DE2751026A1 - Verfahren zur herstellung von peptiden, die tyrosinsulfat enthalten - Google Patents

Description

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die aus 6-20 Aminosäureresten bestehen, insbesondere von Pankreozyminpeptiden, für deren biologische Wirksamkeit ein Tyrosinrest mit Schwefelsäure verestert vorliegen muß, sowie ihrer pharmazeutisch anwendbaren Salze. Das Gastrointestinalhormon Cholecystokinin/Pankreozymin (im weiteren als PZ bezeichnet), sein C-terminales Hepta- und Oktapeptid und Caerulein, ein Dekapeptid ähnlicher Sequenz aus der Haut des Frosches Hyla caerulae, haben die Fähigkeit, die Gallenblase zu kontrahieren, den Gallengang zu relaxieren, die Enzymausschüttung des exokrinen Pankreas zu stimulieren und die Darmpassage zu beschleunigen. Sie können z.B. als Hilfsmittel bei Röntgenuntersuchungen eingesetzt werden und haben Aussicht auch therapeutisch angewandt zu werden.

Sie haben folgende Formel

PZ-Oktapeptid: Asp-Tyr(SO[tief]3[hoch]-)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2

Caerulein: PCA-Gln-Asp-Tyr(SO[tief]3[hoch]-)-Thr-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2

Darüberhinaus enthalten Humangastrin II, das die Säuresekretion im Magen stimulierende Hormon, sowie ein Analoges des C-terminalen Caerulein-Heptapeptids, das diese Säuresekretion hemmt, einen Tyrosinsulfatrest.

Charakteristik der bekannten technischen Lösungen

Die Herstellung und die biologische Wirksamkeit von Caerulein und einem Derivat, in dem die OH-Gruppe des Threonins acetyliert ist, sind im BRD-Patent 1 643 504 beschrieben. Die Einführung des Schwefelsäurerestes erfolgt in die Dekapeptidsequenz mittels des Pyridin-SO[tief]3-Komplexes. Die Umsetzung ist in dieser Stufe offensichtlich nicht quantitativ. Danach geschieht die Entfernung der Acetylgruppe durch alkalische Verseifung. Die Ausbeute nach der unbedingt erforderlichen Reinigung liegt bei 40% (Engl. Patent 1. 173 539).

Die Herstellung des C-terminalen Oktapeptides des Pankreozymins und seine pharmazeutische Nutzung sind in den US-Patenten 3 723 406 und 3 734 946 dargelegt. Hier erfolgt die Einführung des Schwefelsäurerestes am Tyrosin in das ungeschützte Oktapeptid mittels konz. Schwefelsäure, wobei infolge Bildung vieler Nebenprodukte die Ausbeuten nach der Reinigung bei 20-25% liegen (vgl. a. J. Amer. Chem. Soc. 92, 195 (1970)). Dort wird auch die Anknüpfung eines geschützten Dipeptids an ein PZ-Dekapeptid, welches Tyrosinsulfat enthält, beschrieben. Auf gleiche Weise wird eine Reihe von Analoga des PZ-Oktapeptids erhalten, von denen die, in denen die N-terminale Asparaginsäure gegen andere Aminosäurereste und gegen Malein- und Fumarsäure ausgetauscht ist, ebenfalls biologisch hochaktiv sind (vgl. Engl. Patent 1 304 074 und J. Med. Chem. 13, 439 (1970)).

Die bei Anwendung von konz. Schwefelsäure entstehenden, am aromatischen Ring des Tyrosins in 3'-Stellung sulfonierten PZ-Okta-, Deka- und Dodekapeptide zeigen eine hohe biologische Wirkung.

Sie sind im US-Patent 3 579 494 beschrieben.

