schering AG
Current assignee: Bayer Pharma AG
Priority date: 1964-01-09
Filing date: 1964-01-09
Publication date: 1969-12-18
Also published as: CH454161A; NL6414277A; US3268502A; GB1092682A; BE658146A

Description

Aus Speicheldrüsen von Tintenfischen (z.B. eledone moschata) konnte als blutdrucksenkende und die glatte Muskulatur stimulierende Substanz das ELEDOISIN isoliert und in seiner Struktur als Undekapeptid aufgeklärt werden (ERSPARMER und ANASTASI, Experientia ]J3, (1962) 58). Eine Bestätigung dieser Struktur erbrachte die Synthese (SANDRIN und BOISSONNAS, Experientia lj}, (I962) 59)· Auf Grund pharmakologischer Untersuchungen am Menschen kommt diesem neuen Peptidwirkstoff eine klinische und therapeutische Bedeutung als hochwirksames blutdrucksenkendes, als gefäßerweiterndes und die Atmung stimulierendes Mittel zu (SICUTERI, FANCUILLACCI, FRANCHI und MICHELACCI, Experientia 1£, (I963)

Es wurde nun gefunden, daß die bisher nicht beschriebenen

Eledoisinanaloga der allgemeinen Formel

L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl-R,-L-alanyl-L-phenyl

alanyl-Rp-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid,

in der R, für L-Glutamyl, L-Glutaminyl, L-Asparaginyl oder Glycyl und Rp für L-Isoleucyl oder L-Valyl sowie R, außerdem

für L-Asparagyl, falls R₂ L-Valyl bedeutet, steht,

überraschenderweise in Art und Stärke ihrer therapeutischen Wirksamkeit dem Eledoisin gleich, aber leichter herzustellen sind.

909851/1763 „₂-

- 2 - p. 711 vom 25/2/1969

Die Synthese der neuen Verbindungen kann nach den üblichen Methoden der Peptidkupplung, wie sie beispielsweise in der Monographie von GREENSTEIN und WINITZ "Chemistry of the Amino Acids" I.Wiley a.Sons, New York, London (I961) beschrieben sind, vorzugsweise nach der Anhydrid-, der Azid-, der Carbodiimid- oder der Aktivierte-Ester-Methode erfolgen. Dabei wird die Aminosäuresequenz vorteilhaft aus kleineren Peptideinheiten - beispielsweise wie in den Figuren 1, Seite 6, und 2, Seite 7$ dargestellt - aufgebaut} gegebenenfalls werden die an der Kondensation nicht beteiligten funktioneilen Gruppen intermediär durch z.B. reduktiv oder hydrolytisch leicht abspaltbare Reste geschützt.

Die Endprodukte selbst werden zweckmäßig durch Kupplung eines Hepta- und eines Tetrapeptids erhalten (vgl. Fig. 1,S.6). Die C-terminale Carboxylgruppe des Heptapeptids liegt dabei zunächst in Form des Methylesters vor, der zur Freisetzung der Carboxylgruppe verseift wird. Die Verseifung kann wie üblich in alkalischem Milieu erfolgen. Als besonders vorteilhaft hat sich jedoch die Freisetzung der C-terminalen Carboxylgruppen durch enzymatische Verseifung, vorzugsweise mit Chymotrypsin oder Trypsin, erwiesen.

Durch dieses hiermit erstmalig bei der Synthese von Peptiden angewandte enzymatische Verfahren wird zum einen die bei der üblichen alkalischen Verseifung notwendig eintretende Racemisierung vermieden, die sich im vorliegenden Pail besonders stark auswirken würde, da es sich bereits um ein längeres Peptid handelt, zum anderen wird - im Gegensatz zur alkalischen Verseifung- die Selektivität der Reaktion gewährleistet. 909 8 51/1783 SAD ORIGINAL

p._ZlL_v

Die anschließende Kupplung mit dem C-terminalen Tetrapeptidamid (Pig. 1,S.5) führt schließlich zu dem vollgeschützten Wirkstoff, bei dem die störenden funktioneilen Gruppen durch leicht abspaltbare Reste (die £ -Aminogruppe des Lysins durch die Carbo-tert.-butoxygruppe, die γ-Carboxylgruppe der Glutaminsäure durch die teit.-Butylgruppe) blockiert sind. Die Abspaltung der Schutzgruppen nach den üblichen Methoden ergibt schließlich das gewünschte Undekapeptid.

