UA73530C2

UA73530C2 - Сполука з властивостями вивільнювати гормон росту

Info

Publication number: UA73530C2
Application number: UA2002053785A
Authority: UA
Inventors: Міхаель Анкерсен
Original assignee: Ново Нордіск А/С; Ново Нордиск А/С
Priority date: 1999-11-10
Filing date: 2000-10-11
Publication date: 2005-08-15
Also published as: US6576648B2; HU229445B1; JP2009062369A; JP2003527338A; ES2231279T3; MXPA02004656A; ZA200202757B; ATE280168T1; PT1230236E; AU782260B2; WO2001034593A1; IL149049A0; EP1230236B1; CA2387095C; PL199989B1; DE60015173T2; AU1269401A; CA2387095A1; EP1230236A1; KR100907637B1

Abstract

Даний винахід стосується нової діастереомерної сполуки, її фармацевтично прийнятних солей, композицій, що їх містять, та їх застосування для лікування захворювань, які виникають в результаті дефіциту гормону росту.

Description

Опис винаходу

Даний винахід стосується нової сполуки, її фФармацевтично прийнятних солей, композицій, що їх містять, та 9 їх застосування для лікування захворювань, які є результатом дефіциту гормону росту.

Гормон росту є гормоном, який стимулює ріст усіх тканин, які здатні рости. Крім того, відомо, що гормон росту має різний вплив на обмінні процеси, наприклад, стимуляцію синтезу білків та мобілізацію вільних жирних кислот, і викликає переключення енергетичного обміну речовин з вуглеводного на жирнокислотний обмін речовин. Дефіцит гормону росту може призводити до багатьох важких захворювань, наприклад, карликовості. 70 Гормон росту вивільнюється з гіпофізу. Вивільнення прямо або непрямо жорстко контролюється багатьма гормонами та нейротрансмітерами. Вивільнення гормону росту може стимулюватися гормоном вивільнення гормону росту (СНКН) та інгібуватися соматостатином. В обох випадках гормони вивільнюються з гіпоталамусу, але їх дія опосередковується насамперед специфічними рецепторами, розташованими в гіпофізі. Було описано й інші сполуки, які стимулюють вивільнення гормону росту з гіпофізу. Наприклад, аргінін,

ІЇ-3,4-дигідроксифенілаланін (І-Допа), глюкагон, вазопресин, РАСАР (пептид, який активує аденілілциклазу гіпофізу), агоністи мускаринового рецептора та синтетичний гексапептид, ЗНЕР (пептид, який вивільнює гормон росту) вивільнюють ендогенний гормон росту або шляхом прямого впливу на гіпофіз, або впливаючи на вивільнення ЗНЕАН та/або соматостатину з гіпоталамусу.

При захворюваннях або станах, коли вимагається підвищення рівня гормону росту, білковий характер гормону росту виключає будь-яке застосування, крім парентерального введення. До того ж, інші прямо діючі природні засоби, що посилюють секрецію, наприклад, ЗОНКН та РАСАР, є довгими поліпептидами, через що перевагу віддають саме парентеральному введенню.

Застосування певних сполук для підвищення рівня гормону росту у ссавців раніше пропонувалося, наприклад, у заявках ЕР 18072, ЕР 83864, УМО 8302272, МО 8907110, УМО 8901711, МО 8910933, МО 8809780, с 29 МО 9118016, УМО 9201711, УМО 9304081, УУО 9413696, У/О 9517423, УМО 9514666, УУО 9615148, УМО 9622997, Го)

УО 9635713, УМО 9700894, УМО 9722620, МО 9723508, УМО 9740023 та МО 9810653.

Склад сполук, які вивільнюють гормон росту, є важливим для їх ефективності вивільнення гормону росту, а також їх біоакумуляції. Таким чином, задача даного винаходу полягає в забезпеченні нової сполуки з властивостями вивільнення гормону росту. Крім того, задача полягає в забезпеченні нової сполуки, яка о вивільнює гормон росту (що посилює секрецію гормону росту), які є специфічними і/або селективними інемають се або практично не мають побічних ефектів, наприклад, вивільнення ІН, ЕЗН, ТОН, АСТН, вазопресину, окситоцину, кортизолу та/або пролактину. Задача також полягає в забезпеченні сполуки, яка має добру о біодоступність при пероральному введенні. со

Згідно з даним винаходом пропонується нова сполука, яка діє безпосередньо на клітини гіпофізу за нормальних умов експерименту іп міго для вивільнення з них гормону росту. -

Сполука, яка вивільнює гормон росту, може застосовуватись іп мйго як унікальний дослідний засіб для розуміння, крім іншого, шляху регулювання секреції гормону росту на рівні гіпофізу.

Крім того, сполука, яка вивільнює гормон росту, згідно з даним винаходом, також може вводитись іп мімо /«ф для збільшення ендогенного вивільнення гормону росту. З 50 Відповідним чином, даний винахід стосується сполуки, яку одержують із застосуванням процедури, описаної с у прикладі 1,

Із» або її фармацевтично прийнятної солі.

Крім того, даний винахід стосується сполуки, яку одержують із застосуванням процедури, описаної у прикладі 1, і яка є 2-аміно-М-К1к)2-(3К)-3-бензил-3-(М,М'М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1--1Н-індол-З-ілметил) і -2-оксоетил|-2-метилпропіонамідом (95)

ЗУ і-й ще « о 50 сн, о сн, с або її фармацевтично прийнятною сіллю.

Крім того, даний винахід стосується сполуки 2-аміно-М-К1к)2-(3К)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-(1Н-індол-3-ілметил 29 )-2-оксоетил|-2-метилпропіонаміду

Ф) се 60 або її фармацевтично прийнятної солі.

Структуру сполуки, яку одержують із застосуванням процедури, описаної у прикладі 1, перевіряють, наприклад, шляхом рентгеноструктурного аналізу |наприклад, як описано у роботі Кетіпдіоп: Тпе Зсіепсе апа

Ргасіїсе ої Рпаптасу, 19(п Едіоп (1995), зокрема, сторінки 160 та 561-562. бо Обсяг даного винаходу охоплює будь-яку можливу комбінацію двох або більшої кількості описаних авторами варіантів втілення.

Процедура, застосована в цьому патенті, основана на з'єднанні пептидів, добре відомому спеціалістам, і ніяким чином не повинна розглядатись як така, що обмежує винахід.

У цій процедурі перед з'єднанням амінокислотних або пептидних залишків добре відомими спеціалістам способами видаляють відповідну захисну групу, таку, як трет-бутилоксикарбоніл (Вос). Можна також уникнути застосування захисних груп. Відповідні амінокислоти можуть бути захищені і позбавлені захисту способами, відомими спеціалістам і описаними, наприклад, у роботі Т.МУ. Сгееп (Ргоїесіїме (згоцрв іп Органічн Зупіпевів, 2. Ед., допп УМіеу апа 5опв, Мем Хогк 19911. 70 У Прикладі 1 процедуру описано детально.

Після розділення рацемічної суміші З-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти 1-трет-бутилового естеру для одержання енантіомерних сполук, кінцевою сполукою, одержаною з застосуванням цієї процедури, є діастереомер 2-аміно-М-К1к)2-(3К)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-(1Н-індол-3-ілметил 75 )-2-оксоетил)|-2-метилпропіонамід

Фе че Х са. сн, Й о св 20 й не й й замість суміші двох діастереомерів.