Weitere Nebenprodukte bei der Herstellung C-terminaler PZ-Sequenzen sind Ausgangsprodukt, d.h.

a) die identische nicht sulfatierte Sequenz, welche auch durch H[tief]2SO[tief]4-Abspaltung bei der Aufarbeitung infolge kurzzeitiger sauerer Reaktion entstehen kann.

b) Derivate mit Substitutionen am Tryptophanring, die insbesondere während des schrittweisen Aufbaus bei wiederholten Abspaltungen der Boc-Schutzgruppe mittels Trifluoressigsäure entstehen können (vgl. dazu Houben Weyl, Methoden der Organischen Chemie XV/1, Synthese von Peptiden I. 566 (1974)).

Das vom Synthesevorgang her einfachste PZ-Peptid mit hoher biologischer Aktivität ist das Boc-Tyr(SO[tief]3[hoch]-)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 letzter Reaktionsschritt in das Boc-Heptapeptid eingeführt. Von mehreren Peptidwirkstoffen ist bekannt, dass die Weglassung der N-terminalen Aminogruppe die biologische Aktivität verstärkt und dass die Einführung N-terminaler Acylgruppen, u.a. wegen der Behinderung des Abbaus durch Aminopeptidasen, vorteilhaft für die biologische Wirkung ist.

Zweck der Erfindung

Zweck der Erfindung ist es, das Boc-Tyr(SO[tief]3[hoch]-)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 mit hohen Ausbeuten, unter Vermeidung aufwendiger Reinigungsoperationen ausgehend von dem Handelsprodukt Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 auf kürzestem Wege zu gewinnen, es als Ausgangsprodukt für weitere, insbesondere N-acylierte PZ-Peptide einzusetzen und dadurch auf die Gallenblase wirksame PZ-Peptide mit möglichst einfacher Struktur zu erhalten.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Im folgenden wird ein allgemein auf die Synthese von höheren Tyrosinsulfat-Peptiden anwendbares Verfahren am Beispiel einiger N-acylierter C-terminaler Heptapeptide des Pankreozymins (PZ) beschrieben.

X-Tyr(OSO[tief]3[hoch]-)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2

X = HOOC-CH[tief]2-CH[tief]2-CO, H[tief]3C-CH[tief]2-OCO-CH[tief]2-CH[tief]2-CO

4-HO-C[tief]6H[tief]4-CH[tief]2-CO

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das geschützte Peptidfragment, das aus 2 bis 6 Aminosäureresten bestehen kann und einen Tyrosinrest enthält, durch Einwirkung eines Überschusses von Pyridin-SO[tief]3-Komplex bzw. von einem Gemisch aus Pyridin, Chlorschwefelsäure in Dimethylformamid/Chloroform mit Schwefelsäure verestert. Bei der Sulfatierung von Boc-Tyr-Met-Gly-OÄt mit 30fachem Überschuß an Cl-SO[tief]3H im Gemisch wird eine 100%ige Umsetzung erreicht.

Eine Spaltung der Schwefelsäureester-Bindung durch kurzzeitige saure Reaktion bei der Aufarbeitung des Reaktionsgemisches wird durch Aufnehmen in ein alkalisches Puffersystem, wie z.B. NH[tief]3/NH[tief]4Cl weitgehend vermieden.

Das Reaktionsprodukt lässt sich mit Gemischen höherer Alkohole, z.B. n-Butanol, mit Essigsäureestern gut aus dem Puffergemisch extrahieren mit einer Ausbeute von 70%.

Es ist ein Vorteil des Verfahrens, dass man auch mit O-Acyl-tyrosin-Produkten verunreinigte Derivate des geschützten Tyrosins, z.B. N[tief]3O-Di-Boc-Tyr, deren Reinigung sehr aufwendig ist, einsetzen kann. Bei der Aufarbeitung durch Ausfällung wird das entstandene O-Acyl-Tyrosinpeptid quantitativ aus dem Tyrosinsulfat-Peptid entfernt. Boc-Tyr(SO[tief]3[hoch]-)-Met-GlyOÄt wird durch alkalische Verseifung auf bekannte Weise in die Tripeptidsäure überführt, mittels n-Butanol/Essigester isoliert (Ausbeute 75%). Die N-geschützte Peptidsäure, die Tyrosinsulfat enthält, kann dann nach üblichen Methoden an ein Peptid mit freier kleines Alpha-Aminogruppe kondensiert werden. Für die Kupplung von Boc-Tyr(SO[tief]3[hoch]-)-Met-Gly an Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 wird bevorzugt die Misch-Anhydrid-Synthese benutzt (88% Ausbeute). Die Herstellung des Boc-geschützten C-terminalen Pankreozymin-Hepta-Peptids Boc-Tyr(SO[tief]3[hoch]-)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 gelingt auf diese Weise mit höherer Gesamtausbeute und höherer Reinheit als nach den bisher beschriebenen Synthesen, bei denen die Sulfatierung als letzter Reaktionsschritt vorgenommen wird.