Die Herstellung der neuen Eledoisinanaloga bietet gegenüber der Synthese des Eledoisins beträchtliche präparative Vorteile, die mit der Wahl der ausgetauschten Aminosäuren zusammenhängen. So vermindert sich die Neigung der Zwischenprodukte zu Nebenreaktionen bei der Synthese des Glutamyl -Analogons. Z.B. neigt die Glutaminsäure weniger zur Glutarimidbildung als die originale Asparaginsäure zur Bildung von Succinimid.

Ein weiterer Vorteil liegt in dem Austausch des Isoleucinrestes in Position 8 des Eledoisins gegen Valin .oder Leucin, da reines Isoleucin wesentlich schwerer zugänglich ist als die anderen beiden Aminosäuren.

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Dosis/kg

Blutdrucksenkung in % beim Kaninchen .0,5 ng.l ng. 2 ng. 5 ng.10 ng. 20 ng.50 ng.

Anzahl

der
Versuche

rel-ative Aktivität

bezogen auf

Eledoisin Bradykinin

Glu^-Eledoisin

Asp(NH_o)⁵-Ele- ^d doisin

Asp(NH₂)⁵-Val°- Eledoisin

Gly⁵-Eledoisin

Gly⁵-Val -Eledoisin

Glu(NHp)⁵-Eledoisin

Eledoisin Bradykinin

13

10

8 16

17

20

22 24

24 28 27

13 18 17 19 25 22

18

19

31

32

29

30

37

25	30	-	38
27	30	33	38
	ohne	7	20

4
4

100 % 100 £

100 % 100 Jg

100 £ 100 %

1000 £ 1000 %

1000 £ 1000 £

1000 % 1000 £

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- 5 - P. 711 vom 25/2/1969

Alle auf diesem Wege erhaltenen Analoga zeigen in ihren Verhalten auf die glatte Muskulatur (Meerschweinchen-Ileum) und
den Blutdruck (Kaninchen) die gleiche oder praktisch die gleiche Wirkung wie das Eledoisin.

In pharmakologischer Hinsicht bietet das GIu -Analogem den
Vorteil der größeren Löslichkeit. Daher können höhere Dosen
z.B. in Gelatine als Depot-Form appliziert werden.

Das Gly-'-Analogon bietet aufgrund der bekannten geringen proteolytischen Spaltungsrate von Peptidyl-Glycin- bzw. Glycyl-Peptid-Bindung weniger Angriffspunkte für den physiologischen Abbau des Wirkstoffes.

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. 1

CO O co co «n

BOC

OtBu

[Pyroglu Pro Ser Lye J-OMe Cbo-{ GIu Ala Phe j-OMe (III) (D

BpC

QtBu

Pyroglu Pro Ser Lyaj-QH H-1GIu Ala Phe j-OMe (IV) (II)

(VIII)

	Pro	Ser	BOC	qtBu	Phe j
[pyroglu			Lys	GIu Ala
00	Pro	Ser	BOC ι	pt Bu	Phe
jPyroglu		Ly₃	GIu Ala

	Pro	Ser	B₁OC	OtBu I	Ala	Phe	lieu	GIy	Leu lletj
[Pyroglu			Ly a	GIu
(VII)	Pro	Ser			Ala	Phe	Heu	GIy	Leu liet j
\|pyro£Tlu		Lys	GIu

Ω >

cn ^ 'OO CO

< O

CO

Γ.7Π vom 25/2/1969

of

f	I
φ	Φ
A4	A4
Ala	Ala
GIy	H CS
I ο ο Al	BOC Π

*Γ

	Met
Met	Leu
Leu	GIy
GIy	φ
φ ■	H M
M	Phe
Ά A4	Ala
Ala	η¹
[GIy

Ii

ro

CS

909851/1763

• ⁸ " ?. 711 vom 25/2/1959

a. Carbobenzoxy-L-glutamyl-Y-tert.-butylester-L-alanyl-L-phenylalaninmethy!ester (I).

