JPS63122699A - ペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 及びそのフラグメント（　ｆ　ｒａｇｍｅｎ　ｔ　）並
びにかかる同族体またはフラグメントを含む製薬学的組
成物に関する。本発明の製薬学的組成物を動物及び人間
における種々な生長ホルモンに関連した障害を処置する
ために用いることができる。

生長ホルモン放出性因子（ＧＲＦ）は、ギレミン（Ｇｕ
　ｉｌｌｅｍｉｎ）等によってンーク研究所（Ｓａｌｋ
　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ）［→ナイエンス（ｓｃｉｅｎｃ
ｅ）、２１８　：　５８５（　１９８２）　］でヒト島
細胞腫から単離され、そして構造的に特性を明らかにさ
れている。ＧＲＦの単離及び特性指摘は、該ポリペプチ
ドが極めて少量で存在するために、１０年間研究者が回
避していた。ヒト視床下部の生長ホルモン放出性因子（
ｈＧＲＦ）は島細胞腫から単離されたＧＲＦと同様な構
造式を有することが見出された［ポーレン（Ｂｏｈｌｅ
ｎ）等、バイオケミカル・アンド・バイオフィジカル・
リサーチ・コムニケーション（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ　、Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１１４：９３
０（１９８３）］。

リバー（Ｒｉｖｉｅｒ）等［ネイチャ−　ＱＪａｔｕｒ
ｅ）、匪２７６（１９８２）］はＧＲＦ（１−４４）及
びＧＲＦ（１−４０）の構造式を記載しており、ＧＲＦ
は生長ホルモンの放出に対して特異的であることを示し
ている。これらの２種のＧＲＦ型はアミン末端で同一で
あるが、しかし、長さにおいて異なっている。ＧＲＦ（
１−４４）はカルボキシ末端でアミド基が存在すること
に特色がある。

リバー等ぐ上記）は、ＧＲＦの生物学的活性が分子のＮ
Ｈ２一末端末端部分在することを示している；完全な活
性は試験管内においてｃＲＦ（１−２９）−ＮＨ２によ
って立証された。

ランス（Ｌａｎｃｅ）等［Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈ
ｙｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．）、１１９：２６５（１
９８４）］は、位１ｌ１、２及び３で選ばれたアミノ酸
の置換基を有するＧＲＦ（↓−２９）−ＮＨ２が生体内
においてブタ及びラットの双方に生長ホルモン（ＧＨ）
の放出増加をもたらすことを示している。米国特許第４
．５１８．！５Ｂ６号は、Ｇｌｙに対する位置ｌ５でＤ
−Ａｌａの置換があるものを含めて、種々なＧＲＦ合成
ペプチドを開示している。同様に、米国特許第４．５２
８。

１９０号及び同第４．５２９，５９５は、位置■５でＤ
−Ａｌａ及び位置２８でＡｓｎの置換を含めて、種々な
ＧＲＦ同族体を開示している。ヨーロッパ特許出願第１
７７．８１９号は、位置ｌ５でグリシンがアラニン、ロ
イシン、バリン、イソロイシン、ノルロイシン、ノルバ
リン、β−アラニンまたはσーアミノイソ酪酸で置換さ
、れるＧＲＦ同族体を開示している。

動物における生長は生物調節分子（ｂｉｏｒｅｇｕｌａ
ｔ。

ｒｙ　ｍｏｌｅｃｕｌｅｓ）のカスケード（ｃａｓｃａ
ｄｅ）によって調節されると信じられている。視床下部
は下垂体から生長ホルモンの放出を誘発するＧＲＦを産
生する。

ＧＲＦの少量は生長ホルモンの血液中への実質的な下垂
体放出をもたらすことが見出されている。かくして、生
長ホルモンの投与が指示された場合、ＧＲＦはこれらの
例において大きな治療実益を有する。例えばＧＲＦを下
垂体性株儒、生長ホルモン産生異常による糖尿病の処置
、創傷及び骨折の治癒の促進、火傷の処置及び老化過程
の遅延に用いることができる。同様に、ＧＲＦは農業の
分野において、実益を有する。農業用途の例には、早期
出荷を可能にするため、または同一期間飼料供給してよ
り大きな動物を生産するため、または肉対脂肪の比を改
善するために鶏または食用に飼育された動物例えばブタ
、ウシ等の肉生産増進が含まれる。またＧＲＦは乳牛に
おけるミルク生産及び鶏における卵生産を刺激する。