Die vollständige Abspaltung der N-Schutzgruppe bei gleichzeitiger minimaler saurer Hydrolyse der Schwefelsäureesterbindung, d.h. bei minimaler Abspaltung des SO[tief]3[hoch]--Restes von der Hydroxylgruppe des Tyrosins sowie bei gleichzeitiger minimaler Entstehung von Nebenprodukten durch Ringsubstitution am Tryptophan-Rest wird durch vorliegendes Verfahren gewährleistet.

Als günstigste Bedingung für die Abspaltung der Boc-Schutzgruppe wurde die Anwendung von 75-85%iger Trifluoressigsäure in Gegenwart von und bei Überschichtung mit Merkaptoäthanol und Methoxybenzol ermittelt. Dabei sind Nebenreaktionen am Tryptophan völlig auszuschließen. Die Hydrolyse des Schwefelsäureesters bleibt unter 20%. Der Einsatz der Boc-Schutzgruppe ist somit gegenüber anderen, bisher bekannten Schutzgruppen, die im schwächer sauren, neutralen oder alkalischen Medium abspaltbar sind, durchaus noch von Vorteil. Das entstehende, in der Sequenz identische Peptid mit freier OH-Gruppe am Tyrosin, ist nach der darauffolgenden N-Acylierung (vgl. unten) sehr leicht abzutrennen, falls dies für den vorgesehenen Anwendungszweck erforderlich ist.

Die Acylierung des so erhaltenen C-terminalen Pankreozymin-Heptapeptids Tyr(OSO[tief]3[hoch]-)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 erfolgte durch Umsetzung mit aktivierten Estern der entsprechenden Carbonsäuren, wie z.B. mit p-Hydroxyphenylessigsäure- und Bernsteinsäureäthylester-2,4,5-Trichlorphenylester bzw. mit Bernsteinsäureanhydrid. Dafür wird das Heptapeptid aus seinem Trifluoracetat mit einer schwachen organischen Base, vorzugsweise N-Äthylmorpholin (NÄM) freigesetzt. Die Acylierung erfolgt unter Zusatz von NÄM!

Von den so erhaltenen Acyl-PZ-Heptapeptiden zeigte das Succinyl-PZ-Heptapeptid, auch als Desamino-PZ-Oktapeptid zu bezeichnen (X = HOOC-CH[tief]2-CH[tief]2-CO) an der Gallenblase eine hohe Wirksamkeit, die in der Größenordnung dem Caerulein nahekommt. Dagegen erreichten das p-Hydroxyphenylacetyl- und das Äthoxysuccinyl-Derivat nur 1% der Caeruleinwirkung.

Die Abtrennung der "desulfatierten" Nebenprodukte, vgl. oben, kann durch Gegenstromverteilung erfolgen. Sie gelingt durch Chromatographie an Dextrangelen. Da sich beide Verbindungen im Molgewicht nur geringfügig unterscheiden, ist der Trenneffekt überraschend.

Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren an Beispielen erläutert.

