DE69105207T2

DE69105207T2 - Peptidverbindungen mit wachstumshormonfreisetzender aktivität.

Info

Publication number: DE69105207T2
Application number: DE69105207T
Authority: DE
Inventors: Cyril Bowers; Wayne Cody; Charles Foster; John Hubbs; Frank Momany
Original assignee: Polygen Holding Corp
Current assignee: Tulane University
Priority date: 1990-07-24
Filing date: 1991-07-23
Publication date: 1995-05-11
Anticipated expiration: 2011-07-24
Also published as: DE69105207D1; RO111370B1; EP0540676B1; CN1061606A; ES2067244T3; HUT62605A; FI930261A; DK0540676T3; IE912585A1; AU8425991A; EP0540676A1; NO930203L; PT98439A; GR3014916T3; MX9100341A; CA2086928A1; PL167804B1; NO930203D0; JPH05509105A; ATE114157T1

Description

Diese Erfindung betrifft neue Polypeptidverbindungen, die die Freisetzung von Wachstumshormon fördern, wenn sie an Tiere verabreicht werden. In einem weiteren Aspekt betrifft diese Erfindung Verfahren zur Förderung der Freisetzung und zur Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln in Tieren durch Verabreichung von bestimmten wachstumshormonfreisetzenden Polypeptid- Verbindungen an diese.

Hintergrund der Erfindung

Die Erhöhung von Wachstumshormon-(GH)-Spiegein bei Säugetieren nach Verabreichung von GH-freisetzenden Verbindungen kann zu einem verbesserten Körpergewicht und zu einer verbesserten Milchproduktion führen, wenn ausreichend erhöhte GH-Spiegel nach der Verabreichung auftreten. Ferner ist bekannt, daß die Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln in Säugetieren durch die Anwendung von bekannten wachstumshormonfreisetzenden Wirkstoffen, wie z. B. die natürlich vorkommenden Wachstumshormon-Releasinghorinone, erreicht werden kann.
Die Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln in Säugetieren kann auch durch Anwendung von wachstumshormonfreisetzenden Peptiden erzielt werden, von welchen einige früher beschrieben wurden, beispielsweise in der U.S. 4,223,019, U.S. 4,223,020, U.S. 4,223,021, U.S. 4,224,316, U.S. 4,226,857, U.S. 4,228,155, U.S. 4,228,156, U.S. 4,228,157, U.S. 4,228,158, U.S. 4,410,512, U.S. 4,410,513, U.S. 4,411,890 und U.S. 4,839,344.
Antikörper des endogenen Wachstumshormonfreisetzungsinhibitors, Somatostatin (SRIF), wurden ebenfalls verwendet, um erhöhte GH-Spiegel zu verursachen. In diesem letzteren Beispiel werden Wachstumshormonspiegel erhöht, indem der endogene GH- Freisetzungsinhibitor (SRIF) entfernt wird, bevor er die Hypophyse erreicht, wo er die Freisetzung von GH inhibiert.
Jedes dieser Verfahren zur Förderung der Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln ist mit Materialien verbunden, die in ausreichender Reinheit zur Verabreichung an ein Empfängertier teuer zu synthetisieren und/oder isolieren sind. Kurzkettige, relativ einfache Polypeptide, die die Fähigkeit haben, die Freisetzung von Wachstumshormonen zu fördern, wären wünschenswert, da sie schnell und preiswert herzustellen, einfach chemisch und/oder physikalisch zu modifizieren sowie leicht zu reinigen und zu formulieren sein sollten. Weiterhin sollten sie hervotrragende Transportiegenschaften haben.
Die Dokumente zum Stand der Technik WO 89/07110, WO 89/07111 und WO 89/10933 beschrieben kurzkettige Polypeptide, die GH- freisetzende Aktivität haben. Diese Dokumente zeigen Polypeptide, die jeweils die allgemeine Formel haben: X-AA2-AA3-Trp- AA5-Y-Z, AA1-AA2-AA3-Trp-AA5-AA6-AA7-Z bzw. Ala-AA2-AA3-Trp- AA5-Y-Z. DPHe und DTrp ist in jedem Fall an der AA2-Position vorgeschlagen.

