AT271745B

AT271745B - Verfahren zur Herstellung von neuen Peptiden

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Publication number: AT271745B
Application number: AT1365A
Authority: AT
Original assignee: Schering Ag
Priority date: 1964-01-09
Filing date: 1965-01-04
Publication date: 1969-06-10

Description


   <Desc/Clms Page number 1> 
 



  Verfahren zur Herstellung von neuen Peptiden 
Aus Speicheldrüsen von Tintenfischen   (z. B.   eledone moschata) konnte als blutdrucksenkende und die glatte Muskulatur stimulierende Substanz das Eledoisin isoliert und in seiner Struktur als Undecapeptid aufgeklärt werden (ERSPARMER und ANASTASI, Experientia Bd. 18   [1962],   S. 58). Eine Bestätigung dieser Struktur erbrachte die Synthese   (SANDRIN   und BOISSONNAS, Experientia Bd. 18   [1962],   S. 59). Auf Grund pharmakologischer Untersuchungen am Menschen kommt diesem neuen Peptidwirkstoff eine klinische und therapeutische Bedeutung als hochwirksames blutdrucksenkendes, als gefässerweiterndes und die Atmung stimulierendes Mittel zu (SICUTERI, FANCUILLACCI, FRANCHI und MICHELACCI,   Experientia Bd. 19 [1963], S. 44).   



   Es wurde nun gefunden, dass die bisher nicht beschriebenen Eledoisinanaloga der allgemeinen Formel 
 EMI1.1 
 in der   R   einen L-Glutaminyl-, L-Glutamyl-,   L-Asparaginyl- oder   Glycyl-, Rz einen L-Isoleucyl-,   L-Leucyl-oder   L-Valylrest bedeuten,   R   ausserdem auch den Asparagylrest, falls Ru für den Leucyloder Valylrest steht, überraschenderweise in Art und Stärke ihrer therapeutischen Wirksamkeit dem Eledoisin gleich, aber leichter herzustellen sind. 



   Die Synthese der neuen Verbindungen erfolgt gemäss der Erfindung dadurch, dass man aus Verbindungen der allgemeinen Formel 
 EMI1.2 
 gruppe   geschützten Asparaginyl-bzw. Glutaminylrest   oder, falls   Rz   für den Leucyl- oder Valylrest steht, auch den Asparagylrest bedeutetn, die Schutzgruppen auf an sich bekannte Weise entfernt. 



   Beispiele für geeignete Schutzgruppen und Mittel zu ihrer Entfernung sind in der nachstehenden Zusammenstellung autgeführt : 

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 EMI2.1 
 
<tb> 
<tb> 1. <SEP> Aminoschutzgruppen
<tb> Schutzgruppe <SEP> Mittel <SEP> zur <SEP> Abspaltung
<tb> Carbo-tertiär-butoxy, <SEP> Säuren, <SEP> insbesondere <SEP> Trifluoressigsäure <SEP> und
<tb> p-Methoxy-carbobenzoxy <SEP> HCI <SEP> in <SEP> Essigester <SEP> oder <SEP> Eisessig
<tb> Carbobenzoxy <SEP> HBr <SEP> in <SEP> Eisessig, <SEP> katalytische <SEP> Hydrierung
<tb> Phthalyl <SEP> Hydrazin
<tb> Tosyl <SEP> Na <SEP> in <SEP> flüssigem <SEP> Ammoniak
<tb> Trityl <SEP> Säuren
<tb> 2.

   <SEP> COOH-Schutzgruppen
<tb> Schutzgruppe <SEP> Mittel <SEP> zur <SEP> Abspaltung
<tb> Methyl, <SEP> Äthyl <SEP> alkalische <SEP> Verseifung
<tb> Benzyl <SEP> alkalische <SEP> Verseifung, <SEP> Hydrierung, <SEP> HBr
<tb> in <SEP> Eisessig
<tb> tertiär-Butyl <SEP> Säuren, <SEP> insbesondere <SEP> Trifluoressigsäure <SEP> und
<tb> HCI <SEP> in <SEP> Essigester
<tb> 
 
DieSynthese der   geschützten Undecapeptide   kann nach den üblichen Methoden der Peptidkupplung, wie   siebeispielsweise inderMonographievonGREENSTEIN undWINITZ"Chemistry   of the Amino Acids"   I. Wiley   and Sons,   New York/London [1961]. beschrieben   sind, vorzugsweise nach der Anhydrid-, der Azid-, der Carbodiimid- oder der Aktivierte-Ester-Methode erfolgen.