10,5 S Carbobenzoxy-L-glutaminsäure-y-tert.-butylester-or-hydrazid (E. Klieger und H. Gibian, Liebigs Ann.Chem. 655, I95 (1962)) werden in 39*6 ecm einer 1,5-prozentigen Lösung von Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran bei -20⁰C suspendiert und mit 3» 65 ecm tert.-Butylnitrit in 20 ecm Tetrahydrofuran versetzt. Nachdem alles in Lösung gegangen ist, wird mit 300 ecm Essigester verdünnt, bei möglichst tiefer Temperatur mit einer gesättigten NaHCO,-Lösung ausgeschüttelt und über Na₂SO^ getrocknet. Die Azidlösung wird mit einem Gemisch von 10 g L-Alanyl-L-phenylalaninmethylesterhydrochlorid und 4,9 ecm Triäthylamin in 50 ecm Dimethylformamid umgesetzt. Nach der üblichen Aufarbeitung werden 12,3 g erhalten. Schmelzpunkt 142 - l45°C (aus Essigester)·, /ö/_D = -26,6° (c=l, Methanol).

b. L-Glutamyl-Y-tert.-butylester-L-alanly-L-phenylalaninmethylester (II).

Aus 10 g der Carbobenzoxyverbindung durch katalytische Hydrierung in Gegenwart von Pd-Mohr in Methanol. Ausbeute: 7,75 gj öl. /ö/_D = -12,3° (c=l, Methanol).

c. L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl- ί -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin (IV).

15*0 g L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-i -tert.-butyloxycarbonyl -L-lysinmethylester (III) (Ed. SANDRIN und R.A. BOISSONNAS,

-9-

909851/1763 ßAD original

- 9 - P. 711 vom 25/2/1969

Experientia XVIII, 77 (19o2)) werden in möglichst wenig Wasser gelöst und mit JO ecm In KOH versetzt. Nach 3-stündigem Stehen bei Raumtemperatur wird das Gemisch über eine Dowex-50 (H -Forrn)-Säule gegeben und mit Wasser nachgewaschen. Die Lösung wurde gefriergetrocknet. Ausbeute 14,6 g. /ö/_D = -111° (c=l, V/asser).

L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-; -tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutamyl-y-tert.-butylester-L-alanyl-L-phenylalaninmethylester (V).

2 g L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin und 1,61 g Tripeptidester werden in 20 ecm Dimethylformamid gelöst und bei -15°C mit einer Lösung von 0,84 g N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid in Dimethylformamid versetzt. Nach 2 Tagen bei 0⁰C wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abgesaugt und im Vakuum eingeengt. Der Rückstand wird in Chloroform aufgenommen, wie üblich ausgeschüttelt und eingeengt. Nach Umfallen aus Äthanol/Petroläther erhält man 2,4 g. Schmelzpunkt I65 - 167⁰C. = -52,0° (c=l, Methanol).

Die gleiche Verbindung ist z.B. auch aus L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-t.-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysinhydrazid (Ed. SANDRIN und R.A. BOISSONNAS, Experientia XVIII, 77 (1962))

unter Verwendung der Azid-Methode zugänglich.

e. L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-vj-,-tert.-butyloxycarbonyl-L-

to lysyl-L-glutamyl-Y-tert.-butylester-L-alanyl-L-phenylalanin (VI)

cn 2,4 g des Methylesters (V) werden mit Chymotrypsin (molares *■** Enzym-Substrat-Verhältnis 1 : 2 000) in Dimethylformamid/

^ Acetat-Puffer (p_H 7,0 mittels Autotritator durch 0,5 η Ammoniak konstant gehalten) enzymatisch verseift. Zur Aufarbeitung wird

BAD ORIGINAL -10-

- ¹⁰ · P. ?11 vom 25/2/1QoO

die Lösung auf 60° erhitzt, vom denaturierten Enzym abgesaugt und nach dem Ansäuern mit HCl unter Kühlung die Peptidsäure in Chloroform aufgenommen. Die Lösung wird neutral gewaschen und über NapSO^i getrocknet.
Ausbeute 1,4 g /JaJ^ = -41,8° (c=l, Methanol).

f. L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-f-tert.-butyloxycarbonyl-L·- lysyl-L-glutamyl-γ-tert. -butylester-L-alanyl-L-phenylalany 1- L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-mQthioninamid (VIl).