Kurzbeschreibung der Erfindung

Wir haben nun verschiedene neue Polypeptidverbindungen gefunden, die die Freisetzung von Wachstumshormon in Tieren fördern. Diese Polypeptide haben die Formel A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-Trp-A&sub5;-A&sub6;- Z, wobei A&sub1; His, 3(NMe)His, A&sub0;-His, A&sub0;-3(NMe)His, Ala, Tyr oder His-Ala ist, wobei A&sub0; jede natürlich vorkommende L-Aminosäure, Met(O), DOPA, Abu oder Peptide der Formel L-A&sub0; ist, wobei L H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys, Tyr-DAla-Phe-Gly, Tyr- DAla-Gly-Phe, Tyr-Ala-Gly-Thr oder Tyr-DAla-Phe-Sar ist, vorzugsweise A&sub0; jede natürlich vorkommende Aminosäure ist, bevorzugter A&sub0; Ala, Lys oder Glu ist; A&sub2; DβNal ist; A&sub3; Ala, Gly oder Ser ist; A&sub5; DPhe, D/Lβ(Me)Phe oder (NMe)DPhe ist; A&sub6; B-G oder G ist, wobei B jede natürlich vorkommende L-Aminosäure, Dipeptide aller natürlich vorkommenden Aminosäuren oder H&sub2;N(CH&sub2;)nCO&sub2;H ist (wobei n=2 - 12), und G Arg, iLys, oder Orn ist; Z die C-terminale Endgruppe -CONR¹R², -COOR1 oder -CH&sub2;OR¹ ist (wobei R¹ H, eine Alkylgruppe mit von 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe mit von 3 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit von 2 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe mit von 6 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen ist und R² wie R¹ definiert ist und gleich oder verschieden sein kann), -Gly-Z', -Met-Z', -Lys-Z', -Cys- Z', -Gly-Tyr-Z' oder -Ala-Tyr-Z' ist, wobei Z' -CONR¹R², -COOR¹ oder -CH&sub2;OR¹ ist, (wobei R¹ und R² wie vorstehend definiert ist), und die organischen oder anorganischen pharmazeutisch akzeptierbaren Salzen davon. Vorzugsweise hat das Peptid die Formel
His-A&sub2;-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;, A&sub0;-His-A&sub2;-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2; (zum Beispiel Ala-His-A&sub2;-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;) oder Ala-A&sub2;-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;.
Derartige Peptide können verwendet werden, um die Freisetzung und die Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln in Tieren durch Verabreichung einer wirksamen Menge des Peptids zu fördern.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung basiert auf dem Auffinden von mehreren kurzkettigen Polypeptiden, die die Freisetzung und die Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln in dem Blut von Tieren fördern. Die als innerhalb des Schutzbereiches der vorliegenden Erfindung liegend betrachteten Polypeptide sind durch die folgende allgemeine Struktur definiert:
A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-Trp-A&sub5;-A&sub6;-Z, worin A&sub1;, A&sub2;, A&sub3;, A&sub5;, A&sub6; und Z wie nachstehend definiert sind. A&sub1; ist His, 3(NMe)His (d. h. worin der Imidazolring an der 3-Position methyliert ist), His-Ala, A&sub0;-His, Ala, Tyr oder A&sub0;-3(NMe)His, wobei A&sub0; jede natürlich vorkoinmende L-Aminosäure, Met(O), DaPA, Abu oder Peptide der Formel L-A&sub0; ist, worin L H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys, Tyr-DAla-Phe-Gly, Tyr-DAla-Gly-Phe, Tyr-Ala-Gly-Thr oder Tyr-DAla-Phe-Sar ist. Vorzugsweise ist A&sub1; His, Ala, His-Ala, A&sub0;-His oder Ala. Bevorzugter ist Al His oder A&sub0;-His. A&sub0; ist vorzugweise jede natürlich vorkommende L-Aminosäure, bevorzugter ist A&sub0; Ala, Lys oder Glu. Noch bevorzugter ist A&sub0; Ala.
A&sub2; ist DβNal.
A&sub3; ist Ala, Gly oder Ser. A&sub3; ist vorzugsweise Ala.
A5 ist DPhe D/Lβ(Me)Phe oder (NMe)DPhe. Bevorzugt ist A5 DPhe.
A&sub6; ist B-G oder G, wobei B jede natürlich vorkommende L-Aminosäure ist, Dipeptide aller naturlich vorkominenden b-Aminosäuren (wie z. B. Ala-Lys, Ala-Ala, Ala-Leu) oder H&sub2;N(CH&sub2;)nCO&sub2;H, wobei n=2-12, und G Arg, iLys, Lys oder Orn ist. Bevorzugter ist B jede natürlich vorkommende L-Aminosäure oder H&sub2;N(CH&sub2;)n CO&sub2;H, wobei n=4-8. Noch bevorzugter ist A&sub6; G, Ala-Lys, oder Ala-Ala-Lys. Noch bevorzugter ist A&sub6; G. Höchst bevorzugt ist A&sub6; Lys.
Z stellt die C-terminale Endgruppe des Polypeptids oder die C-terminale(n) Aminosäure(n) plus Endgruppe dar, wobei Z -CONR¹R², -COOR¹ oder CH&sub2;OR¹ ist, wobei R¹ H, eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe mit 3 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit 2 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe mit 6 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen ist. R² ist definiert wie R¹ und kann gleich oder verschieden sein. Vorzugsweise ist R¹ H oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen. Z kann auch -Gly-Z',-Met-Z', -Lys-Z', -Cys-Z', -Gly-Tyr-Z' oder -Ala-Tyr- Z' sein, wobei Z' -CONR¹R², -COOR¹ oder -CH&sub2;OR¹ ist, wobei R¹ und R² wie vorstehend definiert sind. Vorzugsweise ist Z -CONR¹R², -COOR1 oder -CH&sub2;OR¹.
Und die pharmazeutisch akzeptierbaren organischen oder anorganischen Additionssalze jedes der Polypeptide.
Die verwendete Aminosäurerestabkürzungen stimmen mit der Standardpeptidnomenklatur überein:
Gly = Glycin
Tyr = L-Tyrosin
Ile = L-Isoleucin
Glu = L-Glutaminsäure
Thr = L-Threonin
Phe = L-Phenylalanin
Ala = L-Alanin
Lys = L-Lysin
Asp = L-Asparaginsäure
Cys = L-cystein
Arg = L-Arginin
Gln = L-Glutamin
Pro = L-Prolin
Leu = L-Leucin
Met = L-Methionin
Ser = L-Serin
Asn = L-Asparagin
His = L-Histidin
Trp = L-Tryptophan
Val = L-Valin
DOPA = 3,4-Dihydroxyphenylalanin
Met(O) = Methioninsulfoxid
Abu = α-Aminobuttersäure
iLys = N&epsi;-Isopropyl-L-Lysin
4-Abu = 4-Aminobuttersäure
Orn = L-Ornithin
DαNal = α-Naphthyl-D-Alanin
DβNal = β-Naphthyl-D-Alanin
Sar = Sarkosin
Alle Drei-Buchstaben-Aminosäureabkürzungen, denen ein "D" vorangestellt ist, geben die D-Konfiguration eines Aminosäurerestes an, und Abkürzungen, denen ein "D/L" vorangestellt ist, geben eine Mischung der D- und L-Konfiguration der bezeichneten Aminosäure an. Für Zwecke dieser Offenbarung wird Glycin als in den Begriff "natürlich vorkommende L-Aminosäuren" eingeschlossen betrachtet.
Die basischen, neutralen oder sauren Aminosäurereste, die für die Aminosäuren A&sub1;, A&sub3;, A&sub5; und A&sub6; verwendet werden können, verleihen ein hohes Maß der Kontrolle über die physiochemischen Eigenschaften des gewünschten Peptids. Eine derartige Flexibilität schafft wichtige Vorteile für die Formulierung und Zuführung des erwünschten Peptids zu jeder gegebenen Spezies. Zusätzliche Flexibilität wird durch die Auswahl der R- und Z-Anteile ebenfalls gewonnen, was eine zusätzliche Kontrolle über die physiochemischen Eigenschaften der gewünschten Verbindung bietet.
Bevorzugte wachstumshormonfreisetzende Verbindungen, die in der praktischen Ausführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden, sind:
A&sub1;-A&sub2;-Ala-Trp-DPhe-A&sub6;-Z, wie etwa
A&sub0;-His-A&sub2;-Ala-Trp-DPhe-A&sub6;-Z,
His-Ala-A&sub2;-Ala-Trp-DPhe-A&sub6;-Z,
Ala-A&sub2;-Ala-Trp-DPhe-A&sub6;-Z und
His-A&sub2;-Ala-Trp-DPhe-A&sub6;-Z, und
organische oder anorganische Additionssalze davon.
Bevorzugt sind
A&sub0;-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2; (insbesondere Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;), und His-D Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;, und
organische oder anorganische Additionssalze jedes der Polypeptide.
Diese Verbindungen sind typischerweise einfach zu synthetisieren, sind zur Förderung einer Erhöhung der Serumwachstumshormonspiegel wirksam und sind für die Produktion und Verwendung im gewerblichen Maßstab anstrebenswert. Zusätzlich können diese Verbindungen insofern vorteilhaft sein, als sie physiochemische Eigenschaften haben, die für die effiziente Übertragung derartiger Polypeptidverbindung auf eine große Vielfalt verschiedener Tierarten aufgrund der durch die verschiedenen Substitutionen an einer Vielzahl von Positionen der Polypeptidverbindungen ermöglichten Flexibilität wünschenswert sind, indem die polare, neutrale oder nichtpolare Natur des N-terminalen, C-terminalen und mittleren Abschnitts dieser Polypeptidverbindungen in der Weise gewählt wird, daß sie mit dem gewünschten Übertragungsverfahren kompatibel ist.
Diese Peptide zeigen typischerweise ein höheres Wirksamkeitsniveau bei der Förderung der Steigerung von Wachstumshormonspiegeln als die meisten äquivalenten Peptide mit einem unterschiedlichen Aminosäurerest an der A&sub2;-Position.
His-D Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2; und A&sub0;-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2; Peptide (wie etwa Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;),
und organische oder anorganische Additionssalze davon sind gegenwärtig am meisten bevorzugt.
Es wurde nachgewiesen, daß diese Verbindungen ein hohes Wirksamkeitsniveau bei der Förderung der Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln haben.
Die Verbindungen gemäß dieser Erfindung können zum Steigern der Blut-GH-Spiegel in Tieren verwendet werden; zur Steigerung der Milchproduktion in Kühen; zur Steigerung des Körperwachstums bei Tieren wie Säuretieren (d.h. Menschen, Schafen, Rindern und Schweinen) ebenso wie bei Fischen, Geflügel, anderen Vertebraten und Krustentieren; und zur Steigerung der Woll- und/oder Pelzproduktion bei Säugetieren. Das Ausmaß des Körperwachstums ist abhängig vom Geschlecht und Alter der Tierart, Menge und Art der wachstumshormonfreisetzenden Verbindung, die angewandt wird, Verabreichungsweg und ähnlichem.
Die neuen Polypeptidverbindungen gemäß dieser Erfindung können gemäß den üblichen Verfahren der Lösungs- und Festphasenpeptidchemie hergestellt werden oder durch klassische, im Stand der Technik bekannte Verfahren. Die Festphasensynthese wird vom C-terminalen Ende des Peptids begonnen. Ein geeignetes Startmaterial kann z. B. durch Anbinden der erforderlichen geschützten alpha-Aminosäure an ein chlormethyliertes Harz, ein hydroxymethyliertes Harz, ein Benzhydrylamin (BIU) Harz oder ein Para-Methyl-Benzylhydrylamin-(p-Me-BHA)-Harz hergestellt werden. Ein solches Chlormethylharz wird unter dem Handelsnamen BIOBEADS SX-1 von Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornien verkauft. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes wird von Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597 (1966) beschrieben. Das BHA-Harz wurde von Pietta und Marshall, Chem. Comm., 650 (1970) beschrieben und ist im Handel von Peninsula Laboratories, Inc., Belmont, Kalifornien erhältlich.
Nach der anfänglichen Anbindung kann die alpha-Aminoschutzgruppe durch eine Auswahl an sauren Reagenzien einschließlich Trifluoressigsäure-(TFA)- oder Salzsäure-(HCl)-Lösungen in organischen Lösungsmitteln bei Raumtemperatur entfernt werden. Nach Entfernen der alpha-Aminoschutzgruppe können die verbleibenden geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Ordnung verbunden werden. Jede geschützte Aminosäure kann allgemein etwa in einem dreifachen Überschuß unter Verwendung eines geeigneten Carboxylgruppenaktivators wie Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder Diisopropylcarbodiimid (DIC) in Lösung z.B. in Methylenchlorid (CH&sub2;Cl&sub2;) oder Dimethylformamid (DMF) und Mischungen davon umgesetzt werden.
Nachdem die gewünschte Aminosäureseguenz vervollständigt wurde, kann das erwünschte Peptid von dem Harzträger durch Behandlung mit einem Reagens wie Hydrogenfluorid (HF) abgespalten werden, das nicht nur das Peptid vom Harz abspaltet, sondern auch die meisten üblicherweise verwendeten Seitenkettenschutzgruppen abspaltet. Wenn ein Chlormethylharz oder Hydroxymethylharz verwendet wird, wird durch die HF-Behandlung die freie Peptidsäure gebildet. Wenn das BHA- oder p-Me-BHA- Harz verwendet wird, ergeben sich aus der HF-Behandlung direkt die freien Peptidamide.
Das oben diskutierte Festphasenverfahren ist im Stand der Technik gut bekannt und wurde von Stewart und Young, Solid Phase Peptide Svnthesis: zweite Ausg. (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) beschrieben.
