SK2793A3 - Polypeptide compounds with ability release of growth hormone - Google Patents

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka nových polypeptidových zlúčenín, ktoré, ak sa podajú zvieratám, promotujú uvoľňovanie rastového hormónu. Do rozsahu vynálezu taktiež patrí spôsob promotovania uvoľňovania n a zvyšovania hladiny rastového hormónu u zvierat, ak sa im podá Špecifická polypeptidová zlúčenina uvoľňujúca tento rastový ,r hormón.

Súčasný stav techniky

Zvýšenie hladiny rastového hormónu (v tomto texte bude niekedy na označenie rastového hormónu používaná, skratka GH) u cicavcov po podaní zlúčeniny uvoľňujúcej rastový hormón vedie k zvýšeniu telesnej hmotnosti a ku zvýšeniu produkcie mlieka, ak sa po podaní dosiahne dostatočné zvýšenie hladiny rastového hormónu. Okrem toho je treba poznamenať, Že zvýšenie hladiny rastového hormónu u cicavcov sa môže dosiahnuť pomocou bežne známych činidiel uvoľňujúcich rastový hormón, ako sú napríklad v prírode sa vyskytujúce hormóny uvoľňujúce rastový hormón.

Toto zvýšenie hladiny rastového hormónu u cicavcov je rovnako možné dosiahnuť aplikáciou peptidov uvoľňujúcich rastový hormón, ktoré sú známe zo súčasného stavu techniky patentov

223 021,

226 857,

228 157,

228 158,

41G 512, 4 410 napríklad f

513,

4 223 019,	4	223	020,
228 155,	4	228	156,
4 411 890,	4	839	344.

Podľa súčasného stavu tec hniky boli na zvýšenie hladiny rastového hormónu takisto použité protilátky endogénneho

inhibítora uvoľňovania rastového hormónu, somatostatínu (SRIF).

Podľa tejto metódy sa hladina rastového hormónu zvyšuje odstraňovaním endogénneho irihibítorá uvoľňovania rastového hormónu (SRIF) ešte predtým, ako sa dostane k hypofýze, kde inhibuje uvoľňovanie rastového hormónu.

Každá z týchto metód, pri ktorej sa promotuje zvyšovanie hladiny rastového hormónu, vyžaduje použitie látok, ktorých syntéza a/alebo izolovanie v stave dostatočne čistom na to, aby tieto látky mohli byť podávané určeným zvieratám, je nákladné. V tejto oblasti teda vzniká potreba vyvinúť relatívne jednoduché n polypeptidové zlúčeniny s krátkym reťazcom, ktoré by mal i schopnosť promotovať uvoľňovanie rastového hormónu, pretože takéto zlúčeniny by bolo možné ľahko pripraviť bez vynaloženia veľkých nákladov, ďalej by také zlúčeniny boli ľahko modlíikovateľné chemicky a/alebo fyzikálne, a takisto by ich bolo možné ľahko vyčistiť a formulovať. Ďalšou požiadavkou je, aby tieto zlúčeniny. mali výborné vlastnosti z hľadiska ich transportovateľnosti.

Vzhľadom k súčasnému stavu techniky v tejto oblasti je zrejmé, že na promotovanie uvoľňovania a zvyšovania hladiny rastového hormónu v krvi zvierat je potrebné vyvinúť také polypeptidové zlúčeniny, ktoré majú krátky reťazec. Z iného hľadiska by takisto bolo vhodné vyvinúť také polypeptidové zlúčeniny, ktoré by bolo možné využiť na promotovanie uvoľňovania a zvyšovania hladiny rastového hormónu v krvi zvierat.

Podstata vynálezu

Podľa uvedeného vynálezu bola zistená skupina nových polypeptidových zlúčenín, ktoré promotujú uvoľňovanie rastového hormónu u zvierat. Tieto polypeptidové zlúčenina majú obecný vzorec:

Ai -A,-» — Ag -Trp-Agt -A^ -Z v ktorom znamená:

»

Ai

3(NMe) His,

Ao -3(NMe)His

His-Ala,

Ala, kde Ao predstavuje ľubovoľnú v prírode sa vyskytujúcu .L- am í noky s e 1 i n u,

Met(Ο)

DOPA,

Abu alebo

L Aq

Lys, Phe, Tyr, Cys,

Tyi—Ala-Gly-Thr alebo Tyi—DAla-Phe-Sar, .5 í

vo výhodnom vyhotovení predstavuje

Ao ľubovoľnú v prírode sa vyskytujúcu aminokyselinu.

konkrétne A_o predstavuje Ala, Lys alebo Glu,

: Az	znamená^	D Nal
! A3	znamená	Ala,
J A5	znamená	DPhe,
S ' Ä6	znamená	B-G a

lebo G

-i alebo DPhe,

Gly alebo Ser,

D/L^(Me)Phe alebo (NMejDPhe, kde B predstavuje ľubovoľnú v prírode sa. vyskytujúcu

L-amlnokyselinu, dipeptidy ľubovoľných v prírode sa vyskytujúcich aminokyselín a

znamená Arg , iLys, Lys alebo Orn, koncovú skupinu na koncovom uhlíku znamená.

-COOR1 alebo	-CHz OR1
obsahujúcu 1	až asi ú
obsahujúcu 3	až asi
obsahujúcu 2	až as i 8
obsahujúcu 6	až asi
ako R1 , pri	čom tieto
rozdielne),	-GLY-Z'
-Gly-Tyr-Z'	ale bo -A1.
kde Z'	predstav

alebo

-CONR¹ R2 , (P.¹ znamená vodík, alkylovú atómov uhlíka, cykloalkylovú atómov uhlíka, alkenylovú atómov uhlíka alebo arylovú skúpi nu skupinu skúpi nu skúpi nu atómov uhlíka., a R² je definovaný i

substituenty môžu byť rovnaké alebo

-Met-Z' a-Tyr-Z* , uje skupiny

-CHzOR¹(v ktorých R¹

-Lys-Z'

Cys-Z- ,

-CONR¹ R² , -COOR¹ alebo a R² majú rovnaký význam ako bolo uvedené vyäéie) pričom clo skupiny týchto zlúčenín taktiež patria organické a anorganické farmaceutický prijateľné soli odvodené od týchto ρο 1 y pe p t i clov .

Vo výhodnom vyhotovení podľa. uvedeného vynálezu majú peptidové zlúčeniny obecný vzorec:

His-As -Ala-Trp-DPhe—Lys-Nliz

Ao -His—Ab -Ala-Trp-DPhe-Lys--NHz í napríklad) Ala-His-As -Ala-Trp-DPhe-Lys-NHa alebo

A1 a— A- —A1a—ľ rp—DP he— Ly s— N Ha

Podľa ešte výhodnejšieho vyhotovenia predstavuje Aa D Nal .

Tieto peptidové zlúčeniny je možno použiť na promotovanie uvoľňovania a zvýšenia hladiny vo výhodnom vyhotovení sa tieto peptidy používajú u ľudí, pričom týmto subjektom sa podáva účinné množstvo to h t- o pe p t i d u .

Podstata uvedeného vynálezu teda podíva v objavení skupiny niekoľkých polypeptidových zlúčenín s krátkym reťazcom, ktoré promo t u j ú uvoľ ííovani e a zvyšovanie hlad i ny rast ov é ho hormó n u v krvi zvierat. Tieto ktoré patria do rozsahu (ako uvedené) obecným vzorcom:

Ai -Az -A3 -Trp-Ae. -A?> -Z

X .v ktorom

Ai , Aj , Λ3 ,

Ai predstavuje

His, 3(NMe)His (to znamená že irnidazolovýkruh je metylovaný v polohe 3), His-Ala, ,

A_o-3 (NMe) His j i <

kde Ao predstavuje Ľubovoľnú v p ľ' í rode s a vy s ky t u j úc u

Met í O)

DOPA peptidy obecného vzorca

L~A<;

i:

kde L znamená H, DOPA,

Ly s, P he , Ty r, Cy s, i;

Ty r-DA1a-G1y-Phe, Ty r-A1aTyr-DAla-PHé-Gly>

Gly-Thr alebo Tyr-DAla-Phe-Sar, pričom vo výhodnom vyhotovení Ai znamená His, Ala, His-Ala,

Aq-Hís alebo Ala, a ešte výhodnejšie Ai znamená His alebo A_o~His, vo výhodnom vyhotovení predstavuj e

A_o ľubovoľnú v prírode sa.

vyskytuj úcu

L-amínokyselinu.

pričom ešte výhodnejšie A_o znamená Ala, Lys alebo Glu, a podľa ešte

-·. výhodnejšieho vyhotovenia A_o znamená Ala, «

y .í

As znamená D^Nal alebo DPhe, pričom vo výhodnom vyhotovení Ας znamená D/^Nal, . A3 znamená Ala, Gly alebo Ser, pričom vo výhodnom vyhotovení A3 znamená Ala,

A5 znamená DPhe, D/l/^(Me)Phe alebo (MMe)DPhe, pričom vo výhodnom vyhotovení A$ znamená DPhe,

Ac znamená B-G alebo G, kde B predstavuje ľubovoľnú v prírode sa vyskytujúcu L-amínokyselinu, dipeptidy ľubovoľných v prírode sa vyskytujúcich aminokyselín (ako je napríklad Ala-Lys, Ala-Ala, Ala-Leu) alebo

H₂ N-(CH₂ )n“CO₂ H, kde n = 2 - 12 a

G znamená Arg, iLys, Lys alebo Orn, pričom vo výhodnom vyhotovení Ac znamená G, Ala-Lys alebo Ala-Ala-Lys, a podľa ešte výhodnejšieho vyhotovenia A.? predstavuje G, najvýhodnejšie A$ predstavuje Lys, znamená koncovú skupinu na koncovom uhlíku polypeptidového reťazca alebo aminokyselinu alebo aminokyseliny na koncovom •uhlíku plus koncovú skupinu, pričom 2 je -CONR¹ R² , -COOR¹ alebo -CHz OR¹ , kde PJ znamená vodík, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až asi 6 atómov uhlíka, cykloalkylovú skupinu obsahujúcu 3 až asi^;' 8 atómov uhlíka, alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až asi 8 atómov uhlíka alebo arylovú skupinu obsahujúcu 6 až asi 12 atómov uhlíka, a R² je definovaný ako R¹, pričom tieto substituenty môžu byť rovnaká alebo rozdielne).

pričom vo výhodnom vyhotovení R¹ znamená H alebo alkylovú skupinu obsahujúcu i až asi 6 atómov uhlíka, a

Z môže taktiež Znamenať -GLY-Z' , -Met-Z' , -Lys-Z' , -Cys-Z· , -Gly-Tyi—Z' alebo -Ala-Tyr-Z* , kole Z' predstavuje skupiny -CONR¹ R² , -COOR¹ alebo -CHz OR¹ (v ktorých R¹ a R² majú rovnaký význam ako bolo uvedené vyššie), vo výhodnom vyhotovení Z predstavuje skupiny -CONR¹R², -COOR¹ alebo -CHz OR¹ ·

Do rozsahu uvedeného vynálezu taktiež patria farmaceutický prijateľné organické alebo anorganické adičné soli odovedené od j · ľubovoľných vyššie uvedených i

’ Použité skratky pre štandardnému označeniu podľa po1y pepti dov.

zbytky aminokyselín zodpovedajú peptidovej nomenklatúry :

	Gly Tyr	=	glycín L-1 i rozí n
1		íle	=	L-izoleucín
4 'i		Glu '	=	L-glutamová kyselina
r '		Tr	=	L-treonín
Č		Phe	=	L-f eny1alanín
;; >		Ala	=	L-alanín
r		Lys	-	L-lyžin
5		Asp	-	L-aspartova kyselina
j	-X	Cys	-	L-cysteín
		Arg .		L-arginín
í		Gin		L-glutamín
i í		Pro	=	L-prolín
r		Leu	=	L-1e ucí n
<5		Met	=	L-metionín
5		Ser		L-serín
5 $		A s n	=	L-asparagln
Ί		His	=	L~histidín
I		Trp	-	L-tryptoíán
i		Val	=	L-val ín
R
á
ä
c·? 31
ä
i
i
d

DOPA	= 3,4-dihydŕoxyfeňýläí áriín
Met(0)	~ metionínsulfoxid
Abu	= oC-aminomáselná kyselina
iLys	= N^-izopropy1-L-lyzín
4-Abu	= 4-aminomáselná kyselina
Orn	= L~orní tín
D Nal	- o(-naíty 1-D-alanín
D Nal	= 4~nafty1-D-alanín
Sar	= sarkozín

Uvedené tri písmená označujúce skratku ktorými je uvedené písmeno D.

znamenajú, že sa jedná o koníiguráciu zbytku aminoyseliny a skratky, pred ktorými je uvedené označenie D/L” označujú zmes D- a L-koníigurácie uvedenej aminokyseliny.