Beispiel 1

N-tert. Butyloxycarbonyl-O-sulfat-L-tyrosyl-L-methionyl-glycin-äthylester-ammoniumsalz

2,8 g (0,036 Mol) Pyridin in 10 ml Chloroform werden auf -10°C gekühlt. Unter Rühren tropft man in 30-40 Min. 2,4 ml (0,037 Mol) Chloroschwefelsäure zu dieser Lösung, wobei man eine Temperatur von +10°C einhalten muß! Nach beendeter Zugabe rührt man noch 30 Min. bei 0° bis 10°C und bringt anschließend das Gemisch des Pyridin-SO[tief]3-Komplexes und Pyridinhydrochlorid mit 10 m. DMF in Lösung.

0,600 g (1,21 mMol) Boc-Tyr-Met-Gly-OÄt werden in 10 ml DMF und 10 ml Pyridin gelöst und unter Rühren zu der Pyridin-SO[tief]3-Komplex-Lösung gegeben. Anschließend wird 5 Std. bei +35°C im Wasserbad gerührt, die Lösungsmittel im Ölpumpenvakuum bei +45°C entfernt und der ölige Rückstand bei -5° bis 0°C unter starkem Rühren schlagartig mit 200 ml 0,1 N-NH[tief]4Cl/0,1 N-NH[tief]3-Puffer (pH 10.5) versetzt. Abschließend wird mit diesem Puffer schnell auf pH 7.0 eingestellt. Der sich in der wässrigen Phase abscheidende Feststoff wird durch Zugabe von 70 ml einer n-Butanol/Essigester-Mischung (2:1) in Lösung gebracht. Die wässrige Phase wird abgetrennt, mit NaCl gesättigt und 3x mit 70 ml ebengenannter Mischung extrahiert. Die organischen Extrakte werden vereinigt, mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen, bis keine SO[tief]4[hoch]---Ionen mehr nachweisbar sind, und die organische Phase über Na[tief]2SO[tief]4 getrocknet. Anschließend wird die Lösung bis auf die Hälfte des Volumens eingeengt. Die n-Butanol-haltige Lösung lässt man zur Entfernung des Boc-Tyr(Boc)-Met-Gly-OÄt langsam unter Rühren in die 2,5fache Menge kalten Äther einfließen. Das ausgefallene Produkt wird abgesaugt, gründlich mit Äther und Petroläther gewaschen und im Vakuum über P[tief]4O[tief]10 getrocknet.

Ausbeute: 0,50 g (70%) F.: 139-141°C

= -9,8 (C = 1.0 in DMF)

Aminosäureanalyse nach alkalischer Hydrolyse.

Tyr SO[tief]4 0,87 Tyr 0,05 Met 0,89 Gly 1,0

Die dünnschichtchromatographische Reinheit wurde auf Silufolplatten der Firma Kavalier CSSR im System (A) -BuCH/Eisessig/Wasser 4:1:1 und (B) Pyridin/n-Butanol/Eisessig/Wasser 20:30:6:24 geprüft.

Rf[tief]A = 0,66, Rf[tief]B = 0,64

Beispiel 2

N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-sulfat-L-tyrosyl-L-Methionyl-glycin-natriumsalz

0,500 g (0,84 mMol) Boc-Tyr(SO[tief]3NH[tief]4[hoch]+)-Met-Gly-OÄt werden in 5 ml Wasser/Äthanol 1:1 gelöst und mit 3 ml 1N NaOH 45 Min. bei Raumtemperatur gerührt. Man engt die Lösung am Rotationsverdampfer bei +40°C auf die Hälfte ihres Volumens ein und verdünnt anschließend mit ca. 5 ml Wasser. Die Reaktionslösung wird bei +5°C mit 1N HCl auf pH 3,0 eingestellt. Die wässrige Phase wird mit 50 ml einer n-Butanol/Essigester-Mischung (2:1) extrahiert, nachfolgend mit NaCl gesättigt und gründlich mit 2 50 ml-Portionen o.g. Lösungsmittelmischung geschüttelt. Die organischen Phasen werden vereinigt, mit gesättigter NaCl-Lösung gewaschen und über Na[tief]2SO[tief]4 getrocknet. Die Lösungsmittel werden im Vakuum bei +40°C entfernt und der Rückstand unter Zusatz von Chloroform mehrfach zur Trockene eingedampft. Der glasige Rückstand wird mit Äther und Petroläther zerrieben, der Feststoff gründlich mit Äther und Petroläther gewaschen und im Vakuum über P[tief]4O[tief]10 getrocknet.