Einige Lösungsverfahren, die zur Synthese der Peptidanteile der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind in Bodansky et al., Peptide Synthesis, zweite Ausgabe, John Wiley & Sons, New York, N.Y. 1976 beschrieben.
Es herrscht die Meinung, daß die Peptide bevorzugter durch ein Lösungsphasenverfahren synthetisiert werden, das die Kondensationsreaktion von wenigstens zwei Peptidfragmenten umfaßt.
Dieses Verfahren umfaßt das Kondensieren eines Peptidfragments X-A&sub1;-Y mit dem Peptidfraginet U-V-W, wobei alle Aminosäure-Seitenketten mit der Ausnahme von A&sub1; neutral oder geschützt sind, und wobei X Prot. oder Prot.-A&sub0; ist, wobei Prot. eine N-terminale Schutzgruppe ist; Y ist A&sub2;-Q, Ala-A&sub2;- Q, A&sub2;-A&sub3;-Q, Ala-A&sub2;-A&sub3;-Q, A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-Q, Ala-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-Q, Ala-Q oder -Q, wobei, wenn Y Q ist, U J-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4; ist oder J-Ala-A&sub2;- A&sub3;-A&sub4;. Wenn Y Ala-Q ist, ist U J-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;. Wenn Y A2-Q oder Ala-A&sub2;-Q ist, ist U J-A&sub3;-A&sub4;. Wenn Y A&sub2;-A&sub3;-Q oder Ala-A&sub2;-A&sub3;-Q ist, ist U J-A&sub4;. Wenn Y A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-Q oder Ala-A&sub2;-A&sub3;-A&sub4;-Q ist, ist U J. V ist A&sub5; oder Z. Wenn V A&sub5; ist, ist W A&sub6;-Z oder Z. Wenn V Z ist, ist W nicht vorhanden. A&sub1;, A&sub5;, A&sub6; und Z sind wie hierin definiert. In der gegenwärtigen Situation ist A&sub2; DβNal und A&sub4; ist Trp.
Q ist die Carboxylendgruppe eines Peptidfragmentes und ist -OR³ oder -M, wobei M ein Anteil ist, der in der Lage ist, durch ein Stickstoff enthaltendes Nukleophil verdrängt zu werden, und R³ ist H, eine Alkylgruppe, die 1 bis etwa 10 Kohlenstoffatome enthält, eine Arylgruppe, die von 6 bis etwa 12 Kohlenstoffatome hat, oder eine Arylalkylgruppe, die von 7 bis etwa 12 Kohlenstoffatome hat; J stellt die Aminoendgruppe des bezeichnet Fragmente der und ist H eine Schutzgruppe, die nicht die Kopplungsreaktion behindert, beispielsweise Benzyl.
Anschließend entfernt man die Schutzgruppen. Alternativ kann man die auf diese Weise gebildeten geschützten Peptide in weiteren Kondensationen verwenden, um ein größeres Peptid herzustellen.
Dieses bevorzugte Verfahren ist detaillierter in der US-Patentanmeldung, Serien-Nr. beschrieben, eingereicht am 24.Juli 1990 von John C. Hubbs und S.W. Parker mit dem Titel "Process for Synthesizing Peptides", die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Förderung der Freisetzung und/oder Erhöhung der Wachstumshormonspiegel in dem Blut eines nicht-humanen Tieres geschaffen. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Dosis von wenigstens einem der vorstehend beschriebenen Polypeptide an ein nicht-humanes Tier.
Die Verbindungen dieser Erfindung können auf oralem, parenteralem (intramuskuläre, (i.m.); intraperitoneale (i.p.), intravenöse (i.v.) oder subkutane (s.c.) Injektion), nasalem, vaginalem, rektalem oder sublingualem Verabreichungsweg verabreicht werden und können in Darreichungsformen, die für jeden Weg der Verabreichung geeignet sind, formuliert werden. Parenterale Verabreichung ist bevorzugt.
Feste Darreichungsformen zur oralen Verabreichung schließen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate ein. In solchen festen Darreichungsformen ist die aktive Komponente mit mindestens einem inerten Trägerstoff wie Sukrose, Laktose oder Stärke gemischt. Solche Darreichungsformen können auch, wie es übliche Praxis ist, zusätzliche Substanzen außer den inerten Verdünnungsmitteln, wie z.B. Gleitmittel wie etwa Magnesiumstearat enthalten. Im Falle von Kapseln, Tabletten und Pillen können die Darreichungsformen auch Pufferreagenzien enthalten. Tabletten und Pillen können zusätzlich mit enterischen Überzügen hergestellt werden.
Flüssige Darreichungsformen zur oralen Verabreichung beinhalten Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe, wobei die Elixiere inerte Verdünnungsmittel, wie sie allgemein im Stand der Technik verwendet werden, wie z.B. Wasser, enthalten. Neben solchen inerten Verdünnungsmitteln können die Zusammensetzungen auch Adjuvantien wie Netzmittel, Emulsionsmittel und Suspensionsmittel und Süßungsmittel, Geschmackstoffe und Duftstoffe enthalten.
Arzneimittel gemäß dieser Erfindung zur parenteralen Verabreichung beinhalten sterile wäßrige oder nicht-wäßrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen. Beispiele von nicht-wäßrigen Lösungsmitteln oder Trägern sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle wie Olivenöl und Maisöl, Gelatine und injizierbare organische Ester wie Ethyloleat. Solche Darreichungsformen können auch Adjuvantien wie konservierende, netzende, emulgierende und dispergierende Mittel enthalten. Sie können durch z.B. Filtration durch einen Bakterien zurückhaltenden Filter, durch Zugabe von sterilisierenden Mitteln in die Zusammensetzungen, durch Bestrahlung der Zusammensetzungen oder durch Erwärmung der Zusammensetzungen sterilisiert sein. Sie können auch in einem Medium von sterilem Wasser oder einem anderen sterilen injizierbaren Medium unmittelbar vor dem Gebrauch hergestellt werden.
Die neuen Verbindungen der vorliegenden Erfindung sind auch nützlich, wenn sie in Kombination mit Wachstumshormon-Releasinghormon (d. h. natürlich vorkommendem Wachstumshormon-Releasinghormon, analogen und funktionellen Äquivalenten davon) sowie in Kombination mit anderen Verbindungen verabreicht werden, die. die Freisetzung von Wachstumshormon fördern, z. B. wachstumshormonfreisetzende Peptide (siehe U.S. Patent Nr. 4,880,778, das hierin durch Bezugnahme eingeschlossen ist). Solche Kombinationen stellen ein besonders bevorzugtes Mittel dar, um die wachstumshormonfreisetzenden Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung zu verabreichen, weil die Kombination die Freisetzung von sehr viel mehr Wachstumshormon fördert als es durch die Summe der einzelnen Reaktionen für jede Komponente der Kombination vorhergesagt ist, d.h. die Kombination bietet eine synergistische Reaktion relativ zu den einzelnen Komponenten. Weitere Details über die Verabreichung von Kombinationen von wachstumshormonfreisetzenden Peptiden sind in dem vorstehend genannten Patent beschrieben. Derartige synergistische Verbindungen sind vorzugsweise Verbindungen, die als ein Agonist an dem Wachstumshormon-Releasinghormonrezeptor wirken oder den Effekt von Somatostatin inhibieren. Der Synergismus kann binär sein, d. h. die vorliegende Verbindung und eine der synergistischen Verbindungen oder mehr als eine synergistische Verbindung einschließen.
Die Menge an verabreichtem Polypeptid oder der Kombination von Polypeptiden der vorliegenden Erfindung kann in Abhängigkeit von zahlreichen Faktoren unterschiedlich sein, z.B. des speziell zu behandelnden Tieres, seines Alters und Geschlechts, des erwünschten therapeutischen Effekts, des Weges der Verabreichung und welches Polypeptid oder welche Kombination von Polypeptiden angewandt wird. In allen Fällen wird jedoch eine Dosis verwendet, die zur Freisetzung und Erhöhung des Wachstumshormonspiegels im Blut des Empfängertieres wirksam ist. Gewöhnlich fällt dieses Dosisniveau in den Bereich von zwischen etwa 0,1 ug bis 10 mg von Gesamtpolypeptid pro kg Körpergewicht. Die bevorzugte Menge kann ohne weiteres empirisch vom Durchschnittsfachmann basierend auf der vorliegenden Offenbarung bestimmt werden.
Beispielsweise fällt bei Menschen, wenn die Verabreichungsweise i.v. ist, das bevorzugte Dosisniveau in den Bereich von etwa 0,1 ug bis 10 ug Gesamtpolypeptid pro kg Körpergewicht, bevorzugter etwa 0,5 ug bis 5 ug Gesamtpolypeptid pro kg Körpergewicht und weiter bevorzugt etwa 0, 7 ug bis 3,0 ug pro kg Körpergewicht. Wenn Kombinationen von wachstumshormonfreisetzenden Peptiden verwendet werden, können niedrigere Mengen des gegenwärtig beschriebenen Peptids verwendet werden. Beispielsweise liegt bei Kombinieren des gegenwärtig beschriebenen Peptids mit z. B. einer synergistischen Verbindung in Gruppe 1 des U.S. Patentes Nr. 4,880,778, wie z. B. GHRH, ein bevorzugter Bereich bei etwa 0,1 ug bis etwa 5 ug der gegenwärtig beschriebenen Verbindung (z. B. Ala-His-DβNal-Ala-Trp- DPhe-A&sub6;-Z, oder His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A&sub6;-Z) pro kg Körpergewicht und etwa 0,5 ug bis etwa 15,0 ug der synergistischen Verbindung (z. B. GHRH) und bevorzugter etwa 0,1 ug bis etwa 3 ug der vorliegenden Verbindung mit etwa 1,0 ug bis etwa 3,0 g der synergistischen Verbindung pro kg Körpergewicht.
Bei oraler Verabreichungsweise sind typischerweise größere Mengen erforderlich. Beispielsweise ist das Dosisniveau bei Menschen für orale Verabreichung typischerweise etwa 30 ug bis etwas 600 ug Polypeptid pro kg Körpergewicht, bevorzugter etwa 70 4g bis etwa 500 ug Polypeptid pro kg Körpergewicht, noch bevorzugter etwa 100 ug bis etwa 350 ug Gesamtpolypeptid pro kg Körpergewicht und noch bevorzugter etwa 200 ug bis etwa 300 ug Gesamtpolypeptid pro kg Körpergewicht. Kühe erfordern etwa dasselbe Dosisniveau wie Menschen, während Ratten typischerweise höhere Dosniveaus erfordern. Das exakte Niveau kann ohne weiteres empirisch auf der Basis der vorliegenden Offenbarung bestimmt werden.
Allgemein ermöglicht, wie vorstehend ausgeführt, die Verabreichung von Kombinationen von wachstumshormonfreisetzenden Peptiden die Verwendung von niedrigeren Dosen der einzelnen wachstumshormomfreisetzenden Verbindungen bezüglich den Dosisniveaus, die für die einzelnen wachstumshormonfreisetzenden Verbindungen erforderlich sind, um eine ähnliche Reaktion zu erhalten, bedingt durch den synergistischen Effekt der Kombination.
Ferner sind in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung Zusammensetzungen eingeschlossen, die als aktiven Inhaltsstoff die organischen und anorganischen Additionssalze der vorstehend beschriebenen Polypeptide und Kombinationen davon umfassen; optional in Verbindung mit einem Trägerstoff, einem Verdünnungsstoff, einer Matrix zur langsamen Freisetzung oder einer Beschichtung
Die organischen oder anorganischen Additionssalze der Wachstumshormonfreisetzenden Verbindungen und Kombinationen davon, die als innerhalb des Schutzbereiches der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet werden, beinhalten Salze von solchen organischen Anteilen wie Acetat, Trifluoracetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Benzoat, Lactat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Naphthalat und ähnliches, und solche anorganischen Anteile wie Gruppe I-(d.h. Alkalimetallsalze), Gruppe II-(d.h. Erdalkalimetallsalze), Ammonium- und Protaminsalze, Zink, Eisen und ähnliches mit Gegenionen wie Chlorid, Bromid, Sulfat, Phosphat und ähnlichen, sowie die oben erwähnten organischen Anteile.
Wenn die Verabreichung an menschliche Patienten in Erwägung gezogen wird, werden pharmazeutisch akzeptable Salze bevorzugt. Solche Salze beinhalten die nicht-toxischen Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalze, die allgemein in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden, einschließlich der Natrium-, Kalium-, Lithium-, Kalzium-, Magnesium-, Barium-, Ammonium- und Protaminsalze, die durch im Stand der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden. Der Begriff schließt weiterhin nicht-toxische Säureadditionssalze ein, die im allgemeinen durch Umsetzung von Verbindungen dieser Erfindung mit geeigneten organischen oder anorganischen Säuren hergestellt werden. Repräsentative Salze beinhalten das Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Bisulfat, Acetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Borat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Naphthylat und ähnliche.
Die Erfindung wird durch die folgenden nicht einschränkenden Beispiele weiter erläutert.