本発明は２９〜４４ＷＡのアミノ酸残基を含む新規なペ
プチド、即ち、式 ％式％ 式中、Ｒ１はＴｙｒ　、　Ｄ−Ｔｙｒ　、デスＮＨ２−
Ｔｙｒ、アシルーリ； ＲＩ２はＬｙｓ　、　Ａ　ｌａ　、　Ｌｅｕ　、　Ｖ；
リエまたはｌｉｅであり；ＲｌｆｉはＡｌａ、Ｌｅｕ、
Ｖａｌ、ｌｉｅ、Ｎｌｅ、Ｎｖａｌ、β−Ａｌａまたは
σ−Ａｉｂであり； ＲｆｆｉｌはＬｙｓ　、　Ａ　ｌａ　、　Ｌｅｕ　、　
Ｖａ　ＩまたはＩｌｅであり；Ｒ２′はＭｅｔ、Ｌｅｕ
、Ｎｌｅまたはｌｉｅであり：ｐ２ａはＭ巴またはＳｅ
ｒであり； Ｘは水素または一〇〇−Ａであり： Ｙは−ＯＥまたは−ＮＧＬであり； Ｃ４−アルキルであり； Ｅは水素または０１〜Ｃ５−アルキルであり；Ｇ及びＬ
は独立して水素ｓ　Ｃ１〜Ｃ７−アルキル、Ｃ２〜Ｃ４
−アルケニルまたはハロー０１〜Ｃ４−フルキルに等し
く； ただし、ＥまたはＧ及びＬの双方が水素である場合、置
換基ｘ、　Ｒ１，Ｒ１２，Ｒ１１及びＲ１５（７）少な
くとも１個は下線を引いた残基を表わし、その７ラグメ
ントはカルボキシル末端から１〜１５個のアミノ酸だけ
数を減じるものとする、のペプチドに関する。また本発
明はその製薬学的に許容し得る酸または塩基付加塩から
なる。

式■の好ましいペプチドは２９．３０．３２または４０
個、更に好ましくは２９．３０または３２個のアミノ酸
残基（アミノ末端から計算する）を含む。

他の具体化例においては、Ｘは水素であり、Ｒ１はＴｙ
ｒまたはデスＮＨ２−Ｔｙｒであり、Ｒ２はＡｌａまた
はＤ−Ａｌａであり、　Ｒ１２はＬｙｓまたはＡｌａで
あり、Ｒ１５はＡｌａであり、ＲｌＩはＬｙｓまたはＡ
ｌａであり、Ｒ２１はＬｅｕまｊ；はＮｌｅであり、そ
して該ペプチドが３２個のアミノ酸残基（アミノ末端か
ら計算する）からなり且つ遊離酸カルボキシル末端を有
する。

本発明の特に好ましい化合物は［Ａｌａ”、　Ｌｅｕ２
７、Ａｓｎ”］−ＧＲＦ（１−３２）−０Ｈ及び［Ａｌ
ａ”、　Ｌｅｕ”、Ａｓｎ”］−ＧＲＦ（１−４０）−
ＯＨである。

更に本発明は製薬学的に許容し得る液体または固体の担
体との組み合わせにおいて活性剤として式Ｉの新規なペ
プチドを含む製薬学的ｍ酸物並びに定温及び変温動物、
例えば人間、ウシ、ブタ、鶏及び魚の生長を促進する方
法において本発明の新規ペプチドＩの用途に関する。式
■のペプチドは生長ホルモン欠乏人間、特に子供を処置
する方法並びに短い体勢の子供を処置する方法に特に有
用である。

上記式Ｉにおいて、通常のアミノ酸命名法を用いた。Ｎ
ｌｅはノルロイシンを意味し、Ｎｖａ　ｌはノルバリン
を意味し、σ−Ａｉｂはα−アミノイソ酪酸を示し、そ
してβ−Ａｌａはβ〜アラニンを示す。アミノ酸残基が
異性体型を有する場合、特記せぬ限り、抜型はＬ−型で
ある。

本明細書において、接尾記号ｒ−ＯＨＪ及びｒ−ＨｚＪ
をｒＧＲＦＪの次に用いた場合、これらはそれぞれポリ
ペプチドの遊離酸及びアミドをを示す。接尾記号を用い
てない場合には、この表現には双方の型が含まれるもの
とする。ＧＲＦの同族体はｒＧＲＦＪの前のかっこ内の
置換されたアミノ酸を説明することによって示した；即
ち、例えば“（Ａｌａ”　）−ＧＲＦ”は、アラニン残
基が位置１５でグリシンに置換されたＧＲＦに対応する
アミノ酸配列を有するポリペプチドを示す。ｒＧＲＦＪ
に続くかっこ内の数字は、フラグメントにおけるアミノ
酸残基の数を示すことによって、完全なポリペプチドの
７ラグメントを示す。例えばＧＲＦ（１〜２９）は完全
な配列の最初の２９個のアミノ酸を有するフラグメント
を示す。