Pr'e účely uvedeného vynálezu sa predpokladá, že glycin j e zahrnutý pod označením v prírode sa vyskytujúce L-aminokyseliny.

Bázické, neutrálne, alebo kyslé zbytky ami nokyse1 i ny, ktoré sa môžu použiť pre aminokyseliny Ai , A3 , As a Af. , predstavujú zbytky so značnou možnosťou kontrolovania í y z i k á 1 n o - c h e m i c k ý c h vlastností požadovaného konečného peptidu. Táto í 1exibi1ita poskytuje významnú formulovaní apli kovaní požadovaného peptidu ľ ubovľnému subjektu. Ďalšie rozšírenie flexibility je možné rovnako dosiahnuť vhodným výberom zbytkov čím sa ďaľéie zlepšenie kontroly íyzikálno-chemických vlastností požadovanej zlúčeniny.

Pri výhodnej realizácii podľa vynálezu sa pri praktickej aplikácii ako zlúčenín produkujúcich rastový hormón používajú nasledovné látky :

Ai-Az-Ala-Trp-DPhe-As-2, ako

A_o-His-Az-Ala-Trp-DPhe-Aó ~2,

His-Ala-Az-Ala-Trp-DPhe-Ac-2,

Ala-Az-Ala Trp-Dphe-A©-2, a

His-Az -Ala. Trp-D.Phe--Ac-2, a organické, alebo anorganické adičné soli odvodené od týchto zlúčenín. Pri výhodnej realizácii podľa vynálezu predstavuje A₂ D Mal. Ešte výhodnejšími zlúčeninami sú

A q -H i s- lA Nal-Ala-Trrp-DPhe~Lys~NH2 (najmä (Ala-His-DANal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHs), a His-T^Nal--Ala . Trp. DPhe-Lys-NHz , a oranické, alebo anorganické adičné soli odvodené od ľubovoľného 'Z uvedených peptidov.

Tieto zlúčeniny podľa uvedeného vynálezu sa obvykle ľahko pripravujú, prejavujú schopnosť promotovať zvýšenie hladiny rastového hormónu v sére a sú vhodné pre bežné komerčné využitie a výrobu v priemyslovom meradle. Okrem toho je treba uviesť, že tieto zlúčeniny podľa vynálezu sú výhodné rovnako aj z toho hľadiska, že ich fyzikálnochernické vlastnosti sú vhodné pre účinné aplikovanie na široký okruh zvierat v dôsledku ílexibility týchto polypeptidových zlúčenín, ktoré sa dosahuje rôznymi substitúciami na rôznych polohách týchto polypeptidových zlúčenín, výberom N-koncových, C-koncových a centrálnych častí týchto polypeptidových zlúčenín, ktoré môžu byť polárnej, neutrálnej, alebo nepoláme j povahy, takým spôsobom, aby boli kompatibilné s požadovanou metódou aplikácie. Tieto peptidy obvykle prejavujú vysoký stupeň účinností pri promotovanl zvýšenia hladiny rastového hormónu v sére v porovnaní s väčšinou ekvivalentných peptidov s rôznymi zbytkarni aminokyselín na A₂-polohe. Uvedené D Nal peptidy obvykle predstavujú najvýhodnejšie zlúčeniny vzhľadom na ich vysokú účinnosť.

Na j výhodne j Sírni peptidmi podľa uvedeného vynálezu sú :

His-DANal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH₂ a Ao~His-Ľ^Na.l-Ala-Trp~DFhe-L.yss-NH2 (ako je ' Ala-His~Iľ^Nal-Ala--Trp-DPhe-Lys-NH2 ) a Ao-His-DPhe-Ala-'Trp-DPhe-Lys-NHs , ako je Ala-HÍB-Dphe-Ala~Trp-Dphe-Lys-NH2. a organickej, alebo anorganickej adičnej soli odvodenej od uvedených zlúčenín.

Pri týchto zlúčeninách sa ukázalo, že prejavujú vysokú .účinnosť, čo sa. týka promotovania zvýšenia hladiny rastového hormónu v sére.

Zlúčeniny podľa uvedeného vynálezu sa môžu použiť na zvýšenie hladiny rastového hormónu v krvi u zvierat, pričom sa u dosiahne zvýšenie produkcie mlieka u kráv, zvýšenie telesnej hmotnosti u zvierat, ako napríklad u cicavcov (to znamená u ľudí, oviec, hovädzieho dobytka a ošípaných) a rovnako i u rýb, hydiny a ďalších stavovcov a kôrovcov, a ďalej zvýšenie produkcie vlny a/alebo srsti u ďalších zvierat. Rozsah prírastkov telesnej hmotnosti závisí na pohlaví a veku daného druhu zvieraťa, na množstve a charaktere podávanej zlúčeniny uvoľfíu j úce j rastový hormón, na spôsobe podávanía a podobne.

Tieto nové polypeptidové zlúčeniny podľa je možné pripraviť obvyklými metódami známymi podľa doterajšieho stavu techniky.

ktoré sa poučívaj ú pre prípravu peptidov v roztoku, alebo metódami podľa doterajšieho stavu techniky.

Syntéza týchto zlúčenín v pevnej fáze sa vykonáva od C-koncovej časti peptidu. Vhodné východzie látky sa. môžu napríklad pripraviť pripojením požadovanej al í a-aminokysel iny ηει chlórrnety lovanú živicu, hydroxymety Lovanú živicu, benzhydry 1 arninovú (BHA) živicu, alebo na para-metyl-benzhydrylamínovú (p-Me-BHA) živicu. Jedna z týchto chlórrnetylových živíc sa predáva pod ochrannou známkou Biobeads SX-1, čo je produkt firmy Eio Rad Laboratories, Richrnond, Kalifornia. Postup prípravy hydroxymetylovej živice je popísaný v Chem.Ind. (Londýn) 38, 1597 (1966), autor Bodansky a kol., pričom postup tu uvedený je možné pre priemyslovú aplikáciu získať od firmy Peninsula Laboratories, Inc.,Belmont, Kalifornia.

Po počiatočnom pripojení je možné chrániacu skupinu alía-aminoskupinu odstráni ť použ i t í m vhodného acidickeho i ϋ reakčného činidla, ako je napríklad roztok kyseliny triíluóroctovej (TFA), alebo kyseliny chlorovodíkovej (HC1) v organickom rozpúšťadle, pričom spracovávanie sa vykonáva pri teplote miestnosti. Po odstránení chrániacej skupiny alía-aminoskupiny sa postupne napoja zostávajúce chránené aminokyseliny v požadovanom poradí. Každá chránená aminokyselina sa obvykle uvádza do reakcie v asi trojnásobnom prebytku, pričom sa používa vhodný aktivátor karboxylovej skupiny, ako je napríklad di cykl ohexy lkarbodi imiel (DCC) , alebo 'diizopropylkarbodiimid (DIC), čo sa vykonáva v roztoku, ako napríklad v roztoku metylénchloridu (CHzCls), alebo dimetylformamidu (DMF), alebo v zmesiach týchto látok.

Po dokončení požadovanej sekvencie aminokyselín je možné požadovaný peptid odätepiť od živicového nosiča spracovaním s takým rekčným činidlom, ako je napríklad fluorovodík (HF), Čím sa dosiahne nielen odštiepenie peptidu od živice, ale rovnako i odbúranie obvykle používaných chrániacich skupín bočného reťazca. V prípade použitia chlórmetylovej živice sa po fluorovodíkovom spracovaní získa voľná peptidová kyselina.

V prípade, že sa použije BHA, alebo p-Me-BHA živica, potom sa po fuorovodíkovom spracovaní získa priamo voľný peptidamid.

Postup vykonávaný v pevnej fáze, ktorý bol popísaný vo vyššie uvedenom texte, je veľmi dobre známy z doterajšieho stavu techniky, viď Stev;art a Yuong, Solid Phase peptid© Synthesis: Second Edn. (Pierce Chemical co., Rockíord, II 1984).

ísiiektoré z metód prebiehajúcich v roztoku, ktoré je možné použiť na syntetickú prípravu peptidových látok podľa uvedeného vynálezu, sú uvedené v publikácii Peptide Synthesis, 2nd Edition, John Wiley & Sons, New York, N.Y. 1976, autori Bodansky a koľ.

Predpokladá sa, že je výhodnejšie vykonávať syntetický postup prípravy uvedenmých peptidov metódou v rozpúšťadlovej fáze, pri ktorej prebieha kondenzačná reakcia prinajmenšom dvoch peptidových fragmentov.

s peptidovýin íracrmentom

IJ-V-W kde.väetky bočné reťazce aminokyselín s výnimkou. Aj sú neutrálne, alebo chránené, a '•r ktorých znamená :

alebo Prot. -A_o , kde Prot.je koncová chrániaca skupina,

Y znamená	Az -Q,	Ala-Az -Q	, Az—A:j ~Q, Ala-Az-A3 ~ Q, A?-A3-A4 - Q
A1 a- A2 — A.3 ~ A4 ~ Q,	Ala-Q	alebo -Q,	pričom
ak Y je Q,	potom	U je J-Az	-A3 -A4 alebo
J A1 a. A2 Aa A4 ,

ak	Y	je	Ala-Q, potom U je J-A2-A3-A4,
ak	Y	je	Aj-Q alebo Ala-Az-Q, potom fJ je J-A.3-A4,
ak	Y	je	A2-A3-Q alebo Ala-Az-A3-Q, potom 'J je J-A4 ,
ak	Y	je	Az-A.3-A4--Q alebo Ala-Az-A3-A4 - Q, potom U je J,

V je	A& ,	alebo Z, pričom
ak V	je	As , potom V/ je As	-Z alebo Z,
ak V	je	2, potom nie je	prítomný,

Ai , Ae> , Ae , a Z majú rovnaký význam ako bolo uvedené vyéčie. V uvedenom prípade Az znamená D^Nal alebo DPhe a A4 je Trp.

Q je koncová karboxyskúpina peptidového fragmentu, pričom predstavuje -ΌΡ.³ alebo -M, kde M je zbytok ktorý j e schopný nahradiť nukleoíilné Časti obsahuj líce

P.³ je vodík, alkýlová skúpi na obsahuj úca j eden až asi .10 atómov uhlí ka, arylová skupina obsahujúca.

až atómov uhlíka, alebo aralkylová skupina obsahujúca 7 a.Ž

1'2 atómov uhlíka.

J znamená amínové zakončenie uvažovaného fragmentu, pričom predstavuje vodík, alebo chrániacu skupinu, ktorá nebráni kondenzačnej reakcii, ako je napríklad benzylová skupina.

V ďaľšorn postupe sa odstránia chrániace skupiny.

V alternatívnom prevedení je možné pre ďalšiu kondenzačnú reakciu za účelom prípravy väčšieho peplidu použiť chránený peptid, získaný zhora uvedeným postupom.

Táto výhodná metóda je podrobne j š i e popísaná v patentovej prihláške

Spoje ných štátov podanej

24.júla

1990 autori John

Hubbs a

Parker, s názvom

Procgss íor Synthesizing Peptides”, uvedenej tu. ako odkazový 'materiál.

Do rozsahu uvedeného vynálezu rovnako náleží postup promótovania uvoľňovania a/alebo zvýšenia hladiny rastového hormónu v/ krvi zvierat. Podstata tohoto postupu spočíva v tom, že sa zvieratám podáva účinné množstvo prinajmenšom jedného vyššie uvedeného polypeptidu.

Zlúčeniny podľa uvedeného vynálezu je možné podávať orálne, .parenterálne (intramusku1árne, i.m.) intraperitoneálne (i.p.), intravenózne (i.v.J, alebo subkutánne (s.c.) pomocou injekcií, ďalej nazálne, vaginálne, rektálne, alebo sublinguálne, pričom tieto zlúčeniny je možné formulovať do dávkových foriem, ktoré sú vhodné pre každú jednotlivú metódu podávania. Pri výhodnom uskutočnení podľa uvedeného vynálezu sa používa parenterálne podávanie.

