PT98439A - Processo de preparacao de peptidos e de composicoes farmaceuticas - Google Patents

Description

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HEMÓRIA DESCRITIVA 0 presente invento refere-se ao processo de preparação de novos compostos de polipéptido que promovem a libertação da hor-mona de crescimento quando administradas a animais- Num seu outro aspecto,, o presente invento descreve métodos para promover a libertação e o aumento dos níveis de hormona de crescimento em animais- por administração de compostos de polipéptido, libertadores da hormona de crescimento, específicos.

An.tecedentes....da.....Invenção A elevação dos níveis de hormona de crescimento (QH) em mamíferos, por administração de compostos libertadores da QH, pode conduzir a um peso corporal mais elevado e a uma produção de leite mais elevada, se, da administração resultarem níveis de QH suficientemente elevados.. Adicionalmente, é conhecido que o aumento dos níveis da hormona de crescimento em mamíferos pode ser conseguida por aplicações de agentes libertadores de hormona de crescimento conhecidos, tais como hormonas de ocorrência natural, libertadoras da hormona de crescimento» A elevação dos níveis de hormona de crescimento em mamíferos pode também ser conseguida por aplicação de péptidos libertadores da hormona de crescimento, alguns dos quais já foram anteriormen™ te descritos, por exemplo, nas patentes U.S. 4 223 019, U„S. 4 223 020, U.S. 4 223 021, U-S- 4 224 316, U.S. 4 226 857, U.S. 4 228 .155, U.S- 4 228 156, U.S. 4 228 157, U.S. 4 228 158, U.S. 4 410 512, U.S. 4 410 513, U.S. 4 411 890 e U.S. 4 839 344. Têm-se também usado anticorpos contra o inibídor da libertação de hormona de crescimento endógena, a somatostatina (SRIF) para causar níveis de QH elevados. Neste último exemplo, os níveis de hormona de crescimento são elevados removendo o inibídor da libertação da QH endógena (SRIF) antes de este atingir a pituitária, onde inibe a libertação da QH.

Cada um destes métodos, para promover a elevação dos níveis de hormona de crescimento, envolve materiais que são caros de 72 949 39540/39736 —4“

sintetizar e/ou isolar com uma pureza suficiente para administração a um animal alvo. Serão desejáveis os polipéptídos de cadeia curta, relativamente simples, que possuam a capacidade de promover a libertação da hormona de crescimento, pois estes podem ser preparados de um modo fácil e barato, facilmente modificados quimicamente e/ou fisicamente, e também facilmente purificados e formulados; e deverão possuir também excelentes propriedades de transporte.

Será desejável dispor de polipéptídos de cadeia curta que promovam a libertação e a elevação dos níveis de hormona de crescimento no sangue de animais. Seria também util ser possível usar estes polipéptídos para promover a libertação e a elevação dos níveis de hormona de crescimento no sangue de animais. &ymãrio.....da.....Invenção.

Verificou-se agora que existem vários novos compostos de polípéptido que promovem a libertação de hormona de crescimento em animais. Estes polipéptídos possuem a fórmula Ai~A2'"'A3‘~iT'P'" -A5~A6"Z, na qual A^ é His, 3(NMe)His, A0~His, A0~3(NMe)His, Ala, Tyr ou His-Ala, onde A0 é qualquer L-aminoácido de ocorrência natural, Met(O), DOPA, Abu, ou péptidos com a fórmula, L-Aq, na qual L é H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys, Tyr-DAla-Phe-Gly, Tyi—DAla-—Gly-Phe, Tyi—Ala-Gly-Thr ou Tyr-DAla-Phe-Sar, preferivelmente, Aq é qualquer aminoácído de ocorrência natural, mais preferivelmente, A0 é Ala, Lys ou fâlu; A2 é DeNal ou DPhe; A3 é Ala, Gly ou Ser; A^ é Phe, D/L^(He)Phe ou (NHe)DPhe; A6 é fâ-fâ ou fâ, onde B é qualquer aminoãcido de ocorrência natural, dipéptidos de quaisquer aminoãcidos de ocorrência natural ou H2N~(CH2)n--CQ2H (onde n=2-12) e G é Arg, iLys ou Qrn; 1 é o grupo de extremidade do terminal C, --CGNR^R'*', COOR·** ou -C^OR"*- (onde R^· é H, um grupo alquilo possuindo de 1 a cerca de 6 átomos de carbono, um grupo cicloalquilo possuindo de 3 a cerca de 8 átomos de carbono, um grupo alcenilo possuindo de 2 a cerca de* 8 átomos de* carbono ou um grupo arilo possuindo de 6 a cerca de 12 átomos de carbono, e R^ é definido como R1 e pode ser o mesmo ou diferente), -Gly-Z*, -iiet-Z”, -Lys-Z3, -Cys-Z”, --Gly-Tyr-Z* ou -Ala-Tyr-Z1, onde ZB é -CGNR^R2, -CQ0R·1· ou “-CH2QR1 (onde R1 e R·2 são definidos como ari~

72 949 39540/39736 -5- teriormente), e os seus saís, orgânicos ou inorgânicos, farmaceu-ticamente aceitáveis» Preferivelmente, o péptido tem a fórmula His-A2”Ala~Trp~DPhe-Lys~NH2, AQ~His~A2~Ala~Trp~DPhe~Lys“NH2 (por exemplo Ala-His-A2~Ala~Trp~0Phe-Lys~NH2) ou

Ala-A2-Ala“Trp~DPhe-Lys~NH2·. Ainda mais preferivelmente, A2 é D^Nal» Estes péptidos podem ser usados para promover a libertação e a elevação dos níveis de hormona de crescimento no sangue em animais, preferivelmente, em humanos, por administração de uma quantidade eficaz do péptido»

Descricâo.....detalhada.....da.....Invenção 0 presente invento é baseado no facto de se ter verificado que vários polipéptidos de cadeia curta promovem a libertação e a elevação dos niveis de hormona de crescimento no sangue de animais» Os polipéptidos, contemplados no âmbito do presente invento, são definidas pela estrutura genérica seguinte: A1~A2“A3~T * na dual A^, A2, Ag, A5, A6 e 1 são de finidos como se segue» A-^ é His, 3(NMe)His (i.e», quando o anel de imidaaole está metilado na posição 3), His-Ala, Aq-Hís, Ala, Tyr ou A0-3(NMe)Hís, onde A0 é qualquer L-aminoácido de ocorrência natural, Met(Q), DOPA, Abu ou péptidos com a fórmula L~Aq, onde L é H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys, Tyr-DAla-Phe-Qly, Tyr-DAla--Qly-Phe, Tyr-Ala~aiy~Thr ou Tyr-DAla-Phe-Sar. Preferivelmente, A^ é His, Ala, His-Ala, Aq-Hís ou Ala- Mais preferivelmente, é His ou A0-His» Aq é, preferivelmente, qualquer L-aminoácido de ocorrência natural, mais preferivelmente, Aq é Ala, Lys ou Glu» Ainda mais preferivelmente, Aq é Ala» A2 é DráNal ou DPhe» A2 é, preferivelmente, D^Nal»

Ag é Ala, Gly ou Ser» Ag é, preferivelmente, Ala» A^ é DPhe, D/L^(Me)Phe ou (NMe)DPhe. Preferivelmente, A^ é DPhe» A6 é B-G ou G, onde B é qualquer L-aminoácido de ocorrência natural, dipéptidos de quaisquer L-aminoãcidos de ocorrência natural (tais como Ala-Lys, Ala-Ala, Ala-Leu) ou H2N(CH2)nC02H, —6— 72 949 39540/39736 «Λ* <r onde η=2-12, e G ê Arg, ILys, Lys ou Orn. Mais preferivelmente, g é qualquer L~aminoácido de ocorrência natural ou ^NCG^^CO^m, onde n=4~8. Ainda mais preferivelmente, A6 é Q, Ala-Lys ou Ala-~Ala~Lys. Ainda mais preferivelmente, A^ é 6. Muito preferivelmente» A6 é Lys. 1 representa o grupo da extremidade da terminal C do poli-péptido ou o grupo da extremidade do terminal 0 mais aminoáci-do(s)» onde Z é -CONR^-R2, -CQOR1 ou -Ch^OR1, onde R1 é H, um grupo alquilo possuindo de 1 a cerca de· 6 átomos de carbono, um grupo cicloalquilo possuindo de 3 a cerca de 8 átomos de carbono, um grupo alcenilo possuindo de 2 a cerca de 8 átomos de carbono, ou um grupo arilo possuindo de 6 a cerca de 12 átomos de carbono. R2 é definido como R-*- e pode ser o mesmo ou diferente. Preferivelmente, R1 é H ou um grupo alquilo possuindo de 1 a cerca de 6 átomos de carbono. Z pode também ser -(317-1% -Met~Z% -Lys-Z% ~Cys~Z% -Gly-Tyr—Z" ou -Ala-Tyr-2% onde Z'J é -C0NR1R2, -C00R1 ou -CHgOR**-, oride R-1· e R2 sáo definidos como anteriormente. Preferivelmente, Z é -CONR^R2, -COOR2 ou -O-^OP1» e os sais de adição, orgânicos ou inorgânicos, farmacêutica-mente aceitáveis, de qualquer dos referidos polipéptidos.

As abreviaturas dos resíduos usadas estão de acordo com a nomenclatura padrão dos péptidosa

Gly Glicina Tyr — L-Tirosina I le L-Isoleucina (3lu = Acido L-fâlutâmico Thr L-Treonina Phe - L-Fení lalan.ina Ala - L-Alanina Lys L-Lisiria Asp - Acido L-Aspártico Cys - L-Cisteína Arg - L-Argiriina Gin ** L-Glutamina Pro ií» L-Prolina 72 949 39540/39736

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Leu = L-Leucina rifôt ” L-Metíonína Ser ~ L-Serina Asri ~ L-Asparagina His - L-Histidina T rp - L-T ríptofano < v—« H L-Valina DOPA ~ 3,4-Di-hidroxifenilalanina Met(O) s Sulfóxído de Metionina Abu ~ Acido a-Amiriobutírico i Lys ™ N€-Isopropi1-L-Lisina 4-AbU - Acido 4-Amínobutírico Orri - L-Ornítina DaNal = a-Naftil-D-Alanína D^Hal - (J-Naf til-D-Alanina Sar - Sarcosina

Todas as abreviaturas de aminoãcidos de três letras precedidas por um "D" indicam a configuração D do resíduo aminoácido e as abreviaturas precedidas por "D/L" indicam uma mistura das configurações 0 e L do aminoácido designado» Para os proposítos da presente descrição considera-se que a glicina está incluída no termo "L-aminoácidos de ocorrência natural".