本明細書に用いた如きＦＣ１〜Ｃ１−アルキル」、ｒｃ
、−ｃ、−アルキル」及びｒＣ，〜Ｃ７−アルキル」な
る用語はそれぞれ炭素原子１〜４個、１〜５個及び１〜
７個を有する直鎖状または分枝鎖状アルキル基、例えば
メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−プ
チノ呟イソブチル及びＬｅｒｔ、−ブチルを示す。「ハ
ローＣ６〜Ｃ４−アルキル」なる用語は塩素、臭素、フ
ッ素またはヨウ素で置換される炭素原子１〜４個を含む
アルキル基、例えば−ＣＨ□Ｃ１，−ＣＨＣ１２、−Ｃ
１１２Ｆ、−ＣＦｘ、−ＣＨ２Ｃｌ、ＣＩ、−ＣＩ、Ｃ
ＣＩ、を示す。「Ｃ２〜Ｃ４−アルケニル」なる用語は
例えば−ＣＨ＜Ｈ２、−ＯＨｚｃＨ＝ｃＨｚ　、−ＣＨ
＝Ｃ）ｉＣＨ２、−ＣＨ，ＣＨ，ＣＨ＝ＣＨ，の如き基
を示す。

本発明のＧＲＦ同族体の製薬学的に許容し得る塩には例
えば亜鉛または鉄による金属鎖体が含まれる。酸付加塩
の例は塩酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、リン酸塩、マレ
イン酸塩、酢酸塩、クエン厳塩、安息香酸塩、コハク酸
塩、リンゴ酸塩、アスコルビン酸塩、酒石酸塩等である
。

本発明の式■の典型的なペプチドを次の第１表に示す。

本発明のポリペプチドは当該分野においてよく知られた
方法によって、即ち、固相ペプチド合成法、液相ペプチ
ド合成法、または組換え体ＤＮＡ法によって製造するこ
とができる。組換え体ＤＮＡ法は本発明のペプチドの部
分のみ、即ち天然に産するアミノ酸残基のみを含む分子
を合成するために用いることができ、次に該分子を、合
成的に製造し且つ遺伝暗号によるコード化されていない
アミノ酸（複数）を含む第二の分子とカップリングさせ
ることができる。メリフィールド（Ｍｅｒｒｉｆ　１ｅ
ｌｄ）によって、ジャーナル・オブ・ジ・アメリカン・
ケミカル・ンサエティ（Ｊ、Ａｍ、Ｃｈｅ＋＋＋、Ｓｏ
ｃ、）、８５：２１４９（１９６３）に記載された如き
固相合成法、並びに当該分野に精通せる者にとっては公
知の他の化学的に同等の合成法を本発明のペプチドを合
成するために用いることができる。

固相台或は、保護されたアミノ酸を適当な樹脂にカップ
リングさせることによって、ペプチドのＣ−末端アミノ
酸によって開始される。出発物質は、アミノ−保護され
たＣ−末端アミノ酸をベンジルエステル；Ｉ！鎖を介し
てクロロメチル化されたまたはヒドロキシメチル樹脂に
、或いはアミド結合を介してベンズヒドリルアミン（Ｂ
ＨＡ）樹脂またはメチルベンズヒドリルアミン（ＭＢＨ
Ａ）樹脂に結合させることによって製造することができ
る。これらの樹脂は市販品であり、その製造は当該分野
に精通せる者にとっては公知である。

本発明の新規なＧＲＦ同族体の酸型は、固体支持体とし
てベンジルエステル樹脂を用いて、固相ペプチド合成法
によって製造することができる。ポリペプチドを分取型
高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によって均等
質に精製することができ、次に２つの分析用ＨＰＬＣ系
、等電点電気泳動及び高圧薄層電気泳動によって均等質
であることを示すことができる。予想したアミノ酸組成
を確認するためにアミノ酸分析を行った。

対応するアミドは固相ペプチド合成において固体支持体
としてＢＨＡまｌ；はＭＢＨＡ樹脂を用いて製造するこ
とができる。当該分野に精通せる者には、ＢＨＡまたは
ＭＢＨＡｌａｔ脂を用いる場合、固体支持体からポリペ
プチドを除去するため無水１１Ｆによる処理によってＣ
−末端アミド基を有するポリペプチドを生ずることが認
められよう。

Ｃ−末端アミノ酸のＮｅ−アミノ基、例えばＧｌｙをｔ
、ｅｒｔ、−ブチルオキシカルボニル（Ｂｏａ）基によ
って保護する。次にＢｏｃ−Ｇｌｙ−ＯＨを、ジシクロ
へキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）を用いて、約２５℃
で２時間攪拌しながら樹脂にカップリングさせる。Ｂｏ
ｃ保護されたアミノ酸の樹脂支持体へのカップリングに
続いて、塩化メチレン中のトリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）
またはＴＦＡのみを用いてσ−アミノ保護基を除去する
。

この脱保護は約０°Ｃ乃至室温間の温度で行われる。

本発明において使用し得るアミノ酸を保護し、そして該
アミノ酸から保護基を除去する一般的な方法はザ・ペプ
チド（Ｔｈｅ　ｐｅｐｔｉｄｅｓ）、第２＝Ｌｌ−２８
４頁（１９７９）［グロス（Ｅ、Ｇｒｏｓｓ）及びメイ
ンホツファ（Ｊ、！Ｊｅｉｅｎｈｏｆｅｒ）編集、アカ
デミツク・プレス、ニューヨーク（Ａｃａｄｅｍｉｃ　
Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ）］に記載されている。

