DE10107707A1 - Antagonisten für alpha¶4¶beta¶7¶-Integrin - Google Patents
Antagonisten für alpha¶4¶beta¶7¶-IntegrinInfo
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- C07K7/64—Cyclic peptides containing only normal peptide links
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- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
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Abstract
Die Erfindung betrifft neue, wirksame und selektive alpha¶4¶beta¶7¶-Integrin Antagonisten, die die Zelladhäsion an das mukosale Adressin-Zelladhäsionsmolekül-1(MAdCAM-1) hemmen. Die neuen Integrin-Antagonisten können als therapeutische Wirkstoffe zur Prävention und Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, die mit einer Störung der durch alpha¶4¶beta¶7¶-Integrin vermittelten Zelladhäsion an MAdCAM-1 assoziiert sind.
Description
Die Erfindung betrifft neue, wirksame und selektive α4β7-Integrin
Antagonisten, die die Zelladhäsion an das mukosale Adressin-
Zelladhäsionsmolekül-1(MAdCAM-1) hemmen. Die neuen Integrin-
Antagonisten können als therapeutische Wirkstoffe zur Prävention und
Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden, die mit einer Störung der
durch α4β7-Integrin vermittelten Zelladhäsion an MAdCAM-1 assoziiert sind.
Integrine sind heterodimere Transmembranglykoproteine, die aus einer α-
und einer β-Untereinheit bestehen. Sie sind an Zell-Zell- und Zell-Matrix-
Wechselwirkungen beteiligt (Hynes, Cell 69 (1992), 11-25). Gegenwärtig
sind 15 unterschiedliche α- und β-Untereinheiten bekannt, aus denen nach
heutigem Kenntnisstand mindestens 23 unterschiedliche Integrinrezeptoren
gebildet werden können (Eble, Integrin-Ligand Interaction, Springer-Verlag
Heidelberg (1997) 1-40). Die Familie der Integrine zeigt erhebliche
Unterschiede in ihren biologischen Funktionen und Ligandenspezifitäten.
Die Gruppe der α4-Integrine wird aus α4β7-Integrin und α4β1-Integrin
gebildet. Beide Rezeptoren werden auf den meisten Typen von Leukocyten
exprimiert und vermitteln als Leukocytenrezeptoren sowohl Zell-Zell- als
Zell-Matrix-Wechselwirkungen. Die wichtigsten endogenen Liganden für α4-
Integrine sind das vaskuläre Zelladhäsionsmolekül-1 (VCAM-1) und
Fibronektin (Fn) (Hemler, Annu. Rev. Immunol. 8 (1990), 365-400;
Postigo et al., J. Immunol. 151 (1993), 2471-2483) sowie MAdCAM-1,
das unter physiologischen Bedingungen ausschließlich an α4β7-Integrine
bindet (Berlin et al., Cell 74 (1993), 185-195; Kilger und Holzmann, J.
Mol. Med. 73 (1995), 347-354).
MAdCAM-1 gehört wie VCAM-1 zur Immunglobulinsuperfamilie (IgSF) und
besitzt drei Immunglobulin (Ig) Domänen. Eine kohlenhydratreiche
mucinartige Domäne ist zwischen der zweiten und dritten Ig-Domäne
inseriert. Die Bindung von α4β7-Integrinen an MAdCAM-1 wird
hauptsächlich durch die erste N-terminale Ig-Domäne vermittelt, es sind
jedoch auch Sequenzen aus der zweiten Ig-Domäne beteiligt. Durch
Peptidepitop-Kartierung und ortsspezifische Mutagenese bei MAdCAM-1
konnte das Leu-Asp-Thr-Motiv aus der N-terminalen Ig-Domäne als
notwendig für die Bindung an α4β7-Integrine identifiziert werden (Shroff et
al., Bioorg. Med. Chem. Lett. 6 (1996), 2495-2500; Briskin et al., J.
Immunol. 156 (1996), 719-726; Viney et al., J. Immunol. 157 (1996),
2488-2497).
MAdCAM-1 ist der wichtigste Gegenrezeptor für α4β7-Integrine auf
mukosalen Endothelzellen (Strauch et al., Int. Immunol. 6 (1994), 236-
275). Die organspezifische Adhäsion normaler Lymphocyten und
Lymphomzellen an endotheliale Venulen von Peyer's-Flecken wird durch
α4β7-Integrine vermittelt (Holzmann et al., Cell 56 (1989), 37-46;
Holzmann und Weissmann, EMBO 8 (1989), 1735-1741; Hu et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992), 8254-8288). Im Maus-Modell konnte
gezeigt werden, dass β7-Integrin und/oder MAdCAM-1 spezifische
Antikörper die Rekrutierung von Lymphocyten im entzündeten Darmgewebe
blockieren und signifikant den Verlauf von entzündlichen
Darmerkrankungen lindern (Picarella et al., J. Immunol. 158 (1997), 2099-
20106). Weiterhin können Antikörper gegen β7-Integrine Mäuse vor der
Ausbildung von Insulin-abhängigem Diabetes schützen (Yang et al.,
Diabetes 46 (1997), 1542-1574).
Peptidische Integrin-Inhibitoren sind bekannt. US-A-6,037,324 offenbart
Dipeptide als Inhibitoren von Integrin-MAdCAM-1-Wechselwirkungen.