BEISPIEL 1

Synthese der wachstumshormonfreisetzenden Peptide

Paramethyl-Benzhydrylaminhydrochlorid-(pMe-BHa HCI)-Harz wird in ein Reaktionsgefäß in einem gewerblich erhältlichen Peptidsynthetisierautomaten gegeben. Das Harz wird mit freiem Amin bis zu einer Beladung von etwa 5 mmole pro Gramm beladen. Die Verbindungen werden durch Kopplung von individuellen Aminosäuren hergestellt, wobei am Carboxy-terminalen Ende der Peptidsequenz begonnen wird, unter Verwendung eines geeigneten Aktivierungsagens, wie N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC). Das alpha-Amin der einzelnen Aminosäuren ist geschützt, z.B. als das t-Butyloxycarbonylderivat (t-Boc), und die reaktiven Seitenkettenfunktionalitäten sind, wie in Tabelle 1 umrissen, geschützt. Tabelle 1 Seitenkettenschutzgruppen, die geeignet sind zur Festphasenpeptidsynthese Arginin Asparaginsäure Cystein Glutaminsäure Histidin Lysin Methionin Serin Threonin Tryptophan Tyrosln Ng-Tosyl O-Benzyl S-para-Methylbenzyl O-Benzyl Nim-Tosyl N&epsi;-2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl S-Sulfoxid O-Benzyl O-Benzyl Nin-Formyl O-2,6-Dichlorbenzyl
Vor dem Einbau der Ausgangsaminosäure wird das Harz dreimal (etwa jeweils eine Minute) mit Dichlormethan (CH&sub2;Cl&sub2;; etwa 10 mL/gm Harz) gerührt, mit drei Rührvorgängen (jeweils etwa zwei Minuten) von N,N-Diisopropylethylamin (DIEA) in Dichlormethan (10:90; etwa 10 mL/gm Harz) neutralisiert und dreimal (jeweils etwa eine Minute) mit Dichlormethan (etwa 10 mL/gm Harz) gerührt. Die Anfangs- und jede der nachfolgenden Aminosäuren werden unter Verwendung eines vorgeformten symmetrischen Anhydrids an das Harz angekoppelt, wobei etwa das 3,0- fache der Gesamtmenge der Bindungskapazität des Harzes einer in geeigneter Weise geschützten Aminosäure und etwa das 1,5- fache der Gesamtmenge der Bindungskapazität des Harzes von DCC in einer geeigneten Menge von Dichlormethan verwendet wird. Für Aminosäuren mit einer niedrigen Dichlormethanlöslichkeit wird N,N-Dimethylformamid (DMF) zugegeben, um eine homogene Lösung zu erreichen. Generell wird das symmetrische Anhydrid bis zu 30 Minuten vor Eingabe in das Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur oder darunter hergestellt. Der Dicyclohexylharnstoff, der sich bei der Herstellung des symmeterischen Anhydrids bildet, wird durch Schwerkraftfiltration der Lösung in das Reaktionsgefäß entfernt. Der Fortschritt der Kopplung der Aminosäure an das Harz wird üblicherweise durch einen Farbtest beobachtet unter Verwendung eines Reagens wie Ninhydrin (welches mit primären und sekundären Aminen reagiert). Nach vollständiger Kopplung der geschützten Aminosäure an das Harz (> 99%) wird die alpha-Aminschutzgruppe durch Behandlung mit einem sauren Reagens bzw. Reagenzien entfernt. Ein üblicherweise verwendetes Reagens besteht aus einer Lösung von Trifluoressigsäure (TFA) und Anisol in Dichlormethan (45:2:53). Das vollständige Verfahren zum Einbau jedes individuellen Aminosäurerestes in das Harz ist in Tabelle 2 dargelegt. Tabelle 2 Verfahren zum Einbau von individuellen Aminosäuren in ein Harz Reagens Rührvorgänge Zeit/Rührvorgang Dichlormethan TFA, Anisol, Dichlormethan DIEA, Dichlormethan (10:90) Vorgeformtes symmetrisches Anhydrid iso-Propanol Überwachung des Fortschritts der Kopplungsreaktion** Wiederholung der Schritte für jede einzelne Aminosäure * Kopplungszeit abhängig von der individuellen Aminosäure ** Das Ausmaß der Kopplung kann üblicherweise durch einen Farbtest beobachtet werden. Wenn die Kopplung unvollständig ist, kann die selbe Aminosäure durch Wiederholen der Schritte 7 bis 11 nochmals gekoppelt werden. Wenn die Kopplung vollständig ist, kann die nächste Aminosaure angekoppelt werden.
Durch Verwendung dieses Verfahrens der Peptidsynthese werden neue harzgebundene Polypeptide, wie z. B.:
A&sub1;-DβNal-A&sub3;-Trp-A&sub5;-A&sub6;-R
erhalten (worin A&sub1;, A&sub3;, A&sub5; und A&sub6; wie vorstehend definiert sind und R ein polymerisches Harz ist und die funktionellen Gruppen der Aminosäurekomponenten mit geeigneten Schutzgruppen nach Bedarf geschützt sind). Bestimmte Sequenzen (in entsprechend geschützter Form), die hergestellt wurden, beinhalten:
His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys- R ,
Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys- R ,
Ala-His-QTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys- R ,
His-Ala-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys- R ,
His-Ala-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys- R ,
His-DαNal-Ala-Trp-DPhe-Lys- R ,
His-DCys(SMe)-Ala-Trp-DPhe-Lys- R ,
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys- R ,
His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys- R ,
Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys- R ,
Try-DArg-Phe-Gly- R,
Ala-His-Dphe-Ala-Trp-DPhe-Lys- R
Ala-His-DHis-Ala-Trp-DPhe-Lys- R, und
Ala-His-DPro-Ala-Trp-DPhe-Lys- R

