DE68912775T2 - Polypeptid-verbindungen mit hormonwachstumsbefreiender wirkung. - Google Patents

Polypeptid-verbindungen mit hormonwachstumsbefreiender wirkung.

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DE68912775T2
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    • C07K14/435Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
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Description

  • Diese Erfindung betrifft neuartige Polypeptidverbindungen, die bei Verabreichung an Tiere die Freisetzung von Wachstumshormon fördern. Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung betrifft Verfahren zur Förderung der Freisetzung und zur Erhöhung der Wachstumshormonspiegel bei Tieren durch Verabreichung von bestimmten wachstumshormonfreisetzenden Polypeptidverbindungen an diese.
  • Der Erfindung zugrunde liegender Stand der Technik
  • In der wissenschaftlichen Literatur gilt als gesichert, daß die Erhöhung von Wachstumshormon-(GH)-Spiegeln bei Tieren nach Verabreichung von GH-freisetzenden Verbindungen zu einem verbesserten Körpergewicht und zu einer verbesserten Milchproduktion führen kann, wenn nach der Verabreichung ausreichend erhöhte GH-Spiegel auftreten. Ferner ist bekannt, daß die Erhöhung der Wachstumshormonspiegel bei Tieren durch Anwendung von bekannten wachstumshormonfreisetzenden Wirkstoffen erzielt werden kann, wie zum Beispiel die natürlich vorkommenden Wachstumshormonfreisetzenden Hormone.
  • Die Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln bei Säugetieren kann auch durch Anwendung von wachstumshormonfreisetzenden Peptiden erzielt werden, von denen einige bereits beschrieben wurden, beispielsweise durch F.A. Momany in der U.S. 4,223,019, U.S. 4,223,020, U.S. 4,223,021, U.S. 4,224,316, U.S. 4,226,857, U.S. 4,228,155, U.S. 4,228,156, U.S. 4,228,157, U.S. 4,228,158, U.S. 4,410,512 und U.S. 4,410,513.
  • Antikörper für den endogenen Wachstumshormonfreisetzungsinhibitor, Somatostatin (SRIF) wurden ebenfalls verwendet, um erhöhte GH-Spiegel zu verursachen. In diesem letzteren Beispiel werden die Wachstumshormonspiegel durch Entfernen des endogenen OH-Freisetzungsinhibitors (SRIF) vor Erreichen der Hypophyse erhöht, wo er die Freisetzung von GH hemmt.
  • Bei jedem dieser Verfahren zur Förderung der Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln sind Materialien beteiligt, die mit hohem Kostenaufwand zu synthetisieren und/oder in ausreichender Reinheit zur Verabreichung an ein Empfängertier zu isolieren sind. Kurzkettige, relativ einfache Polypeptide mit niedrigem Molekulargewicht, die relativ preiswert herzustellen sind und die Fähigkeit zur Förderung der Freisetzung von Wachstumshormon haben, wären erstrebenswert, da sie ohne weiteres und preiswert herzustellen sein sollten, problemlos chemisch und/oder physikalisch zu modifizieren sein sollten sowie ohne weiteres gereinigt und formuliert werden könnten. Auch sollten sie herausragende Transporteigenschaften haben.
  • Aufgaben der Erfindung
  • Es ist daher eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neuartige wachstumshormonfreisetzende Verbindungen zu schaffen, die in der Lage sind, die Freisetzung und Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln im Blut von Tieren zu fördern.
  • Es ist eine weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung, Verfahren zur Förderung der Freisetzung und/oder Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln im Blut von Tieren zu schaffen.
  • Diese und weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden durch Studium der folgenden Beschreibung und Patentansprüche augenscheinlich.
  • Kurzbeschreibung der Erfindung
  • Gemäß vorliegender Erfindung haben wir neuartige Polypeptidverbindungen entdeckt, die die Freisetzung von Wachstumshormon bei Tieren fördern. Die Herstellung, Charakterisierung und Verabreichung dieser neuartigen wachstumshormonfreisetzenden Verbindungen wird nachfolgend im Detail beschrieben.
  • Detaillierte Beschreibung der Erfindung
  • Die vorliegende Erfindung basiert auf der Entdeckung von kurzkettigen (d.h. sechs bis zehn Aminosäurereste) Polypeptiden, die die Freisetzung und die Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln im Blut von Tieren fördern. Die als innerhalb des Umfanges der vorliegenden Erfindung liegend betrachteten Polypeptide sind durch die folgende allgemeine Struktur definiert:
  • Ala-AA2-AA3-Trp-AA5-Y-Z,
  • wobei
  • AA2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DPhe, DTrp, 5-Fluor-D oder D/LTrp; 6-Fluor-D oder D/LTrp (d.h., wobei der Indolring an der 5- oder 6-Position fluoriert ist), (Formyl)DTrp (d.h. DTrp, das am Indolstickstoff formyliert ist), *XTrp, wobei *XTrp ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den N-monomethylierten DTrp-Isomeren (d.h. (NαMe)DTrp und (Indol-NMe)DTrp), DαNal und DβNal;
  • AA3 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ala, Gly und Ser;
  • AA5 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DPhe und (NMe)DPhe;
  • Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
  • (a) AA7, wobei AA7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arg, iLys, Lys und Orn; und
  • (b) -AA6-AA7, wobei AA6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus allen natürlich vorkommenden L-Aminosäuren, Dipeptiden der natürlich vorkommenden L-Aminosäuren, z.B. Ala-Ala, und Verbindungen der Formel:
  • H&sub2;N-(CH&sub2;)n-CO&sub2;H, wobei n = 1-12,
  • und wobei AA7 wie vorstehend definiert ist; und
  • Z die C-terminale Endgruppe des Polypeptids oder die C-terminale(n) Aminosäure(n) plus Endgruppe darstellt, wobei Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CONH&sub2;, -COOH, -COOR, -CONHR, -CONR&sub2;, -CH&sub2;OH und -CH&sub2;OR, wobei R eine Alkylgruppe mit 1 - 6 Kohlenstoffatomen oder ein aromatischer Ring mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist; und wobei Z alternativ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -Gly-Z', -Met-Z', -Lys-Z', -Cys-Z', -Gly-Tyr-Z', und Ala-Tyr-Z', wobei Z' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CONH&sub2;, -CONHR, -COOH, -COOR, -CONR&sub2;, -CH&sub2;OH, und -CH&sub2;OR, wobei R wie vorstehend definiert ist;
  • und organischen oder anorganischen Additionssalzen jedes beliebigen der Polypeptide;
  • wobei die verwendeten Aminosäurerestabkürzungen mit der Standardpeptidnomenklatur übereinstimmen:
  • Gly = Glycin
  • Tyr = L-Tyrosin
  • Ile = L-Isoleucin
  • Glu = L-Glutaminsäure
  • Thr = L-Threonin
  • Phe = L-Phenylalanin
  • Ala = L-Alanin
  • Lys = L-Lysin
  • Asp = L-Asparaginsäure
  • Cys = L-Cystein
  • Arg = L-Arginin
  • Gln = L-Glutamin
  • Pro = L-Prolin
  • Leu = L-Leucin
  • Met = L-Methionin
  • Ser = L-Serin
  • Asn = L-Asparagin
  • His = L-Histidin
  • Trp = L-Tryptophan
  • Val = L-Valin
  • DOPA = 3,4-Dihydroxyphenylalanin
  • Met(O) = Methioninsulfoxid
  • Abu = α-Aminobuttersäure
  • iLys = Nε-Isopropyl-L-Lysin
  • 4-Abu = 4-Aminobuttersäure
  • Orn = L-Ornithin
  • DαNal = α-Naphthyl-D-Alanin
  • DβNal = ß-Naphthyl-D-Alanin
  • Alle aus drei Buchstaben bestehenden Aminosäureabkürzungen, denen ein "D" vorangeht, bezeichnen die D-Konfiguration des Aminosäurerestes, während Abkürzungen, denen ein "D/L" vorangeht, eine Mischung der D- und L-Konfigurationen der betreffenden Aminosäure bezeichnen. Für Zwecke dieser Offenbarung wird Glycin als in den Begriff "natürlich vorkommende L-Aminosäuren" eingeschlossen betrachtet.