WO 97/25351 offenbart peptidische Substanden mit an den N- und C-
Terminus gebundenen Gruppen als Mimotope des konservierten
Aminosäuremotivs LDTSL von MAdCAM-1. WO 98/06248 beschreibt
humanisierte Immunglobuline mit hoher Spezifität für Integrine, welche eine
Antigen bindende Region von nichthumanem Ursprung und mindestens
einen Teil eines Immunglobulins von humanem Ursprung aufweisen. US-A-
5,510,332 offenbart Peptide mit einer Länge von 4-13 Aminosäuren
umfassend die LDV-Domäne des CS1-Peptids, welche die Bindung von
α4β1-Integrinen an VCAM-1 oder Fibronektin hemmen. US-A-6,087,330
offenbart zyklische Peptide mit 5-13 Aminosäuren abgeleitet vom CS1-
Peptid, welche die Bindung von α4β7-Integrinen an VCAM-1, Fibronektin
oder Invasin selektiv hemmen. Inhibitoren der Bindung von α4β1-Integrin an
seine Rezeptoren, z. B. VCAM-1, werden auch in US-A-6,096,773
offenbart. Ein Verfahren zur Identifizierung von α4β7-Antagonisten wird in
WO 00/30681 beschrieben.
Die der vorliegenden Erfindung zugrunde liegende Aufgabe bestand darin,
neue Antagonisten von α4β7-Integrinen bereitzustellen, die insbesondere
eine hohe Selektivität für MAdCAM-1 besitzen. Diese Aufgabe wird durch
Bereitstellung neuer zyklischer Peptide gelöst.
Ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind somit peptidische
Verbindungen mit einer Struktur der Formeln (Ia) oder (Ib):
c(X1-D-X2-X3-X4-X5) (Ia)
c(X1-D-X3-X3-X5-X4) (Ib)
worin
X1 ein Aminosäurerest mit einer Leucin- oder Isoleucin-Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L- Konfiguration vorliegt,
D ein Aminosäurerest mit einer Asparagin-Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt,
X2 ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt,
X3 ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten oder sauren oder mit einer aromatischen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D- oder/und L-Konfiguration vorliegt,
X4 ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D-Konfiguration vorliegt und
X5 ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt.
X1 ein Aminosäurerest mit einer Leucin- oder Isoleucin-Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L- Konfiguration vorliegt,
D ein Aminosäurerest mit einer Asparagin-Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt,
X2 ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt,
X3 ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten oder sauren oder mit einer aromatischen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D- oder/und L-Konfiguration vorliegt,
X4 ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D-Konfiguration vorliegt und
X5 ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die erfindungsgemäßen
peptidischen Verbindungen, deren Salze und Derivate eine überraschend
hohe und selektive inhibitorische Wirkung auf die Wechselwirkung von
α4β7-Integrin mit seinem Rezeptor, insbesondere MAdCAM-1 zeigen.
Die monomeren Bausteine der erfindungsgemäßen peptidischen
Verbindungen sind Aminosäuren, vorzugsweise α-Aminocarbonsäuren. Es
können jedoch auch andere Aminosäuren, beispielsweise β-
Aminocarbonsäuren, Aza-Aminosäuren (Derivate von α-
Aminocarbonsäuren, bei denen die α-CH-Gruppe durch ein N-Atom ersetzt
ist) oder/und Peptoid-Aminosäuren (Derivate von α-Aminocarbonsäuren, bei
denen die Aminosäureseitengruppe nicht an das α-C-Atom sondern an die
Aminogruppe gebunden ist) verwendet werden.
Die Aminosäure-Bausteine X1, D, X2, X3 und X5 liegen - sofern sie ein
optisch aktives Zentrum aufweisen - vorzugsweise in der L-Konfiguration
vor. Der Baustein X4 liegt hingegen - sofern er ein optisch aktives Zentrum
aufweist - vorzugsweise in der D-Konfiguration vor. Von den
erfindungsgemäßen Verbindungen sind solche mit einer Struktur der Formel
(Ia) besonders bevorzugt.
Die bevorzugten Bedeutungen der monomeren Bausteine in den
peptidischen Verbindungen sind wie folgt:
X1 ist ein Aminosäurerest mit einer Leucin- oder Isoleucin-Seitenkette, vorzugsweise mit einer Leucin-Seitenkette. Besonders bevorzugt ist X1 die α-Aminocarbonsäure L-Leucin.
D ist ein Aminosäurerest mit einer Asparagin-Seitenkette, besonders bevorzugt die α-Aminocarbonsäure L-Asparaginsäure.
X2 ist ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten Seitenkette, die vorzugsweise 1-3 C-Atome, insbesondere 2 C-Atome aufweist, vorzugsweise mit einer Threonin- oder Valin-Seitenkette. Besonders bevorzugt wird X2 aus den α- Aminocarbonsäuren L-Threonin und L-Valin ausgewählt.
X3 ist ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten oder sauren, die beispielsweise 1-4 C-Atome aufweist, oder mit einer aromatischen Seitenkette, vorzugsweise mit einer Alanin-, Asparaginsäure-, Phenylalanin- oder Phenylglycin (Phg)-Seitenkette. Besonders bevorzugt ist X3 eine α- Aminocarbonsäure ausgewählt aus L-Alanin, L-Asparaginsäure, L- Phenylalanin und D- oder/und L-Ph.