Beispiel 2

In Vivo GH Freisetzung bei Ratten

Unausgereifte weibliche Sprague-Dawley Ratten wurden von Charles River Laboratories (Wilmington, MA) erhalten. Nach der Ankunft wurden sie bei 25ºC mit einem 14:10 Std. Hell:Dunkel-Zyklus gehalten. Wasser und Purina-Rattenfutter standen ad libitum zur Verfügung. Junge wurden bis zum Alter von 21 Tagen mit ihrer Mutter gehalten.
Sechsundzwanzig Tage alte Ratten, sechs Ratten pro Behandlungsgruppe, wurden intraperitoneal mit 50 mg/kg Pentobarbital 20 Minuten vor der i.v. Behandlung mit Peptiden anästhesiert. Normale Kochsalzlösung mit 0,1 % Gelatine war der Träger für intravenöse (i.v.) Injektionen der Peptide. Die anästhesierten Ratten, die 55-65 g wogen, wurden i.v. mit der Menge an wachstumshormonfreisetzenden Verbindungen, wie in Tabellen 3, 4 und 5 angegeben, injiziert. Die Injektion wurde als eine 0,2 mL Lösung in die Jugularvene gegeben.
Alle Tiere wurden durch guillotinieren 10 Minuten nach der letzten Testinjektion (siehe Tabelle 3 und 4) getötet. Blut aus dem Rumpf wurde zur Bestimmung der Blut-GH-Spiegel anschließend an die Enthauptung gesammelt. Nachdem man dem Blut ermöglichte zu gerinnen, wurde es zentrifugiert und das Serum von dem Blutgerinnsel getrennt. Das Serum wurde gefroren gehalten bis zum Tag der Probenentnahme zur Radioimmunoassay- (RIA)-Bestimmung von Wachstumshormonspiegeln gemäß der folgenden Vorgehensweise, wie sie vom National Institute of Arthritis, Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIADDK) entwickelt wurde.
Die Reagenzien werden üblicherweise zu den RIA-Analyseröhrchen in einer einzigen Versuchssitzung bei Kühlschranktemperatur (etwa 4ºC) in der folgenden Reihenfolge zugegeben:
(a) Puffer,
(b) "kalter" (d.h. nicht radioaktiver) Standard oder unbekannte, zu analysierende Serumprobe,
(c) radio-jodiertes Wachstumshormonantigen, und
(d) Wachstumshormonantiserum.
Die Reagenszugabe wird üblicherweise so ausgeführt, daß eine endgültige RTA-Röhrchenverdünnung von etwa 1:30.000 (Antiserum zu Gesamtflüssigkeitsvolumen; Vol:Vol) erreicht wird.
Die gemischten Reagenzien werden dann typischerweise bei Raumtemperatur (etwa 25ºC) etwa 24 Stunden lang vor Zugabe eines zweiten Antikörpers (d.h. Ziegen- oder Kaninchen- Anti- Affengammaglobulinserum) inkubiert, welcher eine Bindung eingeht und ein Ausfällen des komplexen Wachstumshormon-Antiserums verursacht. Der ausgefällte Inhalt der RIA-Röhrchen wird dann auf die Anzahl der Zählwerte in einem bestimmten Zeitraum in einem Gamma-Szintillationszähler analysiert. Eine Standardkurve wird durch Auftragen der Anzahl der radioaktiven Zählwerte gegen den Wachstumshormon-(GH)-Spiegel hergestellt. GH-Spiegel von Unbekannten werden dann durch Bezugnahme auf die Standardkurve bestimmt.
Serum-GH wurde durch RIA mit Reagenzien gemessen, die vom National Hormone and Pituitary Program zur Verfügung gestellt waren.
Serumspiegel in Tabellen 3, 4, 5 und 6 sind in ng/mL bezüglich dein Ratten-GH-Standard von 0,61 internationalen Einheiten/mg (IU/mg) aufgezeichnet. Die Daten sind als das Mittel +/- Standardfehler. des Mittels (SEM) aufgezeichnet. Eine statistische Analyse wurde mit Student's t-Test durchgeführt. Die in Tabellen 3, 4, 5 und 6 gezeigten Ergebnisse sind der Durchschnitt der Studien mit sechs Ratten. Tabelle 3 In Vivo GH-Freisetzung (ng/mL) gefördert durch wachstumshormonfreisetzende Verbindungen in Pentobarbital-anästhesierten Ratten (Die Tiere wurden 10 Minuten nach der letzten Injektion getötet) Spalte A wachstumshormonfreisetzende Verbindungen Gesamtdosis (ug) Kontrolle GH ng/mL Durch die Verbindung in Spalte A freigesetzes GH ng/mL +SEM p-Wert Tabelle 4 In Vivo GH-Freisetzung (ng/mL) gefördert durch wachstumshormonfreisetzende Verbindungen in Pentobarbital-anästhesierten Ratten (Die Tiere wurden 10 Minuten nach der letzten Injektion getötet) Spalte A wachstumshormonfreisetzende Verbindungen Kontrolle GH ng/mL Gesamtdosis (ug) Durch die Verbindung in Spalte A freigesetzes GH ng/mL Tabelle 5 Peptid Gesamtdosis (ug) Kontrolle GH ng/mL freigesetztes GH ng/mL
Tabellen 3, 4, 5 und 6 zeigen, daß die Verbindungen der Ertindung die Freisetzung und Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln im Blut von Ratten fördern, an die derartige Verbindungen verabreicht wurden. Die Peptide der vorliegenden Erfindung zeigen Aktivität, wohingegen äquivalente Verbindungen mit einer Substitution an der A&sub2;-Position (z.B. mit DAsp, DCys(SMe), DHis und DPro) keine derartige Aktivität zeigen. Diese Tabellen zeigen auch, daß His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys- NH&sub2; aktiver ist als die Verbindungen, die DTrp, DαNal, DAsp und DCys (SMe) an der A&sub2;-Position haben. In ähnlicher Weise ist Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2; aktiver als die äquivalente DTrp-Verbindung.

BEISPIEL 3

Verabreichung einer Kombination von GH-freisetzenden Verbindungen

Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt, mit der Ausnahme, daß die Ratten weder anästhesiert noch mit Pentobarbital vorbehandelt waren, und eine Kombination von Peptiden den Ratten verabreicht wurde. Die verabreichten Verbindungen, das Dosisniveau und die Ergebnisse sind in Tabelle 6 aufgezeigt. Tabelle 6 In Vivo GH-Freisetzung (ng/mL) angeregt durch wachstumshormonfreisetzende Verbindungen in Pentobarbital-anästhesierten Ratten Spalte A GH-freisetzendes Peptid Gesamtdosis Kontrollserum GH ng/mL ± (SEM) (N=6) freigesetzes GH Serum-GH ng/mL + (SEM) (N=6) Tabelle 7 In Vivo synergistische Effekte bei nichtanästhesierten Ratten der erfindungsgemäßen Verbindung mit Verbindungen der Gruppe 1 und/oder der Gruppe 3 Verabreichte Verbindung Dosis (ug) freigesetztes GH (ng/ml) ± SEM Kontrolle * Verbindungen der Gruppe 1 und der Gruppe 3 sind im Detail im US-Patent Nr. 4,880,778 beschrieben.
a - 175-1 = His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH² (Verbindung innerhalb der Erfindung)
b - C = His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2; (Vergleichsverbindung)
c - GHRH = Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe- Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys- Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser- Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln- Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH&sub2; (Verbindung der Gruppe 1)
d - TP = Tyr-DArg-Phe-Gly-NH&sub2; (Verbindung der Gruppe 3) Tabelle 7 zeigt, daß die erfindungsgemäße Verbindung eine synergistische Reaktion zeigt, wenn sie mit exemplarischen Verbindungen der Gruppe 1 und/oder der Gruppe 3 verabreicht wird. Die Ergebnisse in Tabelle 7 zeigen weiter, daß die erfindungsgemäße Verbindung eine größere synergistische Reaktion als die mit einer Vergleichsverbindung (C) erzielte hat, für die vorab nachgewiesen wurde, daß sie eine synergistische Reaktion hat.