Medzi pevné dávkové íormy pre orálne podávanie patria kapsule, tablety, pilulky, prášky a granule. Pri príprave týchto pevných dávkových foriem sa účinná látka zmiešava prinajmenšom s jedným sacharóza, inertným nosičovým materiálom, ako je napríklad laktóza, alebo Škrob. Tieto dávkové formy môžu rovnako obsahovať, ako je to bežné v obdobných iných prípadoch v tornto odbore, ďaľšie látky okrem uvedených inertných nosičových látok, ako sú napríklad mazivá, napríklad stearat horečnatý. V prípade kapsulí, tabliet a piruliek môže dávková forma rovnako obsahovať tlmiace činidlá. Tabletky a pirulky je’ možné formulovať spoločne s obduketami (čo sú látky napomáhajúce uvoľňovanie účinnej látky v črevách) .

Medzi kvapalné dávkové formy pre orálne podávanie je možné zaradiť emulzie, roztoky, suspenzie, sirupy, elixíry obsahujúce inertné riedidlá, všeobecne známe a používané v tomto odbore, ako napríklad voda. Okrem vyššie uvedených riediacich látok môžu tieto prostriedky obsahovať rovnako pomocnej .látky, ako sú napríklad zmáčacie Činidlá, ernulgačné a suspendačné činidlá a sladidlá, esencie a voňavé prísady.

Prostriedky podľa uvedeného vynálezu pre parenterálne podávanie zahrňujú sterilné vodné, alebo nevodné roztoky, suspenzie, alebo emulzie. Ako príklad nevodných rozpúšťadiel, alebo vehikulov je možné uviesť propylénglykol, polyet-y léngly kol, rastlinné oleje, ako je napríklad olivový olej, ďalej želatína a organické estery používané na injekcie, ako je napríklad etylester kyseliny olejovej. Tieto dávkové formy môžu rovnako obsahovať prídavné látky, ako sú napríklad konzervačné prísady, zmáčacie, emulgaČné a dispergačné činidlá. Tieto prostriedky je možné sterilizovať, napríklad filtráciou cez filter zachycujúce baktérie, pridaním steri .1 izačných Činidiel do týchto prostriedkov, ožarovaním týchto prostriedkov, alebo zahrievaním týchto prostriedkov. Rovnako je možné tieto prostriedky bezprostredne pred použitím pripravovať v prostredí sterilnej vody, alebo v inom sterilnom médiu vhodnom pre injekcie.

Tieto nové zlúčeniny podľa uvedeného vynálezu sú rovnako vhodné na podávanie¹v kombinácii s hormónmi uvoľňujúcimi rastový hormón /ako sú napríklad v prírode sa vyskytujúce hormóny uvľňujúce rastový hormón, analógy a funkčné deriváty týchto látok) a rovnako v kombinácii s inými zlúčeninami, ktoré promótujú uvoľňovanie rastového hormónu, ako su napríklad peptidy uvoľňujúce rastový hormón (viď napríklad patent Spojených štátov amerických č.4 880 778, ktorý je tu uvedený ako odkazový materiál). Tieto kombinácie predstavujú najmä výhodné formy, pomocou ktorých sa podávajú peptidy na uvoľňovanie rastového hormónu podľa uvedeného vynálezu, pretože tieto kombinácie

- 14 promótujú uvoľňovanie omnoho väčšieho množstva rastového hormónu.

ako by zodpovedalo súčtu jednotlivých účinkov pre každú jednotlivú zložku prítomnú v uvedenej kombinácii, to^: znamená, že táto kombinácia poskytuj e ynerejický účinok vzhľadom na jednotlivé z1ož ky.

Ďalšie detai ly podávania kombinácií uvoľ huj úce rast ový hormón sú popísané vo vyššie uvedenom pat e ríte·.

Týmito synergicky pôsobiacimi zlúčeninami sú vo výhodnom uskutočnení vynálezu zlúčeniny, ktoré účinkujú, ako agonisti receptora hormónu, alebo ''inhibujú účinok soinatostatínu. Tento synergizmus môže byť nemu dochádzať medzi zlúčeninou podľa synergicky účinnou látkou, alebo môže synergicky účinná zlúčenina. Množstvo kombinácia polypeptidov podľa v širokých medziach v závislosti na konkrétnom zvierati, ktoré na vek a pohlavie, na podávania a na tom, polypept. i dov sa ovšem používa taká alebo zvýšenia sa podáva táto pe pt i du pohy bu j e telesnej hmotnosti.

spôsobom určiť v danom odbore binárny, to znamená môže k uvedeného vynálezu a jednou byť prítomná viac ako jedna podávaného polypeptidu, uvedeného vynálezu, sa na rôznych .faktoroch, je ošetrované pomocou požadovanom terapeut i ckom aký konkrétny polypept používa. Vo všetkých dávka, ktorá je účinná hladiny rastového látka. Obvykle sa v rozmedzí od 0,1 Výhodné používané empiricky, Čo môže na základe iníormáci ale bo pohybu j e ako naprik1ad týchto peptidov, účinku, na spôsobe id, alebo kombinácia tých t o pr1padoch sa na promótovanie uvoľňovania hormónu v krvi zvieraťa, ktorému táto dávka celkovo podávaného μ-g do 10 mg na kilogram množstvo je možno jednoduchým urobiť každý odborník pracujúci í uvedených v tomto opise.

Napríklad v prípade podávania uvedených látok ľudom, ak sa použije intravenózne podávanie, sa výhodné množstvo pohybuje v rozmedzí od asi O,1 μg do asi 10 μg celkového množstva polypeptidu na kilogram telesnej hmotnosti, podľa ešte výhodnejšej aplikácie je toto množstvo v rozmedzí od asi 0,5 p.g do asi 5 pg celkového množstva polypeptidu na kilogram telesnej hmotnosti a ešte výhodnejšie je toto množstvo v rozmedzí od asi

0,7 pig do asi

3,0 pg celkového množstva polypeptidu na. kilogram telesnej hmotnosti. V prípade, sa používajú kombinácie obsahujúce peptidy uvoľňujúce rastový hormón, potom je možné použiť nižšie množstvo tohto peptidu. Napríklad je možné uviesť, že v prípade kombinovania peptidu podľa uvedeného vynálezu napríklad so synergicky pôsobiacou zlúčeninou zo skupiny I podľa patentu Spojených Štátov amerických č. 4 880 778, ako je napríklad GURU, potom sa výhodné množstvo peptidu podľa uvedeného vynálezu pohybuje v rozmedzí od asi 0,1 pg do asi 5 pg ( ako je napríklad

Ala-His D^Nal-Ala Trp-DPhe-A<;-Z

Ala-His-DPhe-Ala-Trp-Dphe-A<; ~Z alebo

His-D$ Nal-Ala-Trp-DPhe-Zts-Z) na kilogram telesnej hmotnosti, pričom množstvo synergicky pôsobiacej zlúčeniny (ako je napríklad GHRH) sa pohybuje v rozmedzí od asi 0,5 pg do asi 15,0 pg na kilogram telesnej hmotnosti, podľa ešte výhodnejšieho vyhotovenia vynálezu v rozmedzí od asi 0,1 pg do asi 3 pg a množstvo synergicky pôsobiacej zlúčeniny je v rozmedzí od asi 1,0 pg do asi 3,0 pg na kilogram telesnej hmotnosti.

V prípade použitia orálneho spôsobu podávania je potrebné použiť väčšie množstvo polypeptidu.

Napríklad v prípade orálneho spôsobu podávania u ľudí sa dávkové množstvo obvykle pohybuje •v rozmedzí od asi

30pg do asi kilogram telesnej hmotnosti.

podľa ešte výhodnejšieho vyhotovenia je toto množstvo v rozmedzí od asi 70 pg do asi 500 pg celkového podielu polypeptidu na kilogram telesnej hmotnosti, podľa ešte výhodnejšieho vyhotovenia je toto množstvo v rozmedzí od asi 100 g do asi 350 g celkového podielu polypeptidu na kilogram telesnej hmotnosti, podľa ešte výhodnejšieho vyhotovenia je toto množstvo v rozmedzí od asi ,100 pg do asi 350 pg celkového podielu polypeptidu na kilogram telesnej hmotnosti a podľa ešte výhodnejšieho vyhotovenia je toto množstvo od asi 200 pg do asi 300 pg celkového podielu polypeptidu na kilogram telesnej hmotnosti. U kráv je potrebné použiť približne rovnaké dávkované množstvo polypeptidu ako u ľudí, zatiaľ čo u potkanov sú potrebné vyššie dávky. Presné dávkované množstvo sa dá ľahko určiť empirickým spôsobom na základe iníormácil uvedených v tomto opise.

Všeobecne je možné uviesť, ako už rovnako bolo uvedené vygäie, že pri podávaní kombinácie obsahujúcej peptidy uvoľňujúce rastový hormón, je možné použiť nižSie dávky jednotlivých zlúčenín uvoľňujúcich rastový hormón v porovnaní s dávkami nutnými v prípade jednotlivo použitých zlúčenín uvoľňujúcich rastový hormón za účelom dosiahnutia rovnakého účinku vzhľadom na synergické pôsobenie dosahované v prípade použitia uvedenej kombinácie.

Do rozsahu uvedeného vynálezu rovnako patria prostriedky obsahujúce ako ilčinnú látku organickú, alebo anorganickú adičnú soľ odvodenú od vyééie uvedených polypeptidov a kombinácie týchto látok, poprípade spoločne s nosičovárn materiálom, riedidlom, matricou s pomalým uvoľňovaním alebo povlakom.

Do skupiny organických, alebo anorganických adičných soli odvodených od zlúčenín uvoľňujúcich rastový hormón podľa uvedeného vynálezu, ktoré patria do rozsahu tohoto vynálezu, je možno zaradiť soli organických častí, ako je napríklad acetát, triíluóracetát, oxalát, valerát, oleát, laurát, benzoát, laktát, tosylát, citrát, maleínan, íumarát, sukcinát, vínan, naítenát a podobné ďalšie zbytky, a ďalej anorganické Časti, ako sú prvky zo skupiny I (to znamená soli alkalických kovov), skupiny II (to znamená soli kovov alkalických zemín), amónne a protamínové soli, .zinok, železo a podobné ďalšie prvky s opačnými iónmi, ako je napríklad chloiricl, bromid, síran, fosforečnan a podobné ďalšie ióny a rovnako tak i s organickými časťami uvedenými vyššie.

Farmaceutický prijateľné soli predstavujú výhodné zlúčeniny v prípadoch, keď sa tieto látky podľa uvedeného vynálezu podávajú ľuďom. Medzi tieto soli je možé zaradiť netoxiocké soli alkalických kovov.

kovov alkalických zemín a amónne soli, ktoré sa bežne používajú a pripravujú vo farmácii, pričom týmito soľami sú napríklad sodné sol i , draselné soli,

Utne soli, vápenaté soli a protamínové soli, pripravované metódami bežne známymi zo súčasného dostupného stavu techniky. Do rozsahu tohto termínu sú tiež zahrnuté netoxické adičné soli s kyselinami, ktoré sa

- . 17 obvykle pripravia reakciou zlúčenín podľa uvedeného vynálezu s vhodnou organickou alebo anorganickou zlúčeninou.

Ako reprezentatívny príklad týchto solí je možné uviesť hydrochloridy, hydrobrontidy, sulfáty.

oxaláty, benzoáty, laktáty, mal e í nany , í umaráty , suke i náty, fosfáty, tosyláty, citráty,

,_% Príklady uskutočnenia vynálezu

Polypeptidové zlúčeniny podľa uvedeného vynálezu a postup i

ich prípravy budú v ďalšom ilustrované pomocou konkrétnych

V príkladov, ktoré však nijako neobmedzujú rozsah tohto vynálezu.

Príklad 1

Postup syntézy pept-idov uvoľňujúcich rastový hormón.

Podľa tohto vyhotovenia sa postupovalo tak, že sa hyd roch1ori d paramety1 be n zhyd ry1am í nove j (pMe-BHA.HCL/ živice umiestni 1 do reakčnej n ádoby bežne obchodne dostupného.

automaticky pracú j úceho zariadenia na.

syntetickú pri pravú peptidov.

Táto živica sa substituovala voľ nými amínovými skupinami v rozsahu, až asi mmólov na grram.