Os resíduos aminoácidos, básicos, neutros ou ácidos, que podem ser usados para os aminoãcidos A·^, Ag, A^ e A6 permitem ter um grande controlo sobre as propriedades fisioquimicas do péptído desejado» Esta flexibilidade proporciona vantagens importantes para a formulação e entrega do péptido desejado a quaisquer espécies» Pela selecçâo das porções R e Z ganha-se também uma flexibilidade adicional, podendo deste modo ter um melhor controlo das propriedades fisioquimicas do composto desejado»

Os compostos libertadores de hormona de crescimento preferidos, utilizados na prática do presente invento, são: A:L”A2'“Ala-Trp-DPhe-A6-Z, tal como AQ-His-A2“Ala-T rp-DPhe-A6~Z,

His-Ala-Ag^Ala-T rp-DPhe-A6-Z 72 949 39540/39736

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Ala-A2~Ala~Trp-DPhe~A6~Z e HÍS“A2~Ala-Trp-DPhe~A6-Z, fô os seus sais de adição orgânicos ou inorgânicos- Preferívelmente, a2 é D^Nal, Ainda mais preferivelmente, são: A^-His-D^Mal-Ala-Trp-DPhe-Lys~NH2 (particularmente, Ala-His-D^Nal-Ala-Trp-OPhe-Lys-Nt-^), e His-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-Nl·^, e os sais de adição, orgânicos ou inorgânicos, de qualquer dos referidos polipéptidos-

Tipicamente, estes compostos são fáceis de sintetizar» são eficazes na promoção de um aumento dos niveis de hormona de crescimento no soro e são desejáveis para a produção e utilização à escala comercial- Adicionalmente, estes compostos podem ser vantajosos por possuírem propriedade fisioquímicas que são desejáveis, para a entrega eficaz destes compostos de polipéptido a uma grande variedade de espécies animais, devido á flexibilidade toi— nada possível pelas várias substituições em numerosas posições dos compostos de polipéptido, por selecçâo da natureza polar, neutra ou não polar das porções do terminal N, do terminal C e do centro destes compostos de polipéptido, de modo a serem compatíveis com o método de entrega desejado-

Tipicamente, estes péptidos mostram um grau de potência mais elevado, na promoção do aumento dos niveis de hormona de crescimento no soro, do que a maior parte dos péptidos equivalentes com urn resíduo aminoãcido diferente na posição A2- Tipicamente, os péptidos de D^Nal são muito preferidos devido ao seu nivel de potência elevada-

Os péptidos Hís-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-Nl·^ e A0-His-DíiNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2!. tais como AIa-His-D®Nal~Ala~Trp-0Phe~Lys-NH2), os péptidos AQ-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 tais como Ala-His-DPhe-Ala-Trp”DPhe-LyS"NH2 e os seus sais de adição orgânicos ou inorgânicos, são, presentemente, os mais preferidos-

Mostrou-se que estes compostos têm um grau de potência ele- 72 949 39540/39736

O* ~9· vado na promoção do aumento dos níveis de hormona de crescimento no soro.

Os compostos do presente invento podem ser usados para aumentar os níveis de OH no sangue de animais; aumentam a produção de leite em vacas; aumentam o crescimento do corpo de animais tais como mamíferos (p.e., humanos, ovinos, bovinos e suínos), bem como, de peixe, de aves e de outros vertebrados e crustáceos; e aumentam a produção de lã e/ou de pele de mamíferos. A quantidade de crescimento do corpo é dependente do sexo e idade da espécie animal, da quantidade e da identidade do composto libertador da hormona de crescimento que está a ser administrada, da via de administração e de outros factores.

Os novos compostos de polipéptido do invento podem ser sintetizados de acordo com os processos usuais da química dos péptidos, em solução e em fase sólida, ou por processos clássicos conhecidos na arte. A síntese em fase sólida é iniciada na extremidade do terminal C do péptido. Pode-se preparar um material de partida adequado, por exemplo, ligando o alfa-amirioácído protegido, requerido, a uma resina clorometilada, a uma resina de hidroximetilo, a uma resina de benzídrilamina (BHA) ou a uma resina de para-metilbenzidrilamina (p-Me-BHA). Uma destas resinas de clorometilo é vendida com a marca comercial BI08EADS SX-1 pela Bio Rad Laboratories, Ríchmond, Califórnia, E.U.A.. A preparação da resina de hidroximetilo é descrita por Bodansky et al., Chem.-. I.n.cL. (London) 38, 1597 (1966),. A resina de BHA foi descrita por

Pietta e Marshall,Chem..........Qofnm,-., 650 (1970) e está comercialmente disponível em Península Laboratories, Inc., IBelmont, Califórnia, E. U. A. „

Após a ligação iniciai, o grupo protector da alfa-amino pode ser removido por uma escolha de reagentes ácidos, incluindo soluções de ácido trifluoroacétioo (TFA) ou de ácido clorídrico (HC1) em solventes orgânicos, à temperatura ambiente. Após a remoção do grupo protector de alfa-amino, os restantes aminoácidos protegidos podern ser acoplados, por passos, na ordem desejada- Geral-mente, faz-se reagir cada aminoácido protegido num excesso de 72 949 39540/39736

10 cerca de 3 vezes usando um activador apropriado do grupo carboxi-lo, tal como diciclo-hexilcarbodíimida (DCC) ou di-ísopropilcar-bodiimida (DIC) em solução, por exemplo, em diclorometano (CH2CI2) ou em dimetilformamida (DMF) e suas misturas- )

Após a sequência de aminoãcidos desejada estar completa, o péptido desejado pode ser clivado do suporte de resina, por tratamento com um reagente tal como ácido fluoridrico (HF) que cliva, não apenas o péptido da resina, mas também os grupos protec-tores da cadeia lateral normalmente usados- Quando se usa uma resina de clorometilo ou uma resina de hidroximetilo, o tratamento com HF resulta na formação do péptido na forma de ácido livre-Quando se usa a resina de BHA ou de p-Me-BHA, o tratamento com HF resulta directamente nas amidas de péptido livres- 0 procedimento em fase sólida descrito anteríormente é bem conhecido na arte e foi descrito por Stwart e Young, Solid Phase

Peotide.....Svnthesiss Second Edn. (Pierce Chemical Co-, Rockford, I.L 1984)-

Em Bodansky et al-, Peptide.........Svnthesis. 2nd Edition, Jonh

Wiley & Sons, New York, N»Y- .1976, descrevem-se alguns processos em solução que podem ser utilizados para sintetizar as porções de péptido do presente invento-

Crê-se que os péptidos serão maís preferivelmente sintetizados por um processo em fase de solução que envolve a reacção de condensação de pelo menos dois fragmentos de péptido-

Este processo compreende a condensação de um fragmento de péptido X-A-j-Y com o fragmento de péptido U-V-W, nos quais todas as cadeias laterais de aminoácido, com excepção de , são neutras ou estão protegidas, e onde X é Prot» ou Prot--A0, onde Prot„ é um grupo protector do terminal N; Y é A2"Q9 Ala~A2~Q, A2~A^—Q, Ala-A2~Ag~Q, A^—A3—A4~Q, Ala—Α·">~Ά3—A4—Q, Ala—Q ou —Q, onde, quando Y é Q, Ué J-A2“A3-A4 ou J-Ala-A2-A3-A4- Quando Y é Ala-Q, U é J-A2“"A3~A4« Quando Y é A2~Q ou Ala-A2~|Q!. d é J-Ag-A^, Quando Y é A2"A3”Q ou Ala-A2-A3“Q, U é J-A4- Quando Y é A2-A3~ 72 949 39540/39736 -A^-Q ou Ala--A2”“A3“-A4~-Q!, U é J. V é ή5 ou Z. Quando V é A^, W é A6~Z ou Z« Quando V é Z, W não está presente. A^, A5, A6 e Z são definidos como anteriormente. Na presente situação, A2 é O^Nal de OPhe e A^ é Trp. Q é o terminal carboxilo de um fragmento de péptido e é ~QR^ ou -Mj, onde M é uma porção capaz de ser deslocada por um riucleó-fílo contendo azoto e é H, um grupo alquilo contendo um a cei— ca de 10 átomos de carbono um grupo arilo possuindo de 6 a cerca de 12 átomos de carbono ou um grupo arílalquilo possuindo de 7 a cerca de 12 átomos de carbono; J representa o terminal amina do fragmento indicado e é H ou um grupo protector, que não impede a reacçâo de acoplamento, por exemplo, benzi lo.

Depois, removem-se os grupos protectores. Alternativamente, pode-se usar o péptido protegido, assim formado, noutras reacções de condensação para preparar um péptido maior.

Este processo preferido é descrito rnais detalhadamente no

Pedido de Patente dos E.U.A. nS de Série______________ depositado em 24 de Julho de 1990 por John C. Hubbs e S. W. Parker intitulado "Process for Synthesizing Peptides", que é aqui incorporado como referência.

De acordo com outra concretização do presente invento, é proporcionado um método para a promoção da libertação e/ou elevação dos níveis de hormona de crescimento no sangue de um animal. 0 referido método compreende a administração a um animal de uma dose eficaz de pelo menos um dos polipéptidos anteriormente descritos.

