MX2014007402A - Nuevos analogos de gh-rh con potentes efectos agonistas. - Google Patents
Nuevos analogos de gh-rh con potentes efectos agonistas.Info
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Abstract
Los péptidos sintéticos tienen la secuencia: [R1-A1, A2, A6, A8, A11, A12, A15, A20, A21, A22, N1e27, A28, A29, A30]hGH-RH(1-30)-R2 (SEQ ID NO: 1) en donde R1 es Ac, Tfa, o se encuentra ausente, A1 es Tyr, Dat o N-Me-Tyr, A2 es Ala, D-Ala, Abu o D-Abu, A6 es Phe o Fpa5, A8 es Asn, Ala, Gln, Thr o N-Me-Ala, A11 es Arg, His o Har, A12 es Orn o Lys(Me)2, A15 es Abu o Ala, A20 es Arg, His o Har, A21 es Orn o Lys(Me)2, A22 es Leu u Orn, A28 es Ser o Asp, A29 es Arg, Har, Agm, D-Arg o D-Har, A30 es Arg, Agm, Ada, Amc, Aha, Apa, Har, D-Arg, D-Har, Gab, Gln, D-Gln, Gln-Gab, D-Gln-Gab o se encuentra ausente, R2 es -NH2, -OH, -NHR2, -N(R2)2 u -OR2, en el cual R2 es cualquiera de alquilo C1-12, alquenilo C2-12 o alquinilo C2-12, con la condición de que si A29 es Agm entonces A30 y R2 se encuentran ausentes, A1 es sólo N-Me-Tyr, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
Description
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NUEVOS ANÁLOGOS DE GH-RH CON POTENTES EFECTOS AGONISTAS
Esta invención se hizo en parte con el apoyo del Gobierno. El Gobierno tiene ciertos derechos sobre esta solicitud.
LISTADO DE SECUENCIAS
La presente solicitud contiene un Listado de Secuencias que se han presentado en el formato ASCII a través de la Red EFS y se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. Dicha copia de ASCII, creada el 13 de Diciembre de 2011 se denomina SHAL3041.txt y es de 35,007 bytes de tamaño.
CAMPO DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a péptidos análogos de la hormona del crecimiento-hormona de liberación (GH-RH) que tienen alta afinidad de unión al receptor de GH-RH in vitro y que tienen influencia sobre la función de la glándula pituitaria in vivo. En particular, la presente invención se dirige a péptidos sintéticos que promueven la liberación de la hormona del crecimiento mediante la glándula pituitaria. Más particularmente, la presente invención se refiere a análogos hGH-RH de 29 o 30 aminoácidos que muestran mucha mayor afinidad al receptor GH-RH que el hGH-RH (1-29)NH2 nativo .
Esta invención también se refiere a una composición farmacéutica que comprende cualquiera de dichos agonistas de
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GH-RH y al uso de estos péptidos agonistas en el tratamiento o prevención de trastornos .
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
En 1981 la hormona de crecimiento pancreático humana-hormaona de liberación (hGH-RH) se aisló por primara vez a partir de extractos de tumores pancreáticos humanos y de manera subsecuente del hipotálamo de varios mamíferos . Se descubrió que este péptido promueve la liberación de la hormona del crecimiento (GH) mediante la pituitaria. Se descubrió que la GH-RH hipotálmica humana tiene la misma secuencia de aminoácidos que la pancreática. La GH-RH humana (hGH-RH) contiene 44 aminoácidos con una términal carboxilo amidatada. La estructura de hGH-RH se reprodujo mediante síntesis. Se han sintetizado diversos análogos de hGH-RH y estudiado su actividad biológica. Estos estudios revelaron que :
a) un fragmento de GH-RH que contiene al menos 29 residuos de aminoácido tiene al menos 50% de la potencia de GH-RH natural; la eliminación adicional de los residuos de aminoácidos da como resultado una marcada disminución en la bioactividad [Cambell RM et al., Péptidos 12: 569-574 (1991) ] ;
b) la sustitución de Arg en la posición 29 por Agm (agmatina, 4-guanidino-butilamina) se dice que proporciona resistencia a la degradación enzimática de C-
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terminal (Bajusz S et al. en Péptidos, 1982, Blaha y Melón, Eds., Walter de Gruyter, Berlin-N. Y. , 1983, pp. 643-647);
c) la sustitución de Tyr en la posición 1 por des-aminotirosina (Dat) se dice que conduce a los análogos con actividades biológicas incrementadas como un resultado de la resistencia de N-terminal a la degradación enzimática [Félix A et al., Int. J. Estudio de Proteina Peptldica 32: 441-454 (1988), Kovacs et al., Life Sci. 42: 27-35 (1988)]. Patentes de E.U. Nums . 4,622,312, 4,649,131 y 4,784,987 describen los agonistas de hGH-RH (1-29) con Ala en la posición 15, así como Dat en la posición 1. Se dice que varios de estos agonistas tienen potencia de cuatro veces la de hGH-RH (1-29) ;
d) diversos análogos que contienen Dat en la posición 1 y Agm en la posición 29 se dice que exhiben la capacidad de liberación de GH mejoarada, y por lo tanto mayor potencia que la de hGH-RH(l-29) e in vivo [Zarandi M et al., J. Estudio de Proteina Peptídica. 39:211-217 (1992)];
e) los grupos hidrofóbicos en la C-terminal de una secuencia de péptidos puede dar como resultado una actividad específica significativamente incrementada. En términos de hidrofobicidad, estos resultados se contradicen con los trabajos de otros grupos, e.g., Muranichi [Muranichi S et al., Pharm. Res. 8:649-652 (1991)];
De manera similar, la Patente de E.U. No. 4,914,189
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describe agonistas que tienen Dat en la posición 1, D-Ala en la posición 2, Lys u Orn en la posición 12, Gly en la posición 15, Lys en la posición 21 y Agm en la posición 29. Sin embargo, debe notarse que se dice que estos agonistas han tenido mayor potencia en inducir la liberación de GH que hGH-RH (1-29) que la que tuvo Lys en la posición 12 y D-Ala en la posición 2.
En la Patente de E.U. No. 4,689,318 los análogos de hGH-RH(l-29) pueden tener Lys12 o Lys21 sustituido por Orn y en cuya posición 8 sería Ser (secuencia GH-RH de rata) , Asn (secuencia GH-RH humana) , Thr (secuencia GH-RH de ratón) o Gln (que se presenta de manera no natural en GH-RH) ; y la posición 27 sería Nle. En estos análogos, la posición 1 nunca es Dat, la posición 15 nuca es Abu, la posición 28 nunca es Asp, y la posición 29 nunca es Agm, Arg-NH-CH3, o Arg-NH-CH2-CH3. Se dice que estos análogos tienen potencia tan fuerte como hGH-RH(l-40) tuvo en sustituciones por Arg en las posiciones 12 y 21.
Otros agonistas de hGH-RH(l-29) se enseñan en las solicitudes de patente de PCT números WO 94/11396 y 94/11397, en donde en la posición 12, Lys12 debe de sustituirse por D-Lys, Arg u Orn. Estos análogos también pueden contener Dat como R1; Asn, D-Asn, Ser, D-Ser como R8, Abu como R15; Lys, D-Lys, Arg o D-Arg como R21; Nle como R27; Asp o Ser como R28; y Agm como R29. Estos agonistas que se dice que inducen GH a
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niveles que exceden los inducidos por hGH-RH (1-29) tienen Lys en las posiciones 12. Sin embargo, las enseñanzas de estas dos publicaciones se consideran abiertas a cuestionamientos ya que algún tiempo después de la presentación de estas solicitudes se descubrió que los compuestos considerados sintetizados pueden no con certeza decirse que corresponden con la fórmula con la que originalmente se emparejaron. A demás, también se descubrió después de la presentación de estas solicitudes que los compuestos no liberan GH a los niveles afirmados originalmente.
La Solicitud de Patente Europea 0 413 839 describe análogos de hGH-RH adicionales en cuyas posiciones 12 y 21 pueden ambas ser Lys u Orn, y en donde la posición 15 es Ala. Sin embargo, estos análogos probados para la capacidad de liberación de GH y que se dice tienen mayor potencia que hGH-RH(l-29), tuvieron Lys en las posiciones 12 y 21.
La Patente de E.U. No. 5262519 describe agonistas que tienen las siguientes sustituciones: N-Me Tyr en la posición 1, Ser en la posición 8, Ala en la posición 15, Ala o Aib en las posiciones 16, 24 y 25, Asn en la posición 28, y -NRH en la C-terminal con R siendo H o alquilo inferior. Sin embargo, debe notarse que estos agonistas se dice que han tenido mayor potencia al inducir la liberación de GH que hGH-RH (1-29) que la que nunca tuvo Gln o Thr en la posición 8, Orn en las posiciones 12 y 21, Abu en la posición 15, y Asp
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en la posición 28.
La Patente de E.U. No. 5, 792,7'47 describe los agonistas de GH-RH que tienen Dat en la posición 1; Glu en la posición 3, Ser, Gln o Thr en la posición 8; Orn en las posiciones 12 y 21; lie en la posición 13; Ala o Abu en las posiciones 15, 22 y 23; Glu en la posición 25; Nle, lie o Leu en la posición 27; Asn o Asp en la posición 28; y Agm en la posición 29. Sin embargo, debe notarse que estos agonistas se dice que han tenido mayor potencia al inducir la liberación de GH que hGH-RH(l-29) que la que nunca tuvo N-Me-Tyr1, D-Ala2 y/o -NH-CH3 o -NH-CH2-CH3 en la C-terminal.
La Patente de E.U. No. 7,928,063 describe los agonistas de GH-RH que tienen las siguientes sustituciones: Dat en la posición 1; ácido 6-guanidino-2-capróico (h-Arg) , ácido 4-guanidina-2-aminobutírico (Gab) , o ácido 3-guanidino-2-aminopropiónico (Gap) en las posiciones 11 y 20; Orn, hArg, Gab o Gap en las posiciones 12 y 21; Ala en la posición 15, Nle en la posición 27; y D-Arg, hArg, Gab o Gap en la posición 29. Estos péptidos se dice que exhiben alta resistencia a las acciones enzimáticas y son estimuladores de la liberación de GH potentes y selectivos. Sin embargo debe notarse, que estos agonistas han sido probados y demostraron alta estabilidad solo en la prueba de digestión de tripsina.
Hasta ahora, la mayoría de los análogos GH-RH descritos se han probado en modelos de ratas, ya sea in vitro
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o in vivo. Ya que el GRF(1-29)NH2 de humano y rata son marcadamente diferentes, las relaciones de la actividad de la estructura de GH-RH son diferentes en ambas especies. Por lo tanto, no es posible extrapolar los resultados obtenidos en ratas a humanos. (Brazeau et al, Patente de E.U. 6,458,764).
Otros análogos de hGH-RH(l-29) se enseñan en la solicitud de E.U. publicada 2009/0023646 Al y la O 2009/009727 A2 , en donde el compuesto más potente tiene Ala2, Tyr10, Gly15, y Leu22 sustituido por D-Ala2, D-Tyr10, D-Ala15, y Lys22 respectivamente, que mostraron unión al receptor GH-RH en somatótrofos en pituitarias de ratas y perros y fueron al menos dos veces más potentes in vivo que el GH-RH (1-44) natural .
Un análogo de hGH-RH(l-44) H2 (tesamorelina) que se modificó por el grupo trans-3 -hexenoilo en la N-terminal mostró resistencia contra la desactivación de DPP-IV catalizado [Ferninandi ES et al, Basic Clin Pharmacol Toxicol. 100:49-58 (2007) y Falutz J et al, Acquir Immune Defic Syndr 53:311-322, (2010)]. Sin embargo, debe mencionarse que este agonista no se protegió contra endopeptidasas y degradación química en solución acuosa y solo fue aproximadamente dos veces tan activo como GH-RH en sí mismo.
El hGH-RH(l-44) nativo y sus análogos se sometieron a inactivación biológica tanto mediante rutas enzimáticas
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como químicas. En plasma, hGH-RH se degrada rápidamente a través de la división de dipeptidilpeptidasa IV (DPP-IV) entre los residuos 2 y 3 [Frohman et al, J. Clin. Invest . 83, 1533-1540 (1989), Kubiak et al, Drug Met.Disp. 17, 393-397 (1989)], el sitio de división principal en plasma. En la pituitaria e hipotálamo, los sitios de división principales se encuentran entre Leu14 - Gly15 (enzimas similares a quimotripsina) y entre Lys21 - Leu22 (enzimas similares a tripsina) [Boulanger et al, Brain Res. 616, 39-47 (1993)]. También se observan otras divisiones específicas de tripsina en los residuos de aminoácidos básicos. El hGH-RH(l-44) también se somete a reordenamiento químico [formando Asp8 o beta-Asp8 a partir de Asn8 a través de la formación de aminosuccinimida] y oxidación [Met(O)27 a partir de et27] en ambiente acuoso que reduce grandemente su bioactividad.
Es por lo tanto ventajoso desarrollar análogos de GH-RH de acción prolongada utilizando sustituciones de aminoácidos específicos en la terminal amino (para evitar degradación enzimática) , en el residuo 8 (para reducir la isomerización) , y el residuo 27 (para evitar la oxidación) . La inclusión de las sustituciones de Alal5 o Abul5 para Glyl5, demostraron previamente mejorar la afinidad de unión del receptor, mejorando también la potencia de GH-RH.
Sería deseable producir análogos de hGH-RH mediante múltiples sustituciones de aminoácidos que tengan elevadas
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afinidades de unión a los receptores pituitarios in vitro, y potencias incrementadas in vivo en comparación con hGH-RH(l-29)NH2 nativo.
Ya que un cambio en la secuencia de aminoácidos de un péptido puede causar un gran cambio en la estructura tri-dimenisonal del péptido que tiene influencia sobre la propiedad de unión así como la potencia biológica del péptido, es imposible predecir cuál del uno o más reemplazos de aminoácidos o combinaciones de sustituciones en los análogos de hGH-RH pueden dar como resultado una afinidad de unión mejorada o alta potencia in vivo.
Aunque la invención se ha descrito con respecto a sus modalidades preferidas, las cuales constituyen el mejor modo actualmente conocido por los inventores, debe entenderse que pueden hacerse diversos cambios y modificaciones que serían obvios para alguien de experiencia ordinaria en la materia sin apartarse del alcance de la invención la cual se establece en las reivindicaciones anexas a la presente. Por ejemplo, pueden hacerse modificaciones en la cadena peptídica, particularmente las supresiones inician en la terminal carboxilo del péptido y se extienden hasta aproximadamente la posición 29, de acuerdo con las prácticas experimentales conocidas a la fecha para crear péptidos o fragmentos de péptido que retienen porciones completas o muy sustanciales de la potencia biológica del péptido, y tales
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péptidos se consideran estando dentro del alcance de la invención. Además, pueden hacerse adiciones a cualquier terminal o a ambas terminales, y/o pueden sustituirse residuos generalmente equivalentes para residuos que ocurren naturalmente, como es muy conocido en toda la técnica de la química del péptido, para producir otros análogos que tienen al menos una porción sustancial de la potencia del polipéptido reivindicado sin desviarse del alcance de la invención. Además, pueden hacerse modificaciones al grupo --NH2 preferido en la C-terminal de acuerdo con el estado de esta técnica actual; por ejemplo, el residuo de carboxilo del residuo de aminoácido en la C-terminal puede ser el radical --COOR, --CRO, - -CONHNHR, --CON(R)(R') O --CH2-OR, con R y R' siendo alquilo inferior, fluoro alquilo inferior o hidrógeno, sin apartarse de la invención, para tales modificaciones que dan como resultado péptidos sintéticos equivalentes (Patente de E.U. de Rivier 5262519) .
SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Se proporciona una nueva serie de análogos de péptidos sintéticos de hGH-RH (1-29) NH2 o hGH-RH (1-30) H2. Los nuevos péptidos sintéticos de esta invención exhiben altas actividades para estimular la liberación de la GH pituitaria en animales, incluyendo humanos. También demuestran capacidad de unión extremadamente alta al receptor hGH-RH. Estos análogos de hGH-RH sintéticos también retienen su
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actividad fisiológica en solución durante un periodo de tiempo prolongado y resisten la degradación enzimática en el cuerpo. Las potencias de liberación de GH más fuertes de los nuevos análogos in vivo, en comparación con los previamente descritos, resultan de la combinación de los reemplazos en hGH-RH(l-29)NH2 o GH-RH (1-30) NH2 y de la resistencia a la degradación in vivo. Sin limitar de ninguna forma la invención o su alcance, los solicitantes desean expresar su entendimiento de que la retención de la actividad in vitro y la resistencia a la degradación in vivo se deben a múltiples sustituciones en la molécula: la incorporación de N-Me-Tyr o des-amino-Tyr (Dat) en la posición 1 la cual protege los péptidos de la degradación en la N-terminal; la incorporación de agmatina (Agm) o -NH-CH3 o -NH-CH2-CH3 en la posición 29 o extensión de la C-terminal con un ácido omega-amino el cual protege los péptidos de la degradación en la C-terminal; y también los reemplazos de ambas lisinas en los péptidos sintéticos con ornitina (Orn) , la cual es un sustrato deficiente para las enzimas similares a tripsina; Gly en el residuo 15 por Abu. Para incrementar la estabilidad química, Asn en la posición 8 se reemplaza por Gln, Thr o Ala. Y Met en la posición 27 se reemplaza por norleucina (Nle) . El reemplazo de los otros residuos en loa péptidos y la combinación de estos reemplazos también se ha descubierto que promueven la actividad biológica.
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Péptidos Sintéticos
Los análogos de hGH-RH sintéticos pueden expresarse como
[RX-A\ A2, A6, A8, A11, A12, A15, A20, A21, A22, Nle27, A28, A29, A30] hGH-RH (1-30) -R2
o alternativamente como
[Ri-A1- A2 -Asp-Ala-Ile A6 Thr- A8-Ser-Tyr- A11 -A12-Val-Leu-A15-Gln-Leu-Ser-Ala-A20, A1-A2 -Leu-Gln-Asp-Ile- Nle- A28, A29, A30] - R2 (SEQ ID NO: 1)
en donde
Ri es Ac, Tfa, o se encuentra ausente,
A1 es Tyr, Dat, o N-Me-Tyr,
A2 es Ala, D-Ala, A u, o D-Abu,
A6 es Phe or Fpa5,
A8 es Asn, Ala, Gln, Thr, o N-Me-Ala,
A11 es Arg, Hes, o Har,
A12 es Orn, o Lys( e)2,
A15 es Abu o Ala
A20 es Arg, Hes, o Har,
A21 es Orn, o Lys(Me)2,
A22 es Leu, o Orn,
A28 es Ser, o Asp,
A29 es Arg, Har, Agm, D-Arg, o D-Har,
A30 es Arg, Agm, Ada, Ame, Ana, Apa, Har, D-Arg, D-Har, Gab, Gln, D-Gln, Gln-Gab,
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D-Gln-Gab, o se encuentra ausente,
R2 es -NH2, -OH, -NHR3, -N(R3)2, o -0R3, en el cual R3 es cualquiera de alquilo Ci-i2, alquenilo C2-12, o alquinilo C2-i2, preferentemente siempre que si A29 es Agm entonces A30 y R2 se encuentran ausentes y adecuadamente A1 es solo N-Me-Tyr, y además preferentemente siempre que en donde A30 es Agm entonces R2 se encuentra ausente, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos .
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS
A. PÉPTIDOS SINTÉTICOS
1. Nomenclatura
La nomenclatura utilizada para definir los residuos de aminoácido y péptidos sintéticos es la especificada por la IUPAC-IUB Commission on Biochemical Nomenclature (European J. Biochem, 1984, 138, 9-37) . Por aminoácido natural se entiende uno de los aminoácidos comunes que ocurren de manera natural encontrado en proteínas que comprenden Gly, Ala, Val, Leu, lie, Ser, Thr, Lys, Arg, Asp, Asn, Glu, Gln, Cys, Met Phe, Tyr, Pro, Trp y His. Por Nle se entiende norleucina, por Abu se entiende a ácido alfa amino butírico, y por Orn se entiende ornitina. Otras abreviaturas utilizadas son:
Abreviaturas
Aah ácido alfa-amino-hexanóico
Aap ácido alfa-amino-pentanóico
Abu ácido alfa-aminobutírico
- -
Ac acetilo
AcOH ácido acético
Ac20 anhídrido acético
Ada 12-aminododecanoilo
Agm agmatina
Aha 6-aminohexanoilo
AM aminometilo
Ame 8-Aminocaprililo
Apa 5-Aminopentanoilo
Aib alfa-aminoisobutiroilo
Boc tert-butiloxicarbonilo
Bom benciloximetilo
2BrZ 2-bromo-benciloxicarbonilo
Bufc butilo terciario (éster) Bzl bencilo
cHx ciclohexilo
2CIZ 2-cloro-benciloxicarbonilo 2CITrt 2-clorotritilo
Cpa para-clorofenilalanina
Dat des-amino-tirosina
DCM diclorometano
DIC N, N1 -diisopropilcarbodiimida DIEA diisopropiletilamina
D F dimetilformamida
Et etilo
- -
Fm fluorenilmetilo
Fmoc fluorenilmetoxicarbonilo
For formilo
Fpa Phe mono- o poli-fluorinado (sustitución de flúor en el anillo aromático)
Fpa5 pentafluoro-Phe
Gab gamma-amino butanoilo
GH hormona del crecimiento
GH-RH GH hormona de liberación
Har homoarginina
HBTU 2- (1 H-Benzotriazol-l-il) -1, 1, 3 , 3 -tetrametiluronio hexaflourofosfato
hGH-RH GH-RH humano
HOBt 1-hidroxibenzotriazol
HPLC cromatografía líquida de alto desempeño
Ibu isobutirilo
MBHA para-metilbencidrilamina
Me metilo
MeOH metanol
MeCN acetonitrilo
Mmt 4-metoxitritilo
Mtr 4-metoxi-2 , 3 , 6-trimetilbencenosulfonilo
N-Me-Ala N-metil-Ala
N-Me-Tyr N-metil-Tyr
Nle norleucina
- -
NMM N-metilomorfolina
Oaa ácido omega-amino
Orn ornitina
PAM fenilacetamidometilo
Pbf 2 , 2 , 4 , 6 , 7-pentametil-dihidrobenzofurano-5-sulfonilo
Ph fenilo
PS poliestireno
rGH-RH GH-RH de rata
RP-HPLC HPLC de fase inversa
SPA para-sulfonil-fenoxiacetilo
tBu butilo terciario (éter)
TFA ácido trifluoroacético
Tfa trifluoroacetilo
Tos para-toluenosulfonilo
Trt tritilo (trifenilmetilo)
Z benciloxicarbonilo
Las secuencias de aminoácido de los péptidos sintéticos se numeran en correspondencia con los residuos de aminoácidos en hGH-RH (1-29) ; así por ejemplo, el Ala4 y R8 en los péptidos sintéticos ocupan la misma posición en la secuencia que los residuos Ala4 y R8 en hGH-RH (1-29) .
La convención bajo la cual la N-terminal de un péptido se coloca a la izquierda, y la C-terminal a la derecha también se sigue en la presente.
Modalidades Preferidas
Los agonistas de hGH-RH de la presente invención se designaron para incrementar la liberación de Gh en el nivel pituitario. Las modalidades particularmente preferidas de los péptidos sintéticos de la presente invención se muestran en la Tabla 1:
P-20103 [N-Me-Tyr1, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 2)
P-20105 [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29)
P-20107 [N-Me-Tyr1, Fpa56, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 3)
P-20109 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa5s, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29)
P-20110 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Agm29] hGH-RH (1-29)
P-20111 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa5e, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29)
P-20113 [N-Me-Tyr1, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 4)
P-20115 [N-Me-Tyr1, Fpa5s, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 5)
P-20117 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27, Agm29] hGH-RH (1-29)
P-20350 [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Agm29] hGH-RH (1-29)
- -
P-20351 [Ac-N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH(l-29)
P-20356 [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Agm29]hGH-RH(l-29) (SEQ ID NO: 6)
P-20357 [Dat1, D-Ala2, N-Me-Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Agm29]hGH-RH(l-29)
P-20358 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, N-Me-Ala8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH(l-29)
P-20359 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Agm29]hGH-RH(l-29)
P-20360 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Agm29]hGH-RH(l-29)
P-20361 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Agm29]hGH-RH(l-29)
P-20367 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Agm29] hGH-RH(l-29)
P-20370 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Agm9]hGH-RH(l-29) (SEQ ID NO: 7)
P-20371 [N-Me-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Agm29] hGH-RH(l-29) (SEQ ID NO: 8)
P-20372 [N-Me-Tyr1, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 9)
P-20373 [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 10)
- -
P-20374 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Agm29]hGH- RH(l-29) (SEQ ID NO: 11)
P-20375 [N-Me-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Agm29] hGH-RH(l-29) (SEQ ID NO: 12)
P-20376 [N-Me-Tyr1, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 13)
P-21300 [Dat1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Ame30] hGH-RH (1-30) NH2
P-21301 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Ame30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 14)
P-21303 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Ame30] hGH-RH (1-30) NH2
P-21304 [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Ame30] hGH-RH (1-30) NH2
P-21305 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH2
P-21306 [Dat1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Ame30] hGH-RH (1-30) NH2
P-21307 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH2
P-21308 [Dat1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Ame30] hGH-RH (1-30) NH2
P-21309 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Ala8, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH2
- -
P-21310 [Dat1, D-Ala2, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21,
Nle27, Asp28, Amc30]hGH-RH(l-30)NH2
P-21311 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, His11, Orn12, Abu15, His20,
Orn21, Nle27, Asp28, Amc30] hGH-RH (1-30) NH2
P-22325 [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Apa30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 15)
P-22326 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2
P-22327 [Dat1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Apa30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 16)
P-22328 [Ac-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2
P-22329 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Apa30] hGH-RH (1-30) NH2
P-22330 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2
P-22331 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2
P-22332 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp23,
Apa30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 17)
P-22334 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Apa30] hGH- RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 18)
P-22335 [N-Me-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Apa30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 19)
- -
P-22336 [N-Me-Tyi^Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Apa30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 20)
P-22337 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Cpa6, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2
P-23250 [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Har30] hGH-RH(l-30)NH2
P-23251 [Dat1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Har30] hGH-RH(l-30)NH2 (SEQ ID NO: 21)
P-23252 [Dat1, D-Ala2 , Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Har30] hGH-RH(l-30)NH2
P-23253 [Dat1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30] hGH- RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 22)
P-23254 [Dat1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Ha 30] hGH-RH (1-30) NH2
P-23255 [Dat1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Har30]hGH-RH(l-30)NH2 (SEQ ID NO: 23)
P-23256 [Dat1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Har30] hGH-RH (1-30) NH2
P-23257 [Dat1, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Har30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 24)
P-23258 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH2
P-23259 [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Har30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 25)
- -
P-23260 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Har30] hGH-RH ( 1-30) NH2
P-23261 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Har30]hGH-RH(l-30)NH2 (SEQ ID NO: 26)
P-23262 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, T r8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Har30]hGH-RH(l-30) H2
P-23263 [N-Me-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Har30] hGH-RH(l-30)NH2 (SEQ ID NO: 27)
P-23264 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH2
P-23265 [N-Me-Tyr1, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Har30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 28)
P-24340 [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Aha30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 29)
P-24341 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Aha30] hGH-RH (1-30) NH2
P-24342 [Dat1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Aha30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 30)
P-24344 [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Aha30] hGH-RH (1-30) NH2
P-24345 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
Aha30] hGH-RH (1-30) NH2
P-24346 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Aha30] hGH-RH (1-30) NH2
- -
P-24347 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Aha30]hGH-RH(l-30)NH2
P-24348 [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Aha30] hGH-RH (1-30) NH2
P-25501 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Gab30] hGH-RH (1-30) NH2
P-25502 [Dat1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Gab30] hGH-RH (1-30) NH2
P-25503 [N-Me-Tyr1, Abu2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Gab30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 31)
P-25504 [Dat1, D-Abu2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gab30]hGH- RH(1-30)NH2
P-25506 [N-Me-Tyr1, D-Abu2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Gab30] hGH-RH (1-30) NH2
P-25508 [Tfa-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Gab30] hGH-RH (1-30) NH2
P-25516 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Gab30] hGH-RH (1-30) NH2
P-26802 [Dat1, D-Ala2, Thr8, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21,
Nle27, Ada30] hGH-RH (1-30) NH2
P-26803 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, His11, Orn12, Abu15, His20,
Orn21, Nle27, Ada30] hGH-RH (1-30) NH-CH3
P-26804 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Ada30] hGH-RH (1-30)NH2
- -
P-27400 [Dat1, D-Ala2 , Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28]hGH
RH(1-29)NH-CH3
P-27401 [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp23
D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH-CH3
P-27403 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27
Asp28] hGH-RH (1- 29)NH-CH3
P-27404 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27
Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3
P-27405 [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH-RH (1
29)NH-CH3 (SEQ ID NO: 32)
P-27406 [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27
Asp28] hGH-RH (1- 29)NH-CH3 (SEQ ID NO: 33)
P-27407 [Dat1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH
RH(1-29)NH-CH3 (SEQ ID NO: 34)
P-27408 [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27
Asp28] hGH-RH(l-30)NH-CH3
P-27409 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27
Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3
P-27410 [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27
Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH3
P-27411 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21
Nle27] hGH-RH(l-29)NH-CH3
P-27412 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27
Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3
- -
P-27413 [Dat1, Gln8, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27,
Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH3 (SEQ ID NO: 35)
P-27414 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Gab30] hGH-RH(l-30)NH-CH3
P-27415 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gab30] hGH- RH (1-30) NH-CH3 (SEQ ID NO: 36)
P-27416 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, His11, Orn12, Abu15, His20,
Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3
P-27417 [Ac-Tyr1, D-Ala2 , Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28]hGH-RH(l-29)NH-CH3
P-27418 [Ac-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH3
P-27419 [Ac-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH-RH (1- 29)NH-CH3 (SEQ ID NO: 37)
P-27422 [N-Me-D-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH3
P-27423 [N-Me-D-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH3
P-27424 [Dat1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH-RH (1- 29)NH-CH3 (SEQ ID NO: 38)
P-27425 [N-Me-D-Tyr1, D-Ala2 , Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27, Asp28]hGH-RH(l-29)NH-CH3
P-27440 [Dat1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, D- Arg29] hGH-RH(l-29)NH-CH3
- -
P-27441 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, D-Arg29]hGH-RH(l-29)NH-CH3
P-27442 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH-CH3
P-27443 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, D-Arg29] hGH- RH (1-29) H-CH3
P-27444 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28,
D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH-CH3
P-27445 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, D-Arg29] hGH-RH(l-29)NH-CH3
P-27446 [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH-CH3
P-27447 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle 27
Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH-CH3
P-27448 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle 27
Asp28, Aha30] hGH-RH (1-30) NH-CH3
P-27449 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle 27
Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH-CH3
P-27450 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle 27
Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH-CH3
P-27451 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, His11, Orn12, Abu15, His 20
Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH-CH3 P-28420 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle 27
Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH2-CH3
- -
P-28421 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28] GH-RH (1-29) NH-CH2-CH3
P-28430 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27] hGH-RH (1-29) NH-CH2-CH3
P-28431 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28] GH-RH(l-29)NH-CH2-CH3
P-28460 [N-Me-Tyr1, D-Ala , Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27, Asp28]hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3
P-28461 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3
P-28462 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3
P-28463 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH- RH (1-29) NH-CH2-CH3
P-28464 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3
P-28465 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH2-CH3
P-28466 [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH2-CH3
P-28467 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3
P-28468 [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH2-CH3
- -
P-28469 [Dat1, D-Ala2 , Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH- RH(1-29)NH-CH2-CH3
P-28470 [Dat1, D-Ala2 , Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH-RH (1- 29)NH-CH2-CH3
P-28471 [Dat1, D-Ala2, Gln8 , Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3
P-28472 [Dat1, D-Ala2, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27, Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3
P-28473 [Dat1, D-Ala2 , Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3
P-28474 [Dat1, D-Ala2 , Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH- RH (1-29) NH-CH2-CH3
P-28475 [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Apa30] hGH-RH(l-30)NH-CH2-CH3
P-28476 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Aha30] hGH-RH(l-30)NH-CH2-CH3
P-28477 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn1 , Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Amc30] hGH-RH(l-30)NH-CH2-CH3
P-28478 [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Har30] hGH-RH(l-30)NH-CH2-CH3
P-28479 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, His11, Orn12, Abu15, His20,
Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH-CH2-CH3
P-29701 [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Gln8 , Orn12
,Abu15,Orn21/Nle27,Asp28,Gln-Gab30]hGH-RH] (1- 30)NH2
- -
P-29702 [Dat1, D-Ala2 , Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gln- Gab30] hGH-RH(l-30)NH2
P-29703 [N-Me-Tyr\Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gln- Gab30] hGH-RH(l-30)NH2 (SEQ ID NO: 39).
P-29704 [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21'22, Nle27,
Gln-Gab30]hGH-RH(l-30)NH2
P-29706 [Tfa-Tyr1, D-Abu2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Gln-Gab30] hGH-RH (1-30) NH2
P-29708 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Om21, Nle27,
Gln-Gab30] hGH-RH (1-30) NH2
P-29710 [N- e-Tyr1, D-Ala2,
Fpa56,Ala8, Orn12,Abu15, Orn21, Nle27,Gln-Gab30] hGH-RH (1- 30)NH2
P-29720 [Dat1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Gln- Gab30] hGH-RH (1-30) NH2
P-29721 [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21'22, Nle27,
Asp28, Gln-Gab30] hGH-RH (1-30) NH2
P-29722 [Tfa-Tyr1, D-Abu2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Gln-Gab30] hGH-RH (1-30) NH2
P-29723 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Gln-Gab30] hGH-RH (1-30) H2
P-29724 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa5s, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21,
Nle27, Asp28, Gln-Gab30] hGH-RH (1-30) NH2
- -
B. MÉTODO DE PREPARACIÓN
1. Resumen de Síntesis
Los péptidos se sintetizan mediante métodos adecuados tales como mediante técnicas de fase sólida exclusivas, mediante técnicas de fase sólida parciales, mediante condensación fragmentaria o mediante síntesis clásica de fase en solución. Por ejemplo, las técnicas de síntesis de fase sólida exclusiva se establecen en el libro de texto "Síntesis de Péptidos de Fase Sólida", J.M. Stewart y J.D. Young, Pierce Chem. Company, Rockford, Illinois, 1984 (2a ed.), y M. Bodanszky, "Principios de la Síntesis de Péptidos", Springer Verlag, 1984. Los péptidos agonistas de hGH-RH se preparan preferentemente utilizando síntesis de fase sólida, tal como la descrita en general por Merrifield, J.Am.Chem.Soc. 85 p. 2149 (1963), aunque también pueden utilizarse otras síntesis químicas equivalentes como se mencionó previamente.
La síntesis se llevó a cabo con aminoácidos que se protegen en su grupo alfa amino. Los grupos de protección tipo uretano (Boc o Fmoc) se utilizan preferentemente para la protección del grupo alfa amino. En ciertos casos, los aminoácidos omega protegidos también se utilizan durante la síntesis. Los grupos de protección Boc o Fmoc también son apropiados para la protección de los grupos omega-amino.
En la síntesis de fase sólida, el residuo de
- -
aminoácido N-alfa-protegido o N-omega-protegido el cual forma el grupo aminoacilo del péptido final en la C-terminal se une a un soporte de resina polimérica a través de un enlace químico. Después de terminar la reacción de acoplamiento, el grupo de protección alfa (u omega) amino se retira selectivamente para permitir que las reacciones de acoplamiento subsecuentes tengan lugar en la terminal amino, preferentemente con 50% de TFA en DCM cuando el grupo de protección N-alfa- (N-omega-) es Boc, o por 20% de piperidina en DMF cuando el grupo de protección N-alfa- (N-omega-) es Fmoc. Los aminoácidos restantes con grupos amino alfa (u omega) protegidos de Boc o Fmoc se acoplan gradualmente al grupo amino libre del aminoácido precedente sobre la resina para obtener la secuencia de péptidos deseada. Debido a que los residuos de aminoácido se acoplan al grupo amino alfa (u omega) del residuo C-terminal, el crecimiento de los péptidos análogos sintéticos de hGH-RH inicia en la C-terminal y progresa hacia la N-terminal. Cuando se ha obtenido la secuencia deseada, el péptido se acila, o el grupo amino queda libre en la N-terminal, y el péptido se retira del polímero se soporte .
Cada aminoácido protegido se utiliza en exceso (2.5 o 3 equivalentes) y las reacciones de acoplamiento se llevan a cabo usualmente en DCM, DMF o mezclas de los mismos. El grado de terminación de la reacción de acoplamiento se
- -
monitorea en cada etapa mediante la reacción de ninhidrina. En casos en donde se determina que el acoplamiento es incompleto, se repite el procedimiento de acoplamiento o se lleva a cabo una concentración mediante acetilación de los grupos amino sin reaccionar, antes de retirar el grupo de protección amino alfa (u omega) antes del acoplamiento al siguiente aminoácido.
Los ciclos de síntesis típicos se muestran en la Tabla 2 y la Tabla 3.
TABLA 2 Protocolo para un Ciclo Sintético Típico Utilizando la estrategia Boc
Etapa Reactivo Tiempo de Mezclado (min)
1. Desprotección 50% TFA en DCM 5+25
Lavado de DCM
lavado 2-propanol
2. Neutralización 5% de DIEA en DCM
lavado de DCM
lavado de MeOH
5% de DIEA en DCM
lavado de MeOH
lavado de DCM (3 veces)
3. Acoplamiento 3 eq. Boc-aminoácido en DCM o DMF
+ 3 eq. DIC o el preformado
ester HOBt del Boc-aminoácido 60
Lavado de MeOH (3 veces)
Lavado de DCM (3 veces)
4. Acetilación Ac20 en piridina (30%) 0+20
(si es apropiado) Lavado de MeOH (3 veces)
Lavado de DCM (3 veces)
- -
TABLA 3 Protocolo para un Ciclo Sintético Típico Utilizando la estrategia Fmoc
Etapa Reactivo Tiempo de Mezclado (min)
1. Desprotección 20% piperidina en DMF 5+15
Lavado de DMF (3 veces) 1
2. Acoplamiento 3 eq. Fmoc-aminoácido en DMF
+ 3 eq. DIC
U
+ 3 eq. HBTU + 3 eq. HOBt + 6 eq. DIEA 60
lavado de DMF 1
(3 veces)
3. Acetilación 3 eq. 1-acetilimidazola en DMF 30
(si es apropiado) lavado DMF (3 veces) 1
Después de terminar la síntesis, la división del péptido a partir de la resina puede efectuarse utilizando procedimientos muy conocidos en la química de péptidos.