   Dabei wird die Aminosäuresequenz vorteilhaft aus   kleinerenPeptideinheiten-beispielsweise wie in   den nachstehenden Schemata 1 und 2 dargestellt-aufgebaut ; gegebenenfalls werden die an der Kondensation nicht beteiligten funktionellen Gruppen intermediär durch z. B. reduktiv oder hydrolytisch leicht abspaltbare Reste geschützt. 



   Das geschützte Undecapeptid wird zweckmässig aus einem geschützten Heptapeptid der Formel 
 EMI2.2 
 worin   R   die oben angegebene Bedeutung besitzt, nach den Methoden der Peptidchemie zusammengesetzt   (vgl. Schema 1). Die C-terminaleCarboxylgruppe   des Heptapeptids liegt dabei zunächst in Form des Methylesters vor, der zur Freisetzung der Carboxylgruppe verseift wird. Die Verseifung kann wie üblich in alkalischem Milieu erfolgen. Als besonders vorteilhaft hat sich jedoch die Freisetzung der C-terminalen Carboxylgruppen durch enzymatische Verseifung, vorzugsweise mit Chymotrypsin oder Trypsin, erwiesen. 



   Durch dieses hiemit erstmalig bei der Synthese von Peptiden angewendete enzymatische Verfahren wird erstens die bei der üblichen alkalischen Verseifung notwendig eintretende Racemisierung vermieden, die sich im vorliegenden Fall besonders stark auswirken würde, da es sich bereits um ein längeres Peptid handelt, und zweitens wird-im Gegensatz zur alkalischen   Verseifung - die Selektivität   der Reaktion gewährleistet. 



   Die anschliessende Kupplung mit dem C-terminalen Tetrapeptidamid (Schema   1)   führt schliesslich zu dem vollgeschützten Wirkstoff, bei dem die störenden funktionellen Gruppen durch leicht abspalt- 

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 bare Reste (die c-Aminogruppe des Lysins durch die Carbo-tert. -butoxygruppe, die y-Carboxylgruppe der Glutaminsäure durch die tert.-Butylgruppe) blockiert sind. Die Abspaltung der Schutzgruppen nach den üblichen Methoden ergibt schliesslich das gewünschte Undecapeptid. 



   Die Herstellung der neuen   Eledoisinanaloga bietet gegenüber der Synthese des Eledoisins beträcht-   liche präparative Vorteile, die mit der Wahl der ausgetauschten Aminosäuren zusammenhängen. So vermindert sich die Neigung der Zwischenprodukte zu Nebenreaktionen bei der Synthese des Glutamyl5Analogons. Beispielsweise neigt die Glutaminsäure weniger zur Glutarimidbildung als die originale Asparaginsäure zur Bildung von Succinimid. 



   Ein weiterer Vorteil liegt im Austausch des Isoleucinrestes in Position 8 des Eledoisins gegen Valin oder Leucin, da reines Isoleucin wesentlich schwerer zugänglich ist als die andern beiden Aminosäuren. 



  Tabelle 
 EMI3.1 
 
<tb> 
<tb> Dosis <SEP> Blutdrucksenkung <SEP> in <SEP> Prozenten <SEP> beim <SEP> Anzahl <SEP> Relative <SEP> Aktivität,
<tb> Kilogramm <SEP> Kaninchen <SEP> der <SEP> bezogen <SEP> auf
<tb> Ver-
<tb> 0,5 <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 5 <SEP> 10 <SEP> 20 <SEP> 50 <SEP> suche <SEP> Eledoisin <SEP> Bradykinin
<tb> ng. <SEP> ng. <SEP> ng. <SEP> ng. <SEP> ng. <SEP> ng. <SEP> ng. <SEP> 
<tb> 