Qs compostos do presente invento podem ser administrados pelas vias de administração oral, parentérica (injecção intramuscular (i.m.), intraperitoneal (i.p„), intravenosa (i.v.) ou subcutânea (s.c.)), nasal, vaginal, rectal ou sublingual, e podem ser formulados em formas de dosagem apropriadas para cada via de administração. Prefere-se a administração parentérica. 72 949 39540/39736 12

As formas de dose sólida para administração oral incluem cápsulas* comprimidos» pílulas» pós e grânulos- Nestas formas de dose sólidas, o composto activo é misturado com pelo menos um transportador inerte tal como sacarose, lactose ou amido- Estas formas de dose podem também compreender, como é prática normal, substâncias adicionais para além dos diluentes inertes, p-e-, substâncias lubrificantes tais como o estearato de magnésio- No caso de cápsulas, comprimidos e pílulas, as formas de dose podem compreender, também, agentes tamponantes- Adicionalmente, os comprimidos e pílulas podem ser preparados com revestimentos entéricos -

As formas de dose líquidas para administração oral incluem emulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires, contendo diluentes enertes normalmente usados na arte, tais como água- Para além destes diluentes inertes, as composições podem incluir também adjuvantes, tais como agentes molhantes, agentes emulsionan-tes e de suspensão, e agentes edul cor antes, aromatizantes e pei— fumantes-

As preparações de acordo com o presente invento para administração parentérica incluem soluções, suspensões ou emulsões estéreis, aquosas ou não aquosas- Exemplos de solventes ou de veículos não aquosos são o propilenoglicol, o polietílenoglícol, óleos vegetais, tais como o azeite e o óleo de milho, a gelatina e ésteres orgânicos injectáveis tais como oleato de etilo- Estas formas de dose podem conter também adjuvantes tais como agentes conservantes, molhantes, emulsionantes e dispersantes- Podem ser esterilízados, por exemplo, por filtração através de um filtro de retenção de bactérias, por incorporação de agentes esterilizantes na composição, por irradiação das composições ou por aquecimento das composições. Podem também ser preparadas num meio de água esterilizada, ou em qualquer outro meio injectável estéril, imediatamente, antes do uso,

Os novos compostos do presente invento são também úteis quando administrados em combinação com hormona libertadora da hormona de crescimento (i-β-, hormona de libertação de hormona de , *> , f nwqj í£*

72 949 39540/39736 crescimento, de ocorrência natural, seus análogos e equivalentes funcionais), bem como em combinação com outros compostos que promovem a libertação da hormona de crescimento, p.e., péptidos de libertação da hormona de crescimento (ver Patente dos E.U.A. nQ 4 880 778 que é aqui incorporada como referência). Estas combinações constituem um meio ejspecialmente preferido para admiriis-trar os péptidos de libertação da hormona de crescimento do presente invento, pois a combinação promove a libertação de muito mais hormona de crescimento do que a que seria de prever pela soma das respostas individuais para cada componente da combinação, i.e., a combinação proporciona uma resposta sinérgica em relação ao componente individual. Na patente anteriormente citada descrevem-se outros detalhes quanto à administração de combinações de péptidos libertadores da hormona de crescimento. Estes compostos sínérgicos, são, preferivelmente, compostos que actuam como um agonista no receptor da hormona libertadora da hormona de crescimento ou que inibem o efeito da somatostatina. 0 sinergis-mo pode ser binário, i.e., o composto do presente invento e um dos compostos sínérgicos, ou pode envolver mais do que um composto sínérgico. A quantidade de polipéptido ou de combinação de polipéptidos do presente invento a administrar variará dependendo de numerosos factores, p.e., do animal particular a ser tratado, da sua idade e sexo, do efeito terapêutico desejado, da via de administração e de qual o polipéptido ou combinação de polipéptidos utilizados. Contudo, em todos os casos, usa-se uma dose eficaz para promover a libertação e a elevação do nível de hormona de crescimento no sangue do animal receptor. Normalmente, este nivel de dose está compreendido na gama de entre cerca de 0,1 pg e 10 mg de polipéptido total por Kg de peso corporal. A quantidade preferida pode ser facilmente determinada, de um modo empírico, pelo perito na arte, com base na presente descrição.

Por exemplo, ern humanos, quando o modo de administração é o i.v., o nivel de dose preferido está na gama de cerca de 0,1 pg a 10 pg de polipéptido total por kg de peso corporal, mais preferivelmente, de cerca de 0,5 pg a 5 pg de polipéptido total por Kg 72 949 39540/39736 14

de peso corporal, ainda mais preferivelmente, de cerca de 0,7 pg a cerca de 3,0 pg por Kg de peso corporal. Quando se usam combinações de péptidos libertadores de hormona de crescimento, podem--se usar quantidades mais pequenas do péptido do presente invento. Por exemplo, combinando o péptido do presente invento com, por exemplo, um composto sinérgico do fârupo I da Patente dos E.U.A» nS 4 880 778 tal como QHRH, uma gama preferida é de cerca de 0,1 pg a cerca de 5 pg do composto do presente invento (p. e. A .1 a-H i s-D íâNa 1 - A 1 a-T rp-DP he-A&-Z,

Ala-His-DPhe-Ala-T rp-Dhe-A6-Z, ou

His-D^Nal-Ala-Trp-OPhe-A^-Z) por Kg de peso corporal e cerca de 0,5 pg a cerca de 15,0 pg de composto sinérgico (p»e«, QHRHJ e, mais preferivelmente, cerca de 0,1 pg a cerca de 3 pg do composto do presente invento com cerca de 1,0 pg a cerca de 3,0 pg do composto sinérgico por Kg de peso corporal.

Quando o modo de administração é o oral, tipicamente, são necessárias maiores quantidades. Por exemplo, para administração oral em humanos, o nível de dose é, tipicamente, de cerca de 30 pg a cerca de 600 pg de polipéptido por kg de peso corporal, mais preferivelmente de cerca de 70 pg a cerca de 500 pg de polipéptido por kg de peso corporal, ainda mais preferivelmente, de cerca de 100 pg a cerca de 350 pg de polipéptido total por kg de peso corporal, ainda mais preferivelmente, de cerca de 200 pg a cerca de 300 pg, de polipéptido total por Kg de peso corporal. As vacas requerem, aproximadamente, o mesmo nivel «la dose do que os humanos, enquanto que as ratazanas requerem, tipicamente, níveis de dose mais elevados. 0 nível exacto pode ser facilmente detei— minado empiricamente com base na presente descrição.

De um modo geral, como anteríormente se descreveu, a administração de combinações de péptidos libertadores de hormona de crescimento permitirá que sejam utilizadas doses menores dos compostos libertadores de hormona de crescimento individuais em relação aos níveis de dose requeridos para os compostos libertadores de hormona de crescimento individuais de modo a obter uma resposta similar, devido ao efeito sinérgico da combinação. 0 0

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No âmbito do presente invento inclui-se também o processo de preparação de composições compreendendo» como ingrediente activo, os sais de adição» orgânicos e inorgânicos» dos polipéptidos an-teriormente descritos e suas combinações; opcionalmente» em associação com um transportador» diluente» matriz de libertação lenta ou revestimento»

Os saís de adição» orgânicos ou inorgânicos» dos compostos libertadores da hormona de crescimento e suas combinações, contemplados no âmbito do presente invento, incluem saís de porções orgânicas tais como acetato, trífluoroacetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, benzoato, lactato, tosilato, citrato, maleato, fumarato, succinato, tartarato» naftalato, e similares; e de porções inorgânicas tais como sais do Qrupo I (i»e», sais de metais alcalinos), do Girupo II (i»e», sais de metais alcalino--terrosos) de amónio e de protamina, de zinco e de ferro, e similares, com contra-iões tais como cloreto, brometo, sulfato, fosfato e similares, bem como com as porções orgânicas referidas anteriormente»

Preferem-se os sais farmaceuticamente aceitáveis quando é contemplada a administração a sujeitos humanos. Estes sais incluem os sais, não tóxicos, de metal alcalino, de metal alcalino--terroso e de saís de amónio normalmente usados na indústria farmacêutica incluindo os saís de sódio, de potássio, de lítio, de cálcio» de magnésio, de bário» de amónio e de protamina, que são preparados por processos bem conhecidos na arte» 0 termo inclui também os sais de adição de ácido não tóxicos que são, de um modo geral» preparados fazendo reagir os compostos do presente invento com um ácido orgânico ou inorgânico adequado» Sais representativos incluem hidrocloreto, hidrobrometo, sulfato, bissulfato, acetato, oxalato, valerato, oleato, laurato, borato, benzoato, lactato, fosfato, tosilato, citrato, maleato» fumarato, succinato, tartarato, naftilato e similares» 0 presente invento será adicionalmente ilustrado pelos exemplos seguintes não limitativos» 72 949 39540/39736

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Exemplo.....1. Síntese.....dos.....Péptidos Libertadores.....da Hormona de.....Crescimento.

Coloca-se a resina de hidroeloreto de para-metilbenzídrila-mina (pMe-BHA»HC1) num vaso reaccional, num sintetizador de pép-tidos automatizado, disponível comercialmente» A resina é substituída com amína livre até uma carga de cerca de 5 mmoies por grama- Os compostos são preparados acoplando os aminoácidos individuais de partida ao terminal carboxilo da sequência de pép-tido, usando um agente activador apropriado tal como N^N^-dici-clo-hexílcarbodiimida (DCC)» A amina alfa dos aminoácidos individuais e protegida, por exemplo, na forma do derivado de t-bu-tiloxicarbonilo (t-Boc) e as funcionalidades reactivas da cadeia lateral são protegidas tal como se descreve na Tabela 1»

Tabela 1 Çrupos protectores de cadeia lateral adequados para síntese.....de péptidos.....em fase sólida

Arginina: Acido Aspãrtico: Cisteína: fHcido Qlutãmicos Histidina: Lisina: Metionína: Serina: Treoninan Triptofanos Tirosina: N^-Tosilo 0-Berizilo S-para-HetíIbenzilo 0-Benzilo

NÍm~TosilG N<s-2,4-Oiclorobenziloxicarbonilo S-Sulfóxido 0-Benzilo 0-Benzilo

Nin-Formil0 Q~2„6~0iclorobenzilo

Antes da incorporação do aminoãcido inicial, agita-se a resina três vezes (cerca de um minuto de cada vez) com diclorometa-no (CHgClg; cerca de 10 ml/g de resina), neutraliza-se com três agitações (cerca de dois minutos de cada vez) com Ν,Ν-di-isopro-piletilamina (DIEA) em diclorometano (10:90; cerca de 10 ml/g de resina) e agita-se três vezes (cerca de um minuto de cada vez) com diclorometano (cerca de 10 ml/g de resina)» 0 aminoácido

72 949 39540/39736

inicial e cada um dos aminoácídos subsequentes, são acoplados à resina, usando um anidrido simétrico pré-formado, usando cerca de 3,0 vezes a quantidade total da capacidade de ligação da resina, de um arnínoãcído adequadamente protegido, e cerca de 1,5 vezes a quantidade total de capacidade de ligação da resina de DCC, numa quantidade apropriada de diclorometano- Para aminoácidos com uma solubilidade em diclorometano baixa, adiciona-se Μ,Ν-dimetilfor-mamida (DMF) para se obter uma solução homogénea, Oeralmente, o anidrido simétrico é preparado até 30 minutos antes da introdução no vaso reaccional à temperatura ambiente ou a uma temperatura mais baixa, A cliciclo-hexilureia, que se forma na preparação do anidrido simétrico, é removida por filtração, por gravidade, da solução para o vaso reaccional- 0 progresso do acoplamento do aminoãcido à resina é seguido, normalmente, por um teste de cor usando um reagente tal como ninidrina (que reage com aminas primárias e secundárias), Após o acoplamento do aminoãcido â resina estar completo (>99%), o grupo protector da amina alfa é removido por tratamento com reagente(s) ácido(s). Um reagente normalmente usado consiste numa solução de ácido trífluoroacético (TFA) e anisole em diclorometano (45s2:53), 0 procedimento completo para incorporação de cada resíduo aminoácido individual na resina, está indicado na Tabela 2, (segue Tabela 2) 72 949 39540/39736 . sjnwwge» lí*'1 18-

Tabela 2

Procedimento para.....incorporação dos aminoácldos individuais numa resina.