BEISPIEL 4

Kondensationsreaktion von Peptidfragmenten zur Bildung von Peptid

Allgemeine Vorgangsweisen

Schmelzpunkte können unter Verwendung eines Thomas Hoover Kapillar-Schmelzpunktgerätes bestimmt werden. Infrarot-(IR) Spektren können auf einem Perkin-Elmer-Modell 137 oder einem Nicolet Modell 5DX Spektrophotometer aufgezeichnet werden und in Wellenzahlen (cm&supmin;¹) berichtet werden. Massenspektren (MS) können unter Verwendung eines Massenspektrometers von VG Analytical Ltd., Modell ZAP-IF im EI (Elektronenstoß), FD (Felddesorption) oder FAB ( Bombardement mit schnellen Atomen) Modus erhalten werden. GCMS können unter Verwendung eines Finnigan 4023 GCMS, ausgerüstet mit einer 30 in D85 Kapillarsäule (J & W Scientific) unter Verwendung von Heliumträgergas erhalten werden. Optische Drehungen können unter Verwendung eines Autopol III Polarimeters, hergestellt von Rudolph Research, gemessen werden.
¹H NMR Spektren können auf einem JEOL GX-400 NMR Instrument, das bei 400 MHz betrieben wird, oder einem JEOL GX-270 NMR Instrument, das bei 270 MHz betrieben wird, erhalten werden. Diese Instrumente sind zu einer Routine-Digitalauflösung von weniger als 0,7 Hz fähig. Chemische Verschiebungen werden in parts per million relativ zu internem 3-(Trimethylsilyl)-Tetradeutero-Natriumpropionat (TSP) ausgedrückt.
Hochleistungs-Flüssigkeits-Chromatographie (HPLC) kann unter Verwendung eines Hitachi Systems ausgeführt werden, bestehend aus einem L-5000 Gradientenkontroller und einer 655A-Pumpe, die an einer Vydac 201TP10I0 oder 218TP1010 halbpräparativen Säule angebracht sind. Kombinationen von Wasser, das 0,2 % Trifluoressigsäure und Methanol enthält, können als das eluierende Lösungsmittel verwendet werden. Typischerweise werden die Verbindungen von Bedeutung mit einer Strömungsgeschwindigkeit von sechs mL pro Minute mit einem (3radienten unter Steigerung der organischen Komponente mit einer Geschwindigkeit von annähernd 1 - 2 % pro Minute eluiert. Die Verbindungen werden anschließend bei geeigneten Wellenlängen unter Verwendung eines LKB 2140 Diodenarray-UV-Detektors erfaßt. Integrationen können anschließend unter Verwendung von Nelson Analytical Software (Version 3.6) erreicht werden.
Die Reaktionen werden unter einer inerten Atmosphäre von Stickstoff oder Argon ausgeführt, sofern nicht anders angegeben. Wasserfreies Tetrahydrofuran (THF, U.V. Grad) und Dimethylformamid (DMF) können von Burdick und Jackson erworben werden und direkt aus der Flasche verwendet werden.

A. Herstellung des Tripeptidfragmentes-K-His-DβNal-Ala-OMe

Nα-Benzyloxycarbonyl-Histidyl-D-beta-Naphthyl-Alanin-Methylester, 25.

Eine Lösung von EtOAc (400 mL) und D-beta-Naphthylalanin-Methylesterhydrochlorid (22, 0,62 mol) wird mit gesättigtem Natriumcarbonat (400 mL) und 0 8 N wäßrigem Natriumhydroxid (ca. 500 mL) gewaschen. Die resultierende wäßrige Phase wird entfernt (pH 8,5) und die organische Phase wird sequentiell mit halbgesättigtem wäßrigem Na&sub2;CO&sub3; (150 mL) und dann mit Wasser (50 mL) gewaschen. Die freie Basenform von 22 wird bei Konzentration der Ethylacetatschicht in vacuo isoliert.
Dicyclohexylcarbodiimid (DCC, ca. 95 g, 0,46 inol) wird zu einer -5ºC (Eis-Ethanolbad) Lösung von Nα-Benzyloxycarbonyl-Histidin (19, 143,5 g, 0,50 mol), N-Hydroxysuccinimid (HONSu, 23, 0,62 mol) und der frisch hergestellten freien Basenform von 22 (ca. 0,52 mol) in DMF (ca. 3L) zugegeben. Die resultierende Reaktionslösung wird 24 Stunden gerührt, während sie auf Raumtemperatur erwärmt wird. HPLC Analyse sollte verwendet werden, um festzustellen, ob die Reaktion vollständig ist. Wenn dies nicht der Fall ist, wird die Reaktionslösung anschließend auf ca. -5ºC gekühlt und ein zusätzlicher Anteil von Dicyclohexylcarbodiimid (ca. 0,17 mol) wird zur Reaktion zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird anschließend weitere 24 Stunden lang gerührt, während es sich auf Raumtemperatur erwärmt. Diese Mischung wird anschließend gefiltert, um Dicyclohexylharnstoff (DCU) zu entfernen. Wasser (1 L) wird zu dem Filtrat zugegeben und die resultierende Lösung wird in vacuo konzentriert. Der resultierende Rückstand wird in wäßriger 1N HClI aufgenommen (ca. 1 L, bis der pH der wäßrigen Phase einen pH von 1 erreicht). Die wäßrige Phase wird anschließend mit zwei Anteilen Ethylacetat (jeweils 1 L) extrahiert. Die Ethylacetatschichten werden anschließend weggeworfen. Der pH der wäßrigen Phase wird anschließend durch Zugabe von kaltem 2N Natriumhydroxid (500 mL) und Natriumhydroxidpellets eingestellt. Während dieser Neutralisation wird die Lösung durch Zugabe von kaltem Ethylacetat (1 L) kalt gehalten. Wenn der pH der wäßrigen Phase annähernd 7 erreicht, ist gewöhnlich eine reichhaltige Ausfällung eines weißen Feststoffes oder Öles die Folge. Dieses Präzipitat wird durch Vakuumfiltration oder Dekantieren gesammelt und sequentiell mit halbgesättigtem Natriumcarbonat (2 X 1500 mL), Wasser (6 X 1500 mL) und Ethylacetat (3 X 1500 mL) gewaschen. Das resultierende Material wird unter hohem Vakuum auf ein konstantes Gewicht getrocknet. Dieses Material kann direkt ohne weitere Reinigung hydrolisiert werden.
Das DPhe-Peptid kann unter Verwendung von D-Phenylalanin-Methylesterhydrochlorid als Verbindung 22 anstelle von D-beta- Naphthylalalin-Methylesterhydrochlorid hergestellt werden.

Nα-Benzyloxycarbonyl-Histidyl-β-Naphthyl-D-Alanin 26.

Wäßriges Natriuinhydroxid (192 mL, 0,08 g/mL Lösung, 0,38 mol) wird zu einer Lösung von Dipeptid 25 (ca. 0,38 mol), Wasser (360 mL) und MeOH (ca. 6 L) zugegeben. Die Lösung wird bei Raumtemperatur bis zur vollständigen Hydrolyse gerührt (ca. 24 Stunden). Das Verschwinden des Startpeptids wird durch HPLC Analyse bestätigt. Die Lösung wird in vacuo zu einem Rückstand konzentriert, der in Wasser (ca. 1 L) aufgelöst wird. Die wäßrige Schicht (pH ca. 10) wird anschließend mit EtOAc (2 X 500 mL) in einem Scheidetrichter extrahiert. Die Ethylacetatschichten werden weggeworfen. Die resultierende wäßrige Phase wird auf einen pH von annähernd 5 mit konzentrierter HCl eingestellt, und an diesem Punkt erfolgt gewöhnlich die Ausfällung eines weißen Feststoffes oder Öles. Das Produkt wird gesammelt und in vacuo getrocknet.

Nα-Benzyloxycarbonyl-Histidyl-D-beta-Naphthyl-Alanyl-Alanin Methylester 20.

Das Dipeptid Nα-Benzyloxycarbonyl-Histidyl-D-beta-Naphthyl- Alanin (26, 0,253 mol) wird zu einer Lösung von HONSu (23, 0,505 mol) in DMF (800 mL) unter einer Argonatmosphäre Zugegeben. Zu dieser Lösung wird eine Mischung von Alanin-Methylesterhydrochlorid (15, 0,303 mol), N-Methylmorpholin (16, 0,303 mol) und DMF (200 mL) zugegeben. Die resultierende Lösung wird auf 10ºC gekühlt, zu welchem Zeitpunkt Dicyclohexylcarbodiimid (24, 0,265 mol) in Methylenchlorid (273 mL) zugegeben wird. Die Reaktion wird durch HPLC überwacht, während die Reaktionstemperatur auf 10ºC bis zur vollständigen Reaktion gehalten wird. Wenn nach mehreren Tagen (ca. 4) die Reaktion nicht bis zur Vollständigkeit fortgeschritten ist, wird eine zusätzliche Beladung von 24 (0,080 mol) zugegeben und die Reaktionsmischung wird einen zusätzlichen Tag lang bei 10ºC gerührt. Die Reaktion wird wiederum durch HPLC-Analyse bis zur Vollendung (typischerweise ca. 5 Tage) überwacht. Die Feststoffe, die sich während der Reaktion bilden, werden durch Vakuumfiltration gesammelt. Das Filtrat wird anschließend zu einem Rückstand in vacuo konzentriert. Der resultierende Rückstand wird in Ethylacetat aufgenommen und mit halbgesättigter wäßriger Na&sub2;CO&sub3; (2 X 500 mL) extrahiert. Die Ethylacetatphase wird über MgSO&sub4; getrocknet. Die resultierende Lösung wird geklärt und auf einen Rückstand in vacuo konzentriert.

