DE2822951A1 - Neue polypeptide mit thymusaktivitaet oder antagonistischer aktivitaet und verfahren zu ihrer herstellung - Google Patents

Description

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BESCHREIBUNG

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Peptidverbindungen, deren chemische Struktur mit der des polypeptidischen Hormons mit Thymusaktivität, das aus dem Schweineblutserum isoliert wird, verwandt ist; chemische Syntheseverfahren zu deren Herstellung und ihre therapeutische Verwendung.

Es ist bekannt, daß die Immunokompetenz der T-Lymphozyten vom Thymus beeinflußt wird. Dieser differenzierende Einfluß des Thymus ist Gegenstand zahlreicher Untersuchungen seit der Entdeckung der Wirkungen der Immunkörperunterdrückung bei Thymusentfernung kurz nach der Geburt. Versuche zur Wiederherstellung der Immunokompetenz von Mäusen, bei denen bei Geburt der Thymus entfernt wurde, durch Thymustransplantate, die in einer für Zellen undurchlässige Diffusionskammer plaziert waren, oder durch azelluläre Thymusextrakte weisen darauf hin, daß der Thymus eine Rolle einer endokrinen Drüse spielt und ein Hormon erzeugt, das in den Blutkreislauf eingeführt wird.

Die Isolierung und Charakterisierung eines Hormons, das in der französischen Fachsprache "facteur thymique
serique" (FTS) (Thymusfaktor) genannt wird,und das im Serum vieler Säugetierearten, insbesondere von Schweinen, enthalten

25 ist, sind Gegenstand von vielen neueren Veröffentlichungen.

Es wurde gezeigt, daß der FTS ein Nonapeptid ist, das durch die folgende Aminosäurensequenz gekennzeichnet ist:

PyroGIu-AIa-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (I)

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Folglich wird die chemische Synthese des Faktors FTS der Struktur (I) ebenso beschrieben wie die einer Gruppe von Peptidverbindungen mit verwandter Struktur, einschließlich der einer anderen aktiven Form des Faktors FTS, entsprechend der folgenden Formel Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (II)

Diese Synthesen führen sowohl zu Polypeptiden mit einer Thymusaktivität, die gleich oder überlegen der des natürlichen Hormons ist, die aber eine erheblich längere Wirkungsdauer wegen ihrer Resistenz gegenüber Enzymen aufweisen, die das Thymushormon im Organismus abbauen, als auch zur partiellen Umwandlung der chemischen Struktur des natürlichen Hormons, die zu Verbindungen führt, die gegebenenfalls gegenüber dem

15 Thymushormon antagonistische oder inhibierende Wirkung zeigen.

Da die Wirkung des Thymushormons zur Ausbildung von Immunabwehrreaktionen zum Abstoßen von Transplantaten führt, kann die antagonistische oder inhibierende Wirksamkeit, die durch solche Verbindungen ausgeübt wird, gegebenenfalls eine wichtige Rolle bei der Verhinderung des Abstoßens von Transplantaten spielen. Die Erfindung betrifft Polypeptidverbindungen der Sequenz

25 Glx-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

in der GIx für PyroGlu oder Gin steht, deren Derivate mit 1 oder 2 modifizierten Aminosäuren und die Hexa-, Hepta- und Oktapeptide dieser Verbindungen, die ihre C-terminale oder N-terminale Sequenz be^-

30 wahren, ausgenommen das nichtmodifizierte Nonapeptid PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn.

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Die Erfindung betrifft ebenfalls Syntheseverfahren zur Herstellung dieser Verbindungen einschließlich des nichtmodifizierten Nonapeptids PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn.

Unter modifizierten Aminosäuren wird verstanden, daß die jeweilige Aminosäure durch ihren optischen Antipoden oder durch eine andere Aminosäure ersetzt oder durch eine temporäre Schutzgruppe, die bei der erfindungsgemäßen Peptidsynthese verwendet wird,

10 geschützt ist.

Als Aminosäuren für den Austausch bei den modifizierten Aminosäuren können beispielsweise die folgenden verwendet werden:
AIa, Cyano-Ala, Asn, Thio-Asn, Asp, D-Lys, Orn, Lys (N⁶Acetyl) , GIu, D-GIn, Glu(jf-Cyano) , GIu(J-CS-NH₂), die 2-Aminohexanoyl, 2,6-Diamino-hexynoyl- und die 2,6-Diairiinohexenoylgruppe, D-Ser, N-Methyl-Ser, Thr, Sar, <Aad, B-AIa-NH₂, ASn-NH₂, Arg, Cys (S-CONH₂) , Har, Hep, Leu, Met(O), Nva und Pro.

Als temporäre Schutzgruppen oder als Gruppen zur Aktivierung der Carbonyigruppen der Aminosäuren können beispielsweise die folgenden verwendet werden: Z, BOC, Mbh, But, OBut, OTcp, ONp, OSu, Ac, Nps und OPcp, deren Abkürzungen im folgenden beschrieben werden.

Unter einer N-terminalen Sequenz wird die gesamte Teilsequenz der Sequenz Glx-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn verstanden, bei der der erste Aminosäurerest GIx ist; unter C-terminaler Sequenz wird die gesamte Teilsequenz der Sequenz Glx-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn verstanden, bei der der letzte Aminosäurerest Asn ist.

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Man kann deshalb die erfindungsgemäßen Verbindungen als Polypeptidverbindungen der Sequenz

X-Gln-Gly-Gly-Y

definieren, bei der Y für -Ser-Asn und X für Ser-, 5 Lys-Ser-, Ala-Lys-Ser-, Glx-Ala-Lys-Ser- stehen, und

wobei Y zusätzlich -Ser sein kann, wenn X Glx-Ala-Lys-Serist, sowie deren Derivate mit 1 oder 2 modifizierten Aminosäuren, ausgenommen die nichtmodifizierte Verbindung PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn.

Die Abkürzungen für die Aminosäuren wie auch für die temporären Schutzgruppen für die reaktiven Funktionen und die Reaktionspartner und Lösungsmittel, die bei der erfindungsgemäßen Synthese der Peptide verwendet werden, werden im folgenden zusammengestellt:

Aminosäuren:

PyroGlu = L-Pyroglutaminsäure, ^GlY ⁼ Glycin

AIa	L-Alanin,
D-AIa	D-Alanin,
Lys =	L-Lysin,
Ser	L-Serin,
Gin	L-Glutamin,
Asn =	L-Asparagin,
Asp =	L-Asparaginsäure,
GIu	L-Glutaminsäure,
Om =	L-Ornithin,
Thr	L-Threonin,
Sar =	L*-Sarkosin,
<Aad	L -2-Pyroaminoadipinsäure, Homopyro-
	glutaminsäure,
B-AIa-NH2	= ß-Alaninamide
Asn-NH-	= 1,4 Diamid der L-Asparaginsäure,

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Arg = L-Arginin, CyS(S-CONH₂) = S-carbamoyl-L-Cystein,

Har = L-Homoargin

Hep = L-Heptylin, L-2-Aminoheptansäure,

Leu = L-Leucin,

Met(O) = L-Methioninsulfoxyd,

Nva = L-Norvalin,

Pro = L-Prolin.

Als temporäre Schutzgruppen für reaktiven Funktionen

Z = Benzyloxycarbonyl,

BOC = ter-Butyloxycarbonyl,

Mbh = 4,4'-Dimethoxybenzhydryl,

But = ter-Butyl,

OMe = Methylester,

OBut = ter-Butylester,

OTcp = 2,4,5-Tri-chlorphenylester,

ONp = 4-Nitrophenylester,

OSu = N-Hydroxysuccinimidester,

Ac = Acetyl,

Nps = 2-Nitrophenylsulfenyl

OPcp = Pentachlorphenylester.

Reagenzienund Lösungsmittel:

NMM = N-Methylmorpholin,

DCHA - Dicyclohexylamin

DMF = Dimethylformamid

THF = Tetrahydrofuran,

AcOEt = Äthylacetat,

MeOH ' = Methanol,

ButOH = n-Butanol.

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Die Peptide mit 6 bis 8 Aminosäureresten (Hexa-, Hepta- oder Oktapeptide), deren Aminosäuresequenz der C-terminalen oder N-terminalen Sequenz des natürlichen Polypeptidhormons der Struktur (I) entspricht, die erfindungsgemäß synthetisiert worden sind: das Hexapeptid: Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (36) das Ileptapeptid: Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (37) die Oktapeptide: Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (38)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser (42) Als Beispiele für Peptide, die synthetisiert wurden, indem teilweise die Struktur des natürlichen Polypeptidhormons durch Austausch einer oder von zwei Aminosäuren der Konfiguration L entweder gegen ihiE optischen Antipoden der Konfiguration D oder gegen eine andere Amino-

15 säure mit mehr oder weniger analoger Struktur, oder

gegen die gleiche Aminosäure, bei der die Funktion in der Seitenkette durch eine temporäre Schutzgruppe geschützt ist, modifiziert wird, können die folgenden erwähnt werden, bei denen die modifizierte Aminosäure un-

20 terstrichen ist:

PyroGlu-D-AIa-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (47)

^Asn (45)

PyroGlU"Ala-Lys~Ser-Gln~Gly-Gly-Ser-As£ (53) • PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asn (59)

2 S -» ——

PyroGlu-Ala-Lys-'AJla-Gln-Gly-Gly-SerT-Asn (60) Z Cln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (34)

Pyro Glu-Alc-JVLv.s-Ser-Glr.-Gly-Gly-Ser-Asn (61) PyroGlu-Ala-j^sj^^j^etvi)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (62) PyroGlu-Ala-Orn-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (63)

. PyroOlu-Ala-·Lv-S-(N-mothyl)Sor-Gln-Gly-Gly-Ser-Agn (64) PyroGlu~Aia-I.ys-A3_a-GXri-Gly-Gly-Sor-Asn (65) PyroGlu-Alu-Lys-n-.Sgr-Gln-Gly-GJ.y-Sor-Asn (66)

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PyroGlu-Ala-Lys-Thr-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (67) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn (68) PyroGlu-Ala-Lys-Ser~Glu(^-cvano)-Gly*-Gly-Ser-Asn (69)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Glu( )f CS-NH ₂)-Gly-Gly-Ser-Asn (70)' PyroGlu-Ala-Lys-Ser-D-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (71)

PyroGlu-AIa-Ly s-Ser-Gln-AJlji-Gly-Ser-Asn (72) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Ala-Ser-Asn (73) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Ala-Ala-Ser-Asn (74)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Sar-Sar-Ser-Asn (75)
IO PyroGlu-Ala~(2--anino-h0X£inovl)>-Ser--G3.n-Gly-Gly--Ser--Asn (76)

PyroGlu-Ala- (2,6-dia:nrr.o-hexYnovl)~Ser-Gln-Gly-Gly- Se r- Asu (77) PyroGlu-Ala-(2,6-diar.ino-hg:cenovl)-SGr-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (78)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln (79) .

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Cly-Gly-Ser-CyanoAla (80) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-ThioAsn (81)

Lys(N acGtyl)~Ser-Gln»Glv-Glv-Sor-Asn (82)

P-Lys-Ser-Gln-Gly-Glv-Sor-Asn (83)

Orn-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (8^)

NOC Z . Ly3~Ser-Gln~Glv~Gly-'SGr~Aan (85)

20 PyroGlu-Ala-Lys-Sor-Gln-Gly-Gly-Ser-ß-Ala-NH^ (86)

Hoji-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (87)

Lys-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn (88)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-D-Ala-Glv-Ser-Asn (89)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn (90)

25 PyroGlu-Ala-Hep-Ser-Gln-Glv-Glv-Sor-Aan (^₁J

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-D^Leu-Gly-Ser-Asn (92)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NH ' (93)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Thr-Asn (94)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-D-Ser-Asn (95)

³⁰ 1 PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Sor-Asn (96)

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— 13 —
PyroGlu-AIa-Lys-Sor-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn (97)

PyroGlu-Ala-Lys-Sor-C _vs(S-CONIU)-Gly-Gly-Ser-Asn (98)

PyroGlu-Ala~Lys-SGr-Mot(o)-Gly--Gly~Sor~Asn. (99)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-D-Ala-Ser-Aan (100)

c, PyroGlu-AIa-Lys-Sor-Gln-Gly-Sar-Sor-Asn O⁰O

PyroGlu-Ala-Lys-Sor-Gln-Gly-D-Lou-Sor-Asn, (102)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Glv-Oly-Oly-Sor-Asn (103)

PyroGlu-Ala-Lys-Sor-Gln-Gly-Sor-Asn (1O'O

Z-AIa-Lys-Ser-Gln-Gly-Ser-Asn . (I05)

D-PyroGlu-Ala-Lys-Sor-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (IO6)

D-Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (107)

Cys(S-CONII )-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (IO8)

Pro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (

<Aad-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (110)

PyroGlu-Ala-Arfr-Sor-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn ( 1 1 1 )

PyroGlu-Ala-Har-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (112)

PyroGlu-Ala-Lys(N -acetyl)-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn (113}

PyroGlu-Ala-D-Lys(K -acotyl)-Ser-Gln-Gly-Gly-Scr-Asn (11h)

PyroGlu-AIa-Lys(N -acety1)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn (115)

Ac-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Sor-Asn · (116)

Die Verbindungen (103) und (104) entsprechen der

allgemeinen Definition mit dem Zusatz hinsichtlich der

Modifikation der Aminosäuren, dass man eine

Aminosäure der Sequenz zufügen oder entnehmen kann. 25

Synthese des Thymusfaktors (FTS) und seiner Derivate:

Die Synthese der beiden Formen des FTS:

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (I)

Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (II) 30 erfolgt erfindungsgemäß auf verschiedenen Wegen. Bei

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einem Weg wird ein Derivat des Glutamine verwendet, daß an seiner y-Amidfunktion durch die Gruppe 4,4'-Dimethoxybenzyhydryl (Mbh) geschützt ist, und bei einem zweiton Weg ohne Schutz der tf-Amidgruppe der Glutaminreste. 5 Beim ersten und zweiten Weg wird das mit Schutzgruppe versehene C-terminale Dipeptid jeweils mit dem geschützten Tetrapeptid Ser-Gln-Gly-Gly und dem geschützten Hexapeptid Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly gekuppelt. Ebenso erfolgt die Herstellung der Polypeptide der

Sequenz

X-Gln-Gly-Gly-Y,
bei der Y für - Sei?-Asn
und X für Ser- oder Ala-Lys-Serstehen,durch Kupplung des geschützten Dipeptids Ser-Asn mit

dem geschützten Peptid X-Gln-Gly-Gly und durch gegebenenfalls folgende Eliminierung der Schutzgruppen .

Bei dem zweiten Weg erhält man das Oktapeptid Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn ebenso wie auch bei dem ersten Weg, wobei das gleiche Oktapeptid aus dem Hexapeptid Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn über das Heptapeptid Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn hergestellt wird.

Das Oktapeptid Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn führt zur Herstellung der beiden Formen des FTS durch Kupplung mit dem ersten Rest PyroGlu oder Gin.

Das Verfahren zur Kupplung des Restes PyroGlu mit der Sequenz Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Y ist das gleiche für die verschiedenen Bedeutungen von Y, nämlich -Ser und -Ser-Asn und für die verschiedenen Möglichkeiten der Modifizierung einer Aminosäure, beispielsweise

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-Ser-Asp _f -Ala-Asn.

Die Kupplung erfolgt vorteilhafterweise mittels des Derivats PyroGlu-OTcp mit der Sequenz Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Y, bei der die Funktion in der Seidenkette einiger Aminosäuren gegebenenfalls geschützt ist.

Beschreibung der Synthesestufen des FTS auf dem ersten Weg A₁) Synthese des geschützten C-terminalen Dipeptids: Z-Ser(But)-Asn-OBut (1), durch Kupplung von Z-Ser(But)

10 (nach Fluka, Buchs in Form des Salzes von DCHA) und

Asn-OBut (nach E. Schnabel und H Schüssler, Liebigs Ann, Chern, 1965, 686, S. 229), Umwandlung in das Acetat von Ser(But)-Asn-OBut (2) durch selektive Eliminierung der temporären Schutzgruppe.

B.) Synthese des Dipeptids Z-Gly-Gly-OMe (3), nachfolgende Umwandlung in das Acetat von Gly-Gly-OMe (4) durch Eliminierung der Gruppe Z.

C₁) Synthese des Tripeptidderivats: Z-GIn(Mbh)-Gly-Gly-OMe (5) durch Kupplung des Derivats Z-Gln(Mbh), (hergestellt nach W. Köning und R. Geiger, Chem. Ber, 1970, 103, S. 2041) mit dem zuvor erhaltenen Derivat Gly-Gly-OMe (4), und Umwandlung des Tripeptidderivats (5) in sein Acetat (6).

D₁) Synthese des Tetrapeptidderivats:

25 Z-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-OMe (7)

durch Kupplung des Derivats Z-Ser(But) (von Fluka, Buchs in Form des Z-Ser(But)-DCHA) mit dem Tripeptidderivat (6).

EJ Herstellung des Derivats Z-Ser(But)-GIn(Mbh)-Gly-Gly-OH (8) durch Verseifung des Derivats (7).

F₁) Synthese des Hexapeptidderivats: Z-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut (9) durch Kupplung

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des C-terminalen, Dipeptidderivats (2) und des Tetrapeptidderivats (8) . Umwandlung des Hexapeptidderivats (9) in sein Acetat (10) durch selektive Eliminierung der Gruppe Z.
G₁) Synthese des Heptapeptidderivats:

Z-Lys(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut (11)

durch Kupplung des Derivats Z-Lys(BOC) (von Fluka, Buchs in Form von Z-Lys-(BOC)-DCHA) und des Hexapeptidderivats (10). Umwandlung des Heptapeptidderivats (11) in sein Acetat (12) durch selektive Eliminierung der Gruppe Z. H₁) Synthese des Oktapeptidderivats:

Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser (But)-Asn-OBut (13)

durch Kupplung des Derivats Z-AIa und des Heptapeptidderivats (12). Umwandlung des Oktapeptidderivats (13) in sein Acetat (14) durch Eliminierung der Gruppe Z. I-) Synthese des Nonapeptidderivats:

PyroGlu-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut (15) durch Kupplung des Derivats PyroGlu-OTcp (hergestellt nach J.C. Anderson, M.A. Barton, D.M. Hardy, G.W. Kenner, J. Preston und R.C. Scheppard, J. Chem. Soc. C. 1957, S. 108), und des Oktapeptidderivats (14) .
J ) Herstellung des freien Nonapeptids:

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (16) durch Elimination aller temporären Schutzgruppen in einer Stufe. Das auf diese Weise erhaltene freie Nonapeptid entspricht der Struktur (I) des F.T,S. K₁) Synthese des Nonapeptidderivats:

Z-GIn-(Mbh)-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser (But)- Asn-OBut (17) durch Kupplung des Derivats Z-GIn(Mbh)

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(erhalten, nach W. Köning und R. Geiger, Chem. Ber, 1970 S.2041) und des zuvor (s. H₁) erhaltenen Oktapeptidderivats (14).

L₁) Herstellung des freien Nonapeptids:

5 Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (18) durch Eliminierung zunächst aller temporären Schutzgruppen der Seitenkettenfunktionen der Aminosäuren und der der C-terminalen Carboxylgruppe und dann der Gruppe Z der N-terminalen Aminfunktionen. Das freie Nonapeptid (18) ent-10 spricht der Struktur (II) des FTS.