Reagente Agitação T empo/Ag i tacão 1. Diclorometano 3 1 min. 2» TFA * Anísole* Diclorometano 1 2 min. (45-.2:53 3« TF A* Ari isole* Diclorometano 1 20 min. ¢45:2:53) 4. Diclorometano 3 1 min. 5. DIEA* Diclorometano 3 2 min „ ¢10:90) 6,. Diclorometano 3 1 min. 7. Anidrido simétrico 1 15-120 min.* pré-formado 8,. Diclorometano 3 1 min. 9. iso-Propanol 3 1 min. 10. Diclorometano 3 1 min. 11. Acompanha-se o progresso da reacção ** de acoplamento 12. Repetem-se os passos 1-12 para cada aminoácido individual. * 0 tempo de acoplamento depende do aminoácido individual. ** A extensão do acoplamento pode ser seguida* de um modo geral * por um teste de cor» Se o acoplamento está incompleto* o mesmo aminoãcido pode ser de novo acoplado por repetição dos passos 7--•11. Se o acoplamento está completo* o aminoácido seguinte pode ser acoplado.

Utilizando este processo de síntese de péptidos, obtêm-se novos polipéptidos ligados a resina tais como: A1-D6Nal“A3~Trp-A5”A6-® e A1~DPhe-A3“Trp~A5~A6-(g> -19- 72 949 39540/39736 (onde Aj_, A3, As e A6 são definidos como anteriormente, e ® é uma resina polimérica e os grupos funcionais dos aminoãcidos constituintes estão protegidos com grupos protectores adequados conforme necessário). Sequências especificas (numa forma apropriadamente protegida) que foram preparadas incluem;

His-DíJNal~Ala-Trp-DPhe-Lys- (r) *

Ala-His-O^Nal-Ala-T rp-DPhe-Lys-(r),

Ala-His-OTrp-Ala-T rp-OPhe-Lys-(r), H :i s-A1 a-DTrp~ A la-T rp-DPhe-Lys- @ , His-DaNal-Ala-Trp~DPhe-Lys-(R),

His-DAsp-Ala-Trp-DPhe-Lys- „ HiS"DCys(SMe)-Ala-Trp“DPhe-Lys”(R), | His-DT rp-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-(r),

His-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys- (r) ,

Ala-His-D^Nal-Ala-T rp-DPhe-Ala-Lys-@,

Try-DArg-Phe-Qly- R „

Ala-His-Dphe-Ala-T rp-DPhe-Lys-(r),

Ala-Hís-DHis-AIa-Trp-DPhe-Lys™ , e Ala-His-DPro-Ala-T rp-DPhe-Lys-^R).

Exemplo 2

Libertação de.....QH.....in.....vivo em ratazanas

As ratazanas Sprague-Dawley, fêmeas, imaturas, foram obtidas nos Charles River Laboratories (Wilmington, MA, E.U.A.). Após a sua chegada foram alojadas, a 25°C, com um ciclo de luz;escuri~ I dão de 14:10 h,. Estavam disponíveis ad libitum água e alimento de ratazana Purina. As crias foram mantidas com as suas mães até aos 21 dias de idade.

Anestesiaram-se ratazanas de vinte e seis dias de idade, seis ratazanas por grupo de tratamento, intraperitonealmente, com 50 mg/kg de pentobarbital, 20 minutos antes do tratamento í.v. com o péptido. Usou-se solução salina normal com 0,1% de gelatina como veículo para as injecções intravenosas (i.v.) dos pépti-dos. As ratazanas anestesiadas, pesando cerca de 55-65 gramas, foram irijectadas i.v. com a quantidade de compostos libertadores de hormona de crescimento indicadas nas Tabelas 3, 4 e 5. A injecção foi administrada como uma solução de 0,2 ml na veia ju- “20- “20- f-f J',* ****&*. 72 949 39540/39736 guiar»

Todos os animais foram sacrificados por decapitação em guilhotina 10 minutos após a injecção de teste final (ver Tabelas 3 © 4)» Após a decapitação* recolheu~se o sangue do tronco para determinação dos níveis de 0H no sangue» Após deixar o sangue coagular* centrifugou-se e separou-se o soro do coágulo» Manteve-se o soro congelado até ao dia de preparação das amostras para determinação, por radio-imuno-ensaio (RIA)* dos níveis de hormona de crescimento* de acordo com o procedimento seguinte* tal como foi desenvolvido pelo National Instituto of Arthrítis* Diabetes and Digestivo and Kidney Diseases (NIADDK)»

De um modo geral* os reagentes são adicionados aos tubos de análise RIA num único local, à temperatura do frigorifico (cerca de 4°C) na sequência seguinte: (a) tampão (b) padrão "frio" (i»e»* não radioactivo) ou amostra de soro desconhecido a ser analisada» (c) antigénio de hormona de crescimento radio-iodado* e (d) anti-soro de hormona de crescimento»

Geralmente, a adição de reagente é realizada de modo a se ter uma diluição final no tubo RIA de cerca de 1:30 000 (anti-soro para volume total de liquido; volsvol).

Tipicamente* incubam-se depois os reagentes misturados* ã temperatura ambiente (cerca de 25¾) durante cerca de 24 horas antes da adição de um segundo anticorpo (p»e», soro de globulina gama de cabra ou de coelho* anti-macaco) que se liga e provoca a precipitação do anti-soro de hormona de crescimento complexada» Os conteúdos precipitados dos tubos RIA são depois analisados pelo número de contagens* durante um período de tempo especificado, num contador de cintilação gama» Prepara-se uma curva padrão representando o número de contagens radioactivas em função do nível de hormona de crescimento (GH). Os níveis de GH das amostras desconhecidas são então determinados por comparação com a curva padrão.

72 949 39540/39736 -21- ή GH do soro foi medida por RIA com reagentes proporcionados pelo National Hormone and Pituitary Program»

Os níveis do soro nas Tabelas 3, 4, S e 6 estão indicados em ng/ml em termos do padrão de GH de ratazanas de 0,61 Unidades Internacíonais/mg (Ul/mg)» Os valores estão Indicados como o valor médio ± o erro padrão da média (SEM)» A análise estatisti-ca foi realizada usando o teste t de Student» NS significa que a diferença não era estatisticamente significativa. Nas Tabelas 3, 4, 5 e 6 os resultados mostrados são a média de estudos com seis ratazanas»

Tabela.,..3

Libertação de.....GH.....ín......vivo......fna/ml).....promovida por compostos libertadores de.....hormona.....de crescimento em ratazanas anestesiadas com pentobarbital (Animais sacrificados 10 minutos após a ínjecção final)

Coluna A Compostos Libertadores de hormona çje crescimento dose total I.ug.i Controlo GH ng/ml) GH libertada pelo composto na coluna A ng/ml +SEM valor de p His-DTrp-Ala-Trp- 0,1 151 ± 16 246 ± 39 - •••0Phe~Lys”~NH2 0,3 151 "h 16 670 ± 75 - 1,0 151 16 1 O o o ± 276 - 3,0 151 ~}r 16 2 106 ± 216 — Η1 s-0 fáNa 1 - A1 a-T rp- 0,1 151 ± 16 938 ± 255 <0,02 -OPhe-Lys-Mf^ 0,3 151 ± 16 1 716 ± 258 <0,02 1,0 151 ± 16 3 728 ± 691 <0,01 3,0 151 16 3 238 ± 273 <0,0.1 HIs-OTrp-Ala- 0,1 138 ± 12 226 ± 31 ~ ~Trp~Dphe”Lys”NH2 0,3 138 Hl·· 12 613 •4» 73 - 1,0 138 ά 12 1 581 ± 228 - 3,0 138 ± 12 2 875 4" 393 - (continua) 22"

22" '*^wjj00P 72 949 39540/39736

Tabela 3 (continuação)

Libertação de 6H in.....vivo.....fng/ml).....promovida por compostos libertadores de.....hormona.....de crescimento em ratazanas anestesiadas com pentobarbital (Animais sacrificados 10 minutos após a injecção final) Coluna A SH libertada

Compostos Liberta- dose pelo campos- dores de hormona total Controlo to na coluna A valor de crescimento .Í.M.9.1 OH nq/ml) nci/ml +SEM de p Ala-His-DT rp-Ala- 0,1 138 ± 12 254 ± 78 NS - ~Trp~DPhe~Lys~NH2 0,3 138 ± 12 809 zfc 59 NS - 1,0 138 ά 12 1 516 ± 215 NS - 3,0 138 -h 12 3 095 ~h 473 NS - A1a~Hΐs-D^Na1-A1a- 0,1 138 ± 12 1 128 zfc 309 <0,02 <0,02 ~Trp-DPhe~Lys-NH2 0,3 138 ± 12 2 479 ± 389 <0,001 0,001 1,0 138 zfc 12 3 899 514 0,001 0,001 3,0 138 12 4 202 ± 369 <0,05 NS A.la-His-DTrp-Ala- 0,1 111 ± 25 360 ± 35 _ -Trp-DPhe-Lys-NH^ 0,3 111 dz 25 903 217 .... 1,0 111 dz 25 2 957 + 427 _ 3,0 111 i 25 3 956 ± 485 ... A1a-H i s-D^Na1-Ά1a™ 0,1 111 i 25 970 ± 169 <0,01 “T rp"-0Phe~Lys-"NH2 0,3 111 ± 25 2 898 247 <0,001 1,0 111 H; 25 3 908 ± 327 NS (segue Tabela 4) 72 949 39540/39736

