PL167804B1 - Sposób wytwarzania nowych peptydów PL - Google Patents

Sposób wytwarzania nowych peptydów PL

Info

Publication number
PL167804B1
PL167804B1 PL91297850A PL29785091A PL167804B1 PL 167804 B1 PL167804 B1 PL 167804B1 PL 91297850 A PL91297850 A PL 91297850A PL 29785091 A PL29785091 A PL 29785091A PL 167804 B1 PL167804 B1 PL 167804B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
ala
dphe
lys
trp
amino acid
Prior art date
Application number
PL91297850A
Other languages
English (en)
Other versions
PL297850A1 (en
Inventor
Cyril Y Bowers
John C Hubbs
Charles H Foster
Wayne L Cody
Frank A Momany
Original Assignee
Polygen Holding Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Polygen Holding Corp filed Critical Polygen Holding Corp
Publication of PL297850A1 publication Critical patent/PL297850A1/xx
Publication of PL167804B1 publication Critical patent/PL167804B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/575—Hormones
    • C07K14/60—Growth hormone-releasing factor [GH-RF], i.e. somatoliberin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Slide Fasteners, Snap Fasteners, And Hook Fasteners (AREA)
  • Stringed Musical Instruments (AREA)
  • Sampling And Sample Adjustment (AREA)