Сполука даного винаходу виявляє посилений опір протеолітичному розщепленню ферментами, оскільки вона не є природною, зокрема, завдяки тому, що природні амідні зв'язки замінюються неприродними міметичними амідними зв'язками. Очікується, що збільшення опору сполуки винаходу протеолітичному розщепленню порівняно з відомими пептидами, що вивільнюють гормони, має поліпшити біоакумуляцію порівняно з сч 25 біоакумуляцією пептидів, які пропонувалися в літературі раніше. о

Сполука даного винаходу необов'язково може бути у формі фармацевтично прийнятної солі, наприклад, У формі фармацевтично прийнятних кислотно-адитивних солей сполук даного винаходу, до яких належать солі, одержані шляхом реакції сполуки формули | з неорганічною або органічною кислотою, такою як соляна, гідробромнувата, сірчана, оцтова, фосфорна, молочна, малеїнова, мигдалева, фталева, лимонна, глутарова, о 30 глюконова, метансульфонова, саліцилова, бурштинова, винна, толуолсульфокислота, трифтороцтова, «9 сульфамінова або фумарова кислота та/або вода.

Сполука даного винаходу може вводитись у формі фармацевтично прийнятної кислотно-адитивної солі або, у й певному випадку, у формі солі лужного металу або лужноземельного металу або нижчої алкіламонієвої солі. «(У

Вважають, що такі форми солей виявляють активність приблизно такого самого порядку, що й вільноосновні 35 форми. -

В іншому аспекті даний винахід стосується фармацевтичної композиції, яка включає як" активний інгредієнт сполуку даного винаходу або її фармацевтично прийнятну соль разом із фармацевтично прийнятним носієм або розріджувачем. « дю Фармацевтичні композиції, що містять сполуку даного винаходу, одержують традиційними способами, з наприклад, як описано в роботі Кетіпдіоп'з РпагтасеціїсаІ! Зсіепсез, 1985, або Кетіпдіоп: Те Зсіепсе апа с Ргасіїсе ої Ріаптасу, 19 Еаййоп (1995). Композиції можуть існувати у традиційних формах, наприклад, у :з» формі капсул, таблеток, аерозолів, розчинів, суспензій або у формах для місцевого нанесення.

Застосовуваний фармацевтичний носій або розріджувач може бути традиційним твердим або рідким носієм.

Прикладами твердих носіїв є лактоза, каолін, цукроза, циклодекстрин, тальк, желатин, агар, пектин, - гуміарабік, стеарат магнію, стеаринова кислота або нижчий алкіловий етер целюлози. Прикладами рідких носіїв є сироп, арахісова олія, оливкова олія, фосфоліпіди, жирні кислоти, аміни жирних кислот, поліоксіетилен або (95) вода. сл Подібним чином, носій або розріджувач може включати будь-який відомий спеціалістам матеріал уповільненого вивільнення, такий як гліцерилмоностеарат або гліцерилдистеарат, окремо або змішаний з се 070 воском, о Якщо для перорального введення застосовують твердий носій, композиція може бути таблетована, поміщена у тверду желатинову капсулу у формі порошку або гранул чи може бути у формі таблетки або пастилки. Кількість твердого носія може бути різною в широких межах, але зазвичай становить від приблизно 25мг до приблизно 1г м'якої желатинової капсули або стерильної рідини для ін'єкцій, такої як водна чи безводна рідка суспензія або 59 розчин.

ГФ) Типова таблетка, яка може бути виготовлена традиційним способом таблетування, може містити: о Ядро:

Активна сполука (як вільна сполука або її сіль) 1Омг 60 Колоїдний діоксид кремнію (Аеговії) 1,Бмг

Целюлоза, мікрокрист. (Амісе!) 7Омг

Модифікована целюлозна смола (Ас-0Оі-ЗоЇ) 7,Бмг

Стеарат магнію

Покриття: б5

НРМС приблизно 9мг

"Мужасей 9-40 Т арргох. О,9мМг "Ацильований моногліцерид, застосований як пластифікатор для плівкоквого покриття.

Для назального введення композиція може містити сполуку даного винаходу, розчинену або суспендовану в рідкому носії, зокрема, водному носії, для аерозольного розпилення. Носій може містити додатки, такі як солюбілізатори, наприклад, пропіленгліколь, поверхнево-активні речовини/ посилювачі абсорбції, такі як лецитин (фосфатидилхолін) або циклодекстрин, або консерванти, такі як парабени.

Взагалі, сполуки даного винаходу відпускаються у формі одиничних доз, які містять 50-200мг активного інгредієнта разом із фармацевтично прийнятним носієм на одиничну дозу. то Прийнятна доза для сполук згідно з даним винаходом становить 0,01-500мг/день, наприклад, від приблизно 5 до приблизно 5Омг, скажімо, 1Омг на дозу при введенні пацієнтові, наприклад, людині, як медикаменту.

У ще одному аспекті даний винахід стосується фармацевтичної композиції у формі одиничної дози, яка включає як активний інгредієнт від приблизно 10 до приблизно 200мг сполуки загальної формули І або її фармацевтично прийнятної солі.

Було продемонстровано, що сполука даного винаходу має здатність вивільнювати ендогенний гормон росту іп мімо. Таким чином, ця сполука може бути застосована для лікування при станах, які вимагають підвищеного рівня гормону росту плазми, наприклад, у людей з дефіцитом гормону росту або у літніх пацієнтів чи худоби.

Таким чином, в одному з аспектів даний винахід стосується фармацевтичної композиції для стимулювання вивільнення гормону росту з гіпофізу, композиції, яка включає як активний інгредієнт сполуку даного винаходу або її фармацевтично прийнятну сіль разом із фармацевтично прийнятним носієм або розріджувачем.

У ще одному аспекті даний винахід стосується способу стимулювання вивільнення гормону росту з гіпофізу, способу, що включає введення суб'єктові, який цього потребує, ефективної кількості сполуки даного винаходу або її фармацевтично прийнятної солі. сч ре У ще одному аспекті даний винахід стосується застосування сполуки даного винаходу або її фармацевтично прийнятної солі для одержання медикаменту для стимулювання вивільнення гормону росту з гіпофізу. (о)