Ausbeute: 0,360 (75%) F.: 196 - 198°C

= -6,8 (C = 0,5 in DMF)

Rf[tief]A = 0,64, Rf[tief]B = 0,57

Beispiel 3

N-tert.-Butyloxycarbonyl-O-sulfat-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-Methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid-natriumsalz
<NichtLesbar>
g (0,631 mMol) BOC-Tyr(SO[tief]3Na)-Met-Gly-OH werden in 20 ml DMF gelöst, 0,079 ml (0,631 mMol) N-Äthylmorpholin dazugegeben und die Reaktionslösung auf -25°C abgekühlt. Man gibt 0,086 ml (0,631 mMol) Chlorameisensäureisobutylester dazu und belässt zur Aktivierung anschließend 10 Min. bei -25°C.

0,400 g (0,631 mMol) Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 werden separat in 20 ml DMF gelöst, mit 0,079 ml (0,631 mMol) N-Äthylmorpholin versetzt und die Reaktionslösung auf -25°C abgekühlt. Diese wird zur Lösung des Misch-Anhydrids von Boc-Tyr(SO[tief]3Na)-Met-Gly-OH gegeben. Man rührt anschließend 30 Min. bei -25°C und 4 Std. bei Raumtemperatur. Das ausgefallene Aminhydrochlorid wird abgesaugt, die Lösungsmittel im Ölpumpenvakuum bei +45°C entfernt und der zähflüssige Rückstand in der Kälte mit einer Mischung von n-Butanol-Äther (1:1) verrieben. Der Feststoff wird abgesaugt, mit Chloroform gründlich gewaschen und im Vakuum über P[tief]4O[tief]10 getrocknet.

Ausbeute: 0,650 g (88%) F. 184-186°C = -7,1 (C = 0,25 in DMF) <Formel> = -3,7 (C = 0,25 in H[tief]2O)

Aminosäureanalyse nach alkalischer Hydrolyse

TyrSO[tief]4 0,88; Tyr 0,03; Phe 0,9; Asp. 1,0

Rf[tief]A = 0,64 Rf[tief]B = 0,67

Beispiel 4

O-Sulfat-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid-trifluoracetat

0,650 g (0,565 mMol) BOC-Tyr(SO[tief]3Na)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 werden mit 0,5 ml Methoxybenzol und 0,1 ml 2-Mercaptoäthanol überschichtet und anschließend mit 125 ml 74% TFE 20 Min. bei 18-20°C gerührt.

Die Reaktionslösung wird in die 2fache Menge einer Äther-Petroläther-Mischung 1:1 gegeben und vom voluminösen Niederschlag abgesaugt. Dieser wird gründlich mit Petroläther gewaschen und im Vakuum über P[tief]4O[tief]10/KOH getrocknet.

Ausbeute: 0,550 g (85%)

Rf[tief]A 0,52 und 0,62 (ca. 20%) Rf[tief]B 0,57 und 0,77 (ca. 20%)

Aminosäureanalyse nach alkalischer Hydrolyse

Tyr(SO[tief]3H) 0,68, Tyr 0,23, Asp 0,74, Gly 1,0, Met 1,6,

Phe 0,9, Trp 1,1

Beispiel 5

N-Succinoyl-O-sulfat-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid-di-N-äthylmorpholiniumsalz

0,550 g (0,00048 Mol) 13 werden in 10 ml DMF gelöst, unter Rühren mit 181 ml (0,00144 Mol) N-Äthylmorpholin (keine andere Base verwenden!) versetzt und die Reaktionslösung auf 0°C abgekühlt.