Zlúčeniny sa pripravili nakondenzovanírn jednotlivých aminokyselín, pričom sa vychádzalo od konca peptidovej sekvencie s karboxylovou skupinou, za použitia vhodného aktivačného činidla, ako je napríklad N,N· - dičyklohexylkarbodiimid (DCC). Alía-aminoskupina jednotlivých aminokyselín bola chránená napríklad t-butoxykarbony.lovým zbytkom (t-Boc), pričom reakčné funkčné skupiny bočného reťazca boli chránené spôsobom uvedeným v nasledujúcej tabuľke č. 1.

Tabuľka č. 1

Chrániace skupiny bočného reťazca vhodné pre syntézu peptidou v pevnej íáze.

arginín	M'-' -tosyl
kyselina aspartová	O.....benzyl
cysteín	S-para-mety i benzy1
glutámová kyselina	0-benzyl
histidin	I\J1 m-+.osyl
lyzin	Nt- 2,4-dichlórbenzyloxy1karbony1
metionln	S-sulíoxid
šerí n	Q-benzyl
tréonín	O-benzyl
tryptofán	N1 m-íorrnyl
ty roz í n	O-2,6-d i ch1orbenzy1

Eäte pred pridaním prvej aminokyseliny bola živica premiešaná s dichlórmetánom t CH:

)Ls ; asi 1 Orní/g r am živice), potom bola neutrál izovaná (DIEA) premiešaním v t r oc h cy k 1 oc h (v každom cykle počas minút) v d i c h1órme t áne (v pomere 10:90;

asi 10 ml/gram živice) a potom bol tento podiel premiešaný v troch cykloch (zakaždým asi jednu minútu) dichlórmetánom (v množstve asi 10 ml/gram živice). Prvá aminokyselina a každá ďalšia aminokyselina bola nakondenzovaná na živicu za použitia predtým pripraveného symetrického anhydridu, za použitia asi trojnásobku vhodne chránenej aminokyseliny vzhľadom k celkovej väzbovej kapacite živice a asi 1,5-násobku DCC vzhľadom k celkovej väzbovej kapacite živice vo vhodnom množstve dichlórmetánu. V prípade aminokyselín s malou rozpústnostou . v dichlórmetáne bol pridaný N,N-dimety1 formamid (DMF) za účelom dosiahnutia homogénneho roztoku. Všeobecne možno konštatoval, že symetrický anhydrid bol pripravený až 30 minút pred zavedením do reakčnej nádoby pri teplote miestnosti, alebo pri teplote nižšej. Dicyklohexy lrnočovina, ktorá sa tvorila počas prípravy symetrického anhydridu bola odstránená odfiltrovaním roztoku pri gravitačnom spáde do reakčnej nádoby. Priebeh kondenzácie aminokyseliny na živicu bol monitorovaný obvyklým spôsobom za použitia bežne používaného farebného testu a reakčných činidiel, ako je napríklad ninhydrín (ktorý reaguje s primárnymi ''a sekundárnymi amínmi). Po dokončení kondenzácie chránenej aminokyseliny na živicu ( >99?ó ) bola chrániaca skupina alfa-aminokyseliny odstránená spracovaním s a.cidickým reakčným *

činidlom (alebo činidlami). Všeobecne používané reakčné činidlo pozostávalo z roztoku tri í 1uóroctovej kyseliny (TFA) a anizolu v dichlórmetáne (v pomere 45 : 2 : 53) . Úplný postup pripojovania každého jednotlivého zbytku aminokyseliny na živicu je uvedený v nasledujúcej tabuľke č. 2.

Tabuľka č. 2

Postup pripojovania jednotlivých aminokyselín na Živicu

Reakčné činidlo

Miešacie cykly

Doba miešania v jednom cykle

1	1 .	d i c h 1 ór m e t án	3	1	minúta
	2.	TFA, anizol,
* .			dichlórmetán	1	2	minúty
		3.	TFA, anizol,
			dichlórmetán /45:2:53/	1	20 minút
		4.	dichlórmetán	'y	1	minúta
		5.	DIEA, dichlórmetán /10:90/	3	2	mi núty
		6.	dichlórmetán	3	1	minúta
		7.	predtým pripravený
			symetrický anhydrid	1	1	5-120 minút*
		3.	dichlórmetán	3	1	mi núta
1		9.	izo-propanol	3	1	minúta
		10.	dichlórmetán	S	1	minúta
		11 .	monitorovanie priebehu
			kondenzačnej reakcie**
		12.	opakovanie stupňov 1-12
	‘x		pre každú jednotlivú

aminokyselinu * - doba kondenzácie závisí na jednotlivej aminokyseline ** - mieru kondenzácie je možné obecne monitorovať .farebným testom. V prípade, Že je kondenzácia neúplná, môže byť tá istá aminokyselina opätovne kondenzovaná tak. Že sa opakuje postup podľa stupňov 7-11, V prípade, že je kondenzácia úplná, je možné kondenzovať ďalšiu aminokyselinu.

ô J.

Pomocou tejto vyššie uvedenej syntézy peptidov je možné podľa uvedeneho vynálezu pripraviť nové poiypeptidy viazané na živicu, ktorými sú pol y pept i dy obecného vzorca:

Αι - D Nal-A₃-Trp-A_s.-A«-R a

Ai -DPhe-A₃ -Trp-A& -A<·. -R (v ktorých majú Ai

A.3 , Aj ,

A<. rovnaký význam ako bolo uvedené hore a R predstavuje polymérnu živicu, pričom funkčné skupiny základných aminokyselín sú pri padne chránené vhodnými chrániacimi skupinami ) .

Ako príklad špeci .f ických sekvencií (vo vhodných chránených formách), ktoré boli takto podľa uvedeného vynálezu pripravené, je možno uviesť nasledujúce sekvencie:

H i s ~ N a 1 - A1 a - T r p - D F h e - Ly s Ala-His- Ľ’Í^N a 1 ·- A1 a. - T r p - D P h e - L.y s - K

Ala-His- DT r p- A1 a - T r p -DP he - L.y s - R

H i s-A ia-DT rp-A1a-T rp-DPhe-Lys-R

H i s - D⁰^ N a. 1 -- Ä1 a - T i' p - DPhe-- Ly s - R

H i s - D A s p- A i a - T r p - D P h e - L',' s - R

His-DCys/SMe/' - A1 a-Trp-DP he-Ly s-R

H i s - DT r p - A1 a - T r p - DP h e - A1 a - Ly s - R His~DANal-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-R A1a-His-L^Mal-Ala-Trp-DPhe-Äla-Lys-R T r y - D A r g - P h e - G .1 y - R

A1 a - H i s - DP h e - A1 a - T r p ·- D P h e - Ly s - R

A1 a - H i s - D H i s - A1 a - ľ r p - D P he Ly s - R a.

A1 a - H i s-DPro-A1a- T r p- D P h e - L.y s - R

Príklad L

Uvoľňovanie rastového hormónu in vivo pri krysiach.

K tomuto' testu boli	POUŽit é	nedospelé	samičky	krýs
Sprague-Dawley, ktoré boli	získané	od f i rmy	Charles	R i ver
Laboratories (Wilmington,	MA.) . Po	získaní sž	i tieto	krysy

umiestnili do klietok o teplote

C v k t· o r ý c h porne r cyklov svet1o:tma bol

14:10 hod in. Tým t o kry sám bola k dispozícii voda a potrava Purina podľa ľubovôle. Mláďatá sa umiestnili spoločne s ich matkami počas 21 dní .

Potom boli krysy (staré 26 dni), v skupinách po šiestich anestetizované i n t raper.it oneá.l ne podaním 50mg ·'' kg pentobarbi tal u,. čo bolo prevedené 20 minút pred intravenóznym podaní peptidu. Pre tieto intravenózne injekcie (i.v.) obsahujúce peptidy bol použitý ako vehikulurn normálny slaný roztok obsahujúci 0,1% želatí ny.

Týmto anestetizovaným krysám gramov boli potom pomocou i . v. i n j e kci ou podá né zlúčeniny u v o 1 íi u j ú c e r a s t o v ý hormón v množstve podľa ďalej uvedených

Injekcie boli prevedené do jugulárnej žily, pričom množstvo injekčného roztoku zodpovedalo Ú, 2 mililitrom.

Všetky zvieratá boli potom usmrtené na tonzilotome 10 minút po podaní poslednej injekcie (viď. tab.

3,4). Po dekapitácii bola odobraná krv trupu pre stanovenie hladiny rastového hormónu v krvi.

Potom sa haná. krv skoagulovať, ďalej bola odstredená.

bolo oddelené od zrazeniny.

Toto sérum bolo potom uchovávané v zmrazenom stave až do vykonania rádioimunologického stanovenía (RIA) hladiny rastového hormónu, čo bolo urobené podľa ďalej popísanej metódy, ktorá bola vyvinutá National Inštitúte oí Arthritis, Diabetes and Digestive and K i n d n e y D i s e a s e s ( N J. ADDK') .

Reakčné činidlá sa obvyklým spôsobom pridali do trubíc pre

RIA stanovenie naraz s teplotou, pri ktorej boli uchovávané v mrazničke (asi 4 ^r-'C), pričom sa postupovalo nasledovne :

a/ puíer b/ studený (t.zn. nerádioaktívnyštandard alebo neznáma vzorka séra, ktorá m á. by ť a n a 1 y z ov a n á c/ rádiooznačený jódovaný antigén rastového hormónu

Pridanie reakčných činidiel sa obvykle vykonáva tak, aby sa dosiahlo zriedenie asi 1 30 000 (tzn. pomer antiséra k celkovému objemu kvapaliny, v jednotkách objem/objem).

Tieto zmiešané reakčné činidlá bo.li potom obvyklým spôsobom inkubované pri teplote miestnosti (asi 25·C) približne 24 hodín, potom bola pridaná druhá protilátka (tzn. kozie alebo králičie anti-opičie gama globulínové sérum), ktorá sa viaže na antisérum rastového hormónu a spôsobuje vyzrážanie takto vzniknutého 'komplexu. Vyzrážaný podiel v trubiciach pre P.I A-stanovenie bol potom analyzovaný na počet pulzov v špecifických časových i periódach, čo bolo prevedené v gama-scinti lačnom počítači. Potom

·. bola vytvorená Štandardná krivka vynesením počtu rádioaktívnych pulzov proti úrovni rastového hormónu (GH). Hladina rastového hormónu pri neznámych vzorkách bola potom stanovená podľa tejto . štandardnej krivky.

Hladina rastového	hormómu v	sére	bo L a z i s ťova n á	metódou	RIA
za pomoci reakčných	činidiel	dodaný	ch Mational	Hormone	and
Pituitary Program.
Hladiny séra v tabuľkách 3,	4, 5,	6 sú uvádzané	v ng/ml	pri

GH-štandarde 0,61 medzinárodných jednotiek/mg (tzn. I'J/mg) . Hodnoty sú uvádzané so strednou +/- Štandardnou odchýlkou od priemernej hodnoty (SEM). Štatistická analýza sa vykonala pomocou Študentovho t-testu. Označenie NE znamená to, že odchýlka nebola štatisticky významná. Výsledky uvedené v tabuľkách 3, 4, 5 a 6 predstavujú priemer testov so Šiestimi krysami.

TABUĽKA č. 3

Uvoľňovanie ras tového hormonu in vi vo (rig/ml.) promotované zlúčeninami uvoľňujúcimi rastový hormón u krýs anestetizovaných pentoba rbi ta lom.