  • Die mit der Auswahl von basischen, neutralen oder sauren Aminosäureresten für die Aminosäuren AA2, AA3, AA5 und Y verbundene Flexibilität verleiht ein hohes Maß an Kontrolle über die physiochemischen Eigenschaften des gewünschten Peptids. Diese Flexibilität bietet wichtige Vorteile für die Formulierung und Übertragung des gewünschten Peptids auf jede gegebene Spezies. Zusätzliche Flexibilität kann durch die Tatsache verliehen werden, daß die Anteile R, Z und Z' ebenfalls variiert werden können, was eine zusätzliche Kontrolle über die physiochemischen Eigenschaften der gewünschten Verbindung bietet.
  • In der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung bevorzugt verwendete wachstumshormonfreisetzende Verbindungen sind ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus:
  • Ala-AA2-Ala-Trp-AA5-AA7-NH&sub2;,
  • Ala-AA2-Ala-Trp-AA5-AA6-AA7-NH&sub2;, und
  • organischen oder anorganischen Additionssalzen jedes beliebigen der Polypeptide; wobei AA2, AA5, AA6 und AA7 wie vorstehend definiert sind.
  • Diese Verbindungen sind aufgrund der Einfachheit ihrer Synthese, der bewiesenen Wirksamkeit bei der Förderung einer Erhöhung von Serum-Wachstumshormonspiegeln und ihrer daraus folgenden Attraktivität für die Verwendung und Herstellung im gewerblichen Maßstab bevorzugt. Zusätzlich können diese Verbindungen durch physiochemische Eigenschaften vorteilhaft sein, die zur effizienten Übertragung derartiger Polypeptidverbindungen auf eine Vielzahl von Tierspezies wünschenswert sind. Aufgrund der durch die verschiedenen Substituierungen an zahlreichen Positionen der erfindungsgemäßen Polypeptidverbindungen ermöglichten Flexibilität kann ein breiter Bereich von Übertragungsträgerstoffen verwendet werden, indem die polare, neutrale oder nicht polare Natur der C-Endgruppe und des Mittelabschnittes dieser Polypeptidverbindungen so ausgewählt wird, daß sie mit dem gewünschten Übertragungsverfahren kompatibel ist.
  • In einer höchst bevorzugten Ausführungsform hat das in der praktischen Anwendung der vorliegenden Erfindung verwendete wachstumshormonfreisetzende Peptid die Sequenz:
  • Ala-AA2-Ala-Trp-AA5-AA7-NH&sub2;; oder
  • organische oder anorganische Additionssalze davon, wobei AA2, AA5 und AA7 wie vorstehend definiert sind. Ein besonders bevorzugtes Mitglied dieser höchst bevorzugten Gruppe von Verbindungen hat die Sequenz:
  • Ala-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;
  • sowie organische oder anorganische Additionssalze davon.
  • Diese Verbindungen sind gegenwärtig höchst bevorzugt, da diese kürzerkettigen Polypeptide kostengünstiger zu synthetisieren sind und für diese bestimmten Verbindungen ein hohes Potentialniveau zur Förderung der Erhöhung von Serum-Wachstumshormonspiegeln nachgewiesen wurde.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zur Erhöhung von Blut-GH-Spiegeln bei Tieren verwendet werden, zur Verbesserung der Milchproduktion bei Kühen, zur Verbesserung des Körperwachstums bei Tieren, wie etwa Säugetieren (z.B. Menschen, Schafe, Rinder und Schweine), sowie bei Fisch, Geflügel, anderen Wirbeltieren und Krustentieren, und zur Erhöhung der Woll- und/oder Pelzproduktion bei Säugetieren. Das Ausmaß des Körperwachstums ist vom Geschlecht und Alter der Tierspezies, Menge und Identität der verabreichten wachstumshormonfreisetzenden Verbindung, dem Verabreichungsweg und ähnlichem abhängig.
  • Die neuartigen Polypeptidverbindungen gemäß dieser Erfindung können gemäß den herkömmlichen Verfahren der Lösungs- und Festphasenpeptidchemie oder durch dem Fachmann bekannte klassische Verfahren synthetisiert werden. Die Festphasensynthese wird vom C-terminalen Ende des Peptids aus begonnen. Ein geeigneter Ausgangsstoff kann beispielsweise durch Anbinden der erforderlichen geschützten alpha-Aminosäure an einem chlormethylierten Harz, einem Hydroxymethylharz, einem Benzhydrylamin-(BHA)-Harz oder einem Paramethylbenzylhydrylamin-(p-Me- BHA)-Harz hergestellt werden. Ein derartiges Chlormethylharz wird unter dem Handelsnamen BIOBEADS SX-1 von Bio Rad Laboratories, Richmond, Calif. verkauft. Die Herstellung des Hydroxymethylharzes wurde von Bodansky et al., Chem. Ind. (London) 38, 1597 (1966) beschrieben. Das BHA-Harz wurde von Pietta und Marshall, Chem. Comm., 650 (1970) beschrieben und ist im Handel von Peninsula Laboratories, Inc. , Belmont, California erhältlich.
  • Nach dem ersten Anbinden kann die alpha-Aminoschutzgruppe durch eine Auswahl von sauren Reagenzien entfernt werden, darunter Trifluoressigsäure-(TFA)- oder Salzsäure-(HCl)-Lösungen in organischen Lösungsmitteln bei Raumtemperatur. Nach dem Entfernen der alpha-Aminoschutzgruppe können die verbleibenden geschützten Aminosäuren schrittweise in der gewünschten Reihenfolge angekoppelt werden. Jede geschützte Aminosäure kann allgemein in etwa einem dreifachen Überschuß unter Verwendung eines geeigneten Carboxylgruppenaktivators, wie z.B. Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) oder Diisopropylcarbodiimid (DIC) in Lösung, beispielsweise in Methylenchlorid (CH&sub2;CL&sub2;) oder Dimethylformamid (DMF) und Mischungen daraus umgesetzt werden.
  • Nach dem Vervollständigen der gewünschten Aminosäuresequenz kann das gewünschte Peptid durch Behandlung mit einem Reagens, wie z.B. Fluorwasserstoff (HF), vom Trägerharz abgespalten werden, das nicht nur das Peptid vom Harz abspaltet, sondern auch die meisten allgemein verwendeten Seitenkettenschutzgruppen abspaltet. Wenn ein Chlormethylharz oder Hydroxymethylharz verwendet wird, führt die Behandlung mit HF zur Bildung der freien Peptidsäure. Wenn das BHA- oder p-Me-BHA- Harz verwendet wird, führt die HF-Behandlung direkt zu freien Peptidamiden.
  • Das vorstehend erörterte Festphasenverfahren ist nach dem Stand der Technik bekannt und wurde von Stewart und Young in Solid Phase Pentide Svnthesis: 2. Ausgabe (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, 1984) beschrieben.
  • Einige der bekannten Lösungs-Verfahren, die zur Synthese der Peptidanteile der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind in Bodansky et al., Peptide Synthesis, 2. Ausgabe, John Wiley & Sons, New York, N.Y. 1976 dargelegt.
  • Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Förderung der Freisetzung und/oder Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln im Blut von Tieren vorgesehen. Das Verfahren umfaßt die Verabreichung einer wirksamen Dosis wenigstens eines der vorstehend beschriebenen Polypeptide an ein Tier.
  • Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf oralem, parenteralem (intramuskuläre (i.m.), intraperitoneale (i.p.), intravenöse (i.v.) oder subcutane (s.c.) Injektion), nasalem, vaginalem, rektalem oder sublingualem Verabreichungswege verabreicht werden und in für jeden Verabreichungsweg geeigneten Darreichungsformen formuliert werden.