2. Selección del Polímero de Soporte
Los péptidos agonistas de hGH-RH pueden sintetizarse sobre una variedad de polímeros de soporte, i.e, MBHA, Merrifield, PAM, amida de Rink o resinas de Wang. Los péptidos también pueden sintetizarse sobre aminometilo, MBHA, u otras resinas que se han derivado previamente con enlazadores adecuados. Ejemplos de tales enlazadores son, el enlazador de ácido 4 -hidroximetil benzóico (HMBA) de base lábil para la unión de grupos carboxilo C-terminal, el enlazador de para-sulfonil-fenoxiacetilo (SPA) ácido- lábil que permite la unión de agmatina a través de su grupo
- -
guanidino, o el enlazador de [3- [ (Metil-Fmoc-amino)metil] -indol-l-il] -acetilo de ácido-lábil que permite la síntesis de péptidos con metilamida C-terminal (-NH-CH3) .
Cuando se sintetizan los péptidos con una C-terminal amidatada al utilizar la estrategia Boc, la resina preferida es MBHA. La unión del aminoácido C-terminal a esta resina puede lograrse mediante el método de acoplamiento estándar mediado por DIC descrito en la Tabla 2.
A fin de preparar los péptidos con la modificación de metilamida (-NH-CH3) o etilamida ( -NH-CH2-CH3) C-terminal, pueden utilizarse dos métodos: a) la resina Merrifield se carga con el aminoácido C-terminal protegido con Boc mediante acoplamiento mediado por fluoruro de potasio (KF) o sal de cesio a temperatura elevada; se utilizan resinas de a) [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilAm o b) 3-[(Etil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetil Am respectivamente para la síntesis de los péptidos que tienen modificación de metilamida (-NH-CH3) o etilamina ( -NH-CH2-CH3) C-terminal. Utilizando estas resinas, el grupo de protección Fmoc tiene que retirarse de la resina con el método descrito en la Tabla 3 antes de la síntesis.
Para la síntesis de los péptidos que tienen Agm en la C-terminal, se han utilizado dos métodos. En un caso, la fase de soporte es la resina MBHA o una resina de aminometilo, y el grupo guanidino de Boc-Agm se une al
- -
polímero de soporte a través de un enlazador estable pero fácilmente divisible tal como el residuo de para-sulfonil-fenoxiacetilo (SPA) . El Agm alfa-amino-Boc protegido se hace reaccionar con el ácido clorosulfonil fenoxiacético C1-S02-C6H4-0-CH2-COOH para formar Boc-Agm-S02-C5H4-0-CH2-COOH. Este compuesto se acopla entonces al polímero de soporte e.g., a la resina MBHA utilizando DIC o HBTU-HOBt-DIEA como el reactivo de activación para producir Boc-Agm-SPA-MBHA. En otro caso, se utiliza la resina Agm-S02-PS para la síntesis (1% de DVB, 100-200 mallas, 2.5 mmol/g, Advanced ChemTech (Louisville, KY) ) a pH 10-13 para formar la resina Boc-Agm-S02.
3. Derivados de Aminoácido Utilizados
Los aminoácidos biofuncionales , i.e., los que no tienen grupos funcionales de cadenas laterales, son los más utilizados en la forma de sus derivados N-alfa Boc- o Fmoc para la síntesis. Los omega-aminoácidos biofuncionales también se utilizan típicamente en la forma de sus derivados N-omega Boc- o Fmoc. Así, Boc-Gly-OH o Fmoc-Gly-OH se utiliza típicamente para incorporar el residuo Gly. Los aminoácidos biofuncionales que ocurren de manera natural son Gly, Ala, Val, Leu, lie, Phe y Pro, y algunos aminoácidos bifuncionales no codificados muy conocidos utilizados en esta invención son Abu, Aib, Gab, Nle, Aah y Aap.
Algunos de los residuos de aminoácido de los
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péptidos tienen grupos funcionales de cadena lateral los cuales se hacen reaccionan con reactivos utilizados en el acoplamiento o desprotección. Cuando tales grupos de cadena lateral se encuentran presentes, los grupos de protección adecuados se unen a estos grupos funcionales para evitar reacciones químicas indeseables que ocurren durante las reacciones de acoplamiento.
Las siguientes reglas generales se siguen al seleccionar un grupo de protección de cadena lateral particular: (a) el grupo de protección retiene preferentemente sus propiedades de protección y no se separa bajo condiciones de acoplamiento, (b) el grupo de protección debe ser estable bajo condiciones para retirar el grupo de protección alfa amino en cada etapa de la síntesis, (c) el grupo de protección de cadena lateral debe retirarse al terminar la síntesis de la secuencia de aminoácidos deseada, bajo condiciones de reacción que no alteren de manera indeseable la cadena peptídica.
Cuando se utilizan los aminoácidos Boc en la síntesis, los grupos funcionales de cadena lateral reactivos pueden protegerse como sigue: Tos o nitro (N02) para Arg y Har; cHx o Fm para Asp y Glu; Bom para His; 2CIZ o Fmoc para Lys y Orn; Bzl para Ser y Thr; y 2BrZ para Tyr. Las cadenas laterales de Asn y Gln no se encuentran protegidas .
En el caso de la síntesis de Fmoc, los grupos
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funcionales de cadena lateral reactivos pueden protegerse por otros grupos de protección apropiados como sigue: 2,2,4,6,7-pentametil-dihidrobenzofurano-5-sulfonilo (Pbf) , 4-metoxi-2, 3, 6-trimetilbencenosulfonilo (Mtr) , o bis-Boc para Arg y Har; tert-butilo (Bufc) para Asp y Glu; sin grupo protector o la protección de tritilo (Trt) para Asn y Gln; Trt para His; Boc o 4-metoxitritilo ( mt) para Lys y Orn; tBu o Trt para Ser y Thr; y tBu o 2-clorotritilo (2ClTrt) para Tyr. Además de los aminoácidos codificados y no codificados ampliamente conocidos antes mencionados, algunos de los péptidos de esta solicitud contienen menos aminoácidos no codificados comunes tales como homoarginina (Har) ; ornitina (Orn) ; IM-metil-alanina [N-Me-Ala] ; N-metil-tirosina [N-Me-Tyr] ; pentafluoro-fenilalanina [Phe(F)5, Fpa5] . Estos residuos de aminoácido se incorporan en los péptidos mediante el acoplamiento de derivados de aminoácido protegidos adecuados . Una lista no exclusiva de tales derivados de aminoácido protegidos que puede utilizarse es como sigue: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Orn(2CIZ) -OH, Boc-N-Me-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Fpa5-OH, Fmoc-Har (Pbf) -OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-N-Me-Ala-OH, y Fmoc-N-Me-Tyr (2CITrt) -OH. Los derivados protegidos de los aminoácidos no codificados antes mencionados se encuentran comúnmente disponibles de diversos proveedores comerciales, incluyendo Novabiochem (San Diego, CA) , Advanced ChemTech (Louisville, KY) , Bachem (King of Prussia, PA) ,
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Peptides International (Louisville, KY) , RSP Amino Acid Analogues DBA (Worcester, MA) y AnaSpec (San José, CA) .
4. Acoplamiento Gradual de Residuos de Aminoácido
Utilizando los polímeros de soporte antes mencionados y después de cargar los aminoácidos C-terminal protegidos o el residuo Agm, el péptido por sí mismo puede construirse de manera adecuada mediante la síntesis de fase sólida en la manera convencional . Cada aminoácido protegido se acopla en aproximadamente un exceso molar de tres veces, con respecto a los residuos amino libres de la unión de resina, y el acoplamiento puede llevarse a cabo en un medio tal como DMF-DCM (1:1) o en DMF o DCM solo. La selección de un reactivo de acoplamiento apropiado se encuentra dentro de la experiencia de la materia. Particularmente adecuados como reactivos de acoplamiento son ?,?' -diisopropil carbodiimida (DIC) , o HBTU combinado con HOBt en la presencia de DIEA. El éxito de la reacción de acoplamiento en cada etapa de la sxntesis se monitorea preferentemente mediante la reacción de ninhidrina. En casos en donde ocurre un acoplamiento incompleto, se repite ya sea el procedimiento de acoplamiento o los residuos amino que no reaccionan con la unión de resina se acetilan utilizando un reactivo de concentración, antes de retirar el grupo de protección amino alfa (u omega) . Los reactivos de concentración adecuados son 1-acetilimidazol y Ac20 en piridina.
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5. División del Péptido a Partir del Polímero de Soporte y el Retiro de los Grupos de Protección de Cadena Lateral
Cuando se completa la síntesis, el péptido se divide de la fase de soporte y se retiran sus grupos de protección de cadena lateral.
En casos en donde los péptidos con una C-terminal amidatada (-CONH2) o con un grupo carboxilo C-terminal (-COOH) se preparan mediante la estrategia Boc sobre una resina MBHA, Merrifield o PA , el retiro del péptido a partir de la resina se lleva a cabo mediante el tratamiento con un reactivo tal como fluoruro de hidrógeno líquido (HF) . Este también es el caso para péptidos sintetizados sobre la resina Boc-Agm-SPA-MBHA o Bos-Agm-tosil . En algunos casos, el HF líquido también divide todos los grupos de protección de cadena lateral restantes. Sin embargo, si los grupos de protección de cadena lateral que resisten el tratamiento de HF se encuentran presentes en el péptido, deben llevarse a cabo etapas de división adicionales a fin de retirar estos grupos de protección. Así, los grupos de protección Fm y Fmoc se retiran mediante el tratamiento con 20% de piperidina en DMF, antes o después del tratamiento con HF.
De manera adecuada, la resina de péptido seca y protegida se trata con una mezcla que consiste de 1.0 mi de m-cresol y 10 mi de fluoruro de hidrógeno anhídrido por gramo de péptido-resina durante 60-120 minutos a 0°C para dividir
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el péptido a partir de la resina así como para retirar los grupos de protección de cadena lateral de HF lábil. Después de retirar el fluoruro de hidrógeno bajo una corriente de nitrógeno y vacio, los péptidos libres se precipitan con éter, se filtran, se lavan con éter y etil acetato, se extraen con 50% de ácido acético y se liofilizan.
En casos en donde se preparan péptidos con una C-terminal de metil- (-NH-CH3) o etil-amida ( -NH-CH2-CH3) mediante la estrategia Boc sobre la resina Merrifield o HMBA-MBHA, los péptidos protegidos se dividen primero a partir de la resina mediante aminolisis mediada por metilamina (CH3NH2) o etilamina (CH3CH2NH2) . De manera adecuada, el líquido CH3NH2 o CH3CH2NH2 se transfiere hacia un matraz de vidrio de pared gruesa enfriado que contiene el péptido-resina seco y protegido. La cantidad de líquido CH3NH2 o CH3CH2NH2 debe ser suficiente para cubrir el péptido-resina. El matraz se tapa, y se agita con el líquido CH3 H2 o CH3CH2NH2 durante 3.5 horas a temperatura ambiente a fin de permitir que tenga lugar la reacción. Después de esto, el matraz se enfría abierto en un baño de hielo seco, y el líquido CH3NH2 o CH3CH2NH2 se filtra del residuo sólido que contiene una mezcla de resina y péptido dividido, teniendo aún el péptido los grupos de protección unidos.
El residuo sólido se seca y se somete a tratamiento de HF como se describe arriba, a fin de retirar los grupos de
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protección de cadena lateral del péptido.
En casos en donde los péptidos con una C-terminal de metil- ( -NH-CH3) o etil-amida (-NH-CH2CH3) se preparan mediante la estrategia Fmoc sobre resinas de [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM o 3- [ (Etil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM, respectivamente, los péptidos protegidos se dividen de la resina con un coctel de segmentación. Ya que ningún procedimiento único de división o desprotección es óptimo para todos los péptidos debido a la naturaleza del enlazador y la composición de aminoácidos del péptido, se probó el siguiente coctel de segmentación para ser el más adecuado para la división y desprotección de los agonistas de GH H : 94% de TFA, 3% de H20, 1.5% de m-cresol y 1.5% de fenol. El coctel de segmentación debe prepararse fresco y se tiene que utilizar TFA y eliminadores de alta calidad. La cantidad del coctel de segmentación utilizada depende tanto de la cantidad del péptido-resina como de sus propiedades. Debe utilizarse suficiente solución del coctel para saturar y engrosar la resina durante la reacción, con aproximadamente 2-3 mm de solución transparente por debajo de los glóbulos flotantes. Se utilizan generalmente 5 mi del coctel de segmentación para 0.5 g de resina. La selección del tiempo de reacción depende del enlazador y de los grupos de protección de cadena lateral del péptido. Preferentemente, se utilizan 3 horas de tiempo de reacción
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para la división y desprotección de los agonistas de GHRH. Para inducir la precipitación del péptido, la mezcla de segmentación se agrega a gotas para enfriar éter (preferentemente a -20°C) . Los productos que no son péptidos permanecen en la solución de éter. El material precipitado se recolecta mediante filtración o centrifugación y se lava tres veces con éter frío para retirar cualquiera de los eliminadores residuales . El péptido dividido y desprotegido se disuelve en 50% de ácido acético y se separa de la resina mediante filtración y después de la dilución con agua, se liofiliza la solución.
6. Purificación
La purificación de los péptidos crudos puede efectuarse utilizando procedimientos muy conocidos en la química de péptidos. Por ejemplo, la purificación puede llevarse a cabo sobre un sistema de Beckman System Gold HPLC (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA) equipado con el Módulo de solvente 127P; el Detector UV-VIS, modelo 166P; la estación de trabajo de Computadora con Monitor CPU e impresora, y software 32-Karat, versión 3.0 utilizando una columna de fase inversa XBridge Prep OBD™ (4.6 x 250 mm, empacada con gel de sílice C18, 300 Á de tamaño de poro, 5 µ?? de tamaño de partícula) (Waters Co, Milford, MA) . La columna se eluyó con un sistema de solventes que consiste de (A) 0.1% de TFA acuoso y (B) 0.1% de TFA en 70% de MeC acuoso en un modo de
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gradiente lineal (e.g, 30-55% de B en 120 minutos); tasa de flujo de 12 ml/min. Se monitoreó el eluyente a 220 nm, y se examinaron las fracciones mediante HPLC analítica utilizando una cromatografo de líquidos Hewlett-Packard Modelo HP-1090 y se reunió para dar una pureza máxima. Se llevó a cabo la HPLC analítica sobre una columna de fase inversa Supeico Discovery HS C18 (2.1 x 50 mm, C18 300 Á de tamaño de poro, 3 µp? de tamaño de partícula) (Supeico, Bellefonte, PA) utilizando elución isocrática con un sistema de solventes que consiste de (A) y (B) antes definidos con una tasa de flujo de 0.2 ml/min. Los picos se monitorearon a 220 y 280 nm. Los péptidos se juzgaron para ser sustancialmente puros (>95%) mediante HPLC analítica. Las masas moleculares se verificaron mediante espectrometría de masas por electro-pulverización (Agilent Technologies 6210 Time-of-Light LC/MS, Santa Clara, CA) y las composiciones de aminoácidos esperadas se confirmaron mediante análisis de aminoácidos .
C. COMPOSICIONES FARMACÉUTICAS Y MODO DE ADMINISTRACIÓN
Los péptidos de la invención pueden administrarse en la forma de sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables, tales como sales de adición de ácido. Ilustrativos de tales sales de adición de ácido son hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato, fosfato, fumarato, gluconato, tanato, maleato, acetato, trifluoroacetato, citrato, benzoato, succinato, alginato, pamoato, malato, ascorbato, tartarato, y lo
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similar. Los agonistas particularmente preferidos son sales de baja solubilidad, e.g, sales de pamoato y lo similar. Estas exhiben una larga duración de actividad.
Los compuestos de la presente invención se administran adecuadamente a sujetos humanos o animales de manera subcutánea (s.c), intramuscular (i.m.) o de manera intravenosa (i.v.); intransalmente o mediante inhalación pulmonar; mediante suministro transdérmico; o en una forma de depósito (e.g, microcápsulas , microgránulos, o implantes similares a varillas cilindricas) formulados a partir de un polímero biodegradable adecuado (tal como D,L-lacturo-coglicoluro) , se prefieren los dos modos de depósito anteriores . Otros modos equivalentes de administración también se encuentran dentro del alcance de esta invención, i.e, goteo continuo, parches cutáneos, inyecciones de depósito, bomba de infusión, y modos de liberación por tiempo tales como microcápsulas y lo similar. La administración se encuentra en cualquier portador inyectable fisiológicamente aceptable, siendo aceptable la solución salina fisiológica, aunque también se utilizan otros portadores conocidos en la materia.
Los péptidos se administran de preferentemente, de manera parenteral, intramuscular, subcutánea o intravenosa con un portador farmacéuticamente aceptable tal como salina isotónica. De manera alternativa, los péptidos pueden
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administrarse como una aspersión intranasal con un portador apropiado o mediante inhalación pulmonar. Una ruta de administración adecuada es una forma de depósito formulada a partir de un polímero biodegradable adecuado, e.g, poli-D,L-lacturo-coglicoluro como microcápsulas, microgránulos o implantes cilindricos que contienen compuestos antagonistas dispersos .
La cantidad del péptido necesario depende del tipo de composición farmacéutica y del modo de administración. En casos en donde los sujetos humanos reciben soluciones de agonistas de GH-RH, administrados mediante inyección i.m. o s . c . , o en la forma aspersión intranasal o inhalación pulmonar, las dosis típicas se encuentran entre 2-20 mg/día/paciente, dándose una vez al día o dividido en 2-4 administraciones/día. Cuando los agonistas de GH-RH se administran intravenosamente a pacientes humanos, las dosis típicas se encuentran en el rango de 8-80 µg/kg de peso corporal/día, dividido en 1-4 inyecciones intravenosas rápidas/día o dadas como una infusión continua. Cuando se utilizan las preparaciones de depósito de los agonistas de GH-RH, e.g, mediante inyección i.m. de sales de pamoato u otras sales de baja solubilidad, o mediante administración i.m. o s.c. de microcápsulas, microgránulos o implantes que contienen los compuestos antagonistas dispersos en un polímero biodegradable, las dosis típicas se encuentran entre
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1-10 mg de agonista/día/paciente.
D. APLICACIONES MÉDICAS DE AGONISTAS DE hGH-RH
Los productos de la presente invención pueden utilizarse para promover el crecimiento de animales de sangre caliente (e.g, humanos) y también mejorar la producción de leche en hembras de mamíferos que producen leche, de manera adecuada pero no exclusivamente de cabras y vacas, preferentemente vacas .
Los péptidos de la invención pueden administrarse en la forma de sales no tóxicas farmacéuticamente aceptables, tales como sales de adición de ácido. Ilustrativos de tales sales de adición de ácido son hidrocloruro, hidrobromuro, sulfato, fosfato, fumarato, gluconato, tanato, maleato, acetato, citrato, benzoato, succinato, alginato, pamoato, malato, ascorbato, tartrato y lo similar.