Спеціалістам добре відомо, що гормон росту застосовується і може застосовуватися найрізноманітнішими способами. Таким чином, сполука даного винаходу може вводитися з метою стимулювання вивільнення гормону росту з гіпофізу і в такому разі може мати практично такий самий вплив або застосування, що й сам гормон о 20 росту. Сполуки даного винаходу застосовують для стимуляції вивільнення гормону росту у літніх пацієнтів, запобігання катаболічним побічним ефектам глюкокортикоїдів, профілактики та лікування остеопорозу, лікування (зе) синдрому хронічної втоми (СЕ5), лікування синдрому гострої втоми та втрати м'язової маси після вибіркового ою хірургічного втручання, стимуляції імунної системи, прискорення загоєння ран, прискорення зростання кісток, прискорення при ускладнених переломах, наприклад, дистракційного остеогенезу, лікування виснаження со з внаслідок переломів, лікування затримки росту, лікування затримки росту в результаті ниркової недостатності, М лікування кардіоміопатії, лікування виснаження у зв'язку з хронічними хворобами печінки, лікування тромбоцитопенії, лікування затримки росту у зв'язку з хворобою Крона, лікування синдрому короткого кишечнику, лікування виснаження у зв'язку з хронічною обструктивною легеневою хворобою (СОРО), лікування ускладнень, пов'язаних із трансплантацією, лікування фізіологічної низькорослості, включаючи лікування дітей з дефіцитом « 20 гормону росту, та низькорослості, пов'язаної з хронічними захворюваннями, лікування ожиріння та затримки -в росту, пов'язаної з ожирінням, лікування анорексії, лікування затримки росту, пов'язаної з синдромом с Прадера-Віллі та синдромом Тернера; прискорення росту у пацієнтів, які мають синдром часткової нечутливості :з» до гормону росту, прискорення одужання та скорочення періоду госпіталізації опікових пацієнтів; лікування внутрішньоматкової затримки росту, дисплазії скелета, гіперкортицизму та синдрому Кушинга; викликання пульсуючого вивільнення гормону росту; заміни гормону росту у пацієнтів, що зазнали стресу, лікування -1 остеохондродисплазії, синдрому Нунана, шизофренії, депресій, хвороби Альцгеймера, повільного загоєння ран та психосоціальної депривації, лікування катаболізму у зв'язку з легеневою дисфункцією та вентиляторною (95) залежністю; лікування серцевої недостатності або пов'язаної з нею судинної дисфункції, лікування порушення сл серцевої функції, лікування або профілактики інфаркту міокарда, зниження кров'яного тиску, захисту від дисфункції шлуночка або профілактики реперфузії; лікування дорослих пацієнтів від хронічного діалізу; (95) послаблення білкової катаболічної реакції після радикального хірургічного втручання, зменшення кахексії та о втрати білків через такі хронічні захворювання, як рак або СНІД; лікування м. гіперінсулінемії, включаючи незидіобластоз, допоміжного лікування для індукування овуляції; стимуляці розвитку тимуса та профілактики пов'язаного зі старінням зниження функції тимуса, лікування пацієнтів з пригніченим імунітетом; лікування саркопенії, лікування виснаження у зв'язку зі СНІДом; поліпшення сили та рухливості м'язів, підтримання товщини шкіри, метаболічного гомеостазу та ниркового гомеостазу у ослаблених пацієнтів літнього віку, (Ф) стимуляції остеобластів, корекції кісток та росту хрящів; регуляції приймання їжі; стимуляції імунної систем

ГІ у свійських тварин та лікування пов'язаних зі старінням порушень свійських тварин, сприяння ростові худоби та стимуляці росту шерсті овець, збільшення удійності худоби, лікування метаболічного синдрому (синдрому Х), во лікування резистентності до інсуліну, включаючи інсулінонезалежний цукровий діабет, у ссавців, наприклад, людини, лікування резистентності до інсуліну у ділянці серця, поліпшення якості сну та корекції відносного гіпосоматропізму при старінні через значне збільшення швидкого сну та зменшення латентності швидкого сну, лікування гіпотермії, лікування крихкості, пов'язаної зі старінням, лікування застійної серцевої недостатності, лікування переломів стегна, лікування імунодефіциту осіб зі зниженим співвідношенням Т4/18 65 клітин, лікування м'язової атрофії, лікування пошкодження скелетних м'язів літніх пацієнтів, підвищення активності білкової кінази В (РКВ), поліпшення загальної легеневої функції, лікування порушень сну, лікування затримки росту у зв'язку з астмою, лікування затримки росту у зв'язку з ювенільним ревматоїдним артритом та лікування затримки росту у зв'язку з кістозним фіброзом.

Для вищезгаданих показань доза може бути різною залежно від способу введення та потрібної терапії. Однак зазвичай пацієнтам та тваринам вводять дозу на рівні від 0,0001 до 10Омг/кг маси тіла на день для досягнення ефективного вивільнення ендогенного гормону росту. Крім того, сполука даного винаходу при введенні у вищевказаних дозах не має або практично не має побічних ефектів, таких як, наприклад, вивільнення І Н, ЕН,

Т5Н, АСТН, вазопресину, окситоцину, кортизолу та/або пролактину. Як правило, дозовані форми, придатні для перорального, назального, пульмонального або крізьшкірного введення, включають від приблизно 0,0001мг до 70 приблизно 100Омг, в оптимальному варіанті -- від приблизно 0,001мг до приблизно 5Омг сполук даного винаходу, змішаних із фармацевтично прийнятним носієм або розріджувачем.

Фармацевтична композиція винаходу необов'язково може включати сполуку даного винаходу у комбінації з однією або кількома сполуками, які виявляють різну активність, наприклад, антибіотиками або іншими фармакологічно активними матеріалами.

Шлях введення може бути будь-яким шляхом, який ефективно переносить активну сполуку до підходящого або потрібного місця дії наприклад, пероральним, назальним, пульмональним, крізьшкірним або парентеральним, причому перевагу віддають пероральному шляхові.

Крім фармацевтичного застосування сполуки даного винаходу, корисними можуть бути іп мйго засоби дослідження регуляції вивільнення гормону росту.

Сполука даного винаходу також може бути корисною як іп мімо засіб для оцінки здатності гіпофізу до вивільнення гормону росту. Наприклад, можуть бути піддані аналізові на гормон росту зразки сироватки, взяті до та після введення сполуки людині. Порівняння гормону росту в кожному зразку сироватки прямо визначає здатність гіпофізу пацієнта до вивільнення гормону росту.

Сполука даного винаходу може вводитись тваринам, які мають промислове або сільського сподарське с об Значення, для збільшення швидкості та міри їх росту, а також для підвищення удійності.

Сполука даного винаходу також може застосовуватись у комбінації з іншими засобами, що поліпшують і) секрецію, такими як СНЕКР (2 або 6), ОНАН та його аналоги, гормон росту та його аналоги або соматомедини, включаючи ІСЕ-1 та ІСЕ-2.

Сполуку даного винаходу піддають іп мйго аналізові на її ефективність та потенційну здатність о зо Вивільнювати гормон росту в первинних культурах гіпофізу щурів, і такий аналіз здійснюють описаним нижче способом. і,

Виділення клітин гіпофізу щурів являє собою дещо змінений спосіб, описаний у роботі О. Загіог еї аї., ю

Епдосгіпоїюсду 116. 1985, рр. 952-957. Самців-альбіносів щура Спрага-Долі (250 47-25 грамів) закуповували у

МоПедаага, Пе ЗКепвзмей, Данія. Щурів розсаджували по клітках групами (чотири тварини на клітку) і ме) поміщували в кімнати з 12-годинним світловим циклом. Кімнатна температура становила від 19 до 249С, а ї- відносна вологість -- від ЗО до 60905.

Щурів декапітували і розрізали гіпофіз. Нейропроміжні частки видаляли, а решту тканини відразу поміщували в ізоляційний буфер при температурі льоду (середовище Гея (бірсо 041-04030) з 0,2595 ЮО-глюкози, 290 замінної амінокислоти (Сібсо 043-01140) та 195 альбуміну сироватки великої рогатої худоби (ВБА) (бідта А-4503)). «