1,36 g N-terminalen Heptapeptidsäure (VI) werden in Dimethylformamid gelöst und mit dem von Triäthylammoniumchlorid abfiltrierten Gemisch von 1,3 g L-Isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid Hydrochlorid und 0,42 ecm Triäthylamin in Dimethylformamid versetzt. Bei -15°C werden 1,03 g N.N'-Dicyclohexylcarbodiimid, ebenfalls in Dimethylformamid gelöst, zugegeben und zwei Tage bei 0° stehengelassen. Nach dem Absaugen des Dicyclohexylharnstoffes wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Zitronensäurelösung, Wasser, gesättigter NaHCO-,-Lösung und Wasser verrieben. Ausbeute 1,08 g.

g. L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-sery1-L-lysyl-L-glutamy1-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid, Glu^-Eledoisin (VIII).

In eine Lösung von 0,9 g vollgeschütztes Undekapeptid in Eisessig wird eine Stunde bei O⁰C Chlorwasserstoff eingeleitet. Nach einstündigem Stehen bei O⁰C und einer weiteren Stunde bei Raumtemperatur wird mit Äther gefällt. Ausbeute 0,75 g. Zur Reinigung

909851/1763 "^U""

BAD ORIGINAL

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wird auf einer SE-Sephadex-Säule chromatographiert (75-proz. methanolischer Collidinacetat-Puffer p„ 5·5# Gradienten-Elution 0,001 bis 0,2 molar). Die reinen Fraktionen werden mehrfach gefriergetrocknet.

Auf dem gleichen Syntheseweg sind das ASp(NH₂)-⁵-, das Asp(NHp-)⁵-Val⁸- und das GIy⁵-VaI -Eledoisin zugänglich.

Beispiel 2;

a. Carbobenzoxy-L-asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalaninmethylestcr 19*3 S Carbobenzoxy-L-asparagin-p-nitrophenylester werden in Dimethylformamid gelöst und mit L-Alanyl-L-phenylalaninmethylester (aus 17*1 g des Hydrochloride mit 8,5 ecm Triäthylamin erhalten) umgesetzt. Nach zweitägigem Stehen bei Raumtemperatur wird das Produkt abgesaugt und mit Äther gewaschen. Ausbeute 22,6 g.
Schmelzpunkt 209 - 211°C . /ö/^ » -15*1° (c=l, Eisessg).

b. L-Asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalaninmethylester.Hydrochloric 15 g der Carbobenzoxy-Verbindung werden in J»J>0 ml Methanol/ Essigsäure/ln HCl 5ϊ$ϊ1 gelöst und in Gegenwart von Pd-Mohr hydriert.
Ausbeute 10.0 g. Schmelzpunkt 168 - 172°C,

/ö/_D = -16,1° (c=l, Eisessig). u>

o. L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-.^-tert.-butyloxycarbonyl- Z^ L-lysyl-L-asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalaninmethylester -J 5»^ g L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-^-tert.-butyloxycar-

**> bonyl-L-lysin und L-Asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalaninmethylester (aus 4,0 g Hydrochlorid durch Reaktion mit

BAO 0RIG1NAU

- 12 - P. 711 vom 25/2/I969

1.4 ecm Triäthylamin erhalten) werden in Gegenwart von

2.5 g Dicyclohexylcarbodiimid zum Heptapeptid gekuppelt. Zur Entfernung der polaren Anteile wird in wäßrigem Methanol mit einem basischen und einem sauren Austauscher behandelt. Ausbeute 5g·

Die gleiche Verbindung kann auch auf folgendem Wege erhalten werden:

d. Carbobenzqxy-^-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalaninmethylester

Aus 6,1 g Carbobenzoxy-o-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin werden in üblicher Weise mit 2,2 ecm Triäthylamin und 1,6 ecm Chlorameisensäureäthylester in Tetrahydrofuran das gemischte Anhydrid hergestellt und dieses mit einem Gemisch von 1,0 g L-Asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalaninmethylester.Hydrochlorid und 2,5 ecm Triäthylamin in Dimethylformamid umgesetzt. Nach üblicher Aufarbeitung werden 9*2 g erhalten. Schmelzpunkt 208 - 210⁰C. /JaJ^ = -9,0° (c=l, Eisessig).

e. Carbobenzoxy-L-prolyl -L-seryl -^. -t ert. -bu tyloxycarbonyl -L-asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalaninmethylester 7*3 g der Carbobenzoxyverbindung aus Beispiel 2d) werden in 130 ecm Dimethylformamid in Gegenwart von Pd-Mohr hydriert und die Lösung nach dem Abfiltrieren vom Katalysator mit Carbobenzoxy-L-prolyl-L-serinazid (aus 2,7 g Hydrazid durch Umsetzung in 20 ecm einer 1,5 η Lösung von Chlorwasserstoff in Tetrahydrofuran mit 1,4 ecm tert.-Butylnitrit) umgesetzt. Ausbeute 6,5 g. Schmelzpunkt 199 - 201°C.

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f. L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-r-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-aspara.-rii-iyl-L-alanyl-L-pIumylalaninmethylester Die im Beispiel 2e) erhaltene Verbindung wird wie oben beschrieben katalytisch hydriert und mit Carbobenzoxy-L-pyroglutaminsäure-p-nitrophenylester umgesetzt. Nach erneuter Hydrierung resultiert ein Produkt, das mit dem nach Beispiel 2c) erhaltenen identisch ist.

g. L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-c-tert.-butyloxyoarbonyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalanin Aus dem Methylester (Beispiele 2c) und 2f)) durch enzymatische Verseifung wie im Beispiel Ie) beschrieben. Zur Aufarbeitung wird das Enzym durch kurzes Erwärmen denaturiert, abgesaugt und die Lösung gefriergetrocknet. Ausbeute 90 %.

h. L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl-L-asparaginyl-L- alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamld

885 mg L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-6-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalanin werden mit 69O mg L-Isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid nach der Carbodiimid-Methode in Dimethylformamid umgesetzt. Nach zweitägigem Stehen bei 0°C und weiteren zwei Tagen bei Raumtemperatur wird vom ausgefallenen Dicyclohexylharn-

co stoff abgesaugt, eingeengt und das so erhaltene Rohprodukt ο

<g mit 10^-iger Zitronensäurelösung, Wasser,gesättigter NaHCO,- ^2 Lösung und Wasser ausgewaschen. Ausbeute 65O mg. 2^ Schmelzpunkt 207 - 209°C.

σ> Zur Abspaltung der £.-tert.-Bu tyloxycarbonyl-Gruppe des co

Lysins werden I80 mg in 5 ecm Trifluoressigsäure gelöst

BAD ORIGINAL' ~^l4~

und 45 Minuten boI Raumtemperatur aufbewahrt. Nach dem Fällen r.it Xther wird das Produkt über eine SE-Sephadex-Säule(Ammonacetat-Gradient P₁₁ 5,5, 0,001 bis 0,2 molar) chromatographiert.

Beispiel 3s L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-alanyl-

L-phenylalanyl-L-valyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid

Auf analogem Wege aus L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-£-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalanin und L-Valyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid erhalten.

Beispiel 4;

a) Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-L-alanyl-L-phenylalaninmethy!ester 17*5 g Tert.-Butyloxycarbonyl-glycin werden bei -15° in 150 ecm Dimethylformamid mit 14 ecm Triäthylamin und 10 ecm Chlorameisensäureäthylester in das gemischte Anhydrid überführt und mit einer Lösung von ]51,5 g H-L-Alanyl-L-phenylalaninmethylester.Hydrochlorid und 15*4 ecm Triäthylamin in I50 ecm Dimethylformamid umgesetzt. Nach der üblichen Aufarbeitung werden 31*5 g (77 % ) erhalten. Schmalzpunkt 106 - 108°; /q/_D * -24,6° (c=l, Methanol).