Los compuestos de la presente invención se administran de manera adecuada a los sujetos humanos o animales s.c, i.m, o i.v.; intranasalmente o mediante inhalación pulmonar; o en una forma de depósito (e.g, microcápsulas, microgránulos o implantes similares a varillas cilindricas) formulados a partir de un polímero biodegradable adecuado (tal como D, L-lacturo-co-glicoluro) , se prefieren los dos modos de depósito anteriores. Otros modos equivalentes de administración también se encuentran dentro del alcance de esta invención, i.e, goteo continuo,
inyecciones de depósitos, bomba de infusión y modos de liberación por tiempo tales como microcápsulas y lo similar. La administración se encuentra en cualquier portador inyectable fisiológicamente aceptable, siendo aceptable la solución salina fisiológica, aunque también pueden utilizarse otros portadores conocidos en la materia.
El nivel de dosificación es adecuadamente entre 0.01 µ9 y 2 µg/kg de peso corporal por inyección, excepto para la forma de depósito en donde la cantidad inyectada se calcularía para durar desde aproximadamente 15 hasta aproximadamente 30 días o más. Estos rangos de dosificación son solamente preferidos. La administración de las formas de no depósito puede estar entre 1 y 4 veces por día, o en el caso de mamíferos lactantes, después de cada ordeño.
Hasta que se inicia la producción de la hormona del crecimiento mediante los métodos de ADN recombinante, el pequeño suministro de la hormona de crecimiento humana derivada de pituitaria limita su uso al tratamiento de niños con deficiencia de la hormona del crecimiento. La amplia disponibilidad de la hormona del crecimiento sintética humana ha hecho posible estudios a largo plazo de otros usos potencialmente benéficos de la hormona del crecimiento y sus acciones más fisiológicas. Aunque el GH sintético se aprobó actualmente en los E.U.A. solo para el tratamiento de la falta de crecimiento debido a la carencia de la hormona del
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crecimiento endógena, esta terapia también se ha utilizado para tratar niños de baja estatura sin la deficiencia clásica de GH. Sin embargo el costo del tratamiento a largo plazo con hGH y la necesidad de la administración s.c. diaria son consideraciones importantes. Actualmente el costo de la terapia de la hormona del crecimiento para un niño con deficiencia de crecimiento varia desde $10,000 hasta $30,000 al año dependiendo del peso corporal . El tratamiento de un adulto de 70-kg con hGH tres veces a la semana cuesta $13,800 al año. Vanee, M.L, N.Eng.J.Med 323:52-54 (1990). Así el tratamiento de hormona de crecimiento a largo plazo en adultos mayores con secreción de hormona del crecimiento disminuida requeriría una considerable inversión personal y financiera. A demás existen muchos niños a través de todo el mundo con retardo del crecimiento debido a la falta de GH quienes no pueden tratarse con hGH debido al costo de esta terapia. Consecuentemente existe la necesidad urgente de desarrollar un fármaco que libere GH y con un precio accesible. Este método alternativo para incrementar la secreción endógena de la hormona del crecimiento es a través de la administración de análogos agonistas de la hormona del crecimiento-hormona de liberación. La terapia con los análogos agonistas de GH-RH deben ser mucho menos costosa que la que utiliza hGH. A demás el desarrollo de sistemas de suministro de acción prolongada para estos análogos pueden
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hacer a esta nueva modalidad de tratamiento más práctica y conveniente .
La capacidad para producir la hormona del crecimiento sintética mediante tecnología de ADN recombinante ha permitido la elaboración de GH en cantidades potencialmente ilimitadas. Esto facilita grandemente el tratamiento de niños con deficiencia en GH. Como se estableció antes, el hGH sintético se aprobó actualmente solo para el tratamiento de la falla del creamiento debido a la carencia de la hormona del crecimiento endógena adecuada, pero también se ha utilizado hGH para tratar niños de baja estatura quienes no son clasicamente deficientes en GH tales como niñas con síndrome de Turner; niños prepúberes con insuficiencia renal crónica y severo retardo de crecimiento; y niños sin deficiencia GH de baja estatura.
La producción de GH mediante ingeniería genética es muy costosa para el uso clínico. En particular, existen riesgos de contaminación de estas preparaciones comerciales con material de la cepa bacteriana utilizada. Estos contaminantes bacterianos pueden ser pirógenos o pueden dar como resultado reacciones inmunógenas en los pacientes . La purificación del producto recombinante se lleva a cabo siguiendo una pluralidad de etapas sucesivas de cromatografía. El drástico criterio de pureza impuesto por las dependencias reguladoras necesita múltiples etapas de
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control de calidad. Patente de E.U. 6458764.
De los 3 millones de niños nacidos anualmente en E.U.A., 90,000 se encontrarán por debajo del tercer percentil de estatura. Estos niños pueden etiquetarse teniendo una baja estatura y pueden ser candidatos para el tratamiento con GH. La terapia con la hormona del crecimiento humana cuesta actualmente aproximadamente $20,000 por año y la duración promedio del tratamiento es de aproximadamente 10 años. El tratamiento se detendrá usualmente cuando el paciente alcance una estatura de adulto aceptable (una altura de más de cinco pies) o cuando el paciente madura sexualmente y la epífisis se cierra, en cuyo momento el crecimiento lineal se modera, o si el paciente ya no responde al tratamiento. Si todos los niños que se encuentran por debajo del tercer percentil de altura reciben un curso de cinco años de terapia de hGH, la hGH para la terapia de aumento de estatura tendrá un costo de al menos desde 8 miles de millones hasta 10 miles de millones por año. Lantos J. et al, JAMA 261:1020-1024, (1989) .
Es deseable determinar la capacidad fisiológica endógena de niños que tienen baja estatura para producir hGH. Esto puede hacerse con una prueba de diagnóstico utilizando una dosis de 50-100 µg de GH-RH; una dosis de 50-100 µg de un análogo de GH-RH el cual sea un péptido sintético de la Fórmula I; y ensayar la respuesta de GH producida por cada dosis.
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Los medios de ensayo pueden ser cualquiera de los medios convencionales los cuales indicarán la cantidad cuantitativa de hGH presente en una muestra sanguínea extraída del paciente. La concentración de GH en suero se determina utilizando procedimientos de radioinmunoensayo estándares ("RIA") como se establece en e.g, Miles I.E.M. et al,. Lancet ii, 492-493 (1968) o O'Dell W et al, J. Lab. Clin.Med. 70, 973-80 (1967).
La prueba se utiliza como sigue. Primero, se administra la dosis de GH-RH. Treinta minutos después, se toma una muestra de sangre para RIA de GH. Pueden utilizarse diversos equipos comercialmente disponibles (e.g, Nichols Institute of Diagnostics (Instituto de Diagnósticos Nichols) , San Juan Capistrano, Calif.)) o preparaciones de referencia de hGH (e.g, NIAMDD-hGH-RP-1) para RIA de GH. Después de esperar 6-24 horas para que desaparezca el efecto de GH-RH, se administra la dosis del análogo GH-RH del péptido sintético. Se extrae de nuevo sangre para el radioinmunoensayo de GH.
La presencia de una respuesta de hGH normal en el primer ensayo revela que se encuentra presente la capacidad de producir hGH endógeno. Este resultado también sugiere que puede ser adecuada si la hay, un curso corto y moderado de terapia de GH-RH. Una baja respuesta de GH o ninguna respuesta, a la primera dosis revela solo que debe evaluarse
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el GH-RH en vista del resultado de la segunda prueba. Si se observa una buena respuesta a hGH en la segunda dosis, existe clara capacidad fisiológica de producir hGH que no se evoca por GH-RH. Esto indica que puede ser deseable una terapia con el análogo de GH-RH. Finalmente, una nula o baja respuesta para ambas pruebas revela de manera confiable la falta de capacidad fisiológica para producir hGH, y así se sugiere así que es probablemente necesaria la terapia con hGH.
Como se indicó antes, la corta estatura en niños puede resultar de muchas causas, ninguna de las cuales son inmediatamente aparentes. El uso de la prueba de diagnóstico en todos los niños con esta condición aclararía grandemente la causa de la baja estatura. Tal prueba difundida de detección también proporcionaría indicaciones tempranas para el tratamiento conveniente .
Los glucocoticoides son inhibidores potentes del crecimiento lineal en hombres y la supresión del crecimiento es un riesgo muy conocido del tratamiento a largo plazo de niños asmáticos con esteroides. Así el crecimiento atrofiado es una consecuencia importante de la administración crónica de gucocorticoides en infantes . La inhibición de la secreción de GH se debe en cierta medida al hecho de que la administración crónica de glucocorticoides suprime el GHRH. Esta inhibición ocurre al nivel del hipotálamo o por arriba y
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en esta situación solo el tratamiento con los agonistas de GH-RH estimularán el crecimiento lineal.
La hormona del crecimiento tiende a disminuir con el proceso de envejecimiento y puede conducir a la disminución de la masa muscular y adiposidad. Los estudios han demostrado que el hombre y la mujer mayores de edad saludables con deficiencia de la hormona del crecimiento tienen incrementos en la masa corporal delgada y disminuciones en la masa del tejido adiposo después de seis meses de la administración de hGH. Otros efectos de la administración a largo plazo de hGH en la composición corporal incluyen el incremento de la densidad osea vertebral y el incremento del grosor de los pliegues de la piel . Además, se ha reportado que la inyección diaria de GH-RH a mujeres menopáusicas, durante 8 días, aumenta las respuestas de GH y los niveles de IGF-I y eleva los niveles de osteocalcina en suero. De este modo la terapia con los análogos agonistas de GH-RH reduce la pérdida muscular, masa ósea y de piel y disminuye el aumento de la grasa corporal que normalmente acompaña al proceso de envejecimiento.
La hormona del crecimiento es una hormona anabólica potente que mejora la síntesis de la proteína y la retención de nitrógeno. La administración crónica de análogos agonistas de GH-RH incrementa la secreción endógena de la hormona del crecimiento. La terapia con análogos agonistas
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de GH-RH tiene usos en otras áreas de la medicina tal como estados catabólicos que causan la pérdida acelerada de peso; reparación del tejido en pacientes con severas quemaduras de la superficie corporal, aceleración de la cicatrización de fracturas sin unión; y en algunos casos de insuficiencia cardiaca.
Aunque es necesario un seguimiento a largo plazo, antes de que todas las respuestas de tratamiento se puedan a tribuir a GH, ha habido una mejora en la masa cardiaca y un incremento tanto en la masa cardiaca como la contractilidad. La terapia con hGH interrumpe el ciclo cardiaco-caquexia . Esta respuesta se encuentra en coincidencia con otras observaciones de que la terapia con GH tiene un papel importante en los estados catabólicos en adultos. Un método alternativo para incrementar la secreción endógena de la hormona del crecimiento en estas condiciones es la administración de los análogos agonistas de GH-RH [Korpas et al., J.Clin.Endoc. Metabol . 75, 530-535, (1992)].
Estos análogos agonistas de GH-RH pueden remplazar hGH para muchas aplicaciones. Los niños deficientes de GH responden a GH-RH(l-40), GH-RH(l-29) o GH-RH(l-44), con un incremento en el crecimiento. Thorner M. O. et al., supra; Ross et al., supra; Takano K et al., supra; and Kirk et al., supra. La mayoría de los niños que responden a hGH, responderán a GH-RH. Esto se debe a que la mayoría de los
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niños deficientes de GH tienen un defecto hipotalámico en la liberación de GH, y mostrarán una respuesta a GH después de la administración de los análogos de la hormona hipotalámica GH-RH. Asi, la administración repetida de GH-RH promueve el crecimiento lineal. GH-RH (1-29) H . sub .2 dado dos veces al día de manera subcutánea promovió el crecimiento lineal en aproximadamente 50% de un grupo de niños deficientes de GH (Ross et al., antes citado). Un pequeño grupo de niños severamente deficientes de GH responderá al GH-RH después de 6 (seis) meses de tratamiento.
APLICACIONES CLÍNICAS ADICIONALES DE ANÁLOGOS AGONISTAS DE GH-RH EN NIÑOS CON RETRASO DEL CRECIMIENTO
1. Como una prueba de detección para la deficiencia de la hormona del crecimiento.
2. Tratamiento de la deficiencia Hipotalámica de GH-RH.
3. Retardo constitucional del crecimiento.
4. Síndrome de Turner.
5. Estatura familiar baja.
6. Niños prepúberes con insuficiencia crónica renal y severo retraso de crecimiento.
7. Infantes y niños con retardo del crecimiento intrauterino .
8. Niños con deficiencia de GH que siguen la radioterapia para lesiones de pituitaria o hipotalámicas .
9. Niños en tratamiento a largo plazo con glucocorticoides
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y crecimiento a una tasa inferior a la normal .
APLICACIONES CLÍNICAS ADICIONALES DE ANÁLOGOS AGONISTAS DE GH-RH EN ADULTOS
1. Pacientes Geriátricos: Para reducir la pérdida muscular, masa ósea y de piel y reducir el incremento de la grasa corporal que normalmente acompaña al proceso de enve ecimiento .
2. Estados catabólicos
3. Cicatrización de heridas
4. Cicatrización retardada de fracturas
5. Osteoporósis
6. Obesidad
7. Como un complemento a la nutrición parenteral total en pacientes desnutridos con enfermedad pulmonar obstructiva crónica.
8. Insuficiencia cardiaca
9. Los agonistas de GH-RH pueden utilizarse durante y después de vuelos espaciales para contrarrestar la disminución de la secreción de GH. La ingravidez del vuelo espacial disminuye de manera significativa la liberación de la hormona del crecimiento, lo cual puede explicar la pérdida de masa ósea y debilidad muscular que muchos astronautas experimentan después de prolongados vuelos espaciales.
Usos Terapéuticos de los agonistas de GH-RH
Se ha reportado un tratamiento exitoso de la
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deficiencia de la hormona del crecimiento utilizando hGH-RH y hGH-RH(l-40) en Takano K et al., Endocrinol . Japan 35; 775-781 (1988) y Thorner M. O. et al, N. Engl . J . Med, 312, 4-9 (1985) respectivamente. Los tratamientos terapéuticos utilizando hGH-RH (1-29) también se han reportado contra la deficiencia de la hormona del crecimiento humana, Ross R. J. M. et al, Lancet 1:5-8, (1987); GH disminuido en varones de edad avanzada, Corpas et al, J. Clin. Endocrin. Metabol. 75, 530-535 (1992) ; y estatura baja idiopática, Kirk J. M. . et al., Clinical Endocrinol. 41, 487-493 (1994). Ya que análogos anteriores de hGH-RH han tratado exitosamente condiciones asociadas con bajos niveles de GH, no es sorprendente que los nuevos péptidos hGH-RH sintéticos descritos en la presente induzcan también la liberación de GH y son nuevos tratamientos terapéuticos para estas condiciones .
En efecto, esta conveniencia como un agente terapéutico se confirma por la prueba in vivo abajo reportada. Esta prueba se considera razonablemente predictiva de los resultados que se pueden esperar al tratar mamíferos superiores, incluyendo humanos. A partir de los resultados siguientes, se puede esperar que los nuevos análogos de hGH-RH sintéticos sean útiles para tratar terapéuticamente humanos para la deficiencia de la hormona de crecimiento, asi como para varias otras condiciones de
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crecimiento de muy bajos niveles de GH. De este modo, la invención comprende además un método para tratar la deficiencia de la hormona del crecimiento humana que comprende administrar desde 0.01 m.u. g hasta 2 m.u. g de un péptido por día por kilo de peso corporal.
Los péptidos sintéticos pueden formularse en una forma de dosificación farmacéutica con un excipiente y administrarse a humanos o animales para propósitos terapéuticos o de diagnóstico. Más particularmente, pueden utilizarse los péptidos sintéticos para promover el crecimiento de animales de sangre caliente como, en humanos, para tratar la deficiencia del crecimiento humano mediante la estimulación in vivo de la síntesis y/o liberación de GH endógeno; para tratar ciertas condiciones fisiológicas tales como retardo severo del crecimiento debido a la insuficiencia renal crónica; para compensar ciertos efectos del envejecimiento, e.g, reduciendo la pérdida muscular y la pérdida de masa ósea; para acelerar la cicatrización y reparación de tejido; para mejorar la utilización de los alimentos, incrementando mediante esto la relación delgadez/grasa favoreciendo la ganancia muscular a costa de la grasa; y también mejorar la producción de leche en vacas lactantes. Además, los péptidos sintéticos pueden utilizarse en un método para determinar la capacidad fisiológica endógena para producir hGH.
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EJEMPLOS
La presente invención se describe en relación con los siguientes ejemplos los cuales se establecen solo para propósitos de ilustración. En los ejemplos, se utilizan los aminoácidos protegidos ópticamente activos en la configuración L, excepto en donde se anote de manera específica. Los siguientes Ejemplos establecen los métodos adecuados para sintetizar los nuevos antagonistas de GH-RH mediante la técnica de fase sólida.
EJEMPLO 1
N-Me-Tyr^Ala^Asp^Ala^Ile^FpaS^Thr'-Gln^Ser9-Tyr^-Arg^-Orn^-Val^-Leu^-Abu^-Gln^-Leu^-Ser^-Ala^-Arg20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-lie26-Nle27-Asp28-Agm29 (Péptido 20103)
[N-Me-Tyr1, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 2)
La síntesis se condujo en una manera gradual utilizando un equipo manual de síntesis de péptidos en fase sólida. Se han utilizado dos métodos para la síntesis de péptidos que tienen Agm en la C-terminal. En un caso, el material de inicio de la síntesis es resina de Boc-agmatina-K^-sulfonil-fenoxiacetil-MBHA (Boc-Agm-SPA-MBHA) con una sustitución de 0.03 mmol/g, la cual se obtuvo comercialmente de California Peptide Research, Inc. (Napa, CA) . La síntesis de esta resina se ha descrito en la Patente de E.U. No.
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4,914,189 y en la literatura científica (Zarandi M, Serfozo P, Zsigo J, Bokser L, Janaky T, Olsen DB, Bajusz S, Schally AV, Int. J. Estudio de Proteina Peptídica. 39: 211-217, 1992) , incorporada en la presente mediante la referencia. Brevemente, la resina Boc-Agm-SPA-MBHA (1.67 g, 0.50 mmol) se pre-dilata en DCM y después se llevan a cabo los protocolos de desprotección y neutralización en la Tabla 2 a fin de retirar el grupo de protección Boc y preparar el péptido-resina para el acoplamiento del siguiente aminoácido. En otro caso, se utiliza la resina Agm-sulfonil-poliestireno (PS) [1% DVB, 100-200 mallas, 0.74 mmol/g, American Peptide Company (Sunnyvale, CA) ] . Brevemente, la resina Agm-sulfonil-PS (680 mg, 0.50 mmol) se neutraliza con 5% de DIEA en DCM y se lava de acuerdo con el protocolo descrito en la Tabla 2. La solución de Boc-Asp (OcHx) -OH (475 mg, 1.5 mmol) en DMF-DCM (1:1) se agita con la resina neutralizada y DIC (235 µ?, 1.5 mmol) en un aparato manual de síntesis de péptidos en fase sólida durante 1 hora. Después, se llevan a cabo los protocolos de desprotección y neutralización descritos en la Tabla 2 a fin de retirar el grupo de protección Boc y preparar el péptido-resina para el acoplamiento del siguiente aminoácido. La síntesis se continua en una manera gradual utilizando un equipo manual de síntesis de péptidos en fase sólida en ambos casos, y la cadena peptídica se construye gradualmente mediante el
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acoplamiento de los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina para obtener la secuencia de péptidos deseada: Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr(Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Estos residuos de aminoácidos protegidos (también comúnmente disponibles de NovaBiochem, Advanced Chemtech, Bachem, and Peptides International) se representan arriba de acuerdo con un convenio bien aceptado. El grupo de protección adecuado para el grupo funcional de cadena lateral de aminoácidos particulares aparece en paréntesis. Los grupos OH en las fórmulas anteriores indican que se encuentra libre la terminal carboxilo de cada residuo.