X4 ist ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette, die günstigerweise ein optisches aktives Zentrum aufweist, das in D- Konfiguration vorliegt. Beispielsweise kann X4 ein α- Aminocarbonsäurerest ausgewählt aus D-Prolin, D-Phenylalanin und anderen beliebigen D-α-Aminocarbonsäureresten sein.
X5 kann an sich beliebiger Aminosäurerest sein, wobei Aminosäurereste mit einer aromatischen Seitenkette, wie etwa einer Phenylalanin-, Tyrosin-, Histidin-, Benzoylphenylalanin (Bpa)- oder Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (Tic)-Seitenkette bevorzugt sind. Andererseits kann X5 auch andere Bedeutungen wie etwa Methionin oder Arginin aufweisen. Besonders bevorzugt ist X5 eine α-Aminocarbonsäure ausgewählt aus L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L- Histidin, L-Bpa, L-Tic, L-Methionin oder L-Arginin.
X1 ist ein Aminosäurerest mit einer Leucin- oder Isoleucin-Seitenkette, vorzugsweise mit einer Leucin-Seitenkette. Besonders bevorzugt ist X1 die α-Aminocarbonsäure L-Leucin.
D ist ein Aminosäurerest mit einer Asparagin-Seitenkette, besonders bevorzugt die α-Aminocarbonsäure L-Asparaginsäure.
X2 ist ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten Seitenkette, die vorzugsweise 1-3 C-Atome, insbesondere 2 C-Atome aufweist, vorzugsweise mit einer Threonin- oder Valin-Seitenkette. Besonders bevorzugt wird X2 aus den α- Aminocarbonsäuren L-Threonin und L-Valin ausgewählt.
X3 ist ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten oder sauren, die beispielsweise 1-4 C-Atome aufweist, oder mit einer aromatischen Seitenkette, vorzugsweise mit einer Alanin-, Asparaginsäure-, Phenylalanin- oder Phenylglycin (Phg)-Seitenkette. Besonders bevorzugt ist X3 eine α- Aminocarbonsäure ausgewählt aus L-Alanin, L-Asparaginsäure, L- Phenylalanin und D- oder/und L-Ph.
X4 ist ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette, die günstigerweise ein optisches aktives Zentrum aufweist, das in D- Konfiguration vorliegt. Beispielsweise kann X4 ein α- Aminocarbonsäurerest ausgewählt aus D-Prolin, D-Phenylalanin und anderen beliebigen D-α-Aminocarbonsäureresten sein.
X5 kann an sich beliebiger Aminosäurerest sein, wobei Aminosäurereste mit einer aromatischen Seitenkette, wie etwa einer Phenylalanin-, Tyrosin-, Histidin-, Benzoylphenylalanin (Bpa)- oder Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (Tic)-Seitenkette bevorzugt sind. Andererseits kann X5 auch andere Bedeutungen wie etwa Methionin oder Arginin aufweisen. Besonders bevorzugt ist X5 eine α-Aminocarbonsäure ausgewählt aus L-Phenylalanin, L-Tyrosin, L- Histidin, L-Bpa, L-Tic, L-Methionin oder L-Arginin.
Besonders bevorzugte konkrete Beispiele für erfindungsgemäße peptidische
Verbindungen sind im folgenden angegeben:
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-A)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-F)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-H)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Y)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-M)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Bpa)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Tic)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-A)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-F)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-H)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Y)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-M)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Bpa)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Tic)
Neben Peptiden der Strukturformeln (Ia) und (Ib) sind auch pharmazeutisch
verträgliche Salze und Derivate davon als α4β7-Integrin-Inhibitoren geeignet.
Als Derivate kommen dabei insbesondere solche Verbindungen in Betracht,
die an reaktiven Gruppen der Seitenkette, z. B. an Hydroxyl-, Amino- oder
Carbonsäuregruppen, modifiziert sind. Beispiele für eine solche
Modifizierung sind eine Acylierung, z. B. eine Acetylierung von
Aminogruppen oder/und eine Amidierung oder Veresterung von
Carbonsäuregruppen.
Die Bausteine der erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen sind über
Säure-Amid-Bindungen -CONR1- oder -NR1CO- verknüpft, d. h. die
Peptidsequenzrichtung kann umgekehrt werden (Retropeptide). R1 kann wie
in nativen Polypeptiden Wasserstoff bedeuten. Andererseits kann R1 jedoch
auch eine Alkylrest, z. B. ein C1 bis C3-Alkylrest wie etwa Methyl oder
Ethyl insbesondere Methyl bedeuten, da durch eine N-Alkylierung der
Amidbindung oftmals eine starke Aktivitätsbeeinflussung bewirkt werden
kann (vgl. z. B. Levian-Teitelbaum et al., Biopolymers 28 (19891, 51-64).
Darüber hinaus kann - wie bereits ausgeführt - R1 bei Peptoid-
Aminosäurederivaten auch die eigentliche Aminosäuren-Seitenkette
enthalten.