Beschreibung der Synthesestufen des FTS über den zweiten Weg:

A₂) Synthese des Tripeptidderivats: BOC-Gln-Gly-

15 GIy-OMe (19) durch Kupplung des Derivats BOC-GIn-ONp (von Serva, Heidelberg) und des Derivats Gly-Gly-OMe (4), das zuvor erhalten wurde (s. Absatz B₁). Umwandlung des Derivats (19) in sein Trifluoracetat (20) durch Eliminierung der Gruppe BOC.

B₂) Synthese des Tetrapeptidderivats: Z-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-OMe (21) durch Kupplung des Derivats Z-Ser(But) und des Derivats (2O)GIn-GIy-GIy-OMe. Umwandlung des Tetrapeptidderivats (21) in sein Acetat (22) durch Eliminierung der Gruppe Z.

C₂) Synthese des Pentapeptidderivats: Z-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-OMe (23) durch Kupplung des Derivats Z-Lys(BOC) und des Tetrapeptidderivats (22). Umwandlung des Derivats (23) in sein Acetat (24).

D₂) Synthese des Hexapeptidderivats: Z-Ala-Lys (BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-OMe (25)durch Kupplung des

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Derivats Z-AIa und des Pentapeptidderivats (24).

E_) Herstellung des Derivats: Z-Ala-Lys(BOC)-Ser (BUt)-GIn-GIy-GIy-NHNH₂ (26) durch Hydrazinolyse des Methylesters des vorhergehenden Derivats (25). F₂) Synthese des Oktapeptidderivats:

Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut (27) durch Kupplung des Azids Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-GIy-N₃, das ausgehend von dem Derivat (26) erhalten wurde, und des Derivats Ser(But)-Asn-OBut (2) (s. Paragraph A.).

Umwandlung des Oktapeptidderivats (27) in sein Acetat (28) durch Eliminierung der Gruppe Z.

G₂) Synthese des Nonapeptidderivats:

PyroGlu-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut (29) durch Kupplung der Derivats PyroGlu 0 Tcp. (her-

15 gestellt nach J.C. Anderson, MA, Barton, O.M. Hardy, G. W. Kenner, J. Preston und R.C. Sheppard, J. Chem. Soc, C 1967 S. 108), und des Oktapeptidderivats (28).

H₂) Herstellung des freien Nonapeptids: PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (30) durch EIiminierung der temporären Schutzgruppen in einer Stufe. Das auf diese Weise erhaltene freie Nonapeptid (30) ist mit dem Nonapeptid (16) identisch, das zuvor über den ersten Weg (s. Paragraph J₁) erhalten wurde und entspricht der Struktur -(I) des FTS.

I) Synthese des Nonapeptidderivats:

BOC-Gln-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut (31) durch Kupplung des Derivats BOC-Gln ONp (von Serva, Heidelberg) und des Oktapeptidderivats (27) (s. Paragraph F₂).

J) Herstellung des freien Nonapeptids:

Gin-Ala-Lys-Ser-GlntGly-Gly-Ser-Asn (32) durch Eliminierung

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der temporären Schutzgruppen in einer Stufe. Das auf diese Weise erhaltene Nonapeptid ist mit dem Nonapeptid (18) identisch, das zuvor über den ersten Weg hergestellt wurde (s, Paragraph L..) und entspricht der Struktur (II) des FTS.

K₂) Synthese des Nonapeptidderivats:

Z-Gln-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn OBut (33) durch Kupplung des Derivats Z-Gln OSu (hergestellt nach J. Beacham, J. Dupuis, G. Finn, F.M.

Storey, H.T. Yanaihara, C. Yanaihara und K. Hofmann, J. Amer. Chem. Soc. 1971, JO, S. 5526) und des Oktapeptidderivats (28) (s. Paragraph F₂).

L₉) Herstellung des Nonapeptidderivats: Z-Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (34) durch EIi-

15 minierung der temporären Schutzgruppen der Seitenkettenfunktion der Aminosäuren und der C-terminalen Carboxylgruppe des Derivats (33).

M„) Herstellung des freien Nonapeptids: Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (35) durch Eliminierung aller temporären Schutzgruppen des Nonapeptidderivats (33). Dieses Nonapeptid ist identisch mit dem Nonapeptid (18), das über den ersten Weg (s. Paragraph L₁) erhalten wurde.

25 Beschreibung der Synthesestufen der Peptidfragmente des FTS und der Struktuanalogen dieses Faktors

A₃) Herstellung des freien Hexapeptids:

Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (36) durch Eliminierung der temporären Schutzgruppen des Hexapeptidderivats Z-Ser(But)-

Gln(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut (9), das über den

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ersten Weg (s. Paragraph F₁) hergestellt wurde.

B-) Herstellung des freien Heptapeptids: Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Ans (37) durch Eliminierung der temporären Schutzgruppen des Heptapeptidderivats Z-Lys (BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut (11) das über den ersten Weg (s. Paragraph G₁) hergestellt wurde.

C₃) Herstellung des freien Oktapeptids: Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (38) durch Eliminierung der temporären Schutzgruppen der entsprechenden Oktapeptidderivate (13) und (27), die jeweils über den ersten bzw. zweiten Weg (s. Paragraphen H₁ und F_?) hergestellt wurden. Dasselbe freie Oktapeptid wurde durch Einwirkung des Enzyms Pyroglutamylaminopeptidase (Boehringer Mannheim) auf das synthetische Nonapeptid Pyro-Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn und durch Trennung der enzymatischen Hydrolyseprodukt durch präparative Rheophorese auf Papier erhalten.

D₃) Synthese des Heptapeptidderivats:

Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-OBut (39) durch Kupplung des Azidderivats des Hexapeptids Z-Ala-Lys (BOC)-Ser-(But)-GIn-GIy-GIy-NHNH₂(26), das über den zweiten Weg (s. Paragraph E-) erhalten wurde, und des Derivats Ser(But)-OBut (hergestellt nach E. Schroeder, Liebigs. Ann. Chem. 1963, 127 S. 670). Umwandlung des Heptapeptidderivats (39) in sein Acetat (40) durch Eliminierung der Gruppe Z.

E₃) Synthese des Oktapeptidderivats: PyroGlu-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-OBut

(41) durch Kupplung des Pyro GIu OTcp (s. Paragraph I₁) und des Heptapeptidderivats (40) .

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F-J Herstellung des freien Oktapeptid: PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser (42) durch Eliminierung der temporären Schutzgruppen des Oktapeptidderivats (41).
5 Gt) Synthese des Oktapeptiddervats:

Z-D-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut (43) durch Kupplung des Derivats Z-D-AIa (hergestellt nach M. Bergmann und L. Zervas, Ber. 1932, £5_ S. 1192) und des Heptapeptidderivats Lys(BOC)-Ser(But) -

10 Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut (12), das über den ersten Weg (s. Paragraph G₁) hergestellt wurde. Umwandlung des Oktapeptidderivats (43) in sein Acetat (44) durch Eliminierung der Gruppe Z.

H₃) Herstellung des freien Oktapeptids:

15 D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (45) durch Eliminierung der temporären Schutzgruppen des Oktapeptidderivats (43).

I₃) Synthese des Nonapeptidderivats;

PyroGlu-D-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut (46) durch Kupplung des Derivats PyroGlu-OTcp

(d. Paragraph I₁) und des Oktapeptidderivats D-Ala-Lys (BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut (43), das zuvor erhalten wurde.

J₃) Herstellung des freien Nonapeptids: PyroGlu-D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (47) durch Eliminierung der temporären Schutzgruppen.

K₃) Synthese des Dipeptidderivats: Z-Ser(But)-Asp-(OBut)-OBut (48), das durch Kupplung von Z-Ser(But) (von Fluka, Buchs) und des Asp-di(OBut) (von Fluka in Form des Dibenzolsufimidsalzes) erhalten wurde. Umwandlung des

Dipeptidderivats (48) in sein Acetat (49) durch Elimi-

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nierung der Gruppe Z,

L₃) Synthese des Oktapeptidderivats Z-Ala-Lys(BOC) Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asp-di(OBut) (50) durch Kupplung des Azids von Hexapeptidhydrazid (26) (s. Paragraph E-) und des Dipeptidderivats(49), das zuvor erhalten wurde. Umwandlung des Oktapeptidderivats (50) in sein Acetat (51) durch Eliminierung der Gruppe Z.

M_) Synthese des Nonapeptidderivats

Pyro-Glu-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asp-di(OBut) (52) durch Kupplung des Derivats Pyro-Glu-OTcp (s. Paragraph I₁) und des zuvor hergestellten Oktapeptidderivats (51).

N₃) Herstellung des freien Nonapeptids:

Pyro-Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (53) durch EIiminierung der temporären Schutzgruppen.

O₃) Synthese des Dipeptidderivats: Z-Ala-Asn-OBut (54) durch Kupplung des Derivats Z-Ala (nach M. Bergmann und L. Zervas, Ber. 1932, 6J5 S 1192) und des Derivats Asn-OBut (s. Paragraph A₁). Umwandlung des Dipeptidderivats (54) in sein Acetat (55) durch Eliminierung der Gruppe Z.

P₃) Synthese des Oktapeptidderivats:

Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ala-Asn-OBut (56) durch Kupplung des Azids des Hexapeptidderivats Z-Ala-Lys (BOC)-Ser(But)-GIn-GIy-GIy-NHNH₂ (26) (s. Paragraph E₃) und des zuvor hergestellten Dipeptidderivats (55). Umwandlung des Oktapeptidderivats (56) in sein Acetat (57) durch Eliminierung der Gruppe Z.

Q₃) Synthese des Nonapeptidderivats:

Pyro-Glu-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ala-Asn-OBut (58) durch Kupplung des Derivats Pyro-Glu OTcp (s. Paragraph I₁) und des zuvor hergestellten Derivats (57).

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R₃) Herstellung des freien Nonapeptids: Pyro-Glu-Ala-Lys-Gln-Gly-Gly-Ala -■ Asn (59) durch Eliminierung der temporären Schutzgruppen des Nonapeptidderivats (58).

Die Synthese der erfindungsgemäßen Peptidverbindungen wird anhand der folgenden Beispiele näher beschrieben.

In den Beispielen steht die Abkürzung CCM für Dünnschichtchromatographie; außerdem wurden folgende Abkür-

zungen für die verwendeten Lösungsmittelgemische verwendet :

A : Äthylacetat/Methanol 5 : 1 (v/v) B : Acetonitril/Benzol 1 : 1 (v/v) C : n-Butanol/Essigsäure/Wasser 3:1:1 (v/v/v)

15 D : n-Butanol/Pyridin/Essigsäure/H₂0 60 : 40 : 12 : 48

(v/v/v)

E : n-Butanol, gesättigt mit Wasser F : Chloroform/ Methanol 10 : 1 (v/v) G : Methanol/Chloroform/konzentriertes NH.OH 2:2:1

(v/v/v) M : n-Ammoniumacetat/Äthanol 3 : 7 (v/v) I : Chloroform/Methanol 3 : 1 (v/v) J ; Äthylacetat/Methanol 2 : 1 (v/v)

BEISPIEL 1

Herstellung des Nonapeptids PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

Stufe a) Herstellung des Acetats von Gly-Gly-OMe (4) Zu 20,92 g Z.GIy OH (von Fluka) in Lösung in 50 ml 30 DMF werden unter Abkühlung auf -20° C 14 ml Triäthylamin

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und dann 9,54 ml Äthylchlorcarbonat (von Fluka) zugesetzt. Nach 5minütigem Rühren bei -20° C werden 12,56 g Chlorhydrat des Glycinmethy!esters (von Fluka), in 250 ml DMF gelöst,und dann 14 ml Triäthylamin zugesetzt. Die Mischung wird unter Rühren bei Zimmertemperatur eine Nacht lang stehengelassen. Der unlösliche Anteil wird abfiltriert und das Lösungsmittel im Vakuum einer Vakuumpumpe abgezogen. Der Rückstand wird mit 100 ml Äthylacetat extrahiert; dann wird die Lösung nacheinander mit 20 ml η-Lösung KHSO., 20 ml Wasser, 20 ml KHCO₃ Lösung und 2 χ 20 ml Wasser gewaschen. Nach Trocknen über MgSO₄ wird das Lösungsmittel im Wasserstrahlvakuum abgezogen und das erhaltene Produkt wird aus der warmen bzw. abgekühlten Mischung AcOEt/Petroläther kristallisiert. Auf diese Weise werden 22,4 g Z.Gly-Gly.OMe (3) (Ausbeute 80 %)mit einem Fließpunkt von 67-68° C erhalten. Nach Dünnschichtchromatographie über Kieselsäuregel in der Lösungsmittelmischung J ist das Produkt homogen und wird direkt für die folgende Stufe verwendet.

Durch 8,9 g Z.Gly-Gly.OMe (3), das auf diese Weise erhalten wurde, in Lösung in 400 ml Methanol mit Gehalt an 8 ml Essigsäure, 8 ml Wasser und 0,9 g Pd/C (5 %) wird vier Stunden lang ein Wasserstoffstrom geleitet. Nach Abfiltrieren des Katalysators über Celit und Glasfritte werden die Lösungsmittel im Wasserstrahlpumpenvakuum abgezogen. Der Rückstand wird in Benzol oder Methanol und schließlich in Äther aufgenommen. Durch Verreiben des Rückstandes mit Äther nach Abziehen der Lösungsmittel wird das Produkt fest. Durch ümkristallisation aus

30 einer Methanol/Äthermischung werden 5,6 g des

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Acetats von Gly-Gly,QMe (4) in Form von Nadeln (Ausbeute 85 %) mit einem Fließpunkt von 95-98° C erhalten. Nach Dünnschichtchromatographie über Silicategel im Lösungsmittelgemisch C ist das Produkt homogen. 5 Stufe b) Herstellung des Acetats von Gin(Mbh)-GIy-

GIy.OMe (6)

Zu 7,4 g Z.Gin(Mbh) faach W.Köning und R.Geiger, Chem. Ber. 103 , (1970), 2041) in Lösung in 100 ml DMF und nach Abkühlung auf -20° C werden 1,7 ml NMM und 1,4 ml Äthylchlorcarbonat (von Fluka) zugesetzt. Nach 5 Minuten werden 3,29 g Acetat des Gly-Gly.OMe (4), das in 100 ml DMF, das 2 ml NMM enthält, gelöst ist, zugesetzt. Nach einer halben Stunde in der Kälte läßt man über Nacht bei Zimmertemperatur stehen. Das Lösungsmittel wird im Vakuum einer Vakuumpumpe bis auf 50 ml eingeengt und filtriert. Dem Filtrat wird langsam Wasser zugesetzt und durch Rühren bzw. Schütteln erfolgt Ausfällung des Tripeptids Z.Gin(Mbh)-Gly-Gly.OMe (5) in Form eines weisen

20 Pulvers. Nach Abfiltrieren wird der Niederschlag zweimal mit 100 ml η-Lösung KHCO₃, zweimal mit 100 ml Wasser, zweimal mit 100 ml KHSO₄, zweimal mit 100 ml Wasser, dann zweimal mit 100 ml Äthylacetat und mit Äther gewaschen. Nach Trocknung im Exsikkator werden 8,6 g

Z.Gin(Mbh)-Gly-Gly.OMe (5) (Ausbeute 90%) erhalten.

Eine kleine Menge des Produktes wird in AcOÄt gelöst. Umkr is tall isation aus DMF/H₂O, F = 189-191° C, C¹³Sk = +1,85° (C = 1, DMF). Nach Dünnschichtchromatographie über Silicagel in den Mischungen A und B ist das Produkt homogen und wird direkt in der nächsten Stufe verwendet.

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Durch8,3 g Z.Gin(Mbh)-Gly-Gly.OMe (5), das auf diese Weise erhalten wurde, in Lösung in 500 ml heißen Methanol mit Gehalt an 5 ml CH-.COOH, 5 ml Wasser und 1 g Pd/C (5%), wird ein Wasserstoffstrom solange geleitet, bis kein Ausgangsprodukt (überprüfung durch Dünnschichtchromatographie) mehr vorhanden ist, wobei

* dieses etwa 6stündiger Hydrierung entspricht. Der

Katalysator wird über Celit und Fritte abfiltriert; dann wird mit Methanol gespült. Das Filtrat wird im

Wasserstrahlvakuum abgezogen; der Rückstand wird einige Male mit Methanol, das anschließend abgezogen wird, aufgenommen. Wenn das Produkt trocken ist, wird es in 50 ml Methanol gelöst und mit Äther ausgefällt. Auf diese Weise wird das Acetat von GIn(Mbh)-Gly-Gly.

OMe (6) in Form eines weissen Pulvers in 90 %iger Ausbeute erhalten. Das Produkt wird unmittelbar in der folgenden Stufe verwendet.

Stufe c) Herstellung von Z .Ser (But) -Gin (Mbh)-Gly-GIy.OH (8)

20 Zu 2,95 g Z.Ser(But) (von Fluka),in Lösung in

100 ml DMF mit Gehalt an 1,1 ml NMM und 1 ml Äthylchlorcarbonat (von Fluka) werden nach Abkühlung 5,6 g Acetat des GIn(Mbh)-Gly-Gly.OMe (6), das in 50 ml DMF mit Gehalt an 1,2 ml NMM gelöst ist, zugesetzt.

Die Folge der Verfahrensschritte ist identisch mit der bei der Isolierung des Tripeptids Z.Gin(Mbh)-Gly-Gly. OMe.

Es werden 6,5 g Z.Ser(But)-GIn(Mbh)-Gly-Gly.OMe (7) (Ausbeute 85 %), F = 199-202° C,Zers.(o<J_D = + 3,2^P

30 (c = 1, DMF) erhalten. Nach Chromatographie in den

* Genauer ausgedrückt handelt es sich bei diesen Hydrierungen um Hydrogenolysen.

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Mischungen A und B ist das Produkt homogen und wird unmittelbar in der folgenden Stufe weiterverwendet.

Zu 5 g des auf diese Weise erhaltenen Z.Ser(But)-Gln(Mbh)-Gly-Gly.OMe (8), in Lösung in 350 ml Methanol ( 90%), werden unter starkem Rühren 10 ml einer n-Lösung NaOH zugesetzt. Die trübe Lösung wird fortschreitend klarer. Die Verseifung ist nach 2 Stunden beendet. Es werden 1000 ml Wasser zugesetzt und man säuert mit Essigsäure an. Nach 2 Stunden in der Kälte wird ein solvatisierter Niederschlag erhalten. Der Niederschlag wird filtriert und mit Wasser gespült. Das Produkt wird in 300 ml AcOÄt suspendiert und filtriert. Nach mehrmaligem Spülen mit Äther wird ein erster Niederschlag von 3,4 g Z.Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-

15 GIy.OH (8) erhalten. Nach Konzentrieren des Filtrats werden 0,8 g eines Zweitniederschlags erhalten. Die beiden Fraktionen sind identisch (Ausbeute 85%). Umkristallisation aus MeOH/Äther (solvatisiertes Produkt). F = 170-172° C, £xj _D = + 2,6° (C = 1, DMF) . Nach Chro-

matographie in den Mischungen C und D ist das Produkt homogen.