-23

Iabela....4

Libertação de GH in.....vivo (ng/ml) promovida pelos compostos de.....libertação de hormona de crescimento em .c.3.,t.âg.ãD.ff.g: pentobarbital (Animais sacrificados lo minn-r~ . * - ~

Coluna A Compostos libertadores de hormona de.....crescimento. A1aH í sDTrp A1airpOP heLysNH2 A1 aH i sDPhe.A 1 aT rpDP heLysNH2 A1 aH í sp.His A1 aT r pDP heLysNH2 A1 aH i sDP.ro A1 a T r pDP heLysNH2 "•inutos apos a ínjecçao final) ΘΗ libertada

Dose Total

Controlo ^.....ag/ml Hl 4 25 101 ± 69 •X.IL."? 117 * 19 0,3 0,3 0,3 0,3

por um composto da coluna A

ng/mJL 901 ± 21 616 ± 74 268 ± 54 262 ± 51 lãbe.la 3

Dose total Controlo fâH libertada Péptido .(.uai QH r !.g/mi ng/ml His-DAsp-Ala-T rp- 1,0 150 -Ή 20 154 63 -DPhe-Lys-NH2 3,0 150 H- 20 155 ± 34 10 , 0 150 ÚZ 20 163 ± 44 30,0 150 ± 20 224 dz 62 H C O jc 0 150 20 178 4- 83 His-DCys(SMe)~Ala~ 0,3 181 ± 69 178 ά 28 -~Trp-DPhe-Lys~-NH2 1,0 181 ± 69 193 28 3,0 181 ± 69 180 ± 34 His™DaNal-Ala'" 0 1 151 16 280 i 70 -Trp"-DPhe”Lys-NH2 0,3 151. ± 16 439 ± 122 1,0 151 16 1 130 ± 179 3,0 151 ± 16 2 319 139 His-DT rp~Ala~T rp~ 0,1 181 i 69 512 ± 43 -DPhfô~Lys~NHo 0 „ 3 J JL 181 A 69 566 ± 114 1,0 181 ± 69 1 531 ± 303 3,0 181 ± 69 2 349 4 26 7 "*·**»· !:> *- «

72 949 39540/39736 -24

Tabela...,,5.....(cp.n.t..ln.u.aç.S,o.).

Dose total Controlo <3H libertada Péptido lua).................... ΘΗ ng/ml nq/ml His-DT rp-Ala-T rp- 0,1 220 ± 29 420 ± 105 -DPhe-Ala-Lys-NH2 0,3 220 29 900 ± 163 1,0 220 ± 29 1 965 ± 366 3,0 220 ± 29 4 553 ± 670 His-O^Nal-Ala- 0,1 111 ± 25 484 ± 89 -Trp-0Phe-Ala-Lys-NH2 0,3 107 16 971 ± 241 1,0 107 ± 16 1 593 ± 359 3,0 107 ± 16 3 337 ± 583 His-Ala-DPrp-Ala-T rp- 0,1 111 ± 25 - -0Phe-Lys-NH2 0,3 151 ± 16 261 ± 32 1,0 151 ± 16 830 ± 103 3,0 151 ± 16 2 588 ± 341 As Tabelas 3, 4, 5 e 6 mostram que os compostos do invento promovem a libertação e a elevação dos níveis de hormona de crescimento no sangue de ratazanas às quais se administraram estes compostos. Os péptídos do presente invento mostram actividade enquanto que os compostos equivalentes com uma substituição na posição A2 (p»e., com DAsp, DCys(SMe), DHis e DPro) rião mostram ( esta actividade. Estas tabelas mostram também que o His-0®Nal- -Ala~Trp~DPhe~Lys~NH2 é mais activo do que os compostos possuindo DTrp, DaNal, OAsp e OCys(SHe) na posição A2- Similarmente,, o Ala-His~D^Nal-Ala-Trp-DPhe-L.ys-NH2 © mais activo do que o composto de DTrp equivalente.

Exemplo 3

Administração.....de uma combinação.....de compostos.....libertadores de GH

Repetiu-se o procedimento do Exemplo 2, com a excepção de não se terem anestesiado as ratazanas e de não terem sido tratadas com pentobarbital, e administrou-se uma combinação de pépti-dos às ratazanas. Na Tabela 6 indicam-se os compostos administrados., o nível da dose e os resultados obtidos. 72 949 39540/39736 ”25

Libertação de.....QH.....in.....vivo promovida pelos.........compostos libertadores de.....hormona.....de crescimento em.....ratazanas anestesiadas com pentobarbital (Animais sacrificados 10 minutos após a ίηό®°Ρ^° final) Coluna A Dose péptido liber- total tador de QH (.Ma). Ala-~His~DBNal~ 0,1 ~QPhe-Lys-NH2 0,3 1,0 3,0

Controlo de soro QH libertada no QH ncj/ml 6oro QH ncj/ml ± 3EH......(.N~6.1 ±........... 337 51 610 ± 90 337 ± 51 1 140 i 187 337 51 2 909 A 257 337 ± 51 3 686 •jr 436

^wp0Bf&

Ala-DBNal-Ala-”T rp”DPhe”Lys-NH2 0,3 1,0 3.010,0 Ala-His-DBNal-Ala” '••Trp~DPhe”LyS”NH2 0,31.0 Ala”His”DBNal”Ala” ) ”Trp~DPhe-Lys”NH2 0,31,0 Ala“His”DBNal”Ala~ ~-Trp”QPhe”Lys”NH2 0,1 0,31,0 167 .ti 46 363 ± 73 167 ± 46 1 450 294 167 ± 46 2 072 ± 208 167 ± 46 2 698 ± 369 160 ± 51 1 418 ± 302 160 ± 51 2 201 ± 269 228 ± 23 1 746 ± 318 228 ± 23 2 610 ± 176 160 ± 36 822 ± 243 160 ± 36 1 549 292 160 ± 36 2 180 Hl·· 284

72 949 39540/39736 ~2ό

Tabela 7 Ε feitos sinérgíços. i n v i v o.... em ratazanas na o an es t es i. a.<das.... do composto do.....invento.....com.....compostos.....do....fâr.upo....l....®/oy......dg....fârupp....3

Coirioos to Adminis trado Dos e íug) GH libertada (nq/ml) SEM Controlo - - 12 ± 3 175~la 1 58 ± 13 175-1 - - rs·· O 240 ± 32 Cb - - 10 204 ± 50 GHRHC - - 3 131 ± 50 Tpd - - 10 79 ± 29 175-1 GHRH 1 + 3 2 014 ± 224 175-1 TP - 1 + 10 987 ± 204 175-1 GHRH TP 1 + 3 + 10 4 150 ± 555 175-1 QHRH — 3 + 3 1 994 ± 249 175-1 TP - 3 + 10 2 149 ± 451 175-1 GHRH γρ 3 + 3 + 10 2 922 ± 384 C GHRH — 10 + 3 2 525 ± 453 C TP - 10 + 10 1 597 ± 387 c GHRH TP 10 + 3 + 10 4 344 ± 374 " —— — — — — — — -------*----- *· Os compostos cios grupos 1 e 3 são descritos em pormenor na

Patente dos E,U„A.. nQ 4 880 778« a - 175-1 “ His“D®Nal“Ala-Trp“DPhe-Lys-NH2 (composto do invento) b - c His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-Nl·^ (Composto de comparação) o - GHRH a Tyi—Ala-Asp-Ala-Ile-Phe--Thr-Asri-Ser-Tyr-Arg-Lys-~Va1-Leu-G1y~G1n-Leu-Se r--AIa-A rg-Lys-Leu-Leu-G1n--Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 (Composto do Grupo l) "v 27 72 949 39540/39736 ¢1 - γρ s Tyr-Darg-Phe-Gly-NHg (Composto do Qrupo 3) A Tabela 7 mostra que o composto do invento exibe uma resposta sinérgica quando administrada com compostos exemplares do Qrupo 1 e/ou do Grupo 3. Os resultados da Tabela 7 mostram ainda que o composto do invento tem uma maior resposta sinérgica do que a que é obtida com um composto de comparação (C), que se mostrou, anteriormente, ter uma resposta sinérgica»

Exemplo 4

Reaccao de condensação dos fragmentos de péptido.....para formar.....o.....péptido ^ Procedimentos gerais

Os pontos de fusão podem ser determinados usando um aparelho de pontos de fusão de capilar Thomas Hoover» Os espectros de in-fra-vermelhos (IV) podem ser registados num espectrofotómetro Perkin-Elmer, Modelo 137, ou num espectrofotómetro Nicolet, Modelo 5DX e indicados em número de onda (cnf1). Os espectros de massa (EM) podem ser obtidos usando um espectrometro de massa Modelo ZAB-1F da VGí Analytical Ldt. nos modos EI (impacto de electrões), FD (deserção de campo) ou FAB (bombardeamento com átomos rápidos)» Os resultados de GCMS podem ser obtidos usando um aparelho de GCMS Finnigan 4023, equipado com uma coluna capilar DBS de 30 m (J & W Scientific), usando hélio como gás trans-} portador» As rotações ópticas podem ser medidas usando um pola-rímetro Autopol III fabricado pela Rudolph Research»

Os espectros de RMN-H'1’ podem ser obtidos num instrumento de RMN JEOL GX-400 operando a 400 MHz ou num instrumento de RMN JEOL (3X-270 operando a 270 MHz» Estes instrumentos são capazes de uma resolução digital de rotina de menos do que 0,7 Hz» Os desvios químicos são expressos em partes por milhão em relação ao 3-(tri-metilsilil)-tetradeutero-propionato de sódio (TSP). A cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) pode ser realizada usando um sistema Hitachi, consistindo num controlador de gradiente L.-5 000 e numa bomba 655A ligada a uma coluna semi-

39540/39736 -28- -preparativa Vydac 201TP1010 ου 218TP1010, Como solvente de eluição podem-se usar combinações de água contendo 0,,2% de ácido trifluoroacético e metanol. Tipicamente, os compostos de interesse serão eluidos, com um caudal de seis ml por minuto, com um gradiente crescente do componente orgânico, com uma velocidade de aproximadamente 1-2% por minuto. Os compostos são depois detec-tados, nos comprimentos de onda apropriados, usando um detector de U„Vh de arranjo de díodo LKB 2140, As integrações podem depois ser realizadas usando um sistema lógico da Nelson Anaiytical (versão 3.6).