Die erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen sind zyklische
Verbindungen, worin bei Struktur (Ia) die Bausteine X1 und X5 und - bei
Struktur (Ib) - die Bausteine X1 und X4 miteinander verbrückt sind. Diese
Verbrückung erfolgt vorzugsweise über N- und C-Terminus des Peptids.
Die erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen sind durch chemische
Synthese, wie in den Beispielen erläutert, erhältlich. Die Verbindungen
können in isolierter Form oder gegebenenfalls gekoppelt an
makromolekulare Trägersubstanzen, z. B. Dextran oder Polypeptide
vorliegen. Die Kopplung an Trägersubstanzen kann über Spacer oder/und
Aminosäure-Seitenketten, z. B. über X4, erfolgen.
Weiterhin betrifft die Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung,
die als Wirkstoff mindestens eine peptidische Verbindung wie zuvor
definiert, gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch üblichen Träger-,
Hilfs- oder Verdünnungsmitteln enthält. Insbesondere werden die
erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen zur Herstellung von α4β7-
Integrin-Inhibitoren verwendet, die sich auch zur Diagnose, Prävention
oder/und Bekämpfung von mit α4β7 assoziierten Krankheiten, z. B. chronisch
entzündlichen Darmerkrankungen wie Morbus Crohn und Colitis ulcerosa,
aber auch Autoimmunerkrankungen, insbesondere Asthma, Typ-I Diabetes
und rheumatoider Arthritis sowie Nahrungsmittelallergien eignen. (Kilger, G.,
Holzmann, J., J. Mol. Med. 1995, 73, 347 ff.). Weitere
Anwendungsgebiete stellen strahlungs- und strahlentherapiebedingte
Magen-Darm-Trakt-Schädigungen dar. Zusätzlich sind Tumore mit α4β7-
Beteiligung wie z. B. Non Hodgkin Lymphom, lymphoblastisches T-Zell
Lymphom sowie MALT-Lymphome besonders bevorzugte
Anwendungsgebiete der erfindungsgemäßen Verbindungen. Besonders
bevorzugt werden die erfindungsgemäßen Verbindungen zur selektieren
Inhibierung der Wechselwirkung von α4β7-Integrin mit MAdCAM-1
verwendet, wobei für diesen Zweck besonders bevorzugt solche
Verbindungen eingesetzt werden, die bezüglich der Wechselwirkung
zwischen α4β7-Integrin und MAdCAM-1 eine mindestens um den Faktor 2
höhere Hemmwirkung als bezüglich der Wechselwirkung zwischen α4β7-
Integrin und VCAM-1 haben.
Noch ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur
Inhibierung von α4β7-Integrin, wobei man eine erfindungsgemäße
peptidische Verbindung in einer wirksamen Dosis in ein α4β7-Integrin
enthaltendes biologisches System, beispielsweise eine Zelle oder einen
Organismus einbringt. Das erfindungsgemäße Verfahren umfasst auch die
Verabreichung des Wirkstoffs an ein bedürftiges Subjekt, insbesondere
einen menschlichen Patienten.
Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen können in
beliebiger Form vorliegen, beispielsweise als Tabletten, als beschichtete
Tabletten oder in Form von Lösungen oder Suspensionen in wässrigen oder
nichtwässrigen Lösungsmitteln. Die peptidischen Verbindungen werden
vorzugsweise oral oder parenteral in einer flüssigen oder festen Form
verabreicht. Bei Verabreichung in flüssiger Form wird Wasser vorzugsweise
als Trägermedium verwendet, das gegebenenfalls Stabilisatoren,
Löslichkeitsvermittler und/oder Puffer enthält, die üblicherweise für
Injektionslösungen verwendet werden. Solche Zusatzstoffe sind
beispielsweise Tartrat- oder Boratpuffer, Ethanol, Dimethylsulfoxid,
Komplexierungsmittel wie etwa EDTA, Polymere wie etwa flüssiges
Polyethylenglycol, etc.
Bei Verabreichung in fester Form können feste Trägersubstanzen wie etwa
Stärke, Lactose, Mannitol, Methylcellulose, Talkum, hochdisperses
Siliciumoxid, hochmolekulare Fettsäuren wie etwa Stearinsäure, Gelatine,
Agar, Calciumphosphat, Magnesiumstearat, tierische oder pflanzliche Fette
oder feste hochmolekulare Polymere wie etwa Polyethylenglykole
eingesetzt werden. Weiterhin können die Formulierungen zur oralen
Applikation, sofern gewünscht, auch Aroma- und Süßstoffe enthalten.
Die erfindungsgemäßen peptidischen Verbindungen können auch in
Komplexen vorliegen, z. B. mit Cyclodextrinen wie etwa α, β oder γ-
Cyclodextrin.
Für therapeutische Anwendungen hängt die verabreichte Dosis vom Alter,
Gesundheitszustand und Gewicht des Patienten, von der Art und der
Schwere der Erkrankung, von der Art der Behandlung, von der Häufigkeit
der Verabreichung und der Art der gewünschten Wirkung ab. Die tägliche
Dosis der aktiven Verbindung ist üblicherweise 0,01 bis 50 mg/kg
Körpergewicht. Normalerweise sind 0,1 bis 40 und vorzugsweise 0,5 bis
20 mg/kg/Tag in einer oder mehreren Dosen ausreichend, um die
gewünschten Wirkungen zu erzielen.