Stufe d) Herstellung von Z.Ser(But)-GIn(Mbh)-GIy-

Gly-Ser(But)-Asn.OBut (9) 1. Herstellung des Dipeptidfragments Ser(But) Asn OBut (2)

25 Zu 2,95 g handelsüblichen Z.Ser(But) (von Fluka) in Lösung in 50 ml THF und nach Abkühlung auf -15 oder -20° C werden 1 ml Athylchlorcarbonat und 1 ml NMM (von Fluka) zugesetzt. Nach 15 Minuten werden 2,6 g des Acetats von Asn.OBut (nach D.Schnabel und H. Schussler,

Liebigs Ann. Chem. 685 (1965), 229)in Lösung in 50 ml

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THF mit einem Gehalt an 2 ml NMM zugesetzt. Nach einer halben Stunde in der Kälte wird das Produkt 16 Stunden bei Zimmertemperatur aufbewahrt. Das Lösungsmittel wird im Rotavapor unter Wasserstrahlvakuum abgezogen. Der Rückstand wird mit 100 ml AcOÄt extrahiert und die organische Lösung dann nacheinander mit 20 ml n-Lösung KHSO₄, 20 ml Wasser, 20 ml η-Lösung KHCO₃ und zweimal mit 20 ml Wasser gewaschen. Nach Trocknung über MgSO. wird das Lösungsmittel im Rotavapor unter Wasserstrahl-

10 vakuum abgezogen. Es wird ein farbloses öl erhalten, das nach Verreiben mit Petroläther fest wird.

Auf diese Weise werden 4,2 g des geschützten Dipeptids Z.Ser(But)-Asn.OBut (1) erhalten. Nach Umkristallisation aus AcOÄt/Petroläther weist das Produkt fol-

15 gende Parameter auf: F = 117-119° C, |V/_D = + 2,0 (C

= 1, DMF). Nach Dünnschichtchromatographie über Silika gel in den Lösungsmittelmischungen A und B ist das Produkt homogen. Zu 4 g Z.Ser(But)-Asn.OBut, das auf diese Weise erhalten wurde, und das in 60 ml Methanol gelöst

20 ist, werden 2 ml Wasser, 2 ml CH₃COOH und 0,4 g Pd/C

(5%) zugesetzt. Die Hydrierung wird bis zum Verschwinden des Ausgangsprodukts (etwa 4 Stunden) durchgeführt. Nach Filtrieren und Konzentrieren im Rotavapor wird das Produkt einige Male in Methanol aufgenommen und wieder konzentriert, bis man ein trockenes Produkt erhält. Weitere Trocknung erfolgt im Exsikkator. Der Umsatz des Acetats von Ser(But)"Asn.OBut (2) ist quantitativ. Nach Dünnschichtchromatographie über Silikagel in den Lösungsmittelmischungen C und E ist das Produkt homogen und wird unmittelbar für die Synthese des Hexapeptids

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Ser-Gln-Gly^-Gly-Ser-Asn weiterverwendet ^ 2.Hersteilung des Hexapeptidfragments (9)

Zu 1,68 g Z.Ser(But)-Gln(Mbh)-Gly-Gly.OH (8) gemäß Stufe c) in Lösung in 20 ml DMF mit Gehalt an 0,25 ml NMM und 0,28 ml Isobutylchlorcarbonat (von Fluka), werden nach Abkühlen über 5 Minuten 0,98 g des Acetats von Ser (But) -Asn.OBut (2) (s. Stufe d) 1 )_t in Lösung in 10 ml DMF mit Gehalt an 0,5 ml NMM,zugesetzt.

Die folgenden Verfahrensschritte sind identisch mit denen der Herstellung des Tripeptids Z.Gln(Mbh)-Gly-Gly. OMe (5). Es werden 2,07 g Z.Ser(But)-Gln(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn.OBut (9) (Ausbeute 87%) erhalten. Umkristallisation aus DMF/H₂O. F = 210-215° C, zers. C°0 _D = -3,2° (C = 0,75, DMF).
Stufe e) Herstellung des Acetats von Ser(But)-GIn

(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn.OBut (10) Durch1,74 g des Hexapeptidesters (9) gemäß Stufe d) in Lösung in 80 ml heißem MeOH mit Gehalt an 1 ml Wasser, 0,8 ml CH₃COOH und 0,25 g Pd/C (5%), wird ein Wasserstoffstrom solange geleitet, bis kein Ausgangprodukt mehr vorhanden ist. Anschließend wird entsprechend der Verfahrensweise zur Herstellung des Produkts (6) verfahren; Ausbeute 90%, Homogenes Produkt in Lösungsmittel C und E; Verwendung ohne weitere Reinigung in der folgenden Stufe. Stufe f) Herstellung von Z.Lys(BOC)-Ser(But)-Gin

(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn.OBut (11) Zu 0,6 g Z.Lys(BOC).DCHA, gelöst in 10 ml DMF, werden nach Abkühlung auf -20° C 0,165 ml NMM und 0,185 ml Isobutylchlorcarbonat zugesetzt. Dann werden 1,41 g des Hexapeptidacetats (10) gemäß Stufe e), in Lösung in 10 ml

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DMF mit Gehalt an 0,2 ml NMM zugesetzt; die Verfahrensweise ist die gleiche wie bei dem Tripeptid (5). Ausbeute 90%. Umkristallisation aus MeOH/Ä'ther. Homogenes Produkt in den Mischungen C, E und F. F = 208-211° C, zers.,f?0 _p = -3,2° (C = 0,75, DMF).

Stufe g) Herstellung des Acetats von Lys(BOC)-Ser

(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn.OBut (12) Durch 1,21 g des Heptapeptidesters (11) gemäß Stufe f) in Lösung in 30 ml MeOH mit Gehalt an 0,3 ml Wasser, 0,3 ml CH₃COOH und 0,1 g Pd/C (5%), wird ein Wasserstoffstrom geleitet; es wird in gleicher Weise verfahren wie bei dem Produkt (6). Es werden 1,05 g (Ausbeute 90 %) des Produktes in Form eines weissen Pulvers erhalten, das unmittelbar in der nächsten Stufe verwendet wird. Stufe h) Herstellung von Z.Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-

Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn.OBut (13) Zu 0,2 g Z.AIa (von Fluka), gelöst in 10 ml DMF, und mit einem Gehalt an 0,1 ml NMM und 0,117 ml Isobutylchlorcarbonat, werden 1,16 g des Acetats des Heptapeptids (12) gemäß Stufe g),in Lösung in 10 ml DMF mit Gehalt an 0,2 ml NMM, zugesetzt; es wird in gleicher Weise wie bei dem Derivat (5) verfahren. Nach Umkristallisation aus DMF/H₂O werden 0,961 g des homogenen Produktes in den Lösungsmitteln C, E und F erhalten. F = 210-215° C, zers.,[k]_D = -5,4° (C = 0,5, DMF).

Stufe i) Herstellung des Acetats von Ala-Lys(BOC) -

Ser (But) -Gin (Pbh) -Gly-Gly-Ser (But) -Asn .OBut (14) Dieses Produkt wird mit 90%iger Ausbeute nach der der Herstellung des Produkts (6) entsprechenden Verfahrensweise erhalten. Dieses Produkt, das in den Lösungsmittelmi-

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schlingen C und E homogen ist, wird unmittelbar in der folgenden Stufe weiterverwendet.

Stufe j) Herstellung von PyroGlu-Ala-Lys(BOC)-Ser

(But)-Gln(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn.OBut (15) Zu 0,162 g von PyroGlu.OTcp (nach J.C. Anderson, M. A. Barton, D.M. Hardy, G.W. Kenner, J. Preston und R.C. Sheppard, J. Chem. Soc. Serie C. 1967, S. 108), gelöst in 10 ml DMF, werden nach Abkühlung auf 0° C 0,65 g Acetat des Oktapeptidesters (14) gemäß Stufe i in Lösung in 10 ml DMF mit Gehalt an 0,11 ml NMM zugesetzt. Nach 1 Stunde im Eisbad läßt man über 20 Stunden auf Zimmertemperatur erwärmen. Das Lösungsmittel wird im Vakuum einer Vakuumpumpe auf die Hälfte des Volumens eingeengt; Durch langsame Zugabe von Wasser wird das Produkt ausgefällt. Nach Filtrieren des Niederschlags wird dieser mit 20 ml Wasser und dann mit 20 ml Äthylacetat und viermal mit 20 ml Äther gewaschen.

Das Produkt wird in Form eines weissen Pulvers mit 70%iger Ausbeute erhalten. Umkristallisation aus DMF/H₂O,

F= 224-228° C, zers., [«<] _D = -4,8° (C = 1,45, DMF). Homogenes Produkt in den Mischungen C, D und E; direkte Weiterverwendung in der folgenden Stufe.

Stufe k) Herstellung des freien Nonapeptids

PyroGlu-^Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (16) 0,10 g des geschützten Oktapeptidesters (14) werden in 5 ml einer Mischung aus Trifluoressigsäure und Anisol (10:1 v/v) gelöst. Nach 3 Stunden wird im Exsikkator bei Zimmertemperatur in Gegenwart von P₂Oc ^un<^ KOH konzentriert. Der Rückstand wird in 30 ml Wasser aufgenommen und die wässrige Lösung mit 10 ml AcOÄt und dann zweimal

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mit 1O ml Äther extrahiert. Durch Gefriertrocknung der wässrigen Phase wird das Produkt mit 80 bis 90%iger Ausbeute erhalten. Dieses Produkt ist in den Mischungen G und H homogen- Nach einstündiger Elektrorheophorese in einem Puffer mit einem pH-Wert von 2,3 (0,1 m Ameisensäure) durch ein Filterpapier Whatman Nr. 3 MM und unter Spannung von 1000 V (15-30 inA) zeigt sich ein einzelner Fleck bei -3,2 cm,der gegenüber Ninhydrin positiv ist.

10 Analyse der Aminosäuren nach saurer Hydrolyse: Asp 1,07; Ser 1,95; GIu 2; Gly 2; AIa 0,92.

BEISPIEL 2

Herstellung des Nonapeptids Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-15 Gly-Ser-Asn (18)

Stufe a) Herstellung von Z.Gln(Mbh)-Ala-Lys(BOC) -

Ser (But) -Gin (Mbh) -Gly-Gly-Ser (But) -Asn .O But (17) Zu 0,121 g Z.Gln(Mbh) (nach W. Köning und R. Geiger, Chem. Ber. 103 (1960), 2041), gelöst in 10 ml DMF, werden nach Abkühlung auf -20° C 0,027 ml NMM und 0,031 ml Isobutylchlorcarbonat zugesetzt. Dann wird dieser Mischung nach Abkühlung 0,27 g Acetat des Oktapeptids (14) gemäß Stufe i) nach Beispiel 1, gelöst in 10 ml DMF mit Gehalt an 0,027 ml NMM zugesetzt. Nach 30 Minuten in der Kälte wird das Produkt 14 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Lösungsmittel wird auf 5 ml eingeengt; dann werden 50 ml Wasser langsam zugegeben, wobei ein feiner Niederschlag ausfällt, der filtriert und zweimal mit 10 ml η-Lösung KHCO₃, zweimal 10 ml Wasser, zweimal 10 ml n-Lösung KHSO., zweimal 10 ml Wasser und dann mit 20 ml

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AcOÄt und, dann mit Äther gewaschen wird. Das Produkt wird, in heißem Methanol aufgenommen. Das Produkt, das unlöslich bleibt, ist der geschützte Nonapeptidester. Nach Filtrieren und Spülen mit Äther werden 0,2 g (Aus-5 beute 50%) des Produkts erhalten. F = 221-225° C, C^ = -5,8° (C = 0,6, DMF). Homogen in der Mischung E. Stufe b) Herstellung des freien Nonapeptids

Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (18)
100 mg des geschützten Nonapeptidesters (17) ge-

10 maß Stufe a) werden in 5 ml der Mischung Trifluoressigsäure/Anisol (10:1 v/v) gelöst. Nach 3 Stunden wird die Mischung im Exsikkator im Vakuum in Gegenwart von P_?Oc und KOH konzentriert. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser aufgenommen und die wässrige Lösung mit 10 ml AcOÄt und

zweimal mit 10 ml Äther gewaschen. Die wässrige Phase wird auf etwa 1 ml konzentriert. Die wässrige Lösung
des Peptids Z.Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn ergibt bei der Rheophorese einen einzigen Fleck in den
Mischungen G und H und unter den gleichen Bedingungen

20 wie bei dem Produkt (16) gemäß Stufe k) nach Beispiel 1; es zeigt sich gegenüber Ninhydrin ein einziger Fleck, der in dem Puffer mit dem pH-Wert = 2,5 auf -2,7 cm wandert.

Der Lösung werden 10 ml MeOH, 0,1 ml Essigsäure

und 10 mg Pd/C (5%) zugesetzt; für 4 Stunden wird ein Wasserstoffstrom durchgeleitet. Nach Abfiltrieren des Katalysators wird in Wasserstrahlpumpenvakuum konzenziert. Der Rückstand wird in 20 ml Wasser aufgenommen und die wässrige Lösung zweimal mit 10 ml Äther gewa-

30 sehen. Durch Gefriertrocknung der wässrigen Phase wird

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das Produkt gewonnen. Es ist in den Mischungen G und H homogen und ergibt unter den vorher beschriebenen Bedingungen bei der Rheophorese einen einzigen Fleck, der bei einem pH-Wert von 2,5 auf -5,8 cm wandert. Analyse der Aminosäure nach saurer Hydrolyse (gesamt) : Asp 0,98; Ser 1,62; GIu 1,95; GIy 2,00; AIa 1,02.

BEISPIEL 3

Herstellung des freien Hexapeptids Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn Dieses Peptidfragment, das dem C-terminalen Hexapeptid des Thymusfaktors des Serums entspricht, wird, ausgehend von dem Derivat Z.Ser(But)-Gln(Mbh)-Gly-Gly-Ser (But)-Asn.OBut gemäß Stufe d) nach Beispiel 1 durch Eliminieren der temp orären Schutzgruppen unter den zuvor für das Peptid (16) gemäß Stufe k) nach Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen erhalten. Das erhaltenen Produkt ist in den Mischungen G und H homogen.

Analyse der Aminosäuren nach saurer Hydrolyse (gesamt) : Asp 1,02; Ser 1,75; GIu 1,0; GIy 2,00.

BEISPIEL 4

Herstellung des freien Heptapeptid Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-

Ser-Asn Diese Peptidfragment entspricht dem C-terminalen

Heptapeptid des Thymusfaktors des Serums. Er wird, ausgehend von dem Derivat Z.Lys(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn.OBut (11) gemäß Stufe f) nach Beispiel 1, durch Eliminierung der temporären Schutzgruppen unter den Bedingungen, wie sie zuvor für das Peptid (16)

30 gemäß Stufe k) nach Beispiel 1 beschrieben wurden,

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hergestellt. Das Produkt ist in den Lösungsmitteln G und H homogen und ergibt bei der Rheophorese unter den gleichen Bedingungen, wie sie für die Produkte (16) und (18) beschrieben wurden, einen einzigen Fleck, der beim 5 pH-Wert von 2,5 auf -6,25 cm wandert.

Analyse der Aminosäuren nach saurer Hydrolyse (gesamt) ; Asp 1,04; Ser 1,73; GIu 1,03; GIy 2,00.

BEISPIEL 5

10 Herstellung des freien Oktapeptids Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (38)

Dieses Fragment entspricht dem C-terminalen Oktapeptid des Thymusfaktor des Serums. Es wird wie die zuvor beschriebenen Fragmente, ausgehend vom entsprechenden geschützten Derivat (13) gemäß Stufe h) nach Beispiel 1 erhalten. Dieses Produkt ist in den Mischungen G und H homogen und ergibt bei der Rheophorese unter den beschriebenen Bedingungen einen einzelnen Fleck der auf -4,65 cm bei einem pH-Wert von 2,5 wandert.

Analyse der Aminosäure nach saurer Hydrolyse (gesamt) : Asp 1,0; Ser 0,94; GIu 1,02; GIy 2,00; AIa 0,96. Das gleiche freie Oktapeptid kann durch Einwirkung des handelsüblichen Pyroglutamylaminopeptiddaseenzyms

25 auf das synthetische Nonapeptid PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn und Trennung der enzymatischen Hydrolyseprodukte durch präparative Rheophorese über Whatmanpapier Nr. 3 MM erhalten werden.

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BEISPIEL· 6

Herstellung des freien Oktapeptids PyroGlu-Ala-Lys-Ser-

Gln-Gly-Gly-Ser (42)

Dieses Fragment entspricht dem N-terminalen Oktapeptid des FTS. Es wird über die folgende stufenweise Synthese erhalten;

Stufe a) Herstellung des Tripeptidderivats BOC.

Gln-Gly-Gly.OMe (19)

Zu 10,96 g BOC.Gin.ONp (von der Fa. Serva) in Lösung in 10 ml DMF mit Gehalt an 4,18 ml Triäthylamin werden 6,15 g des Acetats von Gly-Gly.OMe (4) gemäß Stμfe a) nach Beispiel 1 zugesetzt. Nach Rühren der Mischung bei Zimmertemperatur über Nacht wird das DMF im Vakuum einer Vakuumpumpe abgezogen und der Rückstand in 125 ml Wasser gelöst. Die wässrige Lösung wird viermal mit Äther gewaschen; dann wird die Lösung mit NaCl gesättigt; dann wird das Produkt mit insgesamt 2,5 Äthylacetat extrahiert. Die Äthylacetatlösung wird zur Trocknung eingeengt und der Rückstand im Exsikkator über H₃SO₄ getrocknet. Nach Anreiben des Rückstands mit Äther werden 8,65 g (Ausbeute 87%) BOC.Gln-Gly-Gly.OMe in Form eines hygroskopischen Pulvers erhalten, das in der folgenden Stufe unmittelbar weiter verwendet wurde. Das Produkt ist nach Dünnschichtchromatographie in der Mischung J (MeOH/AcOÄt, 1;2) homogen.

Stufe b) Herstellung des Trifluoracetats von

Gln-Gly-Gly.OMe (20)

Man stellt das Derivat (20) her, indem man von 8,65 g des Derivats (19) gemäß Stufe a) ausgeht, mit 125 ml 95%iger Trifluoressigsäure bei Zimmertemperatur

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ANVAR P 743

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über 15 Minuten umsetzt und die Säure in Vakuum abzieht. Nach Einreiben mit Äther wird, das Produkt fest, Umkristallisation aus Methanol/Äthylacetat. Es werden 7,25 g (81% Ausbeute) des Produktes erhalten. Homogenes Produkt nach Dünnschichtchromatographie in der MischungC ButOH/CH₃COOH/H₂O (3:1:1). F = 165-167° C, [°^1_D = + 13,8° (C = 1, MeOH).

Stufe c) Herstellung des Tetrapeptidderivats Z.Ser(But)-Gln-Gly-Gly.OMe (21)

10 12,57 g Z.Ser(But)DCHA (von Fluka) werden nach Spagenberg et al. (Hoppe Seyler, Zts. Physiol. Chem. 1971, _352, 655) entsalzt.

Zu dem in 100 ml THF gelösten Rückstand werden 3,7 ml Triäthylamin und nach Abkühlung der Lösung auf

-15° C 2,3 ml Ätliylchlorcarbonat zugesetzt. Nach 5 Minuten werden 8,54 g Trifluoracetat von Gln-Gly-Gly.0Me (20) gemäß Stufe b) und 3,1 ml Triäthylamin, das zuvor in einer Mischung aus DMF und THF gelöst wurde, zugesetzt.