Abstract

1 . Sposób wytwarzania nowych peptydów o ogólnym wzorze A 1-A 2-A3-T r P-A5-A6-Z, w którym A 1 oznacza His, 3(NMe)His, His-Ala, Ala, Tyr, Ao- His lub Ao-3 (NMe)His, gdzie Ao oznacza dowolny naturalny L-aminokwas, Met(O). DOPA, Abu lub peptydy o wzorze L-Ao, w którym L oznacza H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys, Tyr-DAla-Phe-Gly, Tyr-DAla-Gly-Phe, Tyr-Ala-Gly-Thr lub Tyr-DAla-Phe-Sar; A 2 oznacza Dß Nal-; A3 oznacza Ala, Gly lub Ser; A5 oznacza DPhe, D/ L ß (M)Phe lub (NMe)DPhe; A6 oznacza B-G lub G, gdzie B oznacza dowolny naturalny L-aminokwas, dwupeptydy dowolnych naturalnych aminokwasów lub H2N(CH2)nCO2 H, gdzie n = 2 -12, a G oznacza Arg, iLys, Lys lub Orn; przy czym w grupach A 1 do A6 His oznacza L-histydyne, 3(NMe)His oznacza 3-(N-metylo) histydyne, Ala oznacza L-alanine, Tyr oznacza L-treo­ nine, Met(O) oznacza sulfotlenek metioniny, DOPA oznacza 3,4-dwuhydroksyfenyloalanine, Abu oznacza kwas a-aminomaslowy, Lys oznacza L-lizyne, Phe oznacza L-fenyloalanine, Cys oznacza L-cysteine, DAla oznacza D-alanine, Gly oznacza glicyne, Thr oznacza L-treonine, Sar oznacza sarkozyne, Dß Nal-oznacza - ß n aftylo-D-alanine, Ser oznacza L-seryne, DPhe oznacza D-fenyloalanine, D/Lß/ (Me)Phe oznacza D/L ß-m ety- lofenyloalamne, (NMe)DPhe oznacza (N-metylo)-D-fenyloalanine, Arg oznacza L-arginine, iLys oznacza NE -izopropylo-L-lizyne, a Orn oznacza L-ornityne; Z oznacza C-koncowa grupe polipeptydu lub C-koncowy(-e) aminokwasy(-y) z grupe koncowa, i Z oznacza -CONR1R 2 , -COOR1 , -CH2OR , Gly-Z’. -Met-Z’, -Lys-Z’, -Cys-Z’, -Gly-Tyr-Z’ lub -Ala-Tyr-Z’, gdzie Z’ oznacza -CONR1 R2 , -COOR1 lub CH2OR1 , gdzie R 1 oznacza H, grupe alkilowa o 1 do okolo 6 atomach wegla, grupe cykloalkilowa o 3 do okolo 8 atomach wegla, grupe alkenylowa o 2 do okolo 8 atomach wegla lub grupe arylowa o 6 do okolo 12 atomach wegla, aR 2 ma takie znaczenie jak R i moze byc takie samo lub rózne; oraz ich organicznych i nieorganicznych farmaceutycznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, ze sprzega sie aminokwasy lub pochodne aminokwasów w kolejnos'ci wynikajacej z powyzszego wzoru albo poddaje sie reakcji kondensacji fragmenty peptydowe w kolejnosci wynikajacej z podanego wyzej wzoru. PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych peptydów pobudzających uwalnianie hormonu wzrostu po podaniu ich istotom żywym.
Zwiększenie poziomu hormonu wzrostu (GH) u ssaków przez podawanie uwalniających GH związków może prowadzić do podwyższonej wagi ciała i zwiększonej produkcji mleka, gdy poziom GH po podaniu będzie dostatecznie podwyższony. Ponadto wiadomo, że zwiększanie poziomu hormonu wzrostu u ssaków można wywołać podaniem znanych środków uwalniających hormon wzrostu, takich jak naturalne hormony uwalniające hormon wzrostu.
Zwiększanie poziomu hormonu wzrostu u ssO<ów można także wywołać podaniem peptydów uwalniających hormon wzrostu, przy czym niektóre z nich opisano w opisach patentowych Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4223019, 4223020, 4223021, 4224316, 4226857, 4228155, 4228156, 4228157, 4228158, 4410512, 4410513, 4411890 i 4839344.
W celu zwiększenia poziomu GH stosowano również przeciwciała przeciw endogennemu inhibitorowi uwalniania hormonu wzrostu, somatostatynie (SRIF). W tym ostatnim przypadku poziomu hormonu wzrostu zwiększa się przez usuwanie endogennego inhibitora uwalniania GH (SRIF) zanim dotrze on do przysadki mózgowej, gdzie inhibituje uwalnianie GH.
W każdej z tych metod pobudzania zwiększania poziomu hormonu wzrostu stosuje się substancje trudne do zsyntetyzowania i/lub wyodrębnienia z czystością wystarczającą na to, by można je było podać wybranej istocie żywej. Pożądane byłyby krótkołańcuchowe, stosunkowo proste polipeptydy o zdolności pobudzania uwalniania hormonu wzrostu, gdyż można by było łatwo i tanioje wytwarzać, łatwa byłaby ich modyfikacja chemiczna i/lub fizyczna, a także można by łatwo je oczyszczać i formułować i powinny mieć one doskonałą zdolność przenoszenia się.
Pożądane byłoby posiadanie krótkołańcuchowych polipeptydów pobudzających uwalnianie hormonu wzrostu i zwiększanie jego poziomu we krwi istot żywych. Użyteczna byłaby także możliwość zastosowania takich polipeptydów do pobudzania uwalniania hormonu wzrostu i zwiększanie jego poziomu krwi istot żywych.
Obecnie opracowano sposób wytwarzania nowych związków polipeptydowych, które nieoczekiwanie pobudzają uwalnianie hormonu wzrostu u istot żywych. Te polipeptydy mają wzór A1 -A2-A3-Trp-AvA6-Z, w którym A1 oznacza His, 3(NMe)His,Ao-IHis, Ao-3(NMe)His, Ala, Tyr, lub His-Ala, gdzie Ao oznacza dowolny naturalny L- aminokwas, Met(O), DOPA, Abu lub peptydy o wzorze L-Ao, w którym L oznacza H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys, Tyr-DAaa-PheGly, Tyr-DAla-Gly-Phe, Tyr-Ala-Gly-Thr lub Tyr-DAla-Phe-Sar, przy czym korzystnie Ao oznacza dowolny naturalny aminokwas, a jeszcze korzystniej Ao oznacza Ala, Lys lub Glu, A 2 oznacza D aNal, A3 oznacza Ala, Gly lub Ser, A5 oznacza DPhe, D/La(Me)Phe lub (NMe)DPhe,
167 804
Ać oznacza B-G lub G, gdzie B oznacza dowolny naturalny aminokwas, dwupeptydy dowolnych naturalnych aminokwasów lub H2N-(CH2)n-CO2H (gdzie n = 2 - 12), a G oznacza Arg, iLys, Lys lub Orn, Z oznacza C-końcową grupę -CONRiR, -COORi lub -CH2OR1 (gdzie Ri oznacza H, grupę alkilową o 1 do około 6 atomach węgla, grupę cykloalkilową o 3 do około 8 atomach węgla, grupę alkenylową o 2 do około 8 atomach węgla lub grupę arylową o 6 do około 12 atomach węgla, a R2 ma takie znaczenie jak Ri i może być takie samo lub różne), -Gly-Z’, Met-Z’, -Lys-Z’, Cys-Z’, -Gly-Tyr-Z’, lub -Ala-Tyr-Z’, gdzie Z’ oznacza -CONR’r2, -COORi lub -CH2OR1 (gdzie Ri ma wyżej podane znaczenie), oraz ich organiczne i nieorganiczne farmaceutycznie dopuszczalnych soli polegający na tym, że sprzęga się aminokwasy lub pochodne aminokwasów w kolejności wynikającej z powyższego wzoru albo poddaje się reakcji kondensacji fragmenty peptydowe w kolejności wynikającej z podanego wzoru. Korzystnie, wytwarzany peptyd ma wzór His-A2-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, Ao-His-A2-Ala-Trp-DPhe-LysNH2 (np. Ala-His-A2-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2) lub Ala-A2-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2. Jeszcze korzystniej A 2 oznacza D ^Nal. Takie peptydy można stosować w celu pobudzania uwalniania hormonu wzrostu i zwiększania jego poziomu we krwi istot żywych, korzystnie ludzi, przez podawanie skutecznej ilości peptydu.
Niniejszy wynalazek opiera się na odkryciu sposobu wytwarzania kilku nowych krótkołańcuchowych polipeptydów, które pobudzają uwalnianie hormonu wzrostu i zwiększają jego poziom we krwi istot żywych. Polipeptydy wytwarzane sposobem według wynalazku są zdefiniowane następującym wzorem ogólnym.
Ai-A2-A3-Trp-A5-A6-Z, w którym Ai, A2, A3, A5, Ać, i Z mają niżej podane znaczenie. Ai oznacza His, 3(NMe)His (to znaczy pierścień imidazolowy jest zmetylowany w pozycji 3), His-Ala, Ao-His, Ala, Tyr lub Ao-3(NMe)His, gdzie Ao oznacza dowolny naturalny L-aminokwas, Met(O), DOPA, Abu lub peptydy o wzorze L-Ao, w którym L oznacza H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys, Tyr-DAla-Phe-Gly, Tyr-DAla-Gly-Phe, Tyr-Ala-Gly-Thr lub Tyr-DAla-Phe-Sar. Korzystnie Ai oznacza His, Ala, His-Ala, Ao-His lub Ala. Korzystniej A| oznacza His lub Ao-His. Ao korzystnie oznacza dowolny naturalny L-aminokwas, a jeszcze korzystniej Ao oznacza Ala, Lys lub Glu. Jeszcze korzystniej Ao oznacza Ala.
A2 oznacza D ^Nal.
A 3 oznacza Ala, Gly lub Ser. Korzystnie A3 oznacza Ala.
A5 oznacza DPhe, D/^^(Me)Phe lub (NMe)DPhe. Korzystnie A5 oznacza DPhe.
Ać oznacza B-G lub G, gdzie B oznacza dowolny naturalny L-aminokwas, dwupeptydy dowolnych naturalnych L-aminokwasów (takiejak Ala-Lys, Ala-Ala, Ala-Leu) lub H 2N-(CH2)nCO2H, gdzie n = 2 - 12, a G oznacza Arg, iLys, Lys lub Om. Korzystniej B oznacza dowolny naturalny L-aminokwas lub H2N-(CH2)n-CC>2H, gdzie n = 4 - 8. Jeszcze korzystniej Ać oznacza G, Ala-Lys lub Ala-Ala-Lys. Jeszcze korzystniej Ać oznacza G. Najkorzystniej Ać oznacza Lys.
Z oznacza C-końcową grupę polipeptydu lub C-końcowy (-e) aminokwas(y) z grupą końcową, gdzie Z oznacza -CONR fR2, -COORi lub -CH2OR1, gdzie R1 oznacza H, grupę alkilową o i do około 6 atomach węgla, grupę cykloalkilową o 3 do około 8 atomach węgla, grupę alkenylową o 2 do około 8 atomach węgla lub grupę arylową o 6 do około 12 atomach węgla. R2 ma takie znaczenie jak R1 i może być takie samo lub różne. Korzystnie R1 oznacza H, grupę alkilową o i do około 6 atomach węgla. Z może także oznaczać -Gly-Z’, -Met-Z’, ;Lys-Z’, -Cys-Z’, -Gly-Tyr-Z’, lub -Ala-Tyr-Z’, gdzie Z’ oznacza -CONR'r2, -COOR1 lub -CH2ORI gdzie R1 i R2 mają wyżej podane znaczenie. Korzystnie Z oznacza -CONR'r2, -COOR1 lub -CH2ORI
Sposobem według wynalazku wytwarza się także farmaceutycznie dopuszczalne organiczne i nieorganiczne sole addycyjne dowolnego z tych polipeptydów.
Stosowane skróty reszt aminokwasowych są zgodne z normą nomenklatury peptydów:
Gly = glicyna
Tyr = L-tyrozyna
Ile = L-izoleucyna
Glu = kwas L-gluuaminowy
The = L-treonina
Phe = L-fenanoalanina
167 804
Ala = L-alanina
Lys = L-lizyna
Asp = kwas L-asparaginowy
Cys = L-cysteina
Arg = L-arginina
Gin = L-glutamina
Prp = L-prolina
Leu = L-leucyna
Met = L-metionina
Ser = L-seryna
Asn = L-asparagina
His = L-histydyna
Trp = L-tryptofan
Val = L-walina
DOPA = 3,4-dwuhydroksyfenyloalanina
Met(O) = sulfotlenek metioniny
Abu = kwas a-aminomaslowy iLys = Ne-izopropylo-L-lizyna 4-Abu = kwas 4-aminomaslowy Om = L-ornityna
D“Nal = x-naftyio-D-alamna
D ^Nal = x-naftylo-D-alanina
Sar = sarkozyna
Wszystkie trzyliterowe skróty aminokwasów poprzedzone D wskazują na konfigurację D reszty aminokwasowej, a skróty poprzedzone D/L wskazują na mieszaninę postaci o konfiguracji D i L danego aminokwasu. Dla potrzeb niniejszego ujawnienia glicyna jest objęta określeniem naturalny L-aminokwas.
Zasadowe, objęte i kwasowe reszty aminokwasów, które można stosować do aminokwasów Ai, A 3, A5 i Aó, umożliwiają szeroką kontrolę fizykochemicznych właściwości pożądanego peptydu. Taka elastyczność to ważna zaleta w przypadku formułowania i podawania pożądanego peptydu wybranemu gatunkowi. Dodatkową elastyczność nadaje także wybór niżej określonych reszt R i Z, co umożliwia dodatkową kontrolę fizykochemicznych właściwości pożądanego związku.
Korzystnymi związkami uwalniającymi hormon wzrostu wytwarzanymi sposobem według wynalazku są:
Ai-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z, takie jak
Ao-His-A2-iAla-Tr)-IDPhe-A6-Z,
His-Ala-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z,
Ala-A2-Ala-Trp-DPhe-A6-Z i
His-A2-Trp-DOhe-A6-Z oraz ich organiczne i nieorganiczne sole addycyjne. Jeszcze korzystniejszą są peptydy o wzorze
An-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-Lws-NH2 (zwłaszcza Ala-His-DβNal-Ala-Trp-DPhe-LysNH2) i His-DeNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 oraz organiczne i nieorganiczne sole dowolnego z tych polipeptydów.
Te związki łatwo jest zazwyczaj zsyntetyzować, są one skuteczne jako środki zwiększające poziom hormonu wzrostu w surowicy krwi i korzystne z punktu widzenia produkcji i wykorzystania na skalę przemysłową. Ponadto te związki mogą być korzystne jako wykazujące właściwości fizykochemiczne pożądane dla skutecznego podawania takich związków pnlipeptwdnwwch różnym gatunkom istot żywych, a to dzięki elastyczności osiągalnej poprzez różne podstawniki w licznych pozycjach związków polipeptwdnwwch i dobór polarnych, obojętnych lub niepolarnych N-końcowych, C-końcowych i środkowych części tych związków pnlipeptwdowwch, w wyniku której nadają się do podawania wybraną metodą.
167 804
Polipeptydy wytworzone sposobem według wynalazku wykazują zazwyczaj wyższą aktywność pobudzającą wzrost poziomu hormonu wzrostu w surowicy niż większość równoważnych peptydów z inną resztą aminokwasową w pozycji A2. Na ogół najkorzystniejsze są peptydy D DNal ze względu na znaczną siłę ich działania.