Weiterhin soll die Erfindung durch die im nachfolgenden beschriebenen
Figuren und Beispiele erläutert werden. Es zeigt:
Fig. 1 die Bindung von 38-β7 Lymphomzellen (α4β7) und Jurkat-Zellen
(α4β1) nach Inkubation mit zyklischen Peptiden an immobilisiertes VCAM-1
und MAdCAM-1. Die Ergebnisse sind als Mittelwerte ±
Standardabweichung angegeben.
Lineare Peptide wurden unter Verwendung der Festphasen-Peptidsynthese
nach Merrifield an einem Tritylchlorid (Trt)-Harz (Rapp-Polymere, Tübingen,
Deutschland) unter Verwendung von Fmoc-Aminosäurederivaten (Fields
und Noble, Int. J. Pept. Prod. Res. 35 (1990), 161-214) hergestellt. Die
Fmoc-geschützten Aminosäuren wurden mit O-(1-H-Benzotriazol-1-yl)-
N,N,N',N'-Tetramethyluroniumtetrafluoroborat(Richelieu, Biotechnologies,
Montreal, Kanada), 1-Hydroxybenzotriazol (Novabiochem, Läufelfingen,
Schweiz) und Diisopropylethylamin als Base in N-Methylpyrrolidon als
Lösungsmittel durchgeführt. Die vollständig geschützten linearen
Aminosäuren wurden vom Harz unter Verwendung einer Mischung aus
Dichlormethan, Trifluorethanol und Essigsäure (8 : 1 : 1) abgespalten. Die
Zyklisierung der linearen Sequenzen erfolgte bei hoher Verdünnung in
Dimethylformamid (cirka 1,25 × 10-3 M) mittels in situ Aktivierung unter
Verwendung von Diphenylphosphorazidat unter Verwendung von
Natriumbicarbonat als fester Base (Brady et al., Peptides'83: Structures
and Function, 8th Ann. Pept. Symp.; Pierce Chemical Company, Illinois,
USA (1983), 127-130). Die Abspaltung der Schutzgruppen erfolgte durch
Behandlung mit 90% Trifluoressigsäure, 6% Triisopropylsilan und 4%
Wasser. Nach Aufreinigung durch Reverse Phase-HPLC wurden Peptide
mit einer Reinheit < 98% erhalten. Die Peptide wurden durch ESI-
Massenspektroskopie und 1D, 2D1H, 13C-NMR Spektroskopie
charakterisiert (Kessler und Seip: NMR of peptides. In: Two-Dimensional
NMR Spectroscopy: Applications for Chemists and Biochemists; Croasmun,
Carlson, Hrsg. VCH Publishers: New York (1994), 619-654).
Mit MAdCAM-1 transfizierte CHO-Zellen (2-3 × 104/Loch) wurden in 96-
Lochplatten gegeben und für 24 h kultiviert. Konfluente Zell-Monoschichten
wurden einmal mit Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) und anschließend
mit Adhäsionstest-Puffer (24 mM Tris, pH 7,4, 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl,
2 mM Glucose und 1% Rinderserumalbumin) gewaschen. Für
Adhäsionstests mit MAdCAM-Immunglobulin wurden die 96 Lochplatten
mit Maultier-Anti-Human IgG (0,5 µg in 100 µl PBS/Loch) über Nacht bei
4°C beschichtet. Die Platten wurden mit Adhäsionstest-Puffer (Click's
RPMI, 1% Rinderserumalbumin, 1,0 mM Ca2+, 1,0 mM Mg2+) gewaschen
und mit 100 ng MAdCAM-Immunglobulin für 30 min bei Raumtemperatur
inkubiert. Nach Waschen wurden die Platten mit Adhäsionstest-Puffer für
1 h bei 37°C blockiert. Alternativ wurden die Platten für 16 h bei 4°C mit
400 ng/Loch VCAM-1 oder 2 µg/Loch gereinigtem Laminin in 50 mM
Carbonatpuffer pH 9,4 beschichtet.
38-β7 Lymphomzellen (Strauch et al. (1994) Supra; Hu et al., (1992)
Supra), Jurkat-Lymphomzellen oder humane periphere Blutlymphocyten
wurden für 30 min bei 37°C mit 12 µg/mL des Farbstoffs H33342
(Calbiochem, La Jolla, Kalifornien) in Zelladhäsionspuffer markiert und mit
PBS enthaltend 1 mM EDTA und anschließend nochmals mit PBS
gewaschen. Die Zellen (8 × 105 Zellen/mL) wurden in Zelladhäsionspuffer
mit 1,0 mM Ca2+ und 1,0 mM Mg2+ resuspendiert. Die zyklischen Peptide
wurden mit den Zellen bei einer Endkonzentration von 1 mg/mL für 10 min
bei 37°C vorinkubiert. Anschließend erfolgte eine 30-minütige Adhäsion
der Zellen bei 37°C. Nicht adhärente Zellen wurden durch Zentrifugation
für 10 min bei 50 g entfernt. Die Adhäsionstests wurden quantitativ durch
Fluorimetrie unter Verwendung eines Cytofluor 2300 Gerätes (Millipore,
Bedford, Massachussets) ausgewertet.