  • Zu festen Darreichungsformen für die orale Verabreichung zählen Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate. Bei derartigen festen Darreichungsformen ist die aktive Verbindung mit wenigstens einem inerten Träger, wie etwa Sucrose, Lactose oder Stärke gemischt. Diese Darreichungsformen können auch, wie in der Praxis üblich, zusätzliche Substanzen neben den inerten Verdünnungsmitteln enthalten, z.B. Schmiermittel, wie etwa Magnesiumstearat. Bei Kapseln, Tabletten und Pillen können die Darreichungsformen ebenfalls puffernde Wirkstoffe umfassen. Tabletten und Pillen können zusätzlich mit enterischen Beschichtungen hergestellt sein.
  • Zu flüssigen Darreichungsformen zur oralen Verabreichung zählen Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirupe, wobei diese Elixiere inerte, allgemein nach dem Stand der Technik verwendete Verdünnungsmittel, wie z.B. Wasser, enthalten. Neben diesen inerten Verdünnungsmitteln können die Zusammensetzungen ferner Adjuvantien enthalten, wie z.B. Benetzungsmittel, emulgierende und suspendierende Wirkstoffe und süßende, geschmacksverleihende und parfürmierende Wirkstoffe.
  • Präparate gemäß dieser Erfindung zur parenteralen Verabreichung schließen sterile wässrige oder nicht wässrige Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen ein. Beispiele für nicht wässrige Lösungsmittel oder Träger sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, pflanzliche Öle, wie etwa Olivenöl und Maisöl, Gelatine und injizierbare organische Ester, wie etwa Ethyloleat. Diese Darreichungsformen können ebenfalls Adjuvantien, wie etwa konservierende, benetzende, emulgierende und dispergierende Wirkstoffe enthalten. Sie können beispielsweise durch Filtration durch ein bakterienundurchlässiges Filter, durch Beimischen von sterilisierenden Wirkstoffen in die Zusammensetzungen, durch Bestrahlen der Zusammensetzungen oder durch Erwärmen der Zusammensetzungen sterilisiert werden Sie können auch in einem Medium aus sterilem Wasser oder einem anderen sterilen injizierbaren Medium unmittelbar vor der Verwendung hergestellt werden.
  • Wie in unseren gleichzeitig anhängigen Anmeldungen Nr. 861,968 und S.N. 37,275, die hierin durch Bezugnahme eingeschlossen sind, vorgeschlagen, werden die neuartigen Verbindungen gemäß vorliegender Erfindung auch für nützlich gehalten, wenn sie in Kombination mit wachstumshormonfreisetzendem Hormon (d.h. natürlich vorkommendem wachstumshormonfreisetzendem Hormon, analogen und funktionellen Äquivalenten desselben) sowie in Kombination mit anderen Verbindungen, die die Freisetzung von Wachstumshormon fördern, verabreicht werden. Derartige Kombinationen stellen ein besonders bevorzugtes Mittel zur Verabreichung der wachstumshormonfreisetzenden Peptide gemäß vorliegender Erfindung dar, da die Kombination die Freisetzung von wesentlich mehr Wachstumshormon fördert, als durch die Summierung der einzelnen Reaktionen für jede Komponente der Kombination vorhergesagt ist, d.h., daß die Kombination eine synergistische Reaktion in Bezug auf die einzelnen Komponenten erzeugt.
  • Kombinationen, die die Freisetzung und die Erhöhung des Spiegels von Wachstumshormon im Blut von Tieren bewirken, umfassen eine wirksame Menge von aus Polypeptiden der Gruppe 2 ausgewählten Polypeptiden und wenigstens eines der Polypeptide der Gruppe 1 oder der Polypeptide der Gruppe 3,
  • wobei Polypeptide der Gruppe 1 ausgewählt sind aus jedem beliebigen der natürlich vorkommenden wachstumshormonfreisetzenden Hormone und funktionellen Äquivalenten derselben, wobei die Polypeptide am wachstumshormonfreisetzenden Hormonrezeptor von Säugetieren und anderen Wirbeltieren sowie Krustentieren wirken;
  • Polypeptide der Gruppe 2 ausgewählt sind aus jedem beliebigen der Polypeptide mit der Struktur:
  • Ala-AA2-AA3-Trp-AA5-Y-Z
  • wobei AA2 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DPhe, DTrp, 5-Fluor-D oder D/LTrp; 6-Fluor-D oder D/LTrp (d.h. wobei der Indolring an der 5- oder 6-Position fluoriert ist), (Formyl)DTrp (d.h. DTrp, das am Indolstickstoff formyliert ist), *XTrp, wobei *XTrp ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus den N-monomethylierten DTrp-Isomeren (d.h. (NαMe)DTrp und (Indol-NMe)DTrp), DαNal und DβNal;
  • AA5 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ala, Gly und Ser;
  • AAS ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus DPhe und (NMe)DPhe;
  • Y ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus:
  • (a) AA7, wobei AA7 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arg, iLys, Lys und Orn; und
  • (b) -AA6-AA7, wobei AA6 ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus allen natürlich vorkommenden L-Aminosäuren, Dipeptiden der natürlich vorkommenden L- Aminosäuren, z.B. Ala-Ala, und Verbindungen der Formel:
  • H&sub2;N-(CH&sub2;)n-CO&sub2;H, wobei n = 1-12
  • und wobei AA7 wie vorstehend definiert ist; und
  • Z die C-terminale Endgruppe des Polypeptids oder die C-terminale(n) Aminosäure(n) plus Endgruppe darstellt, wobei Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CONH&sub2;,-COOH, -COOR, -CONHR, -CONR&sub2;, -CH&sub2;OH und -CH&sub2;OR, wobei R eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder ein aromatischer Ring mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist; und wobei Z alternativ ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Gly-Z', -Met-Z', -Lys-Z', -Cys-Z', -Gly-Tyr-Z', und Ala-Tyr-Z', wobei Z' ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus -CONH&sub2;, -COOH, -CONHR, -COOR, -CONR&sub2;, -CH&sub2;OH, und -CH&sub2;OR, wobei R wie vorstehend definiert ist;
  • und organischen oder anorganischen Additionssalzen jedes beliebigen der Polypeptide;
  • wobei die verwendeten Aminosäurerestabkürzungen mit der Standardpeptidnomenklatur übereinstimmen:
  • Gly = Glycin
  • Tyr = L-Tyrosin
  • Ile = L-Isoleucin
  • Glu = L-Glutaminsäure
  • Thr = L-Threonin
  • Phe = L-Phenylalanin
  • Ala = L-Alanin
  • Lys = L-Lysin
  • Asp = L-Asparaginsäure
  • Cys = L-Cystein
  • Arg = L-Arginin
  • Gln = L-Glutamin
  • Pro = L-Prolin
  • Leu = L-Leucin
  • Met = L-Methionin
  • Ser = L-Serin
  • Asn = L-Asparagin
  • His = L-Histidin
  • Trp = L-Tryptophan
  • Val = L-Valin
  • Abu = α-Aminobuttersäure
  • Sar = Sarkosin
  • Sar-ol = Sarkosin-Alkohol
  • DOPA = 3,4-Dihydroxyphenylalanin
  • Gly-ol = 2-Aminoethanol
  • Hyp = trans-4-Hydroxy-L-Prolin
  • Met(O) = Methioninsulfoxid
  • Met(O)-ol = Methioninsulfoxid-Alkohol
  • Thz = L-Thiazolidin-4-carbonsäure
  • iLys = Nε-Isopropyl-L-Lysin
  • 4-Abu = 4-Aminobuttersäure
  • Orn = L-Ornithin
  • DαNal = α-Naphtyl-D-Alanin
  • DβNal = β-Naphtyl-D-Alanin
  • Alle aus drei Buchstaben bestehenden Aminosäureabkürzungen, denen ein "D" vorangeht, bezeichnen die D-Konfiguration des Aminosäurerestes; Abkürzungen, denen ein "D/L" vorangeht, bezeichnen eine Mischung der D- und L-Konfigurationen der betreffenden Aminosäure. Glycin ist in den Umfang des Begriffs "natürlich vorkommende L-Aminosäuren" eingeschlossen.