Peptydy His-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHk i Ao-His-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 (takie jak Ala-His-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2) oraz ich organiczne i nieorganiczne sole addycyjne są obecnie najkorzystniejsze.
Te związki wykazały dużą siłę działania pobudzającego wzrost poziomu hormonu wzrostu w surowicy.
Związki wytwarzane sposobem według wynalazku można st<^^ować w celu zwiększenia poziomu GH we krwi istot żywych, zwiększania produkcji mleka przez krowy, zwiększania rozrostu ciała u takich istot żywych jak ssaki (np. ludzie, owce, bydło i świnie), a także ryby, drób, inne kręgowce i skorupiaki, a także produkcji wełny i/lub sierści u ssaków. Stopień rozrostu ciała zależy od płci i wieku gatunku istoty żywej, danego podawanego związku uwalniającego hormon wzrostu i jego ilości, drogi podawania, itp.
Nowe związki polipleptydowe wytwarzane sposobem według wynalazku można syntetyzować metodami znanymi w chemii peptydów w roztworze lub w fazie stałej, względnie klasycznymi znanymi sposobami. Synteza w fazie stałej rozpoczyna się od C-końca peptydu. Odpowiedni materiał wyjściowy można wytworzyć np. dołączywszy żądany zabezpieczony α-aminokwas do żywicy chlorometylowanej, żywicy hydroksymetylowanej, żywicy benzhydryloaminowej (BHA) lub żywicy p-inetylobenzhydryloaminowej (p-Me-BHA). Jedna z takich żywic chlorometylowych jest sprzedawana pod nazwą handlową BIOBEADS SX-1 przez Bio Rad Laboratories, Richmond, Kalifornia. Wytwarzanie żywicy hydroksymetylowej opisali Bodansky i in. w Chem. INd. (Londyn) 38, 1597 (1966). Żywicę bHa opisali Pietta i Marshall, Chem. Comm., 650 (1970), a jest ona dostępna w handlu jako produkt Peninsula Laboratories, Inc., Belmont, Kalifornia.
Po wstępnym przyłączeniu grupę zabezpieczającą grupę a-aminową można usunąć przy użyciu różnych reagentów kwasowych, w tym roztworów kwasu trójfluorooctowego (TFA) lub kwasu solnego (HCl) w rozpuszczalnikach organicznych w temperaturze pokojowej. Po usunięciu grupy zabezpieczającej grupę α-aminową pozostałe zabezpieczone aminokwasy można sprzęgać stopniowo w żądanej kolejności. Każdy zabezpieczony aminokwas można ogólnie poddawać reakcji w około trzykrotnym nadmiarze, z użyciem odpowiedniego aktywatora grupy karboksylowej, takiegojak dwucykloheksylodwuimid (DCC) lub dwuizopropylokarbodwuimid (DIC) w dwumetyloformamidzie (DMF) i jego mieszaninach.
Po zakończeniu żądanej sekwencji aminokwasów żądany peptyd można odszczepić z nośnika żywicznego działaniem takiego reagentajak fluorowodór (HF), który nie tylko odszczepia peptyd od żywicy, ale także odszczepia peptyd od żywicy, ale także odszczepia większość powszechnie stosowanych grup zabezpieczających łańcuchy boczne. Gdy stosuje się żywice chlorometylową lub hydroksymetyłową, to w wyniku działania HF otrzymuje się peptyd w postaci wolnego kwasu. Gdy stosuje się żywicę bHa lub p-Me-BHA, to w wyniku działania HF otrzymuje się bezpośrednio wolne peptydy amidowe.
Opisany wyżej sposób syntezy w fazie stałej jest dobrze znany i został opisany przez Stewarda i Younga w Solid Phase Peptide Synthesis: Second Edn. (Pierce Chemical Co., Rockford, II, 1098).
Niektóre metody syntezy w roztworze, które można stosować do syntezy ugrupowań peptydowych sposobem według wynalazku przedstawiono w publikacji Bodansky i in., Peptide Syntheis, 2nd Edition, John Wiley & Sons, Nowy Jork, NJ. 1976.
Uważa się, że korzystniejsza jest synteza peptydów w fazie roztworu, obejmująca reakcję kondensacji co najmniej dwóch fragmentów peptydowych.
Sposób ten polega na kondensacji fragmentu peptydowego Χ-Α1-Υ z fragmentem peptydowym U-V-W, gdzie wszystkie aminokwasy z wyjątkiem A| są obojętne lub zabezpieczone, a X oznacza Prot lub Prot-Ao, gdzie Prot oznacza grupę zabezpieczającą N-koniec, Y oznacza A2-Q, Ala-A2-Q, A2-A.3-Q, Ala-A2-A.3-Q, A2-A3-A4-Q, Ala-A2-A3-At-Q, Ala-Q lub -Q, przy czym gdy Y oznacza Q, to wówczas U oznacza J-A2-A3-A4- lub J-Ala-A2-A.3-A4-. Gdy Y oznacza
167 804
Ala-Q, to wówczas U oznacza J-A2-A3-A4. Gdy Y oznacza A2-Q lub Ala-A2-Q, to wówczas U oznacza J-A3-A4 Gdy Y oznacza A 2-33Q lub Ala-A2-A2-A3-Q, to wówczas U oznacza J-A4. Gdy
Y oznacza A 2-A3-A4--5 lub Ala-A2-A3-A4-Q, to wówczas U oznacza J. V oznacza A5 lub Z. Gdy
Y oznacza A5, to wówczas W oznacza Ać-Z lub Z. Gdy V oznacza Z, to wówczas nie ma W. Ai, A 5, Ać i Z mają zdefiniowane tu znaczenie. W niniejszej sytuacji A2 oznacza D^Nal, a A4 oznacza Trp.
Qjest końcem karboksylowym fragmentu peptydu i oznacza -OR' lub -IM, gdzie M oznacza resztę zdolną do ulegania podstawieniu przez zawierający azot nukleofil, a R3 oznacza H, grupę alkilową o 1 około 10 atomach węgla, grupę arylową o 6 do około 12 atomach węgla lub grupę aralkilową o 7 do około 12 atomach węgla. J oznacza koniec aminowy wskazanego fragmentu i oznacza H lub grupę zabezpieczającą, która nie przeszkadza w reakcji sprzęgania, np. benzyl.
Następnie usuwa się grupę zabezpieczającą. Alternatywnie można zastosować tak wytworzony zabezpieczony peptyd w dalszych kondensacjach, w celu wytworzenia większego peptydu.
Tę korzystną metodę opisano bardziej szczegółowo w zgłoszeniu patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki złożonym 24 lipca 1990 r. przez Johna C. Hubbsa i S. W. Parkera, zatytułowanym Proces for Synthesizing Peptides, przytoczonym tu jako pozycja literaturowa.
Związki wytwarzane sposobem według wynalazku pobudzają uwalnianie hormonu wzrostu i/lub zwiększają jego poziom we krwi istot żywych. Stosuje się je, podając istocie żywej skuteczną dawkę co najmniej jednego z wyżej opisanych polipeptydów.
Związki wytwarzane sposobem według wynalazku można podawać doustnie, pozajelitowo (drogą iniekcji domięśniowej (i.m.), dootrzewnowej (i.p.), dożylnej (i.v.) lub podskórnej (s.c.), donosowo, dopochwowo, doodbytniczo lub podjęzykowo i można im nadawać formę postaci dawkowanych odpowiednich dla danej drogi podawania. Korzystne jest podawanie pozajelitowe.
Do stałych postaci dawkowanych do podawania doustnego należą kapsułki, tabletki, pigułki, proszki i granulaty. W takiej stałej postaci dawkowanej związek aktywny jest zmieszany z co najmniej jednym obojętnym nośnikiem, takim jak sacharoza, laktoza lub skrobia. Takie postacie dawkowane mogą także zawierać, co jest powszechną praktyką, dodatkowe substancje inne niż obojętne rozcieńczalniki, np. środki poślizgowe, takie jak sterynian magnezu. W przypadku kapsułek, tabletek lub pigułek postacie dawkowane mogą także zawierać bufory. Tabletki i pigułki mogą dodatkowe mieć powłoczki jelitowe.
Ciekłe postacie dawkowane do podawania doustnego obejmują emulsje, roztwory, zawiesiny, syropy i eliksiry, zawierające powszechnie stosowane obojętne rozcieńczalniki, takie jak woda. Poza takimi obojętnymi rozcieńczalnikami kompozycje mogą zawierać także substancje pomocnicze, takie jak zwilżacze, emulgatory i środki suspendujące, a także środki słodzące, smakowe i zapachowe.
Do preparatów do podawania pozajelitowego należą jałowe wodne lub niewodne roztwory, zawiesiny lub emulsje. Przykładami niewodnych rozpuszczalników lub nośników są glikol propylenowy, poliglikol etylenowy, oleje roślinne, takie jak oliwa z oliwek i olej kukurydziany, żelatyna i estry organiczne do iniekcji, takie jak oleinian etylu. Takie postacie dawkowane mogą także zawierać substancje pomocnicze, takie jak konserwanty, zwilżacze, emulgatory i dyspergatory. Można je wyjaławiać, np. drogą filtracji przez filtr zatrzymujący bakterie, przez wprowadzanie środków wyjaławiających do kompozycji, przez naświetlanie kompozycji lub przez ogrzewanie kompozycji. Można je także wytwarzać w środowisku jałowej wody lub innym jałowym środowisku do iniekcji bezpośrednio przed użyciem.
Nowe związki wytwarzane sposobem według wynalazku są także użyteczne gdy podaje się je w połączeniu z hormonem uwalniającym hormon wzrostu (to jest naturalnym hormonem uwalniającym hormon wzrostu, jego analogami lub funkcyjnymi odpowiednikami), a także w połączeniu z innymi środkami pobudzającymi uwalnianie hormonu wzrostu, np. peptydami uwalniającymi hormon wzrostu (patrz opis patentowy Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4880778 przytoczony tu jako pozycja literaturowa). Takie połączenia są szczególnie korzystnymi środkami do podawania uwalniających hormon wzrostu peptydów, wytwarzanych sposobem według wynalazku, gdyż połączenie sprzyja uwalnianiu znacznie
167 804 większej ilości hormonu wzrostu niż można by to było przedstawić sumując poszczególne reakcje na poszczególne składniki połączenia, to znaczy połączenie wywołuje reakcję synergiczną w stosunku do indywidualnego składnika. Dalsze szczegóły dotyczące podawania połączeń uwalniających hormon wzrostu peptydów opisano w wyżej przytoczonym opisie patentowym. Takie związki synergiczne są korzystnie związkami działającymi jako agoniści receptorów hormonu wzrostu uwalniającego hormon wzrostu lub inhibitującymi działanie somatostatyny. Synergizm może być dwoisty, to znaczy występować w przypadku związku wytwarzanego sposobem według wynalazku i jednego ze związków synergicznych, względnie występować w przypadku większej liczby związków synergicznych.
Ilość podawanego polipeptydu lub kombinacji polipeptydów wytwarzanych sposobem według wynalazku będzie się zmieniać w zależności od licznych czynników, np. danej leczonej istoty żywej, jej wieku i płci, żądanego efektu terapeutycznego, drogi podawania i tego jaki polipeptyd lub jaką kombinację polipeptydów zastosowano. We wszystkich jednak przypadkach stosuje się dawkę skutecznie pobudzającą uwalnianie i zwiększającą poziom hormonu we krwi przyjmującej istoty żywej. Na ogół ta dawka wynosi od około 0,i μg do 10 mg polipeptydu ogółem na 1 kg wagi ciała. Korzystną ilość fachowiec łatwo określi empirycznie w oparciu o niniejsze ujawnienie.
Przykładowo, w przypadku podawania i.v. ludziom, korzystna dawka wynosi od około 0,i pg do 10 pg polipeptydu ogółem na 1 kg wagi ciała, korzystniej od około 0,5 (tg do 5 (Lg popipeptydu ogółem na 1 kg wagi ciała, a jeszcze korzystniej od około 0,7 pg do 3,0 (tg polipeptydu ogółem na 1 kg wagi ciała. Gdy stosuje się kombinację peptydów uwalniających hormon wzrostu, można użyć mniejszej ilości opisywanego tu peptydu. Przykładowo przy połączeniu opisywanego tu peptydu z np. synergicznym związkiem z Grupy 1 i z opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4880778, takim jak GHRH, korzystny zakres wynosi od około 0,1 pg do około 5 pg opisywanego tu związku (np. Ala-His-DnNal-A!a-TrpDPhe-Ać-Z lub His-DnNal-Ala-Trp-DPhe-A<5-Z) na 1 kg wagi ciała i od około 0,5 pg do około 15,0g związku synergicznego (np. GHRH), a korzystniej od około 0,1 gdg do oko ło 3 pg nowe go związku i od około 1,0 pg do około 3,0 pg związku synergicznego na 1 kg wagi ciała.
W przypadku podawania doustnego trzeba na ogół stosować większe ilości. Przykładowo przy doustnym podawaniu ludziom dawka wynosi zwykle od około 30 pg do około 600 pg polipeptydu na 1 kg wagi ciała, korzystniej od około 70 pg do około 500 pg polipeptydu na 1 kg wagi ciała, ajeszcze korzystniej od około 200 pg do około 300 pg na 1 kg wagi ciała. Krowom trzeba podawać w przybliżeniu takie same dawki jak ludziom, natomiast szczury wymagają zazwyczaj dawek większych. Konkretną dawkę łatwo jest ustalić empirycznie na podstawie niniejszego ujawnienia.
Jak wspomniano poprzednio, na ogół podawanie połączenia peptydów uwalniających hormon wzrostu pozwala na obniżenie dawki w stosunku do dawki potrzebnej dla uzyskania podobnej reakcji w przypadku oddzielnego podawania poszczególnych związków uwalniających hormon wzrostu, a to ze względu na synergiczne działanie połączenia.
Związki, wytworzone sposobem według wynalazku wchodzą w skład kompozycji zawierających jako substancję czynną organiczną lub nieorganiczną addycyjną sól wyżej opisanych polipeptydów i ich połączeń, ewentualnie wraz z nośnikiem, rozcieńczalnikiem, matrycą zapewniającą powolne uwalnianie lub powłoką.