Dann trägt man innerhalb von 40 Min. unter weiterem Rühren 0,062 g (0,000624 Mol) Butandisäureanhydrid ein und tropft gleichzeitig 0,079 ml N-Äthylmorpholin zu. Die Reaktionslösung rührt man noch 3 Std. bei 0°C und lässt über Nacht bei +4°C stehen.

Das Lösungsmittel wird im Ölpumpenvakuum bei +40°C entfernt und der viskose Rückstand mit einer kalten Mischung von n-Butanol-Äther verrieben, der Feststoff abgesaugt, gründlich mit Tetrachlormethan, Äther und Petroläther gewaschen und im Vakuum über P[tief]4O[tief]10 getrocknet.

Ausbeute: 0,588 g (91%) Schmp. 172-175°C

Aminosäureanalyse nach alkalischer Hydrolyse

TyrSO[tief]4 0,72, Tyr 0,18, Asp. 1,0, Gly 1,1, Met 1,6, Phe 0,93, Trp. 0,75

Rf[tief]A 0,53 und 0,70 (ca. 20%) Rf[tief]B 0,64 und 0,68 (ca. 20%)

Reinigung durch Gelfiltration an Sephadex G-25

Mehrere Stunden in 0,1 N Ammoniumacetat-Lösung (1 N Essigsäure durch Zugabe von Ammoniak auf pH 6,5 gequollenes Sephadex G-25 wird in eine Säule von 120 cm Länge und 4 cm Durchmesser gefüllt. Man trägt eine Lösung von 200 mg "Roh-Desaminooktapeptid" in 8 ml 0,1N NHyAC-Lsg und 2 ml Dimethylformamid auf und eluiert mit 0,1N Ammoniumacetat-Lsg. Bei einer Durchlaufgeschwindigkeit von 15 ml/h wird die Konzentration am Peptid durch Messung der Extinktion bei 280 nm (Uvicord) bestimmt und das Eluat in 8 ml Fraktionen aufgefangen. Die Fraktionen 9-31 enthielten das Desamino-PZ-oktapeptid, die Fraktionen 32-34 desulfatiertes Nebenprodukt.

Ausbeute: 0,116 g (60%)

und 0,055 g (11,6%) desulfatiertes Heptapeptid.

C[tief]49H[tief]60N[tief]9O[tief]16S[tief]3 (1357, 75)

2 C[tief]6H[tief]13NO Ber C 53,96 H 6,38 N 11,34 S 7,17

Gef 54,15 6,38 11,70 6,90

= -3,4° +- 0,5°C = 0,25 in Wasser

= -9,4° +- 1°C = 0,25 in DMF

Aminosäureanalyse nach alkalischer Hydrolyse

Tyr (OSO[tief]3[hoch]-) Tyr Asp Gly Met Phe Trp

0,80 0,08 1,0 1,0 1,64 0,90 1,0

Beispiel 6

N-Äthoxysuccinyl-O-sulfat-L-tyrosyl-L-methionyl-glycyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid

0,190 g (0,167 mMol) Tyr(OSO[tief]3[hoch]-)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 (Beispiel 4) werden in 10 ml DMF gelöst, 0,0182 mMol (0,146 mMol) N-Äthylmorpholin zugegeben. Man kühlt das Reaktionsgemisch auf 0°C ab und fügt 0,059 g (0,182 mMol) Äthoxybernsteinsäure-2,4,5-trichlor-phenylester dazu, rührt 30 min. bei 0°C und belässt 2 Tage bei Raumtemperatur.

Das Lösungsmittel wird bei +45°C im Vakuum entfernt, der ölige Rückstand mit Äther/Petroläther digeriert, der Feststoff abgesaugt und mit Chloroform, Äther und Petroläther gewaschen.

Ausbeute: 0,146 g (75%) Rf[tief]B = 0,61 12b

Rf[tief]B = 0,70 ca. 15% desulfatiertes, acyliertes Heptapeptid.