  • Polypeptide der Gruppe 3 sind ausgewählt aus einem der Polypeptide mit der Struktur: cyclisches Disulfid freies Dithiol
  • organischen oder anorganischen Additionssalzen jedes beliebigen der Polypeptide der Gruppe 3;
  • wobei die Kombination in einem solchen Verhältnis verabreicht wird, daß die Kombination zur Verursachung der synergistischen Freisetzung und Erhöhung von Wachstumshormon im Blut des entsprechenden Tieres wirksam ist.
  • Bevorzugte Polypeptide der Gruppe 1 sind ausgewählt aus jedem beliebigen der Polypeptide:
  • (a) mit den folgenden Aminosäuresequenzen an Position 1 bis 44 (gezählt vom terminalen H zum terminalen C): und funktionelle Äquivalente davon;
  • wobei die C-terminale Aminosäure die folgende allgemeine Kurzformel hat
  • wobei jedes R' unabhängig die Substituenten des jeweiligen Aminosäurerestes darstellt, z.B.: Wasserstoff, Alkyl-, Aryl-, Amino- oder Säuresubstituenten; X die C-terminale Endgruppe bezeichnet und ausgewählt ist aus -CONH&sub2;, -COOH, -COOR, -CONRR, - CH&sub2;OH, und -CH&sub2;OR, wobei R eine Alkylgruppe mit 1-6 Kohlenstoffatomen oder ein aromatischer Ring mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist; und wobei die verwendeten Abkürzungen für die Aminosäurereste mit der Standard-Peptidnomenklatur übereinstimmen:
  • G = Gly (Glycin)
  • Y = Tyr (L-Tyrosin)
  • I = Ile (L-Isoleucin)
  • E = Glu (L-Glutaminsäure)
  • T = Thr (L-Threonin)
  • F = Phe (L-Phenylalanin)
  • A = Ala (L-Alanin)
  • K = Lys (L-Lysin)
  • D = Asp (L-Asparaginsäure)
  • C = Cys (L-Cystein)
  • R = Arg (L-Arginin)
  • Q = Gln (L-Glutamin)
  • P = Pro (L-Prolin)
  • L = Leu (L-Leucin)
  • M = Met (L-Methionin)
  • S = Ser (L-Serin)
  • N = Asn (L-Asparagin)
  • H = His (L-Histidin)
  • W = Trp (L-Tryptophan) und
  • V = Val (L-Valin)
  • Nle = Norleucin
  • Sar = Sarkosin
  • Sar-ol = Sarkosin-Alkohol
  • Gly-ol = 2-Aminoethanol
  • Met(O) = Methioninsulfoxid
  • (b) jedes beliebige der Polypeptide aus (a) mit den folgenden Aminosäuresubstitutionen:
  • Position 1 von (#144-#148) ist DTyr oder His;
  • Position 1 von (#149) ist Tyr oder DHis;
  • Position 2 von (#144-#149) ist (NMe)DAla oder Aib oder DAla;
  • Position 3 von (#144-#149) ist DAsp;
  • Position 4 von (#144-#149) ist DAla;
  • Position 1 + 2 von (#144-#149) ist DTyr¹ + DAla², DTyr¹ + (NMe)DAla², oder DTyr¹ + Aib²;
  • (c) jedes beliebige der Polypeptide aus (a), oder (b) mit einer Substitution von Nle für Met an Position 27;
  • (d) jedes beliebige der Polypeptide aus (a) (b) oder (c), bei dem die N-terminale Gruppe -NH&sub2; ersetzt ist durch -NHCOR und wobei R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen oder ein aromatischer Ring mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist;
  • (e) Fragmente jedes beliebigen der Polypeptide aus (a), (b), (c) oder (d), die wenigstens die Aminosäurereste der Positionen 1 bis 29 enthalten;
  • (f) mit den folgenden spezifischen Aminosäuresequenzen an Position 1 bis 29 (gezählt von der N-terminalen Gruppe zur C-terminalen Gruppe): (lineares dithiol), und (cyclisches Disulfid)
  • wobei die C-terminale Aminosäure und X wie vorstehend definiert sind; und Modifikationen jeder beliebigen dieser Verbindungen aus Gruppe (f) in Übereinstimmung mit den in (b), (c) und (d) vorstehend dargelegten Modifikationen; und
  • (g) organischen oder anorganischen Additionssalze jedes beliebigen der Polypeptide der Gruppe 1 aus (a), (b), (c), (d), (e) oder (f).
  • Für weitere Details zur Verabreichung der Kombinationen von wachstumshormonfreisetzenden Peptiden wird der Durchschnittsfachmann auf die vorstehend genannten Anmeldungen verwiesen.
  • Die verabreichte Menge von Polypeptiden oder der Kombination von Polypeptiden gemäß vorliegender Erfindung variiert in Abhängigkeit von zahlreichen Faktoren, z.B. vom jeweils behandelten Tier, dessen Alter und Geschlecht, der jeweils gewünschten therapeutischen Wirkung, dem Verabreichungsweg und davon, welches Polypeptid oder welche Kombination von Polypeptiden verwendet wird. In jedem Fall wird jedoch eine Dosis verwendet, die die Förderung der Freisetzung und Erhöhung des Wachstumshormonspiegels im Blut des Empfängertieres bewirkt. Gewöhnlich fällt dieses Dosisniveau in den Bereich zwischen etwa 0,1 ug bis zu 10 mg Gesamtpolypeptid pro kg Körpergewicht. Im allgemeinen erlaubt die Verabreichung von Kombinationen von wachstumshormonfreisetzenden Peptiden die Verwendung von niedrigeren Dosen der einzelnen wachstumshormonfreisetzenden Verbindungen im Vergleich zu den für die einzelnen wachstumshormonfreisetzenden Verbindungen erforderlichen Dosisniveaus, um eine ähnlich Reaktion zu erhalten, was durch den synergistischen Effekt der Kombination begründet ist.
  • Im Umfang der vorliegenden Erfindung sind ebenfalls Zusammensetzungen eingeschlossen, die als aktiven Inhaltsstoff die organischen und anorganischen Additionssalze der vorstehend beschriebenen Polypeptide und der Kombinationen derselben enthalten; auf Wunsch in Verbindung mit einem Träger, einem Verdünnungsstoff, einer Matrix zur langsamen Freisetzung oder einer Beschichtung.
  • Die organischen oder anorganischen Additionssalze der wachstumshormonfreisetzenden Verbindungen und der Kombinationen derselben, die als innerhalb des Umfangs der vorliegenden Erfindung liegend betrachtet werden, schließen Salze solcher organischer Anteile wie z.B. Acetat, Trifluoracetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Benzoat, Lactat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Naphthalat und ähnliche ein, sowie anorganische Anteile, wie z.B. Ammonium- und Protaminsalze der Gruppe I (d.h. Alkalimetallsalze), der Gruppe II (d.h. Erdalkalimetallsalze), Zink, Eisen und ähnliches, mit Gegenionen wie etwa Chlorid, Bromid, Sulfat, Phosphat und ähnlichen sowie die vorstehend bezeichneten organischen Anteile.
  • Wenn die Verabreichung an Menschen in Betracht gezogen wird, sind pharmazeutisch akzeptierbare Salze bevorzugt. Zu diesen Salzen zählen die nicht toxischen Alkalimetall-, Erdalkalimetall- und Ammoniumsalze, die allgemein in der pharmazeutischen Industrie verwendet werden, darunter Natrium-, Kalium-, Lithium-, Calcium-, Magnesium-, Barium-, Ammonium- und Protaminsalze, die durch bekannte Verfahren hergestellt werden. Der Begriff schließt ebenso nicht toxische Säureadditionssalze ein, die allgemein durch Umsetzen der erfindungsgemäßen Verbindungen mit einer geeigneten organischen oder anorganischen Säure hergestellt werden. Zu den repräsentativen Salzen zählen Hydrochlorid, Hydrobromid, Sulfat, Bisulfat, Acetat, Oxalat, Valerat, Oleat, Laurat, Borat, Benzoat, Lactat, Phosphat, Tosylat, Citrat, Maleat, Fumarat, Succinat, Tartrat, Napsylat und ähnliche.