Zunächst wurden 5 zyklische Pentapeptide mit der Sequenz cyclo(L-D-T-A-
A) synthetisiert, worin jeweils eine Aminosäure in D-Konfirmation vorliegt.
An Stelle von D-Alanin wurde jedoch D-Prolin verwendet. Auf diese Weise
wurden die zyklischen Pentapeptide P1 bis PS (Tabelle 1) erhalten.
Anschließend wurde dieselbe Methode für das Hexapeptid cyclo(L-D-T-A-A-
A) verwendet, wobei die 6 Verbindungen P6 bis P11 (Tabelle 1) erhalten
wurden. Die zyklischen Peptide wurden auf ihre Fähigkeit zur Hemmung der
Adhäsion von α4β7-Integrin exprimierenden 38-β7 Lymphomzellen an stabil
mit MAdCAM-1 transfizierten CHO-Zellen getestet. Die Ergebnisse sind in
Tabelle 1 zusammengefasst.
Nur die 2 Hexapeptide P10 und P11 zeigten eine wirksame Hemmung der
Bindung von α4β7-Integrinen an MAdCAM-1. Die Verbidung P10 zeigte eine
höhere Aktivität als P1 l. Die lineare Vorstufe des zyklischen Hexapeptids
P10 H2N-L-D-T-A-p-A-OH zeigte keine Aktivität selbst bei einer hohen
Konzentration von 2 mg/ml.
Auf Basis dieser Ergebnisse wurde die zyklische Peptidstruktur P10
(entsprechend der peptidischen Verbindung Ia) als Leitstruktur für weitere
Optimierungen verwendet.
Nach Ermittlung der Leitstruktur wurde systematisch jeder Aminosäurerest
in P10 optimiert. In diesen Experimenten wurde die biologische Aktivität
durch Hemmung der Adhäsion von 38-β7 Lymphomzellen an ein
immobilisiertes MAdCAM-Ig Fusionsprotein bestimmt. Verglichen mit CHO-
MAdCAM-1 Transfektanten als Substrat ergibt die Beschichtung von
Platten mit dem MAdCAM-Ig Protein eine höhere Ligandendichte und
bewirkt stringentere Bedingungen für die Selektion nach biologisch aktiven
Verbindungen. Die Hemmung der 38-β7 Zelladhäsion an MAdCAM-Ig mit
1 mg/ml des Inhibitors P10 war daher weniger wirksam als die Hemmung
der Bindung an CHO-MAdCAM-1 (38% restliche Adhäsion für MAdCAM-Ig
gegenüber 7% für CHO-MAdCAM Zellen; vgl. Tabellen 1 und 2).
Innerhalb des LDT-Motivs von Peptid P10 wurden Modifikationen unter
Verwendung funktionell verwandter Aminosäuren durchgeführt. Leucin
(P10 und P18) wurde durch Valin (P13), Isoleucin (P14), Phenylalanin
(P20), D- und L-Phenylglycin (P21 und P22) und auch durch Glycin (P12)
ersetzt. Threonin (P10 und P18) wurde durch Glycin (P15), Serin (P16) und
Valin (P17 und P19) ersetzt. Die Substitution von Leucin durch Glycin
(P12), Valin (P13), Phenylalanin (P20) oder D- und L-Phenylglycin (P21 und
P22) führte zu inaktiven Verbindungen. Bei Ersetzen von Leucin durch
Isoleucin (P14) konnte noch Aktivität nachgewiesen werden. Auch bei
Austausch von Threonin durch Valin (P17 und P19) blieb die Aktivität
erhalten, während bei Glycin (P15) und Serin (P16) keine Aktivität
gefunden wurde (Tabelle 2).
Die Aminosäuren an den Positionen 4 bis 6 von P10 (cyclo(L1-D2-T3-A4-p5-
A6) wurden ebenfalls systematisch variiert. Alanin an Position 6 wurde
durch saure (Asparaginsäure, Glutaminsäure), basische (Arginin) oder
aromatische (Phenylalanin, Tyrosin, Histidin) Reste sowie durch Threonin
und Methionin ersetzt. Weiterhin wurden die nicht-natürlichen hydrophoben
Aminosäuren Benzoylphenylalanin (Bpa), Cyclohexylglycin (Chg) und
Tetrahydroisochinolin-3-carbonsäure (Tic) verwendet.
Der Austausch von Alanin an Position 6 durch Asparaginsäure (P23) und
Glutaminsäure (P24) führte zu einem Aktivitätsverlust. Im Einklang mit
diesem Befund steht auch die geringe inhibitorische Wirkung der Peptide
P37, P38 und P42 bis P45. Im Gegensatz dazu konnte durch Ersetzen von
Alanin durch aromatischen Aminosäurereste Phenylalanin (P25 und P28),
Tyrosin (P30), Histidin (P29), Bpa (P32) oder Tic (P34) die Aktivtät stark
erhöht werden. Auch Verbindungen mit Methionin (P31) und Arginin (P26)
zeigten eine erhöhte Aktivität. Peptide, die Threonin (P27) und Chg (P33)
an Position 6 enthalten, zeigen eine ähnliche Aktivität wie die
Ausgangsmoleküle.