Тканину розрізали на дрібні фрагменти і переносили в ізоляційний буфер з З,вмг/мл трипсину (Ууогійіпдіоп 23707 с ТАКІ -3) та ЗЗОмг/мл ДНКази (Зідта 0-4527). Цю суміш інкубували при 7Ооб/хв протягом Збхв при 37 9С в ц атмосфері 95/595 05/СО5. Тканину після цього тричі промивали у вищезгаданому буфері. Застосовуючи "» стандартну пастерку, тканину після цього відсмоктували в окремі клітини. Після диспергування клітини фільтрували крізь нейлоновий фільтр (160мм) для видалення зайвої тканини. Суспензію клітин тричі промивали ізоляційним буфером з інгібітором трипсину (0,75мг/мл, УМогіпіпдіоп 252829) і остаточно ресуспендували в -І культуральному середовищі; ОМЕМ (Сірсо 041-01965) з 25мММ НЕРЕЗ (Зідта Н-3375), 4мММ глутаміну (бірсо 043-05030Н), 0,07590 бікарбонату натрію (Зідта 5-8875), 0,190 замінної амінокислоти, 2,595 ембріональної о телячої сироватки (БС5, бірсо 011-06290), З9о конячої сироватки (Сібсо 034-06050), 1090 свіжої щурячої 1 сироватки, 1НМ Таз (Зідта Т-2752) та 40мг/л дексаметазону (Зідта О-4902) рН 7,3, до густини 2х109 клітин/мл. сю 50 Клітини висівали у мікротитрувальні планшети (Мипс, Данія), 20О0мл/лунку, і культивували протягом З днів при 372С та 895 СО». «2 Випробування сполуки

Після культивування клітини двічі промивали стимуляційним буфером (збалансований сольовий розчин

Хенкса (Сірсо 041-04020) з 190 ВБА (Зідта А-4503), 02596 Ю-глюкози (Зідта 0-5250) та 25мм НЕРЕЗ (Зідта

ІН-3375) рН 7,3) і попередньо інкубували протягом 1год при 372С. Буфер замінювали на 9Омл стимуляційного

ГФ) буфера (3722). Додавали 1Омл розчину випробуваної сполуки і планшети інкубували протягом 15хв при 3729С і юю 596 СО». Середовище декантували і піддавали аналізові на вміст гормону росту (СН) у випробувальній системі

ГОН РА.

Сполуку випробували у дозах від 10пПМ до 100мМ. Залежність реакції від дози вибудовували користуючись бо рівнянням Хілла (Рід Р, Віозої?). Ефективність (максимальне вивільнення СН, Е пах) виражали у 95 від Епах ВІД

СНАР-6. Потенційну здатність (ЕСво) визначали як концентрацію, що викликає половину від максимальної стимуляції вивільнення СН.

Сполуки даного винаходу оцінюють на метаболічну стійкість, застосовуючи процедуру описану нижче:

Сполуку розчиняють у концентрації їмг/мл у воді. 25мл цього розчину додають до 175мл відповідного бо ферментного розчину (що в результаті дає співвідношення фермент:субстрат (маса/маса) приблизно 1:5).

Розчин залишають до наступного дня при 372С. 1Омл розчинів різного ступеня розщеплення піддають аналізові порівняно з відповідним "нульовим" зразком, застосовуючи електророзпилювальну мас-спектрометрію (ЕБМ5) з нагнітанням потоку при спостереженні за вибраним молекулярним іоном. Якщо сигнал послаблюється більше ніж на 2095 порівняно з "нульвим" зразком, решту розчину піддають аналізові шляхом високоефективної рідинної хроматогрфії (НРІ С) та мас-спектрометрії з метою точного визначення ступеня та місця (місць) розщеплення.

Для випробування стійкості брали кілька стандартних пептидів (АСТН 4-10, ангіотензин 1-14 та глюкагон) з метою перевірки здатності різних розчинів до розщеплення пептидів.

Стандартні пептиди (ангіотензин 1-14, АСТН 4-10 та глюкагон) закуповували у бБідта, МО, США) 70 Усі ферменти (трипсин, хімотрипсин, еластазоамінопептидазу М та карбоксипептидазу У та В) закуповували у Воепгігідег Маппйеійт СтрН (Мапппеїт, Сегпгтапу)

Панкреатична ферментна суміш: трипсин, хімотрипсин та еластаза в 100мм амонійбікарбонату, рН 8,0 (концентрація в усіх випадках 0,025мг/мл).

Карбоксипептидазна суміш: карбоксипептидаза ХМ та В у 5Омм амонійацетат, рН 4,5 (концентрація в усіх 7/5 випадках 0,025мг/мл).

Розчин амінопептидази М: амінопептидаза М (0,025мг/мл) у 100мм амонійбікарбонату, рН 8,0.

Мас-спектрометричний аналіз здійснювали, застосовуючи два різні мас-спектрометри. Потрійний квадрупольний пристрій для І1С-М5 Зсіех АРІ ПП (Зсіех іпвігитепів, Тпотй!, Опіагіо), оснащений електророзпилювальним джерелом іонів, та часопролітний пристрій з плазмовим осадженням Віо-іІоп 20 (Віо-Іоп 20 Могаїс АВ, Оррзаїа, Швеція).

Визначення кількості сполуки (до та після розщеплення) здійснювали на пристрої АРІ ІІ, застосовуючи відстеження одиничного молекулярного іона з нагнітанням потоку аналіту. Потік рідини (МеОН:вода 1:1) зі швидкістю 1О0Омл/хв контролювали за допомогою пристрою для НРІ С АВІ 1408 (Регкіп-ЕІтег Арріїед Віозувіетв

Оімізіопз, Розіег Спу, СА). Параметри пристрою встановлювали згідно зі стандартними робочими умовами, і с 25 Відстеження ЗІМ здійснювали, застосовуючи найбільш інтенсивний молекулярний іон (у більшості випадків він відповідає подвійно зарядженому молекулярному іонові). о

Крім того, ідентифікація продуктів розщеплення включала застосування мас-спектрометрії з десорбцією плазми (РОМ5) з нанесенням зразків на вкриті нітроцелюлозою мішені та стандартними параметрами вимірювання. Точність визначених таким чином мас, як правило, є кращою за 0,195. ав 30 Відокремлення та виділення продуктів розщеплення здійснювали, застосовуючи НРІ С-колонку НУ-ТАСН

С-18 зі зворотною фазою, 4,6х105мм (Немейк-Раскага Сотрапу, Раїо А, СА) зі стандартним ацетонітрилом: і. градієнт відокремлення ТЕА. Застосовуваною системою НРІ С була НР10О9ОМ (Немей-РасКкага Сотрапу, Раїо ю

АО, СА). со зв щі еюю 11111111 дстнию | пеню 00003

Плюкаюно0мввте 1 зеуновазтв) ввимює 00000 ч 4 детотениногля| тло 10 З с Фнява 000 00000000

З ФаяРє 000овшения 00000303 п

Сполуку даного винаходу піддають оцінці на її біодоступність при пероральному введенні, і таку оцінку (95) здійснюють описаним нижче способом. сл Фармакокінетику сполуки досліджують на собаках породи бігль, яких утримують без їжі.

Внутрішньовенне та пероральне введення випробуваної сполуки у 595 розчині глюкози здійснювали з (95) 50 тижневим інтервалом. о Зразки крові забирали безпосередньо перед введенням ліків (початок відліку), а потім 0,08, 0,25, 0,50, 0,75, 1,0, 1,5,2,0, 3,0, 4,0, 5,0 та 6,0 годин після введення.

Зразки плазми до аналізу зберігали замороженими («х-182С). 5 Для визначення кількості сполуки у плазмі застосовували спосіб НРІС з видобуванням твердої фази та ультрафіолетовим детектуванням. (Ф) Біоакумуляція сполуки даного винаходу при пероральному введенні становить близько 50965. г) Фармакокінетичні параметри для сполук розраховували некомпартментальними способами з застосуванням фармакокінетичної програми на базі РО У/іпМопіїп, версія 1,1 (Зсіепійіс Сопзикіпа Іпс., Арех, МС, США). во Будь-яка описана авторами нова особливість або комбінація особливостей вважається суттєвою для даного винаходу.