  • Nachfolgend wird die Erfindung unter Bezug auf die folgenden, nicht einschränkenden Beispiele näher im Detail erläutert.
  • BEISPIEL 1 - Synthese der wachstumshormonfreisetzenden Peptide
  • Paramethyl-Benzhydrylaminhydrochlorid (pMe-BHA HCl)-Harz wird in ein Reaktionsgefäß auf einem im Handel erhältlichen automatisierten Peptidsynthesizer gegeben. Das Harz wird mit freiem Amin bis zu einer Zugabe von etwa 5 mmol pro Gramm substituiert. Die Verbindungen werden durch Ankoppeln einzelner Aminosäuren, beginnend an dem Carboxylende der Peptidsequenz, unter Verwendung eines geeigneten Aktivatorwirkstoffes, wie z.B. N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) hergestellt. Die funktionellen alpha-Aminogruppen der einzelnen Aminosäuren werden geschützt, beispielsweise als t- Butyloxycarbonylderivat (t-Boc), und die funktionellen reaktiven Seitenkettengruppen können wie in Tabelle 1 angegeben geschützt werden. Tabelle 1 Für die Festphasenpeptidsynthese geeignete Seitenkettenschutzgruppen Arginin: Asparaginsäure: Cystein: Glutaminsäure: Histidin: Lysin: Methionin: Serin: Threonin: Tryptophan: Ng-Tosyl O-Benzyl S-para-Methylbenzyl O-Benzyl Nim-Tosyl Nε-2,4-Dichlorbenzyloxycarbonyl S-Sulfoxid O-Benzyl O-Benzyl Nin-Formyl Tyrosin: 0-2, 6-Dichlorbenzyl
  • Vor der Anbindung der Anfangsaminosäure wird das Harz dreimal mit Dichlormethan (CH&sub2;Cl&sub2;; etwa 10 mL/gm Harz) gerührt (jeweils etwa eine Minute lang) , mit drei Rührvorgängen (jeweils etwa zwei Minuten lang) mit N,N-Diisopropylethylamin (DIEA) in Dichlormethan (10:90; etwa 10 mL/gm Harz) neutralisiert und dreimal (etwa jeweils eine Minute lang) mit Dichlormethan (etwa 10 mL/gm Harz) gerührt. Die Anfangs- und jede der nachfolgenden Aminosäuren werden unter Verwendung eines vorgeformten symmetrischen Anhydrids an das Harz gekoppelt, wobei etwa das 3,0-fache der Gesamtmenge der Bindungskapazität des Harzes einer in geeigneter Weise geschützten Aminosäure und etwa das 1,5-fache der Gesamtmenge der Bindungskapazität des Harzes von DCC in einer angemessenen Menge von Dichlormethan verwendet werden. Für Aminosäuren mit einer niedrigen Dichlormethanlöslichkeit wird N,N-Dimethylformamid (DMF) zugegeben, um eine homogene Lösung zu erzielen. Allgemein wird das symmetrische Anhydrid bis zu 30 Minuten vor der Einführung in das Reaktionsgefäß bei Raumtemperatur oder darunter hergestellt. Der Dicyclohexylharnstoff, der sich nach Herstellung des symmetrischen Anhydrids bildet, wird durch Schwerkraftfiltration der Lösung in das Reaktionsgefäß entfernt. Der Fortschritt der Ankopplung der Aminosäure an das Harz wird allgemein über einen Farbtest unter Verwendung eines Reagens, wie etwa Ninhydrin (das mit primären und sekundären Aminen reagiert), überwacht. Nach der vollständigen Ankopplung der geschützten Aminosäure an das Harz (> 99%) wird die alpha-Aminoschutzgruppe durch eine Behandlung mit sauren Reagenzien entfernt. Ein allgemein verwendetes Reagens besteht aus einer Lösung von Trifluoressigsäure (TFA) und Anisol in Dichlormethan (45:2:53).
  • Nachdem die gewünschte Aminosäuresequenz vollendet wurde, kann das gewünschte Peptid von dem Harzträger durch Behandlung mit einem Reagens, wie z.B. Fluorwasserstoff (HF), abgespaltet werden, das nicht nur das Peptid vom Harz abspaltet, sondern auch die allgemein gebräuchlichsten Seitenkettenschutzgruppen abspaltet. Wenn ein Chlormethylharz oder Hydroxymethylharz verwendet wird, führt die HF-Behandlung zur Bildung der freien Peptidsäure. Wenn BHA- oder p-Me-BHA-Harz verwendet wird, führt die HF-Behandlung direkt zu freien Peptidamiden.
  • Das vollständige Verfahren zur Anbindung jedes einzelnen Aminosäurerestes am Harz ist in Tabelle 2 umrissen. TABELLE 2 Verfahren zur Anbindung einzelner Aminosäurereste an einem Harz Reagens Rührvorgänge Dauer/Rührvorgang 1. Dichlormethan 2. TFA, Anisol, Dichlormethan 5. DIEA, Dichlormethan 7. vorgeformtes symmetrisches Anhydrid 8. Dichlormethan 9. Iso-Propanol 10. Dichlormethan 11 Überwachung des Fortschritts der Ankopplungsreaktion ** 12. Wiederholen der Schritte 1 - 12 für jede einzelne Aminosäure * Die Ankopplungszeit ist von der jeweiligen Aminosäure abhängig. ** Das Ausmaß der Ankopplungsreaktion kann allgemein durch einen Farbtest überwacht werden. Ist die Ankopplung unvollständig, kann dieselbe Aminosäure durch Wiederholen der Schritte 7 bis 11 erneut angekoppelt werden. Wenn die Ankopplung vollständig ist, kann die nächste Aminosäure angekoppelt werden.
  • BEISPIEL 2 - In-Vivo-GH-Freisetzung bei Ratten
  • Unreife weibliche Sprague-Dawley Ratten wurden von Charles River Laboratories (Wilmington, MA) bezogen. Nach dem Erhalt wurden sie bei 25ºC unter einem 14:10 Stunden Hell: dunkel-Zyklus untergebracht. Wasser und Purina Rattenfutter waren nach Belieben verfügbar. Junge wurden bis zum Alter von einundzwanzig Tagen bei ihren Müttern gehalten.
  • Sechsundzwanzig Tage alte Ratten, je sechs Ratten pro Behandlungsgruppe, wurden intraperitoneal mit 50 mg/kg Pentobarbital 20 Minuten vor der i.v.-Behandlung mit Peptid anästhesiert. Normalsalzlösung mit 0,1 % Gelatine diente als Träger für die intravenösen (i.v.) Injektionen der Peptide. Die anästhesierten Ratten mit einem Gewicht von 55 bis 65 g erhielten i.v. Injektionen der in Tabelle 3 angegebenen Menge von wachstumshormonfreisetzenden Verbindungen. Die Injektion erfolgte als 0,1 mL Lösung in die Jugularvene.
  • Alle Tiere wurden 10 Minuten nach der letzten Versuchsinjektion (s. Tabelle 3) durch Guilliotinieren getötet. Nach der Enthauptung wurde Blut aus dem Rumpf zur Bestimmung der Blut-GH-Spiegel entnommen. Nach der Gerinnung des Blutes wurde es zentrifugiert und das Serum vom Gerinnsel getrennt. Das Serum wurde bis zum Tag der Probenahme für die Radioimmunoassay(RIA)-Bestimmung der Wachstumshormonspiegel gefroren gehalten, die gemäß dem folgenden, vom National Institute of Arthritis, Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIADDK) entwickelten Verfahren erfolgte.