Do odpowiednich organicznych i nieorganicznych soli addycyjnych związków wytwarzanych sposobem według wynalazku uwalniających hormon wzrostu, i ich połączeń należą sole z takimi ugrupowaniami organicznymi jak ugrupowania octanu, trójfluereectanu, szczawianu, walerianianu, oleinianu, laurynianu, benzoesanu, mleczanu, tosylanu, cytrynianu, maleinianu, fumaranu, bursztynianu, winianu, naftalanu, itp., oraz takimi ugrupowaniami nieorganicznymi jak ugrupowania soli metali z grupy I (to jest soli metali alkalicznych), z grupy II (to jest soli metali ziem alkalicznych), soli amonowych i soli protaminy, cynku, żelaza, itp., z takimi przeciwjonami jak chlorek, bromek, siarczan, fosforan, itp., a także ugrupowania organiczne podane powyżej.
W przypadku podawania pacjentom - ludziom korzystne są sole farmaceutycznie dopuszczalne. Do takich soli należą nietoksyczne sole metali alkalicznych, metali ziem alkalicznych i
167 804 amonowe powszechnie stosowane w przemyśle farmaceutycznym, takie jak sole sodowe, potasowe, litowe, wapniowe, magnezowe, barowe, amonowe i protaminy, które wytwarza się dobrze znanymi metodami. To określenie obejmuje także nietoksyczne addycyjne sole z kwasami, które na ogół wytwarza się drogą reakcji związków według wynalazku z odpowiednim kwasem organicznym lub nieorganicznym. Do reprezentatywnych soli należą chlorowodorek, bromowodorek, siarczan, wodorosiarcza, octan, szczawian, walerianian, oleinian, laurynian, boran, benzoesan, mleczan, fosforan, tosylan, cytrynian, maleinian, furman, bursztynian, winian, naftylan, itp.
Działanie biologiczne związków, wytwarzanych sposobem według wynalazku, udokumentowano w poniższych próbach porównawczych.
Uwalnianie GH in vivo u szczurów
Niedojrzałe samice szczurów Spraque-Dawley otrzymano z Charles rivers Laboratories (Wilmington, MA). Po przybyciu umieszczono je w pomieszczeniu o temperaturze 25°C i cyklu światło : mrok 14 : 10 godzin. Woda i pokarm dla szczurów Purina były dostępne do woli. Małe szczury trzymano z matkami do wieku 21 dni.
Dwadzieścia sześć dorosłych szczurów, po 6 szczurów w grupie zabiegowej, uśpiono przez dootrzewnowe podanie 50 mg/kg pentobarbitalu na 20 minut przed dożylnym podaniem peptydu. Nośnikiem preparatu peptydu do iniekcji dożylnej (i.v.) był normalny roztwór solanki zawierający 0,1% żelatyny. Uśpionym ^zczunora o wadze 55 - 65g wstrzyknięto i.v. związki uwalniające hormon wzrostu w ilościach podanych w Tabelach 1, 2 i 3. Wsztrzykiwano 0,2 roztworu w żyłę szyjną.
Wszystkie zwierzęta uśmiercono przez zgilotynowanie w 10 minut po ostatniej iniekcji badanego związku (patrz Tabele 1 i 2). Po dekapitacji zebrano krew z tułowia dla oznaczenia poziomu GH we krwi. Pozwolono, by krew skrzepła, po czym odwirowano ją i surowicę oddzielono od skrzepu. Surowicę przechowywano w stanie zamrożonym aż do dnia przeprowadzenia analizy radioimmunologicznej (RIA) dla określenia poziomu hormonu wzrostu według następującej procedury opracowanej w National Institute of Arthritis, Diabetes and digestive and kidney Diseases (NIaDDk).
Reagenty dodawano zwykle do probówek do RIA w pojedynczym uchwycie w temperaturze lodówki (około 4°C) w następującej kolejności.
(a) bufor (b) zimny (to jest nieradioaktywny) wzorzec lub próbka nieznanej surowicy przeznaczonej do analizy, (c) znaczony jodem radioaktywnym antygen hormonu wzrostu i (d) surowica przeciw hormonowi wzrostu.
Dodawanie reagentów prowadzono zazwyczaj tak, by uzyskać końcowe rozcieńczenie w probówce do RIA około 1 : 30000 (stosunek objętości surowicy anty do całkowitej objętości cieczy).
Zmieszane reagenty na ogół inkubowano następnie w temperaturze pokojowej (około 25°C) przez około 24 godziny przed dodaniem drugiego przeciwciała (np. surowica kozy lub królika wiążąca gamma-globuliny małpy), które wiąże się z surowicą przeciw hormonowi wzrostu i powoduje percypitację jego kompleksu. Zawartość próbek do RIA z osadem analizowano następnie pod kątem liczby impulsów zliczonych w określonym okresie czasu w liczniku scyntylacyjnym gamma. Krzywą wzorcową otrzymano, sporządziwszy wykres liczby impulsów w funkcji poziomu hormonu wzrostu (GH). Następnie poziom GH w badanych próbkach określano przez porównanie z krzywą wzorcową.
Pomiar dla surowicy GH metodą RIA prowadzono z użyciem reagentów dostarczonych przez the National Hormone and Pituitary Program.
Poziom w surowicy z Tabel 1, 2, 3 i 4 rejestrowano w ng/ml w odniesieniu do normy szczurzej wynoszącej 0,61 jednostki międzynarodowej (IU/mg). Wyniki zarejestrowano jako średnią +/- błąd standardowy średniej (SEM). Analizę statystyczną przeprowadzono przy użyciu testu t-Studenta. W tabelach 1, 2, 3 i 4 podane wyniki to wartości średnie z badań dla 6 szczurów.
167 804
Uwalnianie GH in vivo (ng/ml) pobudzane przez związki uwalniające hormon wzrostu u szczura znieczulonego pentobarbitalem (Zwierzęta uśmiercono w 10 minut po ostatniej iniekcji)
Kolumna A. Związki uwalniające hormon wzrostu Całkowita dawka (μ-g) GH w próbie kontrolnej ng/ml GH uwolniony przez związek z Kolumny A ng/ml+SEM Wartość p
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 151 ± 16 246 ± 39 -
0,3 151 ± 16 151 ± 16 -
1,0 151 ± 16 1000 ± 276 -
3,0 151 ± 16 2106 ± 216 -
His-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 151 ± 16 938 ± 255 <0.02
0,3 151 ± 16 1716 ± 258 <0,02
1,0 151 ± 16 3728 ± 691 <0,01
3,0 151 ± 16 3238 ± 273 <0,01
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 138 ± 12 226 ± 31
0,3 138 ± 12 613 ± 73 -
1,0 138 ± 12 1581 ± 228 -
3,0 138 ± 12 2875 ± 393 -
Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 138 ± 12 254 ± 78 NS-
0,3 138 ± 12 809 ± 59 NS-
1,0 138 ± 12 1516 ± 215 NS-
3,0 138 ± 12 3095 ± 473 NS-
Ala-His-DeNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 138 ± 12 1128 ± 309 <0,02 <0,02
0,3 138 ± 12 2479 ± 389 <0,01 0,01
1,0 138 ± 12 3899 ± 514 0,01 0,01
3,0 138 ± 12 4202 ± 369 <0,05 NS
Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lws-NH2 0,1 111 ± 25 360 ± 35
0,3 111 ± 25 903 ± 217 -
1,0 111 ± 25 2957 ± 217 -
3,0 111 ± 25 3956 ± 485 -
Ala-His-DeNal-Ala-TRp-DPhe-Lys-NH2 0,1 111 ± 25 970 ± 169 <0,01
0,3 111 ± 25 2898 ± 247 <0,001
1,0 111 ± 25 3908 ± 327 NS
Uwalnianie GH in vivo (ng/ml) pobudzane przez związki uwalniające hormon wzrostu u szczura znieczulonego pentobarbitalem (zwierzęta uśmiercono w 10 minut po ostatniej iniekcji)
Kolumna A. Związki uwalniające hormon wzrostu GH w próbie kontrolnej ng/ml Całkowita dawka (W) GH uwolniony przez związek z Kolumny A ng/ml
AlaHi sDT rp AlaT rpDPheLysNH 111 ± 25 0,3 901 ±21
AlaHisDHj£AlaTrpDPheL>'sNH2 117 ± 19 0,3 268 ±54
AlaHisDProAlaTrpDPheLwsNH2 117+19 0,3 262 ±51
167 804
T a b e l a 3
Peptyd Całkowita dawka (Fg) GH w próbie kontrolnej ng/ml Uwolnion ng/m y GH l
His-DAsp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 1,0 150 ± 20 154 ± 63
3,0 150 ± 20 155 ± 34
10,0 150 ± 20 163 ± 44
30,0 150 ± 20 224 ± 62
100,0 150 ± 20 178 ± 83
His-DCys-(SMe)-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 181 ± 69 178 ± 28
1,0 181 ± 69 193 ± 28
3,0 181 ± 69 180 ± 34
His-DaNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 151 ± 16 280 ± 70
0,3 151 ± 16 439 ± 122
1,0 151 ± 16 1130 ± 179
3,0 151 ± 16 2319 ± 139
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 181 ± 69 512 ± 43
0,3 181 ± 69 566 ± 114
1,0 181 ± 69 1531 ± 303
3,0 181 ± 69 2349 ± 267
His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-Nifc 0,1 220 ± 29 420 ± 105
0,3 220 ± 29 900 ± 163
1,0 220 ± 29 1965 ± 366
3,0 220 ± 29 4553 ± 670
His-DaNal-Ab-Ti-p- DPhe-Ala-Lys-ίNH2 0,1 111 ± 25 484 ± 89
0,3 107 ± 16 971 ± 241
1,0 107 ± 16 1593 ± 359
3,0 107 ± 16 3337 ± 583
His-Ala-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 111 ± 25
0,3 151 ± 16 262 ± 32
1,0 151 ± 16 830 ± 103
3,0 151 ± 16 2588 ± 341
Tabele 1, 2, 3 i 4 wykazują, że związki wytworzone według wynalazku pobudzają uwalnianie hormonu wzrostu i zwiększają jego poziom we krwi szczurów, którym takie związki podano. Peptydy wytworzone sposobem według wynalazku wykazują aktywność, podczas gdy równoważne związki podstawione w pozycji A2 (np. przez DAsp, DCys(SMe), DHis i DPro) nie wykazują takiej aktywności. Tabele te pokazują także, iż His-D^Nał- Ala-Trp-DPhe-Lys-NH jest aktywniejszy od związków mających w pozycji A2 DTrp, DaNal, DAsp i DCys(SMe). Podobnie, Ala-His-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 jest aktywniejszy niż równoważny związek DTrp.
Podawanie połączenia związków uwalniających GH
Postępowano jak w próbie uwalniania GH u szczurów, lecz szczurów nie znieczulono i nie poddano ich wstępnemu zabiegowi z użyciem pentobarbitalu, a podano im połączenie peptydów. Podane związki, poziom dawki i wyniki przedstawiono w tabeli 4.
167 804
Ta b e1a4
Uwalnianie GH in vivo wywołane przez związki uwalniające hormon wzrostu u szczurów znieczulonych pentobabitalem (Zwiereęa uśmiercono w 10 minut po ostatniej iniekcji)
Kolumna A. Peptyd uwalniający GH Całkowita dawka (g.g) GH w surowicy w próbie kontrolnej ng/ml + SEM Uwolniony GH w surowicy ng/ml+SEM
Ala-His-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,1 337 ± 51 610 ± 90
0,3 337 ± 51 1140 ± 187
1,0 337 ± 51 2909 ± 257
3,0 337 ± 51 3686 ± 436
Ala-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 167 ± 46 363 ± 73
1,0 167 ± 46 1450 ± 294
3,0 167 ± 46 2072 ± 208
10,0 167 ± 36 2698 ± 369
Ala-His-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 160 ± 51 1418 ± 302
1,0 160 ± 51 2201 ± 269
Ala-His-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 0,3 228 ± 23 1746 ± 318
1,0 228 ± 23 2610 ± 176
Ala-His-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-Nhfc 0,1 160 ± 36 822 ± 243
0,3 160 ± 36 1549 ± 292
1,0 160 ± 36 2180 ± 284
Ta b e l a 5
Działanie synergiczne związku wytworzonego sposobem według wynalazku ze związkami z Grupy 1 i/lub z Grupy 3 * u nie znieczulonych szczurów
Podany związek Dawka (ąg) Uwolniony GH (ng/ml + SEM)
1 2 3
Próba kontrolna - - - 12 ± 13
175-1' - - 1 58 ± 13
175-1 - - 3 240 ± 32
Cb - - 10 204 ± 50
GHRCc - - 3 131 ± 50
TPd - - 10 79 + 29
175-1 GHRH 1+3 2014 + 224
175-1 TP - 1 + 10 987 + 204
175-1 GHRH TP 1+3+10 4150 ± 555
175-1 GHRH - 3 + 3 1994 ± 249
175-1 TP - 3+10 2149 ± 451
175-1 GHRH TP 3 + 3+10 2922 ± 384
167 804
1 2 3
c GHRH - 10 + 3 252.5 + 453
c TP - 10+10 1587 + 387
c GHRH TP 10 + 3 + 10 4344 ± 374
Związki z Grupy 1 i 3 opisano szczegółowo w opisie patentowym Stanów Zjednoczonych Ameryki nr
4880778.
a -175-1 = His-DPNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-INH2 (związek wytworzony sposobem według wynalazku), b -C = His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 (związek porównawczy) c - GHRH = Trp-Ala-Asp-Aaa-He-PheTgr-Asn-Ser-Tyr-Arg-LysVal-Leu-Gly-Gln-Leu-SerAla-Arg-Lys-Leu-Leu-GLn- .
Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH2 (związek z Grupy 1 według opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4880778). d -TP = Tyr-DArg-Phe-Gly-NH2 (związek z Grupy 3 według opisu patentowego Stanów Zjednoczonych Ameryki nr 4880778).
Tabela 5 wskazuje, że związek wytwarzany sposobem według wynalazku wywołuje reakcję synergiczną gdy podaje się go z przykładowymi związkami z Grupy 1 i/lub Grupy 3. Wyniki z tabeli 5 wskazują ponadto, że związek wytworzony sposobem według wynalazku daje silniejszą reakcję synergiczną niż uzyskana z użyciem porównawczego związku (C), którego działanie synergiczne było już znane poprzednio.
Wynalazek zilustrowano następującymi przykładami, nie stanowiącymijego ograniczenia.
Przykład I. Synteza peptydów uwalniających hormon wzrostu.
Chlorowodorek żywicy p-metylobenzhydryloaminowej (pMe-BHA.HCl) umieszczono w naczyniu reakcyjnym dostępnego w handlu zautomatyzowanego urządzenia do syntezy peptydów. Żywicę podstawiono wolną aminą do uzyskania obciążenia 5 mmoli/g. Związki wytworzono drogą sprzęgania poszczególnych aminokwasów, zaczynając od końca karboksylowego sekwencji peptydów, z użyciem odpowiedniego środka aktywującego, takiego jak N,N’dwucykloheksylokarbodwuimid (DCC). Grupy α-aminowe poszczególnych aminokwasów zabezpieczono jako np. pochodne t-butoksykarbonylowe (t-Boc), a reaktywne grupy funkcyjne w łańcuchach bocznych zabezpieczono jak to podano w tabeli 6.