アミノ酸を結合した樹脂からσ−アミン保護基を除去し
た後、他のアミノ酸を逐次所望の順序で、Ｂｏａ−保護
された型でカップリングさせる。また、合成に際して各
アミノ酸を別個に加える代わりに、固相合成器に加える
前に、一部を相互にカップリングさせることができる。

適当なツ】ツブリング試薬の選択は当該分野に清通せる
者にとって問題はない。ＤＣＣが殊に適当である。

各保護されたアミノ酸またはペプチドを固相反応器に過
剰量で加え、カップリングをジメチルホルムアミド（Ｄ
ＭＦ）または塩化メチレン（ｃｏ２ｃ１□）或いはその
混合物中で行うことができる。不完全なカップリングが
起こる場合、カップリング手順を、次のアミノ酸のカッ
プリング前に、Ｎｅ−アミン保護基を除去する以前にく
り返し行う。合成の各段階でのカップリング反応の結果
を監視することができる。合成を監視する好ましい方法
はニンヒドリン反応によるものである。カンプリング反
応を自動的に例えばベガ２５０ペプチド・シンセサイザ
（Ｖｅｇａ　２５０　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎＬｈｅｓ
ｉｚｅｒ）で行うことができる。

樹脂からペプチドの開裂はペプチド化学ｌ；おいてよく
知られｔ；方法を用いて行うことができる。

ｐ−クレゾール及びジメチルスル７アイドの存在下にお
いて０°Ｃで１時間、フッ化水素との反応に続いて、ｐ
−クレゾールの存在下において０°Ｃで２時間、フッ化
水素との第二の反応を行うことができる。

本発明のポリペプチドの精製はペプチド化学においてよ
く知られた方法を用いて行うことができる。すでに示し
た如く、本ペプチドを分取型ＨＰＬＣを用いて精製する
ことができる；しかしながら、また他の公知のクロマト
グラフ法、例えばゲル浸透、イオン交換及び分配クロマ
トグラフィーまたは向流分配法を用いることができる。

本発明のポリペプチドは生長ホルモン放出活性を有する
。本発明による製薬学的組成物には、製薬学的に許容し
得る液体または固体担体に分散させた鎖中に２９〜４４
個のアミノ酸を有するＧＲＦ同族体またはこれらのいず
れかの無毒性塩が含まれる。

かかる製薬学的組成物を人間及び動物の双方に臨床医薬
として治療または診断学的目的に用いることができる。

本発明の化合物及び製薬学的組成物は、医師がＧＨ産生
を、高めることを望む場合、人間に適用するために有用
である。本発明のペプチドによるＧＨ分泌の刺激は、内
因性ＧＲＦの生産不足に起因する完全または相対的ＧＨ
欠乏による患者において、下垂体性佳儒及びＧＨ産生に
おける異常から生ずる糖尿病の処置に重要である。更に
、ＧＨ分泌増加及びそれに伴う生長増進が人間及び動物
に正常ＧＨレベルによって得られることが考えられる。

更に、投与は身体の脂肪含有量を変え、そして他のＧＨ
−依存代謝、免疫学的及び発育過程を改善する。

例えば本発明のペプチドは、人間において火傷等の処置
に対して同化過程を刺激する手段として有用である。更
に、本化合物を取り引き用の定温動物、例えば鶏、七面
鳥、ブタ、ヤギ、ウシ、ヒツジに生長を刺激するため、
または肉、ミルクもしくは卵生産のために飼育する動物
における飼料効率を高めるために投与することができ、
そしてまた、生長を促進させるため及び脂肪に対する蛋
白質の比を増加させるために、魚及び他の海の変温動物
、例えば海がめ及びうなぎ並びに両生動物を飼育する際
の水耕法に用いることができる。

人間に投与するためには、本発明のペプチドは少なくと
も約９３％、好ましくは少なくとも９８％の純度を存す
るべきである。ここに用いた如き「純度」なる用語は存
在する全ペプチド及びペプチド７ラグメントの上記の重
量％を構成する意図されたペプチドを示す。生長を促進
及び脂肪含有塩量を減少させるためにかかる合成ペプチ
ドを動物に投与するためには、約３％程度、または０．
ＱＩ％程度の純度でも満足できる。

本発明の化合物の生物活性を天然産のＧＲＦ（１−４４
）−Ｎｌ２に匹敵する合成ＧＲＦ（１−４４）−Ｎｌ２
と比較した。

合成ＧＲＦ（１−４４）−Ｎｌ２の生物活性は、先端巨
大症にかかった固体のヒト膵臓Ｍ１ｇ１から単離した天
然のＧＲＦ（１−４４）−Ｎｌ２と同一である［ソーク
研究所標準ｈＧＲＦ−ＮＨ２（ＮＬ−Ａ−１０）］。組
織培養においてラット下垂体細胞における生長ホルモン
の産生を刺激する能力に基づく生物活性に対する評価分
析を後記の実施例２に述べた如くして行った。