Das Produkt wird unter Rühren bei Zimmertemperatur sich selbst überlassen. Nach Abfiltrieren des gebildeten Triäthylaminchlorhydrats wird das THF unter Wasserstrahlvakuum abgezogen; dann werden der verbleibenden Lösung 200 ml m-KHCO₃ zugesetzt. Durch Extraktion der Mischung

mit einem Liter Chloroform wird eine chloroformische Lösung erhalten, die mit mit NaCl gesättigtem Wasser, mit n-KHSO. und mit Wasser bis zur Neutralreaktion gewaschen wird.

Nach Einengen der Chloroformlösung zur Trockne

wird der Rückstand im Exsikkator über H₃SO₄ getrocknet.

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ANVAR P 743

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Durch Kristallisation des Rückstands in der Methanol/ Äthermischung ist das Produkt in der Mischung MeOH/ AcOÄt{1:2}jünnschichtchromatographisch homogen. Es werden 9,1 g (Ausbeute 75%) des Produktes erhalten. Nach Umkristallisation aus DMF/Äther beträgt F = 163-167° C, [cC] _D = + 3,4° (C = 1,16, DMF) .

Stufe d) Herstellung des Acetats von Ser(But)-GIn-

Gly-Gly.OMe (22)
3,3 g Z.Ser(But)-Gln-Gly-Gly.0Me (21) gemäß Stufe

c) in Lösung in 150 ml MeOH mit Gehalt an 1,5 ml Wasser und 1,5 ml CH₃COOH werden in Gegenwart von Pd/C (5%) über 5 Stunden hydriert. Dann wird, wie bei dem Produkt (6), gemäß Stufe b) nach Beispiel 1 verfahren. Das sehr trockene Produkt wird einige Male mit Äther gespült (Ausbeute 2,8 g). Das Produkt ist in den Lösungsmittelmischungen C und E dünnschichtchromatographisch homogen.

Stufe e) Herstellung des Derivats Z.Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly.OMe (23)

Zu einer Lösung von 1,9 g Z.Lys(BOC) in 30 ml DMF werden nach Abkühlen auf -15° C 0,55 ml NMM und 0,65 ml Isobutylchlorcarbonat zugesetzt. Nach 5 Minuten wird eine kalte Lösung von 2,4 g Acetat des Ser-(But)-Gln-Gly-Gly.OMe (22) nach Stufe d) und 1 ml NMM in 30 ml DMF zugesetzt. Nach 30 Minuten bei-15 ° C und einer Nacht bei Zimmertemperatur werden 1 Liter Chloroform und 200 ml n-KHCO., zugesetzt. Nach Rühren und Absetzen wird die Chloroformphase abgetrennt, die zweimal mit 100 ml Wasser gewaschen wird. Die wässri-

30 gen Phasen werden erneut mit einem Liter Chloroform

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ANVAR P 74J

2B22951

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extrahiert. Die organischen Phasen werden vereinigt undüber MgSO₄ getrocknet. Die Chloroformlösung wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit Äther angerieben. Es werden 2,9 gweisses Pulver erhalten (Ausbeute 75%). 5 Das Produkt ist dünnschichtchromatographisch in den Mischungen I und J homogen. F = 194-198° C zers., m =-1,9° (C = 2, DMF).

Stufe f) Herstellung des Acetats von Lys(BOC)-Ser

(But)-Gln-Gly-Gly.OMe (24)

10 2,9 g des Derivats (23) gemäß Stufe i) werden, wie zuvor beschrieben, in 50 ml MeOH, 0,5 ml CH₃COOH und 0,5 ml Wasser in Gegenwart von 50 mg Pd/C (5%) über 5 Stunden hydriert. Es werden 2,8 g eines dünnschichtchromatographisch homogenen Produktes in den Lösungs-15 mitteln C und E erhalten, das in der nächsten Stufe unmittelbar weiterverwendet wird.

Stufe g) Herstellung von Z.Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-

Gln-Gly-Gly.OMe (25)

Zu einer Lösung von 0,892 g Z.AIa in 30 ml DMF bei -15° C werden 0,522 ml Isobutylchlorcarbonat und 0,44 ml NMM zugesetzt. Nach 5 Minuten wird eine Lösung von 70 ml DMF mit Gehalt an 2,8 g des Acetats von Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly.OMe (24) gemäß Stufe f) und 0,8 ml NMM zugesetzt. Nach 30 Minuten in der Kälte läßt man das Produkt eine Nacht bei Zimmertemperatur stehen und konzentriert die Lösung im Vakuum einer Vakuumpumpe auf ein Volumen von 50 ml. Dann werden langsam 450 ml Wasser zugesetzt. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert, und mit Wasser, dann mit einer η-Lösung KHCO-. und erneut mit Wasser ge-

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ANVAR Γ 743

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waschen. Es wird mit Äther gespült und im Exsikkator getrocknet. Es werden 2,7 g (Ausbeute 80%) eines in den Lösungsmitteln F und J dünnschichtchromatographisch homogenen Produktes erhalten. F = 210-220° C 5 zers., W₀= ¹'⁷° (C = 2,2, DMF).

Stufe h) Herstellung von Z.Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-

GIn-GIy-GIy-NHNH₂ (26)

2,3 g des Derivats (25) gemäß Stufe g) werden in 150 ml Methanol unter Erhitzen gelöst. Nach Abkühlen werden 2,6 ml Hydrazinhydrat (98%) zugesetzt; die Lösung wird heftig gerührt. Nach Stehenlassen bei Zimmertemperatur über Nacht wird auf -20° C abgekühlt und der erhaltene Niederschlag abfiltriert. Dieser erste Niederschlag wird mit Äther gewaschen. Die Mutterlösungen werden konzentriert: Der zweite Niederschlag wird mit Äther angerieben. Die erhaltenen Produkte sind identisch: nach Trocknen im Exsikkator über H₂SO. führen sie zu 2,2 g eines in den Lösungsmittelgemischen I und J dünnschichtchromatographisch homogenen Produktes.

20 F= 191-195° C, zers., OOf _D = -3,8° (C = 2,2, DMF).

Stufe i) Herstellung von Z.Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-

Gln-Gly-Gly-Ser(But).OBut (39)

Zu einer Lösung von 0,85 g des Derivats (26) gemäß Stufe h) in 30 ml DMF werden nach Abkühlung auf -40° C 0,63 ml (5 Äquivalente) einer wasserfreien Lösung von HCl/THF (8 n) und 0,16 ml Isoamylnitril zugesetzt. Die Lösung wird unter Rühren bei -40° C 30 Minutenlang gehalten; dann werden T,4 ml Triäthylamin und 0,366 g des Chlorhydrats von Ser(But).OBut gemäß E. Schroeder (Liebigs Ann. Chem 1963. 127 S. 670) zu

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ANVAR P

41 -

gesetzt. Nach einer Stunde bei -40° C läßt man das Produkt 48 Stunden in einer Kühltruhe stehen. Im Vakuum einer Vakuumpumpe wird auf ein Volumen von 10 ml eingeengt; dann werden langsam 200 ml Wasser zugesetzt. Nach 4 Stunden in der Kälte wird der 5 Niederschlag abfiltriert und zunächst mit Wasser und dann

mit Äther gewaschen. Man erhält ein weißes Pulver, das in den Mischungen E, F und J dünnschichtchromatographisch homogen ist. Umkristallisation aus Methanol/Äther. F = 225-230° C, zers., £«J _D = -4,0° (C = 1,0, DMF).
Stufe j) Herstellung des Acetats von Ala-Lys(BOC) -

Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But).OBut (40) Dieses Derivat wird ausgehend von 0,5 g des Derivats (39) gemäß Stufe i) unter den zuvor für die Derivate (22) und (24) (Stufe d) und f)) beschriebenen Bedingungen hergestellt. Quantitativer Umsatz. Homogenes Produkt nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischungen C und E; direkte Weiterverwendung in der folgenden Stufe.

Stufe k) Herstellung von PyroGlu-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But).OBut (41)

Zu einer Lösung von 0,25 g des Produktes (40) gemäß Stufe j) in 10 ml DMF werden nach Abkühlung auf 0° C 0.03 ml NMM und nach 5 Minuten 0,088 g PyroGlu. OTcp (nach J.C. Anderso et al. J. Chem. Soc. C. 1967 S. 108) zugegeben. Nach 30 Minuten in der Kälte läßt man das Produkt 18 Stunden bei Zimmertemperatur stehen. Im Vakuum einer Vakuumpumpe wird die Lösung konzentriert. Der Rückstand wird in derWärme mit Äthylacetat und dann mit Äther behandelt. Es werden 0,195 g (70% Ausbeute) erhalten, umkristallisation aus Methanol/

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ANVAR ρ 7^3

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Äther: homogenes Produkt nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischungen E, F und J. F = 219-222° C,|V]_D = -3,0° (C = 0,9, DMF).

Stufe 1) Herstellung des freien Oktapeptids Pyro-5 Glu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser (42)

0.020 g des Derivats (41) gemäß Stufe k) werden in 5 ml einer Mischung von CF^COOH/Anisol (10:1 v/v) gelöst. Nach 3 Stunden bei Zimmertemperatur wird das Produkt in Exsikkator in Vakuum konzentriert. Der Rück-

stand wird in 40 ml Wasser aufgenommen. Es wird mit 20 ml Äthylacetat und 20 ml Äther extrahiert. Die wässrige Phase wird gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt ist nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischung G und H homogen. Bei der Rheophorese in einem Puffer von Ph-Wert 2,3 (0,1 m Ameiensäure) über Whatmannpapier Nr. 3 MM und unter einer Spannung von 1000 V (15-30 mA) ergibt sich ein einziger Fleck bei -2,9 cm.

Analyse der Aminosäuren nach der saurer Hydrolyse

(gesamt): Ser 1,87; GIu 1,92; GIy 2,00; Ala 1,01.

BEISPIEL 7

Herstellung des Oktapeptidanalogen D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (45)
Diese Strukturanaloge entspricht dem C-terminalen Oktapeptid (38) , das in Beispiel 5 beschrieben wurde, mit dem einzigen Unterschied, daß der Rest L- AIa durch den Rest D-AIa ersetzt ist. Es wird über die folgenden Synthesestufen erhalten: Stufe a) Herstellung des Derivats Z.D-Ala-Lys

(BOC)-Ser(But)Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn.OBut (43)

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ANVAR P 741^J

- 43 -

Zu einer Lösung von 0.03 g Z,D-AIa (hergestellt nach M. Bergmann und L. Zervas, Ber. 1932, 6_5, 1192) in Lösung in 1 ml DMF werden nach Abkühlen auf -15° C unter Rühren 0,015 ml NMM und 0,018 ml Isobutylchlorcarbonat und dann nach 5 Minuten eine Lösung von 0,172 g des Acetats von Lys(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn.OBut (12), dessen Herstellung gemäß Stufe g) nach Beispiel 1 erfolgt, und 0.03 ml NMM in 5 ml DMF zugesetzt. Nach 30 Minuten bei -15° C läßt man das Produkt bei Zimmertemperatur eine Nacht stehen. Die Lösung wird auf ein Volumen von 1 ml konzentriert und langsam mit 20 ml einer 10%igen Lösung Zitronensäure versetzt. Der sich bildende Niederschlag in Form eines feinen Pulvers wird filtriert und einige Male mit Wasser und dann mit einer η-Lösung KHCO- und noch einmal mit Wasser gewaschen. Dann wird einige Male mit Äther gespült und im Vakuum im Exsikkator getrocknet. Es werden 0,165 g des Produktes in Form eines feinen Pulvers (Ausbeute 85%) erhalten.

ümkristallisation aus Methanol/Äther. Homogenes Produkt nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischungen D, E und F; F = 211-215° C, zers.,fc<J = -3,3° (C = 0,45, DMF).

Stufe b) Herstellung des Acetats von D-Ala-Lys (BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)

Asn.OBut (44)

0,11g des Derivats (43) gemäß Stufe a) werden un-« ter den beschriebenen Bedingungen in 10 ml MeOH, 0,1 ml CH₃COOH und 0,1 ml Wasser und in Gegenwart von 10 ml

30 Pd/C (5%) über 4 Stunden hydriert. Es wird ein homogenes

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ANVAR P 741

28229S1

- 44 -

Produkt erhalten, das unmittelbar in der folgenden Stufe weiterverwendet wird.

Stufe c) Herstellung des freien Oktapeptids

D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (45) Ausgehend von dem Derivat (44) gemäß Stufe d) wird das freie Oktapeptid erhalten, in dem gemäß dem beschriebenen Verfahren zur Herstellung des Nonapeptids PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Asn (16) gemäß Stufe k) nach Beispiel 1 verfahren wurde.

Es wird ein homogenes Produkt nach Dünnschichtchromatographie in den Mischungen G und H erhalten. Bei der Rheophorese unter den für das Peptid (42) gemäß Stufe 1) nach Beispiel 6) beschriebenen Bedingungen wird ein einziger Fleckerhalten, der nach —4,65 cm wandert.

Analyse der Aminosäuren nach saurer Hydrolyse (gesamt): Asp 1,02; Ser 1,77; GIu 1,0; GIy 2,00; AIa 0.91.

BEISPIEL 8

Herstellung des Nonapeptidanalogen PyroGlu-D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (47)

DiesesStrukturanaloge entspricht dem Nonapeptid
(16) nach Beispiel 1 und besitzt die Struktur des Thy-25 mushormons mit dem einzigen Unterschied, daß der Rest L-AIa durch den Rest D-AIa ersetzt ist. Es wird durch Synthese aus dem Derivat (44) gemäß Stufe b) nach Beispiel 7 in den folgenden Stufen hergestellt:

Stufe a) Herstellung von PyroGlu-D.AIa-Lys(BOC) Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn.

OBut (46)

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ANVAR ? 74?

- 45 -

Zu einer Lösung von 0.104 g des Acetats von Lys (BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn.OBut (44) das zuvor bei der Stufe b) in Beispiel 7 beschrieben wurde, in 3 ml DMP werden nach Abkühlen auf 0⁰C 30μ1 NMM und dann nach 5 Minuten eine Lösung von 29 mg PyroGlu OTcp (nach J.D. Anderson et al. J. Chem. Soc, C, 1967 S. 108) in 5 ml DMF zugegeben. Das Produkt wird 24 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen und dann auf ein Volumen von 1 ml konzentriert; dann

10 werden langsam 20 ml Wasser bis zum Auftreten eines

feinen Niederschlags, der abfiltriert wird, zugegeben. Nach Spülen mit Äthylacetat und Äther werden 0,078 g (Ausbeute 70%) eines homogenen Produktes nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischungen

15 C, D und E erhalten. F = 210-215° C, (<*■] _D = -5,0° (C = 0,4, DMF).

Stufe b) Herstellung des freien Nonapeptids (47) Aus dem vorhergehenden Derivat (46) wird das freie Nonapeptid hergestellt, indem gemäß dem Verfahren zur Herstellung des Oktapeptids (45) und des Nonapeptids (16) verfahren wird. Es wird ein homogenes Produkt nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmitteln G und H erhalten. Bei der Rheophorese bei einem pH-Wert von 2,3 tritt ein einziger Fleck der nach -3,2 cm

25 wandert, auf.

Analyse der Aminosäure nach saurer Hydrolyse (gesamt) : Asp 0,97; Ser 1,67; GIu 1,84; GIy 2,00; AIa 0,98.

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ANVAR P 74 3

282295T

- 46 -

BEISPIEL 9

Herstellung des strukturanalogen Nonapeptids PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp (53)

Dieses Analoge entspricht den Nonapeptiden (16) und (30) und entspricht der Struktur des Thymushormons mit dem einzigen Unterschied, daß der C-terminale Rest L-Asparagin (Asn) durch den L-Asparaginsäurerest (Asp) ersetzt ist.

Es wird in folgenden Synthesestufen erhalten:

Stufe a) Herstellung des Derivats Z-Ser(But)-

Asp-di.OBut (48)

Zu einer Lösung von 0,295 g Z-Ser(But) (von Fluka) in 10 ml DMF werden nach Abkühlen auf -15° C 0,12 ml NMM und 0,13 ml Isobutylchlorcarbonat zugesetzt. Nach 5 Minuten werden 10 ml einer kalten Lösung DMF mit Gehalt an 0,54 g Asparagin-di-tert-butylester in Form des Dibenzosulfimidsalzes (von Fluka> und 0,15 ml NMM zugesetzt. Das Produkt wird unter Rühren 30 Minuten in der Kälte und eine Nacht bei Zimmertemperatur ge-

20 lassen. Dann wird die Lösung im Vakuum konzentriert und der Rückstand in 100 ml Äthylacetat aufgenommen. Es wird mit 50 ml einer η-Lösung KHSO₄, Wasser, n-KHCO., und erneut mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über MgSO. getrocknet und dann im Vakuum ein-

geengt. Es wird ein öl erhalten, das durch Zugabe von Petroläther kristallisiert. Nach ümkristallisation aus Petroläther werden 0,43 g (Ausbeute 80%) eines homogenen Produktes nach Dünnschichtchromatographie in der Mischung A'ther/Petroläther (1:1 v/v) erhalten.

F = 83-85° C, C<=SJ _n = -4,9° (C : 1,25, DMF).

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ANVAR ? 743

2822351

- 47 -

Stufe b) Herstellung des Acetats von Ser(But)-Asp-

di.OBut (49)

0,26 g des Derivats (48) , das gemäß Stufe a) hergestellt wurde, werden in 10 ml Methanol mit Gehalt an 0,1 ml CH₃COOH und 0,1 ml Wasser in Gegenwart von 0,1g Pd/C (5%) über 2 Stunden hydriert. Das Acetat von Ser (But)-Asp-di.OBut, das in quantitativer Ausbeute erhalten wird, ist nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischungen C und E homogen und wird in der folgenden Stufe unmittelbar weiterverwendet.

Stufe c) Herstellung von Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-

Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asp-di.OBut (50) Zu einer Lösung des Derivats Z-A3a-Lys(BOC)-Ser (BUt)-GIn-GIy-GIy-NHNH₂ (26) (erhalten gemäß Stufe h) nach Beispiel 6) in 10 ml DMF werden 0,175 ml einer 8 η-Lösung HCL/THF zugesetzt und auf -40° C abgekühlt. Dann werden 0,045 ml Isoamylnitrit zugesetzt; die Lösung wird 30 Minuten unter Rühren bei -40° C gehalten. Dann wird eine abgekühlte Lösung von 10 ml DMF mit Gehalt an 0,18 g des Acetats von Ser(But)-Asp-di.OBut (49) gemäß Stufe b) und 0,1 ml Triäthylamin zugesetzt. Das Produkt wird 30 Minuten bei -40° C und 48 Stunden in einer Kühltruhe stehengelassen. Dann wird die Lösung im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit 20 ml Wasser behandelt. Der Niederschlag wird abfiltriert und mit Äther gespült. Der Niederschlag wird in 5 ml Methanol aufgenommen, mit Äther ausgefällt und das erhaltene Pulver filtriert.

Durch ümkristallxsation aus Methanol werden 0,25 g (Ausbeute 75%) eines homogenen Produktes nach Dünnschicht-

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ANVAR P 74 3

- 48 -

Chromatographie in den Lösungsmittelmischungen I und J erhalten.