T a b e l a 6
Grupy zabezpieczające łańcuchy boczne odpowiednie do stosowania w syntezie peptydów w fazie stałej
Arginina: Ng-tosyl
Kwas asparaginowy: 0-benzyl
Cysteina: S-^^-n^t^yl^lje^zyl
Kwas glutaminowy: 0-benzyl
Histydyna: Nim-tosyl
Lizyna: Ne-ż.ą-dwuchlorobenzyloksykarbonyl
Metionina: S-suufotlenek
Seryna: 0-benzyl
Treonina: 0-benzyl
Tryptofan: Nin-omyl
Tyrozyna: 0-2,6-dwuchlorobenzyl
Przed wprowadzeniem początkowego aminokwasu żywicę trzykrotnie mieszano (każdorazowo przez 1 minutę) z dwuchlorometanem (CH2Cl2, około 10 ml/kg żywicy), zobojętniono ją przez trzykrotne mieszanie (każdorazowo około 2 minuty) z N,N-dwuizopropyloetyloaminą (DIEA) w dwuchlorometanie (10 : 90, około 10 ml/g żywicy) i trzykrotnie mieszano (każdorazowo przez 1 minutę) z dwuchlorometanem (około 10 ml/mg żywicy). Początkowy i każde następne aminokwasy sprzęgano z żywicą z użyciem wstępnie wytworzonego symetrycznego
I4
I67 804 bezwodnika, stosując około trzykrotną ilość odpowiednio zabezpieczonego aminokwasu i około półtorakrotną ilość DCC w przeliczeniu na całkowitą siłę wiążącą żywicy w odpowiedniej ilości dwuchlorometanu. W przypadku aminokwasów o słabej rozpuszczalności w dwuchlorometanie dla uzyskania jednorodnego roztworu dodawano N,N-dwumetylofonnamid (DMF). Na ogół symetryczny bezwodnik wytwarzano do 30 minut przed wprowadzeniem do naczynia reakcyjnego w temperaturze pokojowej lub niższej. Dwucykloheksylomocznik powstały przy wytwarzaniu symetrycznego bezwodnika usuwano drogą filtrowania grawitacyjnego roztworu do naczynia reakcyjnego. Postęp sprzęgania aminokwasu do żywicy na ogół śledzono z użyciem testu barwnego, stosując taki odczynnik jak ninhydryna (która reaguje z I- i Π-rzędowymi aminami). Po pełnym sprzęgnięciu zabezpieczonego aminokwasu z żywicą ( >99%) grupę zabezpieczającą grupę a-aminową usuwano działaniem reagenta(-ów) kwasowego(-ych). Powszechnie stosowanym reagentem jest roztwór kwasu trójfluorooctowego (TFA) i anizolu w dwuchlorometanie (45 : 2 : 53). Pełną procedurę wprowadzania poszczególnych aminokwasów na żywicę przedstawiono w Tabeli 7.
T a b e l a 7
Reagent Mieszanina Czas mieszania
i. Dwuchlorometan 3 i minuta
2. TFA, anizol, dwuchlorometan (45:2:53) i 2 minuty
3. TFA, anizol, dwuchlorometan (45:2:53) i 20 minut
4. Dwuchlorometan 3 i minuta
5. DIEA, dwuchlorometan (I0 : 90) 3 2 minuty
6. Dwuchlorometan 3 i minuta
7. Wstępnie wytworzony symetryczny bezwodnik i I5-120 minut*
8. Dwuchlorometan 3 i minuta
9. Izopropanol 3 i minuta
i0. Dwuchlorometan 3 i minuta
i i. Śledzenie postępu reakcji sprzęgania
i2. Powtórzenie etapów i - i2 dla poszczególnych aminokwasów
^Czas sprzęgania zależy od danego aminokwasu Stopień sprzęgania można ogólnie śledzić przy użyciu testu barwnego. Gdy sprzężenie nie jest pe-ł ne, ten sam aminokwas można poddać ponownemu sprzęganiu powtarzając etapy 7-II. Gdy sprzężenie jest pełne, można sprzęgać następny aminokwas.
Dzięki zastosowaniu tej metody syntezy peptydów można wytworzyć nowe, związane z żywicą polipeptydy, takie jak: A i -D*Nal-A3-Trp-A5-A6-R (gdzie Ai, A3, A5 i Ać mają wyżej podane znaczenie, a R oznacza polimeryczną żywicę, zaś grupy funkcyjne składników aminokwasowych są w razie potrzeby zabezpieczone odpowiednimi grupami zabezpieczającymi). Do konkretnych substancji (w odpowiednio zabezpieczającej postaci), które otrzymano należą:
His-D^N al-Ala-T rp-DPhe-Lys-R,
Ala-His-DPNal-Aa-Trp-DPhe- Lys-R,
Ala-His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-R,
His-Ala-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-R,
His-DaNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-R,
His-DAsp-Ala-T rp-DPhe-Lys-R,
His-DCys(SMe)-Aaa-Trp-DPhe-Lys-R,
His-DT rp-ALa-T rp-DPhe-Ala-Lys-R,
His-D“Nal-Aa-Trp-DPhe-Ala-Lys-R,
Ala-His-DaNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-R,
Try-DArg-Phe-Gly-R,
Ala-His-DHis-Aa-Trp-DPhe-Lys-R i
Ala- His-DPro-Ala-Trp-DPhe-Lys-R.
167 804
Przykład II, Reakcja kondensacji fragmentów peptydowych z wytworzeniem peptydu
Ogólny sposób postępowania
Wartości temperatury topnienia można wyznaczyć za pomocą kapilarnego urządzenia do pomiaru temperatury topnienia Thomas Hoover. Widma w podczerwieni (IR) można rejestrować w spektrofotometrze Perkin-Elmer Model 137 lub Nicolet Model 5DX i podawać jako liczby falowe (cm'i). Widma masowe (MS) można oznaczać za pomocą spektrometru masowego VG Analytical Ltd. Model ZAB-1F w trybie EI (uderzenia elektronowego), FD (jonizacji polem) lub FAB (szybko bombardowania elektronami). GCMS można oznaczać aparatem Finigan 4023 GCMS wyposażonego w kolumnę kapilarną 30m DB5 (J & W Scientific), stosując gazowy hel jako nośnik. Skręcalność optyczną można mierzyć polarymetrem Autopol III produkcji Rudolph Research.
Widma 1H NMR można otrzymać za pomocą urządzenia JEOL GX-400 NMR pracującym przy 400 MHz lub JEOL GX-270 pracującym przy 270 MHz. Te urządzenia mają cyfrową zdolność rozdzielczą poniżej 0,7 Hz. Przesunięcia chemiczne są wyrażone w częściach na milion względem wzorca wewnętrznego, 3--(rójmetylosiillo)czterodeuteropropienianu sodowego (TSP).
Wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) można realizować z użyciem układu Hitachi złożonego z kontrolera gradientu L-500 i pompy 655A przyłączonych do półpreparatywnej kolumny Vydac 201 TP lub 218 TP 1010. Jako rozpuszczalnik eluujący można zastosować połączenia wody zawierającej 0,2% kwasu trójfluoroectewege i metanolu. Na ogół związki, o które chodzi, będą ulegały elucji przy prędkości przepływu 6 ml/minutę i gradiencie składnika organicznego rosnącym z prędkością około 1 - 2%/minutę. Związki wykrywa się następnie przy odpowiednich długościach fali z użyciem detektora UV z diodą LKB 2140. Całkowanie można następnie przeprowadzić z użyciem programu Nelson Analytical (Version 3.6).
Reakcje, o ile nie podano inaczej, prowadzono w obojętnej atmosferze azotu lub argonu. Bezwodny tetrahydrofuran (THF, gatunku UV) i dwumetyloformamid (DMF) można nabyć w Burdick and Jackson i używać bezpośrednio z butli.
A. Wytwarzame zaagrnentg trójpeptydowego w H2N-Trp-DPre-lys(Boc)-NH2, amidu N“benzyloksykarbonyle-(Nεt-butoksyk<αbonylo)lizyny (związek 4)
Do roztworu karbonylodwuiNidαfelu (CDI, 2, 88,24g, 0,544 mola) o temperaturze 10°C i bezwodnego tetrahydrofuranu (THF, 1500 ml) dodano powoli N benzyleksykabonylo--N6t-butoksykaaboπylo)lizyny (związek, 1, 180g, 0,474 mola). Podczas dodawania obserwuje się wydzielanie gazu. Podczas powstawania związku pośredniego 3, iNidαzolidu Nabenzzloksykarbonylo-(Nβt-buteksykarbonyle)lizyny sporządzono nasycony roztwór amoniaku i THF (2000 ml) bezwodny gazowy NH3 przepuszcza się przez THF w temperaturze 5 - 10oC). Po uznaniu, że powstawanie związku pośredniego 3 dobiegło końca (gdy ustaje wydzielanie się gazu, około 2 godziny) do roztworu amoniaku dodano połowę roztworu THF zawierającego związek pośredni 3. Resztę roztworu zawierającego związek pośredni 3 dodano w 30 minut później. Podczas dodawania i przez następnych 45 minut utrzymywano stały przepływ gazowego amoniaku. Po dodaniu dwóch roztworów zawierających związek pośredni 3 wytrąca się biały osad. Pozwolono na ogrzanie się mieszaniny reakcyjnej do temperatury pokojowej i mieszano ją przez 15 godzin. Rozpuszczalnik susuwano z fαwie-iny pod próżnią. Pozostałość rozprowadzono w wodzie, a powstałą substancję stalą odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem.
Wytwarzanie amiduE-tabtaesykaar>onylolizynz (związek 5)
Roztwór amidu lizyny (związek 4) (181,48g, 0,479 mola) w metanolu (MeOH, 1000 ml) dodano w atmosferze argonu do zawiesiny katalizatora, 5% Pd/C (5g) w metanolu (250 ml). Przez Nie-zaninę reakcyiną przepuszczano pęcherzykami wodór (około 15 minut), po czym mieszaninę reakcyjną Nieszano w atmosferze wodoru do czasu gdy analiza HPLC wykazała, że reakcja zaszła do końca (36 godzin). Atmosferę wodoru zastąpiono wówczas atmosferą argonu. Roztwór reakcyjny klarowano, przesączywszy go przez warstwę CelituR i po usunięciu rozpuszczalnika pod próżnią otrzymano substancję stałą.
Wytwarzanie amidu Na-benzylok-ykarbenylo-D-aenyloalanylo-(NEttautoksykarbonzlo)lizyny (związek 8)
167 804
N α-benzyloksykarbonylo-D-fenyloalaninę (związek 6, 126,39g 0,423 mola) dodano powoli do roztworu CDI (związek 2, 66,03g, 0,409 mola) w THF (500 ml) o temperaturze 10°C. Podczas dodawania obserwuje się wydzielanie się gazu. Gdy wydzielanie się gazu ustało, dodano roztwór amidu lizyny (związek 5,110,75g, 0,452 mola) w THF (500 ml). Po około 48 godzinach mieszaninę przesączono w celu usunięcia substancji stałych. Przesącz zatężono pod próżnią.
Powstałą substancję stalą rozprowadzono w octanie etylu (EtOAc, 500 ml) i przemyto jak następuje we wkraplaczu:
1. Wodnym roztworem HCl (1n, 3 x 500 ml), pH pierwszej cieczy z przemywania około 8, pH następnej cieczy z przemywania i,
2. Wodą (500 ml),
3. Wodnym roztworem Na2CO3 (1/2 nasycony, 2 x 500 ml) sączenie dla zebrania powstałych krystalicznych substancji stałych (związek 8).
4. Wodą (3 x 500 ml).
Warstwę organiczną suszono nad MgSO4. Po sklarowaniu rozpuszczalnik usunięto pod próżnią. Otrzymaną pozostałość można poddać rekrystalizacji z gorącego EtOAc i otrzymać drugą próbkę związku 8.
Amid D-fenyloalanylo-(Nε---butoksykaΓbonylo)lizyny (związek 9)
Metanolowy roztwór (1500 ml) amidu związku 8 (120,53g, 0,229 mola) dodano do zawiesiny katalizatora, 5% Pd/C (50g) w MeOH (200 ml). Atmosferę argonu zastąpiono atmosferą wodoru. Gdy analiza HPLC wykazała, że reakcja zaszła do końca (około 4 godzin), atmosferę wodoru zastąpiono atmosferą argonu. Roztwór reakcyjny klarowano przez warstwę CelituR, a przesącz odparowano pod próżnią do pozostałości. Ten produkt dwupeptydowy można stosować bezpośrednio do wytwarzania trójpeptydu (związek 12).
Wytwarzanie amidu Nα-benzyloksykarbonylo-tryptofilo-D-fenyloalnyylo-(^f---butoksykarbonylo)lizyny (związek 12)
W temperaturze 10°C roztwór N“-benzyloksykiM·bonylotIyptofanu (związek 10, 67,60g 0,200 mola), THF (500 ml) i CDI (związek 2, 33,05g, 0,204 mola) mieszano do ustania wydzielania się gazu. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano roztwór związku 9 (40,9g, 0,103 mola) w THF (okoł 200 ml). Powstały roztwór poddawano reakcji przez 15 godzin, ogrzewając go do temperatury pokojowej. Powstałe substancje stałe odsączono pod próżnią. Z przesączu otrzymano pozostałość przez zatężenie pod próżnią. Pozostałość i substancję stałą ponownie połączono i roztworzono w EtOAc (400 ml), stosując lekkie ogrzewanie. Po ochłodzeniu roztworu do temperatury pokojowej tworzy się substancję stałą. Tę substancję stałą odsączono pod próżnią. Substancję stałą podano rekrystanzacji z gorącego MeOH, otrzymując oczyszczony trójpeptyd (związek 12). przesącz EtOAc (z pierwszej rekrystaHzacji) przemytojak następuje we wkraplaczu:
1. Wodnym roztworem HCl (ln, 2 x 500 ml),
2. Wodą (1x500 ml),
3. Wodnym roztworem Na2CO3 (1/2 nasycony, 2 x 500 ml),
4. Wodnym roztworem NaCl (1 x 500 ml).
Warstwę organiczną suszono nad MgSO 4 i klarowano przez sączenie pod próżnią. Rozpuszczalnik usunięto z przesączu pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymaną pozostałość ponownie roztworzono w EtOAc i otrzymano suchą substancję stałą. Tę substancję stałą można poddać rekrystalizacji z gorącego MeOH o otrzymać drugi rzut związku 12 w postaci białej substancji stałej.
Wytwarzanie amidu tryptofilo-D-fenyloalanylo-(Nε-t-butoksykaabonylo)llzyny związku 13
Metanolowy roztwór (1500 ml) trójpeptydu stanowiącego związek 12 (64,59g, 0,091 mola) dodano do zawiesiny katalizatora, 5% Pd/C (5g) w metanolu (250 ml) w atmosferze argonu. Dodano jeszcze MeOH (2250 ml) i atmosferę argonu zastąpiono atmosferę wodoru i pozwolono na przebieg reakcji (około 24 godzin). Po zakończeniu reakcji atmosferę wodoru zastąpiono atmosferą argonu. Roztwór klarowano przez warstwę CelituR, a przesącz odparowano pod próżnią, otrzymując trójpeptyd (związek 13) w postaci białej substancji stałej.
B. Wytwarzaniefragmentu trójpeptydowego - K-His-D^Nal-Ala-OMe, esttu metyj owego Nα-benzyloksykarbonylo-histydylo-D-β-naftyloalaniny, związek 25