Das Ersetzen von D-Prolin (P18) an Postition 5 durch D-Phenylalanin (P35)
hatte einen keinen Einfluss auf die inhibitorische Wirkung. Offensichtlich ist
die D-Aminosäure nicht direkt an der Bindung an den Integrin-Rezeptor
beteiligt. Ihre Funktion scheint ausschließlich darin zu bestehen, die aktive
Komformation der pharmakophoren Reste zu induzieren. Daher ist diese
Position frei zur weiteren Manipulation, z. B. zur Kopplung an
Trägersubstanzen, Markierungsgruppen wie Fluoreszenzfarbstoffe oder zur
D1- oder Multimerisierung.
Das Ersetzen von Alanin an Position 4 durch Asparaginsäure führte zu
keiner Beeinträchtigung der inhibitorischen Wirkungen der Verbindungen
(P10 bis P18, P17 bis P19 und P25 bis P28). Das Vorhandensein von Lysin
(P39 bis P41) führte jedoch zu einer erheblichen Verringerung der Aktivität.
Neben der biologischen Aktivität ist auch die Selektivität eine wichtige
Eigenschaft bei der Entwicklung von pharmakologischen Wirkstoffen.
Zunächst wurde daher der Einfluss der Peptide P28 bis P31 auf die Bindung
von humanen peripheren Blutlymphocyten (PBL) an Laminin untersucht.
Diese Wechselwirkung wird hauptsächlich durch das Integrin α6β1
vermittelt. Die Ergebnisse zeigen, dass die getesteten Verbindungen keinen
Einfluss auf die α6β1 abhängige PBL-Adhäsion an Laminin zeigten (Tabelle
3). Kontrollexperimente zeigten, dass die Bindung PBL an MAdCAM-Ig
durch diese Verbindungen stark gehemmt wurde.
Zur weiteren Bestimmung der Selektivität wurde die Fähigkeit der Peptide
zur Hemmung der Bindung von α4β7-Integrin und des strukturelle
verwandten α4β7-Integrins an VCAM-1 untersucht. Die durch α4β1-Integrin
vermittelte Adhäsion wurde unter Verwendung von Jurkat-Lymphomzellen
(α4β1+, α4β1-) getestet. Unsere Ergebnisse zeigen, dass α4β7/VCAM-1
Wechselwirkungen auch durch Peptide P25 und P28 bis P31 inhibiert
wurden, allerdings mit erheblich geringerer Stärke als die α4β7-Bindung an
MAdCAM-1. Im Gegensatz dazu hatten die untersuchten zyklischen Peptide
keinen Einfluss auf die Adhäsion von α4β1-Integrin an VCAM-1 (P25, P28
und P31) oder sie zeigten nur eine sehr geringe inhibitorische Wirksamkeit
(P29 und P30). Die inhibitorische Wirksamkeit von P28 bis P30 für die α4β1
vermittelte Zelladhäsion an VCAM-1 waren jedoch erheblich geringer als
die diejenige für die α4β7/MAdCAM-1 Wechselwirkung. Das negative
Kontrollpeptid P46 hatte keinerlei inhibitorische Wirksamkeit. Die
Ergebnisse sind in Tabelle 4 und Fig. 1 zusammengefasst.
Die Verwendung von zyklischen Peptiden führte zur Identifizierung des
zyklischen Hexapeptids P10 cyclo(L-D-T-A-p-A), welches ein Inhibitor der
MAdCAM-1/α4β7-Integrinwechselwirkung ist. Die aktive Komfirmation der
Verbindung P10 besteht aus 2 gegenüberliegenden β-Kehren mit dem D-
Prolin an der Position i + 1 einer βII-Kehre und der Asparaginsäure an der
Position i + 1 einer βI und/oder βII-Kehre. Ein systematischer Austausch
der Aminosäurereste unter Beibehalt der Rückgratstruktur ergab mehrere
zyklische Hexapeptide mit verbesserter Aktivität (P25, P28 bis P30). Die
hohe Selektivität dieser Peptide zeigte sich durch ihre starke Hemmung der
α4β7/MAdCAM-1 Wechselwirkung ohne signifikante Hemmung der
α4β1/VCAM Wechselwirkung.
Die erfindungsgemäß identifizierten zyklischen Peptide, Salze und
Additionsverbindungen sowie davon abgeleitete peptidische Verbindungen
sind als therapeutische Wirkstoffe zur Behandlung oder Prävention von
α4β7-Integrin assoziierten Krankheiten geeignet.
Neben den im Beispiel 1 angegegenen zyklischen Peptiden konnten noch
weitere zyklische Peptide als aktiv identifiert werden. Es sind dies die
Peptide DG403 c(L-D-F-D-p-F) und DG404-2 c(L-D-Phg-D-p-F), wobei Phg
in D- oder/und L-Konfiguration vorliegen kann.
Die biologische Aktivität dieser Peptide ist in Tabelle 5 gezeigt. Es ist zu
erkennen, dass die Peptide eine hohe und selektive inhibitorische Wirkung
auf die α4β7/MAdCAM-Wechselwirkung besitzen.