F = 220° C zers._f(ot]_D = -8,0° (C = 0,6, DMF). Stufe d) Herstellung des Acetats von Ala-Lys(BOC) Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asp di.OBut(51)

Die katalytische Hydrierung von 0,15 g des Derivats (50) gemäß Stufe c) in 10 ml Methanol mit Gehalt an 0,1 ml CH₃COOH und 0,1 ml Wasser und 10 mg Pd/C (5%) führt nach 3 Stunden zu einem homogenen Produkt nach Dünn-Schichtchromatographie in den Lösungsmitteln C und I, wobei der die Ausbeute quantitativ ist. Diese Produkt wird in der folgenden Stufe unmittelbar weiterverwendet. Stufe e) Herstellung von PyroGlu-Ala-Lys(BOC)-Ser (But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asp di.OBut (52) Zu einer Lösung von 0,126 g des vorhergehenden

Derivats (51), das in 4 ml DMF gelöst wird, werden nach Abkühlen auf 0° C 0,038 ml NMM und dann nach 5 Minuten 0,038 g PyroGlu 0 Tcp (nach J.C. Anderson et al. J. Chem. Soc, C. 1967 S 108) zugesetzt. Nach 30 Minuten in der Kälte und 24 Stunden bei Zimmertemperatur wird die Lösung im Vakuum konzentriert und der Niederschlag mit Wasser, dann mit Äthylacetat und anschließend mit Äther behandelt. Der Niederschlag wird abfiltriert, und in der kleinstmöglichen Menge warmen Methanols aufgenommen und mit Ä'ther ausgefällt. Durch Umkristallisation aus Methanol werden 0,085 g (Ausbeute 65%) eines homogenen Produkt in den Lösungsmittelmischungen C und I erhalten. F = 225° C zers. QJLj = -5,8° (C = 0,4, DMF) . Stufe f) Herstellung von PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-As£ (53)

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ANVAR τ> 743

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0.02 g des Derivats (52) gemäß Stufe e) werden in 5 ml einer Mischung von CF₃COOH/Anisol (10/1 v/v) gelöst und 3 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Lösung wird im Exsikkator konzentriert und der Rückstand in 40 ml Wasser aufgenommen; dann wird mit 20 ml Äthylacetat und 20 ml Äther extrahiert und die wässrige Phase gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt ist homogen nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmitteln G und H. Bei der Rheophorese unter den für das Peptid (42) nach Beispiel 6 beschriebenen Bedingungen ergibt ein einzelner Fleck, der nach -2,8 cm wandert.

Analyse der Aminosäuren nach saurer Hydrolyse (gesamt) : Asp 1,05; Ser 1,73; GIu 1,97; GIy 2,00; AIa 1,02.

15 BEISPIEL 10

Herstellung des Nonapeptidanalogen PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asn (59)

Dieses Analoge entspricht dem Nonapeptid mit der Struktur des Thymushormons mit dem einzigen Unterschied, daß der Rest Ser_o in der vorletzten Stellung durch den

Rest Ala ersetzt ist.

Es wird über die folgenden Synthesestufen hergestellt:

Stufe a) Herstellung des Derivats Z-Ala-Asn OBut (54) 0,461 g Z-AIa (von Fluka), in Lösung in THF, werden mit 0,23 ml NMM versetzt, dann auf -15° C abgekühlt und mit 0,25 ml Isobutylchlorcarbonat versetzt. Nach 5 Minuten werden eine THF-Lösung des Acetats von Asn OBut (nach E. Schnabel und H. Schüssler, Liebig's Ann. Chem.

30 1965, 685, 229) und 0,38 ml NMM zugesetzt. Nach einer

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ANVAR ι? 7 4 Γ-

- 50 -

Nacht bei Zimmertemperatur unter Rühren wird das Lösungsmittel abgezogen und der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen. Die organische Lösung wird mit einer m-Lösung KHSO₄/ dann mit Wasser, dann mit einer n-Lösung KHCO-, und erneut mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird über MgSO₄ getrocknet. Nach Abziehen des Äthylacetats wird ein Rückstand erhalten, der nach Zugang von Petroläther kristallisiert. Umkristallisation aus Äthylacetat/Petroläther. Es werden 0,635 g (Ausbeute 94%) eines homogenen Produktes in der Lösungsmittelmischung A erhalten.

F = 156-158° C (äJ = -9,0° (C = 1,13, DMF)
Stufe b) Herstellung des Acetats von Ala-Asn OBut (55) Eine Lösung von 0,25 g des Derivats (54) nach Stufe 15 a) in 15 ml Methanol, 0,5 ml CH₃COOH und 0,5 ml Wasser
mit Gehalt an 20 mg Pd/C (5%) wird über 5 Stunden hydriert. Nach Filtrieren durch eine Glasfritte und Celit wird zur Trocknung eingeengt und der Rückstand zunächst in Benzol und dann in Methanol aufgenommen. Quantitati-20 ver Umsatz zu einem homogenen Produkt nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischungen C und E.

Das erhaltene Produkt wird in der nächsten Stufe unmittelbar weiterverwendet.

Stufe c) Herstellung von Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ala-Asn OBut (56)

Zu einer Lösung von 0,28 g des Derivats Z-Ala-Lys (BOC)-Ser(But)-GIn-GIy-GIy-NHNH₂ (26) (nach Stufe h) nach Beispiel 6) in 10 ml DMF werden nach Abkühlung auf -40° C 0,208 ml einer 8 η-Lösung HCl/THF, dann 0,058 ml Isoamylnitrit zugesetzt. Nach 30 Minuten bei

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ANVAR P 74'

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-40° C werden 0,50 ml Triäthylamin und eine Lösung von 0,14 g des Acetats von Ala-Asn OBut (55) gemäß Stufe b) in 5 ml DMF zugesetzt. Nach 1 Stunde bei
-40° C unter Rühren wird das Produkt 48 Stunden in einer Kühltruhe stehengelassen. Die Lösung wird im Vakuum eingeengt und der Rückstand mit 20 ml Wasser und dann mit 20 ml Äthylacetat und anschließend mit 30 ml Äther behandelt. Nach Filtrieren wird ein weises Pulver erhalten, daß aus Methanol umkristallisiert. Das Produkt ist homogen nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischungen C und F = 210° C zers. ft) = -12,9° (C =0,9, DMF). Stufe d) Herstellung des Acetats von

Ala-Lys(BOC) -Ser (But) -Gln-Gly-Gly-Ala-AsnOBut (57)

15 0,115 g des Derivats (56) gemäß Stufe c) das in 10 ml Methanol, 0,1 ml CH₃COOH und 0,5 ml Wasser mit Gehalt an 10 ml Pd/C (5%) gelöst ist, werden über 4 Stunden hydriert. Es wird mit quantitativer Ausbeute ein Produkt erhalten, das nach Dünnschichtchro-

matographie in den Lösungsmittelmischungen C und E homogen ist und in der folgenden Stufe weiterverwendet wird.

Stufe e) Herstellung von PyroGlu-Ala-Lys(BOC)-Ser (But)-Gln-Gly-Gly-Ala-Asn OBut (58)

25 Zu einer Lösung von 0,10 g des Derivats (57) gemäß Stufe d) in 5 ml DMF werden nach Abkühlung auf 0° C 0,02 ml NMM und nach 10 Minuten 0,033 g PyroGlu-OTcp (nach J.C. Anderson et al. J. Chem. Soc, C. 1967 S. 108) zugesetzt. Nach 24 Stunden bei Zimmertemperatur

30 unter Rühren wird das Lösungsmittel im Vakuum abgezogen

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und der Rückstand in heißem Chloroform aufgenommen. Das gebildete Pulver wird abfiltriert und mit Äther gespült. Nach Umkristallisation in Methanol werden 0,065 g eines homogenen Produkts nach Dünnschicht-Chromatographie in den Lösungsmittelmischungen C und E erhalten.

F = 210° C zers., ^]₀= "13,7° (C = 0,95, DMF).

Stufe f) Herstellung des freien Nonapeptids (59)

Eine Lösung von 0,02 g des Derivats (58) gemäß 10 Stufe e) in 5 ml einer Mischung von CF₃COOH/Anisol

(10:1 v/v) werden nach 3 Stunden bei Zimmertemperatur unter Rühren in einem Exsikkator unter Vakuum konzentriert. Der Rückstand wird in 40 ml Wasser aufgenommen. Die wässrige Lösung wird mit 20 ml Äthylacetat und 20 ml Äther extrahiert. Die wässrige Phase wird gefriergetrocknet. Das erhaltene Produkt ist homogen nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischungen G und H.

Bei der Rheophorese unter den zuvor beschriebenen Bedingungen (für die Peptide (16), (36), (37), (38) etc.) ergibt sich ein einziger Fleck, der nach -3,15 cm wandert.

Analyse der Aminosäure nach saurer Hydrolyse (gesamt) : Asp 0,98; Ser 0,87; GIu 1,95; GIy 2,00; AIa 1,99. 25

BEISPIEL Π

Herstellung des Nonapeptids Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-

Gly-Ser-Asn (32) und der Derivate dieses Peptids.

Das Nonapeptid (32) ist dem Thymushormon mit dem einzigen Unterschied äquivalent, daß der N-termi-

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282295T

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nale Glutaminylrest durch den Pyroglutamylrest ersetzt ist.

Es wird über die folgenden Stufen hergestellt: Stufe a) Herstellung von Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn OBut (27)

Dieses Derivat ist dem Derivat (13) äquivalent, dessen Synthese zuvor (Stufe h) nach Beispiel 1) beschrieben wurde, wobei der Rest Gin nicht durch die 4-4-Dimethoxy-benzhydryl (Mbh) -Gruppe geschützt ist, und seine Herstellung erfolgt auf einem anderen Weg als die des Derivats (13) . Zu einer Lösung von 0,08 g Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-GIn-GIy-GIy-NHNH₂ (26) gemäß Stufe h) nach Beispiel 6, in 2 ml DMF werden nach Abkühlung auf 40° C 0.056 ml einer 8,3n-Lösung HCL/THF und dann 0,016 ml Isoamylnitrit zugesetzt. Nach 20 Minuten unter Rühren bei -40° C werden 0,13 ml Triäthylamin und 0.0445 g des Acetats von Ser(But)-Asn OBut (2) (hergestellt gemäß Stufe d) 1° nach Beispiel 1) zugesetzt. Das Produkt wird unter Rühren 2 Stunden bei -40° C und 48 Stunden bei -20° C stehengelassen. Das Lösungsmittel wird unter Vakuum abgezogen und der Rückstand mit Wasser behandelt. Nach Filtrieren wird das erhaltene Pulver im Exsikkator getrocknet. Das Produkt (69 mg, Ausbeute 64%) ist praktisch homogen nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelgemischen D und J.

F - 210° C_f zersetzt ohne Schmelzen. Diese Produkt wird in der folgenden Stufe unmittelbar weiterverarbeitet.

Stufe b) Herstellung des Acetats von Ala-Lys(BOC) -

Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn OBut (28)

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Eine Lösung von 0,0322 g des Derivats (27) gemäß Stufe a) in Lösung in 4 ml Methanol, 0,1 ml CH₃COOH und 0/.1 ml Wasser wird in Gegenwart von Pd/C (5%) hydriert. Nach Reaktionsende (kontrolliert durch Dünn-5 Schichtchromatographie) wird abfiltriert und das FiI-trat zur Trocknung eingeengt. Der Rückstand wird über P₃O₅ im Exsikkator getrocknet. Quantitativer Umsatz zu einem in dem Lösungsmittelgemisch J praktisch homogenen Produkt.

Das Produkt wird in der folgenden Stufe unmittelbar weiterverarbeitet.

Stufe c) Herstellung von BOC Gln-Ala-Lys(BOC)-Ser (BUt)-GIn-GIy-GIy-SER(BUt)-ASn OBut (31) Zu einer Lösung von 0,0278 g des Derivats (28) gemaß Stufe b) in 2 ml DMF werden 0,016 g BOC GIn-ONp (von Serva) und 6 μΐ Triäthylamin zugesetzt. Das Produkt wird unter Rühren eine Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen. Das Lösungsmittel wird im Vakuum abgezogen und der Rückstand in Äther aufgenommen. Es werden 28 mg (Ausbeute 78%) eines Produkts erhalten, daß nach Dünnschichtchromatographie schwach verunreinigt ist. 13 mg des Produktes werden aus Methanol/Wasser umkristallisiert. Es wird ein nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelgemischen C und J homogenes Produkt erhalten. F = 218° C, zers.

Stufe d) Herstellung des freien Nonapeptids (32) 2 ml des gereinigten Derivats (31) werden 3 Stunden mit 0,5 Trifluoressigsäure behandelt. Die Säure wird bei Zimmertemperatur im Exsikkator abgezogen und der Rückstand über P₂ ⁰S ^{und K0H} getrocknet. Das erhal-

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tene Produkt wird in Wasser gelöst und dreimal mit Äthylacetat gewaschen und dann gefriergetrocknet. In der Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischung H und G tritt zusätzlich zu dem Nonapeptid (32) ein sehr schwacher Fleck mit dem gleichen Rf-Wert wie das Nonapeptid PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (16) und (30) auf.

Bei der Rheophorese über Whatman 3 MM-Papier unter einer Spannung von 600 V über 45 Minuten in dem Puffer Wasser/Pyridin/Essigsäure: 1000/2,5/9 mit einem pH-Wert von 4,0wandert das Glutaminyl-Nonapeptid (32) auf -0,5 cm und die Verunreinigung (Pyroglutamyl-Nonapeptid) auf + 0,7 cm. In dem Ameisensäurepuffer (0.01 n) mit dem pH-Wert 2,3 wandert das Gln-Nonapeptid nach -4,9 cm und die Verunreinigung (pyroGlu-Nonapeptid) auf -2,2 cm. Analyse der Aminosäure nach saurer Hydrolyse (insgesamt) : Asp 1,12; Ser 1,99; GIu 2,00; GIy 2,10; AIa 1,06; Lys 0,82; NH₃ 3,45.

20 BEISPIEL 12

Herstellung von PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (30) aus dem Derivat (28) gemäß Stufe b) nach Beispiel

Zu einer Lösung von 0,0213 g des Derivats (28) in 2 ml DMF werden 10 mg PyroGlu OTcp (nach J.C. Anderson et al. J. Chem. Soc, C. 1967 S.108) und 5 μΐ Triäthylamin zugegeben. Das Produkt wird 24 Stunden unter Rühren bei Zimmertemperatur stehengelassen. Der gebildete Niederschlag wird abfiltriert und das DMF im Vakuum abgezogen und der Rückstand in Äthylacetat aufgenommen. Es

30 werden 14,2 mg (Ausbeute 57%) eines Produkts erhalten.

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das nach dünnschichtchromatographischer Untersuchung ein gegenüber Ninhydrin negative Verunreinigung aufweist, und das nach der Chlormsthode in den Lösungsmittelmischungen A und C auftritt. 5 mg des Produkts werden durch präparative Dünnschichtchromatographie (Silicatplatten von Merck mit einer Dicke von 2 mm) in der Lösungsmittelmischung C gereinigt. Das erhaltene Produkt ist in den Lösungsmitteln C und A chromatographisch rein und entspricht dem Derivat PyroGlu-Lys(BOC)-Ser (But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn OBut (29).

Aus diesem gereinigten Produkt wird das freie Nonapeptid PyroGlu-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (30) durch Behandlung mit einer 4 η-Lösung HCl/Äthylacetat erhalten. Nach Abziehen der Lösungsmittel und Trocknung über ^2^5 ^un<^ ^*¹ wird der Rückstand in Wasser und wieder aufgelöst und nach dreimaligem Waschen mit Äthylacetat der wässrigen Lösung wird das freie Peptid (30) durch Gefriertrocknung gewonnen. Das Produkt ist nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischungen

20 H und G rein.

Analyse der Aminosäuren nach saurer Hydrolyse (gesamt) : Asp 1,00; Ser 1,72; GIu 1,89; GIy 1,94; AIa =,96.

BEISPIEL 13

Herstellung des Derivats Z-Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (34)

Dieses Derivat wird aus dem Derivat (28) gemäß Stufe b) nach Beispiel 11 hergestellt.

Zu einer Lösung von 0,107 g des Derivats (28) in 5 ml DMF werden nach Abkühlung auf 0° C 0.03 ml NMM

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und dann nach 5 Minuten 0,04 mg Z-GIn OSu (nach J. Beacham et al. J. Amer. Chem. Soc. 1971, J33_, 5526) zugesetzt und bei Zimmertemperatur stehengelassen. Die Reaktionsmischung verdickt sich zu einer Masse. Unter Vakuum wird eingeengt und der Rückstand in der kleinstmöglichen Menge heißen Alkohols aufgenommen. Nach Abkühlung auf 0° C wird der Niederschlag filtriert und mit Äther gespült. Das erhaltene Produkt ist nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischungen C, E und I homogen.

Dieses Produkt entspricht dem Derivat Z-Gln-Ala-Lys (BOC)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn OBut (33). Aus diesem Derivat und durch Entfernung der temporären Schutzgruppen BOC und But durch CF-^COOH/Ani-

sol (10/1 v/v) unter den gleichen Bedingungen wie bei dem homologen Derivat (18) nach Beispiel 2 wird das Nonapeptidderivat Z.Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (34) erhalten.

Das auf diese Weise gebildete Produkt ist nach

20 Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittelmischungen G und H homogen. Bei der Rheophorese unter den für die anderen freien Nonapeptide beschriebenen Bedingungen tritt ein einzelner Fleck, der nach -2,7cm wandert, auf.

25 Analyse der Aminosäuren nach saurer Hydrolyse (gesamt) j Asp 1,02; Ser 1,89; GIu 1,92, GIy 2,00; AIa 0,94.

Durch katalytische Hydrierung des Nonapeptidderivat s (34) unter den bei der Herstellung des Nonapeptids (18) (Stufe b) nach Beispiel 2) beschriebenen Bedingun-

gen wird ein nach Dünnschichtchromatographie in den

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- 58 -

Lösungsmittelmischungen G und H homogenes Produkt erhalten, das mit dem Nonapep*tid (18) identisch ist, und das über einen anderen Syntheseweg hergestellt wurde.

Das auf diese Weise hergestellte Produkt entspricht dem Nonapeptid Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (35) .

Analyse der Aminosäuren nach saurer Hydrolyse (gesamt): Asp 1,01; Ser 1,83; GIu 1,85; GIy 2,00; AIa 0,97.

BEISPIEL 14

Herstellung der strukturanalogen Nonapeptide PyroGlu-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (65)

15 PyroGlu-Ala-Lys-D-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (66) PyroGlu-Ala-Lys-Thr Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (67) PyroGlu-Ala-Lys-(N-Methyl-Ser)-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn, (64) die dem Nonapeptid mit der Struktur des Thymushormons mit dem einzigen Unterschied entsprechen, daß der Serin-

rest in der 4-Stellung durch die L-Alanin, D-Serin, L-Threonin, oder N-Methyl-Serinreste ersetzt ist.

Diese Analogen werden über die gleichen Synthesestufen erhalten, wie sie zuvor für die Synthese des Nonapeptids PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (16) (cf.

25 Beispiel 1) beschrieben wurden, mit dem Unterschied, daß in der Stufe c) anstelle von Z.Ser(But) die Derivate Z.AIa, Z.D.-Ser(But), Z.L-Thr(But) und Z-(N-Methyl)-Ser verwendet werden.

Die auf diese Weise erhaltenen freien Nonapeptide

30 sind nach Dünnschichtchromatographie in den Lösungsmittel-

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- 59 -

mischungen G und H homogen und ergeben bei der Rheophorese unter den für das Nonapeptid (16) (Beispiel 1) beschriebenen Bedingungen einen einzelnen Fleck.