(Zvieratá usmrtené 10 minút po poslednej injekcii)

j Stĺpec A: i 1 ( Zlúčeniny , . uvoľňujúce rastový hocmon j J * í ,	Celková dávka (/vg)	GH u kontrolnej vzorky (ng/ml)	GH uvoľnený zlú- čeninou v stĺpci A (ng/ml.)^SEM	p- hodnota
i His-DTrp-Ala-	0,1	151+16	246139
I Trp-DPhe-Lys-	0,3	151116	670175	-
j NH2	1,0	151116	10001276	-
í J	3,0	151+16	21061216	-
His-D^Nal-Ala-	0,1	151116	9381255	<0,02
Trp-DPhe-Lys-	0,3	151+16	17161258	<0,02
j ‘ NH2	1,0	151116	37281691	<0,01
3	3,0	151116	32381273	<0,01
S : His-DTrp-Ala-	o,i	138112	226131	-
i s Trp-DPhe-Lys-	0,3	138112	613173	-
1 NH2	1,0	138112	15811228	-
$	3,0	138112	2875+393	-
j Ala-His-DTrp-	0,1	138112	254+78	NS -
í Ala-Trp-DPhe-	0,3	138112	809+59	NS -
| Lys-NH2	1,0	138112	1516+215	NS -
•t	3,0	138112	3095+473	NS -

TABUĽKA č. 3 (pokračovanie)

Stĺpec A:	Celková	GH u kon-	GH uvoľ- p-
Zlúčeniny	dávka	trolnej	nený zlú- hodnota
uvoľňujúce	(A9)	vzorky	čeninou
rastový hormón		(ng/ml)	v stĺpci A (ng/ml )j;SEM

Ala-His-	0,1	138112	11281309	<0,02	<0,02
D^Nal-Ala-	0,3	138+12	2479+389	<0,001	<0,001
Trp-DPhe-	1,0	138+12	38991514	0,001	0,001
Lys-NH2	3,0	138112	42021369	<0,05	NS
Ala-His-	0,1	111+25	360+35	- ’
DTrp-Ala-	0,3	111+25	903+217	-
Trp-DPhe-	1,0	111125	2957+427	-
Lys-NH2	3,0	111+25	39561485	—
Ala-His-	0,1	111+25	970+169	<0,01
D^Nal-Ala-	0,3	111125	2898+247	<0,001
Trp-DPhe-	1,0	111+25	3908+327	NS
Lys-NH2

TABUĽKA č. 4

Uvoľňovanie rastového hormónu in vivo (ng/ml) promotované zlúčeninami uvoľňujúcimi rastový hormón u krýs anestetizovaných pentobarbitalom.

(Zvieratá usmrtené 10 minút po poslednej injekcii)

s,	Stĺpec A: Zlúčeniny uvoľňujúce rastový hormón	GH u kontrolnej vzorky (ng/ml)	Celková dávka	GH uvoľnený zlúčeninou v stĺpci A (ng/ml)+SEM
	Ala-His-DTrp-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2	111±25	0,3	9O1±21
	Ala-His-DPhe-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2	181+69	0,3	616+74
•	Ala-His-DHis-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2	117±19	0,3	268±54
«	Ala-His-DPro-Ala-Trp- DPhe-Lys-NH2	117±19	0,3	262±51

TABUĽKA č. 5

Peptid	Celková >	GH Ui kon-	Uvoľnený
	dávka	trolnej	GH
	Qag)	vzorky (ng/ml)	(ng/ml)

His-DAsp-Ala-Trp-	1,0	150120	154163
DPhe-Lys-NH2	3,0	150120	155134
	10,0	150120	163144
	30,0	150.120.	224162
	100,0	150120	178183
His-DCys-(SMe)-Ala	0,3	181169	178128
Trp-DPhe-Lys-NH2	1,0	181169	193128
	3,0	181169	180134
His-D*Nal-Ala-	0,1	151116	280+70
Trp-DPhe-Lys-NH2	0,3	151116	439+122
	1,0	151116	1130+179
	3,0	151116	2319+139
His-Trp-Ala-Trp-	0,1	181169	512143
DPhe-Lys-NH2	0,3	181169	566+114
	1,0	181169	1531+303
	3,0	181169	2349+267
His-DTrp-Ala-Trp-	0,1	220129	4201105
DPhe-Ala-Lys-NH2	0,3	220129	9001163
	1,0	220129	19651366
	3,0	220129	45531670

TABUĽKA č. 5 (pokračovanie)

Peptid	Celková dávka <>g)	GH u kontrolnej vzorky (ng/ml)	Uvoľnený GH (ng/ml)
His-D^Nal-Ala-Trp-	0,1	111125	484189
DPhe-Ala-Lys-NH2	0,3	107116	9711241
	1,0	107116	15931359
	3,0	107116	33371583
His-Ala-DTrp-Ala-	0,1	111125	-
Trp-DPhe-Lys-NH2	0,3	151116	261132
	1,0	151116	8301103
	3,0	151116	25881341

Ξ výsledkov uvedených v tabúľkách č.3, a t je zrejmé.

že zlúčeniny podľa uvedeného vynálezu promotujú uvoľňovanie rastového hormónu a zvyšovanie hladiny tohto rastového hormónu v krvi krýs, ktorým boli tieto zlúčeniny podané. Peptidy podľa uvedeného vynálezu vykazujú túto aktivitu, pričom ekvivalentné zlúčeniny so substitúciou na A3 - polohe [tzn. napríklad s DAsp, DCys(SMe),DHis a DProJ neprejavujú túto aktivitu. Z vyššie uvedených tabuliek je taktiež zrejmé, že

His-D/^Nal-Al a-Trp-DPhe-Lys-NHz je aktívnejší než zlúčeniny ktoré majú DTrp,

D Nal, DAsp a DCys(3Me) na A,2-polohe. Podobne je možno uviesť, že

A1 a- H i s -D^ Na 1 - A1 a- Tr p- DP he - Ly s - N Hz je aktívnejší než ekvivalentná DTrp-zlúčenina.

Príklad J

Podávanie kombinácie obsahujúcej zlúčeniny uvoľňujúce rastový hormón (GH).

Postup podľa príkladu 2 bol opakovaný s tou výnimkou, že krysy neboli anestetizované ani neboli predtým ošetrené pentobarbitalom, pričom týmto krysám sa podala kombinácií», obsahujúca peptidy podľa vynálezu. Podané zlúčeniny, dávkované množstvo a získané výsledky sú uvedené v tabuľke č.6.

-31TABUĹKA č. 7

Synergický účinok zlúčenín podľa vynálezu v kombinácii so zlúčeninami zo skupiny 1 a/alebo zo skupiny 3 in vivo u neanestetizovaných krýs.

Podaná	zlúčenina	Dávka (/ug)	Uvoľnený GH (ng/ml) _+SEM
Kontrolní	-	-	1213
175-la	-	-	1	58113
175-1	-	-	3	240+32
Cb	-	-	10	204+50
GHRHC	-	-	3	131150
Tpd	-	-	10	79+29
175-1	GHRH	-	1 + 3	20141224
175-1	TP	-	1 + 10	9871204
175-1	GHRH	TP	1+3+10	41501555
175-1	GHRH	-	3 + 3	1994+249
175-1	TP	-	3 + 10	2149+451
175-1	GHRH	TP	3+3+10	2922+384
C	GHRH	-	10 + 3	2525+453
C	TP	-	10 + 10	1597+387
C	GHRH	TP	10+3+10	4344+374

-30TABUĹKA č. 6

Uvoľňovanie rastového hormonu in vivo iniciované zlúčeninami uvoľňujúcimi rastový hormón u krýs anestetizovaných pentobarbitalom.

(Zvieratá usmrtené 10 minút po poslednej injekcii)

Stĺpec	A:	Celková	GH v kon-	Uvoľnený GH
Peptid	uvoľ-	dávka	trolnom	GH v sére
ňujúci	ras-	(^g)	sére (ng/ml)	(ng/ml)
tový hormón		+SEM (N = 6)	+SEM (N=6)

Ala-His-D^Nal-	0,1	337151	610+90
DPhe-Lys-NH2	0,3	337+51,	11401187
	1,0	337+51	29091257
	3,0	337+51	3686+436
Ala-D^Nal-Ala-	0,3	167146	363+73
Trp-DPhe-Lys-NH2	1,0	167+46	1450+294
	3,0	167+46	2072+208
	10,0	167+46	26981369
Ala-His-DANal-AÍa-	0,3	160151	14181302
Trp-DPhe-Lys-NH2	1,0	160+51	2201+269
Ala-His-D^Nal-Ala-	0,3	228+23	17461318
Trp-DPhe-Lys-NH2	1,0	228123	2610+176
Ala-His-O^Nal-Ala-	0,1	160+36	8221243
Trp-DPhe-Lys-NH2	0,3	160+36	1549+292
	1,0	160+36	2180+284

lúčeníny zo skupín 1

a.

sú popísané detailne v patente

Spojených štátov amerických č. 4 88.0 778 a: 175*1 = Hís-dA Mal-Ala— Trp-DPhe-Lys-NHs (zlúčenina poclľa uvedeného vynálezu), b: C = His-DTrp-.Ala-Trp-.DPhe-Lys-NH₂ (porovnávacia zlúčenina), c: GHRH = Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phes Thr-Asn-Sei—Tyr-Arg-LysVal-Leu-Gly-Gln-Leu-SerA1 a - Arg- Ly s - Le u - Le u - G1 n Asp-I1e—N1e-Ser-Arg-NHs (zlúčenina zo skupiny 1) d: TP = Tyr—DArg—Phe-Gly-NHz (zlúčenina zo skupiny 3)

Z výsledkov uvedených v tabuľke 7 je zrejmé, že zlúčeniny podľa uvedeného vynálezu prejavujú synergický účinok pri podaní spoločne s príkladnými zlúčeninami, vybranými zo skupiny 1 a/aíebo 3. Z týchto uvedených výsledkov v tabuľke 7 je tiež zrejmé, že zlúčeniny podľa vynálezu prejavujú silnejší synergický účinok než je účinok dosiahnutý s porovnávacou zlúčeninou (C), ktorá sa uvádza podľa súčasného dostupného stavu techniky ako zlúčenina so synergickým účinkom.

Príklad 4 .Kondenzačná reakcia peptidových fragmentov pre prípravu peptidu.

Obecný postup:

Teplotu topenia je možno stanoviť na prístroji Thomas Hoover pre stanovenie teploty topenia kapilárnou metódou. Infračervené spektrá (IR) je možné zaznamenať na spektrof otornetri Perkin—Elmer Model 137 alebo Nicolet Model 5DX, pričom hodnoty sa

- .33 uvádzajú v počte vi n (cm'¹). Hmotnostné spektrum (MS) sa stanoví na prístroji VG Análytical Ltd. Model ZAB-1F Mass Spektrometer metódou EI (elektrónového nárazu), FD (desorpcie poľa) alebo FAB (bombardovanie rýchlymi atómami). GCMS je možno zmerať na prístroji Finnigan 4023 GCMS vybavenom 30-rnetrovou DB5 kapilárnou kolónou (J & W Scientific) za použitia hélia ako nosného plynu. Optickú rotáciu je ' možno zmerať na. polarimetri Autopol III, vyrábaným firmou Rudolph Research.

¹ H NMP. spektrá je možné namerať na prístoji JEOL GX-400 NMR pracujúcom pri 400 MHz alebo na prístroji JEOL GX-270 NMR pracujúcom pri 270 MHz. Tieto prístroje sú schopné pracovať s bežným digitálnym rozlíšením menším ako 0,7 Hz. Chemický posun je vyjadrený v dieloch na milión dielov vzhľadom k vnútornému štandardu, ktorým j e 3- (trimety lsi. ly 1) tetradeuteropropi onát sodný (TSP).

Vysokoúčinná kvapalinová chromatografia (HPLC) sa vykonala za použitia systému Hitachi, pozostávajúceho z gradientového regulátora L-500 a čerpadla 650A, pripojeného na semipreparátívnu kolónu 218TP1010. Ako elučné rozpúšťadlo je možné použiť kombináciu vody obsahujúcej 0,2 % kyseliny tri í luóroctove j a metanolu. V obvyklom prevedení sú požadované zlúčeniny eluované prietokovou rýchlosťou & rnl/min so stúpajúcim gradientom organickej zložky rýchlosťou približne 1-2 % za minútu. Zlúčeniny i

sa potom stanovia pri vhodných vlnových dĺžkach za použitia U.V. detektora LKB 2140 s diódovým usporiadaním. Integráciu je potom možné previesť pomocou programu Nelson Analytical Soítware (verzia 3.6).

Reakcie sa uskutočnili pod inertnou atmosférou dusíka alebo argónu, F>okiaľ sa neuvádza, inak. Bezvodý tetrahydroíurán (THF, akosť U. V.) a dimetylformamid (DMF) boli dodané firmou Burdick and Jackson, pričom tieto látky boli priamo odoberané z nádoby.

A. Postup prípravy tripeptidového fragmentu -

- 2HN—Trp-DPhe-Lys(Boe)-NHz

N* —benzyloxykarbony.l- (N’t-butoxykarbonyl) -lyží n-amid, 4.