Los aminoácidos protegidos (1.5 mmol cada uno) se acoplan con DIC (235 µ?, 1.5 mmol) con las excepciones de Boc-Asn-OH y Boc-Gln-OH que se acoplan con sus ésteres HOBt preformados .
A fin de dividir el péptido a partir de la resina y desprotegerlo, se agita una porción de 250 mg de resina de péptido seca con 0.5 mi de m-cresol y 5 mi de fluoruro de hidrógeno (HF) a 0°C durante 2 horas. Después de la
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evaporación del HF bajo una corriente de nitrógeno y al vacío, el residuo se lavó con dietil éter seco y etil acetato. El péptido dividido y desprotegido se disolvió en 50% de ácido acético y se separó de la resina mediante filtración. Después de la dilución con agua y liofilización, se obtuvieron 68 mg de producto crudo.
El péptido crudo se verificó mediante HPLC analítica utilizando un cromatógrafo de líquidos Hewlett-Packard Modelo HP-1090 equipado con una columna de fase inversa Supelco Discovery HS C18 (2.1 mm x 5 cm, empacada con gel de sílice C18, 300 Á de tamaño de poro, 3 µp? de tamaño de partícula) (Supelco, Bellefonte, PA) . La elución de gradiente lineal (e.g, 40-70% B) se utilizó con un sistema de solventes que consiste de (A) 0.1% de TFA acuoso y (B) 0.1% de TFA en 70% de MeCN acuoso, y la tasa de flujo es de 0.2 ml/min. Se llevó a cabo la purificación sobre un sistema de Beckman System Gold HPLC (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA) equipado con el Módulo de solvente 127P; el Detector UV-VIS, modelo 166P; Estación de trabajo de computadora con Monitor de CPU e impresora, y software de 32-Karat, versión 3.0. Se disolvieron 68 mg de péptido crudo en AcOH/H20, se agitó, filtró y aplicó sobre una columna de fase inversa XBridge Prep OBD™ (4.6 x 250 mm, empacada con gel de sílice Ci8, 300 Á de tamaño de poro, 5 µp? de tamaño de partícula) (Waters Co, Milford, MA) . La columna se eluyó con el sistema de
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solventes antes descrito en un modo de gradiente lineal (e.g, 40-60% B en 120 minutos) ; tasa de flujo de 12 ml/min. Se monitoreó el eluyente a 220 nm, y se examinaron las fracciones mediante HPLC analítica. Las fracciones con mayor pureza a 95% se agruparon y liofilizaron para dar 18 mg de producto puro La HPLC analítica se llevó a cabo sobre una columna de fase inversa Supelco Discovery C18 antes descrita utilizando elución isocrática con un sistema de solventes antes descrito con una tasa de flujo de 0.2 ml/min. Los picos se monitorearon a 220 y 280 nm. El producto se juzgó para ser sustancialmente puro (>95%) mediante HPLC analítica. La masa molecular se verificó mediante espectrometría de masas con electro-aspersión y se confirmó la composición de aminoácido esperada mediante análisis de aminoácidos.
De acuerdo con el procedimiento anterior el Péptido
20105, Péptido 20107, Péptido 20109, Péptido 20110, Péptido 20111, Péptido 20113, Péptido 20115, Péptido 20350, Péptido 20351, Péptido Péptido 20356, Péptido 20357, Péptido 20358, Péptido 20359, Péptido 20360, Péptido 20361, Péptido 20363, Péptido 20367, Péptido 20370, Péptido 20371, Péptido 20372, Péptido 20373, Péptido 20374, Péptido 20375, Péptido 20376, se sintetizaron de la misma manera que el Péptido 20103, excepto que estos péptidos también contienen otras sustituciones de aminoácidos en la secuencia de péptidos, y los residuos de acilo en sus N-terminales . Los detalles para
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esta síntesis se establecen abajo.
Para la síntesis del péptido 20105, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-0H, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20107, la estructura química de la cual es [[N-Me-Tyr1, Fpa56, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 3), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
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Para la síntesis del Péptido 20109, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr\ D-Ala2, Fpa56, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Or (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20110, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Agm29] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20111, la estructura
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química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina: Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-0rn(2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-0H, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20113, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 4), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc- Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Or (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20115, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Fpa56, Thr8, Orn12, Abu15,
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Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 5), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-lle-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-lle-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20117 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Agm29] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-lle-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-0H, Boc-lle-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20350 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes
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aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina: Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-0H, Boc-lle-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 20351 la estructura química de la cual es [Ac-N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser(Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Ac-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20356, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 6), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-
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OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-0H, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20357 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, N- e-Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-N-Me-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 20358 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, N-Me-Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH,
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Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-N-Me-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20359, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20360, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -
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OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-A u-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20361, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20367, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH (1-29) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH,
- -
Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20370, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Orn12, A u15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(l-29) (SEQ ID NO: 7), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, BOC-Asp (OCHX) -OH, BOC-Gln-OH, BOC-Leu-OH, BOC-LeU-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20371, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29] hGH-RH(l-29) (SEQ ID NO: 8), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-
- -
Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20372, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(l-29) (SEQ ID NO: 9), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20373, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Agm29]hGH-RH(l-29) (SEQ ID NO: 10), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-
- -
Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -0H.
Para la síntesis del Péptido 20374, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Orn12, A u15, Orn21, Nle27, Agm29] hGH-RH(l-29) (SEQ ID NO: 11), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn(2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Ty (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20375, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 12), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Th (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-
- -
Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 20376, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Agm29] hGH-RH (1-29) (SEQ ID NO: 13), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina Agm-S02-PS: Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-0rn(2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
La división y desprotección de HF, y purificación subsecuente mediante HPLC semipreparativa del Péptido 20105, Péptido 20107, Péptido 20109, Péptido 20110, Péptido 20111, Péptido 20113, Péptido 20115, Péptido 20350, Péptido 20351, Péptido 20356, Péptido 357, Péptido 20358, Péptido 20359, Péptido 20360, Péptido 20361, Péptido 20363, Péptido 20367, Péptido 20370, Péptido 20371, Péptido 20372, Péptido 20373, Péptido 20374, Péptido 20375, Péptido 20376 se hacen como se describe en el caso del Péptido 20103. Los compuestos purificados se juzgan para ser sustancialmente puros (>95%) mediante HPLC analítica. Sus masas moleculares se verifican mediante espectrometría de masas por electroespray, y las
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composiciones de aminoácido esperadas se confirman mediante análisis de aminoácidos.
EJEMPLO II
Dat1-D-Ala2-Asp3-Ala4-lie5-Phe6-Thr7-Asn8-Ser9-Tyr10-Arg11-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile2S-Nle27-Asp2B-Arg29-Amc30-NH2 (Péptido 21300) [Dat1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH2.
La síntesis se condujo en una manera gradual utilizando un equipo manual de síntesis de péptidos en fase sólida. Brevemente, la resina para-metilbencidrilamina ( BHA) (100-200 mallas, 1% DVB, 0.7 mmol/g, Advanced Chemtech, Louisville, KY) (350 mg, 0.50 mmol) se neutraliza con 5% de DIEA en DCM y se lavó de acuerdo con el protocolo descrito en la Tabla 2. La solución de Boc-Amc-OH (390 mg, 1.5 mmol) en DMF-DCM (1:1) se agitó con la resina MBHA neutralizada y DIC (235 µ?, 1.5 mmol) en un aparato manual de síntesis de péptidos en fase sólida durante 1 hora. Después de completar la reacción de acoplamiento se probó mediante una prueba de ninhidrina negativa, los protocolos de desprotección y neutralización descritos en la Tabla 2 se llevaron a cabo en el orden para retirar el grupo de protección Boc y preparar el péptido-resina para el acoplamiento del siguiente aminoácido. La síntesis se continuó y la cadena peptídica se construyo gradualmente
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mediante el acoplamiento de los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina para obtener la secuencia péptida deseada: Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-0rn(2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH. Estos residuos de aminoácido protegidos (también comúnmente disponibles de Novabiochem, Advanced Chemtech, Bachem, and Peptides International) se representan arriba de acuerdo a un acuerdo bien aceptado. El grupo de protección adecuado para el grupo funcional de cadena lateral de los aminoácidos particulares aparece en paréntesis. Los grupos OH en la fórmula anterior indican que la terminal carboxilo de cada residuo se encuentra libre. Los aminoácidos protegidos (1.5 mmol cada uno) se acoplan con DIC (235 µ?, 1.5 mmol) con las excepciones de Boc-Asn-OH y Boc-Gln-OH que se acoplan con sus ésteres HOBt preformados.
A fin de dividir el péptido a partir de la resina y desprotegerlo, se agita una porción de 250 mg de resina de péptido seca con 0.5 mi de m-cresol y 5 mi de fluoruro de hidrógeno (HF) a 0°C durante 2 horas. Después de la
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evaporación del HF bajo una corriente de nitrógeno y vacío, el residuo se lavó con dietil éter y etil acetato seco. El péptido dividido y desprotegido se disolvió en 50% de ácido acético y se separó de la resina mediante filtración. Después de la dilución con agua y liofilización, se obtuvieron 130 mg de producto crudo.
El péptido crudo se verificó mediante HPLC analítica utilizando un cromatógrafo de líquidos Hewlett-Packard Model HP-1090 equipado con una columna de fase inversa Supelco Discovery HS C18 (2.1 mm x 5 cm, empacada con gel de sílice C18, 300 Á de tamaño de poro, 3 µt? de tamaño de partícula) (Supelco, Bellefonte, PA) . La elución de gradiente lineal (e.g, 40-70% B) se utilizóa con un sistema de solventes que consiste de (A) 0.1% de TFA acuoso y (B) 0.1% de TFA en 70% de MeCN acuoso, y la tasa de flujo es 0.2 ml/min. La purificación se llevó a cabo sobre un sistema Beckman System Gold HPLC (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA) equipado con Módulo de solvente 127P; Detector UV-VIS, modelo 166P; Estación de trabajo de Computadora con Monitor de CPU e impresora, y software 32-Karat, versión 3.0. Se disolvieron 130 mg de péptido crudo en AcOH/H20, se agitó, filtró y aplicó sobre una columna de fase inversa XBridge Prep OBD™ (4.6 x 250 mm, empacada con gel de sílice Ci8, 300 Á de tamaño de poro, 5 µp? de tamaño de partícula) (Waters Co, Milford, MA) . La columna se eluyó con el sistema de solventes antes
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descrito en un modo de gradiente lineal (e.g, 40-60% B en 120 min) ; tasa de flujo de 12 ml/min. El eluyente se monitoreó a 220 nm, y se examinaron las fracciones mediante HPLC analítica. Las fracciones con mayor pureza que el 95% se agruparon y liofilizaron para dar 28 mg de producto puro. La HPLC analítica se llevó a cabo sobre una columna de fase inversa Supelco Discovery C18 antes descrita utilizando elución isocrática con el sistema de solventes antes descrito con una tasa de flujo de 0.2 ml/min. Los picos se monitorearon a 220 y 280 nm. El producto se juzgó para ser sustancialmente puro (>95%) mediante HPLC analítica. Se verificó la masa molecular mediante espectrometría de masas de electroespray, y se confirmó la composición de aminoácidos esperada mediante análisis de aminoácidos.
De acuerdo con el procedimiento anterior el Péptido
21301, Péptido, Péptido 21304, Péptido 21305, Péptido 21306,
Péptido 21307, Péptido 21308, Péptido 21309, Péptido 21310,
Péptido 21311, Péptido 22325, Péptido 22326, Péptido 22327,
Péptido 22328, Péptido 22329, Péptido 22330, Péptido 22331,
Péptido 22332, Péptido 22334, Péptido 22335, Péptido 22336,
Péptido 22337, Péptido 23250, Péptido 23251, Péptido 23252,
Péptido 23253, Péptido 23254 , Péptido 23255, Péptido 23256,
Péptido 23257, Péptido 23258, Péptido 23259, Péptido 23260,
Péptido 23261, Péptido 23262, Péptido 23263, Péptido 23264,
Péptido 23265, Péptido 24340, Péptido 24341, Péptido 24342,
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Péptido 24344, Péptido 24345, Péptido 24346, Péptido 24347, Péptido 24348, Péptido 25501, Péptido 25502, Péptido 25503, Péptido 25504, Péptido 25506, Péptido 25508, Péptido 25516, Péptido 26802, Péptido 26803, Péptido 2680, se sintetizaron de la misma manera que el Péptido 20300, excepto que estos péptidos también contienen otras sustituciones de aminoácidos en la secuencia de péptidos, y/o diferentes residuos de aminoácidos alfa u omega en su C-terminal. Los detalles de estas síntesis se establecen abajo.
Para la síntesis del Péptido 21301, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 14), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Amc-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Se (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 21303, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina
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MBHA: Boc-Amc-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -0H, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-A u-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -0H, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 21304, la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Amc-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 21305, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Amc-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -
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OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 21306, la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH) , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Amc-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 21307, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Amc-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH,
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Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 21308, la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Amc-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 21309, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH2 , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Amc-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH,
- -
Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -0H .
Para la síntesis del Péptido 21310, la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, His11, Orn12, A u15, His20, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Amc-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn(2CIZ) -OH, Boc-His (Bom) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-His (Bom) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 21311, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH(l-30)NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Amc-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-His (Bom) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-
- -
OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-His (Bom) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH .
Para la síntesis del Péptido 22325, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, A u15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 15), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Apa-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 22326, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Apa-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -
- -
OH, Boc-Tyr ( 2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH .
Para la síntesis del Péptido 22327, la estructura química de la cual es [Dat1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 16), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Apa-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Or (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos ) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Or (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 22328, la estructura química de la cual es [Ac-Tyr1, D-Ala2 , Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Apa-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-
Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Ac-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 22329, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, A u15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Apa-OH, Boc-Arg (Tos ) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Th (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 22330, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2 , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Apa-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-
- -
Asp(OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH .
Para la síntesis del Péptido 22331, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] GH-RH (1-30) NH2 , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Apa-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 22332, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 17), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la Resina MBHA: Boc-Apa-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-0rn(2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 22334, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 18), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la Resina MBHA: Boc-Apa-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc- Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Se (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 22335 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 19), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la Resina MBHA: Boc-Apa-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Or (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 22336 la estructura
química de la cual es [N-Me-Tyr1, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 20), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Apa-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH .
Para la síntesis del Péptido 22337 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Cpa6, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH(l-30)NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Apa-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Cpa-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 23250, la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
- -
Nle27, Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, BOC-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 23251, la estructura química de la cual es [Dat1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 21), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 23252, la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nile27, Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) H2, se acoplan los siguientes
- -
aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 23253, la estructura química de la cual es [Dat1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30]hGH-RH(l-30) H2 (SEQ ID NO: 22), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2Brz) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 23254, la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2 , Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina
- -
MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-0rn(2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 23255, la estructura química de la cual es [Dat1 Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30]hGH-RH(l-30)NH2 (SEQ ID NO: 23), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 23256, la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30]hGH-RH(l-30)NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH,
- -
Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -0H, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 23257, la estructura química de la cual es [Dat1, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30] hGH-RH(l-30)NH2 (SEQ ID NO: 24), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Or (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 23258, la estructura química de la cual es [N- e-Tyr1, D-Ala2, Gln3, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-
- -
Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -0H, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 23259, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp23, Har30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 25), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 23260, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-
- -
Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, BOC-Phe-OH, BOC-Ile-OH, BOC-Ala-OH, BOC-Asp(OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -0H.
Para la síntesis del Péptido 23261, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Orn12, A u15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30]hGH-RH(l-30)NH2 (SEQ ID NO: 26), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH .
Para la síntesis del Péptido 23262, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la Resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-
- -
Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -0H, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -0H, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 23263, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30]hGH-RH(l-30)NH2(SEQ ID NO: 27), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA : Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH .
Para la síntesis del Péptido 23264, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-
- -
Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -0H, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH .
Para la síntesis del Péptido 23265, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 28), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Har (Tos) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 24340 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Aha30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 29), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Aha-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Or (2CIZ) -OH,
- -
Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH .
Para la síntesis del Péptido 24341 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Aha30] hGH-RH (1-30) NH2) se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Aha-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH .
Para la síntesis del Péptido 24342 la estructura química de la cual es [Dat1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Aha30] hGH-RH (1-30) NH2 (SEQ ID NO: 30), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Aha-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-
- -
Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 24344 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Aha30]hGH-RH(l-30) H2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Aha-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 24345 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ana30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Aha-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-
- -
Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 24346 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Aha30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Aha-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 24347 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Aha30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Aha-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
- -
Para la síntesis del Péptido 24348 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Aha30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Aha-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Or (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 25501 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gab30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 25502 la estructura
química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gab30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 25503 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Abu2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gab30]hGH-RH(l-30)NH2 (SEQ ID NO: 31), se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Abu-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 25504 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Abu2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27,
Gab30] hGH-RH (1-30) H2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la Resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Abu-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 25506 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Abu2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gab30] hGH-RH (1-30) NH2 , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Abu-OH, Boc-N-Me-Ty (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 25508 la estructura química de la cual es [Tfa-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gab30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina
- -
MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn(2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 25516 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Gab30]hGH-RH(l-30)NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Arg (TOS) -OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 26802 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Thr8, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, Ada30] hGH-RH( 1-30) H2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Ada-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH,
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Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-His (Bom) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-His (Bom) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-T r (Bzl) -OH, Boc-Thr(Bzl)-OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 26803 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Gln8, His11, Orn12, Abu15, His20, orn21, Nle27, Ada30] hGH-RH (1-30) NH2 , se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Ada-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-His (Bom) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn(2CIZ) -OH, Boc-His (Bom) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 26804 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Ada30] hGH-RH (1-30 ) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Ada-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH,
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Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn(2ClZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
La división y desprotección de HF y la subsecuente purificación mediante HPLC setnipreparativa del Péptido 21301,
Péptido 21303, Péptido 21304, Péptido 21305, Péptido 21306,
Péptido 21307, Péptido 21308, Péptido 21309, Péptido 21310,
Péptido 21311, Péptido 22325, Péptido 22326, Péptido 22327,
Péptido 22328, Péptido 22329, Péptido 22330, Péptido 22331,
Péptido 22332, Péptido 22334, Péptido 22335, Péptido 22336,
Péptido 22337, Péptido 23250, Péptido 23251, Péptido 23252,
Péptido 23253, Péptido 23254, Péptido 23255, Péptido 23256,
Péptido 23257, Péptido 23258, Péptido 23259, Péptido 23260,
Péptido 23261, Péptido 23262, Péptido 23263, Péptido 23264,
Péptido 23265, Péptido 24340, Péptido 24341, Péptido 24342,
Péptido 24344, Péptido 24345, Péptido 24346, Péptido 24347,
Péptido 24348, Péptido 25501, Péptido 25502, Péptido 25503,
Péptido 25504, Péptido 25506, Péptido 25508, Péptido 25516,
Péptido 26802, Péptido 26803, Péptido 2680 se hacen como se describe en el caso del Péptido 21300. Los compuestos piurificados se juzgan para ser sustancialmente puros (>95%) mediante HPLC analítica. Se verifican sus masas moleculares
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mediante espectrometría de masas por electroespray, y se confirmaron las composiciones de aminoácido esperadas mediante análisis de aminoácidos.