  Glu <SEP> 5-Eledoisin <SEP> 13 <SEP> 17 <SEP> 22 <SEP> 24 <SEP> 29 <SEP> 32 <SEP> 37 <SEP> 3 <SEP> 1000/0 <SEP> 10000/0
<tb> Asp <SEP> (NH <SEP> 2) <SEP> 5 <SEP> - <SEP> 
<tb> Eledoisin <SEP> 10 <SEP> 24 <SEP> 28 <SEP> 27 <SEP> 31 <SEP> 32 <SEP> 38 <SEP> 5 <SEP> 1000/0 <SEP> 1000%
<tb> Asp <SEP> (NHVal"Eledoisin <SEP> 8 <SEP> 13 <SEP> 18 <SEP> 17 <SEP> 27 <SEP> 29 <SEP> 33 <SEP> 4 <SEP> 100% <SEP> 1000%
<tb> Gly-Eledoisin <SEP> 16 <SEP> 19 <SEP> 25 <SEP> 22 <SEP> 25 <SEP> 30 <SEP> 35 <SEP> 4 <SEP> 100% <SEP> 1000%
<tb> Gly5-Leu8Eledoisin----ohne <SEP> 2 <SEP> 12 <SEP> 4 <SEP> 100 <SEP> 100%
<tb> Leu-Eledoisin----ohne <SEP> 8 <SEP> 14 <SEP> 3 <SEP> 100/0 <SEP> 100%
<tb> a)
<tb> Eledoisin <SEP> 3 <SEP> 8 <SEP> 19 <SEP> 27 <SEP> 30 <SEP> 33 <SEP> 38
<tb> b)

  
<tb> Bradykinin----ohne <SEP> 7 <SEP> 20
<tb> 
 
Alle auf diesem Wege erhaltenen Analoga zeigen in ihrem Verhalten auf die glatte Muskulatur (Meerschweinchen-Ileum) und den Blutdruck (Kaninchen) die gleiche oder praktisch die gleiche Wirkung wie das Eledoisin. Lediglich die   Leus-Analoga   zeigen eine etwas geringere Aktivität, die aber immer noch in der gleichen Grössenordnung liegt wie   z. B.   die Wirkung des Bradykinins   (vgl. Tabelle).   



   In pharmakologischer Hinsicht bietet das Glus-Analogon den Vorteil der grösseren Löslichkeit. Daher können höhere Dosen z. B. in Gelatine als Depotform appliziert werden. 



   Das   Gly-Analogon   bietet auf Grund der bekannten geringen proteolytischen Spaltungsrate von Peptidyl-Glycin- bzw. Glycyl-Peptid-Bindung weniger Angriffspunkte für den physiologischen Abbau des Wirkstoffes. 

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  Schema 1 
 EMI4.1 
 

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 Schema 2 
 EMI5.1 
 

 <Desc/Clms Page number 6> 

    H-Heu Gly Leu Met-NHBeispiel l :   a)   Carbobenzoxy-L-glutamyl-&gamma;-tert.-butylester-L-alanyl-L-phenylalaninmethyl-   ester (I). 



     10, 5   g   Carbobenzoxy-L-glutaminsäure-y-tert.-butylester-ct-hydrazid   (B. Klieger und H. Pcibian, Liebigs Ann. Chem. Bd. 655 [1962], S. 195) werden in 39,6 cm3 einer 1,5%igen Lösung von Chlorwas- 
 EMI6.1 
 arbeitung werden   12, 3 g erhalten. F. =   142 bis 1450C (aus   Essigester); [&alpha;]D=-26,6 (c=1,Methanol).   b)   L-Glutamyl-&gamma;-tert.-butylester-I,-alanyl-L-phenylalaninmethylester (II).   



   Die in der Überschrift angegebene Verbindung erhält man aus 10 g der Carbobenzoxyverbindung durch katalytische Hydrierung in Gegenwart von Pd-Mohr in Methanol. 



   Ausbeute = 7,75   g ; Öl. [cJD =-12, 30 (c   = 1, Methanol). 
 EMI6.2 
 Sandrin und R. A. Boissonnas, Experientia XVIII [1962], S. 77) werden in möglichst wenig Wasser gelöst und mit 30 cm3 1n-KOH versetzt. Nach dreistündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird das Gemisch über eine Dowex-50   (H+-Form)-Säule   gegeben und mit Wasser nachgewaschen.   Die Lösung   wurde gefriergetrocknet. 
 EMI6.3 
 

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   Auf dem gleichensyntheseweg sind das Asp(NH2)5-und das Asp(NH2)5-Va;8-Eledoisin zugänglich:   Beispiel 2 :   a) Carbobenzoxy-L-asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalaninmethylester. 



   19,3 g Carbobenzoxy-L-asparagin-p-nitrophenylester werden in Dimethylformamid gelöst und mit L-Alanyl-L-phenylalaninmethylester (aus 17, 1 g des Hydrochlorids mit 8,5   cm3   Triäthylamin erhalten) umgesetzt. Nach zweitägigem Stehen beiRaumtemperatur wird das Produkt abgesaugt und mit Äther gewaschen. 



   Ausbeute = 22,6 g. F. = 209 bis   211 C.     [cp     = -15, 10   (c = 1, Eisessig). b) L-Asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalaninmethylester-hydrochlorid. 