ПРИКЛАДИ:

Спосіб одержання сполуки даного винаходу та композицій, що містять цю сполуку, далі пояснюється на нижчеподаних прикладах, які, однак, не повинні тлумачитись як такі, що обмежують обсяг винаходу.

Структура сполуки підтверджується або високоефективною рідинною хроматографією (НРІ С), або ядерним б5 магнітним резонансом (ЯМР, ВгиКег 40Омгц), або рідинною хроматографією-мас-спектрометрією (І С-М5). Зсуви

ЯМР (4) представлено у мільйонних частинах (млн."), і даються лише вибрані піки, т. пл. означає точку плавлення, представлену в С. Колонкову хроматографію здійснюють, застосовуючи технологію, описану в роботі МУ.С. Б еї аї., 9У. Огу. Спет. 1978, 43, 2923-2925 на силікагелі Мегск 60 (Ап 9385). Сполуки, які застосовували як вихідні матеріали, є або відомими сполуками, або сполуками, які легсо можна одержати відомими способами. Застосованим розчином метанол/аміак є 1095 розчин аміаку в метанолі.

НРІ С-аналіз:

Спосіб А1.

КР-аналіз здійснювали, застосовуючи ультрафіолетове детектування при 214, 254, 276 та ЗОїнм на 218ТР54 70 4,бммч250мм 5т С-18 силікагелевій колонці (Те Зерагайопз сгоцр, Незрегіа), яку елюювали при мл/хв і 4226.

Колонку врівноважували 595 ацетонітрилом у буфері, що складався з 0,1М сульфату амонію, який доводили до рН 2,5 за допомогою 4М сірчаної кислоти. Після введення зразок елюювали градієнтом від 595 до 6090 ацетонітрилу у тому самому буфері протягом 5Охв.

Спосіб В1.

КР-аналіз здійснювали, застосовуючи ультрафіолетове детектування при 214, 254, 276 та ЗО1нм на 218ТР54 4,6бммх250мм бт С-18 силікагелевій колонці (Те Зерегайопз (згоир, Незрегіа), яку елюювали при Тмл/хв і 4226.

Колонку врівноважували 5905 (ацетонітрилн0,1ї 96 ТЕА) у водному розчині ТЕА у воді (0,195). Після введення зразок елюювали градієнтом від 595 до 6095 (ацетонітриля0,195 ТРА) у тому самому водному буфері протягом 5ОХвВ.

Спосіб НПВ:

КР-аналіз здійснювали, застосовуючи ультрафіолетове детектування при 214 та 254нм на 218ТРБ54 4,б6ммх150мм С-18 силікагелевій колонці, яку елюювали при імл/хв і 42 «С. Колонку врівноважували 590 ацетонітрилу, 8595 води та 1095 розчину 0,595 трифторооцтової кислоти у воді і елюювали лінійним градієнтом від 595 ацетонітрилу, 85956 води та 1095 розчину 0,595 трифторооцтової кислоти до 9095 ацетонітрилу та 1095..:СМ розчину 0,595 трифторооцтової кислоти за 15хв. о

Хіральна НРІС:

Хіральну НРІ С здійснювали, застосовуючи ультрафіолетове детектування при 225 та 254нм на 4,б6мм Х 250мм колонці СВігасе! 0), оснащеною 4,бммх8вОмм попередньою колонкою СпВігасе! 0), (обидві від Оаїсе!

Спетісаї! Іпаивігієв, І ТО), які елюювали при 0,7мл/хв при кімнатній температурі. Зразокелюювали ізократичним (52 елюентом гептану(92)і1РгОН(В8): ТРА(О, 1). со

І С-М5-аналіз:

І С-М8-аналізи здійснювали на системі РЕ Зсіех АР1100 І С/М5, застосовуючи симетричну колонку МУаїсте? М

Зммх15О0мм З,5м С-18 та розпилення позитивних іонів при швидкості потоку 20мл/хв. Колонку елюювали лінійним со градієнтом 5-9095 ацетонітрилу, 85-095 води та 10 95 трифторооцтової кислоти (0,195) води за 15хв при

Швидкості потоку мл/хв. в.

Скорочення:

ТС: тонкошарова хроматографія рМ5О: диметилсульфоксид « хв: хвилини год: години т с Вос: трет-бутилоксикарбоніл "» ОМЕ: диметилформамід " ТНЕ: тетрагідрофуран

ЕБАС: М-етил-М'-диметиламінопропілкарбодимідгідрохлорид

НОАС 1-гідррксі-7-азабензотриазол - ОРІЕА: діізопропілетиламін с ТЕА: трифторооцтова кислота

Складові блоки: 1 М-метильовані амінокислоти, застосовані у представлених нижче прикладах, одержували, як описано у Сап. с 20 3). Спет. 1977, 55, 906.

М',М'-диметилгідразид мурашиної кислоти «2 Суміш 5Омл метилформату та 5Омл 1,1-диметилгідразину перемішували протягом З днів при кімнатній температурі. Концентрували іп масо для утворення кристалів, які перемішували в ЕН/З):гептані(95), охолоджували в холодильнику до наступного дня і фільтрували: 50,7г (575ммоль) (Вихід: 88905) 22 М,М,М'-триметилгідразин. дигідрохлорид о У дволітрову колбу з трьома шийками та круглим дном, оснащену магнітною мішалкою та лійкою для подачі, подавали 20,4г ГіАІН,, відкачували повітря і промивали азотом. Лійку для подачі після цього оснащали азотним о барботером і повільно додавали 250мл сухого тетрагідрофурану (екзотермічно). Суспензію сірого кольору енергійно перемішували і по краплях протягом 1 години додавали розчин 40,0г М,М'-диметилгідразиду 60 мурашиної кислоти в 250мл сухого тетрагідрофурану. Перемішували до наступного дня при кімнатній температурі. Реакцію контролювали за допомогою ТІ С (СНоСІг(100):МеОоН(10):МНІ(1)).

У другу дволітрову колбу з треома шийками та круглим дном, оснащену конденсатором сухого льоду, подавали ЗбОмл 4,8М НСІ/СНЗОН і поміщували у баню з сухим льодом (-7092С). Потім її з'єднували з реакційною колбою через мідгеих-конденсатор, і реакційну колбу поміщували на олійну баню. До" реакційної бо суміші обережно додавали суміш 200мл тетрагідрофурану та 200мл Меон. Дистиляцію продукту та розчинника здійснювали шляхом повільного нагрівання до 130 С, в результаті чого збирали кристалічну дигідрохлоридну сіль триметилгідразину (при-702С). Баню з сухим льодом видаляли і температурі давали піднятися до кімнатної температури. Концентрація іп масо давала рідку безбарвну олію, яку висушували до наступного дня, застосовуючи високовакуумний насос: 45,2г (З09ммоль) (Вихід: 6895). Цей дуже гігроскопічний продукт тримали в атмосфері азоту.

Інші вихідні матеріали можна придбати у Аїагіси.

Приклад 1

Процедура одержання сполуки, яка є або 70. 2-аміно-М-К1к)-2-(ЗК)-3-бензил-3-(М,М,М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1--1Н-індол-3-ілметил)-2- оксоетил|-2-метилпропіонамідом

У нів м. Ї «кох, й ще ще: або 2-аміно-М-(К1к)-2-(35)-3-бензил-3-(М,М,М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-(1Н-індол-3-ілметил )-2-оксоетил|-2-метилпропіонамідом

Й ча СА, . с

Етапа о

З-етиловий естер піперидин-1.3-дикарбонової кислоти 1-трет-бутилового естеру чать.