Ejemplo III
Dat1-D-Ala2-Asp3-Ala4-Ile5-Phe6-Thr7-Asn8-Ser9-Tyr10-Arg1:1-Orn12-Val13-Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25- 1le26-Nle27-Asp28-Arg29-NH-CH3 (Péptido
27400)
[Dat1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp8] hGH-RH (1-29) NH-CH3 La síntesis se condujo en una manera gradual utilizando un equipo manual de síntesis de péptidos en fase sólida. Brevemente, la resina [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM (Nova Biochem, La Jolla, CA) (750 mg, 0.50 mmol) se desprotege con 20% de piperidina en DMF durante 5 y 15 minutos y se lavó de acuerdo con el protocolo descrito en la Tabla 3. La solución de Fmoc-Arg (Pbf) -OH (975 mg, 1.5 mmol) en DMF se agitó con la resina lavada y DIC (235 µ?, 1.5 mmol) en un un aparato manual de síntesis de péptidos en fase sólida durante 1 hora. Después de lavar la resina tres veces con DMF, se repitió la reacción de acoplamiento como se describió arriba. Después del acoplamiento repetido y después de completar la reacción se prueba mediante una prueba de ninhidrina negativa, los protocolos de desprotección y neutralización descritos en la Tabla 3 se llevan a cabo a fin de retirar el grupo de protección Fmoc y
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preparar el péptido-resina para el acoplamiento del siguiente aminoácido. La síntesisi se continúa y la cadena peptídica se construye gradualmente mediante el acoplamiento de los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina para obtener la secuencia de péptidos deseada: Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu1") -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn(Boc)-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gl (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu'') -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Estos residuos de aminoácidos protegidos (también comúnmente disponibles de Novabiochem, Advanced Chemtech, Bachem, and Peptides International) se representan arriba de acuerdo con un convenio bien aceptado. El grupo de protección adecuado para el grupo funcional de cadena lateral de aminoácidos particulares aparece en paréntesis. Los grupos OH en las fórmulas de arriba indican que la terminal carboxilo de cada residuo se encuentra libre .
Los aminoácidos protegidos (1.5 mmol cada uno) se acoplan con DIC (235 µ?, 1.5 mmol) con las excepciones de Fmoc-Asn (Trt) -OH y Fmoc-Gln (Trt) -OH que se acoplan con el reactivo HBTU.
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A fin de dividir el péptido a partir de resina y desprotegerlo, una porción de 250 mg de la resina de péptido seca se agita con 2.5 mi de coctel de segmentación (94% de TFA, 3% H20, 1.5% de m-cresol, y 1.5% de fenol) a temperatura ambiente durante 3 horas. Para inducir la precipitación del péptido, se agregó la mezcla de segmentación a gotas para enfriar el éter (preferentemente 20°C) . El material precipitado se recolectó mediante filtración o centrifugación y se lavó tres veces con éter frío. El péptido dividido y desprotegido se disolvió en 50% de ácido acético y se separó de la resina mediante filtración. Después de la dilución con agua y liofilización, se obtienen 118 mg de producto crudo.
El péptido crudo se verificó mediante HPLC analítica utilizando un cromatógrafo de líquidos Hewlett-Packard Modelo HP-1090 equipado con una columna de fase inversa Supelco Discovery HS C18 (2.1 mm x 5 cm, empacada con gel de sílice C18, 300 Á de tamaño de poro, 3 µp? de tamaño de partícula) (Supelco, Bellefonte, PA) . Se utilizó la elución de gradiente lineal (e.g, 40-70% B) con un sistema de solventes que consiste de (A) 0.1% de TFA acuoso y (B) 0.1% de TFA en 70% de MeCN acuoso, y la tasa de flujo es de 0.2 ml/min. La purificación se llevó a cabo sobre un sistema Beckman System Gold HPLC (Beckman Coulter, Inc, Brea, CA) equipado con el Módulo de solvente 127p; el Detector UV-VIS, modelo 166p; la estación de trabajo de Computadora con el
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Monitor de CPU e impresora, y software32-Karat , versión 3.0. Se disolvieron 118 mg de péptido crudo en AcOH/H20, se agitaron, filtraron y aplicaron sobre una columna de fase inversa XBridge Prep OBD™ (4.6 x 250 mm, empacada con gel de sílice C18, 300 Á de tamaño de poro, 5 µt? de tamaño de partícula) ( aters Co, Milford, MA) . La columna se eluyó con el sistema de solventes antes descrito en un modo de gradiente lineal (e.g, 40-60% B en 120 min) ; tasa de flujo de 12 ml/min. Se monitoreó el eluyente a 220 nm, y se examinaron las fracciones mediante HPLC analítica. Las fracciones con pureza mayor al 95% se agruparon y liofilizaron para dar 19 mg de producto puro. La HPLC analítica se llevó a cabo sobre una columna de fase inversa Supelco Discovery C18 antes descrita utilizando una elución isocrática con el sistema de solventes antes descrito con una tasa de flujo de 0.2 ml/min. Se monitorearon los picos a 220 y 280 nm. El producto se juzgó para ser sustancxalmente puro (>95%) mediante HPLC analítica. La Masa molecular se verificó mediante espectrometría de masas por electroespray, y se confirmó la composición de aminoácidos esperada mediante análisis de aminoácidos.
De acuerdo con el procedimiento anterior el Péptido 27401, Péptido 27403, Péptido 27404, Péptido 27405, Péptido 27406, Péptido 27407, Péptido 27408, Péptido 27409, Péptido 27410, Péptido 27411, Péptido 412, Péptido 27413, Péptido
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27414, Péptido 27415, Péptido 27416, Péptido 27417, Péptido
27418, Péptido 27419, Péptido 27422, Péptido 27423, Péptido
27424, Péptido 27425, Péptido 27440, Péptido 27441, Péptido
27442, Péptido 27443, Péptido 27444, Péptido 27445, Péptido
27446, Péptido 27447, Péptido 27448, Péptido 27449, Péptido
27450, Péptido 27451 se sintetizaron de la misma manera que el Péptido 27400, excepto que estos péptidos también contienen otras sustituciones de aminoácidos en la secuencia de péptidos. Los detalles para estas síntesis se establecen abajo.
Para la síntesis del Péptido 27401, la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, D-Arg29]hGH-RH(l-29)NH-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo Am: Fmoc-D-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu*1) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu ) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc- Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu*1) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 27403, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Gln8, Orn12, Abu15,
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Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc- Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27404, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc- Thr(tBu)-OH, Fmoc-Fpa5-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-
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Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27405, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27]hGH-RH(l-29)NH-CH3 (SEQ ID NO: 32), se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu*1) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fraoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27406, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH3 (SEQ ID NO: 33), se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu ) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH,
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Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln(Trt) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27407, la estructura química de la cual es [Dat1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28]hGH-RH(l-29)NH-CH3 (SEQ ID NO: 34), se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-As (OBu*) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( Bu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc- Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 27408, la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28]hGH-RH(l-29)NH-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu*) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-As (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH,
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Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-As tOB^) -0H, Fmoc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 27409, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28]hGH-RH(l-29)NH-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Tyr ( Bu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( tBu) -OH .
Para la síntesis del Péptido 27410, la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu*) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-
- -
OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt ) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc- Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27411 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH-RH (1-29) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( Bu) -OH, Fraoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( tBu) -OH .
Para la síntesis del Péptido 27412 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp23] hGH-RH (1-29) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -
- -
acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (???? ) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -0H, Fmoc-Gln (Trt) -0H, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Ftnoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -0H, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -0H, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr ( tBu) -0H, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-AspíOBu ) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27413 la estructura química de la cual es [Dat\ Gln8, His11, Orn12, Abu15, His20, Om21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3 (SEQ ID NO: 35), se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ ( etil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-AspíOBu*) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu* ) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 27414 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gab30] hGH-RH (1-30) NH-CH3 , se acoplaron los
siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ ( etil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Gab-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (BocpOH, FraOC=- Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Fpa5-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27415 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gab30]hGH-RH(l-30)NH-CH3 (SEQ ID NO: 36), se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Gab-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu*) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Or (Boc) -OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
- -
Para la síntesis del Péptido 27416 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ ( etil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-AspíOBu*1) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu") -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu*) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27417 la estructura química de la cual es [Ac-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu*^ -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-As (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( Bu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-
- -
Gln(Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Ac-Tyr(tBu)-OH.
Para la síntesis del Péptido 27418 la estructura química de la cual es [Ac-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Fpa5-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Ac-Tyr(tBu)-OH.
Para la síntesis del Péptido 27419 la estructura química de la cual es [Ac-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH-RH (1-29) NH-CH3 (SEQ ID NO: 37), se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-
- -
Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -0H, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu*") -OH, Fmoc-Ala-OH, Ac-Tyr ( tBu) -OH .
Para la síntesis del Péptido 27422 la estructura química de la cual es [N-Me-D-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH( 1-29) NH-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-As (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu ) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( Bu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu*1) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27423 la estructura química de la cual es [N-Me-D-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu1^ -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu*) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH,
- -
Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fraoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Tyr (tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -0H, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( tBu) -0H .
Para la síntesis del Péptido 27424 la estructura química de la cual es [Dat1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH-RH(l-29)NH-CH3 (SEQ ID NO: 38), se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu*1) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 27425 la estructura química de la cual es [N-Me-D-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu*) -OH, Fmoc-Nle-OH,
- -
Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -0H, Fmoc-Arg (Pbf) -0H, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu ) -0H, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr(tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27440 la estructura química de la cual es [Dat1 Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, D-Arg29] hGH-RH (1-29)NH-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu*) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Tyr (tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu1 ) -OH, Fmoc-Ala-OH, Dat-OH .
Para la síntesis del Péptido 27441 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en
- -
la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino)metil] -indol-1-il] -acetilo A : Fmoc-D-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu") -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg ( Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu') -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr(tBu)-OH.
Para la síntesis del Péptido 27442 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino)metil] -indol-1-il] -acetilo AM: Fmoc-D-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr ( Bu) -OH, Fmoc-Fpa5-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu*1) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27443 la estructura
- -
química de la cual es [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-D-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tfiu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27444 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-D-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu') -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Se ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-
- -
Tyr(tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27445 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-1-il] -acetilo AM: Fmoc-D-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBv ) -OH, Fmoc-Gln (Trt ) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( Bu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc -Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr(tBu)-OH.
Para la síntesis del Péptido 27446 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, D-Arg29] hGH-RH (1-29) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-1-il] -acetilo AM: Fmoc-D-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH,
- -
Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Thr (tBu) -0H, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-AspíOBu ) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( Bu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27447 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Apa-OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Asp (OBu1^ -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( Bu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27448 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Aha30] hGH-RH (1-30) NH-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Aha-OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-
- -
Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn(Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc- yr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt)-OH, Fmoc-Gln(Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -0H, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu ) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27449 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH (1-30) NH-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Amc-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-As (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( Bu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Or (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27450 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -
- -
acetilo A : Fraoc-Har (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp(OBut) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-As (OBuc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln(Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( Bu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 27451 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, Asp28, Ana30] hGH-RH (1-30) NH-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado en la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino)metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Apa-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Asp (OBu'') -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser(tBu)-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Tyr ( Bu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( tBu) -OH .
La división y desprotección de TFA con el coctel de segmentación, y la purificación subsecuente mediante HPLC
- -
setnipreparativa del Péptido 27401, Péptido 27403, Péptido
27404, Péptido 27405, Péptido 27406, Péptido 27407, Péptido
27408, Péptido 27409, Péptido 27410, Péptido 27411, Péptido
27412, Péptido 27413, Péptido 27414, Péptido 27415, Péptido
27416, Péptido 27417, Péptido 27418, Péptido 27419, Péptido
27422, Péptido 27423, Péptido 27424, Péptido 27425, Péptido
27440, Péptido 27441, Péptido 27442, Péptido 27443, Péptido
27444, Péptido 27445, Péptido 27446, Péptido 27447, Péptido
27448, Péptido 27449, Péptido 27450, Péptido 27451 se hacen como se describe en el caso del Péptido 27400. Se juzgaron los compuestos purificados para ser sustancialmente puros (>95%) mediante HPLC analítica. Sus masas moleculares se verificaron mediante espectrometría de masas de electroespray, y se confirmaron las composiciones de aminoácidos esperadas mediante análisis de aminoácidos.
EJEMPLO IV
N-Me-Tyr1-D-Ala2-Asp3-Ala4-1le5-Phe6-Thr -Gln8-Ser9-Tyr10-Arg11-Orn12-Val13 -Leu14-Abu15-Glnls-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-Asp28-Arg29-NH-CH2-CH3 (Péptido 28420) .
N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28]hGH-RH(1-29)NH-CH2-CH3
La síntesis se condujo en una manera gradual utilizando el equipo manual de síntesis de péptidos en fase sólida. Brevemente, la resina 3- [ (Etil-Fmoc-amino) metil] -
- -
indol-l-il] -acetilo AM (Nova Biochem, La Jolla, CA) (610 mg, 0.50 mmmol) se desprotegió con 20% de piperidina en DMF durante 5 y 15 minutos y se lavó de acuerdo con el protocolo descrito en la Ta bla 3. La solución de Fmoc-Arg (Pbf) -OH (975 mg, 1.5 mmol) en DMF se agitó con la resina lavada y DIC (235 µ?, 1.5 mmol) en un aparato manual de síntesis de péptido de fase sólida durante 1 hora. Después de lavar la resina tres veces con DMF, se repitió la reacción de acoplamiento como se describió antes . Después del acoplamiento repetido y después de completar la reacción se probó mediante prueba de ninhidrina negativa, se llevaron a cabo los protocolos de desprotección y neutralización descritos en laTabla 3 a fin de retirar el grupo de protección Fmoc y preparar el péptido-resina para el acoplamiento del siguiente aminoácido. La síntesis se continuó y la cadena del péptido se construyó gradualmente mediante el acoplamiento de los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina para obtener la secuencia de péptidos deseada: Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( Bu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH,
- -
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (???^) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Estos residuos de aminoácido protegidos (también comúnmente disponibles de Novabiochem, Advanced Chemtech, Bachem, and Peptides International) se representan arriba de acuerdo con un convenio bien aceptado. El grupo de protección adecuado para el grupo funcional de cadena lateral de aminoácidos particulares aparece en paréntesis. Los grupos OH en la fórmula anterior indican que el término carboxi de cada residuo se encuentra libre.
Los aminoácidos protegidos (1.5 mmol cada uno) se acoplan con DIC (235 µ?, 1.5 mmol) con las excepciones de Fmoc-Asn (Trt) -OH y Fmoc-Gln (Trt) -OH que se acoplan con el reactivo HBTU.
A fin de dividir el péptido de la resina y desprotegerlo, se agitó una porción de 250 mg de resina de péptido seca con 2.5 mi de coctel de segmentación (94% de TFA, 3% H20, 1.5% de jn-cresol, y 1.5% de fenol) a temperatura ambiente durante 3 horas. Para inducir la precipitación del péptido, la mezcla de segmentación se agregó a gotas para enfriar (preferentemente a -20°C) el éter. El material precipitado se recolectó mediante filtración o centrifugación y se lavó tres veces con éter frío. El péptido dividido y desprotegido se disolvió en 50% de ácido acético y se separó de la resina mediante filtración. Después de la dilución con
- -
agua y liofilización, se obtuvieron 110 mg de producto crudo.
El péptido crudo se verificó mediante HPLC analítica utilizando un cromotógrafo de líquidos Hewlett-Packard Model HP-1090 equipado con una columna de fase inversa Supelco Discovery HS C18 (2.1 mm x 5 cm, empacada con gel de sílice C18, 300 Á de tamaño de poro, 3 µp? de tamaño de partícula) (Supelco, Bellefonte, PA) . La elución de gradiente lineal (e.g., 40-70% B) se utilizó con un sistema de solventes que consiste de (A) 0.1% de TFA acuoso y (B) 0.1% de TFA en 70% MeCN acuoso, y la tasa de flujo es de 0.2 ml/min. Se llevó a cabo la purificación sobre un sistema Beckman System Gold HPLC (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA) equipado con Módulo solvente 127P; Detector UV-VIS, modelo 166P; Estación de trabajo de Computadora con Monitor CPU Monitor e impresora, y software 32-Karat, versión 3.0. Se disolvieron 110 mg de péptido crudo en AcOH/H20, se agitó, filtró y aplicó sobre una columna de fase inversa XBridge Prep OBD™ (4.6 x 250 mm, empacada con gel de sílice Cig , 300 A de tamaño de poro, 5 pm de tamaño de partícula) (Waters Co., Milford, MA) . La columna se eluyó con el sistema de solventes antes descrito en un modo de gradiente lineal (e.g., 40-60% B en 120 min) ; tasa de flujo de 12 ml/min. Se monitoreó el eluyente a 220 nm, y se examinaron las fracciones mediante HPLC analítica. Se agruparon fracciones con una pureza mayor a 95% y se liofilizaron para dar 16 mg
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de producto puro. La HPLC analítica se llevó a cabo sobre la columna de fase inversa Supelco Discovery C18 antes descrita utilizando elución isocrática con el sistema de solventes antes descrito con una tasa de flujo de 0.2 ml/min. Se monitorearon los picos a 220 y 280 nm. Se juzgó el producto para ser sustancialmente puro (>95%) mediante HPLC analítica. Se verificó la masa molecular mediante espectrometría de masas de electroespray, y se confirmó la composición de aminoácidos esparada mediante análisis de aminoácidos.
De acuerdo con el procedimiento anterior el Péptido
28421, Péptido 28430, Péptido 28431, Péptido 28460, Péptido 28461, Péptido 28462, Péptido 28463, Péptido 28464, Péptido 28465, Péptido 28466, Péptido 28467, Péptido 28468, Péptido 28469, Péptido 28470, Péptido 28471, Péptido 28472, Péptido 28473, Péptido 28474, Péptido 28475, Péptido 28476, Péptido 28477, Péptido 28478, Péptido 28479 se sintetizaron de la misma manera que el Péptido 28460, excepto que estos péptidos también contienen otras sustituciones de aminoácidos en la secuencia de péptidos. Los detalles para esta síntesis se establecen abajo.
Para la síntesis del Péptido 28421 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-1-
- -
il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu11) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 28430 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH-RH (1-29) NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fraoc-amino) metil] -indol-1-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-As (OBu1) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 28431 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15,
- -
Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-1-il] -acetilo A : Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu ) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp ( tBu) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 28460 la estructura química de la cual es [N- e-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Fpa5-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-As (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-
- -
OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 28462 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-1-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( Bu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-T r ( tBu) -OH, Fmoc-Fpa5-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu ) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr(tBu)-OH.
Para la síntesis del Péptido 28463 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH-RH (1-29) NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH,
- -
Fmoc-Tyr (tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( tBu) -OH .