As reacções serão realizadas sob uma atmosfera inerte de | azoto ou de árgon, a não ser onde se especifique ser de outro modo. 0 tetra-hidrofurano anidro (THF, grau U.V.) e a dimetílfor— mamida (DMF) podem ser adquiridas na Burdick and Jackson e são usadas directamente do frasco.

A·· Preparação do.....fragmento de tripéptido oHN-Trp-PPhe-Lvs(Boc)NFU

Na~benziloxicarbonil-(N -t-butoxicarbonll)lisina-amida,......4 A uma solução, a 10°C, de carbonildiimidazole (COI, 2, 88,24 g, 0,544 mole) e de tetra-hidrofurano (THF, 1 500 ml), adiciona-se, lentamente, Na-benziloxicarbonil-(N -t-butoxicarbo-nil)lisina (1, 180 g, 0,474 mole). Durante esta adição observa--se a libertação de gás. Enquanto se está a formar o imidazoleto de N -benzi'loxicarboní 1~(N -t-butoxícarbonil)lisina intermediário ) 3, prepara-se urna solução saturada de amoníaco em THF (2 000 ml) (faz-se passar NHg gasoso, anidro, através de THF a 5-10°C). Após se julgar que a formação do intermediário & está completa (quando a libertação de gás tiver terminado, aproximadamente 2 horas, adiciona-se metade da solução de THF contendo 3 à solução de amoníaco. 0 restante da solução contendo g, é adicionado 30 minutos maís tarde. Durante as adições e durante um periodo adicional de 45 minutos após as adições, mantém-se um fluxo continuo de amoníaco gasoso. Pela adição das duas soluções contendo 3, forma-se um precipitado branco. Deixa-se a mistura reaccional aquecer até à temperatura ambiente e agita-se durante 15 horas. Remove-se o solvente da suspensão, in.....vácuo. Suspende-se o resíduo em água e recolhe-se o sólido resultante por filtração de vácuo. -29· 72 949 39540/39736 Ν -t-Butoxicarbonil-lisina-amída,......5

Adiciona-se uma solução da lisína-amida 4 (181,48 g, 0,479 mole) em metanol (MeOH, 1 000 ml) a uma suspensão de catalisador de 5% de Pd/C (5 g) em metanol (250 ml) sob árgon- Faz"*se borbu™ lhar hidrogénio através da mistura reacciorial (ca- 15 minutos) e, depois, agita-se a mistura reaccional, sob uma atmosfera de hidrogénio, até a análise por HPLC indicar que a reacçâo está completa (36 horas). Depois, elimina-se a atmosfera de hidrogénio com árgon. A solução reaccional. é clarificada através de um leito de Qel ite® e o solvente é removido in. vácuo para se obter um sóiido-

Na-Ben.2.1,1 ox. iça r bonl 1-D-F-eri i 1 a 1 ari i 1 - (H~ t-bu toxica r bon iDlisina--amida.........8.

Adiciona-se lentamente Na-benziloxi-carbonil-D-fenilalanina (6, 126,39 g, 0,423 mole) a uma solução, a 10^C, de GDI (2, 66,03 g, 0,409 rnrriole) em THF (500 ml)_ Durante a adição, observa-se a libertação de gás- Após a libertação de gás ter terminado, adiciona-se a lisina-amída 5 (110,75 g, 0,452 mole) na forma de uma solução em THF (500 ml)- Após aproximadamente 48 horas, filtra--se a mistura para remover os sólidos- Concentra-se o filtrado in vácuo -

Retoma-se o resíduo resultante em acetato de etilo (EtOAc, 300 ml) e depois lava-se como se segue, numa ampola de decantação- 1„ HC1 aq- (IN, 3 x 500 ml), pH da lavagem 1, ca- 8? pH das lavagens subsequentes, 1, 2„ água (500 ml), 3- Na2C03 aq- (50% de saturação, 2 x 500 ml), é filtrada para recolher os sólidos cristalinos formados (8), 4- água (3 x 500 ml)-

Seca-se a fase orgânica sobre MgSQ4- Após clarificação, remove-se o solvente in vácuo- 0 resíduo resultante pode ser re-cristalizado em EtOAc quente para se obter uma segunda amostra de 8 - 72 949 39540/39736

-30 D-Fenilalanil-(N -t-butoxicarbonil)llsina-amida.9

Adiciona-se uma solução metanólica (1 500 ml) da atrdda 8 (120,53 g, 0,229 mole) a uma suspensão de catalisador de 5% de Pd/C (50 g) em MeOH (200 ml).. Elímina-se a atmosfera de árgon com hidrogénio. Quando a análise por MPLC indica que a reacção está completa (ca, 4 horas), elimina-se a atmosfera de hidrogénio com ãrgon. Depois, clarifica-se a solução reaccional através de um leito de Celite® e evapora-se o filtrado in vácuo, obtendo-se um resíduo- Este produto de dipéptido pode ser usado directamen-te na preparação do tripéptido 12, l^?~Een.zi.lQxic.a rbon.il r.tr.ip.tofi.l-D.-f.en i la.lan i 1-Nrt-b.u.t.Q.x.i.carbo-nil)lisina-amida, 12

Agita-se uma solução, a 10°C, de Na~benziloxicarbonil-trip-tofano (10, 67,60 g, 0,200 mole), THF (500 ml) e CDI (2, 33,05 g, 0,204 mole), até terminar a libertação de gás. Depois, adiciona--se uma solução de 9 (40,8 g, 0,103 mole) em THF (ca, 200 ml) à mistura reaccional- Deixa-se a solução resultante reagir durante 15 horas aquecendo à temperatura ambiente- 0 sólido que se forma é depois recolhido por filtração sob vácuo. Do filtrado obtém-se um resíduo, por concentração in vácuo.. Recombinam-se o resíduo resultante e o sólido e retomam-se em EtQAc (4 000 ml) com um ligeiro aquecimento. Por arref©cimento da solução até à temperatura ambiente, forma-se um sólido. 0 sólido é recolhido por filtração sob vácuo. Este sólido é recristalizado em MeOH quente obtendo-se o tripéptido purificado 12- Lava-se o filtrado de EtOAc (da primeira cristalização), como se segue, numa ampola de decantação. 1. HC1 aq. (IN, 2 x 500 ml), 2. água (1 x 500 ml), 3. Na2C03 aq. (50% de saturação, 2 x 500 ml) 4. NaCl aq, (1 x 500 ml).

Seca-se a fase orgânica sobre MgSO^ e depois clarifica-se por filtração sob vácuo. Remove-se o solvente do filtrado in vácuo. 0 resíduo resultante é retomado em EtOAc, obtendo-se um sólido seco, 0 sólido pode ser submetido a uma segunda recrista- 39540/39736 -31- --^3 lização em MeOH quente para se obter uma segunda colheita de 12 na forma de um sólido branco.

Triotof il-D-fenilalanil-ÍN -t-butiloxicarboniinisina-amida, 13

Adiciona-se uma solução metanolica (1 500 ml) de tripéptido 12 (64,59 g, 0,091 mole) a uma suspensão de catalisador de 5% de Pd/C (5 g) e de MeOH (250 ml), sob uma atmosfera de árgon. Adiciona-se um volume adicional de MeOH (2 250 ml). Elimina-se a atmosfera de árgon com hidrogénio e deixa-se reagir (ca. 24 horas). Após a reacção estar completa, elimina-se a atmosfera de hidrogénio com árgon. Clarifica-se a solução através de um leito de Celi teí© e concentra-se o filtrado in vácuo obtendo-se o trí-péptido 13 na forma de um sólido branco. B. Preparação do fragmento.....de tripéptido-K-His-D^Nal-Ala-QMe Éster de metílo de Na~benzíloxícarboníl-hístidil-D-beta-naf-tilalanina, 2.5.

Lava-se uma solução de EtOAc (400 ml) e do hidrocloreto do éster de metilo de D-beta-naftilalanina (22, 0,62 mole) com solução saturada de carbonato de sódio (400 ml) e com solução aquosa de hidróxido de sódio 0,8 h!. (ca. 500 ml). Remove-se a fase aquosa resultante (pH 8,5) e lava-se a fase orgânica sequencialmente com solução aquosa semi-saturada de Ma2C03 (150 ml) e, depois, com água (50 ml). A forma de base livre de 22 é isolada por concentração in vãguo. da fase de acetato de etilo.

Adiciona-se diciclo-hexilcarbodiimida (DCC, ca. 95 g, 0,46 mole) a uma solução, a -5ÔC (banho de gelo-etanol), de Na-benzí-loxicarbonil-histidina (19, 143,5 g, 0,50 mole), de N-hidroxis-succinimida (HONSu, 23, 0,62 mole) e da forma de base livre de 22 (ca. 0,52 mole), recentemente preparada, em DMF (ca. 3 1). Agi-ta-se a solução reaccíonal resultante, durante 24 horas, com aquecimento à temperatura ambiente. Devei—se-á usar uma análise por HPLC para verificar se a reacção está completa. Se não estiver, arrefece-se depois a mistura reaccíonal até cerca de -5,;>C e adiciona-se uma porção adicional de diciclo-hexilcarbodiimida (ca. 0,17 mole) à mistura reaccíonal. Depois, agita-se a mistura ~32 ~32 fi 72 949 39540/39736 reaccional durante mais 24 horas com aquecimento à temperatura ambiente. Filtra~se depois a mistura para remover a diciclO" -hexilureia (OCU). Ao filtrado, adiciona-se água (1 1) e concentra-se a solução resultante i.a vácuo.. Retoma-se o resíduo resultante em HC1 aquoso IN (ca- 1. 1, até o pH da fase aquosa atingir um pH de 1). Depois, extraeta-se a fase aquosa com duas porções de acetato de etilo (1 1 de cada vez). Rejeitam-se as fases de acetato de etilo. Depois, ajusta-se o pH da fase aquosa peia adição de solução de hidróxido de sódio 2N, fria, (500 ml) e de pelotas de hidróxido de sódio. Durante esta neutralização, mantém-se a solução fria pela adição de acetato de etilo frio (1. 1), Quando o pH da fase aquosa atinge aproximadamente 7, resulta, usualmente, na precipitação copiosa de um sólido branco ou de óleo. Recolhe-se este precipitado, por filtração sob vácuo ou por decantação, e lava-se, sequencialmente, com solução semi-saturada de carbonato de sódio (2 x 1 500 ml), água (6 x l 500 ml) e acetato de etilo (3 x 1 500 ml). Seca-se o material resultante, sob um vácuo elevado, até peso constante. Este material pode ser hidrolisado directamente sem qualquer purificação adicional. 0 péptido de DPhe pode ser preparado usando o hidrocloreto do éster de metilo de D-fenilalanina como composto £2„ em vez do hidrocloreto do éster de metilo de D-beta-naftllalanina- W5r:i§n.z.ilox,íça,rbon.il-h,ís.t.ídi.l ti .1-D-alani.na., 26