   15 g   derCarbobenzoxyverbindung   werden in 330 ml   Methanol/Essigsäure/1n-HCI   5 : 5 : 1 gelöst und in Gegenwart von Pd-Mohr hydriert. 



   Ausbeute = 10,0 g. F. = 168 bis 1720C. [a]D = 16, 10 (c = 1, Eisessig). c)   L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-e-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-alanyl-L-   - phenylalaninmethylester. 



   5,   4 g L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin   und L-Asparaginyl-L- - alanyl-L-phenylalaninmethylester (aus 4, 0 g Hydrochlorid durch Reaktion mit   1, 4 cm3   Triäthylamin erhalten) werden in Gegenwart von 2,5 g Dicyclohexylcarbodiimid zum Heptapeptid gekuppelt. Zur Entfernung der polaren Anteile wird   in wässerigem Methanol   mit einem basischen und einem sauren Austauscher behandelt. 



   Ausbeute = 5 g. 



   Die gleiche Verbindung kann auch auf folgendem Wege erhalten werden : 
 EMI7.1 
 
 EMI7.2 
 
E-tert. - butyloxycarbonyl- L -lysinninmethylester. 



   7, 3 g der Carbobenzoxyverbindung aus Beispiel 2 d) werden in 130   cm3   Dimethylformamid in Gegenwart von Pd-Mohr hydriert und die Lösung nach demAbfiltrieren vomKatalysator mitCarbobenzoxy- - L-prolyl-L-serinazid (aus 2, 7 g Hydrazid durch Umsetzung in 20 cm3 einer   1, 5n-LösungvonChlorwas-   serstoff in Tetrahydrofuran mit 1,4 cm3 tert.-Butylnitrit) umgesetzt. 



   Ausbeute = 6, 5 g. F. = 199 bis   2010C.     cl) L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-e-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-alanyl-L-   - phenylalaninmethylester. 



   Die gemäss b) erhaltene Verbindung wird wie oben beschrieben katalytisch hydriert und mit Carbobenzoxy-L-pyroglutaminsäure-p-nitrophenylester umgesetzt. Nach erneuter Hydrierung resultiert ein Produkt, das mit dem nach b) erhaltenen identisch ist. d)   L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-alanyl-L-   - phenylalanin. 



   Aus dem Methylester c) und   c')   durch enzymatische Verseifung wie in 1 e) beschrieben. Zur Aufarbeitung wird das Enzym durch kurzes Erwärmen denaturiert, abgesaugt und die Lösung gefriergetrocknet. 



   Ausbeute = 90%. 
 EMI7.3 
 ser ausgewaschen. 



   Ausbeute   =     65o   mg. F. = 207 bis   2090C.   



   Zur Abspaltung der   e-tert.-Butyloxycarbonylgruppe   des Lysins werden 180 mg in 3 cm3 Trifluoressigsäure gelöst und 45 min bei Raumtemperatur stehen gelassen. Nach dem Fällen mit Äther wird das Produkt über eine SE-Sephex-Säule (Ammonacetat-Gradient PH   5, 5, 0, 001- bis 0, 2-molar) chroma-   tographiert. 

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 EMI8.1 
 
3 : L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl-L-asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalanyl--asparaginyl-L-alanyl-L-phenylalanin und L-Valyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid erhalten. 



   Beispiel 4 : Auf analogem Wege, ausgehend von Carbobenzoxy-L-asparagyl-ss-tert,-butylester- 
 EMI8.2 
 halten werden. Nach enzymatischer Verseifung, Kupplung mit L-Leucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid und üblicher Schutzgruppenabspaltung und Reinigung resultierte das Leu8-Eledoisin. 



   Beispiel 5 : a) Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-L-alanyl-L-phenylalanin-methylester. 
 EMI8.3 
 



  Aus dem Methylester durch Umsetzung mit der vierfachen Menge Hydrazinhydrat in Methanol. 



  Ausbeute = 89%. F. = 177 bis 183 C,   Mp     = -27, 70 (e   = 1, Eisessig). c) Tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-L-alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-me- thioninamid. 
 EMI8.4 
 3,6 cm3 einer 2,2n-Lösung   vonchlorwasserstoff inTetrahydrofuran   suspendiert und mit 0,37 cm3 tert.- -Butylnitrit in das Azid überführt. Nach dem Versetzen mit 40 cm3 kaltem Essigester wird mit einer gesättigten NaHCOs-Lösung gewaschen und über   Na. S04   getrocknet. Diese Azidlösung wird mit einem   Gemischvon 1, 4   g L-Isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid-hydrochlorid und   0, 42 cm3   Triäthylamin in 15 cm3 Dimethylformamid umgesetzt.