Die Herstellung der Strukturanalogen durch Ersatz des L-Lysinrestes durch die D-Lysin, N -Acethyl-L-Lysin-L-Ornithinreste ist ebenfalls über die gleichen Stufen möglich, wie sie zuvor bei der Synthese des Nonapeptids (16) (Beispiel 1) beschrieben wurden, mit dem einzigen Unterschied, daß in der Stufe e) anstelle von Z-Lys(BOC)

10 die Derivate Z-D-Lys(BOC), Z-Lys(Azet) und Z-Orn(BOC)

verwendet wurden. Das gilt auch für die strukturanalogen Nonapeptide, die durch Ersatz des Glutaminylrestes in 5-Stellung durch einen Glutamyl- oder D-Glutaminylrest, des Gly-Gly-Restes in 6- und 7-Stellung durch L-Alanin-oder D-Alaninreste und des Asn in der C-terminalen Stellung durch die L-Glutamin-oder D-Asparaginreste hergestellt wurden.

Um den Wert und die Wirksamkeit der Peptidsyntheseverfahren, die für die Herstellung der neuen erfindungsgemäßen Polypeptide, die Fragmente oder Strukturanaloge des Thymushormons sind, beschritten wurden, zu prüfen, wurden ebenso parallel unter Anwendung der gleichen Verfahren das Nonapeptid PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (16) und (30), entsprechend dem Thymushormon,

25 hergestellt.

Die physicochemisehen Eigenschaften und die biologischen Eigenschaften in vitro und in vivo des Thymushormons und des auf diese Weise synthetisch erhaltenen Nonapeptids sind identisch.

Zusätzlich zu den zuvor beschriebenen beiden Synthesewegen wurden zur Herstellung einer Reihe anderer Derivate

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des FTS die mit den Ziffern 3, 4, 5, 6, 7 und 8 gekennzeichneten Synthesewegen beschritten, deren Stufen im folgenden beschrieben werden.

Die Einzelheiten der Herstellung der Synthesezwischenprodukte gemäß diesen letzteren Wegen gleichen denen gemäß den Beispielen 1 bis 14.

Beschreibung der Synthesestufen für die FTS-Derivate auf dem dritten Weg:

(Peptide Nr. 61, 62, 63, 82, 83, 84, 87, 91) A- Herstellung des Tetrapeptidderivats Z-Ser(But)-GIn-Gly-Gly-OH durch Verseifung des Derivats Z-Ser (But)-Gln-Gly-Gly-OMe (21).
B - Synthese des Hexapeptidderivats Z-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn.OBut durch Kopplung des C-terminalen Dipeptidderivats (2)(Acetat von Ser(But)-Asn-OBut) mit dem gemischten Anhydrid von Isobutylchlorcarbonat und des vorhergehenden Tetrapeptidderivats und Umwandlung des Hexapeptidderivats in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.
C- Synthese des Heptapeptidderivats:

Z-Lys(Ac)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut durch Kupplung des Derivats Z-Lys(Ac) (nach L. Benoiten, Can. J. Chem. 1963, 41, 1718) mit dem Acetats des vorherigen Hexapeptidderivats nach der Methode der gemischen Anhydride und Umwandlung des Heptapeptidderivats in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z. D - Herstellung des Acetats von Ala-NHNHBOC durch Hydrogenolyse des Derivats Z-Ala-NHNHBOC (nach N. Yanaihara, C. Yanaihara, T. Sakagami, T. Nakajima, T. Nakayama und K. Matsumoto ehe. Pharm. Bull. Jap. 1973, 21, 616).

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E - Synthese der Derivats PyroGlu-Ala-NHNHBOC durch

Kupplung des vorhergehenden Derivats mit dem Derivat PyroGlu-OTcp (nach J.C. Anderson, M.A. Barton, D.M. Hardy, G.W. Kenner, J. Preston und R.C. Scheppard, J. Chem. Soc. C, 1967, S. 108).
F - Synthese des Nonapeptidderivats:

PyroGlu-Ala-Lys(Ac)-Ser(But)-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut durch:

a) Herstellung des Derivats PyroGlu-Ala-NHNH- durch
Acidolyse der Gruppe BOC des unter E hergestellten Derivats;

b) Herstellung des Azids PyroGlu-Ala-IvU, aus dem zuvor beschriebenen Hydrazid nach der Methode K-Medzihradszky et al. (Acta Chim. Acad. Sei. Hung. 1962, 30, 105);

c) Kupplung dieses Azids mit dem Acetat des Heptapeptidderivats unter C.

G - Herstellung des freien Nonapeptids:

PyroGlu-Ala-Lys(Ac)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (62) 20 durch Entfernung aller temporären Schutzgruppen in

einer einzigen Stufe, wie es in der Stufe f) in Beispiel 10 beschrieben wurde.
H - Herstellung des freien Heptapeptid:

Lys(Ac)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (82)

25 aus dem Acetat des Heptapeptidderivats unter C durch Entfernung aller temporären Schutzgruppen in einer einzigen Stufe.

I - Verwendet man anstelle des Derivats Z-Lys(Ac) die Derivate Nps-D-Lys(BOC) und Nps.Orn (BOC) (herge-30 stellt nach I. Barral und J. Savrda, Synthesis 1973,

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S. 795 durch Umsetzung des O-Nitrophenylsulfenylthiozyanats mit den Kupferkomplexen von N BOC-D-Lysin j_nach R. Schwyzer und W- Rittel, HeIv. Chim. Acta 1961, 20, 159 Jbezw. von N -BOC-Ornithin [ nach

F. Marchiori, R. Rocchi, G. Vivaldi, A. Tamburro
und E. Scoffone, J. Chem. Soc. C 1967, S. 81 ^Wd Z-Hep (hergestellt durch Benzylcarbonylxerung des
L-Heptylin, hergestellt nach B. Sanborn und G. Hein, Biochemistry 1968, 7, 3616), erhält man über den
gleichen Syntheseweg J_ selektive Entfernung der

Nps-Gruppe erfolgt gemäß W. Köning (HOppe-Seylers Z. Physiol. Chem. 1971, 352, 2 und H. Klostermeyer und E. Schwertner (Z. Naturforschung 1973, 28b, 334)j die Heptapeptide:

D-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (83)

Qrn-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (84)

Hep-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (87)

und die Nonapeptide:

PyroGlu-Ala-D-Lys-Ser-Gln- Gly-Gly-Ser-Asn (61) PyroGlu-Ala-Orn-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (63) PyroGlu-Ala-He£-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (91) Beschreibung der Synthesestufen für die Derivate des FTS über den vierten Weg: (Peptide Nr. 65, 66, 67)
A - Synthese des Tripeptidderivats Z-Gln-Gly-Gly-OMe
durch Kupplung des Acetats von Gly-Gly-OMe (4) mit

dem Derivat Z-Gln-ONp {von Fluka).
B - Herstellung des Derivats Z-GIn-GIy-GIy-NHNH₂ durch

Hydrazinolyse des vorhergehenden Methylesters. C - Synthese des Pentapeptidderivats Z-Gln-Gly-Gly-Ser 30 (But)-Asn-OBut durch Kupplung des Azids Z-GIn-GIy-GIy-N₃

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(hergestellt aus dem vorhergehenden Hydrazid nach R.H. Mazur und J.M. Schlatter, J. Org. Chem. 1964, 29, 3212) mit dem C-terminalen Dipeptidderivat (2) (Acetat von Ser(But)-Asn-OBut). 5 Umwandlung des Pentapeptidderivats durch Hydrogenolyse

der Gruppe Z.

D - Synthese des Hexapeptidderivats Z-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut
Durch Kupplung des Derivats Z-AIa (von Fluka) mit dem Acetat des vorhergehenden Pentapeptidderivats

nach der Methode der gemischten Anhydride. Umwandlung des Hexapeptidderivats in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.
E - Synthese des Tripeptidderivats PyroGlu-Ala-Lys(BOC) -

NHNHZ

durch Kupplung des Azids PyroGlu-Ala-N., (s. dritter Weg, Stufe F b)) mit dem Derivat Lys(BOC)-NHNHZ (nach C. Sakarellos, M. Sakrellos-Daitsiotis, D. Blanot, I.Barral, J. Savrda und E. Bricas. Bull. Soc. Chim.

Fr., 1967, S. 781) .

F - Synthese des Nonapeptidderivats PyroGlu-Ala-Lys(BOC)-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut durch:

a) Herstellung des Derivats PyroGlu-Ala-Lys(BOC)-NHNH₂ durch selektive Hydrogenolyse der Gruppe Z.

b) Herstellung des Azids PyroGlu-Ala-Lys(BOC)-N₃ aus dem vorhergehenden Hydrazid nach der Methode nach R.H. Mazur und J.M. Schlatter (J. Org. Chem. 1964, 29, 3212);

30 c) Kupplung des Azids mit dem Acetat des Hexapeptidderivats, das unter D hergestellt wurde.

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ANVAR E 743

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G - Herstellung des freien Nonapeptids PyroGlu-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (65)

Durch Entfernung aller temporären Schutzgruppen in einer einzigen Stufe/ gemäß Stufe f) nach Beispiel H- Verwendet man anstelle des Derivats Z-AIa (Stufe D) die Derivate Z-Thr(But) (von Fluka) und Z-D-Ser-OPcp (nach J. Kovacs, M.Q. Ceprini, CA. Dupraz und E. N. Schmit, J. Org. Chem 1967, 32, 3696) werden die entsprechenden Nonapeptide erhalten:

PyroGlu-Ala-Lys-Thr-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (67) PyroGlu-Ala-Lys-D-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (66) Beschreibung der Synthesestufen zur Herstellung der Derivate des FTS über den fünften Weg (Peptide 72, 88, 89, 92)

A- Synthese des Dipeptids Z-D-Ala-Gly-OMe durch Kupplung von Z-D-Ala (nach M. Bergman und L. Zervas. Ber. 1932, 65, 1192) mit dem Glycinmethylester (handelsüblich in Form des Chlorhydrats von Fluka). Umwandlung des Dipeptids in sein Acetat durch Hydrogeno-Iyse der Gruppe Z.

B - Synthese des Tripeptidderivats Z-GIn(Mbh)-D-Ala-Gly-OMe durch Kupplung des Derivats Z-GIn(Mbh) (nach W. Köning und R. Geiger, Chem. Ber. 1970, 103, 2041) mit dem Acetats des vorhergehenden Dipeptids. Um-Wandlung dieses Tripeptidderivats in sein Acetat

durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.

C - Synthese des Tetrapeptidderivats Z-Ser(But)-Gin(Mbh)-D-Ala-Gly-OMe durch Kupplung des Derivats Z-Ser(But) (von Fluka) mit dem zuvor erhaltenen Acetats des Tripeptidderivats. Umwandlung dieses Tetrapeptid-

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ANVAR P 74 3

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derivats in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.

D - Synthese des Pentapeptidderivats Z-Lys(BOC)-Ser(But)-

Gin(Mbh)-D-Ala-Gly-OMe durch Kupplung des Derivats Z-Lys(BOC) (von Fluka) mit dem zuvor erhaltenen Acetat des Tripeptidderivats.

E - Herstellung des Pentapeptidderivats Z-Lys(BOC)-Ser (But)-Gin(Mbh)-D-Ala-Gly-OH durch Verseifung des zuvor erhaltenen Methylesters des Pentapeptidderivats.

F - Synthese des Heptapeptidderivats Z-Lys(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-D-Ala-Gly-Ser(But)-Asn-OBut durch Kupplung des C-terminalen Dipeptidderivats (2)(Acetat von Ser (But)-Asn-OBut) mit dem gemischten Anhydrid aus Iso-15 butylchlorcarbonat und dem vorhergehenden Pentapeptidderivat. Umwandlung des Heptapeptidderivats in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z. G - Synthese des Oktapeptidderivats Z-Ala-Lys(BOC)-Ser

(But)-Gin(Mbh)-D-Ala-Gly-Ser(But)-Asn-OBut durch Kupplung des Derivats Z-AIa (von Fluka) mit dem Acetat des vorhergehenden Heptapeptidderivats. Umwandlung des Oktapeptidderivats in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.

H - Synthese des Nonapeptidderivats PyroGlu-Ala-Lys(BOC) 25 Ser(But)-Gin(Mbh)-D-Ala-Gly-Ser(But)-Asn-OBut durch Kupplung des Derivats PyroGlu-OTcp (nach J.C. Anderson et al., J. Chem. Soc. C. 1967, S. 108) mit dem Acetat des zuvor erhaltenen Oktapeptidderivats. I - Herstellung des freien Nonapeptids: PyroGlu-Ala-Lys-30 Ser-Gln-D-AlaGly-Ser-Asn (89)

durch Entfernung aller temporären Schutzgruppen in

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einer einzigen Stufe gemäß Stufe f) nach Beispiel 10. J - Herstellung des freien Heptapeptids Lys-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn (88)

aus dem Acetat des unter F hergestellten Heptapeptidderivate durch Entfernung aller temporären Schutzgruppen in einer einzigen Stufe.

K - Verwendet man anstelle des Derivats Z-D-AIa gemäß Stufe A die Derivats Z-AIs und Z-D-Leu, werden über den gleichen Syntheseweg die folgenden Nonapeptide 1 0 erhalten:

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Ala-Gly-Ser-Asn (72) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-D-Leu-Gly-Ser-Asn (92) Beschreibung der Synthesestufen zur Herstellung der FTS-Derivate über den sechsten Weg: (Peptide Nr. 86, 90, 93, 94, 95)

A - Synthese des C-terminalen geschützten Dipeptide Z-Ser(But)-D-Asn-OBut durch Kupplung von Z-Ser(But) (von Fluka in Form des DCHA-Salzes) und des Acetats von D-Asn-OBut (erhältlich durch Hydrogenolyse von Z-D-Asn-OBut, das wiederum nach E. Schnabel und H. Schüssler, Liebigs Ann. Chem. 1965, 686, 229) erhalten wird. Umwandlung des geschützten Dipeptids in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.

B - Herstellung des Acetats des Tetrapeptidderivats: H-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-OMe durch Hydrogenolyse der Gruppe Z des Tetrapeptidderivats Z-Ser(But)-Gln(Mbh)-Gly-Gly-OMe (7).
C - Synthese des Pentapeptidderivats; Z-Lys(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-OMe durch Kupplung von Z-Lys(BOC) (von Fluka) mit dem vorhergehenden Acetat des Tetra-

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ANVAR P 7 43

- 67 -

peptidderivats. umwandlung des Pentapeptidderivats in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z. D - Synthese des Hexapeptidderivats: Z-Ala-Lys(BOC) Ser(But)-Gln(Mbh)-Gly-Gly-OMe durch Kupplung von Z-AIa (von Fluka) mit dem vorhergehenden Acetat

des Pentapeptidderivats.

E - Herstellung des Derivats Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gin (Mbh) -GIy-GIy-NHNH₂ durch Hydrazinolyse des vorhergehenden Methylesters.

F- Synthese des Oktapeptidderivats: Z-Ala-Lys(BOC) Ser(But)-GIn(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-D-Asn-OBut durch Kupplung des Azids Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-GIy-GIy-N₃, das aus dem vorhergehenden Hydrazid erhältlich ist mit dem unter A herge-

15 stellten Dipeptidacetats. Umwandlung des Okta-

peptidderivat in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.
G - Synthese des Nonapeptidderivats: PyroGlu-Ala-Lys

(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-D-Asn-OBut durch Kupplung des Derivats PyroGlu-OTcp (nach J. C. Anderson et al., J. Chem. Soc. C. 1967, S. 108) und des vorhergehenden Acetats des Oktapeptidderivats.
H - Herstellung des freien Nonapeptids: PyroGlu-Ala-

25 Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn (90)

durch Entfernung aller temporären Schutzgruppen in einer einzigen Stufe gemäßkStufe f) nach Beispiel 10.
- Verwendet man anstelle des Acetats von D-Asn-OBut

30 in der Stufe A das Acetat von B-AIa-NH₀ (nach

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ANVAR τ> 743

- 68 -

H.T. Hanson und E.L. Smith, J. Biol. Chem. 1948, 175, 833) und das Bromhydrat von H-Asn-NH₂ (nach M. Bodanszky, Y.S. Klausmer und V. Mutt, Bioorg. Chem. 1972, 2, 30) erhält man über den gleichen Syntheseweg die jeweiligen Nonapeptide:

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-ß-Ala-NH,, (86) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-Nl^ (93) J - Synthese der C-terminalen Dipeptide: Z-Thr(But)-Asn-OBut

10 Z-D-Ser-Asn-OBut

durch Kupplung des Derivats Asn-OBut (nach E. Schnabel und H. Schüssler, Liebigs Ann. Chem. 1965, 686, 229) jeweils mit den Derivaten Z-Thr(But) (von Fluka)bezw. Z-D-Ser-OPcp (nach J. Kovacs et al., J.

Org, Chem. 1967, 32, 3696). Aus diesen beiden Dipeptidderivaten werden über den gleichen Syntheseweg die folgenden Nonapeptide erhalten: PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Thr-Asn (94) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-D-Ser-Asn (95) Beschreibung der Synthesestufen zur Herstellung der FTS-Derivate über den siebten Weg: (Peptide Nr. 68, 71, 96, 97, 98, 99)

A - Synthese des Tetrapeptidderivats Z-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut

durch Kupplung des C-terminalen Dipeptidderivats (2) (Acetat von Ser(But)-Asn-OBut) mit dem Derivat Z-Gly-Gly (hergestellt durch Benzyloxycarbonylierung des Glycy!glycin von der Fa. Sigma). Umwandlung des Tetrapeptidderivats in sein Acetat durch

30 der Gruppe Z.

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ANVAR P 743

- 69 -

B - Synthese des Pentapeptidderivats Z-GIu(OBut)-GIy-Gly-Ser(But)-Asn-OBut

durch Kupplung des Derivats Z-GIu(OBut) (von Fluka) mit dem vorhergehenden Acetat des Tetrapeptidderi-5 vats. Umwandlung des Pentapeptidderivats in sein

Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z. C - Synthese des Hexapeptidderivats Z-Ser(But)-Glu (OBut)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut durch Kupplung des Derivats Z-Ser(But) (von Fluka)

10 mit dem vorhergehenden Acetat des Pentapeptidderivats. Umwandlung des Hexapeptidderivats in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.

D - Synthese des Heptapeptidderivats Nps-Lys(BOC)-Ser (But)-Glu(OBut)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut durch Kupplung des Derivats Nps-Lys(BOC) (nach J. Barral und J. Savrda, Synthesis 1973, S. 795) mit dem vorhergehenden Hexapeptidderivat. Umwandlung des Heptapeptidderivats in sein Bromhydrat durch selektive Entfernung der Gruppe Nps nach W. Köning (Hoppe-Seylers Z. Physiol. Chem 1971, 352, 2) und

H. Klostermeyer und E. Schwertner (Z. Naturforschung 1973, 28b, 334).
E - Synthese des Nonapeptidderivats: PyroGlu-Ala-Lys

(BOC)-Ser(But)-Glu(OBut)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut

25 durch Kupplung des Azids PyroGlu-Ala-N₃ (s. 3. Weg, Stufe F b)) mit dem vorhergehenden Bromhydrat des Heptapeptidderivats,

F - Herstellung des freien Nonapeptids: PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn (68)

durch Entfernung aller temporären Schutzgruppen in

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ANVAR P 74 3

- 70 -

einer einzigen Stufe gemäß Stufe f) nach Beispiel 10. G - Verwendet man anstelle des Derivats Z-GIu(OBut) in der Stufe B die Derivate Z-D-GIn(Mbh), Z-Asn(Mbh), Z-Nva, Nps-Cys (S-CONH₂) und Nps-Met(O) erhält man die jeweilige Nonapeptide:

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-D-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn (71) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn (96)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn (97)

S-CO-NH ₂)-Gly-Gly-Ser-Asn (98)

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Met(0)-Gly-Gly-Ser-Asn (99) Beschreibung der Synthesestufen zur Herstellung der FTS-Derivate über den achten Weg: (Peptide Nr. 73, 100, 101, 102, 103, 104)

A - Synthese des Tripeptidderivats Z-D-Ala-Ser(But)-Asn-OBut

durch Kupplung von Z-D-AIa (nach M. Bergmann und L. Zervas, Ber. 1932, 65, 1192) mit dem C-terminalen Dipeptidderivat (2) (Acetat von Ser(But)-Asn-OBut). Umwandlung des Tripeptidderivat in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.