Podľa roztoku obsahujúcemu karbonyldiimidazol (CDI; 2; 58,24 gramov;

Ú, 544 inólov) a suchý tetrahydrofurán (THF, 1500 mililitrov) o

N^· -benzyloxykarbony 1- (N^ teplote 10 °C pomaly pridávaný

-t-butoxykarbonyl)lyžín (i;

v množstve

180 gramov; 0,474 mólov). Počas tohto prídavku bolo pozorované uvoľňovanie plynu. Zatiaľčo sa tvoril medziprodukt 3, ktorým je -benzyloxykarbony1-(N^-t-butoxykarbonyl)-lyzínimidazolín, bol pripravený nasýtený roztok amoniaku a THF (2000 mililitrov). Čo sa urobilo tak, že plynný amoniak sa viedol tetrahydrofuránom pri teplote v rozmedzí od 5 do 10 °C. Potom, čo sa odhadlo, že vznik medziproduktu 3 prebehol úplne (to znamená.

že vývoj plynu ustal, čo trvalo približne 2 hodiny), sa jedna polovica THF roztoku, obsahujúca medziprodukt 3 pridala k roztoku amoniaku. Zvyšok roztoku obsahujúci medziprodukt 3 sa pridal po 30 minútach. Počas tohto prídavku sa udržoval kontinuálny prúd plynného amoniaku, tento prúd bol udržovaný počas ďalších 45 minút po tornto prídavku. Počas pridávania týchto dvoch podielov roztoku obsahujúceho medziprodukt 3 sa vytvorila biela zrazenina. Takto získaná reakčná zines sa potom ohriala a premiešavala 15 hodín. Použité rozpúšťadlo bolo odstránené: od suspenzie aplikáciou vákua. Získaný zbytok bol suspedovaný vo vode, pričom výsledná pevná látka sa oddelila vákuovou filtráciou.

nS

-ť- - butoxy karbony 1 — ly z í n— am i d,

5.

Podľa tohto vyhotovenia sa roztok obsahujúci lyzínarnid 4 (v množstve 181,48 gramu, čo je 0,479 mólu) v rnetanole (MeOH, v množstve 1000mi) pridával ku katalytickej suspenzii obsahujúcej 5 % Pd/C (v množstve 5 gramov) v rnetanole (250 ml) pod atmosférou argónu. Touto reakčnou zmesou bol potom prebublávaný vodík (počas 15 minút), pričom reakčná zmes sa potom premiešavala pod atmosférou vodíka tak dlho pokiaľ sa HPLC-metódou nezistilo, že reakcia prebehla úplne (36 hodín). Vodíková atmosféra bola potom vymanená argónom. Reakčný roztok bol prečistený prechodom cez vrstvu C'elitu a rozpúšťadlo sa odstránilo za. použitia vákua, čím sa získala pevná látka.

u £

N - benzyloxykarbonyl-D-fenylalany1-(N'-t-butoxykarbony1)lyžínamid, 8

Podľa tohto vyhotovenia

M sa N -benyzloxykarbony1-D-feny1λ alanín (6, v množstve 126,39 gramu, čo odpovedá 0,423 mólom) .4 pomaly pridával k roztoku CDI (2 množstve

66,03 gramu, čo je

0,409 mólov) v THF (500 mililitrov) o teplote o

Počas tohto pridávania, sa pozoroval vývoj plynu.

Potorn, čo vývoj plynu ustal.

sa pridal lyzínámid 5 (v množstve 110,75 crr amu,

0,452 mólom) vo forme roztoku v THF (500 mililitrov)

Po asi 43 hodinách sa takto získaná odstránenia pevných látok. Oddelený íiltrát sa skoncentroval za použitia vákua.

Takto získaný zbytok sa octovej (EtOAc, v množstve 500 mililitrov) a tento podiel sa potorn premyl v deličke nasledujúcim spôsobom:

vodný roztok kyseliny chlorovodíkovej (IN,

500 mililitrov), pH premytého podielu 1 bolo asi 8, nasleuj úce premývacie podiely mali pH 1;

2. voda (500 mililitrov);

vodný roztok uhličitanu sodného Na2CO3 (polovičné nasýtený roztok, podiely 2 x 500 mililitrov) sa sfi.ltroval za účelom oddelenia vzniknutého kryštalického pevného podielu (8);

4. voda (3 x 500 mililitrov).

Organická vrstva sa potom vysušila pomocou síranu horečnatého MgSOj. Po vyčistení sa rozpúšťadlo odstránilo za

J* ú* použitia vákua. Získaný zbytok bol z horúceho EtOAc, čím sa získal druhý podiel vzorky 8.

s

D-íenylalany1-(Ν'-t-butoxykarbonyl)-lyžínamid, 9 potom rekryštalizovaný

Podľa tohto vyhotovenia sa metanólický roztok (v množstve

1500 mililitrov) amidu 8 (v množstve 120,53 gramu.

čo je 0,229 .mólov) pridal ku katalytickej suspenzii obsahujúcej % P d/C (50 gramov) v metanole MeOH (200 mililitrov).

Argdnová atmosíéra sa potom nahradila vodíkom. Potom, čo sa HPLC analýzou zistilo. Že reakcia prebehla úplne (reakcia prebiehala počas asi 4 hodín), sa vodíková atmosféra nahradila argónom. Získaný reakčný produkt sa potom vyčistil priechodom cez vrstvu Celitu, pričom filtrát sa potom skoncentroval za použitia vákua, čím sa získal zbytok.

Tento dipeptidový produkt. sa potom použil priamo pre prípravu tripeptidu 12.

<5

N - benzyloxykarbonyl - tryptofy1-D-fenylalany1 - (Ν' -t-butoxy karbonyl ) lyží namid, 12

Podľa tohoto vyhotovenia sa roztok obsahujúci N -benzyloxykarbonyl-tryptofan (10, v množstve 67,60 gramov, čo je 0,200 mólov), THF (v množstve 500 mililitrov) a CDI (2, v množstve

33,05 gramov, čo je 0,104 mólov) o teplote 10 °C premiešaval tak vývoj plynu. K tejto reakčnej zmesi sal obsahujúci zlúčeninu 9 (v množstve 40,8 mólov) v THF (asi 200 mililitrov). Takto pokiaľ neustal potom pridal roztok am o v

Čo ie O, 103 vzniknutý roztok reagoval počas 15 hodín, pričom sa tento roztok ohrial na teplotu miestnosti. Týmto spôsobom sa vytvorila pevná látka, ktorá bola oddelená vákuovou filtráciou. Získaný filtrát sa potom skoncentroval za použitia vákua, čím sa získal zbytok. Takto získaný zbytok a pevný podiel sa potom opäť spojili a vložili do etylesteru kyseliny octovej EtOAc (v množstve 4080 mililitrov) za mierneho ohrevu. Po ochladnúťí tohto roztoku na teplotu miestnosti vznikol pevný podiel. Tento pevný podiel sa potom oddelil vákuovou filtráciou. Získaná pevná látka bola potom rekryštalizovaná z horúceho metanolu MeOH, čím sa získal čistý tripeptidový produkt 12. Etylacetátový íiltrát (z prvej kryštalizácie) sa potom premyl v deličke nasledujúcim spôsobom:

1. vodný roztok kyseliny chlorovodíkovej (IN, 2 x 500 mililitrov)

2. voda íl x 500 mililitrov) vodný roztok uhličitanu sodného

NajCO3 (polovičné nasýtený roztok.

x 5 0 (ď m i 1 i 1 i t rov)

4.

vodný roztok chloridu sodného (1 x

500 mililitrov)

Organická vrstva sa

vysušila pomocou síranu horečnatého MgS04 a potom sa tento podiel .prečistil vákuovou filtráciou. Rozpúšťadlo z tohto íiltrátu sa potom odstránilo za použitia vákua. Takto získaný- výsledný zbytok sa potom opäť pridal do etylesteru kyseliny octovej, čím vznikol suchý pevný podiel. Tento pevný materiál sa . potom podrobil rekryštalizácii z horúceho metanolu MeOH, čím sa získal druhý výťažok zlúčeniny vo forme bielej pevnej látky.

Trypto.fyl-D-fenylalanyl-(N’-t-butoxykarbonyl) lyzínamid, 1.3

Podľa tohto vyhotovenia roztok (v množstve

1500 mililitrov) tripeptidovej zlúčeniny (v množstve 64,59 gramu, čo je

0,091 mólov) pridal ku katalytickej suspenzii obsahujúcej 5 %

Pd/C (5 gramov) a

MeOH (250 mililitrov) argónu.

Potom sa podiel metanolu

MeOH (2250 mililitrov).

Argónová atmosféra sa potom nahradí la vodíkom a reakčná zreagovať (reakcia prebi ehala asi 24 hodín). Po dokončení reakcie sa vodíková atmosféra nahradila argónom. Takto získaný roztok sa po t om vyčistil cez vrstvu Celitu a získaný filtrát. sa skoncentroval za použitia vákua, čím sa získal tripeptid 13 vo forme bielej pevnej látky.

I

B. Príprava tr'ipep'tidového íragmentu - K-His-D^Nal-Ala-OMe

Metylester N - benzy loxykarbony 1 -histidy 1— D—beta—na f ty L -a.laní nu

Podľa tohto vyhotovenia sa roztok obsahujúci etylester kyseliny octovej EtOAc (v množstve 400 mililitrov) a hydrochlorid metylesteru D-beta-naftylalanínu (.22, v množstve 0,62 mólu) premyl nasýteným. roztokom uhličitanu sodného (400 mililitrov) a. 0,8 N vodným roztokom hydroxidu sodného (asi 500 mililitrov).

Získaná, vodná íáza sa odstránila (pH 8,5) a organická íáza sa postupne premyla polovičné nasýteným vodným roztokom uhličitanu sodného Na2 CO3 (150 mililitrov) a potom vodou (50 mililitrov).

Voľná bázická forma zlúčeniny 22 sa potom odde1 i 1a pri skoncentrovávaní ety1acetátovei vrstvy vo vákuu.

Dicyklohexylkarbodiimid (DCC, v množstve asi 95 gramov, čo je 0,46 mólov) sa pridal k roztoku obsahujúcemu N -benzyloxykarbonýl-histidín (19, v množstve 143,5 gramu, čo je 0,50 mólov), N-hydroxysukcínimid (HONSu, 22, v množstve 0,62 mólov) a čerstvo pripravenú voľnú bázickú formu zlúčeniny 22 (v množstve asi 0,52 mólov/) v DMF (asi 3 litre) o teplote -5 °C (roztok chladený v ľadovom etanolovom kúpeli). Takto získaný výsledný reakčný roztok sa potom premiešaval počas 24 hodín, pričom sa tento roztok ohrial na teplotu miestnosti. K zisteniu..

či reakcia prebehla úplne, je možno použiť HPLC-analýzu (vysokoúčinná kvapalinová chromatograíia) reakčného produktu. V prípade, že reakcia neprebehla úplne, reakčný roztok sa ochladil na asi -5 °C a k reakčnej zmesi sa pridal ďalší podiel dicykohexy lkarbodi irnidu (asi 0,17 mólov). Táto reakčná zmes sa opäť premiešavala počas ďalších 24 hodín pri súčasnom ohriatí na teplotu miestnosti. Takto získaná zrnes sa potom sfiltrovala za.

účelom odstránenia dicyklohexy1močoviny . (DCU). K takto získanému íiltrátu bola potom pridaná voda (1 liter) a tento roztok sa potom skoncentroval vo vákuu. Zbytok bol potom spracovaný vodným roztokom IN kyseliny chlorovodíkovej (asi J. liter, pokiaľ hodnota pH vodnej fázy nedosiahla 1). Vodná fáza sa potom extrahovala dvoma podielmi etylesteru kyseliny octovej (každý podiel o objeme liter). Takto získané etylacetátové vrstvy boli potom oddelené.

Hodnota pH vodnej fázy sa potom upravila prídavkom chladného 2N roztoku hydroxidu sodného (5Ô0 mililitrov) a peletami hydroxidu sodného. Počas vykonávania neutralizácie sa roztok udržoval v chladnom stave prídavkom etylesteru kyseliny octovej (1 liter).

Po úprave hodnoty pH tejto vodnej íázy na približne 7 nastane obvykle veľmi intenzívne vyzrážanie bielej pevnej látky alebo oleja. Získaná zrazenina sa oddelila vákuovou filtráciou alebo dekantovaním a potom sa premyla polovičné nasýteným roztokom • _x uhličitanu sodného (2 x 1500 mililitrov), x'odou (6 x 1500 mililitrov) a etylesterom kyseliny octovej (3 x 1500 mililitrov).

Získaný podiel sa potom vysušil za vysokého vákua na konštantnú hmotnosť. Tento produkt sa potom hydrolyzoval priamo bez dalšieho prečisťovania.