投与する本発明のポリペプチドの適当な投薬量は個々の
患者及び処置する症状に応じていくぶん変わるであろう
。正常生長及びペプチドの生長ホルモン放出活性に伴う
生長ホルモンの公知の循環レベルに基づき、当該分野に
精通せる者は適当な投薬量を決定し得るであらう。当該
分野においてよく知られているように、生長に関連する
病気の処置は、生長ホルモン産生不足の程度に応じて、
個人個人に投薬量を変える必要がある。

一般に生長ホルモン放出を刺激するために、患者の体重
を基準にして０．０４μｇ／ｋｇ／日乃至約１．０μｇ
／ｋｇ／日範囲の投薬量を用いることができる。家畜に
おいて生長活性を刺激するために用いる投薬量は、人間
における下垂体体温の如き生長ホルモン欠乏の場合に正
常生長を回復するために用いる投薬量よりも、かなり多
いてあらう。一般に家畜の場合、下垂体生長ホルモンの
放出を刺激するために、皮下的に０．４μｇ／ｋｇ／日
乃至約１０μｇ／ｋｇ／日範囲の投薬量を用いることが
できる。

人間または動物用の製薬学的組成物は普通の製薬学的組
成物製法によって製造することができ乙。

経口的、静脈内、皮下的、筋肉内、腹腔内または鼻内投
与に適する組成物を用いることができる。製薬学的用途
に対する適当な投与形態は本発明の化合物約０．Ｏ１〜
０．５ｍｇであり、該化合物を無菌の水または塩水で再
構成するために凍結乾燥することができる。組成物は同
族体の安全性を保持するために、約８．０以下のｐＨ値
に保持すべきである。また処置する種類による血清アル
ブミン（例えば人間の場合のヒト血清アルブミン、ウシ
の場合のウシ血清アルブミン等）が他の公知の製薬学的
補助剤と共に存在していてもよい。

また本発明は、正常生長に伴うレベルに生長ホルモンの
産生を刺激するために十分な量の本発明のＧＲＦ同族体
を投与することからなる生長ホルモンの不十分な産生に
特色のある生長に関連した病気の処置方法に関する。

生長ホルモンの正常血清レベルは個人個人でかなり変わ
り、そして−個人１こあっても、循環する生長ホルモン
のレベルは一日を通してかなり変化する。成人において
は、生長ホルモンの正常血清レベルは約０−１０ｎｇ／
ｍＩ２に変化することが報告されている。子供において
は、生長ホルモンの正常血清レベルは約０〜２０ｎｇ／
＋＋＋＋２に変化することが報告されている。

上記のＧＲＦ同族体で効果的に下垂体佳儒を処置するた
めに、生長期間中処置剤を投与する。女性の場合、一般
にこの期間は月経開始前後までの期間である。かくして
、女性の処置は、個人に応じて、はぼ１２〜１６オで止
めるべきである。男性の場合には、生長の刺激は思春期
を越えてかなり長期間可能である。かくして、男性の効
果的な処置は通常約１８〜１９才まで、そしである個人
の場合には約２５才まで可能であろう。

また、正常生長に伴うレベルに生長ホルモンの産生を刺
激するために十分な量のＧＲＦ同族体を投与ｒることに
よって動物の生長速度を増加させる方法が提供される。

実施例 以下の実施例において、特記せぬ限り、Ｌ−立体配置に
おける保護された光学的活性アミノ酸を用いた。保護さ
れたアミノ酸をシリカゲルＧプレート上で薄層クロマト
グラフィーによって試験し、塩素−ＴＤＭで展開した。

融点を１・−マス−ツーバー（Ｔｈｏｍａｓ−Ｈｏｏｖ
ｅｒ）装置で測定し、未補正であり、光学的回転をパー
キン−エル？　−（Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ）モデル
１４１偏光計においてジャケット付１ｄｍセル中で測定
し、得られた値に従った。アミノ酸はウォーターズ・ア
ミノ酸アナライザー（Ｗａｔｅｒｓ　Ａｍ１ｎｏ　Ａｃ
１ｄ　Ａｎａｌｙｚｅｒ）によって行った。

種々な保護基及び試薬を示すために、実施例において次
の略号を用いた： ＢＯＣ＝　ｔｅｒｔ、−ブチルオキシカルボニルＺ　　
　　＝ベンジルオキシカルボニル２−ＣＩＺ　　　＝２
−クロロベンジルオキシカルボニルＢｚｌ　　　　−ベ
ンジル ２．６−Ｃ１ｚ−Ｂｚｌ　＝　２．６−ジクロロベンジ
ルＴｏｓ　　　　＝　ｐ−トルエンスルホニルＤＣＣ−
ジシクロへキシルカルボジイミドＢｌｌΔ　　　＝ベン
ズヒドリルアミンＰＡＩＪ　　　　＝フニニルアセ１−
アミドメチルＤ！ＩｌＦ　　　　−ジメチルホルムアミ
ドＤＴＥ　　　　−ジチオエタン ＴＦＡ　　　　＝トルフルオロ酢酸 Ｃ１１２Ｃ１２＝塩化メチレン ＴＧＡ　　　　−チオグリコール酸 本発明のＧＲＦ同族体は市販の自動化された固相ペプチ
ド合成器［ベガ２５０ペプチド・シンセサイザー（Ｖｅ
ｇａ　２５０　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｂｅｓｉｚｅ
ｒ）］を用いて、アミノ酸の逐次カンブリングによって
製造した。