В однолітрову колбу з однією шийкою та круглим дном, оснащену магнітною мішалкою та лійкою для подачі «2 завантажували гранули МаонН (15,6г), тетрагідрофуран (400мл) та етилніпекотат (5Омл, 324ммоль). До со перемішуваної суміші при кімнатній температурі по краплях додавали розчин ВоС 250 (84,9г, З89ммоль), розчиненого в тетрагідрофурані (15Омл) (1год, білий твердий осад, розчинений з гранулами МаонН, екзотерм.). МО

Суміш перемішували до наступного дня при кімнатній температурі. Цю суміш додавали до ЕЮАс (500мл) та НО со (2000мл), і водний шар реекстрагували ЕЮАс (2Х500мл) і комбіновані органічні шари промивали сольовим

Зо розчином (100мл), висушували над МазО,, фільтрували і концентрували іп масо для одержання З-етилового о естеру піперідин-1,3-дикарбонової кислоти 1-трет-бутилового естеру (82,5г) у вигляді рідкої жовтої олії. 7Н-ЯМР (З00МНа, СОСІв): 5 1,25 (Її, ЗН, СН); 1,45 (в, ЗН, ЗХСН»); 2,05 (т, 1Н); 2,45 (т, 1Н); 2,85 (т, 1Н); 3,95 (а (широк.), 1Н); 4,15 (д, 2Н, СНо) «

Етап б с 50 З-етиловий естер 3-бензилпіперідин-13-дикарбонової кислоти 1-трет-бутилового естеру (рацемічна суміш) З з» пз 7

З дволітрової колби з трьома шийками та круглим дном, оснащеної магнітною мішалкою, термометром, азотним барботером та лійкою для подачі відкачували повітря, промивали азотом, завантажували безводним і тетрагідрофураном (500мл) і охолоджували до -702С. Потім додавали діїзопропіламін літію (1б4мл 2,0М розчину (4) в тетрагідрофурані, 327ммоль). До перемішуваного розчину при -7092С по краплях пртягом 45хв додавали розчин сл З-етилового естеру піперідин-1,3-дикарбонової кислоти 1-трет-бутилового естеру (80г, 311ммоль) у безводному тетрагідрофурані (5Омл) (температура від -709С до -602С, прозорий червоний розчин). Суміш перемішували (95) 50 протягом 20хв., після чого протягом 40хв. по краплях додавали розчин бензилброміду (37мл, З311ммоль) у о безводному тетрагідрофурані (25Омл) (температура від -702С до -60С). Суміш перемішували протягом 1 години при -702С, а потім залишали до наступного дня при кімнатній температурі (блідо-оранжевий колір). Реакційну суміш концентрували іп масио до приблизно З0О0мл, переносили до ділильної лійки, розріджували СНоСІі» 5Б (900мл) і промивали НО (900мл). Через погане відокремлення водний шар реекстрагували СН Сі» (200мл), комбіновані органічні шари промивали водним розчином Ман5о4 (200мл, 1095), водним розчином Мансо»з (Ф) (200мл, насичен.), НьО (200О0мл), сольовим розчином (10О0мл), висушували над МазсСИи, фільтрували і ка концентрували іп масцо для одержання олії, яку розчиняли в Е(Ас (1):гептані(10) і окиснювали до наступного дня. Утворені тверді речовини видаляли шляхом фільтрації, промивали гептаном і висушували іп масо для бр одержання рацемічної суміші З-етилового естеру 3-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти 1-трет-бутилового естеру (81,4г).

Ріс фехІвеівтях бо Етап в

1-трет-бутиловий естер 3-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти (рацемічна суміш) по

З-етиловий естер З3-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти 1-трет-бутилового естеру (81 г, 23З3ммоль) розчиняли в ЕН (400мл) та Маон (400мл, 1695 водний розчин) в однолітровій колбі з однією шийкою та круглим дном, оснащеній конденсатором та магнітною мішалкою. Суміш піддавали дефлегмації протягом 10год в атмосфері азоту і охолоджували до кімнатної температури, концентрували іп масо до приблизно бООмл 70 (твердий осад), розріджували НоО (400мл), охолоджували в льодяній ванні і при енергійному перемішуванні підкислювали 4М НьБзО); до рН-З (кінцева температура 2822). Суміш екстрагували ЕЮАс (2Х7О0Омл) і комбіновані органічні шари промивали сольовим розчином (200мл), висушували над Мо95О,, фільтрували і концентрували іп масцо для одержання олії, яку розчиняли в Е(Ас (1):гептані(10) і окиснювали до наступного дня. Утворені кристали видаляли шляхом фільтрації, промивали гептаном і висушували іп масо для одержання 7/5 рацемічної суміші 1-трет-бутилового естеру З-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти (66,Ог) пРіствувстяя 11111111 нествюехв вав

Етап г 1-трет-бутиловий естер (З3К)-3-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти або 1-трет-бутиловий естер СМ (35)-3-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти о (Зворотне розчинення 1-трет-бутиловий естеру З-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти) че «в) або со пз ю со 1-трет-бутиловий естер З-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти (7бг, 23в8ммоль) розчиняли в ЕЮАс ча (540 І) у п'ятилітровій колбі з однією шийкою, оснащеній магнітною мішалкою. Потім додавали НО (ЗОмл),

К(У-1-фенетиламін (18,2мл, 14Зммоль) та ЕБМ (13,2мл, 95ммоль) і суміш перемішували до наступного дня при кімнатній температурі, в результаті чого осаджувалися білі кристали (41,9г), які видаляли шляхом фільтрації, промивали Е(Ас і висушували іп масою. Осад розчиняли в суміші водного МаНнЗО ; (З0Омл, 1095) та ЕЮАс « (6(Х)мл), шари відокремлювали і водний шар реекстрагували ЕАс (100мл). Комбіновані органічні шари -у с промивали сольовим розчином (10Омл), висушували над Мо5О, і фільтрували. Розчинник видаляли іп масо для одержання безбарвної олії, яку розчиняли в Е(ОАс (1):гептані(10) і окиснювали до наступного дня. Утворені :з» кристали видаляли шляхом фільтрації, промивали гептаном і висушували іп масио для одержання однієї сполуки, яка є або 1-трет-бутиловим естером (З3К)-3З-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти, або 1-трет-бутиловим естером (35)-3-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти (27,8Г). -І Хіральна НРІ С (Спігасеї! 0), гептан(92):ІРОН(8):ТРА(О 1)): -7,96хв. 95,895 ее о Етапд с Трет-бутиловий естер (З3К)-3-бензил-3-(М,М,М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-карбонової кислоти с 50 або трет-бутлловий естер (35)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-карбонової кислоти о не

Триметилгідразиндигідрохлорид (15,3г, 104ммоль) суспендували у тетрагідрофурані (250мл) в однолітровій 5Б колбі з однією шийкою та круглим дном, оснащеній великою магнітною мішалкою та лійкою для подачі/азотним барботером. Після цього колбу поміщували у водяну баню (темп: 10-20 оС), додавали