DPhe-peptid je možné pripraviť použitím hydrochloridu metylesteru D-fenylalanlnu ako zlúčeniny 22 namiesto hydrochloridu metylesteru D-beta-naítylalanínu.

N^-benzy1oxy karboný1-his ti dy1-B-nalty1-D-alani n, 26

Podľa tohto whotovenia sa vodný roztok hydroxidu sodného (v množstve 192 mililitrov; ú,03 g/ml roztoku; 0,38 mólov) pridal

i.

. k roztoku obsahujúcemu dipeptid 25 (asi 0,33 mólu), vodu (360 mililitrov) a metanol MeOH (asi 6 litrov). Takto získaný roztok • sa potom premiešaval pri teplote miestnosti tak dlho, pokiaľ hydrolýza neprebehla úplne (asi 24 hodín). Spotrebovanie východzieho peptidu bolo potvrdené HPLC analýzou. Potom sa tento roztok skoncentroval za použitia vákua, čím vznikol zbytok, ktorý bol rozpustený vo vode (asi 1 liter). Vodná vrstva sa potom extrahovala etylesterom kyseliny octovej EtC’Ac (2 x 500 mililitrov) v deličke. Etylacetátová vrstva sa potom oddelila.

Získaná vodná íáza bola potom upravená na pH približne 5 prídavkom koncentrovanej kyseliny chlorovodíkovéj, pričom v tomto okamžiku nastalo vyzrážanie bielej pevnej látky alebo oleja. Produkt sa oddelil a vysušil za použitia vákua.

f

Metylester N^-benzyloxykarbony1-histidy1-D-beta-naftyi alanyl-alanínu, 20

Podľa tohto vyhotovenia sa hore uvedený dipeptid ŕ/^-benzyloxykarbony 1-Jiistidyl-D-beta-naftylalanín (26, v množstve 0,253 mólov) pridal k roztoku HONSu (23, v množstve 0,505 mólov) v DMF (800 mililitrov) pod atmosférou argónu. K tomuto roztoku sa potom pridala zmes obsahujúca hydrochlorid inetylesteru slaninu (15, v množstve 0,303 molov), M-metyImoríolín (16, v množstve ^0,303 mólov) a dimetyformamid DMF (200 mililitrov). Takto získaný konečný roztok sa potom ochladil na teplotu 10 °C , pričom súčasne bol pridaný dicyklohexylkarbodiimid (24, v množstve 0,265 mólov) v metylénchloride (273 mililitrov). Reakčný priebeh bol monitorovaný metódou HPLC, pričom reakčná teplota sa udržiavala na 10 °C až do konca reakcie. Ak po niekoľkých dŕíoch (asi 4 dni) neprebehne reakcia úplne, pridá sa k reakčnej zmesi ďalší podiel zlúčeniny 24 (v množstve 0,080 mólov) a táto reakčná zmes sa potom nechá premiešavať počas uskutočňuje pri teplote 10 °C. Reakcia sa znovu monitoruje metódou

HPLC pokiáľ nie je zaznamenaný úplný priebeh reakcie (obvykle asi

Pevný podiel, ktorý počas tejto reakcie^p vzni koľ sa oddeli 1 vákuovou filtráciou. Získaný íiltrát bol potom skoncentrovaný za použitia vákua, čím vznikol zbytok. Tento kyseliny octovej a extrahovaný polovičné nasýteným roztokom uhl i č i tanú, sodného

Naz C Ch ( 2 x

00 m i 1 i 1 i t- rov) . P o t om bo 1 a etylacetátová fáza

-s vysušená síranom horečnatým MgSCú . Získaný skoncentroval za použitia vákua za vzniku zbytku.

C. Príprava tetrapeptidového fragmentu Ala—His-Ľ^Nal-Ala-OH

Me t y1es te r histidy1-D-beta-nafty1-alany1-alani nu, 30

Podľa tohto uskutočnenia sa 5¾ paládia na uhlíku (v množstve gramy) opatrne pridalo k roztoku metylesteru

N -benzy 1 oxy kar bony 1-h.is t idy i -D--beta--na í ty la lány 1-slaní nu 20 (v množstve 71 mrnólu) v metanole (500 mililitrov) pod atmosférou

- 41 argónu. Potom bol argón prebublávaný reakčnou zmesou počas 15 zmesou bol potom podpovrchovo prebublávaný vodík počas 15 minút a potom sa táto reakčná zmes premiešala pri teplote miestnosťi a pod ochrannou vrstvou vodíka (O,.L

MPa) .

Na zistenie prípadnej prítomnej východzej látky sa na monitorovanie tejto reakčnej zmesi použila metóda HPLC-analýzy (vysokoúči nná kvapali nová chromatografi a).

V prípade, keď sa zistila prítomnosť určitého podielu východzej , látky, bol

S reakčnou zmesou prebublávaný argón (podpovrchovým fáze sa pridal ďalší pa 1 á d i a na. u h 1 1 k u (v

Potom bol znovu zavedený

Touto reakčnou bol znovu prebublávaný argón, pričom výsledný reakčný filtráciou ce skoncentroval za pouč i t i a vákua, produkt. Časť tohto produktu bola rozpustená alebo vo vode (500 iskanému výslednému materiálu sa potom pridal vodný roztok uhličitanú sodného. Oddelením etylacet át ove j vrstvy al e bo vzniknutých pevných látok sa získala požadovaná zlúčenina 30 vo í orrne voľ ného ace tát.u.

N-hydroxysukcínimidester Boc-alanín, 31

Podľa tohto vyhotovenia sa dicyklohexy i kar bod i imiel (v množstve 43 mólov) pridal pri teplote miestnosti k roztoku obsahujúcemu Boc-alanín (v množstve 43 mmólov) a N-hydrosukcínimid í v množstve 48 mmólov) v metylénchloride (250 mililitrov). Takto získaný roztok sa potom premiešaval počas celej noci. získaná reakčná zmes sa potom sfiltrovala za účelom odstránenia dicyklohexylmočoviny a vyčistený filtrát bol skoncentrovaný za použitia vákua, čím sa získal požadovaný produkt, ktorý sa pred použitím skladoval pri teplote -20 °C pod atmosférou argónu.

í

Boc-Ala-His-D^Nal-OMe,. 32

Vyššie uvedený ester alanínu (v množstve 23,9 gramu), získaný hore uvedeným postupom, sa podľa tohto vyhotovenia pridal do roztoku obsahujúceho His-D/^Nal-ňla-OMe (30) , (v množstve 20,1 mmólov) v bezvodom dimety1 í ormamide (DMF, 200 mililitrov). Takto získaný homogénny roztok sa potom premiešaval počas víkendu pri a potom sa analyzoval. V prípade.

že sa pri

HPLC'-analýze ukázalo, že v reakčnej zmesi nebol prítomný skoro nžiadny tripeptid (to znamená po intervale asi 3 dní), bola k reakčnej zmesi pridaná voda (v množstve 50 mililitrov). Takto získaná reakčná zmes sa potom premiešavala počas ďalšieho jedného dŕía. Získaný roztok sa potom skoncentroval za použitia vákua. Vznikol zbytok, ktorý bol rozpustený v etylestere kyseliny octovej a potom bol extrahovaný polovičné nasýteným vodným roztokokrn uhličitanu sodného (v množstve 2 x

300 mililitrov).

Získaná sa potom vysušila pomocou síranu horečnatého MgSOq a síranu a potom bola skoncentrovaná za použitia vákua.

čím sa získal požadovaný tetrapeptid. Táto látka bola potom použitá bez ďalšieho čistenia pre- prípravu Boe·•••Ala-His--D“<* Nal-Ala-OH.

Boc-Ala-His-D-^Nal-Ala-OH, 33

Podľa tohto vyhotovenia sa vodný roztok 2N hydroxidu sodného (v množstve 7,5 mililitrov, Čo je 15 milimólov) pridal k roztoku metanolu (v množstve 500 mililitrov) a vody (200 mililitrov) obsahújúcemu Boc-Ala-His -D-/S Nal •-•Ala-OMe (v množstve 13,7 mmólov). Po prebehnutí reakcie sa získaná reakčná zmes premiešavala počas noci pri teplote miestnosti., pričom potom HPLC-análýzou (vysokoúčinná kvapalinová chromatograíia) sa zistilo, že v tejto reakčnej zmesi ostáva ešte určitý poodiel východzej látky. Po temer úplne dokončenej reakcii (čo trvalo asi po dobu celej noci) bol získný výsledný roztok skoncentrovaný vo vákuu na objem približne 200 mililitrov. K tomuto roztoku sa pridala voda (100 mililitrov) a hodnota pH sa upravila na približne 12 prídavkom

2Ν hydroxidu sodného (i mililiter). Tento výsledný roztok sa extrahoval etylesterom kyseliny octovej ('2 x 500 mililitrov). Vzniknutá etylacetátová vrstva sa pot-om odstránila. Hodnota pH vodnej fázy sa potom upravila na približne 5 prídavkom vodného roztoku kyseliny chlorovodíkovej, čo obvykle spôsob! vyzrážanie produktu. V tejto fáze je dôležité minimalizovať objem vodnej fázy za účelom urýchlenia vyzrážania produktu. Vodná fáza bola potom dekantovaním oddelená od získaného produktu a tento produkt bol opláchnutý vodou (.2 x 50 mililitrov). Oddelený produkt sa •.potom vysušil na konštantnú hmotnosť vo vákuu.

·· D. Kondenzácia peptidových fragmentov za účelom prípravy <· heptapeptidu Boe—Ala— His-D-T^Nal-Ala-Trp-D-Phe—Lys(Boc)-NHa , 34 t

* Podľa tohto vyhotovenia sa dva peptidy, to znamená

Boc-Ala-His-D- Nal-Ala-OH (33, v množstve 2,6 rnmólov) a Trp-D-Phe-Lys(Boe)-NHz (13, v množstve 2,8 rnmólov) rozpustili v bezvodom DMF, pričom získaný výsledný roztok sa skoncentroval za pooužitia vákua. Toto predbežné skoncentrovanie sa. uskutočnilo z toho dôvodu, metanolu, ktoré stopové množstvá by mohli byť prítomné. Takto získaná peptidová opäť rozpustila v DMF a ďalej sa pridal

N-hydrosukcínimid (v množstve 5,1 rnmólov).

Takto získaný výsledný roztok sa potom potom sa pridal dicyklohexylkarbodiimid (v množstve 3,4 rnmólov) vo forme roztoku zmes sa

-s, potom premiešavala pri teplote roztoku

-2 °C počas dní. Na úplne sa použila metóda

HPLC (vysokoúčiňná kvapalinová chromatograíia).

Po tomto uvedenom e sa zaznamenalo, že reakcia neprebehla úplne.

sa pridal ďal ší podiel dicyklohexy lkarbodi .imidu a takto získaná reakčná.

jedného dňa pri teplote -2

V prípade.

e v nasledujúcom dni (to znamená celkovo po dňoch) sa metódou

HP.LC- an lýzy (vysokoúči nná kvapali nová c hrom a t ogra í i a) znovu zistilo, že reakcia neprebehla úplne, roztoku sa potom ponechala trochu vzrásť na teplotu miestnosti (25 °C), čo sa uskutočňovalo počas niekoľkých hodín (asi ť hodín). Takto získaná reakčná zmes sa potom premiešavala počas noci pri teplote miestnosti.

Tento postup sa potom opakoval, kým reakcia neprebehli a úplne.

K výslednej reakčnej

P.otorn pridala, voda (50 mililitrov) a výsledná reakčná potom premiešavala počas ďalšieho jedného dňa.

Potom sa reakčný roztok sfiltroval za účelom odstránenia di cyklohexy1močoviny získaný í iltrát sa s koncentrova1 vo vákuu na viskózny olej.

K takto získanému výslednému zbytku sa potom pridal etylester kyseliny octovej a polovičné nasýtený roztok uhličitanu sodného (200 mililitrov).