167 804
Roztwór EtOAc (400 ml) i chlorowodorku estru metylowego D-β -nafttyoalaniny (związek 22, 0,62 mola) przemyto nasyconym roztworem węglanu sodowego (400 ml) i 0,8n wodnym roztworem wodorotlenku sodowego (około 500 ml). Powstałą fazę wodną usunięto (pH 8,5), a fazę organiczną przemyto kolejno półnasyconym wodnym roztworem Na2CO3 (150 ml), a potem wodą (50 ml). Po zatężeniu pod próżnią warstwy w octanie etylu wyodrębniono związek 22 w postaci wolnej zasady.
W temperaturze -5°C (łaźnia lodowo-etanolowa) do roztworu N“-benzyloksykarbonylohistydyny (związek 19, 143,5g, 0,50 mola), N-hydroksysukcynimidu (HONSu, związek 23, 062 mola) i świeżo wytworzonego związku 22 w postaci wolnej zasady (około 0,52 mola) w DMF (około 3 litrów) dodano dwucykloheks^^^^!^i^ł^o(^,^^i^mid (DCC, około 95g, 0,46 mola). Powstały roztwór reakcyjny mieszano przez 24 godziny, ogrzewając go do temperatury pokojowej. Należy stosować analizę HPLC by stwierdzić czy reakcja zaszła do końca. Jeśli nie, roztwór reakcyjny chłodzono do około -5°C i dodano jeszcze dwucykloheksylokarbodwuimidu (około 0,17 mola). Mieszaninę reakcyjną mieszano następnie jeszcze przez 24 godziny, ogrzewając ją do temperatury pokojowej. Następnie mieszaninę sączono dla usunięcia dwucykloheksylomocznika (DCU). Do przesączu dodano wody (1 litr) i powstały roztwór zatężono pod próżnią. Otrzymaną pozostałość roztworzono w 1n wodnym roztworze HCl (około 1 litra, do chwili gdy pH wodnej fazy osiągnie 1). Warstwę wodną ekstrahowano dwoma porcjami octanu etylu (po 1 litrze każda). Warstwy w octanie etylu odrzucono. Wartość pH fazy wodnej regulowano następnie przez dodanie zimnego 2n wodorotlenku sodowego (500 ml) i pastylek wodorotlenku sodowego. Podczas zobojętniania roztwór utrzymywano w chłodzie przez dodawanie zimnego octanu etylu (1 litr). Gdy pH fazy wodnej osiągnęło około 7, zwykle wydziela się obficie biała substancja stała lub olej. Tę wytrąconą substancję zbierano przez odsączenie pod próżnią lub dekantację i przemyto kolejno półnasyconym wodnym roztworem węglanu sodowego (2 x 1500 ml), wodą (6 x 1500 ml) o octanem etylu (3 x 1500 ml). Otrzymany materiał suszono pod wysoce zmniejszonym ciśnieniem do stałej wagi. Ten materiał można poddać bezpośredniej hydrolizie bez dalszego oczyszczania.
Wytwarzanie N-benzyloksykarbonylo-histydylo-p-naftylo-D-alamny, związek 26.
Wodny roztwór wodorotlenku sodowego (192 ml, 0,08 g/ml roztworu, 0,38 mola) dodano do roztworu dwupeptydu związek 25 (około 0,38 mola), wody (360 ml) i MeOH (około 6 litrów). Roztwór mieszano w temperaturze pokojowej do zakończenia hydrolizy (około 24 godziny). Zanik wyjściowego peptydu potwierdza analiza HPLC. Roztwór zatężono pod próżnią, a pozostałość rozpuszczono w wodzie (około 1 litra). Warstwę wodną (pH około 10) ekstrahowano następnie EtOAc (2 x 500 ml) we wkraplaczu. Warstwy w octanie etylu odrzucono. Powstałą fazę wodną doprowadzono do pH około 5 za pomocą stężonego HCl, a wówczas z reguły wytrąca się biała substancja stała lub olej. Produkt zbierano i suszono pod próżnią.
Wytwarzanie estru metylowego Na-benzyloksykarbonylo-histydylo-D-P-naftyloalanyloalaniny, związek 20
Dwupeptyd N“-benzyloksykarbonylo-histydylo-D-P-naftyloalanlnę (związek 26, 0,253 mola) dodano do roztworu HONSu (związek 23, 0,505 mola) w DMF (800 ml) w atmosferze argonu. Do tego roztworu dodano mieszaninę chlorowodorku estru metylowego alaniny (związek 15, 0,303 mola), N-metylomorfollny (związek 16, 0,303 mola) i DMF (200 ml). Powstały roztwór chłodzono do temperatury 10°C i w tym czasie dodano dwucykloheksylokarbodwuimidu (związek 24,0,265 mola) w chlorku metylenu (273 ml). Przebieg reakcji śledzono metodą HPLC i mieszaninę reakcyjną utrzymywano w temperaturze 10°C do czasu zakończenia reakcji. Gdy po kilku dniach (około 4) reakcja nie dobiega końca, dodano jeszcze związek 24 (0,080 mola) i mieszaninę re^^^^yjną mieszano jeszcze przez 1 dzień w temperaturze 10°C. Przebieg reakcji śledzono znowu metodą HPLC do zakończenia reakcji (na ogół około 5 dni). Wytrącone w trakcie reakcji substancje stałe odsączono pod próżnią. Przesącz zatężono pod próżnią, otrzymując pozostałość. Tę pozostałość roztworzono w octanie etylu i ekstrahowano półnasyconym wodnym roztworem Na2CO3 (2 x 500 ml). Fazę w octanie etylu suszono nad MgSOą. Powstały roztwór klarowano i za^żono pod próżnią do pozostałości.
C. Wytwarzawie fragm entu metero peptydowego Ata-His-DβNal-Ala-Oh, e-trh metyu oweyo hletydzlo-D-β-naftyloalanylo-aianlnz związku 30
167 804
Do roztworu estru metylowego Na-benzyloksykarbonylohistydylo-D-3-naftyloalanyloalaniny stanowiącego związek 20 (71 mmoli) w metanolu (500 ml) dodano ostrożnie w atmosferze argonu 5% palladu na węglu (3g). Przez mieszaninę reakcyjną przepuszczano pęcherzykami argon przez I5 minut, a potem dodano kwasu octowego (15 ml, 0,26 mola). Przez powstałą mieszaninę reakcyjną przez 15 minut przepuszczano pęcherzykami (pod powierzchnią) wodór, a potem mieszaninę reakcyjną mieszano w temperaturze pokojowej i w atmosferze wodoru (0,98.105 Pa). Następnie prowadzono analizę HPLC, aby stwierdzić ile pozostało materiału wyjściowego, o ile pozostało. Gdy jest go jeszcze trochę, ostrożnie przepuszczano pęcherzyki przez mieszaninę reakcyjną (pod powierzchnią, przez 30 minut) i dodano jeszcze 5% palladu na węglu (2,5g). następnie wprowadzono ponownie wodór. Następnie przez mieszaninę reakcyiną przepuszczano ponownie argon i powstały roztwór klarowano przez warstwę ziemi okrzemkowej. powstały roztwór zatężono pod próżnią, otrzymując produkt. Część tego produktu rozpuszczono lub rozprowadzono w wodzie (500 ml). Do otrzymanego materiału dodano octanu etylu lub nasyconego wodnego roztworu węglanu sodowego, po wyodrębnieniu warstwy w octanie etylu lub powstałych substancji stałych otrzymano materiał (związek 30), wolny od octanu.
Wytwarzanie estru Boc-ałaniny i Na^h^d^<^l^^2^^i^ł^c^^^nii^^idu, związek 31
Dwucykloheksylokarbodwuimid (43 mmoli) dodano w temperaturze pokojowej do roztworu Boc-a]aniny (43 mmoli) i (48 mmoli) w chlorku metylenu (250 ml), powstały roztwór mieszano przez noc. Następnie mieszaninę reakcyjną sączono dla usunięcia dwucykloheksyłomocznika i sklarowany przesącz zatężono pod próżnią, w wyniku czego otrzymano produkt, który przed użyciem przechowywano w temperaturze -20°C w atmosferze argonu.
Wytwarzanie Boc-Ała-His-D-Nal-Ala-OMe, związek 32
Ester alaniny (23,9 mmola), otrzymany jak opisano wyżej, dodano do roztworu his-D^Nal-Ala-Ome (związek 30) (20,1 mmola) w bezwodnym dwunerylofornamidzie (DMF, 200 ml). Powstały jednorodny roztwór mieszano przez weekend w temperaturze pokojowej i monitorowano. Gdy analiza HPLC wykazała, że zasadniczo w mieszaninie reakcyjnej nie ma już trójpeptydu (np. po około 3 dniach), do mieszaniny reakcyjnej dodano wody (50 ml) i powstałą mieszaninę mieszanojeszcze przez dzień. Ten roztwór zatężono następnie pod próżnią. Otrzymaną pozostałość rozpuszczono w octanie etylu, a następnie ekstrahowano półnasyconym wodnym roztworem Na2C0.3 (2 x 300 ml). Warstwę organiczną suszono nad MgSOą i Na2SOą i zatężono pod próżnią, otrzymując czteropeptyd. Ten materiał stosowano bez dalszego oczyszczania do wytwarzania Boc-Ala-His-D^-Nal-Ala-OH.
Wytwarzanie Boc-Ala-His-D^-Nal-Ala-OH - związku 33
Do roztworu metanolu (500 ml) i wody (200 ml) zawierającego Boc-Ala-His-D^Nał-AlaOMe (13,7 mmola) dodano 2n wodny roztwór wodorotlenku sodowego (7,5 ml, 15 mmoli). Mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej, po czym drogą analizy HPLC stwierdzono ile pozostało materiału wyjściowego. Gdy reakcja zaszła zasadniczo do końca (w przybliżeniu w ciągu nocy), powstały roztwór zatężono pod próżnią do objętości około 200 ml, dodano wody (1200 ml) i doprowadzono pH do około 12 przez dodanie 2n wodorotlenku sodowego (1 ml), powstały roztwór ekstrahowano octanem etylu (2 x 500 ml). Warstwy w octanie etylu odrzucono. Wartość pH fazy wodnej doprowadzono do około 5 przez dodanie wodnego roztworu HCl, co zwykle prowadzi do wytrącenia produktu. Ważne jest by objętość fazy wodnej zmniejszyć do minimum dla ułatwienia tego wytrącania. Warstwę wodną dekantowano znad produktu, produkt przepłukano wodą 92 x 50 ml). Wyodrębniony produkt suszono do stałej wagi pod próżnią.
D. Reakcje kondensncji fragmenagn peptydowych z wytworzmierz sienmiopentoPu, Boc-Ala-Ji--DβNal-Ala-Trp-D-Phe-Lys-Boc)-NH2 - związku 34
Dwa peptyCz, Boc-AIa-His-D-Nał-Ala-OH (związek 33, 2,6 mmola) i Trp-D-PheLzs(Boc)-NH2 (związek 13, 2,8 mmla) rozpuszczono w bezwodnym DMF i powstały roztwór za^żono pod próżnią. To wstępne zatężanie prowadzono jako próbę usunięcia wszelkich obecnych śladów metanolu. Powstałą nieszapipę pepryCów rozpuszczono ponownie w DMF i dodano N-hydroksysu kcy n ńmidu (5,1 mmla). Powstały roztwór chłodzono do temperatury -2°C
167 804 i do roztwom dodano następnie dwucykloheksylokarbodwuimidu (3,4 mmola) jako roztwór w chlorku metylenu (3,5 ml). Powstałą mieszaninę reakcyiną mieszano w temperaturze -2°C przez 3 dni. W celu stwierdzenia, czy reakcja zaszła do końca, stosowano analizę HPLC. Jeśli po tym okresie czasu jeszcze nie zaszła, można dodać jeszcze dwucykloheksylokarbodwuimidu i powstałą mieszaninę reakcyjną mieszać jeszcze przez dzień w temperaturze -2°C. Jeśli następnego dnia (ogółem po 4 dniach) analiza HPLC ponownie wskaże, że reakcja nie zaszła do końca, chłodzenie mieszaniny reakcyjnej należy przerwać. Można pozwolić, by temperatura roztworu wzrosła powoli do temperatury pokojowej (25°C) w ciągu kilku godzin (około 8). Powstałą mieszaninę reakcyjną mieszano przez noc w temperaturze pokojowej. Procedurę powtarzano do zakończenia reakcji. Następnie dodano wody (50 ml) i powstałą mieszaninę mieszano przez jeszcze 1 dzień. Roztwór reakcyjny przesączono następnie dla usunięcia dwucykloheksylomocznika i powstały przesącz zatężono pod próżnią do postaci lepkiego oleju. Do pozostałości dodano octanu etylu i półnasyconego wodnego roztworu węglanu sodowego (200 ml). Dwufazową mieszaninę mieszano intensywnie w wyparce obrotowej przez około 1 godzinę. Wszelkie wytrącone substancje stałe odsączono przez sączek ze szkła spiekanego, otrzymując produkt. Warstwę organiczną przemyto wodą, a potem suszono do stałej wagi pod próżnią, otrzymując produkt.
Wytwarzanie Ala-His-D-Nal-AlaaTrp-D-Phe-Lys-NKb - związku 35
Siedmiopeptyd BocaAla-His-Dβ-Nal-AlaaTrp-D-Phe-Lys-aBoc)-NH^ (związek 34, 1,02 mmola) dodano w temperaturze pokojowej do roztworu kwasu trójfluorooctowego (30 ml), dwumetylosulfotlenku (14 ml), etanodwutiolu-1,2 (7 ml) i anizolu (2,2 ml) w chlorku metylenu (15 ml). Jednorodną mieszaninę reakcyjną mieszano przez 15 minut. Po tym okresie czasu dodano bezwodnego eteru (450 ml) aby wytrącić biologicznie czynny surowy produkt peptydowy stanowiący związek 35. Ten produkt wyodrębniono przez odsączenie na sączku ze szkła spiekanego lub przez dekantancję. Otrzymany produkt rozpuszczono w wodzie i liofilizowano. Zliofilizowany produkt można dalej oczyścić drogą chromatografii średniociśnieniowej w kolumnie szklanej 26 x 460 mm zawierającej materiał do kolumn Lichroprep™ RP-18 (C-18, 25 - 40 nm, nieregularne ziarno). Po wstrzyknięciu peptydu w roztworze w wodzie kolumnę eluowano z prędkością przepływu 9 ml/minutę płytkim gradientem 0 - 25% metanolu przez 5 20 godzin, a potem gradientem 25 - 55% metanolu przez około 48 godzin. Stężenie metanolu w gradiencie podnoszono następnie z prędkością 2%/godzinę. Podczas elucji resztę kompozycji rozpuszczalnikowej uzupełniano wodą zawierającą 0,2% kwasu trójfluorooctowego. Produkt stanowiący związek 35 identyfikowano metodą HPLC i wyodrębniano przez zatężenie odpowiedniej objętości eluatu.
Wynalazek opisano szczegółowo w odniesieniu do korzystnych jego postaci. Trzeba jednak wziąć pod uwagę, że fachowcy po zapoznaniu się z niniejszym ujawnieniem mogą dokonywać zmian i modyfikacji zgodnych z ideą i zakresem wynalazku.
167 804
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 90 egz Cena 1,50 zł