Ф) бромо-трис-піролідино-фосфоній-гексафторофосфат (40,4г, 86,7ммоль) і при енергійному перемішуванні по ко краплях додавали діізопропілетиламін (59мл, 347ммоль). Суміш (з інтенсивним осадженням) перемішували протягом 5хв і протягом 1,5год повільно додавали розчин продукту етапу г, який був або 1-трет-бутиловим бо естером (3К)-3-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти, або 1-трет-бутиловим естером (35)-3-бензилпіперідин-1,3-дикарбонової кислоти (27,7г, 86,7ммоль) у тетрагідрофурані (25О0мл). Суміш перемішували до наступного дня при кімнатній температурі. Реакційну суміш розріджували ЕЮАс (100Омл), промивали НоО (500мл), водним розчином Манзо,, (200мл, 1095), водним розчином МансСоО»з (20Омл, насиченим), сольовим розчином (200мл), висушували над М950О5, фільтрували і концентрували іп масо для 65 одержання рідкої оранжевої олії. Суміш розчиняли в ЕЮАс (З00мл), додавали до ЗІО 25 (150г) і концентрували іп масцо до одержання білого порошку, який наносили на фільтр з 5іО 5 (150г), промивали гептаном (1л) і потрібну сполуку виділяли ззастосуванням ЕЮдАс (2,51). Після концентрації іп масо одержували продукт, який був або трет-бутиловим естером (З3К)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)-піперідин-1-карбонової кислоти, або трет-бутиловим естером (33)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)-піперідин-1-карбонової кислоти (49г) у вигляді оранжевої олії.

НРІ С (НВ): К-14,33Ххв.

Етапе

Триметилгідразид (3К)-3-бензил-піперидин-3-карбонової кислоти або триметилгідразид 70 (35)-3-бензил-піперідин-3-карбонової кислоти св, щея сн, /5 або си и ти сов, іч

Продукт етапу д, який є або трет-бутиловим естером, (38)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)-піперідин-1-карбонової кислоти, або трет-бутиловим естером (35)-3-бензил-3-(М,М'М'-триметилгідразинокарбоніл)-піперідин-1-карбонової кислоти (56, 7г, 100, 9ммоль), розчиняли в ЕЮАс (500мл) (прозорий безбарвний розчин) у дволітровій колбі з однією шийкою та круглим дном, оснащеною магнітною мішалкою. Після цього колбу розміщували на водяну баню (темп. 10-202С) і протягом бхв крізь розчин пропускали НСіІ-газ (пилоподібний осад). Після перемішування протягом год с (осадження великої кількості білих кристалів) розчин промивали М2 для видалення надлишку НСІ. Осад Го) видаляли шляхом обережної фільтрації, промивали ЕЮАс (2Х10Омл) і висушували у вакуумі при 40 С до наступного дня для одержання продукту, який є або триметилгідразидом (З3К)-3-бензил-піперідин-3-карбонової кислоти, або триметилгідразидом (35)-3-бензил-піперідин-3-карбонової кислоти (37,ОГг).

НРІ С (НВ): К7,84хв. о

Етап є со

Трет-бутиловий естер

І1кО-2-(ЗК)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)-піперідин-1-ілі-1-41Н-індол-З-іл)уметил)-2-оксоет юю илікарбамінової кислоти або трет-бутиловий естер с

І1кО)-2-(35)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)-піперідин-1-ілІ|-1-(1Н-індол-З-іл)уметил)-2оксоети лікарбамінової кислоти - она. « - с або 2» -. во ще

Ш- ни ! ! -

Вос-О-Ттр-ОН (32,3г, 10бммоль) розчиняли в диметилацетаміді (25Омл) у колбі з однією шийкою та круглим о дном (500мл), оснащеній магнітною мішалкою та азотним барботером. Розчин охолоджували до 0-59С і с додавали 1-гідрокси-7-азабензотриазол (14,4г, 10бммоль), 1-етил-3-(З-диметиламінопропіл)карбодіїмідгідрохлорид (20,3г, 10бммоль), М-метилморфолін (11,бмл, і 10бммоль). Після перемішування протягом 20Охв. при 0-5 оС додавали продукт етапу є, який був або о триметилгідразидом (3К)-3-бензил-піперидин-3-карбонової кислоти, або триметилгідразидом (35)-3-бензил-піперидин-З-карбонової кислоти (37,0г, 1О0бммоль), та М-метилморфолін (24,4мл, 22З3ммоль).

Реакційну суміш перемішували до наступного дня при кімнатній температурі. Потім цю суміш додавали до ЕЮАс вв (750мл) і промивали водним розчином Манзо, (З0Омл, 10965). Шарам давали відокремитись і водний шар реекстрагували ЕОАс (500мл). Комбіновані органічні шари промивали НО (100мл), водним розчином МансСо»з

Ф) (З0Омл, насиченим), НоО (10Омл), сольовим розчином (З0О0мл), висушували над Мазо,), фільтрували і ко концентрували іп масо для одержання продукту, який є або трет-бутиловим естером

І1кО-2-(ЗК)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-41Н-індол-З-іл)уметил)-2-оксоети бо лікарбамінової кислоти, або трет-бутиловим естером

І1кО-2-(35)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-(1Н-індол-3-іл)уметил)-2-оксоети лікарбамінової кислоти (56,7г) у вигляді оранжевої олії. зеістюкєтеях ве

Етап ж

Триметил гідразид 1-(2К)-2-аміно-3-(1Н-індол-3-іл)пропіоніл|-(3ЗК)-3-бензилпіперідин-З-карбонової кислоти або триметилгідразид 1-(2К)-2-аміно-3-(1Н-індол-3-іл)пропіоніл|-(35)-3-бензилпіперідин-3-карбонової кислоти

К з і «

Й І ще: й або сн,

Продукт етапу є, який є або трет-бутиловим естером

І1кО-2-(ЗК)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-41Н-індол-З-іл)уметил)-2-оксоети лікарбамінової кислоти, або трет-бутиловим естером

І1кО-2-(ЗК)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-41Н-індол-З-іл)уметил)-2-оксоети лікарбамінової кислоти (56,7г, 100,9ммоль) розчиняли в ЕЮЮАс (500мл) (прозорий безбарвний розчин) у колбі з однією шийкою та круглим дном (2л), оснащеною магнітною мішалкою. Після цього колбу розміщували на водяну баню (темп. 10-2022) і крізь розчин протягом 1Охв пропускали НСІ-газ (інтенсивне осадження олії). Суміш промивали Мо для видалення надлишку НОСІ, а потім розділяли на олійний та ЕЮАс-шари. ЕЮАс-шар видаляли. сч ре Олію розчиняли в Н.О (500мл), СНЬСІ» (1000Омл) і додавали тверду сіль МагСО»з до рН»7. Шари відокремлювали і органічний шар промивали Но (100мл), сольовим розчином (100мл), висушували над Ма5О,, фільтрували і (о) концентрували іп масо для одержання продукту, який є або триметилгідразидом 1-К2кК)-2-аміно-3-(1Н-індол-З-іл)пропіоніл|-(ЗК)-3-бензилпіперідин-3-карбонової кислоти, або триметилгідразидом 1-К2к)-2-аміно-3-(1Н-індол-З3-іл)пропіоніл|-(35)-3-бензилпіперідин-З-карбонової //- кислоти о 20 (27г) у вигляді оранжевої піни.