Adiciona-se solução aquosa de hidróxido de sódio (192 ml, solução de 0,08 g/rnl, 0,38 mole) a uma solução do dipéptido 25 (ca- 0,38 mole), água (360 ml) e HeOH (ca. 6 1). Agita-se a solução à temperatura ambiente até a hidrólise estar completa (ca. 24 horas). 0 desaparecimento do péptido de partida é estabeleci do por análise de HPLC. Concentra-se a solução In. vácuo até se obter um resíduo que é dissolvido em água (ca. 1 1). Depois, ex-tracta-se a fase aquosa (pH ca. 10) com EtOAc (2 x 500 ml) numa ampola de decantação. Rejeitam-se as fases de acetato de etilo. Ajusta-se a fase aquosa resultante até urn pH de aproximadamente 5, com HC1 concentrado, resultando, usualmente, a precipitação de um sólido branco ou óleo. Recolhe-se o produto e seca-se i.n. 33 ff 72 949 39540/39736 .. vácuo.» Éster..........de.........meti lo.........de..........Na"ben2:iloxicarbonil"-histidil-D~beta-naf til- ”âIãD.lI.alãD.l.D.ã.»......20

Adiciona-se o dipéptido Na-benziloxicarbonil~histidil~D~be-ta~naftílalanina (26, 0,253 mole) a uma solução de HONSu (25, 0,505 mole) em OMF (800 ml) sob uma atmosfera de árgon. A esta solução, adiciona-se uma mistura de hídrocloreto do éster de metilo de alanina (15, 0,303 mole), N-metilmorfolina (16, 0,303 mole) e OMF (200 ml). Arrefece-se a solução resultante até 10°C., após o que se adiciona diciclo-hexilcarbodiimida (24, 0,265 mole) em cloreto de metíleno (273 ml). Segue-se a reacção por HPLC, mantendo a temperatura da mistura reaccional a 10°C, até a reacção estar completa. Se, após vários dias (ca. 4), a reacção nao está completa, adiciona-se uma carga adicional de 24 (0,080 mole) e agita-se a mistura reaccional durante mais um dia a 10°C.. De novo, segue-se a reacção por análise de HPLC até esta estar completa (tipicamente, ca. 5 dias). Os sólidos que se formam durante a reacção são recolhidos por filtração sob vácuo» Depois, concentra-se o filtrado, in vácuo, até se obter um resíduo» Retoma-se o resíduo resultante em acetato de etilo e extracta-se com solução aquosa semi-saturada de Na2C0g (2 x 500 ml). Seca-se a fase de acetato de etilo sobre iigS04» Clarifica-se a solução resultante e conoentra-se in y.ãçu.o. até se obter um resíduo»

C» Preparação....do.....fragmento.....d.e,...Tet.rapépt.í.do.....Ala-His-D^Nal-Ala-QH Éster de metilo de Histidil-O-beta-Naftil-Alanil-Alanina,......30

Adiciona-se 5% de Pd/C (3 g), cuidadosamente, a uma solução do éster de metilo de Na~benzíloxicarbonil-hístidil-D-beta-naf-tilalanilalanina 20 (71 mmol) em metanol (500 ml) sob uma atmosfera de árgon. Faz-se borbulhar árgon através da mistura reaccional durante 15 minutos e, depois, adicíona-se ácido acético (15 ml, 0,26 mole). Faz-se borbulhar hidrogénio (sob a superfície) através da mistura resultante, durante 15 minutos, e agíta--se a mistura reaccional, à temperatura ambiente, sob um balastro de hidrogénio (1 atm). Usa-se então a análise por HPLC para verificar se existe ainda algum material de partida. Se existe

72 949 39540/39736 ~34 ainda algum material de partida, faz-se borbulhar árgon, cuidado-samente, através da mistura reacciorial (sob a superfície, durante 30 minutos), e adiciona-se uma porção adicional de 5% de Pd/C (2,5 g)» Depois, introduz-se de novo hidrogénio» Faz-se borbulhar de novo árgon através da mistura reaccional e clarifica-se a solução resultante através de um leito de terra de diatomãceas» Concentra-se a solução resultante, iri. vácuo, obtendo-se o produto» Díssolve-se ou suspende-se uma parte deste produto em água (500 ml)» Ao material resultante adicionam-se acetato de etilo e solução aquosa saturada de carbonato de sódio» Por isolamento a partir da fase de acetato de etilo ou dos sólidos que resultam, obtém-se um material (30) que está isento de acetato» Éster.....de N-hidroxissuccinimida de.....Boc-Alanina......31.

Adiciona-se diciclo-hexilcarbodiimida (43 mmole) a uma solução, à temperatura ambiente, de Boc-alanina (43 mmole) e. de N-hidroxissuccinimida (48 mmole) em diclorometano (250 ml). Agita-se a solução resultante de um dia para o outro» Depois, filtra-se a mistura reaccional, para remover a diciclo-hexilureia, e concentra-se o filtrado clarificado, in vácuo, para se obter o produto, que é armazenado a -20°C, sob uma atmosfera de árgon, até ser usado»

Boc-Ala-His-D^Nal-Ala-Qiie,.....32

Adiciona-se o éster de alanína anterior (23,9 mmole) a uma } solução de His-D^Nal-Ala-GMe (30) (20,1 mmole) em dimetilformami- da anidra (DMF, 200 ml)» Agita-se a solução homogénea resultante durante o fim-de-semana, à temperatura ambiente, seguindo a evolução da reacção» Quando a análise por HPLC indica que não está presente, virtualmente, qualquer tripéptido na mistura reacional (p»e«, cerca de 3 dias), adiciona-se água (50 ml) à mistura reaccional e agíta-se a mistura resultante durante mais um dia» Depois, concentra-se esta solução in. vácuo» Dissolve-se o resíduo resultante em acetato de etilo e, depois, extracta-se com solução aquosa semi-saturada de carbonato de sódio (2 x 300 ml). Seca-se a fase orgânica com MgSO^ e e concentra-se i.n vácuo obtendo-se o tetrapéptido» Este material é usado sem qualquer purificação adicional na preparação do 72 949 39540/39736 ~3S~

Boc-Ala-Hís-D^Nal-Ala-QH»

Boc-Ala-His-D^Nal-Ala-OH.......33

Adiciona-se uma solução aquosa 2H de hidróxido de sódio (7,5 ml, 15 rnrnole) a uma solução de metanol (500 rn.1) e de agua (200 ml) contendo Boc-Ala-His-D^Nal-Ala-OMe (13,7 rnrnole)» Após se agitar a mistura reaccional de um dia para o outro à temperatura ambiente, a análise por HPLC índica a quantidade do material de partida restante» Quando a reacção está essencialmente completa (ca» de um dia para o outro), concentra-se a solução resultante in yácuo at£ um volume de, aproxímadamente, 200 ml» Adiciona-se água (100 ml) e ajusta-se o pH, até aproxímadamente 12, pela adição de solução de hidróxido de sódio 2.N (1 ml). Extracta-se a solução resultante com acetato de etilo (2 x 500 ml)» Rejeitam-se as fases de acetato de etilo» Depois, ajusta-se o pH da fase aquosa, até aproxímadamente 5, pela adição de HC1, o que resulta, usualmente, na precipitação do produto» É importante minimizar o volume da fase aquosa para promover esta precipitação» Oecanta-se a fase aquosa para separar o produto e, depois, lava-se o produto com água (2 x 50 ml). Seca-se o produto isolado, in vácuo» até peso constante» D» Reacção de condensação dos.......fragmentos de péptido para produzir o Heotapé&tido........Boc-Ala-His-D^Nal-Ala-TrD-D-Phe-Lvs(fâoc)-NH2. 3.1

Oissolvem-se os dois péptidos Boc-Ala-His-D^Nal-Ala-OH, (33, 2,6 rnrnole) e Trp-DPhe-Lys(Boc)-NH2 (13, 2,8 rnrnole), em DMF anidra, e concentra-se a solução resultante in vácuo» Esta concentração preliminar é realizada numa tentativa para remover quaisquer vestígios de metanol que possam estar presentes» A mistura de péptidos resultante é redissolvida em DMF e, depois, adiciona--se N-hidroxissuccinimida (5,1 rnrnole)» Depois, arrefece-se a solução resultante até uma temperatura de -2°C e adiciona-se então diciclo-hexilcarbodiimida (3,4 rnrnole) na forma de uma solução em diclorometano (3,5 ml)» Agita-se a mistura reaccional resultante, a uma temperatura de -2°C, durante um período de três dias» Usa-se a análise por HPLC para determinar se a reacção está essencialmente completa- Após este período de tempo, se a *-ts» 72 949 39540/39736

36 reacção náo estiver completa, pode-se depois adicionar mais dici-clo-hexilcarbodiimida e agita-se a mistura reaccíorial resultante durante mais um dia a -2^0. Se no dia seguinte (durante um total de quatro dias) a análise por HPLC indicar de novo que a reacção está. incompleta, dever-se-ã terminar o arrefecimento da mistura reaccional. Pode-se deixar a temperatura da solução subir lentamente até à temperatura ambiente (25°C) durante um período de horas (ca- 8)- Agita-se a mistura reaccional resultante de um dia para o outro à temperatura ambiente- Repete-se o procedimento até a reacção estar completa- Depois, adiciona-se água (50 ml) e agita-se a mistura resultante durante mais um dia- Filtra--se depois a mistura reaccional para remover a diciclo-hexilureia e concentra-se o filtrado resultante, In. vácuo- até se obter urn óleo viscoso. Ao resíduo resultante, adicionam-se acetato de etilo e solução aquosa semi-saturada de carbonato de sódio (200 ml)- Agita-se vigorosamente a mistura de duas fases num evapora-dor rotativo durante aproxímadamente uma hora- Recolhem-se quaisquer sólidos formados obtendo-se o produto, por filtração num funil de vidro sinterizado. Lava-se a fase orgânica com água e„ depois, seca-se íri vácuo, até peso constante obtendo-se o produto- ^la-HiS-D^Nal-Ala-Trp-D-Phe-Lvs-NHo.......35