Týmto spôsobom vznikla dvojfázová reakčná zmes, ktorá bola intenzívne premiešavaná na rotačnom odparováku počas asi jednej hodiny. Celkový podiel pevných látok sa potom oddelil í i 11ráčiου sa premyla vodou a potom sa vysušila na konštantnú hmotnosť za použ i t· i a vákua, čím sa získal ďalší podiel produktu.

t t

Podľa tohto vyhotovenia sa heptapeptid získaný hore postupom,

1,02 rnmólov).

pri to ( 34, teplote miestnosti k odsahujúcemu triíluóroctovú kyselinu dirnety lsul í i d (v množstve (v množstve 7 mililitrov) a an.izol v mety lénchloricle (15 m i 1 i 1 j. t rov) .

uvedeným znamená množstve roztoku (v množstve 30 mililitrov).

mi 1 i 1 i trov),

1,2-etándiol (v množstve 2,2 mi 1 i 1 i trov)

Takto z ískaná hom og é nn a £

í* reakčná časovom zmes sa intervale pot om pr ern i ešava 1 a sa pridal počas 15 minút. Po tomto rni 1 i 1 i trov) za účel om dosiahnutia vyzrážania surového biologicky akt í vne ho peptidového produktu

5.

Tento produkt sa potom izoloval filtráciou na írite alebo dekantovaním. Takto získaný produkt sa potom rozpustil vo vode a potom sa lyoíi 1izoval. Takto získaný lyof i 1izovaný produkt bol potom ďalej prečistený chromatografickou metódou za stredného tlaku v sklenenej kolóne x 460 milimetrov naplnenej materiálom Lichroprep P.P-18 (C-18

25-4Ú nm, nepravidelná hodnota mesh, alebo rozdelenie veľkosti zi*n) . Po privedení peptidu vo forme roztoku vo vode bola táto kolóna eluovaná prietokovou rýchlosťou 9 mililitrov za minútu pri malom gradiente v rozmedzí 0 až 25 % metanolu počas 5 až 20 hodín a potom pri gradiente 25 až 55 % počas 40 hodín. Koncentrácia metanolu pri použití tohto gradientu vzrastala rýchlosťou 2 % za hodinu. Počas uskutočňovania tohto eluovania bol zbytok rozpúéťadlovej zmesi upravený vodou obsahujúcou ú,2 % kyseliny chlorovodíkovej. Produkt získaný týmto postupom 35 sa potom pnylyzoval metódou HPLC ívysokoúčinná kvapalinová chromatograíia), pričom bol oddelený skoncentrovaním vhodných podielov získaných eluovanim.

Uvedený vznález bol detailne popísaný pomocou jedného z výhodných uskutočnení patriacich do rozsahu obecného riešenia podľa vynálezu. Je však potrebné poznamenať, že odborníkom pracujúcim v danom odbore budú na základe hore uvedeného popisu zrejmé i ďalšie uskutočnenia, alternatívy a modifikácie tohto postupu, ktoré všetky spadajú do rozsahu uvedeného vynálezu.

Claims (5)

1. PATENT O V É N Á R O K Y

   1. Peptid obecného vzorca

   Aj. -Ae -As -Trp-Ao Ac -Z v ktorom znamená:

   Ai His, 3(NMe)His, His-Ala, Ala, Tyr, A_o~His alebo Ao~3(NMe)His kde A_o predstavuje ľubovoľnú v prírode sa vyskytujúcu L-arnl nokysel i nu, Met(O), DOPA, Abu alebo peptidy obecného vzorca

   L-Ao kde L znamená H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys, Tyi—DAla-Phe-Gly, Tyr—DA1a-Gly-Phe,

   Tyr—A.la-Gly-Thr alebo Tyr-DAla-Phe-Sar,

   Az znamená D^Nal alebo E>Phe,

   A3 znamená Ala, Gly alebo Ser,

   A*, znamená DPhe, D/Ľ® (Ne)Phe alebo (NMe)DPhe,

   Aľj znamená B-G alebo G, kde B predstavuje ľubovoľnú v prírode sa vyskytujúcu

   L-a.mínokyselinu, dipeptidy ľubovoľných v prírode sa vyskytujúcich aminokyselín alebo

   Hz N-(CHs )r»-CQz H, kde n ~ 2 - 1Ξ a

   G znamená Arg, iLys, Lys alebo Orn,

   Z znamená koncovú skupinu na koncovom uhlíku polypeptidu alebo C-koncovú aminokyselinu alebo kyseliny plus koncovú skupinu, pričom E je -CONR¹ R² , -COOR¹ alebo -CH2 OR¹ , -GLY-Z’ , -Met-Z· , -Lys-Z· , -Cys-Z· , --Cly-Tyr-Z- alebo -Ala-Tyr-Z’ , kde Z’ predstavuje skupiny —CONR¹R²

   -CHz OR¹ , a

   -COOR¹ alebo

   4.7

   B¹’ znamená vodík, alkylovú skupinu obsahujúcu 1 až asi 6 atómov uhlíka, cykloalkylovú skupinu obsahuj úcu asi

   8 atómov uhlíka, alkenylovú skupinu obsahujúcu 2 až asi 8 a t. óm o v uhlíka a 1 e b o a ry 10' ·’ ú s k u p i n u obsahuj úcu

   6 až asi 12 atómov' uhlíka, ak² je cle í i novaný ako R¹ , pričom tieto substituenty môžu byť rovnaké alebo rozdielne-, a organické alebo anorganické

   1 arrnaceut i cky pri j at eľ né sol i odvodené od týchto
2. 2. Peptid podľa nároku 1, v/ ktorom

   Αχ znamená His, Ala,

   His-Ala alebo A_o-His.

   3. Peptid podľa nároku 1, v ktorom Aa znamená Ala. 4. Peptid podľa nároku 2, v ktorom A_o je Ala, Lys alebo Glu; a₃ je Ala; A.5 j e Lys, i Ly s, ZA 1 a - Ly s , A1 a - Ala-Lys alebo Hz N(CHz )_nCO-Lys , kde n- j e 4 r až 8.

   Peptid podľa nároku 1 v ktorom l\z je D Nal.

   6. Peptid podľa nároku 1 ktorý má obecný vzorec:

   His-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-IV, -Z

   7.Peptid podľa nároku i.

   v ktorom A
3. 3 je DPhe.

   8/ Peptid podľa nároku 6,,, ktorý má obecný vzorec:

   His—D/ÍNal- Ala- Trp-DPhe-Lys-Nlb ·

   9. Peptid podľa, nároku 1, ktorý má obecný vzorec:

   Äo-His-JD^Nal-Ala-Trp-DPhe—Ac-Z alebo

   Ä2-His-DPhe-Ala-Trp-Dphe-A?-Z.

   10. Peptid podľ a nároku 9, v ktorom A_o je Ala. 11 . Peptid podľa nároku 6,9,18, a 1 e bo 2 6 , \>. ktorom Σ znamená CONH₂ . 1Ξ. Peptid podľa nároku. 12, ktorý má obecný vzorec:

   Ala-His—DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHs,

   Ala-His-l/^NaJ.-Ala-ľrp-DPhe-Lys-NIb , ' Ala-His—D^Nal-Ala— Trp-DPhe—Ala—Lys-NIL ,

   Ala—His—D^Nal—Ala—Trp—DPhe—Ala—Ala—Lys-NHa , , Lys-His—D^Nal-Ala-Trp-DPhe- Ac -NÍL alebo ‘ Glu-His-DANal-Ala-Trp-DPhe-Ae-NH2.

   v

   13. Peptid podľa nárokov 2,6,9,18 alebo 20, v ktorom A« znamená G.

   14. Peptid podľa nároku 3, ktorý má obecný vzorec:

   Ala-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Ala-Lys-NHs

   Ala-His—DPhe-Ala-Trp-DPhe-Ala-Ala-Lys-NHs

   Ly s- H i s -DPhe- A1 a- T r p-.DP he- - A<. ~NHz , Glu-His-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Ac-NHs.

   f 15. Peptid podľa nároku 1, ktorý má obecný vzorec:

   ’ His-Ala-DANal-Ala-Trp-DPhe-Aô-Z.

   16. Peptid podľa nároku 15, v ktorom Σ znamená -CGNHz.

   17. Peptid podľa nároku 16, ktorý má obecný vzorec:

   His-Ala-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys- NHz .

   18. Peptid podľa nároku 1, ktorý má obecný vzorec:

   His-PPhe-Ala-Trp-DPhe-A<. -Z.

   19. Peptid podľa nároku 18, ktorý má obecný vzorec:

   Ilis-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NHž -

   20. Peptid podľa nároku 1, ktorý má obecný vzorec

   Ala-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-Ae-Z

   Ala-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Ae-Z.

   21. Peptid podľa nároku 20, ktorý má obecný vzorec^:

   Ala-D^Nal-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2 Ala-DPhe-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH2.

   22. Spôsob promotovania uvoľňovania a zvyšovania hladiny rastového hormónu u živočíchov, vyznačujúci sa tým, že živočíchom sa podáva účinné množstvo prinajmenšom jedného peptidu podľa nárokov 1,
4. 4,5,7,12,14 alebo 15.

   23. Spôsob podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým.

   že uvedeným živočíchom je cicavec.

   24. Spôsob podľa nároku 23, vyznačujúci sa tým, že uvedeným cicavcom je človek.

   25. Farmaceutický prostriedok na promotovanie uvoľňovania a zvyšovania hladiny rastového hormónu u živočíchov, vyznačujúci sa tým, že obsahuje prinajmenšom jeden z peptidov podľa nároku 1,4,5,7,12,14 alebo 15 a farmaceutický prijateľnú nosičovú látku alebo riedidlo.

   26. Peptid podľa nároku 2, v ktorom Ao predstavuje ľubovoľnú v prírode sa vyskytujúcu aminokyselinu.

   27. Spôsob promotovania uvoľňovania a zvyšovania hladiny rastového hormónu v krvi, vyznačujúci sa tým, že subjektu sa podáva peptid podľa nároku 1 v synergicky účinnom množstve
5. 5ϋ s druhou zlúčeninou, pričom touto druhou zlúčeninou je zlúčenina, ktorá pôsobí ako agonista receptoru hormónu uvoľňujúceho rastový hormón, alebo zlúčenina, ktorá inhibuje účinok gornatostati nu.

   28. Farmaceutický prostriedok podľa nároku 22, vyznačujúci sa tým, Že ďalej obsahuje druhú zlúčeninu, ktorá pôsobí ako agonista receptoru hormónu uvoľňujúceho rastov,ý hormón alebo ktorá inhibuje účinok somatostatínu.

   29. Použitie zlúčniny obecného vzorca ΐ i i · _t Ai — Az — Ag -Trp—A?, - -Ά, -Z f v ktorom znamená:

   Ai His, 3(NMe)His, His-Ala, Ala,

   Ty r.

   Ao-His alebo

   Ao -3(NMe) His kde A_o predstavuje ľubovoľnú v prírode sa

   L- arn í n oky s e 1 i n u, Met(0), DOPA, Abu alebo peptidy obecného v z or c a L-Ao kde L znamená H, DOPA, Lys, Phe, Tyr, Cys,

   * Tyr-DAla-Phe-Gly, Ty r-DA1a-G1y-Phe T y r— A1 a- G1y-T hr a1 e bo T y r - D A1 a - P h e - S a r, r Az znamená Z^Ahal alebo DPhe, 'x Ag znamená Ala, Gly alebo Ser, A? znamená DPhe, D/'(Me)Phe alebo í NMe)DPhe, A-5 znamená B-G alebo G,

   pre prípravu liečiva na promotovanie uvoľňovania a zvyšovania hladiny rastového hormónu v krvi .

   30. Spôsob prípravy zlúčeniny obecného vzorca:

   Ai ~Fc -A3 -Trp -As -~1\β ~Z v ktorom znamená:

   Ai His, 3(NMe)H:is, His-Ala, Ala, Ty r, Ao-His alebo A_o-3(NMe .) His kde A_o predstavuje ľubovoľnú v prírode sa vyskytujúcu L-amínokyselinu, MetíO), DOPA, Abu alebo peptidy obecného vzorca

   L—A.-.·.

   kde L znamená H, DOPA, Lys, Phe, Ty r, Cys, Tyr-DAia-Phe~Gly, Tyr-DAla-Gly-Phe,

   T y r - A1 a - G1 y - '1T ί r a 1 e b o ' Γ y r - D A1 a - F he - Sa r,

   Ä£ znamená. Iľ^Nal alebo DPhe, Aa znamená Ala, Gly alebo Ser, A*5- znamená DPhe, D/L^CMejFhe alebo (NMejDPhe, A._? znamená B-G alebo G,

   vyznačujúci sa týin, že sa kondenzujú aminokyseliny alebo deriváty aminokyselín za vzniku uvedenej zlúčeniny.

   31. Spôsob prípravy peptidu. podľa nároku L, vyznačujúci sa tým, Že sa kondenzujú peptidové- fragmenty za vzniku uvedeného peptidu.