Claims (19)
1. Peptidische Verbindungen mit einer Struktur der Formeln (Ia) oder
(Ib):
c(X1-D-X2-X3-X4-X5) (Ia)
c(X1-D-X3-X3-X5-X4) (Ib)
worin
X1 ein Aminosäurerest mit einer Leucin- oder Isoleucin- Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt,
D ein Aminosäurerest mit einer Asparagin-Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist ist - in L- Konfiguration vorliegt,
X2 ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt,
X3 ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten oder sauren oder mit einer aromatischen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D- oder/und L-Konfiguration vorliegt,
X4 ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D- Konfiguration vorliegt,
X5 ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L- Konfiguration vorliegt.
c(X1-D-X2-X3-X4-X5) (Ia)
c(X1-D-X3-X3-X5-X4) (Ib)
worin
X1 ein Aminosäurerest mit einer Leucin- oder Isoleucin- Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt,
D ein Aminosäurerest mit einer Asparagin-Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist ist - in L- Konfiguration vorliegt,
X2 ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L-Konfiguration vorliegt,
X3 ein Aminosäurerest mit einer aliphatischen und gegebenenfalls hydroxylierten oder sauren oder mit einer aromatischen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D- oder/und L-Konfiguration vorliegt,
X4 ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in D- Konfiguration vorliegt,
X5 ein Aminosäurerest mit einer beliebigen Seitenkette ist, der - sofern er ein optisch aktives Zentrum aufweist - in L- Konfiguration vorliegt.
2. Verbindungen nach Anspruch 1,
dadurch gekennzeichnet,
dass sie eine Struktur der Formel (Ia) aufweisen.
3. Verbindungen nach Anspruch 1 oder 2,
dadurch gekennzeichnet,
dass X1 ein Aminosäurerest mit einer Leucin-Seitenkette ist.
4. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 3,
dadurch gekennzeichnet,
dass X2 ein Aminosäurerest mit einer Threonin- oder Valin-
Seitenkette ist.
5. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 4,
dadurch gekennzeichnet,
dass X3 ein Aminosäurerest mit einer Alanin-, Asparaginsäure-,
Phenylalanin- oder Phenylglycin (Phg)-Seitenkette ist.
6. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 5,
dadurch gekennzeichnet,
dass X4 ein Aminosäurerest mit einer Prolin- oder Phenylalanin-
Seitenkette ist.
7. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass X5 ein Aminosäurerest mit einer aromatischen Seitenkette ist.
8. Verbindungen nach Anspruch 7,
dadurch gekennzeichnet,
dass X5 ein Aminosäurerest mit einer Phenylalanin-, Tyrosin-,
Histidin-, Bpa- oder Tic-Seitenkette ist.
9. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 6,
dadurch gekennzeichnet,
dass X5 ein Aminosäurerest mit einer Methionin- oder Arginin-
Seitenkette ist.
10. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 9,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Aminosäurereste jeweils unabhängig aus α-
Aminocarbonsäureresten, β-Aminocarbonsäureresten, Aza-
Aminosäureresten und Peptid-Aminosäureresten ausgewählt sind.
11. Verbindungen nach Anspruch 10,
dadurch gekennzeichnet,
dass die Aminosäurereste aus α-Aminocarbonsäureresten
ausgewählt sind.
12. Verbindungen nach einem der Ansprüche 1 bis 11 ausgewählt aus:
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-A)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-F)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-H)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Y)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-M)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Bpa)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Tic)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-A)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-F)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-H)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Y)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-M)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Bpa)
c(L-D-T/V/F/Phg-A/D-p-Tic)
13. Pharmazeutische Zusammensetzung,
dadurch gekennzeichnet,
dass sie als Wirkstoff mindestens eine Verbindung nach einem der
Ansprüche 1 bis 12 gegebenenfalls zusammen mit pharmazeutisch
üblichen Träger-, Hilfs- und Verdünnungsmitteln enthält.
14. Verwendung einer peptidischen Verbrückung nach einem der
Ansprüche 1 bis 12 zur Herstellung eines α4β7-Inhibitors.
15. Verwendung nach Anspruch 14 zur Herstellung eines Inhibitors, der
für die Wechselwirkung zwischen α4β7-Integrinen und MAdCAM-1
selektiv ist.
16. Verfahren nach Anspruch 14 oder 15 zur Inhibierung von α4β7-
Integrin vermittelten Zell-Zell- oder Zell-Matrix-Wirkungen.
17. Verwendung nach einem der Ansprüche 14 bis 16 zur Diagnose,
Prävention oder/und Therapie von Erkrankungen, die mit α4β7-
Integrinen assoziiert sind.
18. Verfahren zur Inhibierung von α4β7-Integrinen,
dadurch gekennzeichnet,
dass man eine peptidische Verbindung nach einem der Ansprüche 1
bis 12 in einer wirksamen Dosis in ein α4β7-Integrin enthaltendes
biologisches System einbringt.
19. Verfahren zur Diagnose, Prävention oder/und Therapie von
Erkrankungen, die mit α4β7-Integrinen assoziiert sind,
dadurch gekennzeichnet,
dass man eine peptidische Verbindung nach einem der Ansprüche 1
bis 12 in einer wirksamen Dosis an ein bedürftiges Subjekt, z. B.
einen Patienten, verabreicht.
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Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
8139 | Disposal/non-payment of the annual fee |