合成においてＮα−Ｂｏｃ−アミノ酸を用いた。

三官能性アミノ酸をそれぞれＮα−Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２
−ＣＩＺ）、Ｎ　ａ　−Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）、
Ｎ　ａ　−Ｂｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、Ｎ　ａ　−Ｂ
ｏｃ−５ｅｒ（Ｂｚｌ）、Ｎσ−ＢｏＣ−Ｔｈｒ（Ｂｚ
ｌ）、Ｎα−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（２，６−Ｃ１ｚ−Ｂｚｌ
）及びＮ　ａ−Ｂｏａ−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）として保護し
た。

以下の実施例は本発明の詳細な説明するだめのものであ
り、決して本発明の範囲を限定するものと解釈すべきで
ない。特記せぬ限り、全ての部及び％は重量基準であり
、全ての温度は°Ｃである。

実施例１ ［ＡｌａｌＳ、Ｌｅｕ”、Ａｓｎ”］−ＧＲＦ（１−３
２）−０Ｈの製造Ｂｏｃ−Ｇｌｙ−ＰＡＭ−樹脂（Ｖｅ
ｇａ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　８ｇｓ　０゜４１
ｍＭ／ｇ）をベガ２９６ペブチド・シンセサイザーの反
応容器に入れ、合計５回の循環に対してＤＣＣ法によっ
て固相ペグチド合成を行い、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ２７−Ａｓ
ｎ”−Ａｒｇ（Ｔｏｓ）”−Ｇｌｎ”−Ｇｉｎ３’−Ｇ
ｌｙ”−ＰＡＭ−樹脂（９，２６ｇ）を得た。ＰＡＭ−
樹脂（０，７ｇ、０．２１ミリモル）をアプライド・バ
イオシステムス（Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ）４３ＯＡペプチド・シンセサイザーの反応容器に入
れ、合計２６回の循環に対して対称性無水物法によって
固相ペプチド合成を行い、［Ａｌａ”、Ｌａｕ”、Ａｓ
ｎ”］−ＧＲＦ（１−３２）−ＰＡＭ−樹脂（１，３ｇ
）が得られ、このものを０°Ｃで２時間、無水ＨＦ（１
０％ＤＴＥ含％）で処理した。ＨＦを０℃で蒸発させ（
高真空下；ＣａＯトラップ）、粗製のペプチド及び樹脂
混合物をＥＩＯＡｃと共に砕解し、ＴＦＡで抽出しｌ；
。溶媒を蒸発させ、残渣を無水エーテルと共に砕解し、
そして乾燥しｔ；。

粗製の物質（０，５２４ｇ）の一部（１００ｍｇ）を２
０ｍＱの０．０２５％ＴＦＡ／Ｈ，Ｏに溶解し、遠心分
離し、濾過し、［０，４５μタイプＨＡミリポア（Ｍｉ
ｌｌｉｐｏｒｅ）７　イルター］、２組からなるｌＸ２
５ｅｍンンクロパック（Ｓｙｎｃｈｒｏｐａｋ）ＲＰ−
Ｐカラム系に入れた。次にカラムを２５％ＣＨ，ＣＮ（
０，０２５％ＴＦＡ）−１１，０から出発して４０％Ｃ
Ｉ！、ＣＮ　（０゜０２５％ＴＦＡ）−Ｈ２Ｏまでの直
線グラジェントによって１２０分間溶離しｌ；（流速２
ｍ１２／分）。フラクションを補集しく１分／フラクシ
ョン）１、被検液を分析用ＨＰＬＣ系で分析した。フラ
クション４１及び４２に現れた生成物を合液し、蒸発さ
せ、凍結乾燥し、純粋な［Ａｌａ１５　、Ｌｅｕ２７、
Ａｓｎ”］−ＧＲＦ（１−３２）−０Ｈを得た、収′ｆ
ｋ、：３．２ｍｇ。

生成物は分析用ＨＰＬＣによって均等性を示し、予想し
たアミノ酸組成を示した（加水分解：１％ＴＧＡ％有６
Ｎ　ＨＣＩ：　ｉｉｏ℃；７２時間）：　Ａｓｐ、　４
．１０；　Ｔｈｒ、０．９３；　Ｓａｒ、　２．１３；
　Ｇｌｕ、　４．２０；　Ｇｌｙ、　１．００；　Ａｌ
ａ。