Para la síntesis del Péptido 28464 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27] hGH-RH (1-29) H-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-1-il] -acétalo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln(Trt)-OH, Fmoc-Thr ( Bu) -OH, Fmoc-Fpa5-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-As (OBu^ -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 28465 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-30) NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3 -[ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-1-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-As (OBu*^ -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH,
- -
Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Se (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-As (OBu^ -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 28466 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-30) NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-1-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( Bu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( Bu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Fpa5-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr(tBu)-OH.
Para la síntesis del Péptido 28467 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-30) NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-1-
- -
il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -0H, Fmoc-Asp (OBuc) -0H, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -0H, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -0H, Fmoc-Arg(Pbf ) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu1) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 28468 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-30 ) H-CH2-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-As (OBu^ -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg(Pbf)-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( Bu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser(Trt)-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( Bu) -OH, Fmoc-Fpa5-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 28469 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21,
- -
Nle27]hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-D-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-As (OBu^ -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( Bu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu*1) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 28470 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27]hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-D-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-AspfOBuyOH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 28471 la estructura
química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-1-il] -acetilo AM: Fmoc-D-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu^ -H, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu*) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( Bu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln(Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-As (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 28472 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2 , Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH2-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-1-il] -acetilo AM: Fmoc-D-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu*) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln-OH, Fmoc-Thr (tBu) -OH, Fmoc-Fpa5-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu*1) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Dat-OH.
- -
Para la síntesis del Péptido 28473 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2 , Fpa55, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH(l-29)NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-1-il] -acetilo AM: Fmoc-D-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Asp (OBu ) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Asn(Trt)-OH, Fmoc-Thr ( Bu) -OH, Fmoc-Fpa5-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu11) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 28474 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28] hGH-RH (1-29) NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-D-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu") -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr (tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Asn (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-
- -
Asp (OBu*^ -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 28475 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, A u15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH-CH2-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Apa-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-AspfOBu*') -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu1) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu^ -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 28476 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ana30] hGH-RH (1-30) NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Aha-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBu") -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu*") -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH,
- -
Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( Bu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -0H, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-As (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 28477 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Ame30] hGH-RH( 1-30) NH-CH2-CH3, se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3 -[ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Amc-OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu*1) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Tyr ( tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr ( tBu) -OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu") -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr (tBu) -OH.
Para la síntesis del Péptido 28478 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30] hGH-RH (1-30) NH-CH2-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Har (Pbf) -OH, Fmoc-Arg (Pbf) -OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBu*1) -
- -
OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn(Boc)-OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser ( tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-Arg (Pbf ) -OH, Fmoc-Tyr(tBu)-OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( tBu) -OH .
Para la síntesis del Péptido 28479 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, His11, Orn12, Abu15, His20, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30] hGH-RH (1-30) NH-CH2-CH3 , se acoplaron los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina desprotegida [3- [ (Metil-Fmoc-amino) metil] -indol-l-il] -acetilo AM: Fmoc-Apa-OH, Fmoc-Arg(Pbf)-0H, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Nle-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Asp (OBufc) -OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Ser (tBu) -OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Gln (Trt) -OH, Fmoc-Abu-OH, Fmoc-Leu-OH, Fmoc-Val-OH, Fmoc-Orn (Boc) -OH, Fmoc-His (Trt) -OH, Fmoc-Tyr (tBu) -OH, Fmoc-Ser (Trt) -OH, Fmoc-Gl (Trt) -OH, Fmoc-Thr(tBu)-OH, Fmoc-Phe-OH, Fmoc-Ile-OH, Fmoc-Ala-OH, Fmoc-Asp (OBu1^) -OH, Fmoc-D-Ala-OH, Fmoc-N-Me-Tyr ( tBu) -OH .
La división y desprotección de TFA con el coctel de segmentación, y subsecuente purificación mediante HPLC semipreparativa del Péptido 28421, Péptido 28430, Péptido 28431, Péptido 28460, Péptido 28461, Péptido 28462, Péptido
- -
28463, Péptido 28464, Péptido 28465, Péptido 28466, Péptido 28467, Péptido 28468, Péptido 28469, Péptido 28470, Péptido 28471, Péptido 28472, Péptido 28473, Péptido 28474, Péptido 28475, Péptido 28476, Péptido 28477, Péptido 28478, Péptido 28479 se hacen como se describe en el caso del Péptido 28420. Se juzgaron los compuestos purificados para ser sustancialmente puros (>95%) mediante HPLC analítica. Se verificaron sus masas moleculares mediante espectrometría de masas de electroespray, y se confirmaron las composiciones de aminoácidos esperadas mediante análisis de aminoácidos.
EJEMPLO V
Dat1-D-Ala2-Asp3-Ala4-1le5-Phee-Thr7-Asns-Ser9-Tyr10-Arg11-Orn12-Val13 -Leu14-Abu15-Gln16-Leu17-Ser18-Ala19-Arg20-Orn21-Leu22-Leu23-Gln24-Asp25-Ile26-Nle27-Ser28-Arg29-Gln-Gab30-NH2
(Péptido 29702)
Dat1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gln-Gab30]hGH-RH(l-30) -NH2
La síntesis se condujo en una manera gradual utilizando un equipo manual de síntesis de péptido de fase sólida. Brevemente, la resina para-metilbencidrilamina (MBHA) (Bachem, King of Prussia, PA) (720 mg, 0.50 mmol) se pre-dilató en DCM y se neutralizó con 5% de DIEA en DCM y se lavó de acuerdo con el protocolo descrito en la Tabla I. La solución de Boc-Gab-OH (265 mg, 1.5 mmol) en DMF-DCM (1:1) se agitó con la resina neutralizada y DIC (235 µ?, 1.5 mmol) en
- -
un aparato manual de síntesis de péptido de fase sólida durante 1 hora. Después de completar la reacción de acoplamiento, se probó mediante la prueba de ninhidrina negativa, se llevaron a cabo los protocolos de desprotección y neutralización descritos en la Tabla 2 a fin de retirar el grupo de protección Boc y preparar el péptido-resina para el acoplamiento del siguiente aminoácido. La síntesis se continuó y la cadena peptídica se construyó gradualmente mediante acoplamiento de los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina para obtener la secuencia de péptidos deseada: Boc-Gab-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn(2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Estos residuos de aminoácido protegidos (también comúnmente disponibles de Novabiochem, Advanced Chemtech, Bachem, and Peptides International) se representan arriba de acuerdo con un convenio bien aceptado. El grupo de protección adecuado para el grupo funcional de cadena lateral de los aminoácidos particulares aparece en paréntesis. Los grupos OH en la fórmula anterior indican que la terminal
- -
carboxilo de cada residuo se encuentra libre.
Los aminoácidos protegidos (1.5 mmol cada uno) se acoplan con DIC (235 µ?, 1.5 mmol) con las excepciones de Boc-Asn-OH y Boc-Gln-OH que se acoplan con sus ésteres HOBt preformados .
A fin de dividir el péptido de la resina y desprotegerlo, se mezcló una porción de 250 mg de la resina de péptido seca, se agitó con 0.5 mi de m-cresol y 5 mi de fluoruro de hidrógeno (HF) a 0°C durante 2 horas. Después de la evaporación del HF bajo una corriente de nitrógeno e in vacuo, el residuo se lavó con dietil éter y etil acetato seco. El péptido dividido y desprotegido se disolvió en 50% de ácido acético y se separó de la resina mediante filtración. Después de la dilución con agua y liofilización, se obtuvieron 109 mg de producto crudo.
Se verificó el péptido crudo mediante HPLC analítica utilizando un cromatógrado de líquidos Hewlett-Packard Model HP-1090 equipado con una columna de fase inversa Supelco Discovery HS C18 (2.1 mm x 5 cm, empacada con gel de sílice C18, 300 Á de tamaño de poro, 3 µt? de tamaño de partícula) (Supelco, Bellefonte, PA) . Se utilizó una elución de gradient lineal (e.g., 40-70% B) con un sistema de solventes que consiste de (A) 0.1% de TFA acuoso y (B) 0.1% de TFA en 70% MeCN acuoso, y la tasa de flujo es de 0.2 ml/min.
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La purificación se llevó a cabo sobre un sistema Beckman System Gold HPLC (Beckman Coulter, Inc., Brea, CA) equipado con Módulo de solvente 127P; Detector UV-VIS, modelo 166P; Estación de trabajo de Computadora con Monitor de CPU e impresora, y software 32-Karat, versión 3.0. Se disolvieron 109 mg de péptido crudo en AcOH/H20, se agitó, filtró y aplicó sobre una columna de fase inversa XBridge Prep OBD™ (4.6 x 250 mm, empacada con gel de sílice Ci8/ 300 Á de tamaño de poro, 5 m de tamaño de partícula) (Waters Co., Milford, MA) . La columna se eluyó con el sistema de solventes antes descrito en un modo de gradiente lineal (e.g., 40-60% B en 120 min) ; tasa de flujo de 12 ml/min. Se monitoreó el eluyente a 220 nm y se examinaron las fracciones mediante HPLC analítica. Se agruparon las fracciones con pureza mayor al 95% y se liofilizaron para dar 27 mg de producto puro. La HPLC analítica se llevó a cabo sobre una columna de fase inversa Supelco Discovery C18 antes descrita utilizando elución isocrática con el sistema de solventes antes descrito con una tasa de flujo de 0.2 ml/min. Se monitorearon los picos a 220 y 280 nm. Se juzgó el producto para ser sustancialmente puro (>95%) mediante HPLC analítica. Se verificó la masa molecular mediante espectrometría de masas por electroespray, y se confirmó la composición de aminoácidos esperada mediante análisis de aminoácidos.
De acuerdo con el procedimiento anterior el Péptido
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29701, Péptido 29703, Péptido 29704, Péptido 29706, Péptido 29708, Péptido 29710, Péptido 29720, Péptido 29721, Péptido 29722, Péptido 29723, Péptido 29724 se sintetizaron de la misma manera que el Péptido 29702, excepto que estos péptidos también contienen otras sustituciones de aminoácidos en la secuencia de péptidos, y los residuos de acilo en sus N-terminales. Los detalles para esta síntesis se establecen abaj o .
Para la síntesis del Péptido 29701 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abuls, Orn21, Nle27, Asp28, Gln-Gab30] hGH-RH (1- 30)NH2; se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-NLe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, BOC-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (Bzl) -OH.
Para la síntesis del Péptido 29703 la estructura química de la cual es N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Gln-Gab30] hGH-RH (1-30)NH2 (SEQ ID NO: 39) se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Gln-OH, Boc-
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Arg(Tos)-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-NLe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp(OcHx) , Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-A u-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-0rn(2C Z) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2CIZ) -OH, Boc-Ser(Bzl)-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (Bzl) -OH.
Para la síntesis del Péptido 29704 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Glns, Orn12, Abu15, Orn21'22, Nle27, Gln-Gab30] hGH-RH (1-30) NH2 se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-NLe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) , Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2CIZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (Bzl) -OH .
Para la síntesis del Péptido 29706 la estructura química de la cual es [Tfa-Tyr1, D-Abu2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gln-Gab30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-
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Ser(Bzl)-OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -0H, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Abu-OH, Tfa-Tyr-OH.
Para la síntesis del Péptido 29708 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2 , Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gln-Gab30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-As (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
Para la síntesis del Péptido 29710 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Gln-Gab30] hGH-RH (1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-
- -
Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH .
Para la síntesis del Péptido 29720 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Gln-Gab30] hGH-RH (1-30)NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2C Z) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 29721 la estructura química de la cual es [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Gln-Gab30]hGH-RH(l-30)NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Om (2CIZ) -OH, Boc-
- -
Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -0H, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -0H, Boc-D-Ala-OH, Dat-OH.
Para la síntesis del Péptido 29722 la estructura química de la cual es [Tfa-Tyr1, D-Abu2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Gln-Gab30] hGH-RH(l-30)NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Phe-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Abu-OH, Tfa-Tyr-OH.
Para la síntesis del Péptido 29723 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Gln-Gab30] hGH-RH( 1-30) NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg(Tos)-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-
- -
Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -0H, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Asn-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp(OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -0H.
Para la síntesis del Péptido 29724 la estructura química de la cual es [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Gln-Gab30] hGH-RH(l-30)NH2, se acoplan los siguientes aminoácidos protegidos en el orden indicado sobre la resina MBHA: Boc-Gab-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Arg (Tos) -OH, BOC- Asp(OcHx) -OH, Boc-Nle-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-Gln-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Leu-OH, Boc-Gln-OH, Boc-Abu-OH, Boc-Leu-OH, Boc-Val-OH, Boc-Orn (2CIZ) -OH, Boc-Arg (Tos) -OH, Boc-Tyr (2BrZ) -OH, Boc-Ser (Bzl) -OH, Boc-Ala-OH, Boc-Thr (Bzl) -OH, Boc-Fpa5-OH, Boc-Ile-OH, Boc-Ala-OH, Boc-Asp (OcHx) -OH, Boc-D-Ala-OH, Boc-N-Me-Tyr (2BrZ) -OH.
La división y desprotección de HF, y purificación subsecuente mediante HPLC semipreparativa del Péptido 29701, Péptido 29703, Péptido 29704, Péptido 29706, Péptido 29708, Péptido 29710, Péptido 29720, Péptido 29721, Péptido 29722, Péptido 29723, Péptido 29724 se hicieron como se describieron en le caso del Péptido 21300. Se juzgaron los compuestos purificados para ser sustancialmente puros (>95%) mediante HPLC analítica. Se verificaron sus masas moleculares
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mediante espectrometría de masas de electroespray, y se confirmaron las composiciones de aminoácido esperadas mediante análisis de aminoácidos.
EJEMPLO VI
Solución Acuosa para Inyección Intramuscular
N-Me-Tyr1,Gln8, Orn12,Abu15,Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(1-29)
(Péptido 20356)(SEQ ID NO: 6) 500.0 mg
Gelatina, no antigénica 5.0 mg
Aguar para inyección q.s. ad 100.0
La gelatina y el Péptido 11602 antagonista de GH-RH se disolvieron en agua para inyección, y después la solución se filtró estéril.
EJEMPLO VII
Formulación Inyectable Intramuscular de Acción Prolongada
(Gel de Aceite de Ajonjolí
[N-Me-Tyr1,Gln8, Orn12,Abu 5,Orn2\Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(1-29) 10.0 mg (Péptido 20356) (SEQ ID NO: 6)
Monoestearato de Aluminio, USP 20.0 mg
Aceite de ajonjolí q.s. ad 1.0 mi
El monoestearato de aluminio se combinó con el aceite de ajonjolí y se calentó a 125°C con agitación hasta que se formó una solución amarilla clara. Esta mezcla se sometió a autoclave entonces para esterilidad y se le dejó
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enfriar. El Péptido 11604 antagonista de GH-RH se agregó entonces acépticamente con trituración. Los antagonistas particularmente preferidos son sales de baja solubilidad, e.g., sales de pamoato y lo similar. Estas exhiben actividad de larga duración.
EJEMPLO VIII
Microcapsulas de Polímero Biodegradable Inyectables
Intramuscularmente (IM) de Acción Prolongada Las microcapsulas se eleboran a partir de lo siguiente :
25/75 de copolímero de glicoluro/lacturo (0.5 viscosidad intrínseca) 99%
[N-Me-Tyr1,Gln8,0rn12,Abu15,0rn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(1- 29) (Péptido 20356) (SEQ ID NO: 6) 1 %
25 mg de las microcápsulas anteriores se suspendieron en 1.0 mi del siguiente vehículo:
Dextrosa 5.0%
CMC, sodio 0.5%
Bencil alcohol 0.9%
Tween 80 0.1 %
Agua purificada, q.s. ad 100%
EJEMPLO IX
Actividad de Liberación de la Hormona del Crecimiento
La liberación de la hormona del crecimiento se ensayó al utilizar un sistema celular pituitario de rata
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superfusionada como se describe en S. Vigh y A. V. Schally, Peptides 5, Suppl : 241-347,1984 la cual se incorpora mediante la referencia en la presente. Los nuevos análogos de péptidos sintéticos de hGH-RH P20356 y JI-38 como control se administraron durante 3 minutos (1 mi de perfusato) a una concentración de 1 nM como se muestra abajo. Se recolectaron las fracciones de 1 mi y el contenido de Gh en cada una se determinó mediante ELISA. El Péptido P20356 fué aproximadamente 3 veces más potente in vitro que JI-38. El efecto de los análogos de hGH-RH (1 nM) sobre la liberación de GH en el sistema celular pituitario de rata superfusionado .
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Tabla . Efectos de Liberación de GH de los agonistas de GHRH P20356 (MR-356) y JI-38 en células pituitarias de rata superfusionadas
Conclusiones: P-20356 es 2-3 veces más potente que
JI-38
Las células pituitarias de 2 ratas macho se utilizaron para cada canal del Sistema de superfusión. Las células se expusieron a impulsos de 3 minutos de los nuevos agonistas de GHRH o a JI-38 como estándar cada 30 minutos. Las muestras que fluyeron de cada canal (1 mi) se recolectaron cada 3 minutos, y los niveles de GH se determinaron mediante ELISA.
EJEMPLO X
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El ensayo de competencia del ligando del ensayo de unión del receptor etiquetado 125I [His\ Nle27] hGH-RH (1-32) -NH2 se utilizó para determinar las afinidades de unión de los nuevos agonistas de hGH-RH a los recpeotres de membrana de las células pituitarias de rata anteriores . Los métodos utilizados se han descrito en detalle (Halmos G, et al. Receptor 3: 87-97, 1993), que se incorporan en la presente mediante la referencia. Brevemente, los [His1, Nle27] hGH-RH (1-32) -NH2 radioidonados se prepararon mediante el método de cloraminas T. En los análisis de unión competitivos, [His1, Nle27] hGH-RH (1-32) -NH2 etiquetado-125I (0.2 nM) se desplazó mediante los análogos GH-RH a 10"6 - 10"12 M. Se calcularon las afinidades de unión finales utilizando el programa de ajuste de curva computarizado LIGAND-PC. Se compararon las afinidades relativas con hGH-RH (1-29) y/o el análogo JI-38 (Izdebski J, et al., Proc . Nati. Acad. Sci. 92: 4872-4876, 1995) y se calcularon como la proporción de IC50 del péptido probado al IC50 del IC5o estándar. IC5o es la dosis de los péptidos probados que causan el 50% de inhibición de la unión específica a los recpetores.
Estudios de Unión del Receptor GHRH
Afinidades de Unión
Materiales y Métodos
La preparación de la fracción de membrana pituitaria humana y la unión de receptor de los agonistas de
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GHRH se llevó a cabo como se describió previamente, al utilizar un ensayo de competencia de ligando sensible in vitro en base a la unión de JV-1-42 etiqetado-125I a los homogenados de membrana de pituitaria humana. Se adquirieron pituitarias humanas normales de National Hormone and Peptide Program (A.F. Parlow, Los Angeles, County Harbor-UCLA Medical Center, Torrance, CA) . Brevemente, en el análisis de unión competitivo, JV-1-42 etiqetado-125I (-0.2 nM) se desplazó mediante los agonistas de GHRH de 10"6 hasta 10"12 M.
Las afinidades de unión finales se expresaron como valores IC50 y se calcularon al utilizar el programa de ajuste de curva computarizado LIGAND-PC de Munson y Rodbard según se modificó por McPherson.