  • Die Reagenzien werden allgemein den RIA-Analyseröhrchen in einer einzigen Sitzung bei Kühlschranktemperatur (etwa 4ºC) in folgender Reihenfolge zugegeben:
  • (a) Puffer
  • (b) "kalter" (d.h. nicht radioaktiver) Standard oder unbekannte, zu analysierende Serumprobe,
  • (c) mit radioaktivem Jod behandeltes Wachstumshormon- Antigen, und
  • (d) Wachstumshormon-Antiserum.
  • Die Zugabe der Reagenzien wird allgemein in der Weise durchgeführt, daß eine abschließende RIA-Röhrchenverdünnung von etwa 1:30.000 (Antiserum zu Gesamtflüssigkeitsvolumen; vol:vol) erzielt wird.
  • Die gemischten Reagenzien werden dann typischerweise bei Raumtemperatur (etwa 25ºC) etwa 24 Stunden lang vor der Zugabe eines zweiten Antikörpers inkubiert (z.B. Ziegen- oder Kaninchen-Antiaffen-Gammaglobulinserum), der sich an das als Komplex vorliegende Wachstumshormon-Antiserum bindet und dessen Ausfällung verursacht. Die ausgefällten Inhalte der RIA- Röhrchen werden anschließend auf die Anzahl der Zähler in einem bestimmten Zeitraum in einem Gammaszintillationszähler analysiert. Durch Auftragen der radioaktiven Zähler gegen den Wachstumshormon-(GH)-Spiegel wird eine Standardkurve erzeugt. Die GH-Spiegel der unbekannten Proben werden anschließend unter Bezug auf die Standardkurve bestimmt.
  • Das Serum-GH wurde durch RIA mit vom National Hormon and Pituitary Program zur Verfügung gestellten Reagenzien gemessen.
  • Die Serumspiegel in Tabelle 3 sind in g/mL unter Bezug auf den Ratten-GH-Standard von 0,61 internationalen Einheiten/mg (IU/mg) aufgezeichnet. Die Daten sind als mittlere +/- Standardabweichung vom Mittelwert (SEM) aufgezeichnet. Die statistische Analyse wurde mit Student's t-Test durchgeführt. Die in Tabelle 3 gezeigten Ergebnisse sind der Durchschnitt von Untersuchungen an sechs Ratten. Tabelle 3 In-Vivo-GH-Freisetzung (ng/mL), die durch die wachstumshormonfreisetzenden Verbindungen bei mit Pentobarbital anästhesierten Ratten gefördert wurde (die Tötung der Tiere erfolgte 10 Minuten nach der letzten Injektion) Spalte A Wachstumshormonfreisetzende Verbindungen Gesamtdosis (ug) Kontrolle GH ng/mL Von der Verbindung in Spalte A freigesetztes GH ng/mL His-DTrP-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;* His-Ala-DTrP-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;* Ala-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2; * Vergleichspeptide ** So bezeichnete Dosen wurden 29 Tage alten weiblichen Ratten verabreicht.
  • In Tabelle 3 zeigt sich für eine erfindungsgemäße Verbindung, daß sie die Freisetzung und Erhöhung von Wachstumshormonspiegeln im Blut von Ratten fördert, denen derartige Verbindungen verabreicht wurden. Die überraschende wachstumshormonfreisetzende Aktivität dieser Verbindung ist potentiell sehr wertvoll, da ein kurzkettiges Polypeptid mit niedrigem Molekulargewicht mit der relativ stabilen und preiswerten Aminosäure Alanin am Aminoende sich als ein preiswertes Mittel zur Verbesserung der Wachstumshormonspiegel bei Tieren erweisen sollte.
  • BEISPIEL 3 - Verabreichung einer Kombination von GH-freisetzenden Verbindungen
  • Das Verfahren von Beispiel 2 wurde wiederholt mit der Ausnahme, daß die Ratten weder anästhesiert noch mit Pentobarbital vorbehandelt wurden und den Ratten eine Kombination von Peptiden verabreicht wurde. Die verabreichten Verbindungen, die verwendeten Dosisniveaus und die Ergebnisse sind in Tabelle 4 dargelegt. TABELLE 4 Synergistische in-Vivo-Effekte der erfindungsgemäßen Verbindung mit einer Verbindung der Gruppe 1* bei nicht anästhesierten Ratten. Verabreichte Verbindung; Dosis (ug)* freigesetztes GH, mg/mL Kontrollgruppe erfindungsgemäße Verbindung, Vergleichsverbindung, Verbindung der Gruppe 1, TABELLE 4 (Fortsetzung) Synergistische in-Vivo-Effekte der erfindungsgemäßen Verbindung mit einer Verbindung der Gruppe 1* bei nicht anästhesierten Ratten. Verabreichte Verbindung; Dosis (ug)* freigesetztes GH, mg/mL Erfindung + Gruppe 1, Vergleich + Gruppe 1, * Verbindungen der Gruppe 1 sind in S.N. 861,968 und 37,275 im Detail beschrieben, die durch Bezugnahme hierin eingeschlossen sind. Alle für dieses Beispiel verwendeten Verbindungen haben die folgenden Sequenzen: Erfindungsgemäße Verbindung: Ala-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2; Vergleichsverbindung: His-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2; Verbindungen der Gruppe 1: Tyr-Ala-Asp-Ala-Ile-Phe-Thr-Asn-Ser-Tyr-Arg-Lys- Val-Leu-Gly-Gln-Leu-Ser-Ala-Arg-Lys-Leu-Leu-Gln- Asp-Ile-Nle-Ser-Arg-NH&sub2;
  • Die Ergebnisse in Tabelle 4 zeigen, daß die erfindungsgemäße Verbindung eine ähnliche synergistische Reaktion zeigt wie die durch die Vergleichsverbindung erhaltene (für die bereits zuvor eine synergistische Reaktion nachgewiesen wurde), wenn sie in Kombination mit einer beispielhaften Verbindung der Gruppe 1 verabreicht wird.
  • Die Erfindung wurde im Detail unter besonderer Bezugnahme auf bevorzugte Ausführungsformen derselben beschrieben. Es versteht sich jedoch, daß Variationen und Modifikationen innerhalb des Sinnes und Umfanges der Erfindung ausführbar sind.