Adiciona-se o heptapéptido Eioc-Ala-His-D^Nal-Ala-Trp-D-Phe--Lys(Boc)-NH2·- (3.4* 1*02 rnmole) a uma solução, à temperatura ambiente, de ácido trífluoroacétíco (30 ml), sulfureto de dimetílo (14 ml), 1,2-etanoditíol (7 ml) e anisole (2,2 ml) em diclorome-fcano (15 ml). Agita-se a mistura reaccional homogénea durante 15 minutos. Após este periodo de tempo, adíciona-se éter anidro (450 ml) para provocar a precipitação do produto de péptido, biologicamente activo, em bruto 35. Este produto é isolado, por filtração num funil de vidro sinterizado ou por decantação. Dissolve-se o produto resultante em água e liofiliza-se» 0 produto liofilizado pode ser purificado adicionalmente por cromatografía de média pressão riuma coluna de vidro de 26 x 460 mm contendo material de enchimento de coluna Lichroprep^M RP-18 (C-18, 25-40 nm, mesh irregular). Após injecçâo do péptido na forma de uma solução em água, a coluna é eluída com urn caudal de 9 ml por mi- 72 949 39540/39736

37 nuto com um gradiente de 0 a 25% de metanol durante 5-20 horas e» depois» com um gradiente de 25 a 55% de metanol durante ca. 48 horash Depois» aumenta-se a concentração de metanol no gradiente» com uma velocidade de 2% por hora» Durante a eluição, o restante da composição de solvente é constituído por água contendo 0»2% de ácido trifluoroacético» 0 produto (35) é identificado por HPLC e é isolado a partir dos volumes de eluição apropriados» 0 invento foi descrito em pormenor com referência particular às suas concretizações preferidas» Contudo» será de notar que os peritos na arte» tendo em conta a presente descrição» podem fazer variações e modificações dentro do espirito e âmbito do invento»

Claims (14)

1. 72 949 39540/39736 “38” R.....E.....I.....V.....I.....N.....D.....I.....C.....A.....ç.....Õ.....E.....3 1 - Processo de preparação de utn péptido de fórmula A1“A2”A3-Trp“A5“A6”Z na qual A^ é Mis, 3(NMe)His, His-Ala, Ala, tyr, A0“Hís ou A0" “3(NMe)His, em que Aq é qualquer L-aminoácido de ocorrência natural, Met(O), DOPA, Abu ou péptidos de fórmula L-A0, em que L é H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys, Tyr-DAla-Phe-Qly, Tyr-DAla-Gly” Phe, Tyr-Ala-Gily-Thr ou Tyr-DAla-Phe-Sar, A/> é 0®Nal ou DPhe, | A3 é Ala, Qly ou Ser, A5 é DPhe, D/Llâ(Me)Phe ou (NMe)DPhe, A^ é 8-Q ou fâ, onde 8 é qualquer L-aminoácído de ocorrência natural, dipéptidos de quaisquer aminoácidos de ocorrência natural ou M2N(CH2)nC02H em que n~2-12 e Q é Arg, iLys, Lys ou Orn, Zé o grupo de extremidade do terminal C do polipéptido ou o grupo de extremidade mais o(s) aminoácido(s) do terminal C, e 1 é “C0NR1R2, -C00R1 ou -CI-^OR1, -fâly-r, -Met-Z', -Lys-Z*, -Cys-Z’, “•(aly-Tyr-Z*, ou ""Ala-Tyr-Z*, em que lv é -GGNR^R2, -CQOR1 ou “CH^OR1 , em que RI é H, um grupo alquilo tendo de 1 a cerca de 6 átomos de carbono, um grupo cicloalquilo tendo de 3 a cerca de 8 átomos de carbono, um grupo alcenilo tendo 2 a cerca de 8 átomos ) de carbono ou um grupo arilo tendo de 6 a cerca de 12 átomos de carbono, R2 é definido como R2 e podem ser iguais ou diferentes, e dos seus sais orgânicos ou inorgânicos farmaceuticamente aceitáveis, caracterizado por compreender uma reacção de condensação de fragmentos peptídícos, de modo a formar o peptido» 2 ~ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A-l ser His, Ala, His-Ala ou A0-Hís_
2. 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A3 ser Ala» 4 ” Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado 39“ 72 949 39540/39736 por Aq ser Ala* Lys ou Qlu; Ag ser Ala; A6 ser Lys, iLys* Ala-“Lys,, Ala-Ala-Lys ou HgNCCf^f/CG-Lys, onde n’ é 4~8.
3. 5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterifado por A2 ser DBNal» 6 “ Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptído ter a fórmula His-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-A^-Z» 7 " Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A2 ser DPhe„
4. 8 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por o péptido ter a fórmula His-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH,^. 9 “ Processo de acordo com a reivindicação 1;, caracterizado por o péptido ter a fórmula AQ™Hís“DIâNal“Ala~Trp-DPhe-A^-Z ou A0“HiS“DPhe~Ala“Trp“DPhe“A6“Z-
5. 10 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por A0 ser Ala» 11 “ Processo de acordo com as reivindicações 6 e 9, carac-terizado por Z ser “C0NH2_ 12 “ Processo de acordo com a reivindicação 11„ caracterí-zado por o péptido ter a fórmula Ala-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH^* A1 a~H i s-D BNa1-A1 a~T r p-DP he-Lys-NHg * A1 a-H i S"D BNa 1 ~ A1 a-T rp-DPhe-A1 a~Ly s-NH2 * Ala“HíS“DfiNal~Ala“Trp“OPhe~Ala~Ala-'LyS“NHoH Lys“His“0BNal-Ala-Trp”0Phe-A6-HH2;, ou fâlU“His-DBNal“Ala-Trp-0Phe~A6“HH2-
6. 13 -Processo de acordo com as reivindicações 2, 6 ou 9* caracterizado por A6 ser a» -40- f 72 949 39540/39736
7. 14 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracteriza-do por o péptido ter a fórmula Ala-His-DPhe-Ala-T rp-DPhe-Ala-Lys-Nl·^ , Ala-His-DPhe-Ala-T rp“DPhe“Ala~Ala“Lys~NH2 , Lys-His-OPhe-Ala-Trp-DPhe-A^-NI^, ou fâlU“HiS“0Phe-Ala-Trp~DPhe“A6~NH2-
8. 15 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido ter a fórmula Η í s~Ala~D ^Na 1-A1a-T rp-DP he~A6~Z - 16 ~ Processo de acordo com a reivindicação .15, caracterizado por Z ser -C0NH2«
9. 17 - Processo de acordo com a reivindicação 16, caracterizado por o péptido ter a fórmula H í s-A1 a-D *^Na 1 - A 1 a-T rp-OP he~Ly3-ΝΗ2 -
10. 13 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido ter a fórmula H i s-DP he-A1a-T rp-DP he-A^-Z. 1/9 - Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o péptido ter a fórmula His~DPhe~AIa-Trp-DPhe-Lys-NH2-
11. 20 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o péptido ter a fórmula Ala-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-A^-2 ou Ala-DPhe-Ala-Trp-DPhe-A^-Z,
12. 21 - Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado por o péptido ter a fórmula Ala-D^Nal-Ala-Trp-DPhe~Lys~NH2 ou Ala-DPhe-Ala-T rp-DPhe-Lys-NH2«
13. 22 - Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por A0 ser qualquer aminoãcido de ocorrência natural„ 72 949 39540/39736

    41 23 ~ Processo de preparação de um péptido de fórmula A1-A2-A3~Trp-A5-~A6-Z na qual A-^ é His, 3(NMe)His, Mís-Ala, Ala, tyr, Aq~Hís ou A0~ w3(NMe)His, em que A0 é qualquer L-aminoácido de ocorrência natural, Met(0), DOPA, Abu ou péptidos de fórmula L-Aq, em que L é H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys, Tyr-DAla-Phe-Oly, Tyr-DAla-fâly-Phe, Tyi—Ala-Oly-Thr ou Tyi—DAla-Phe-Sar, A.7 é DeNal ou DPhe, ><<« · Ag é Ala, Gly ou Ser, A5 é DPhe, D/L&(He)Phe ou (NMe)DPhe, A6 é B-Q ou fâ, onde 8 é qualquer L-aminoãcido de ocorrência natural, dipéptidos de quaisquer aminoácidos de ocorrência natural ou H2N(CH2)nC02H ern que n~:2-12 e Q é Arg, iLys, Lys ou Orn, Z é o grupo de extremidade do terminal C do polipéptido ou o grupo de extremidade mais o(s) aminoácido(s) do terminal C, e Z é -OQNF^R2, -C00R1 ou -CHgQR1, -01y*“Z9, -Met“Z% -Lys-Z9, -Qly-Tyi—2% ou •••Ala-Tyi—Zs, ern que Z3 é -CQNR^R2, -COOR'1· ou ™CH20R:l , em que RI e H, um grupo alquilo tendo de l a cerca de 6 átomos de carbono, um grupo eicloalquilo tendo de 3 a cerca de 8 átomos de carbono, um grupo alcenilo tendo 2 a cerca de 8 átomos de carbono ou um grupo arilo tendo de 6 a cerca de 12 átomos de carbono, R2 é definido como R-*~ e podem ser iguais ou diferentes, e dos seus sais orgânicos ou inorgânicos farmaceutícamente aceitáveis, caracterizado por compreender o acoplamento de aminoácidos ou de derivados de aminoácidos, para formar o composto, 24 ~ Processo de preparação de uma composição farmacêutica para promover a libertação dos níveis de hormona de crescimento em animais, caracterizado por compreender a associação de pelo menos um dos péptidos das reivindicações 1, 4, 5, 7, 9, 12, 14 ou 15, com um veículo ou díluente farmaceutícamente aceitável,
14. 25 - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por compreender ainda um segundo composto que actua como ago~ -42- 72 949 39540/39736 nista do receptor da hormona de libertação da hormona de cresci mento ou que inibe o efeito da somatostatina. Lisboa, íA JUL 1991 Por POLYGEN HOLDING CORPORATION ~ 0 AGENTE OFICIAL -