Reinigung durch Gegenstromverteilung

Als Verteilungssystem wird Chloroform/Methanol/0,1N Ammoniumacetat 11,1:8:10 verwendet. Nach 32 Verteilungsschritten und Lyophilisation betrug die Ausbeute 84% (Fraktion 24-31) neben 15% desulfatiertem, acyliertem Heptapeptid (Fraktion 20-22). Säure-Basen-Titration und Sulfatbestimmung (BaSO[tief]4) ergaben 90% bzw. 92% der berechneten Werte.

Beispiel 7

p-Hydroxyphenylacetyl-O-sulfat-L-tyrosyl-L-methionyl-L-tryptophyl-L-methionyl-L-aspartyl-L-phenylalaninamid

0,190 g (0,167 mMol) Heptapeptidsulfat nach Beispiel 4 werden in 10 ml DMF gelöst, 0,0182 ml (0,146 mMol) N-Äthylmorphilin zugegeben und das Reaktionsgemisch auf 0°C abgekühlt. Man fügt 56 mg (0,182 mMol) p-Hydroxyphenylessigsäure-2,4,5-trichlorphenylester dazu, rührt 30 Min. bei 0°C und 2 Tage bei Raumtemperatur. Das Lösungsmittel wird bei +45°C im Vakuum entfernt und der ölige

Rückstand mit Äther/Petroläther (1:1) digeriert. Der Feststoff wird abgesaugt, mit Chloroform, Äther und Petroläther gewaschen.

Ausbeute: 0,150 g (80%) Rf[tief]B = 0,59

bei Rf[tief]B = 0,69 ca. 15% desulfatiertes, acyliertes Heptapeptid.

Die Reinigung erfolgte durch Gegenstromverteilung. Vgl. Beispiel 6.

Ausbeute 80% (Fraktion 24-31) neben 15% desulfatiertem Heptapeptid (Fraktion 11-23).

Säure-Basen-Titration und Sulfatbestimmung (BaSO[tief]4) ergaben 95% bzw. 93% der berechneten Werte.

Formelschema n

Bericht über das Ergebnis der vorläufigen Prüfung der Neuheit und der technisch-ökonomischen Effektivität

Es wurde eine Recherche in der Patentschriftensammlung des AfEP in der Int. Cl. C 07 c 103/52 - Peptide - für die Länder DDR, BRD, GB und USA durchgeführt.

Folgende Nummernbereiche wurden durchgesehen:

von bis

DDR 5 757 120 648

BRD 1 000 001 1 601 820

USA 3 423 390 3 971 736

GB 1 291 477 1 453 454

Weitere Informationsquellen sind:

J. Amer. Chem. Soc. 92, 195 (1970)

J. Med. Chem. 13, 439 (1970)

Houben Weyl, Methoden der Org. Chemie XV (1),

Synthese von Peptiden I, 566 (1974)

Experentia 24, 771 (1968)

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die Tyrosinsulfat enthalten.

Die die Erfindung betreffenden bekannten technischen Lösungen wurden bei der Darstellung des Standes der Technik abgehandelt, so dass hier auf eine Wiederholung verzichtet werden kann.

Anwendungsgebiet ist die pharmazeutische Industrie.

Zusammenfassung

Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die Tyrosinsulfat enthalten

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Peptiden, die aus 6-20 Aminosäureresten bestehen, insbesondere von Pankreozyminpeptiden, für deren biologische Wirksamkeit ein Tyrosinrest mit Schwefelsäure verestert vorliegen muß, sowie ihre pharmazeutisch anwendbaren Salze.

Der Erfindung liegt die Aufgabe zugrunde Boc-Tyr(SO[tief]3[hoch]-)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 mit hohen Ausbeuten unter Vermeidung aufwendiger Reinigungsoperationen von dem Handelsprodukt Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 zu gewinnen.

Erfindungsgemäß wird ein geschütztes Tyrosinpeptid aus 2 bis 6 Aminosäureestern durch Einwirkung eines Überschusses von Pyridin-SO[tief]3-Komplex bzw. von einem Gemisch aus Pyridin, Chlorschwefelsäure in Dimethylformamid/Chloroform mit Schwefelsäure verestert. Anschließend wird dieses Peptid, das Tyrosinsulfat enthält, nach üblichen Methoden mit einem Peptid, das aus 2-14 Aminosäureresten besteht, verknüpft. Nach Abspaltung der Schutzgruppe können ggf. weitere Substitutionen an der -Aminogruppe vorgenommen werden.