B. Herstellung des Tetrapeptidfragments Ala-His DβNal-Ala-OH Histidyl-D-beta-Naphthyl-Alanyl-Alanin-Methylester, 30.

Fünf Prozent Palladium auf Kohlenstoff (3 g) werden vorsichtig zu einer Lösung von Nα-Benzyloxycarbonyl-Histidyl-D-beta- Naphthyl-Alanyl-Alanin-Methylester 20 (71 mmol) in Methanol (500 mL) unter einer Argonatmosphäre zugegeben. Argon wird 15 Minuten lang durch das Reaktionsgemisch geblasen und Essigsäure (15 mL, 0,026 mol) wird anschließend zugegeben. Wasserstoff wird (unter der Oberfläche) durch das resultierende Gemisch 15 Minuten lang geblasen und anschließend wird die Reaktion bei Raumtemperatur unter einem Wasserstoffballast (1 atm) gerührt. Anschließend wird HPLC Analyse verwendet, um zu überwachen, wie viel Startmaterial, wenn überhaupt, verbleibt. Wenn Startmaterial verbleibt, bläst man sorgfältig Argon durch das Reaktionsgemisch (unter der Oberfläche, 30 Minuten lang) und ein zusätzlicher Anteil von 5 % Palladium auf Kohlenstoff (2,5 g) wird zugegeben. Wasserstoff wird anschließend erneut eingeführt. Argon wird wiederum durch das Reaktionsgemisch geblasen und die resultierende Lösung wird durch Filtration durch ein Diatomeenerde-Pad geklärt. Die resultierende Lösung wird in vacuo konzentriert, um das Produkt zu erhalten. Ein Teil dieses Produktes wird in Wasser (500 mL) aufgelöst oder aufgeschlämmt. Ethylacetat und gesättigtes wäßriges Natriumcarbonat werden zu dem resultierenden Material zugegeben. Die Isolierung der Ethylacetatschicht oder der entstehenden Feststoffe ergibt ein Material (30), das frei von Acetat ist.

Boc-Alanin-N-Hydroxysuccinimidester, 31.

Dicyclohexylcarbodiimid (43 mmol) wird zu einer Lösung mit Raumtemperatur von Boc-Alanin (43 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (48 mmol) in Methylenchlorid (250 mL) zugegeben. Die resultierende Lösung wird über Nacht gerührt. Das Reaktionsgemisch wird anschließend gefiltert, um Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, und das geklärte Filtrat wird in vacuo konzentriert, um das Produkt zu erhalten, das bei -20ºC unter einer Argonatmosphäre vor der Verwendung gelagert wird.

Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-OMe, 32.

Der vorstehende Alaninester (23,9 mmol) wird zu einer Lösung von His-D-βNal-Ala-OMe (30) (20,1 mmol) in wasserfreiem Dimethylformamid (DMF, 200 mL) zugegeben. Die resultierende homogene Lösung wird über das Wochenende bei Raumtemperatur gerührt und überwacht. Wenn die HPLC Analyse angibt, daß praktisch kein Tripeptid in dem Reaktionsgemisch verbleibt (z. B. etwa 3 Tage), wird Wasser (50 mL) zur Reaktion zugegeben und das resultierende Gemisch wird einen zusätzlichen Tag lang gerührt. Diese Lösung wird anschließend in vacuo konzentriert. Der resultierende Rückstand wird in Ethylacetat aufgelöst und anschließend mit halbgesättigtem wäßrigem Natriumcarbonat (2 x 300 mL) extrahiert. Die organische Phase wird mit MgSO&sub4; und Na&sub2;SO&sub4; getrocknet und in vacuo konzentriert, um das Tetrapeptid zu erhalten. Dieses Material wird ohne weitere Reinigung bei der Herstellung von Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-OH verwendet.

Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-OH, 33.

Eine 2N wäßrige Natriumhydroxidlösung (7,5 mL, 15 mmol) wird zu einer Methanol- (500 mL) und Wasserlösung (200 mL) zugegeben, die Boc-Ala-His-DβNal-Ala-OMe (13,7 mol) enthält. Nachdem die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur gerührt wird, gibt die HPLC Analyse die Menge des verbleibenden Startmaterials an. Wenn die Reaktion im wesentlichen vollständig ist (ca. über Nacht), wird die resultierende Lösung in vacuo auf ein Volumen von annähernd 200 mL konzentriert. Wasser (100 mL) wird zugegeben und der pH wird auf annähernd 12 durch Zugabe von 2N Natriumhydroxid (1 mL) eingestellt. Die resultierende Lösung wird mit Ethylacetat (2 X 500 mL) extrahiert. Die Ethylacetatschichten werden weggeworfen. Der pH der wäßrigen Phase wird anschließend auf annähernd 5 durch Zugabe von wäßriger HCl eingestellt, was gewöhnlich die Ausfällung des Produktes zur Folge hat. Es ist wichtig, das Volumen der wäßrigen Phase zu minimieren, um diese Ausfällung zu fördern. Die wäßrige Phase wird vom Produkt abdekantiert und das Produkt wird anschließend mit Wasser (2 X 50 mL) gespült. Das isolierte Produkt wird auf ein konstantes Gewicht in vacuo getrocknet.

C. Kondensationsreaktion der Peptidfragmente zur Herstellung des Heptapentids Boc-Ala-His-Dβ-Nal-Ala-Trp-D-Phe- Lys(Boc)-NH&sub2;, 34.

Die beiden Peptide Boc-Ala-His-D-βNal-Ala-OH (33, 2,6 mmol) und Trp-D-Phe-Lys(Boc)-NH&sub2; (13, 2,8 mmol) werden in wasserfreiem DMF aufgelöst und die resultierende Lösung wird in vacuo konzentriert. Diese vorab erfolgende Konzentration wird ausgeführt, um zu versuchen, Spuren von Methanol, die vorhanden sein könnten, zu entfernen. Das resultierende Peptidgemisch wird in DMF-Gemisch erneut aufgelöst und N-Hydroxysuccinimid (5,1 mmol) wird anschließend zugegeben. Die resultierende Lösung wird anschließend auf eine Lösungstemperatur von -2ºC gekühlt und Dicyclohexylcarbodiimid (3,4 mmol) wird anschließend als eine Lösung in Methylenchlorid (3,5 mL) zugegeben. Das resultierende Reaktionsgemisch wird bei -2ºC Lösungstemperatur über einen Zeitraum von drei Tagen gerührt. Die HPLC Analyse wird verwendet, um zu bestimmen, ob die Reaktion im wesentlichen vollständig ist. Wenn dies nach diesem Zeitraum nicht der Fall ist, kann daraufhin zusätzliches Dicyclohexylcarbodiimid zugegeben werden und das resultierende Reaktionsgemisch wird für einen zusätzlichen Tag bei -2ºC gerührt. Wenn am folgenden Tag (über eine Gesamtdauer von vier Tagen) die HPLC Analyse wiederum eine unvollständige Reaktion anzeigt, sollte das Kühlen des Reaktionsgemisches beendet werden. Die Lösungstemperatur der Reaktion kann auf Raumtemperatur (25ºC) über einen Zeitraum von Stunden (ca. 8) langsam gesteigert werden. Das resultierende Reaktionsgemisch wird über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Der Vorgang wird wiederholt, bis die Reaktion vollständig ist. Anschließend wird Wasser (50 mL) zugegeben und das resultierende Gemisch wird einen zusätzlichen Tag lang gerührt. Die Reaktionslösung wird anschließend gefiltert, um Dicyclohexylharnstoff zu entfernen, und das resultierende Filtrat wird in vacuo zu einem viskosen Öl konzentriert. Ethylacetat und halbgesättigtes wäßriges Natriumcarbonat (200 mL) werden zu dem resultierenden Rückstand zugegeben. Das Zwei-Phasen-Gemisch wird auf einem Rotationsverdampfer annähernd eine Stunde lang kräftig verwirbelt. Alle gebildeten Feststof fe werden gesammelt, um das Produkt durch Filtration auf einen gescinterten Glastrichter zu ergeben. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen und anschließend auf konstantes Gewicht in vacuo getrocknet, um das Produkt zu ergeben.

Ala-His-D-βNal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-NH&sub2;, 35.