^b) Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-L-alanyl-L-phenylalaninhydrazid Aus dem Methylester durch Umsetzung mit der vierfachen Menge Hydrazinhydrat in Methanol. Ausbeute 89 %. Schmelzpunkt 177 - 183⁰; /a/_D « -27,7° (c-1, Eisessig).

coc) Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isleucyl-"* glyoyl-L-leuQyl-L-methioninamid

I^ 1,22 g tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-L-alanyl-L-phenylalaninhydra-

^m ο

w zid werden bei -20 in 3*6 ecm einer 2,2n Lösung von Chlorwasser- stoff in Tetrahydrofuran suspendiert und mit 0,37 ecm tert.-

BAD ORIGINAL - "

P.

Butylnitrit in das Azid überführt. Nach dem Versetzen mit 40 ecm kaltem Essigester wird mit einer gesättigten NaHCO-,-Lösung gewaschen und über NapSO^ getrocknet. Diese Azid-Lösung wird mit einem Gemisch von 1,4 g L-Isoleucylglycyl-L-leucyl-L-methioninamid.Hydrochlorid und 0,42 ecm Triethylamin in 15 ecm Dimethylformamid umgesetzt. Nach dem Einengen wird mit lOprozentiger Zitronensäurelösung, Wasser, NaHCO,-Lösung und Wasser gewaschen und getrocknet. Ausbeute 2,16 g (89 #). Schmelzpunkt 252 - 255°j /ö/_D = -27,0° (c=l, Dimethylformamid).

d) H-Glycyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-irethionlnamid. Hydrochlorid .1,5 H^O Aus 2 g tert.-Butyloxycarbonylverbindung werden durch Schutzgruppenabspaltung mit Chlorwasserstoff in Eisessig in der wie oben beschriebenen Weise 1,6 g (88 %) erhalten. Schmelzpunkt 240 - 260°; /aJ_D = -45,8°( c=l, Eisessig).

e) L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl-glycyl-L-alanyl-L-phenyl-alanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid 1,6 g des Heptapeptids nach Beispiel 4a) werden in Dimethylformamid mit 0,3 ecm Triäthylamin versetzt und nach dem Abfiltrieren des Triäthylammoniumchlorids mit 1,2 g L-Pyroglutamyl -L-prolyl-L-seryl-6-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin und 4,4 g Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Nach 3-tägigem

co ο

ο Stehen bei 0 wird nach Zerstörung des überschüssigen

oo Carbodiimids mit wenig 2n Essigsäure vom ausgefallenen cn

^ Dicyclohexylharnstoff abgesaugt, das Piltrat eingeengt und H in üblicher Weise mit lOprozentiger Zitronensäurelösung,Wasser, to gesättigter NaHCO,-Lösung und Wasser verrieben und getrockno·,

BAD ORIGINAL

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Ausbeute 1,8 g, Schmelzpunkt 223 - 225°. Durch übliche Schutzgruppenabspaltung mit Trifluoressigsäure und Reinigung durch Chromatographie an SE-Sephadex wie unter Ig) beschrieben, wird das Gly^-Eledoisin erhalten.

Beispiel 5'·

Das Gly^-Eledoisin wird entsprechend dem Syntheseweg Fig. 1 analog Beispiele 1-3 auch aus Glycyl-L-alanyl-L-phenyl-alaninmefchylesterhydrochlorid (aus der tert.-Butyloxycarbonyl-Verbindung Beispiel ha.) durch Schutzgruppenabspaltung zugänglich, Schmelzpunkt 206 - 210° ßkJ·^ --13*5° (c=l, Methanol)), Umsetzung mit L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-i-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin nach der Carbodiimid-Methode, enzymatische Verseifung des Reaktionsproduktes und erneute Carbodiimidkupplung mit L-Isoleucylglycyl-L-leucyl-L-methioninamid erhalten.