Anwendungsgebiet ist die pharmazeutische Industrie.

Verwendete Abkürzungen

Asp - Asparaginsäure

Gln - Glutamin

Gly - Glycin

Met - Methionin

Phe - Phenylalanin

Thr - Threonin

Trp - Tryptophan

Tyr - Tyrosin

PCA - Pyrrolidon-2-carbonsäure

PZ - Pankreozymin

Boc - tert.-Butyloxycarbonyl

OÄt - Äthylester

OTcp - 2,4,5-Trichlorphenylester

NÄM - N-Äthylmorpholin

TFE - Trifluoressigsäure

DMF - Dimethylformamid

Claims (7)

1. Verfahren zur Herstellung von Peptiden aus 6-20 Aminosäureresten, die mit Schwefelsäure verestertes Tyrosin enthalten, dadurch gekennzeichnet, dass die Einführung der Schwefelsäuregruppe (Sulfatierung) in ein geschütztes Tyrosinpeptid aus 2-6 Aminosäureestern erfolgt, dieses nach in der Peptidsynthese üblichen Methoden mit der Aminogruppe eines anderen Peptids, das aus 2-14 Aminosäureresten besteht, verknüpft wird und nach Abspaltung der Schutzgruppe ggf. weitere Substitutionen an der kleines Alpha-Aminogruppe vorgenommen werden.

2. Verfahren zur Herstellung von X - Tyr(SO[tief]3[hoch]-)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2, wobei X = H[tief]5C[tief]2OOC-CH[tief]2-CH[tief]2-CO-, HO-C[tief]6H[tief]5-CH[tief]2-CO, HOOC-CH[tief]2-CH[tief]2-CO und andere Acylreste bedeutet, nach Punkt 1, dadurch gekennzeichnet, dass der geschützte Tripeptidester Y-Tyr-Met-Gly O Alkyl sulfatiert wird, die Alkylestergruppe verseift wird, die geschützte, sulfatierte Tripeptidsäure vorzugsweise nach der Misch-Anhydrid-Methode mit Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 verknüpft wird und das nach Abspaltung der Schutzgruppe entstandene Heptapeptid unter Zusatz einer schwachen organischen Base, vorzugsweise N-Äthylmorpholin, acyliert wird.

3. Verfahren nach Punkt 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass bei der Aufarbeitung der Sulfatierungsstufe wässrig-alkalische Pufferlösungen, vorzugsweise NH[tief]3/NH[tief]4Cl verwendet werden.

4. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, dass zur Isolierung des geschützten, sulfatierten Tripeptidesters Gemische höherer Alkohole mit Essigsäureestern, vorzugsweise n-Butanol/Äthylacetat verwendet werden.

5. Verfahren nach Punkt 2, dadurch gekennzeichnet, dass die tert. Butyloxycarbonyl-Schutzgruppe verwendet wird und ihre Abspaltung von sulfatiertem Heptapeptidamid mit 75-85prozentiger Trifluoressigsäure unter Zusatz von sowie Überschichtung mit Methoxybenzol/Merkaptoäthanol bei Zimmertemperatur erfolgt.

6. Verfahren nach Punkt 1, 2 und 5, dadurch gekennzeichnet, dass bei Säurebehandlung möglicherweise entstehende Anteile von desulfatiertem Peptid der gleichen Aminosäuresequenz nach der Acylierung der Aminogruppe durch Gelfiltration abgetrennt werden.

7. Succinyl-Tyr(SO[tief]3[hoch]-)-Met-Gly-Trp-Met-Asp-PheNH[tief]2 seine Salze und pharmazeutischen Zusammensetzungen in Mixturen mit einer Lösung oder einem Träger.