B - Synthese des Dipeptidderivats Z-GIn(Mbh)-GIy-OMe durch Kupplung von Z-GIn(Mbh) (nach W. Köning und R. Geiger, Chem. Ber. 1970, 103, 2041) mit dem Glycinmethylester (handelsüblich von Fluka in Form 25 des Chlorhydrats). Umwandlung des Dipeptidderivats

in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z. C - Synthese des Tripeptidderivats Z-Ser(But)-Gin(Mbh)-GIy-OMe

durch Kupplung von Z-Ser(But) (von Fluka) mit dem vorhergehenden Acetat des Dipeptidderivats. Umwand-

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ANVAR P 74 J

- 71 -

lung des Tripeptidderivat in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.
D - Synthese des Tetrapeptidderivats Z-Lys(BOC)-Ser(But)-

Gin(Mbh)-GIy-OMe

5 durch Kupplung von Z-Lys(BOC) (von Fluka) mit dem vorhergehenden Acetat des Tripeptidderivats. Umwandlung des Tetrapeptidderivats in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.
E - Synthese des Pentapeptidderivats: Z-Ala-Lys(BOC)-

0 Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-OMe

durch Kupplung von Z-AIa (von Fluka) mit dem vorhergehenden Acetat des Tetrapeptidderivats. F - Herstellung des Pentapeptidderivats: Z-Ala-Lys(BOC) Ser(But)-Gin(Mbh)-GIy-OH

15 durch Verseifung des vorhergehenden Methylesters des

Pentapeptidderivats.

G - Synthese des Oktapeptidderivat: Z-Ala-Lys(BOC)-Ser (But)-Gin(Mbh)-Gly-D-Ala-Ser(But)-Asn.OBut durch Kupplung des Acetats des Tripeptidderivats,

20 das unter A hergestellt wurde, mit dem gemischten Anhydrid von Isobutylchlorcarbonat und dem vorhergehenden Pentapeptidderivat. Umwandlung des Oktapeptidderivats in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.

H- Synthese des Nonapeptidderivats: PyroGlu-Ala-Lys (BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-D-Ala-Ser(But)-Asn.OBut durch Kupplung des Derivats PyroGlu-OTcp (nach J. C. Anderson et al., J. Chem. Soc. C. 1967, S. 108) mit dem vorhergehenden Acetat des Oktapeptidderivats.

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ANVAR P 743

- 72 -

I - Herstellung des freien Nonapeptids: PyroGlu-Ala-Lys Ser-Gln-Gly-D-Ala-Ser-Asn (100)

durch Entfernung aller temporären Schutzgruppen in einer einzigen Stufe gemäß Stufe f) nach Beispiel 10. 5 J- Verwendet man anstelle des Derivats Z-D-AIa in Stufe A die Derivate Z-AIa, Z-Sar, Z-D-Leu bzw. Z-Gly-Gly, erhält man die entsprechenden Nonapeptide: PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Ala-Ser-Asn (73) PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Sar-Ser-Asn (101) 10 PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-D-Leu-Ser-Asn (102) und das Dekapeptid:

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Gly-Ser-Asn (103) K - Verwendet man anstelle des Tripeptidderivat in Stufe

G das Dipeptidderivat (2) (Acetat von Ser(But)-Asn-OBut), erhält man:

PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Ser-Asn (104)

Andere über den ersten Weg hergestellte FTS-Derivate: (Peptide Nr. 85, 105, 106, 107, 108, 109, 110) A - Durch selektive Acidolyse der Gruppen BOC und But des Derivats

Z-Lys (BOC) -Ser (But) -Gin (Mbh) -Gly-Gly-Ser (But) -Asn-OBut (11) und des Derivats Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gin(Mbh)-Gly-Gly-Ser (But) -Asn-OBut (13), erhält man das Heptapeptid

25-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (85)

und das Oktapeptid:

Z-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (105)

B - Durch Ersatz in Stufe I₁) des Wegs 1 des Derivats

PyroGlu-OTcp durch die Derivate D-PyroGlu-OTcp, Z-30 D-GIn(Mbh), Nps-CyS(S-CONH₂), BOC-Pro und L-Aad-OTcp

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ANVAR P 743

- 73 -

erhält man die entsprechenden Nonapeptide: D-PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (106) D-Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (107) CyS(S-CONH ₂)-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (108) Pro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (109) Aad-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Äsn (110) Andere über den zweiten Weg hergestellte FTS-Derivate (Peptid Nr. 79)

A - Synthese des Dipeptidderivats: Z-Ser(But)-Gln-OBut durch Kupplung des Derivats Z-Ser(But) (von Fluka) und des Derivats Gln-OBut (nach E.Schnabel und H. Schüssler, Liebigs Ann. Chem 1965, 686, 229). Umwandlung des Dipeptidderivats in sein Acetat durch Hydrogenolyse der Gruppe Z.

B- Über den zweiten Syntheseweg wird unter Verwendung des vorhergehenden Derivats das Nonapeptid erhalten: PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln (79) Herstellung der FTS-Derivate durch Guanidinierung der synthetischen Verbindungen: (Peptide Nr. 111 und 112) Durch Guanidinierung bei einem pH-Wert von 10,5 und 4⁰C mit O-Methylisoharnstoff(handelsübliches Sulfat der Fa. Serva) des Peptids (63) und des synthetischen FTS (16), und nachfolgende Reinigung durch präparative Elektrophorese bei hoher Spannung werden die entsprechenden Peptide erhalten:

PyroGlu-Ala-Arx[-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (111)

PyroGlu-Ala-Har-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (112)

Herstellung der FTS-Derivate durch Acetylierung der
synthetischen Verbindungen: (Peptide Nr. 113, 114, 115,

116)

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ANVAR P 713

- 74 -

A - Durch Acetylierung (nach M. Reboud-Ravaux und C.

Ghalis (Eur. J. Biochem 1976, 65, 25) der Nonapeptide (89), (61) und (90) mit Acetylbenzotriazol werden die entsprechenden folgenden N -acetylierten Nonapeptide erhalten:

PyroGlu-Ala-Lys(Ac)-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn (113) PyroGlu-Ala-D-Lys(Ac) - Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (114) PyroGlu-Ala-Lys(Ac)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn (115) B - Verwendet man die gleiche Verfahrensweise auf das Derivat (14) (Acetat von Z-Ala-Lys(BOC)-Ser(But)-Gln(Mbh)-Gly-Gly-Ser(But)-Asn-OBut) an, gefolgt von einer selektiven Acidolyse der Gruppen BOC und But, erhält man das folgende N -acetylierte Oktapeptid: Ac-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn (116)

Pharmakologische Eigenschaften und therapeutische Verwendung :

Wie zuvor ausgeführt besitzen die erfindungsgemäßen Polypeptide eine Thymusaktivität, die der des natürlichen Thymushormons gleich oder überlegen ist,oder sie weisen eine antagonistische oder inhibierende Wirkung gegenüber dem Thymushormon auf.

Mit den erfindungsgemäßen Polypeptiden wurden Versuche in vivo und in vitro durchgeführt.

Bei den in vitro Untersuchungen wurde der im fοIgenden beschriebene Rosettentest angewendet:

Bestimmung der Thymusaktivität der Polypeptide im Rosettentest.

Der Rosettentest wurde durch J.F. Bach und M. Dardenne in Immunologie, 25_, 353 (1975) beschrieben; Der Inhalt dieses Artikels ist auch Inhalt dieser Beschreibung.

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ANVAR P 713

- 75 -

Die Thymusaktivität des Polypeptide wird bestimmt, indem man es zur Inkubation in ein Hämolyserohrchen mit 3x10 Zellen der Milz von ausgewachsenen Mäusen C 57/B1 6 (vom Centre d'Elevage des Animaux de Laboratoire du C.N.R.S. (45 Orleans, La Source), bei denen 10 bis 20 Tage vorher der Thymus entfernt wurden ist, einbringt. Das Verfahren zur Thymusentfernung ist durch M. Dardenne und J.F. Bach in Immunologie, 25, 343 (1973) S. 344 beschrieben. Der Inhalt dieses Artikels ist eben-

10 falls Inhalt dieser Beschreibung.

Die Inkubation wird über 90 Minuten bei 37° C in Gegenwart von Azathioprin (As) in einer Konzentration von 10 μg/ml durchgeführt.
Diese Konzentration ist ein Hittelwert der A„-Mindestkonzentration, bei der 50 % der rosettenbildenden Zellen (RFC) der Milz von Mäusen inhibiert werden, die bei normalen Mäusen 1 /ug/ml und bei ausgewachsenen Mäusen, deren Thymus entfernt wurde, 25-10 ^ig/ml beträgt.

Am Ende der Inkubation werden 12x10 rote Zellen aus Schafsblut (SRBC) der Versuchsprobe zugesetzt. Die Zellen der Versuchsprobe werden 6 Minuten bei 200 g zentrifugiert und vorsichtig durch Rotation bei niederer Geschwindigkeit (10 U/Min.) über eine RoI-Ie (10 cm 0) in Suspension gebracht. Die RFC werden in einem Hämatozytometer gemessen. Bei fehlender Thymusaktivität beträgt die Zahl der RFC 1210/1O⁶ Zellen +_ 120 (mittlere Abweichung, SD). Bei vorhandener Thymusaktivität ist die RFC-Menge auf ein Niveau von

30 200-400/10 Zellen vermindert. In Abwesenheit von Az

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ANVAR ? 743

- 76 -

üben die Peptide keine inhibierende Wirkung auf RFC aus. Die Thymusaktivität ist als Inhibierung von mehr als 50% der rosettenbildenden Zellen definiert.

Die in vitro im Rosettentest untersuchten Peptide sind in Konzentration kleiner 1 pg/ml aktiv. Die Wirkung ist spezifisch, weil die Vergleichspeptide mit entsprechendem Molekulargewicht wie das Angiotensin und die Substanz P inaktiv sind.

Die in vitro aktiv Peptide wurden gleichermaßen in vivo untersucht. Nach Injizieren in Mäuse, bei denen im Alter von 6 Wochen der Thymus entfernt wurde und die 8 Wochen nach Thymusentfernung verwendet wurden, verursachen die Peptide nach 15 Minuten das Auftreten einer biologischen Aktivität im Serum, die der Sensibilisierung der rosettenbildenden Milzzellen gegenüber Azathioprin entspricht. Diese Aktivität, die gleichermaßen mit dem Ausgangspeptid beobachtet wird, wird bei PeptidVerdünnungen über 1/1000 gefunden.

Gleichzeitig erhöhen die Milzzellen der mit den Peptiden behandelten Mäuse die Sensibilisierung der rosettenbildenden Zellen gegenüber Azathioprin und dem Anti-Theta-Serum; dieser Umstand weist darauf hin, daß diese Zellen Merkmale von T-Zellen erworben haben,

25 die sie vorher nicht besaßen. Diese Versuche wurden

mit verschiedenen Peptiddosen wiederholt: 10 und 100 pg, 1 und 10 ng, wodurch eine Dösis-Wirkungbeziehung und das Fehlen akuter Toxizität aufgezeigt werden konnte, gleichgültig, ob das Produkt allein (in physiologischem Serum) oder adsorbiert an Carboxymethylzellulose injiziert wird.

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ANVAR _t Γ 743

- 77 -

In den folgenden Tabellen I bis IV werden die Versuchsergebnisse mit einigen erfindungsgemäßen Verbindungen wiedergegeben.

Folgende Versuche wurden durchgeführt: 5 1) Aktivität in vitro im Rosettentest.

2) Aktivität in vivo (Untersuchung des Serums 2 Stunden und 4 Stunden nach Injektion bei Mäusen, deren Thymus entfernt wurde, bei verschiedenen Mengen (0,1, 1, oder 10 ng) an Carboxymethylzellulose absor-

10 biertem Peptid).

3) Korrektur der anormalen Reaktivität der rosettenbildenden Zellen aus der Milz gegenüber Azathioprin bei Mäusen, bei denen der Thymus entfernt wurde, 24 Stunden nach Injektion des Peptids (0,1, 1, 10 ng),

15 gebunden an Carboxymethylzellulose.

4) Kinetik der Aktivität im Serum nach Injektion von 0,1 oder 1 ng Peptid ohne Carboxymethylzellulose um aktive Peptide mit verzögerter Aktivität zu finden.

5) Untersuchung in vitro der inhibierenden oder antagonistischen Aktivität der inaktiven Polypeptide.

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ANVAR

P 7'.J

- 78 -

TABELLE I

N0	Peptid	Akti vität in vitro	Akti vität in vivo	verbin- lunq· naif Anti körpern
38	Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Sör-Asn	■ +	+	+
kz	PyroGlu-Ala-Lys-Sor-Gln-Gly-Gly-Ser	-	-	-
53	PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asp	-	-	-
59	PyroGlu-Ala-Lys-Sor-Gln-Gly-Gly-Ala-Asn	-	-	+
18	Gln-Ala-Lys-Sor-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn	+	+	+
34	Z-Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn	+	+	+
37	Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn	+	+	+
*7	PyroGlu-D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser- Asn	—	—	+
hü	D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn	-	-	+
36	Sor-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn	-	-	-
79	PyroGlu-AIa-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln	-	-	-
66	PyroGlu-Ala-Lys-D-Scr-Gln-Gly-Gly-Ser- Asn	—	—	—
65	PyroGlu-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn	-	-	-
82	Lys(N -acetyl)-Sor-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn	-	-	+
83	D-Lys-Sor-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn	-	-	+
84	Orn-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn	-	-	+
85	NaZ-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn	-	-	+
62	PyroGlu-Ala-Lys(N -acetyl)-Ser-Gln-Gly- Gly-Sor-Asn	-	+R	+
61	PyroGlu-Ala-D-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn	+	+R	+
63	PyroGlu-Ala-Orn-Ser-Orn-Gly-Gly-Ser-Asn	-	-	+
86 87	PYroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-ßAla- NH2 Hep-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn	+		+
88	Lys-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn	-	-	+
89	PvroGlu-Ala-Lvs-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn	-	+R	+
90	PvroGlu-Ala-Lvs-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn		+R	+

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ANVAR P 743

- 79 -

In der Tabelle I bedeuten die Zeichen + und - , ob das Peptid aktiv oder inaktiv ist. Das Zeichen R zeigt an, daß das Peptid eine verzögerte Aktivität aufweist.

Ob sich die Peptide mit Antikörpern verbinden oder nicht, wird durch die Zeichen + bzw. - gekennzeichnet.

Die Ergebnisse gemäß Tabelle I werden in den Tabellen II, III und IV aufgeschlüsselt.

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TABELLE II

Aktive Konzentration (ng/ml)
(Versuch in
vitro)

Seren (Versuch in vivo) 2 Stunden nach Injektion

Injizierte Menge
(ng)

Aktive Verdünnung Milz (Versuche in vivo) 24 Stunden nach Injektion

Injizierte
Menge
(ng)

Menae Azathioprin

Verbindung mit Antikörpern

38

. O
CO
OO

CD CO OO

2.10 7.10

-6

-6

2.10

-6

64ÖÖÖ 256000

128000 512OOO 512OOO

0,3 0,3 0,3

0,3 0,3

<0,03

<o,O3

1
10

1 1000

^siooo

1 1000

Ί000

25

50

53

<0,03 <0,03

0,1
1

Ί0ΟΟ

<■

1000

_J

1000

_J

2000

25

50

50

50

0,03 <o,O3

0,1
1

1__

4000

Mooo

_J

8000

1

4000

25

50

50

CO

CO

cn

13

7.10"

0,1

128000 256OOO 512OOO

0,3 0,7 0,3

TABELLE II (Portsetzung)

	Ν·	Aktive Konzen tration (ng/ml) (Versuch in vitro)	Seren (Versuch in vivo) 2 Stunden nach Injektion	Aktive Verdünnung	Milz (Versuche in vivo) 24 Stunden nach Injektion	Menge Azathioprin (ng)	Verbin dung mit Anti körpern
		7.1O-6 3.1O-6	Injizier te Menqe (ng)	11 1 512000 512000 512000	Inji zierte Menae (ng)'	0,3 0,3 0,3
809851	30	2.10*6 2.10~6		1 1 1		0,3 0,3 0,7 0,3 0,7 0,3	+
/0638	37	0,03 0,007	0,1 1	128000 256000 256000 1 1 1	0,1 1	25 25 25 6 12 3 3 6	*
		<0,03	0,1 10	256000 256ΟΟΟ 256ΟΟΟ	0,1 10	50 50 · 50 25 · 50 25	+
		<0,03	1 10	1 1 1 64000 32ΟΟΟ 32ΟΟΟ 1 1 1 256ΟΟΟ 128000 128000	1 10	25 25 2^> 50 50 50 12	+
0,1	/ 1 / 1 ·. _l_ 125 S25O 500 1 11 125 125 ' 125	0,1
_J 1 1 L- 1 1 500 500 500 1000 1000 1000

Ni CO NJ

TABELLE II (Fortsetzung)

OD O CO OO

ο o> co

	Aktive Konzen tration (ng/ml) (Versuch in vitro)	Seren (Versuch in vivo) 2 Stunden nach Injektion	Aktive Verdünnuna	Milz (Versuche in vivo) 24 Stunden nach Injektion	Menae Azathioprin (ug)'	Verbin dung mit Anti körpern	2822951
36	0,3 0,6	Injizier te Menqe (ng)	/ 1 /1 /1 ^125 S125 S125	Inji zierte Menqe (ng)	50 50 50	-
79	<o,o3	1	, 1 /1 /1 ^250 ^250 ^250	1	25 25 50	-
66	<0,03	0,1	/_L· /_L- ' 1 ^250 ^250 ^250	0,1	50 50 50	+
65	<0,03	0,1	/_L /_JL· / τ 250 ^250 250.	0,1	50 50 50	· +
32	<0,03	0,1	y_JL· /_L- ' •_!_ ^250 ^250 ·. 250	0,1	50 . 50 50	+
83	<0,03	0,1	1 1 "· 1 250 250 250.	0,1	50 ' 50 50	+
84	<0,03	0,1	1 /1 /1 250 ^250 250	0,1	50 50 50	+
0,1	, 0,1

co

•X)

(0

TABELLE II (Fortsetzung)