３．９６；　Ｖａｌ、！、０６；　Ｉｌｅ、　１．８９
；Ｌｅｕ１５．Ｑ９；　Ｔｙｒ。

１．８０；　Ｐｈｅ、０．９４：　Ｌｙｓ、　２．０１
；　Ａｒｇ、　２．８８゜同様の方法において、純粋な
［Ａｌａ”、Ｌｅｕ”、ｓｎ”］−ＧＲＦ（１−４０）
−０Ｈを製造した。

実施例２ ［Ａ　ｌａ　’　ｓ、Ｌｅｕ”　’、Ａｓｎ”　’］−
ＧＲＦ（１−３２）−０Ｈの生物学活匡 ３０−４０匹のスブラーグードーレイ（Ｓｐｒａｇｕｅ
−Ｄａｗ＋ｅｙ）ラッＩ−（１７５ｇ）からの下垂体を
断頭後に無菌的に除去した。前葉を補集し、無菌のヘツ
ベス（Ｈｅｐｅｓ）緩衝剤（０，０２５Ｍ、ｐＨ７，３
５）で３回洗浄し、３７°Ｃで膠原酵素（４ｍｇ／ｍ（
２）及びディスパーゼ（ＤｉｓｐａｓｅＸ蛋白酵素級、
２ｍｇ／ｍＱ）を含むヘツペス緩衝剤（ｐＨ７，３５）
２０〜３０ｍｆｆに分散させた。１００〜１１０分７間
静かにうずをマキ、そしてパスツールピペットで砕解し
た後、分散した細胞を遠心分離（１５０Ｘｇ、４分間）
によって分離し、ノイラミニダーゼ（ｎｅｕｒａｍｉｎ
ｉｄａｓｅＸ８ｇ／ｍＱ）ヲ含むヘッペス緩衝剤及びエ
チレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）ニナトリウム塩２０
０ｇ／ｍｃ＋：　ＰＨ７，３５で１０分間再懸濁させた
。

細胞をプレート用媒質で２回洗浄し、次の制限媒質を用
いて、マルティウエル（ｍｕｌｔｉｗｅｌｌ）−グレー
ト（１，５Ｘ　１０’細胞／ｍＱ）に加えた：２ｇＢＳ
Ａ／１．２．３８ｇヘツベス７勺、５０ｍｇ　ＰＳＮ抗
生物質混合物［ギブコ・ラボラトリイズ（Ｇｉｂｃｏ　
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）によるＦ−１２／ＤＭＥＭ
／ＢＧＪ　（６：３：ＩＸギブコニ　４３０−１７００
／４３０−１６００７３２０−２５９１）、ｌ−８３ｇ
　ＮａＨＣＯ３／１２［ベーカ−（Ｂａｋｅｒ　３５０
６）による１０ｍｇ／１２　ｈランスフェリン［シグマ
（Ｓｉｇｍａ）Ｔ２２５２］。各ウェル中の媒質を、媒
質１ｍＱ当たり０．８〜２００フェムトモル（ｆｍｏｌ
）範囲の濃度で、新規なＧＲＦペプチドまたは天然ＲＦ
（１−４４）−Ｎｌ２の試料で補充した。対照ウェルに
は補充液（ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ）を含ませなかった。

細胞の速い固定を確実にするために、２％子子牛光血清
を加えたこの媒質で塗布を行った。

４０目に、細胞を子牛胎児血清を含まぬ制限媒質で２回
洗浄した。最後に制限媒質９００μＱを、３通りに作成
した各個々の処置剤を含む同一媒質に１００μＱを加え
たウェルに加えた。４時間培養後、媒質を補集し、ラッ
ト生長ホルモンに対するラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ
）を行うために必要なようにして希釈した。

ラット生長ホルモンに対するＲＩＡをンンナ（Ｓｉｎｈ
ａ）のアンチムリン（ａｎｔｉ−ｍ）＋ｒｉｎｅ）Ｇｌ
ｌ免疫血清及び抗体抗原複合物を沈殿さ■・るために蛋
白質Ａを用いるナショナル・ビチュイタリイ・エージエ
ンシイ（Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ｐｉｔｕｉｔａｒｙ　Ａｇ
ｅｎｃｙ）による方法を用いて行った。その結果を次の
第２表に集約する。