Das Heptapeptid Boc-Ala-His-D Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-(Boc)-NH&sub2; (34, 1,02 mmol) wird zu einer Lösung mit Raumtemperatur von Trifluoressigsäure (30 mL), Dimethylsulfid (14 mL), 1,2 Ethandithiol (7 mL) und Anisol (2,2 mL) in Methylenchlorid (15 mL) zugegeben. Das homogene Reaktionsgemisch wird 15 Minuten lang gerührt. Nach diesem Zeitraum wird wasserfreier Ether (450 mL) zugegeben, um die Ausfällung des rohen biologisch aktiven Peptidproduktes 35 zu verursachen. Dieses Produkt wird durch Filtration auf einem gescinterten Glastrichter oder durch Dekantieren isoliert. Das resultierende Produkt wird in Wasser aufgelöst und lyophilisiert. Das lyophilisierte Produkt kann weiter durch Chromatographie unter mittlerem Druck auf einer 26 X 460 mm Glassäule, die Lichroprep RP-18 Säulenpackungsmaterial (C-18, 25-40 nm, unregelmäßiges Mesh) enthält, gereinigt werden. Nach der Injektion des Peptids als eine Lösung in Wasser wird die Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 9 mL pro Minute mit einem flachen Gradienten von 0 bis 25 % Methanol 5 - 20 Stunden lang eluiert und anschließend mit einem Gradienten von 25 bis 55 % Methanol ca. 48 Stunden lang. Die Methanolkonzentration des Gradienten wird anschließend mit einer Rate von 2 % pro Stunde gesteigert. Während der Elution ist der Rest der Lösungsmittelzusammensetzung aus Wasser, das 0,2 % Trifluoressigsäure enthält, zusammengesetzt. Das Produkt (35) wird durch HPLC identifiziert und durch Konzentration der geeigneten Elutionsvolumina konzentriert.

Claims

1. Peptid der Formel

A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-Trp-A&sub5;-A&sub6;-Z,

wobei A&sub1; His, 3(NMe)His, His-Ala, Ala, Tyr, A&sub0;-His oder A&sub0;- 3(NMe)His ist, wobei A&sub0; jede beliebige natürlich vorkommende L-Aminosäure, Met(O), DOPA, Abu oder Peptide der Formel L-A&sub0; ist, wobei L H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys, Tyr-DAla-Phe-Gly, Tyr-DAla-Gly-Phe, Tyr-Ala-Gly-Thr oder Tyr-DAla-Phe-Sar ist;

A&sub2; DβNal ist;

A&sub3; Ala, Gly oder Ser ist;

A&sub5; DPhe, D/Lβ (Me)Phe oder (NMe)DPhe ist;

A&sub6; B-G oder G ist, wobei B jede beliebige natürlich vorkommende L-Aminosäure, Dipeptide aller beliebigen natürlich vorkommenden Aminosäuren oder H&sub2;N(CH&sub2;)nCO&sub2;H ist, wobei n=2 - 12, und G Arg, iLys, Lys oder Orn ist;

Z die C-terminale Endgruppe des Polypeptids oder die C-terminale Aminosäure(n) plus Endgruppe ist, und Z -CONR¹R², -COOR¹, -CH&sub2;OR¹, -Gly-Z', -Met-Z', -Lys-Z', -Cys-Z', -Gly- Tyr-Z' oder -Ala-Tyr-Z' ist, wobei Z' -CONR¹R², -COOR¹ oder -CH&sub2;OR¹ ist, wobei R¹ H, eine Alkylgruppe mit von 1 bis etwa 6 Kohlenstoffatomen, eine Cycloalkylgruppe mit von 3 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen, eine Alkenylgruppe mit von 2 bis etwa 8 Kohlenstoffatomen oder eine Arylgruppe mit von 6 bis etwa 12 Kohlenstoffatomen ist; R² wie R¹ definiert ist und gleich oder verschieden sein kann; wobei Aminosäurerestabkürzungen mit den von der IUPAC-IUB-Kommission für biochemische Nomenklatur oder den gewöhnlich in diesem Gebiet verwendeten übereinstimmen, sofern nicht anders angegeben, die Aminosäure in der L-Form vorliegt, wenn der Drei-Buchstaben-Aminosäureabkürzung ein D vorangestellt ist, die Aminosäure in der D-Form vorliegt, wenn ein D/L vorangestellt ist, die Aminosäure eine Mischung von D- und L-Konfigurationen ist;

DOPA = 3,4-Dihydroxyphenylalanin, Met(O) = Methioninsulfoxid, Abu = α-Aminobuttersäure, iLys = NE-Isopropyl-L-Lysin, 4-Abu = 4-Aminobuttersäure, Orn = L-Ornithin, DαNal = α-Naphthyl-D-Alanin, DβNal = β-Naphthyl-D-Alanin, Sar = Sarkosin, (Me) = Methyl, (NMe) = N-Methyl;

und die organischen oder anorganischen pharmazeutisch akzeptablen Salze derselben.

2. Peptid gemäß Anspruch 1, wobei A&sub1; His, Ala, His-Ala oder A&sub0;-His ist.

3. Peptid gemäß Anspruch 1, wobei A&sub3; Ala ist.

4. Peptid gemäß Anspruch 2, wobei A&sub0; Ala, Lys oder Glu ist; A&sub3; Ala ist; A&sub6; Lys, iLys, Ala-Lys, Ala-Ala-Lys oder H&sub2;N(CH&sub2;)n'CO-Lys ist, wobei n' 4-8 ist.

5. Peptid gemäß Anspruch 1 mit der Formel

His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A&sub6;-Z.

6. Peptid gemäß Anspruch 5 mit der Formel

His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;.

7. Peptid gemäß Anspruch 1 mit der Formel

A&sub0;-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A&sub6;-Z.

8. Peptid gemäß Anspruch 7, wobei A&sub0; Ala ist.

9. Peptid gemäß einem der Ansprüche 5, 7, 12 oder 14, wobei Z -CONH&sub2; ist.

10. Peptid gemäß Anspruch 1 mit der Formel

Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;,

Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-NH&sub2;,

Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Ala-Lys-NH&sub2;,

Lys-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A&sub6;-NH&sub2; oder

Glu-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A&sub6;-NH&sub2;.

11. Peptid gemäß Anspruch 2, 5, 7 oder 14, wobei A6 G ist.

12. Peptid gemäß Anspruch 1 mit der Formel

His-Ala-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A&sub6;-Z.

13. Peptid gemäß Anspruch 12 mit der Formel

His-Ala-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;.

14. Peptid gemäß Anspruch 1 mit der Formel

Ala-DβNal-Ala-Trp-DPhe-A&sub6;-Z.

15. Peptid gemäß Anspruch 14 mit der Formel

Ala-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;.

16. Nicht therapeutisches Verfahren zur Förderung der Freisetzung von Wachstumshormon und Steigerung seiner Spiegel in einem nicht-humanen Tier, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Menge wenigstens eines der Peptide nach Anspruch 1, 4, 7, 10 oder 12 an das Tier.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei das nicht-humane Tier ein Säugetier ist.

18. Pharmazeutische Zusammensetzung zur Förderung der Freisetzung von Wachstumshormon und Steigerung seiner Spiegel in Tieren, umfassend wenigstens eines der Peptide nach Anspruch 1, 4, 7, 10 oder 12 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger- oder Verdünnungsstoff.

19. Peptid gemäß Anspruch 2, wobei A&sub0; jede beliebige natürlich vorkommende Aminosäure ist.

20. Synergistische Kombination des Peptids nach Anspruch 1 und einer zweiten Verbindung, wobei die zweite Verbindung eine Verbindung ist, die als ein Agonist an dem Wachstumshormonfreisetzungshormonrezeptor wirkt oder die Freisetzung von Somatostatin hemmt und zur Förderung der Freisetzung und Erhöhung der Blut-Wachstumshormonspiegel eingerichtet ist.

21. Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 18, die ferner eine zweite Verbindung umfaßt, die als ein Agonist am Wachstumshormonfreisetzungshormonrezeptor wirkt oder die Freisetzung von Somatostatin hemmt.

22. Verwendung einer Verbindung der Formel:

A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-Trp-A&sub5;-A&sub6;-Z,

A&sub2; DβNal ist;

A&sub3; Ala, Gly oder Ser ist;

A&sub5; DPhe, D/Lβ(Me)Phe oder (NMe)DPhe ist;

A&sub6; B-G oder G ist, bei der Herstellung eines Medikamentes zur Förderung der Freisetzung von Blutwachstumshormon und zur Erhöhung seiner Spiegel.

23. Verfahren zur Herstellung einer Verbindung der Formel

A&sub1;-A&sub2;-A&sub3;-Trp-A&sub5;-A&sub6;-Z,

A&sub2; DβNal ist;

A&sub3; Ala, Gly oder Ser ist;

A&sub5; DPhe, D/Lβ(Me)Phe oder (NMe)DPhe ist;

A&sub6; B-G oder G ist, das das Kopplung von Aminosäuren oder Aminosäurederivaten zur Bildung der Verbindung umfaßt.

24. Verfahren zur Herstellung des Peptids nach Anspruch 1, das eine Kondensationsreaktion von Peptidfragmenten zur Bildung des Peptids umfaßt.