CD CO OO

	Aktive Konzen tration (ng/ml) (Versuch in vitro)	Seren (Versuch in vivo) 2 Stunden nach Injektion	Aktive Verdünnung	Milz (Versuche in vivo) 24 Stunden nach Injektion	Menge Azathioprin	Verbin dung mit Anti körpern	•
85	1.10"3	Injizier te Menge (ng)	4_L <_L <_L. 250 Ί25Ο 250	Inji zierte Menge (ng)	50 50 25	+
		0,1	• »	0,1	•

TABELLE III

	62	Aktive Konzen tration (ng/ml) (Versuch in vitro)	Seren (Versuch in vivo) 2 Stunden nach Injektion	Aktive Verdünnung	Serum (Versuche in vivo) 4 Stunden nach Injektion	Aktive Verdünnung
	61	<0,06	Injizier te Menge (ng)	1 1 1 2000 4000 4000 1 1 8000 4000	Inji zierte Menae (ng)	1 1 1 128000 128000 256000
CO O co OO cn k O	63	2.ΙΟ"6	0,1	1 1 1 256000 512000 512000	0,1	11 1 256000 512000 512000
869	86	<0,03	0,1	_J Jj ' /_1 1000 1000 s1000	0,1	J 1 _J 1 MOOO 1000 1000
	87	7.1Ο"3	0,1	1 1 1 64000 64000 64000	0,1	1 1 1 32000 32000 32000
	88	<o,o3	0,1	11 ' i' 4000 4000 . 4000	0,1	Jj 1 1 8000 8000 8000
			0,1	1111 500 1000 1000 1000	0,1	_J 1 1 1 1000 2000 1000 1000
		0,1		0,1

TABELLE III (Fortsetzung)

oo α co co cn

ο σ> co oo

N°	Aktive Konzen tration (ng/ral) (Versuch in vitro)	*	Seren (Versuch in vivo) 2 Stunden nach Injektion	Aktive Verdünnung	Serum (Versuche in vivo) 4 Stunden nach Injektion	-— -	Aktive Verdünnung
89	<0,03	Injizier te Menqe (ng)	1111 500 1000 1000 500	Inji zierte Menae (ng)	1 1 1 32000 128000 128000
90	<0,03 <0,03	0,1	1 1 128000 128000 1 1 128000 128000	0,1	1 1 ^iooo 44ooo 1 1 128000 128000
•	0,1		0,1	•
•

TABELLE IV

OO Q CO OO

ο σ> co co

Ν°	Milz (Versuche in vivo) 24 Stunden nach Injektion	Injizier te Menge (ng)	Menae Azathioprin (ug)	Milz (Versuche in vivo) 48 Stunden nach Injektion	•	•	1 10 50	Menge Azathioprin Ug)	Verbindung itiit Anti körper
62	0,1	6 6 3 1,5 3 6	Injizier te Menge (ng)		12 12 12 3 12 6 3 3 1,5 0,7 0,7 0,7 1,5 1,5	+
61	0,1	0,7 0,7 1,5	1 10 50	50 50 50 25 25 50 6 12 12	+
63	0,1	50 50 50	1 10 50		+
86	0,1	12			-
87	0,1	3 3		+
88	0,1	50 50 25 25		+
89	0,1	6 6 12	25 25 25 12 6 6 3 3 1,5	+

TABELLE IV (Fortsetzung}

Milz (Versuche in vivo) 24 Stunden nach Injektion

Injizierte Menge (ng)

Menge Azathioprin

0,1

12

12

O CO CO

CT) CD OO

Milz (Versuche in vivo) Stunden nach Injektion

Injizierte Menge
(ng)

Menge Azathioprin Ug)

Verbindung »mit

Anti- ' körper

ANVAR P 74 3

- 88 -

In den Tabellen II und III werden die Ergebnisse der Rosettentests (Versuche in vitro) wiedergegeben, wobei für jedes untersuchte Peptid die aktive Konzentation des Peptid in ng/ml angegeben wird. Diese in den Rosettentests aktive Konzentration wurde, wie zuvor beschrieben, bestimmt.

Die Versuchsergebnisse in vivo am Serum und an der Milz gemäß den Tabellen II, III und IV wurden ebenfalls, wie zuvor beschrieben, erhalten. Die Versuche am Serum wurden durchgeführt, in dem Mäusen, denen der Thymus entfernt wurde, eine bestimmte Menge Polypeptid (0,1, 1 oder 10 ng), absorbiert auf Carboxymethylzellulose, eingespritzt wurde, wobei ihr Serum nach einer bestimmten Zeit (2 Stunden und gegebenenfalls auch 4 Stunden nach Injektion) entnommen wurde, und indem man die Verdünnungen des Serums mit biologischer Aktivität bestimmt, die die Sensibilisierung der rosettenbildenden Milzzellen gegenüber Azathioprin vermittelt.

Die Versuche an der Milz wurden durchgeführt, indem die Azathioprinmenge bestimmt wurde, die nötig ist, um die rosettenbildenden Zellen der Milz von Mäusen, bei denen der Thymus entfernt wurde, nach Ablauf einer bestimmten Zeit (24 Stunden oder gegebenenfalls auch 48 Stunden) nach Injektion einer bestimmten Menge PoIy-

25 peptid (0,1, 1 oder 10 ng) zu inhibieren.

Nach Untersuchung der Ergebnisse gemäß der vorhergehenden Tabellen ergibt sich, daß die aktiven Polypeptide die Verbindungen 38, 18, 34, 37, 62, 61, 86, und 90 sind. Die inaktiven Polypeptide sind die Verbindungen 42, 53, 59, 47, 45, 36, 79, 66, 65, 82, 83,

809851/0698

ANVAR P 74 3

- 89 -

84, 85_f 63, 87 und 88.

Einige der aktiven Polypeptide besitzen nach 4 Stunden nach Injektion in dem in vivo Versuch am Serum (Tabelle III) und 48 Stunden nach Injektion in dem in vivo Versuch ander Milz (Tabelle IV) merkliche Aktivität. Diese Polypeptide mit verzögerter Aktivität sind die Polypeptide 62, 61, 89 und 90.

Diese Polypeptide wurden dem zuvor beschriebenen Versuch Nr. 4 unterzogen, um die Kinetik der Aktivität im Serum nach Injektion von 0,1 oder 1 ng Peptid ohne Carboxymethylzellulose bei Musen,bei denen der Thymus entfernt wurde, festzustellen, indem die Verdünnungen des aktiven Serums als Funktion der Zeit nach der Injektion verfolgt wurden.

15 Diese Kinetik wurde gleichfalls für die aktiven

aber nicht verzögernden Produkte aus Vergleichszwecken aufgeklärt.

Die Ergebnisse dieser Versuche werden in Form von Kurven in den Figuren 1, 2 und 3 wiedergegeben. In Fig.

1 werden die Kurven wiedergegeben, die die Veränderungen der aktiven Verdünnungen des Serums als Funktion der Zeit nach Injektion von 1 ng des Polypeptids (nicht an Carboxymethylzellulose gebunden) bei Mäusen, bei denen der Thymus entfernt wurde, wiedergeben. Die Kurven entsprechen 4 aktiven, aber nicht verzögert aktiven Polypeptiden, nämlich FTS, und den Polypeptiden 34, 37 und 45.

Es zeigt sich, daß diese 4 Polypeptide einen Aktivitätspiek 15 Minuten nach Injektion aufweisen, und daß diese Aktivität dann als Funktion der Zeit sehr

30 schnell abnimmt.

809851 /0698

ANVAR P ?43

Aus Fig. 2 gehen 4 Kurven hervor, die unter analogen Bedingungen für FTS allein, FTS, gebunden an Carboxymethylzellulose, und die Polypeptide 61 und 62, nicht gebunden an Carboxymethylzellulose, erhalten 5 wurden.

FTS allein besitzt einen Aktivitätspiek nach 15 Minuten und die Aktivität nimmt dann sehr schnell ab. FTS, verbunden mit Carboxymethylzellulose, besitzt
einen Aktivitätspiek nach 90 Minuten, wobei die Carboxymethylzellulose die Aktivität des FTS verzögert.

Die Polypeptide 61 und 62 besitzten einen Aktivitätspiek nach 30 Minuten bzw. nach 45 Minuten.

In Fig. 3 sind 3 Kurven abgebildet, die unter analogen Bedingungen für FTS, verbunden mit arboxymethyl-15 Zellulose, und die Polypeptide 89 und 90 erhalten wurden. Die Polypeptide 89 und 90 besitzten ein Aktivitätspiek nach 60 Minuten und sind deshalb sehr interessante Produkte mit verzögerter Aktivität.

Die inaktiven Polypeptide wurden dem zuvor beschriebenen Versuch Nr. 5 unterworfen.

Dieser in vitro Versuch zur Bestimmung der inhibierenden oder antagonistischen Aktivität der inaktiven Peptidanalogen besteht darin, daß man die inaktiven Polypeptide mit FTS und Milzzellen von Mäusen,
denen der Thymus entfernt wurde, inkubiert, um zu bestimmen, ob das Polypeptid die Wirkung des Thymusfaktors auf diese Zellen inhibiert.

Die in vitro bezüglich FTS antagonistischen Polypeptide, die besonders interessant sind, sind die 30 Polypeptide 4 2, 53, 59, 36, 79 und 66.

809851/0698

ANVAR P 743

- 91 -

Außerdem wurden die Polypeptide in dem Versuch Nr. 6 untersucht, der darin bestand, ein Homotranspiatat von Mäusen vom Stamm A als Donator auf Mäuse vom Stamm CBA übertragen.

Die Mäuse, auf die das Transplantat übertragen wurde, wurden 8 Tage vor der übertragung (3 Injektionen je Woche) mit 10 oder 100 ng FTS, verbunden mit Carboxymethylzellulose, oder einem Polypeptid mit verzögerter Wirkung, das nicht mit carboxymethylzellulose verbunden war, behandelt. Die Vergleichstiere wurden lediglich mit Carboxymethylzellulose behandelt. Die Transplantation wurde am 8. Tag nach der Behandlung durchgeführt und wurde bis zum Abstoßen des Transplantats verfolgt. Es wurde gefunden, daß der FTS und die

15 Polypeptide mit verzögerter Wirkung ganz wesentlich das Abstoßen des Transplantats verzögern können.

Die aktiven Polypeptide sind anstelle des Thymushormons wegen ihrer höheren Widerstandsfähigkeit gegenüber abbauenden Mitteln verwendbar. Diese Polypeptide sind auf denselben therapeutischen Verwendungsgebieten wie das natürliche Thymushormon verwendbar und sind zur Behandlung von auto-immunologischen Erkrankungen wie den Erkrankungen vom Typ Lupus und insbesondere für die Behandlung des Lupus Erythematodes bei Menschen geeig-

25 net.

Die Polypeptide sind ebenfalls geeignet, selektiv die Aktivität der T-Zellen im Verlauf bestimmter akuter oder chronischer bakterieller oder Virusinfektionen und bei Alterserkrankungen zu stimulieren. Die Polypeptide sind ebenfalls zur Behandlung von gewissen neoplasischen

8098B1 /0698

ANVAR P 743

- 92 -

Zuständen geeignet.

Die inaktiven oder nur sehr gering aktiven Polypeptide besitzen normalerweise hinsichtlich der Thymusaktivität inhibierende oder antagonistische Wirkung und
wirken auf die T-Zellen, indem sie diese hindern, ihre Immunabwehrrolle zu spielen. Diese Peptide können verwendet werden, um bestimmte Immunreaktionen zu unterdrücken, beispielsweise die Abstoßung von Transplantaten zu verhindern.

Die erfindungsgemäßen neuen Polypeptide können intravenös oder intramuskulär verabreicht werden. Zu den geeigneten Trägern für entsprechende Zusammensetzungen können beispielsweise sterile Flüssigkeiten wie Wasser oder ein physiologisches Lösungsmittel oder Substanzen zur Verlängerung der Lebensdauer der Peptide verwendet werden. Zusätzlich zu einem Träger können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen ebenfalls andere Bestandteile wie Stabilisatoren, Anti-Oxydantien, Suspensionsmittel und Konservierungsmittel wie Phenol oder Chlorbutanol

und Verbindungen des gleichen Typs enthalten. Die fertige Lösung kann leicht nach bekannter Filtrationstechnik sterilisiert werden. Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen enthalten in wässriger Lösung eine therapeutisch ausreichende Menge des Mittels. Die zu verabreichende Dosis hängt in großem Umfang von der Art der Erkrankung, vom Zustand und Gewicht des Patienten ab.
Die parenterale Verabreichung ist bevorzugt. Im allgemeinen liegen die täglichen Dosen zwischen 0,00001 mg
bis etwa 0,1 mg an aktiven Wirkstoff je kg Körperge-

wicht des Patienten bei einer oder mehreren Verabreichungen pro Tag. Die bevorzugten täglichen Dosen be-

809851/0698

ANVAR P 743

- 93 -

tragen etwa 0,0001 bis etwa 0,001 mg Wirkstoff je kg Körpergewicht. Eine besonders geeignete injizierbare Dosis enthält 0,01 mg aktiven Wirkstoff, die täglich verabreicht wird. Bei parenteraler Verabreichung besteht die Einheitsdosis normalerweise aus der reinen Verbindung in steriler wässriger Lösung oder in Form eines löslichen Pulvers.

In den folgenden Beispielen werden Zusammensetzungen für pärenterale Verabreichung in Ampullen, in 10 Fläschchen und in Fläschchen für mehrere Dosen beschrieben.

BEISPIEL 15

Pärenterale Lösung mit Gehalt an 0,1 mg Polypeptid 15 Polypeptid 0,1 rag

Steriles destilliertes Wasser, frei von Pyrogenen 1,0 ml sterilisiert durch Filtrieren; abgefüllt in Ampullen, Fläschchen oder Flaschen für mehrere Dosen.

BEISPIEL 16

Ampullen, enthaltend 0,1 mg des gefriergetrockneten Polypeptids

Ampulle;

Polypeptid 0,1 mg

Ampulle;

Verdünnungsmittel: steriles Wasser zur Injektion 1 ml

Wenn nötig, können Vielfache der angegebenen Mengen

verwendet werden.

609851 /0698

Leerseife

Claims (1)

1. 2. INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE' LA RECHERCHE MEDICALE (I.N.S.E.R.M.)

   Neue Polypeptide mit Thymusaktivität oder antagonistischer Aktivität und Verfahren zu ihrer Herstellung.

   Prioritäten: 25. Mai 1977 - Frankreich - 77 15 963

   21. April 1978 - Frankreich - 78 11 870

   PATENTANSPRÜCHE

   1. Polypeptidverbindungen der Sequenz

   -^ X-Gln-Gly-Gly-Y

   in der Y für -Ser-Asn und X für Ser-, Lys-Ser, Ala-Lys-Ser-, Glx-Ala-Lys-Ser- stehen, wobei GIx für PyroGlu oder GIn steht, und in der Y zusätzlich -Ser sein kann, wenn X für Glx-Ala-Lys-Ser- steht; sowie

   809851/0698

   OBIQlNAL INSPECTED

   ANVAR P

   deren Derivate, die 1 oder 2 modifizierte Aminosäuren aufweisen, mit Ausnahme der nichtmodifizierten Verbindung PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn.

   2. Verbindungen nach Anspruch 1, nämlich Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn
   Z Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn
   AIa-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn
   Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn
   10

   3. Verbindungen nach Anspruch 1, nämlich PyroGlu-D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-AIa-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-As£ PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ala-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser
   Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn
   D-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

   4. Verbindungen nach Anspruch 1, nämlich PyroGlu-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-D-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys(N Acetyl)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Orn-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-(N-Methyl)Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ala-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-D-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Thr-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Glu-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Glu(y-Cyano)-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Glu(^CS-NH ₂)-Gly-Gly-Ser-Asn

   80085 - /0698

   ANVAR P

   PyroGlu-Ala-Lys-Ser-D-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Ala-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Ala-Ser-Asn 5 PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Ala-Ala-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Sar-Sar-Ser-Asn PyroGlu-Ala-(2-Amino-hexanoyl)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-(2,6-Diamino-hexynoyl)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-(2,6-Diamino-hexenoyl)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn 10 PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Gln

   PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-CyanAla PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Thio Asn

   5. Verbindungen nach Anspruch 1, nämlich Lys(N⁶-Acetyl)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

   D-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn Orn-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn NcC-Z Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

   PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-ß-Ala-NH ₂ Hep-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn

   Lys-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn

   6. Verbindungen nach Anspruch 1, nämlich PyroGlu-Ala-Hep-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-D-Leu-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn-NHo PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Thr-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-D-Ser-Asn

   809851 /0698

   ANVAR P

   PyroGlu-Ala-Lys^Ser-Asn-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Nva-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Cys(S-CONH ₂)-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Met(0)-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-D-Ala-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-KSln-Gly-Sar-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-D-Leu-Ser-Asn Z-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Ser-Asn D-PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly~Ser-Asn D-Gln-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn Cys(S-CONH ₂)-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn Pro-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn {Aad-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Arg-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Har-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys(N -Acetyl)-Ser-Gln-D-Ala-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-D-Lys(N -Acetyl)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn PyroGlu-Ala-Lys(N -Acetyl)-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-D-Asn

   Ac-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Ser-Asn 20

   7. Polypeptidverbindungen der Sequenz X-Gln-Gly-Gly-Y

   in der Y für -Ser-Asn und X für Ser-, Lys-Ser, Ala-Lys-Ser-,

   Glx-Ala-Lys-Ser- stehen, wobei Glx für PyroGlu oder Gin 25 steht, und in der Y zusätzlich -Ser sein kann, wenn X

   für Glx-Ala-Lys-Ser- steht; sowie deren Derivate mit 1 oder 2 modifizierten Aminosäuren, mit Ausnahme der nichtmodifizierten Verbindung PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-

   Gly-Gly-Ser-Asn, dadurch gekennzeichnet , 30 daß der Sequenz eine Aminosäure zugefügt oder aus der

   809851/0698

   ANVAR P 743

   Sequenz herausgenommen ist,

   8. Verbindungen nach Anspruch 7, nämlich PyroGlu-Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Gly-Ser-Asn

   5 PyroGlu-Äla-Lys-Ser-Gln-Gly-Ser-Asn

   9. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden der Sequenz

   X-Gln-Gly-Gly-Y

   in der Y für -Ser-Asn und X für Ser- oder Ala-Lys-Serstehen, und von ihren Derivaten mit 1 oder 2 modifizierten Aminosäuren, dadurch gekennze lehnet, daß man die dipeptidische geschützte Verbindung Ser-Asn mit der geschützten Peptidverbindung X-Gln-Gly-Gly kuppelt und dann gegebenenfalls die Schutzgruppen entfernt.

   10. Verfahren zur Herstellung von Polypeptiden der Sequenz

   X-Gln-Gly-Gly-Y

   in der Y für -Ser, -Ser-Asn und X für PyroGlu-Ala-Lys-Serstehen, und von ihren Derivaten mit 1 bis 2 modifizierten Aminosäuren, dadurch gekennzeichnet, daß man das geschützte PyroGlu mit der Peptidverbindung Ala-Lys-Ser-Gln-Gly-Gly-Y kuppelt,und daß man dann ge-

   25 gebenenfalls die Schutzgruppen entfernt.

   11. Arzneimittel mit Gehalt an einer Polypeptidverbindung gemäß mindestens einem der Anspruch 1 bis 8 als Wirkstoff.

   12. Pharmazeutische Zusammensetzung mit Gehält an mindestens einer der Polypeptidverbindungen gemäß den Ansprüchen 1 bis 8, und einem pharmazeutisch verträglichen Träger.

   809851/0698