Claims (17)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób wytwarzania nowych peptydów o ogólnym wzorze A 1-A2-A3-T1P-A5-A6-Z, w którym A1 oznacza His, 3(NMe)His, His-Ala, Ala, Tyr, Ao- His lub Ao-3 (NMe)His, gdzie Ao oznacza dowolny naturalny L-aminokwas, Met(O). DOPA, Abu lub peptydy o wzorze L-Ao, w którym L oznacza H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys, Tyr-DAla-Phe-Gly, Tyr-DAla-Gly-Phe, Tyr-Ala-Gly-Thr lub Tyr-DAla-Phe-Sar; A2 oznacza DLNal-; A3 oznacza Ala, Gly lub Ser; A5 oznacza DPhe, D/L^ (M)Phe lub (NMe)DPhe; A oznacza B-G lub G, gdzie B oznacza dowolny naturalny L-aminokwas, dwupeptydy dowolnych naturalnych aminokwasów lub H2N(CH2)nCO2H, gdzie n = 2 -12, a G oznacza Arg, iLys, Lys lub Orn; przy czym w grupach A1 do Aó His oznacza L-histydynę, 3(NMe)His oznacza 3-(N-metylo) histydynę, Ala oznacza L-alaninę, Tyr oznacza L-treoninę, Met(O) oznacza sulfotlenek metioniny, DOPA oznacza 3,4-dwuhydroksyfenyloalaninę, Abu oznacza kwas α-aimnomaslowy, Lys oznacza L-lizynę, Phe oznacza L-fenyloalaninę, Cys oznacza L-cysteinę, DAla oznacza D-alaninę, Gly oznacza glicynę, Thr oznacza L-treoninę, Sar oznacza sarkozynę, DpNal-oznacza β-naftylo-D-aaaninę, Ser oznacza L-serynę, DPhe oznacza D-fenyloalaninę, D/L((Me)Phe oznacza D/L β-metylofenyloalaninę, (NMe)DPhe oznacza (N-metylo)-D-fenyloalaninę, Arg oznacza L-argininę, iLys oznacza Ne-izopropylo-L-llzynę, a Orn oznacza L-ornitynę; Z oznacza C-końcową grupę polipeptydu lub C-końcowy(-e) aminokwasy (-y) z grupę końcową, i Z oznacza -CONR1R.2, -COOR’, -CHzOR1, Gly-Z’, -Met-Z’, -Lys-Z’, -Cys-Z’, -Gly-Tyr-Z’ lub -Ala-Tyr-Z’, gdzie Z' oznacza -CONR*r2, -COOR1 lub CH2ORI gdzie R1 oznacza H, grupę alkilową o 1 do około 6 atomach węgla, grupę cykloalkilową o 3 do około 8 atomach węgla, grupę alkenylową o 2 do około 8 atomach węgla lub grupę arylową o 6 do około 12 atomach węgla, a r2 ma takie znaczenie jak R1 i może być takie samo lub różne; oraz ich organicznych i nieorganicznych farmaceutycznie dopuszczalnych soli, znamienny tym, że sprzęga się aminokwasy lub pochodne aminokwasów w kolejności wynikającej z powyższego wzoru albo poddaje się reakcji kondensacji fragmenty peptydowe w kolejności wynikającej z podanego wyżej wzoru.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako resztę aminokwasową do wytwarzania peptydu stosuje się His, Ala, His-Ala lub Ao-His.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako resztę aminokwasową A 3 do wytwarzania peptydu stosuje się
  4. 4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako resztę aminokwasową A1 stosuje się resztę aminokwasową o wzorze Ao-His lub Ao-3(NMe)His, w którym Ao oznacza Ala, Lys lub Glu, a jako resztę aminokwasową A 3 stosuje się Ala a jako resztę aminokwasową Aó stosuje się Lys, iLys, Ala-Lys, Ala-Ala-Lys lub H 2N(CH2)n-CO-Lys, gdzie n’ oznacza liczbę 4-8.
  5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania peptydu o wzorze His-DLNal-Ala-Trp-DPhe-Aó-Z, sprzęga się tworzące go aminokwasy.
  6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako resztę aminokwasową A1 stosuje się DPhe.
  7. 7. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania peptydu o wzorze His-DpNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 sprzęga się tworzące go aminokwasy.
  8. 8. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związków o wzorze Ao-His-DLNal-Ala-Trp-DPhe-Aó-Z lub Ao-His-DOhe-Ala-Trp-DPhe-Aó-Z, sprzęga się tworzące je aminokwasy.
  9. 9. Sposób według zastrz. 8, znamienny tym, że jako resztę aminokwasową Ao-His lub Ao-3(NMe)His stosuje się resztę aminokwasową, w której Ao oznacza Ala.
  10. 10. Sposób według zastrz. 5 albo 8, znamienny tym, że stosuje się C-końcowy aminokwas, w którym Z oznacza -CONH2.
  11. 11. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związków o wzorach:
    167 804
    Ala-His-DeNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2,
    Ala-His-DeNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-NH2,
    Ala-His-DeNal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Ala-Lys-NH2,
    Lys-His-l/Nal-Ala-Trp-DPhe-A6-NH2 lub Glu-His -DPNal-Ala-Trp-DPhe-A6-NH2, sprzęga się tworzące je aminokwasy.
  12. 12. Sposób według zastrz. 2 albo 5 albo 8, znamienny tym, że jako resztę aminokwasową Aó stosuje się resztę Aó oznaczającą G.
  13. 13. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku o wzorze His-Ala-D ^Nal-Ala-Trp-DPhe-Aó-N^, sprzęga się tworzące go aminokwasy.
  14. 14. Sposób według zastrz. 13, znamienny tym, że stosuje się C-końcowy aminokwas, w którym Z oznacza -CONH2.
  15. 15. Sposób według zastrz. 14, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku o wzorze His-Ala-DaNal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2, sprzęga się tworzące go aminokwasy.
  16. 16. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w przypadku wytwarzania związku o wzorze Ala-DaNal-Ala-Trp-DPhe-As-Z, sprzęga się tworzące go aminokwasy.
  17. 17. Sposób według zastrz. 16, znamienny tym, że jako resztę Aó-Z stosuje się resztę Lys-NH2.
PL91297850A 1990-07-24 1991-07-23 Sposób wytwarzania nowych peptydów PL PL167804B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US55722690A 1990-07-24 1990-07-24
US55812090A 1990-07-24 1990-07-24
PCT/US1991/005208 WO1992001711A1 (en) 1990-07-24 1991-07-23 Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL297850A1 PL297850A1 (en) 1993-09-20
PL167804B1 true PL167804B1 (pl) 1995-11-30