Beispiel 6;

L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl-L-glutaminyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid Analog Beispiel 4e werden 0.9 g L-Glutaminyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucy1-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid in Dimethylformamid gelöst und mit 0.6 g L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-6-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin in Gegenwart von 2.0 g Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Nach der üblichen Aufarbeitung wird das Rohprodukt (Schmelzpunkt 230 - 250⁰C, Zersetzung) zur Schutzgruppenabspaltung in Trifluoressigsäure gelöst, nach 30 Minuten mit Äther gefällt und wie oben beschrieben durch Chromatographie gereinigt. Schmelzpunkt

225 - 237°C, Zersetzung.

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Beispiel 7;

GIu(NH₂) -Eledoisin (vgl. Beispiel 6) ist ebenfalls analog
der GIu -Verbindung (Beispiel 1) aus L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-i-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-glutam1ryl-L-alanyl-L-phenylalanin-methylester (Schmelzpunkt 182-188⁰C), enzymatischer Verseifung und Kupplung mit L-Isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid nach der Carbodiimidmethode zugänglich.

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Claims

in der R₁ einen L-Glutaminyl-, L-Glutamyl-, L-Asparaginyl· oder Glycyl-, R₂ einen L-Isoleucyl-, oder L-Valylrest bedeutet, R, außerdem auch den Asparagylrest, falls R₂ für den Valylrest steht,
dadurch gekennzeichnet, daß man

a) L-Pyroglutaminsäure, L-Prolin, L-Serin, L-Lysin, L-Glutaminsäure bzw. L-Glutamin bzw. L-Asparagin bzw. Glycin bzw. auch Asparaginsäure, wenn R₂ für L-Valyl steht, L-Alanin und L-Phenylalanin in dieser Reihenfolge nach an sich bekannten Methoden kondensiert, vorzugsweise indem man reaktionsfähige Derivate der genannten Aminosäuren, in denen die nicht an der Reaktion beteiligten funktionellen Gruppen zweckmäßig während der Reaktion geschützt sind, zum Heptapeptid umsetzt, worauf man die C-terminale Carbomethoxygruppe des Heptapeptids enzymatisch verseift und das Heptapeptid mit dem nach an sich bekannten Methoden gewonnenen Tetrapeptid H.R₂-glycyl-L-leucyl-L-Methioninamid, wobei R₂ die oben angegebene Bedeutung hat, kuppelt, oder daß man

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b) L-Pyroglutaminsäure, L-Prolin, L-Serin, L-Lysin, L-Glutaminsäure bzw. L-Glutamin bzw. L-Asparagin bzw. Glycin bzw. auch Asparaginsäure, wenn Ro für L-Vaiyl steht, L-Alanin, L-Phenylalanin, L-Isoleucin bzw. L-Valin, Glycin, L-Leucin und L-Methioninamid in dieser Reihenfolge nach an sich bekannten Methoden kondensiert, vorzugsweise indem man reaktionsfähige Derivate der genannten Aminosäuren, in denen die nicht an der Reaktion beteiligten funktioneilen Gruppen zweckmäßig während der Reaktion geschützt sind, miteinander umsetzt

und endlich die Schutzgruppen abspaltet.

2.Verfahren nach Anspruch la), dadurch gekennzeichnet, daß als Enzym ein proteolytisches Enzym, vorzugsweise Chymotrypsin oder Trypsin, verwendet wird.

5.Verbindungen der allgemeinen Formel

L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl-R^-L-alanyl-L-pheny1-alanyl-Rg-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid,

in der R₁ einen L-Glutaminyl-, L-Glutamyl-, L-Asparaginyl- oder Glycyl-, R₂ einen L-Isoleucyl- oder L-Valylrest bedeutet, R, außerdem auch den L-Asparagylrest, falls für den L-Leucyl- oder L-Valylrest steht.

4. Glu⁵-Eledoisin

5. Asp (NH₂)⁵-Eledoisin

6. Asp (NH₂)⁵-Val⁸-Eledoisin

7. Gly⁵-Eledoisin 909851/1763

ς 8 BAD ORIQ¹NAL

8. Gly^-Väl^Eledoisin öau