   Nach dem Einengen wird mit   10% tiger   Citronensäurelösung, Wasser,   NaHC03 -Lösung   und Eiswasser gewaschen und getrocknet. 



   Ausbeute = 2,16 g (89%). F. = 252 bis 255 C,   Mp     = -27, 00 (c : = 1,   Dimethylformamid). d) H-Glycyl-L- alanyl-L-phenylalanyl-L-isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid-hydrochlo-   rid#1,5 H2O.   



   Aus 2 g der. tert.-Butyloxycarbonylverbindung werden durch Schutzgruppenabspaltung mit Chlorwasserstoff in Eisessig in der wie oben beschriebenen Weise 1, 6 g   (880 ; 0)   erhalten. F. = 240 bis 260 C,   [&alpha;]D=-45,8 (c   =   l,   Eisessig). e) L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl-glycyl-L-alanyl-L-phenylanyl-L-isoleucyl-glycyl- -L-leucyl-L-methioninamid. 



   1,6 g des Heptapeptids nach a) werden in Dimethylformamid mit 0,3   cm3   Triäthylamin versetzt und nach dem Abfiltrieren des Triäthylammoniumchlorids mit 1, 2 g L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl- - e-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin und 4, 4 g Dicyclohexylcarbodiimid umgesetzt. Nach dreitägigem Stehen bei 0 C wird nach Zerstörung des überschüssigen Carbodiimids mit wenig 2n-Essigsäure vom ausgefallenen Dicyclohexylharnstoff abgesaugt, das Filtrat eingeengt und in üblicher Weise mit   10% tiger   Citronensäurelösung, Wasser, gesättigter NaHCO3-Lösung und Wasser verrieben und getrocknet. 



   Ausbeute = 1, 8 g. F. = 223 bis 225 C. 



   Durch übliche Schutzgruppenabspaltung mit Trifluoressigsäure und Reinigung durch Chromatographie an SE-Sephadex (wie unter 1 g beschrieben) wird das Gly5-Eledoisin erhalten. 



     Beispiel 6 :   Auf analogem Wege ist aus tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-L-alanyl-L-phenylalanyl- -   L-leucyl-L-glycyl-I@leucyl-L-methionina mid [durch   Reaktion von   tert.-Butyloxycarbonyl-glycyl-L-     - alanyl-L-phenylalaninhydrazid   und H-L-Leucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid erhalten, F.   = 227   bis 229 C,   [aJD   =-32,6  (c =1, Dimethylformamid)]. Schutzgruppenabspaltung und Kupplung mit L- 
 EMI8.5 
 

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    7 :- seryl-E-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysin   nach der Carbodiimidmethode, enzymatische Verseifung des Reaktionsproduktes und erneute Carbodiimidkupplung mit L-Isoleucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid bzw. L-Leucyl-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid erhalten. 



    PATENTANSPRÜCHE :    
1. Verfahren zur Herstellung von neuen Peptiden der allgemeinen Formel 
 EMI9.1 
 in der Rl einen L-Glutaminyl-, L-Glutamyl-,   L-Asparaginyl- oder   Glycyl-,   Rz   einen L-Isoleucyl-, L-Leucyl- oder L-Valylrest bedeuten, Ri ausserdem auch den Asparagylrest, falls Ra für den Leucyloder Valylrest steht, dadurch gekennzeichnet, dass man aus Verbindungen der allgemeinen Formel 
L-Pyroglutamyl-L-prolyl-L-seryl-L-lysyl (A)-X1-L-alanyl- - L-phenylalanyl-R2-glycyl-L-leucyl-L-methioninamid, worin A eine ct-Aminoschutzgruppe,   X 1   den Glycyl-, L-Glutamyl-oder den an der freien Carboxylgruppe   geschütztenasparaginyl-bzw, Glutaminylrest   oder, falls   Rj   für den Leucyl- oder Valylrest steht, auch den Asparagylrest bedeuten,

   die Schutzgruppen auf an sich bekannte Weise entfernt. 
 EMI9.2

Claims

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass man das geschützte Heptapeptid aus dem am C-terminalen Ende mit Methanol veresterten geschützten Heptapeptid durch Verseifung, vorzugsweise mit Hilfe eines Enzyms, wie Chymotrypsin oder Trypsin, herstellt.