Resultados
Los resultados de estos experimentos se dan en la
Tabla 5. Los valores IC50 de los mejores agonistas estuvieron en el rango 0.01-0.09 nm. En base a los resultados de unión del receptor todos estos nuevos agonistas de GHRH excedieron la afinidad de unión de nuestro péptido de referencia JI-38. Algunos de estos nuevos agonistas de GHRH probados demostraron la más alta afinidad de unión al receptor GHRH, siendo sus valores IC50 45-406 veces menores que los de GHRH (1-29) . En base a su valor IC50 el agonistas de GHRH P20356 demostró 171 veces mayor afinidad de unión que nuestro compuesto de referencia JI-38.
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Tabla 5. Valores IC50w y actividades de unión de los nuevos análogos agonistas de GHRH
Agonistas de GHRH IC50 (nM) Afinidad relativa
(Potencia de unión)
vs GHRH vs JI-38
GHRH (1-29) 4.06 1
JI-38 1.71 2.4 1
P20303 0.09 45.1 19.0
P20350 0.04 101.5 42.7
P20356 0.01 406.0 171.0
P25502 0.07 58.0 24.4
P29702 0.05 81.2 34.2
* Expresado con relación a GHRH(l- 29 ) = 1 o JI- 38 (agonistas de GHRH) = 1,
Los valores se calcularon a partir de tubos duplicados.
Estudios de Unión del Receptor GH-RH
Afinidades de Unión
Materiales y Métodos
Se llevaron a cabo la preparación de la fracción de la membrana pituitaria humana y la unión del receptor de los agonistas de GHRH como se describió previamente, al utilizar un ensayo de competencia de ligando sensible in vitro en base a la unión de [His1, Nle27] hGHRH ( 1-32 ) NH2 etiquetado-125I a homogenados de la membrana pituitaria humana. Se adquirieron pituitarias humanas normales de National Hormone and Peptide Program (A.F. Parlow, Los Angeles, County Harbor - UCLA Medical Center, Torrance, CA) .
Brevemente, en el análisis de unión competitivo, [His1,125I-Tyr10, Nle27] hGHRH (1-32) NH2 (0.2 nM) se desplazó
- -
mediante los agonistas de GHRH de 10"6 hasta 10"12 M. Se expresaron las afinidades de unión finales como valores IC50 y se calcularon al utilizar el programa de ajuste de curva computarizado LIGAND-PC de Munson y Rodbard según se modificó por cPherson.
Resultados
Se dieron los resultados de estos experimentos en la Tabla adjunta. Los valores IC50 de los mejores agonistas estuvieron en el rango 0.04 - 0.09. En base a los resultados de la unión al receptor todos los nuevos agonistas de GHRH excedieron la afinidad de unión de los péptidos de referencia Ji-34, Jl-36 y Ji-38. Algunos de estos nuevos agonistas de GHRH mostraron la mayor afinidad de unión al receptor GHRH, sus valores IC50 fueron 21-48 veces menores que los del agonistas de GHRH JI-38.
Tabla 6. Valores ICM y actividades de unión de los nuevos anlálogos agonistas de GHRH
Agonistas de GHRH IC50 (nM) Afinidad relativa
(Potencia de unión) vs GHRH vs JI-38
GH-RH(1-29) 5.92 1
JI-34 1.37 4.32
Jl-36 1.82 3.25
JI-38 1.95 3.03 1
P-23252 0.14 42.3 13.9 P-23254 0.07 84.5 27.8 P-23256 0.04 148.0 48.7 P-21304 0.08 74.0 24.4 P-20352 0.07 84.5 27.8
* Relativo expresado con relación a GHRH (1-29) = 1 o JI-38
- -
(agonistas de GHRH) = 1
Los valores se calcularon a partir de tubos duplicados o triplicados.
Estudios de Union del Receptor GH-RH
Afinidades de Unión
Materiales y Métodos
La preparación de la fracción de la membrana pituitaria humana y la unión del receptor de los agonistas de GHRH se llevaron a cabo como se describió previamente, al utilizar un ensayo de competencia de ligando sensible in vitro en base a la unión de JV-1-42 etiquetado-125I a los homogenados de la membrana pituitaria humana. Se adquirieron pituitarias humanas normales de National Hormone and Peptide Program (A.F. Parlow, Los Angeles, County Harbor -UCLA Medical Center, Torrance, CA) .
Brevemente, en el análisis de unión competitiva, JV-1-42 etiquetado-125I (-0.2 nM) de desplazó mediante los agonistas de GHRH de 10"6 a 10"12 M. Se expresaron las afinidades de unión finales como valores IC50 y se calcularon al utilizar el el programa de ajuste de curva computarizado LIGAND-PC de Munson y Rodbard según se modificó por McPherson.
Resultados
Se dieron los resultados de estos experimentos en la Tabla adjunta. Los valores IC50 de los mejores agonistas
- -
estuvieron en el rango 0.16 - 0.87 nM. En base a los resultados de la unión del receptor la mayoría de los nuevos agonistas de GHRH excedieron la afinidad de unión de los péptidos de referencia JI-38. Algunos de estos agonistas de GHRH mostraron 5-27 veces mayor pogtencia de unión que el agonista de GHRH JI-38. Ver Tabla 7.
Tabla 7. Valores IC50 y actividades de unión de nuevos análogos agonistas de GHRH
Agonistas de GHRH IC50 (nM) Afinidad relativa
(Potencia de Unión) vs JI-38
JI-38 4.35 1
P-21300 3.61 1.20
P-21301 2.99 1.45
P-21303 1.87 2.32
P-22325 3.80 1.14
P-22326 0.71 6.12
P-22327 1.99 2.18
P-20357 0.86 5.06
P-20350 0.52 8.37
P-20351 3.44 1.26
P-20356 0.27 16.11
P-20359 3.05 1.43
P-20361 0.82 5.30
P-20367 1.70 2.56
P-25501 1.07 4.07
P-25502 0.33 13.18
P-25503 1.18 3.67
P-25504 1.44 3.02
P-27413 2.45 1.78
- -
P-27414 1.56 2.79
P-27415 3.02 1.44
P-29702 0.86 5.06
P-29703 1.22 3.57
P-27400 3.35 1.30
P-27401 2.74 1.59
P-27403 0.16 27.19
P-27404 0.87 5.00
P-27405 1.08 4.03
P-27406 0.30 14.5
P-27407 3.00 1.45
P-27408 0.55 7.91
P-27409 1.06 4.10
P-27410 0.83 5.24
P-28420 0.52 8.37
P-28421 1.47 2.96
Expresado en relación a JI-38 (agonistas de GHRH) = 1
Los valores se calcularon de tubos duplicados
*compuesto de referencia
EJEMPLO XI
Pruebas in vivo sobre la actividad endocrina de los nuevos agonistas de GHRH.
Administración Intravenosa
Para las pruebas in vivo en base a la administración intravenosa, las ratas Sprague-Dawley machos adultos se anestesiaron con pentobarbital (6 mg/100/g, b.w.)/ se inyectron i.p.; 20 minutos después de la inyección de pentobarbital, se tomaron muestras sanguíneas de la vena yugular (nivel pre-tratado) e inmediatamente después de esto
- -
se inyectaron i.v. hGH-RH (1-29) NH2 (como un control) o análogos de hGH-RH. Se tomaron muestras sanguíneas de la vena yugular 5, 15 minutos y 30 minutos después de la inyección. Se centrifugaron las muestras sanguíneas, se removió el plasma y el nivel de GH se midió mediante ELISA. Los resultados expresados como relativa potencia a hGH-RH (1-29)NH2 aparecen en la Tabla 8.
TABLA 8
Potencias de liberación de GH de los análogos de hGH-RH in vivo con
relación a JI-38 (= 1) en la rata después de la inyección i.v.
Análogo hGH-RH Después (min) Potencia
P-20356 5 1.07
15 0.91
30 1.22
P-21300 5 0.39
15 0.51
30 0.81
P-21301 5 0.79
15 0.92
30 1.00
P-21303 5 0.79
15 1.14
30 0.81
P-22326 15 0.28
30 0.94
P-25502 5 6.76
15 5.40
30 5.83
- -
P-25504 5 1.66
15 1.65
30 1.37
P-27403 15 5.01
30 4.01
P-27450 5 0.07
15 0.11
30 0.49
P-28475 5 0.19
15 0.36
30 0.92
P-29702 5 0.98
15 0.99
30 1.22
EJEMPLO XI
Administración Subcutánea
Se utilizaron ratas macho adultas y se anestesiaron con pentobarbital (6 mg/100 g, b.w.), se inyectaron i.p.; 20 minutos después de la inyección de pentobarbitla se tomaron muestras sanguíneas de la vena yugular (nivel pretratado)e inmediatamente después de esto se inyectaron de manera subcutánea (s.c.) hGH-RH(l-29)NH2 (como control) o análogos de hGH-RH. Las muestras de snagres se tomaron de la vena yugular; 5, 15 y 30 minutos o solo 15 o 30 minutos después de la inyección. Las muestras de sangre se centifugaron, se retiró el plasma y se midió el nivel de GH mediante ELISA. Los resultados se resumen en términos de potencia en la Tabla 9.
- -
TABLA 9
Potencias de liberación de GH de análogos de hGH-RH después Inyección subcutánea (s.c.) con relación a JI-38 (= 1)
Análogos de hGH-RH Después (min) Potencia
P-20350 15 1.53
30 1.17
P-20351 15 0.38
30 0.44
P-20353 15 0.26
30 0.31
P-20356 15 1.72
30 1.09
P-20357 5 0.63
15 1.07
30 1.41
P-20360 15 0.24
30 0.39
P-20361 15 1.18
30 1.50
P-20367 15 1.12
30 2.01
P-20373 15 0.23
30 0.88
P-21301 15 0.41
30 0.74
P-221303 15 0.95
30 1.45
P-22325 5 0.33
15 0.68
30 1.03
P-2232 15 1.76
30 2.31
-
P- 22327 15 1.15
30 1.30
P-25501 5 1.40
15 1.36
30 1.63
P-25502 15 1.10
30 0.94
P-25503 5 0.55
15 0.64
30 0.63
P-25504 15 0.78
30 0.98
P-27400 15 0.47
30 0.38
P-27401 15 0.61
30 0.73
P-27403 15 3.60
30 2.57
P-27404 15 2.07
30 1.47
P-27405 15 1.60
30 1.13
P-27406 15 0.47
30 0.50
P-27409 15 1.47
30 1.31
P-27412 15 1.10
30 1.29
P-27413 15 0.36
30 0.57
P-27414 15 1.30
30 1.23
P-27415 15 0.45
30 0.41
P-27425 15 0.49
- -
30 0.31
P-29701 5 0.92
15 1.30
30 1.55
P-29702 15 0.53
30 0.73
P-29703 5 1.18
15 0.96
30 1.04
Análisis de Pruebas endocrinas
Después de la administración intravenosa, los nuevos análogos dieron niveles de la hormona del crecimiento mayores a las de hGH-RH (1-29) NH2 o JI-38. El efecto es más durardero lo cual indica que los análogos no solo tienen mayor afinidad del receptor sino también mayor resistencia de peptidasa. Los análogos i.v. más potentes fueron P-27403 y P-25502. Después de la administración subcutánea, los análogos dieron mayores niveles de la hormona del crecimiento que hGH-RH o JI-38. Aquí los análogos P-22326, P-20350, P-20356, P-27403, P-27404, P-27409, P-25501, P-25502 producen respuestas inusualmente altas.
Los resultados de la administración i.v. y s.c. mostraron diferentes patrones de actividad biológica. Los análogos dados i.v. se sometieron a degradación en la corriente sanguínea. Los análogos dados s.c. pueden degradarse mediante peptidasa en el sitio de inyección. Se cree que la actividad depende principalmente de la capacidad
- -
de unión del péptido a su recpetor, y de las favorables propiedades de transporte, la unión adecuada a las proteínas de plasma y estabilidad raetabólica. Por lo tanto los descubrimientos anteriores indican que los análogos que muestran mejor actividad cuando se dan de manera subcutánea son resistentes a la degradación local en el sitio de inyección y también son menos susceptibles a la degradación enzimática en la corriente sanguínea y/o tienen más afinidad para los receptores GH-RH que hGH-RH (1-29) H2.
En conclusión, los análogos i.v. más potentes fueron P-27403 y P-25502. Después de la administración subcutánea, los análogos que dieron especialmente mayores niveles de la hormona del crecimiento que hGH-RH o JI-38 son P-22326, P-20350, P-20356, P-27403, P-27404, P-27409, P-25501, P-25502.
Claims (4)
1. Un péptido seleccionado del grupo que tiene la fórmula : [Rx-A1, A2, A6, A8, A11, A12, A15, A20, A21, A22, Nle27, A28, A29, A30] hGH-RH(l-30) -R2 (SEQ ID NO: 40) en donde Ri es Ac, Tfa, o se encuentra ausente, A1 es Tir, Dat o N-Me-Tyr, A2 es Ala, D-Ala, Abu o D-Abu, A6 es Phe o Fpa5, A8 es Asn, Ala, Gln, Thr o N-Me-Ala, A11 es Arg, Hes o Har, A12 es Orn o Lys(Me)2, A15 es Abu o Ala, A20 es Arg, Hes, Har, A21 es Orn o Lys(Me)2, A22 es Leu u Orn, A28 es Ser o Asp, A29 es Arg, Har, Agm, D-Arg o D-Har, A30 es Arg, Agm, Ada, Ame, Aha, Apa, Har, D-Arg, D-Har, Gab, Gln, D-Gln, Gln-Gab, D-Gln-Gab o se encuentra ausente, R2 es -NH2, -OH, -NHR3, -N(R3)2 u -OR3, en el cual R3 es cualquiera de alquilo Ci_i2, alquenilo C2-i2, o alquinilo C2-i2, con la condición de que si A29 es Agm entonces A30 y R2 se encuentran ausentes, A1 es sólo N-Me-Tyr, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos .
2. Un péptido de la Reivindicación 1 seleccionado del grupo que tiene la fórmula: [Ri-A1, A2, A6, A8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, A28, A29, A30] hGH-RH(l-30) -R2 (SEQ ID NO: 41) en donde Rx is Ac o se encuentra ausente, A1 es Tyr, Dat, o N-Me-Tyr, A2 es Ala, D-Ala, Abu, o D-Abu, A6 es Phe or Fpa5, A8 es Asn, Ala, Gln, o Thr, A12 es Orn, A15 es Abu, A21 es Orn, A27 es Nle A28 es Ser, or Asp, A29 es Arg, D-Arg, o Agm, A30 es Arg, Agm, Ada, Ame, Ana, Apa, Har, D-Arg, D-Har, Gab, Gln, D-Gln, o se e ncuentra ausente, R2 es -NH2, -OH, -NHR3, -N(R3)2, u -OR3, en el cuál R3 es cualquiera de alquilo C1-12, alquenilo C2-12» o alquinilo C2-i2, siempre que si A29 es Agm entonces A30 y R2 se encuentran ausentes, A1 es solo N-Me-Tyr, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos .
3. El péptido de la Reivindicación 2 seleccionado del grupo que tiene la fórmula: [A1, A2, A6, A8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, A28, A29, A30]hGH-RH(l-30) -R2 (SEQ ID NO: 42) en donde A1 es Dat o N- e-Tyr, A2 es Ala or D-Ala, A6 es Phe or Fpa5, A8 es Asn, Gln, o Thr, A27 es Nle A28 es Ser, o Asp, A29 es Arg, D-Arg, o Agm, A30 es Arg, Agm, Ada, Ame, Ana, Apa, Har, D-Arg, D-Har, Gab, Gln, D-GIn, o se encuentra ausente, R2 es -NH2, -OH, -NHR3, -N(R3)2, u -OR3, en el cual R3 es cualquiera de alquilo Ci-i2, alquenilo C2-i2, o alquinilo C2_i2, Siempre que si A29 es Agm entonces A30 y R2 se encuentran ausentes, A1 es solo N-Me-Tyr, y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos .
4. El péptido de la Reivindiación 1, seleccionado del grupo que tiene la fórmula: P-20103 [N-Me-Tyr1, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(1-29) (SEQ ID NO: 2) P-20105 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(1-29) P-20107 [N-Me-Tyr1, Fpa56, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(1-29) (SEQ ID NO: 3) P-20109 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm 9]hGH-RH(1-29) P-20110 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Agm29]hGH- RH(1-29) P-20111 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(1-29) P-20113 [N-Me-Tyr1, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH- RH(1-29) (SEQ ID NO: 4) P-20115 [N-Me-Tyr1, Fpa56, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm 9]hGH-RH(1-29) (SEQ ID NO: 5) P-20117 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Agm29]hGH-RH(1-29) P-20350 [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH- RH(1-29) P-20351 [Ac-N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(1-29) P-20356 [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH- RH(1-29) (SEQ ID NO: 6) P-20357 [Dat1, D-Ala2, N-Me-Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm 9]hGH-RH(1-29) P-20358 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, N-Me-Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(1-29) P-20359 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Fpa56, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(1-29) P-20360 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(1-29) P-20361 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm 9]hGH-RH(1-29) P-20367 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH- RH(1-29) P-20370 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH-RH(1-29) (SEQ ID NO: 7) P-20371 [N-Me-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH- RH(1-29) (SEQ ID NO: 8) P-20372 [N-Me-Tyr1, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Agm29]hGH- RH(1-29) (SEQ ID NO: 9) P-20373 [N-Me-Tyr1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Agm29]hGH-RH(1-29) (SEQ ID NO: 10) P-20374 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Agm29]hGH-RH(1-29) (SEQ ID NO: 11) P-20375 [N-Me-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Agm29]hGH-RH(1-29) (SEQ ID NO: 12) P-20376 [N-Me-Tyr1, Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Agm29]hGH-RH(1-29) (SEQ ID NO: 13) P-21300 [Dat1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Amc30]hGH-RH(1- 30)NH2 P-21301 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Amc30]hGH-RH(1- 30)NH2 (SEQ ID NO: 14) P-21303 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Amc30]hGH- RH(1-30)NH2 P-21304 [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Amc30]hGH- RH(1-30)NH2 P-21305 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Amc30]hGH-RH(1-30)NH2 P-21306 [Dat1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Amc30]hGH- RH(1-30)NH2 P-21307 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Amc30]hGH-RH(1-30)NH2 P-21308 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P-22332 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30]hGH-RH(1- 30)NH2 (SEQ ID NO: 17) P-22334 [N-Me-Tyr1, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Apa30]hGH-RH(1-30)NH2 (SEQ ID NO: 18) P-22335 [N-Me-Tyr1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30]hGH- RH(1-30)NH2 (SEQ ID NO: 19) P-22336 [N-Me-Tyr1Ala8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30]hGH-RH(1- 30)NH2 (SEQ ID NO: 20) P-22337 [N-Me-Tyr1, D-Ala2, Cpa6, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Apa30]hGH-RH(1-30)NH2 P-23250 [Dat1, D-Ala2, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30]hGH- RH(1-30)NH2 P-23251 [Dat1, Gln8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30]hGH-RH(1- 30)NH2 (SEQ ID NO. 21) P-23252 [Dat1, D-Ala2, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30]hGH-RH(1- 30)NH2 P-23253 [Dat1, Orn12 Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30]hGH-RH(1-30)NH2 (SEQ ID NO: 22) P-23254 [Dat1, D-Ala2, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30]hGH- RH(1-30)NH2 P-23255 [Dat1, Thr8, Orn12, Abu15, Orn21, Nle27, Asp28, Har30]hGH-RH(1- 30)NH2 (SEQ ID 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