Family

ID=27071367

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL91297850A PL167804B1 (pl) 1990-07-24 1991-07-23 Sposób wytwarzania nowych peptydów PL

Country Status (26)

Country Link
EP (1) EP0540676B1 (pl)
JP (1) JPH05509105A (pl)
KR (1) KR927002373A (pl)
CN (1) CN1061606A (pl)
AT (1) ATE114157T1 (pl)
AU (1) AU667186B2 (pl)
BG (1) BG97334A (pl)
BR (1) BR9106676A (pl)
CA (1) CA2086928A1 (pl)
CZ (1) CZ401392A3 (pl)
DE (1) DE69105207T2 (pl)
DK (1) DK0540676T3 (pl)
ES (1) ES2067244T3 (pl)
FI (1) FI930261A0 (pl)
GR (1) GR3014916T3 (pl)
HU (2) HUT62605A (pl)
IE (1) IE912585A1 (pl)
IL (1) IL98910A0 (pl)
MX (1) MX9100341A (pl)
NO (1) NO930203L (pl)
NZ (1) NZ239079A (pl)
PL (1) PL167804B1 (pl)
PT (1) PT98439A (pl)
RO (1) RO111370B1 (pl)
SK (1) SK2793A3 (pl)
WO (1) WO1992001711A1 (pl)

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5663146A (en) * 1991-08-22 1997-09-02 Administrators Of The Tulane Educational Fund Polypeptide analogues having growth hormone releasing activity
EP0663834A4 (en) * 1992-09-25 1996-01-24 Smithkline Beecham Corp GROWTH HORMONE RELEASING PEPTIDES.
SK281963B6 (sk) * 1993-12-23 2001-09-11 Novo Nordisk A/S Zlúčeniny ovplyvňujúce uvoľňovanie rastového hormónu, farmaceutické prostriedky s ich obsahom a ich použitie
CN1052730C (zh) * 1993-12-23 2000-05-24 诺沃挪第克公司 具有生长激素释放特性的化合物
US5798337A (en) * 1994-11-16 1998-08-25 Genentech, Inc. Low molecular weight peptidomimetic growth hormone secretagogues
US20020111461A1 (en) 1999-05-21 2002-08-15 Todd C. Somers Low molecular weight peptidomimetic growth hormone secretagogues
BR9708854A (pt) * 1996-04-24 1999-08-03 Novo Nordisk As Composto composição farmacêutica processo para estimular a liberação do hormônio do crescimento pela pituitária e para aumentar a taxa e grau de crescimento de animais e uso de um composto
AU7906998A (en) 1997-06-20 1999-01-04 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
WO1999036431A1 (en) 1998-01-16 1999-07-22 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
WO1999039730A1 (fr) * 1998-02-09 1999-08-12 Kaken Pharmaceutical Co., Ltd. Preparation a administration orale contenant des peptides favorisant la secretion d'hormone de croissance
US6919315B1 (en) 1998-06-30 2005-07-19 Novo Nordisk A/S Compounds with growth hormone releasing properties
UA73530C2 (uk) 1999-11-10 2005-08-15 Ново Нордіск А/С Сполука з властивостями вивільнювати гормон росту
US9119832B2 (en) 2014-02-05 2015-09-01 The Regents Of The University Of California Methods of treating mild brain injury
WO2017075535A1 (en) 2015-10-28 2017-05-04 Oxeia Biopharmaceuticals, Inc. Methods of treating neurodegenerative conditions

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1175810A (en) * 1979-03-30 1984-10-09 Frank A. Momany Synthetic peptides having pituitary growth hormone releasing activity
US4880778A (en) * 1986-05-12 1989-11-14 Eastman Kodak Company Combinations having synergistic growth hormone releasing activity and methods for use thereof
US4839344A (en) * 1987-06-12 1989-06-13 Eastman Kodak Company Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
WO1989007110A1 (en) * 1988-01-28 1989-08-10 Eastman Kodak Company Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
ATE113607T1 (de) * 1988-01-28 1994-11-15 Polygen Holding Corp Polypeptidverbindungen mit wachstumshormonfreisetzender aktivität.
WO1989010933A1 (en) * 1988-05-11 1989-11-16 Eastman Kodak Company Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity

Also Published As

Publication number Publication date
BR9106676A (pt) 1993-06-22
AU8425991A (en) 1992-02-18
ATE114157T1 (de) 1994-12-15
BG97334A (en) 1994-03-24
EP0540676A1 (en) 1993-05-12
NO930203D0 (no) 1993-01-21
DK0540676T3 (da) 1995-05-01
CZ401392A3 (en) 1994-02-16
ES2067244T3 (es) 1995-03-16
SK2793A3 (en) 1993-09-09
JPH05509105A (ja) 1993-12-16
KR927002373A (ko) 1992-09-03
IE912585A1 (en) 1992-01-29
HUT62605A (en) 1993-05-28
MX9100341A (es) 1992-08-10
DE69105207D1 (de) 1994-12-22
AU667186B2 (en) 1996-03-14
CN1061606A (zh) 1992-06-03
PL297850A1 (en) 1993-09-20
NO930203L (no) 1993-01-21
GR3014916T3 (en) 1995-05-31
PT98439A (pt) 1992-05-29
CA2086928A1 (en) 1992-01-25
HU9300192D0 (en) 1993-04-28
HU210611A9 (en) 1995-05-29
EP0540676B1 (en) 1994-11-17
FI930261A (fi) 1993-01-22
RO111370B1 (ro) 1996-09-30
DE69105207T2 (de) 1995-05-11
WO1992001711A1 (en) 1992-02-06
NZ239079A (en) 1994-01-26
FI930261A0 (fi) 1993-01-22
IL98910A0 (en) 1992-07-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US5663146A (en) Polypeptide analogues having growth hormone releasing activity
US5534494A (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
EP0398961B1 (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
US5486505A (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
PL167804B1 (pl) Sposób wytwarzania nowych peptydów PL
EP0417165B1 (en) Polypeptide compounds having growth hormone releasing activity
US4880777A (en) Synthetic peptides having growth hormone releasing activity