Claims (18)

1. Ein Polypeptid, das imstande ist, die Hormonfreisetzung und Hormonspiegelerhöhung von Wachstumshormonen im Blut von Empfängertieren zu fördern, wobei das genannte Polypeptid ausgewählt ist aus der Gruppe, die sich zusammensetzt aus durch die generische Struktur
Ala-AA2-AA3-Trp-AA5-Y-Z
definierten Polypeptiden, worin AA2 aus der Gruppe ausgewählt ist, die von DPhe, DTrp, 5-Fluor-D oder D/LTrp; 6-Fluor-D oder D/LTrP (d.h. mit dem Indolring in 5- oder 6-Stellung fluoriert), (Formyl)DTrp (d.h. am Indolstickstoff formyliertes DTrp), *XTrp, wobei *XTrp aus der Gruppe der N-monomethylierten DTrp-Isomere (d. h. (NαMe)DTrp und (Indol-NMe)DTrp) ausgewählt ist, DαNal und DβNal gebildet wird;
AA3 aus der aus Ala, Gly und Ser bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
AA5 aus der aus DPhe und (NMe)DPhe bestehenden Gruppe ausgewählt ist; Y aus der Gruppe ausgewählt ist, die sich zusammensetzt aus
(a) AA7, wobei AA7 aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Arg, iLys, Lys und Orn besteht, und
(b) -AA6-AA7, wobei AA6 aus der Gruppe ausgewählt ist, die alle natürlich vorkommenden L-Aminosäuren, Dipeptide der natürlich vorkommenden L-Aminosäuren wie zum Beispiel Ala-Ala und Verbindungen der Formel
H&sub2;N-(CH&sub2;)-CO&sub2;H mit n = 1 bis 12
umfasst, und AA7 wie oben definiert ist; und
Z die C-endständige Gruppe des genannten Polypeptids oder die C-endständige(n) Aminosäure(n) mit Endgruppe darstellt, wobei Z aus der von -CONH&sub2;, -COOH, -COOR, -CONHR, -CONR&sub2;, -CH&sub2;OH und -CH&sub2;OR gebildeten Gruppe ausgewählt ist, in der R eine Alkylgruppe mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen oder ein aromatischer Ring mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist, oder wo Z umgekehrt aus der aus -Gly-Z', -Met-Z'. -Lys-Z', -Cys-Z', -Gly-Tyr-Z' und -Ala-Tyr-Z' gebildeten Gruppe ausgewählt ist, worin Z' aus der aus -CONH&sub2;, -COOH, -CONHR, -COOR, -CONR&sub2;, -CH&sub2;OH und -CH&sub2;OR gebildeten Gruppe ausgewählt ist, in der R wie oben definiert ist;
und aus organischen oder anorganischen salzförmigen Anlagerungsverbindungen jedes beliebigen der genannten Polypeptide;
wobei die für die Aminosäurereste verwendeten Abkürzungen mit der standardisierten Peptidnomenklatur übereinstimmen:
Gly = Glycin
Tyr = L-Tyrosin
Ile = L-Isoleucin
Glu = L-Glutaminsäure
Thr = L-Threonin
Phe = L-Phenylalanin
Ala = L-Alanin
Lys = L-Lysin
Asp = L-Asparaginsäure
Cys = L-Cystein
Arg = L-Arginin
Gln = L-Glutamin
Pro = L-Prolin
Leu = L-Leucin
Met = L-Methionin
Ser = L-Serin
Asn = L-Asparagin
His = L-Histidin
Trp = L-Tryptophan
Val = L-Valin
DOPA = 3,4-Dihydroxyphenylalanin
Met(O) = Methioninsulfoxid
Abu = α-Aminobuttersäure
iLys = L-Nε-Isopropyllysin
4-Abu = 4-Aminobuttersäure
Orn = L-Ornithin
DαNal = D-α-Naphthylalanin
DβNal = D-β-Naphthylalanin
Alle dreibuchstabigen Aminosäureabkurzungen, denen ein "D" vorangeht, bezeichnen die D-Konfiguration des Aminosäurerests, während Abkürzungen, denen ein "D/L" vorangeht, Mischungen der D- und L-Konfiguration der betreffenden Aminosäuren bezeicbnen; Glycin ist in den Begriff von "natürlich vorkommenden L-Aminosäuren" einbezogen.
2. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das genannte Polypeptid ausgewählt ist aus der aus
Ala-AA2-Ala-Trp-AA5-AA7-NH&sub2;,
Ala-AA2-Ala-Trp-AA5-AA6-AA7-NH&sub2;
und organischen oder anorganischen salzförmigen Anlagerungsverbindungen jedes beliebigen der genannten Polypeptide bestehenden Gruppe, wobei AA2, AA5, AA6 und AA7 wie oben definiert sind.
3. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das genannte Polypeptid die Sequenz
Ala-AA2-Ala-Trp-AA5-AA7-NH&sub2;
hat, oder dessen organische oder anorganische salzförmige Anlagerungsverbindungen, wobei AA2, AA5 und AA7 wie oben definiert sind.
4. Ein Polypeptid nach Anspruch 1, wobei das genannte Polypeptid die Sequenz
Ala-DTrp-Ala-Trp-DPhe-Lys-NH&sub2;
hat, oder dessen organische oder anorganische salzförmige Anlagerungsverbindungen.
5. Eine Methode, die Hormonfreisetzung und Hormonspiegelerhöhung von Wachstumshormonen im Blut von Tieren zu fördern, indem diesen eine wirksame Menge mindestens eines der in Anspruch 1 aufgeführten Polypeptide verabreicht wird.
6. Eine Methode, die Hormonfreisetzung und Hormonspiegelerhöhung von Wachstumshormonen im Blut von Tieren zu fördern, indem diesen eine wirksame Menge mindestens eines der in Anspruch 2 dargelegten Polypeptide verabreicht wird.
7. Eine Methode, die Hormonfreisetzung und Hormonspiegelerhöhung von Wachstumshormonen im Blut von Tieren zu fördern, indem diesen eine wirksame Menge mindestens eines der in Anspruch 3 dargelegten Polypeptide verabreicht wird.
8. Eine Methode, die Hormonfreisetzung und Hormonspiegelerhöhung von Wachstumshormonen im Blut von Tieren zu fördern, indem diesen eine wirksame Menge mindestens eines der in Anspruch 4 dargelegten Polypeptide verabreicht wird.
9. Eine Zusammensetzung, die die Hormonfreisetzung und Hormonspiegelerhöhung von Wachstumshormon im Blut eines Tieres bewirken kann, bestehend aus einer wirksamen Menge von Polypeptiden, die aus Polypeptiden einer zweiten Gruppe von Polypeptiden und mindestens einem Polypeptid einer ersten oder dritten Gruppe ausgewählt sind,
wobei die Polypeptide der ersten Gruppe unter beliebigen, natürlich vorkommenden, wachstumshormonfreisetzenden Hormonen und diesen funktionell gleichwertigen Substanzen ausgewählt sind und die genannten Polypeptide auf den wachstumshormonfreisetzenden Hormonrezeptor von Säugetieren und anderen Wirbeltieren sowie Krustentieren wirken;
die Polypeptide der zweiten Gruppe unter beliebigen Polypeptiden der Struktur
Ala-AA2-AA3-Trp-AA5-Y-Z
ausgewählt sind, worin AA2 aus der Gruppe ausgewählt ist, die von DPhe, DTrp, 5-Fluor-D oder D/LTrp; 6-Fluor-D oder D/LTrp (d.h. mit dem Indolring in 5- oder 6-Stellung fluoriert), (Formyl)DTrp (d.h. am Indolstickstoff formyliertes DTrp), *XTrp, wobei *XTrp aus der Gruppe der N-monomethylierten DTrp-Isomere (d.h. (NαMe)DTrP und (Indol-NMe)DTrp) ausgewählt ist, DαNal und DβNal gebildet wird;
AA3 aus der aus Ala, Gly und Ser bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
AA5 aus der aus DPhe und (NMe)DPhe bestehenden Gruppe ausgewählt ist;
Y aus der Gruppe ausgewählt ist, die sich zusammensetzt aus
(a) AA7, wobei AA7 aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus Arg, iLys, Lys und Orn besteht, und
(b) -AA6-AA7, wobei AA6 aus der Gruppe ausgewählt ist, die alle natürlich vorkommenden L-Aminosäuren, Dipeptide der natürlich vorkommenden L-Aminosäuren wie zum Beispiel Ala-Ala und Verbindungen der Formel
H&sub2;N-(CH&sub2;)n-CO&sub2;H mit n = 1 bis 12
umfasst, und AA7 wie oben definiert ist; und
Z die C-endständige Gruppe des genannten Polypeptids oder die C-endständige(n) Aminosäure(n) mit Endgruppe darstellt, wobei Z aus der von -CONH&sub2;, -COOH, -COOR, -CONHR, -CONR&sub2;, -CH&sub2;OH und -CH&sub2;OR gebildeten Gruppe ausgewählt ist, in der R eine Alkylgruppe mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen oder ein aromatischer Ring mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist, oder wo Z umgekehrt aus der aus -Gly-Z', -Met-Z', -Lys-Z', -Cys-Z', -Gly-Tyr-Z' und -Ala-Tyr-Z' gebildeten Gruppe ausgewählt ist, worin Z' aus der aus -CONH&sub2;, -COOH, -CONHR, -COOR, -CONR&sub2;, -CH&sub2;OH und -CH&sub2;OR gebildeten Gruppe ausgewählt ist, in der R wie oben definiert ist;
und aus organischen oder anorganischen salzförmigen Anlagerungsverbindungen jedes beliebigen der genannten Polypeptide;
wobei die für die Aminosäurereste verwendeten Abkürzungen mit der standardisierten Peptidnomenklatur übereinstimmen:
Gly = Glycin
Tyr = L-Tyrosin
Ile = L-Isoleucin
Glu = L-Glutäminsäure
Thr = L-Threonin
Phe = L-Phenylalanin
Ala = L-Alanin
Lys = L-Lysin
Asp = L-Asparaginsäure
Cys = L-Cystein
Arg = L-Arginin
Gln = L-Glutamin
Pro = L-Prolin
Leu = L-Leucin
Met = L-Methionin
Ser = L-Serin
Asn = L-Asparagin
His = L-Histidin
Trp = L-Tryptophan
Val = L-Valin
Abu = α-Aminobuttersäure
Sar = Sarcosin
Sar-ol = Sarcosinol (Sarcosin Alkohol)
DOPA = 3,4-Dihydroxyphenylalanin
Gly-ol = 2-Aminoethanol
Hyp = L-trans-4-Hydroxyprolin
Met(O) = Methioninsulfoxid
Met(O)-ol = Methioninolsulfoxid (Methioninsulfoxid Alkohol)
Thz = L-Thiazolidin-4-carbonsäure
iLys = L-Nε-Isopropyllysin
4-Abu = 4-Aminobuttersäure
Orn = L-Ornithin
DαNal = D-α-Naphthylalanin
DβNal = D-β-Naphthylalanin
Alle dreibuchstabigen Aminosäureabkürzungen, denen ein "D" vorangeht, bezeichnen die D-Konfiguration des Aminosäurerests, während Abkürzungen, denen ein "D/L" vorangeht, Mischungen der D- und L-Konfiguration der betreffenden Aminosäuren bezeichnen; Glycin ist in den Begriff von "natürlich vorkommenden L-Aminosäuren" einbezogen.