НРІ С(НВ8): КЧ-10,03хв. со

Етап з Й ою

Трет-бутиловий естер 11-(1к)-2-(3К)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-(1Н-індол-3-іл)метил)-2-оксо- (зе) етилкарбамоїл|-1-метилетил)карбамінової кислоти або трет-бутиловий естер м 11-(1к)-2-(35)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-(1Н-індол-3-іл)метил)-2-оксо- етилкарбамоїлі-1-метилетил)карбамінової кислоти

Хо ув « ми», з нано: "7 о - або и? т з еру -І (95) Вос-АЇр-ОН (11,9г, 58,4ммоль) розчиняли в диметилацетаміді (125мл) у колбі з однією шийкою та круглим сл дном (500мл), оснащеній магнітною мішалкою та азотним барботером. До перемішуваного розчину при кімнатній температурі додавали 1-гідрокси-7-азабензотриазол (7,95г, 58,4мМмоль), (95) 1-етил-3-(З-диметиламінопропіл)карбодиімідгідрохлорид (11,2г, 58,4ммоль), та дізопропілетиламін (13,Омл, о 75,8ммоль). Через 20хв (жовтий з осадом) додавали розчин продукту етапу ж, який є або триметилгідразидом 1-К2кК)-2-аміно-3-(1Н-індол-З-іл)пропіоніл|-(ЗК)-3-бензилпіперідин-3-карбонової кислоти, або триметилгідразидом 1-К2к)-2-аміно-3-(1Н-індол-З3-іл)пропіоніл|-(35)-3-бензилпіперідин-З-карбонової //- кислоти 5 (27,0г, 58,4ммоль) у диметилацетаміді (125мл). Реакційну суміш перемішували при кімнатній температурі протягом Згод. Цю суміш додавали до ЕЮАс (75О0мл) і промивали водним розчином Мансо з (З0Омл, 10905). (Ф) Шарам давали відокремитись і водний шар реекстрагували ЕТОАс (500мл). Комбіновані органічні шари

Ге промивали НьО (100мл), водним розчином МансСоО»з (З0О0мл, насиченим), НО (10Омл), сольовим розчином (З00мл), висушували над МозО,, фільтрували і концентрували іп масо до приблизно 500мл. Потім додавали

БІО» (150г) і решту ЕІЮАс видаляли іп масцо для одержання сухого порошку, який наносили на фільтр з БІО 5 60 й й й й ни (150г), промивали гептаном (1л) і потрібну сполуку виділяли з застосуванням ЕАс (2,5л). Після концентрації іп масо одержували продукт, який є або трет-бутиловим естером 11-К1к)-2-(3К)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-«1Н-індол-3-ілметил)-2-оксо-е тилкарбамоїл|-1-метилетил)карбамінової кислоти, або трет-бутиловим естером в5 11-(1к)-2-(35)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-«1Н-індол-3-ілметил)-2-оксо-е тилкарбамоїл)|-1-метилетил)карбамінової кислоти, 33,9г у вигляді оранжевої піни.

НРІ С(НВ8): КЧ-14,05хв.

Етапи 2-аміно-М-К1к)-2-(3К)-3-бензил-3-(М.М'.М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-ілІ|-1-(1Н-індол-3-ілмети л)-2-оксоетил|-2-метилпропіонамід, фумарат або 2-аміно-Щ(1К)-2-(35)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-ілі-1-(1Н-індол-3-ілметил)-2- оксоетил|-2-метилпропіонамід, фумарат 5. . що ес не ше ие або ц ст, і, ков 1 сн,

Продукт етапу 3, який є або трет-бутиловим естером 11-К1к)-2-(3К)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-«1Н-індол-3-ілметил)-2-оксо-е тилкарбамоїл|-1-метилетил)карбамінової кислоти, або трет-бутиловим естером 11-(1к)-2-(35)-3-бензил-3-(М,М,М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-ілІ|-1-(1Н-індол-3-ілметил)-2-оксо-ет илкарбамоїл)|-1-метилетил)карбамінової кислоти (23,8г, 36,8ммоль) розчиняли в Е(Ас (800мл) (прозорий жовтий розчин) у колбі з однією шийкою та круглим дном (1л), оснащеній магнітною мішалкою. Після цього колбу сч ов розміщували на водяну баню (темп. 110-202) і крізь розчин протягом 5хв пропускали НСІ-газ (пилоподібний осад). Після перемішування протягом год (осадження великої кількості жовтого порошку) розчин промивали М 2 о для видалення надлишку НСІ. Осад видаляли шляхом обережної фільтрації і висушували у вакуумі при 40920 до наступного дня.

Некристалічний осад розчиняли в НО (500мл) і промивали ЕІЮАс (100мл). Потім додавали СНЬСІ» (1000О0мл) «з зо та тверду сіль МагСОз до рН»7. 2 шари відокремлювали один від одного і водний шар реекстрагували СНЬСІ» (200мл). Комбіновані органічні шари промивали сольовим розчином (100мл), висушували над Мо5оО, і о фільтрували. Розчинник випарювали в умовах зниженого тиску і піддавали зворотному розчиненню в ЕЮАс юю (БбОмл) у колбі з однією шийкою та круглим дном (1л), оснащеній магнітною мішалкою. Поволі додавали суспензію фумарової кислоти (3,67г) в ізопропанолі (2О0мл) та ЕТОАс (5Омл) (бхв.), в результаті чого о осаджувалася біла кристалічна сіль. Через 1 годину осад відокремлювали шляхом фільтрації і висушували до ч- наступного дня у вакуумі при 40 9С для одержання фумаратної солі сполуки, яка є або 2-аміно-М-(1к)-2-(3К)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-(1Н-індол-3-ілметил)-2 -оксоетил|-2-метилпропіонамідом або « 2-аміно-М-К1к)-2-(35)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-(1Н-індол-3-ілметил)-2 -оксоетил|-2-метилпропіонамідом (13,9г), у вигляді білого порошку. - с . пРізідо вевая » Пів взає -І оо

Claims

Формула винаходу й 1 Й і95) 2-аміно-М-(1к)-2-(3К)-3-бензил-3-(М,М',М'-триметилгідразинокарбоніл)піперидин-1-іл|-1-(1Н-індол-3-ілметил)-2 о -оксоетил|-2-метилпропіонамід Н

І

5. (В) сн (Ф) о | І не щ М.

з Н.М М М Мен, н сн, во сн, о шк. - й або його фармацевтично прийнятна сіль. ве 2. Фармацевтична композиція, яка містить як активний інгредієнт сполуку за п. 1 разом із фармацевтично прийнятним носієм або розріджувачем.

З. Фармацевтична композиція за п. 2 для стимулювання вивільнення гормону росту з гіпофізу.

4. Фармацевтична композиція за п. 2 або З для введення тваринам для збільшення швидкості та міри росту, для збільшення їх удійності та росту шерсті, або для лікування захворювань.

5. Спосіб стимулювання вивільнення гормону росту з гіпофізу ссавця, який включає введення вищезгаданому ссавцеві ефективної кількості сполуки за п. 1 або фармацевтичної композиції згідно з будь-яким з пп. 2-4.

6. Спосіб збільшення швидкості та міри росту, збільшення удійності та росту шерсті, або лікування захворювань, який включає введення суб'єктові, який цього потребує, ефективної кількості сполуки за п. 1 або фармацевтичної композиції згідно з будь-яким з пп. 2-4. 70 7. Застосування сполуки за п. 1 або її фармацевтично прийнятної солі для одержання медикаменту.

8. Застосування за п. 7 для одержання медикаменту для стимулювання вивільнення гормону росту з гіпофізу ссавця. Офіційний бюлетень "Промислоава власність". Книга 1 "Винаходи, корисні моделі, топографії інтегральних 7/5 Мікросхем", 2005, М 8, 15.08.2005. Державний департамент інтелектуальної власності Міністерства освіти і науки України. с щі 6) «в) Зо со ів) (зе) і -

- . и? -і (95) 1 (95) (42) іме) 60 б5