笹ｌξ ＧＲＦ（１−４４）−ＮＨｚ　　　　　　　　　　　　
　　　＋、　、。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、式 【遺伝子配列があります】 I 式中、Ｒ＾１はＴｙｒ、Ｄ−Ｔｙｒ、デスＮＨ＿２−Ｔ
   ｙｒ、アシル−Ｔｙｒ、Ｈｉｓまたは￥Ｃ＾α−メチル
   ￥−Ｔｙｒであり； Ｒ＾２はＡｌａ、Ｎ−メチル−Ｄ−ＡｌａまたはＤ−Ａ
   ｌａであり； Ｒ＾１＾２はＬｙｓ、Ａｌａ、￥Ｌｅｕ￥、￥Ｖａｌ￥
   、または￥Ｉｌｅ￥であり； Ｒ＾１＾５はＡｌａ、Ｌｅｕ、Ｖａｌ、Ｉｌｅ、Ｎｌｅ
   、Ｎｖａｌ、β−Ａｌａまたはα−Ａｉｂであり； Ｒ＾２＾１はＬｙｓ、￥Ａｌａ￥、￥Ｌｅｕ￥、￥Ｖａ
   ｌ￥または￥Ｉｌｅ￥であり； Ｒ＾２＾７は￥Ｍｅｔ￥、Ｌｅｕ、ＮｌｅまたはＩｌｅ
   であり； Ｒ＾２＾８は￥Ａｓｎ￥またはＳｅｒであり； Ｘは水素または−ＣＯ−Ａであり； Ｙは−ＯＥまたは−ＮＧＬであり； Ａは￥水素￥、￥Ｃ＿１〜Ｃ＿４−アルキル￥または￥
   ハロ−Ｃ＿１〜Ｃ＿４−アルキル￥であり； Ｅは水素またはＣ＿１〜Ｃ＿５−アルキルであり； Ｇ及びＬは独立して水素、Ｃ＿１〜Ｃ＿７−アルキル、
   Ｃ＿２〜Ｃ＿４−アルケニルまたはハロ−Ｃ＿１〜Ｃ＿
   ４−アルキルに等しく； ただし、ＥまたはＧ及びＬの双方が水素である場合、置
   換基Ｘ、Ｒ＾１、Ｒ＾１＾２、Ｒ＾２＾１及びＲ＾２＾
   ８の少なくとも１個は下線を引いた残基を表わし、その
   フラグメントはカルボキシル末端から１〜１５個のアミ
   ノ酸だけ数を減じるものとする、 のペプチド並びに該化合物の製薬学的に許容し得る酸ま
   たは該化合物の塩基付加塩。 ２、Ｒ＾２＾８がＡｓｎである特許請求の範囲第１項記
   載の化合物。 ３、Ｒ＾１がデスＮＨ＿２−ＴｙｒまたはＴｙｒである
   特許請求の範囲第１項または第２項記載の化合物。 ４、Ｒ＾２がＡｌａ、Ｎ−メチル−Ｄ−ＡｌａまたはＤ
   −Ａｌａである特許請求の範囲第１〜３項のいずれかに
   記載の化合物。 ５、Ｒ＾１＾６がＡｌａである特許請求の範囲第１〜４
   項のいずれかに記載の化合物。 ６、２９、３０、３２または４０個のアミノ酸を含む特
   許請求の範囲第１〜５項のいずれかに記載の化合物。 ７、Ｒ＾２＾１がＡｌａまたはＬｙｓであり、そしてＸ
   が水素である特許請求の範囲第１〜６項のいずれかに記
   載の化合物。 ８、Ｒ＾１＾２がＡｌａまたはＬｙｓであり、そしてＸ
   が水素である特許請求の範囲第１〜７項のいずれかに記
   載の化合物。 ９、Ｒ＾２＾７がＬｅｕである特許請求の範囲第１〜８
   項のいずれかに記載の化合物。 １０、ペプチドがアミノ末端から３２個のアミノアシル
   残基からなり、そして遊離酸カルボキシル末端を有する
   、Ｘが水素であり、Ｒ＾１がＴｙｒまたはデスＮＨ＿２
   −Ｔｙｒであり、Ｒ＾２がＡｌａまたはＤ−Ａｌａであ
   り、Ｒ＾１＾２がＬｙｓまたはＡｌａであり、Ｒ＾１＾
   ５がＡｌａであり、Ｒ＾２＾１がＬｙｓまたはＡｌａで
   あり、Ｒ＾２＾７がＬｅｕまたはＮｌｅであり、Ｒ＾２
   ＾８がＡｓｎまたはＳｅｒである特許請求の範囲第１項
   記載の化合物。 １１、［Ａｌａ＾１＾５、Ｌｅｕ＾２＾７、Ａｓｎ＾２
   ＾８］−ＧＲＦ（１−３２）−ＯＨである特許請求の範
   囲第１項記載の化合物。 １２、［Ａｌａ＾１＾５、Ｌｅｕ＾２＾７、Ａｓｎ＾２
   ＾８］−ＧＲＦ（１−４０）−ＯＨである特許請求の範
   囲第１項記載の化合物。 １３、動物の生長増進のため、或いはそのミルク、肉ま
   たは卵生産を刺激するために獣医薬として使用する特許
   請求の範囲第１〜１２項のいずれかに記載の化合物。 １４、活性成分として特許請求の範囲第１〜１２項のい
   ずれかに記載の化合物及び製薬学的に許容し得る固体ま
   たは液体担体からなる製薬学的組成物。 １５、獣医薬において、及び動物によるミルク、肉また
   は卵の生産における特許請求の範囲第１〜１２項のいず
   れかに記載の化合物の使用。