Polypeptide der dritten Gruppe sind ausgewählt unter beliebigen Polypeptiden der Struktur
und
organischen oder anorganischen salzförmigenAnlagerungsverbindungen beliebiger Polypeptide der dritten Gruppe;
wobei die genannte Zusammensetzung in einem solchen Verhältnis verabreicht wird, dass sie die synergistische Hormonfreisetzung und Hormonspiegelerhöhung von Wachstumshormon im Blut eines solchen Tieres bewirkt.
10. Zusammensetzung gemäss Anspruch 9, worin the Polypeptide der genannten ersten Gruppe ausgewählt sind unter beliebigen Polypeptiden
(a) mit den folgenden Aminosäuresequenzen in Positionen 1 bis 44 (vom N-Ende zum C-Ende gezählt):
und diesen funktionell gleichwertige Substanzen,
wobei die am C-Ende befindliche Aminosäure die folgende ab gekürzte allgemeine Formel hat:
worin jedes der R' unabhängig die Substituenten eines spezifischen Aminosäurerestes darstellt, zum Beispiel Wasserstoff-, Alkyl-, Aryl-, Amino- oder Säuresubstituenten; X bezeichnet die C-endständige Gruppe und ist unter -CONH&sub2;, -COOH, -COOR, -CONRR, -CH&sub2;OH und -CH&sub2;OR ausgewählt, wobei R eine Alkylgruppe mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen oder ein aromatischer Ring mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist, und worin die für die Aminosäurereste verwendeten Abkürzungen mit der standardisierten Peptidnomenklatur übereinstimmen:
G = Gly (Glycin),
Y = Tyr (L-Tyrosin),
I = Ile (L-Isoleucin),
E = Glu (L-Glutaminsäure),
T = Thr (L-Threonin),
P = Phe (L-Phenylalanin),
A = Ala (L-Alanin),
K = Lys (L-Lysin),
D = Asp (L-Asparaginsäure),
C = Cys (L-Cystein),
R = Arg (L-Arginin),
Q = Gln (L-Glutamin),
P = Pro (L-Prolin),
L = Leu (L-Leucin),
M = Met (L-Methionin),
Ser = (L-Serin),
N = Asn (L-Asparagin),
H = His (L-Histidin),
W = Trp (L-Tryptophan) und
V = Val (L-Valin);
Aib = α-Aminoisobuttersäure
Nle = Norleucin
Sar = Sarcosin
Sar-ol = Sarcosinol (Sarcosin Alkohol)
Gly-ol = 2-Aminoethanol
Met(O) = Methioninsulfoxid
(b) unter beliebigen unter (a) genannten Polypeptiden mit den folgenden Aminosäuresubstitutionen:
Position 1 in (#144-#148) ist DTyr oder His;
Position 1 in (#149) ist Tyr oder DHis;
Position 2 in (#144-#149) ist (NMe)DAla oder Aib oder DAla;
Position 3 in (#144-#149) ist DAsp;
Position 4 in (#144-#149) ist DAla; und
Positionen 1 und 2 in (#144-#149) sind DTyr¹ + DAla², DTyr¹ + (NMe)DAla² oder DTyr¹ + Aib²;
(c) unter beliebigen der unter (a) oder (b) genannten Polypeptide mit Nle anstatt Met in Position 27;
(d) unter beliebigen der unter (a), (b) oder (c) genannten Polypeptide, in denen das N-endständige -NH&sub2; durch -NHCOR ersetzt ist und worin R eine Alkylgruppe mit ein bis sechs Kohlenstoffatomen oder ein aromatischer Ring mit bis zu 12 Kohlenstoffatomen ist;
(e) unter Bruchstücken eines beliebigen der unter (a), (b), (c) oder (d) genannten Polypeptide mit wenigstens den Aminosäureresten in Positionen 1-29;
(f) mit den folgenden spezifischen Aminosäuresequenzen in Positionen 1-29 (vom N-Ende zum C-Ende gezählt): (lineares Dithiol) und (zyklisches Disulfid);
worin die C-endständige Aminosäure und X wie oben definiert sind; und mit Abwandlung jeder beliebigen Verbindung der Gruppe (f) gemäss den in (b), (c) und (d) weiter oben dargelegten Abwandlungen; und
(g) unter organischen oder anorganischen salzförmigen Anlagerungsverbindungen jedes beliebigen der unter (a), (b), (c), (d), (e) oder (f) genannten Polypeptide der ersten Gruppe.
11. Zusammensetzung gemäss Anspruch 9 mit je einer Verbindung aus der ersten und zweiten Gruppe von Polypeptiden.
12. Zusammensetzung gemäss Anspruch 9 mit je einer Verbindung aus der zweiten und dritten Gruppe von Polypeptiden.
13. Zusammensetzung gemäss Anspruch 9 mit je einer Verbindung aus der ersten, zweiten und dritten Gruppe von Polypeptiden.
14. Verfahren, um die Hormonfreisetzung und Hormonspiegelerhöhung von Wachstumshormon im Blut eines Tieres zu bewirken, indem eine wirksame Dosis der Zusammensetzung nach Anspruch 9 verabreicht wird.
15. Verfahren, um die Hormonfreisetzung und Hormonspiegelerhöhung von Wachstumshormon im Blut eines Tieres zu bewirken, indem eine wirksame Dosis der Zusammensetzung nach Anspruch 10 verabreicht wird.
16. Verfahren nach Anspruch 14, worin die genannte Zusammensetzung je eine Verbindung aus der ersten und zweiten Gruppe von Polypeptiden umfasst.
17. Verfahren nach Anspruch 14, worin die genannte Zusammensetzung je eine Verbindung aus der zweiten und dritten Gruppe von Polypeptiden umfasst.
18. Verfahren nach Anspruch 14, worin die genannte Zusammensetzung je eine Verbindung auf der ersten, zweiten und dritten Gruppe von Polypeptiden umfasst.
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