JPS59176238A - ポリペプチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ソーク研究所（５ａｉｋ　Ｉｎ５ｔｉｔｕｔｅ　）のグ
イレミン（Ｇｕｉ　ｌ　ｌ　ｅｍｉｎ　）博士および共
同研究者ら（徒、彼らが成長ホルモン放出因子（ｇｒｏ
ｗｔｈ〕Ｌ　Ｏｎｎ、ｏ　？Ｌ　ｅｒｅｌｅａ、ｓｉｎ
ｇ　ｆａｃｔｏｒ　）　（ＧＩＵ？；　５ｃｉｅｎｃｅ
　２１８゜５８５　ＣＡ’ｏυ、５，１９８２］）と呼
ぶ、一連の関連物質の単離、合成および生物理学的活性
を報告した。この因子は科学者らにより数十年間にわた
って求められてきだが、このような探索は、このような
物質の天然に存在する量が微小なために、現在捷で報告
のないものであった。

（′；Ｒｆ”の単離の成功は、一部分、先端巨大症に関
連する膵臓吐湯による大量のＧ　ＲＦの異所性生類の発
見によるものであった。膵臓腫瘍から誘導されたＧ　Ｒ
Ｆの３つの形態が観測された。３つの形態は、長さが４
４．４０および３７アミノ酸の３つの同族の（、ｈｏｍ
ｏｌｏｇｏｕｓ　）ペプチドから成り、アミン末節１１
において同一であり、そしてカルボキシル末端の停止点
において異なる。４４−アミノ酸ＧＲＦはカルボキシ末
端にアミド基を有することにおいてさらに区別され、こ
れに対して他の２つの形態はその末端に遊離のカルボキ
シ基を有する。アミド基を除去して４４アミノ酸ＧＲＦ
の遊離酸の形態を生成すると、生物学的活性が有意に損
失される。

ＧＲＦ（１−４４）のアミド化形態は、明らかに親分子
であり、そして試販管内で最高の生物学的活性をもつこ
とが示された。しかしながら、すべての３種類のペプチ
ドは生体内で事実上等しい効力をもつことがわかった。

ＧＲＦからアミノ末端チロシンを除去すると、生物活性
が完全に失なわれることがさらに示され、このことから
分子の活性なコア（ＣＯγｅ）は最初のアミン末端アミ
ノ酸で開始することが明らかにされた。

リビア−（Ｒｉｖｉｅｒ　）ら（ＮａｔｌＬｒｅ　３０
０　、２７６−２７８、Ｎｏｖｅｍｂｅｒ　１８　、１
９８２　）は、合成的に製造されたＧＲＦ　（１−２９
）　−ＮＢ２゜ＧＲＦ（１−３２）−ＮＢ２　、ＧＲＦ
（１−３９）−Ｎ１１２　、ＧＡＦ（１−４０）−Ａ’
Ｈ２、ＣＪ？Ｆ（１−４０）−Ｐｈ、ｅ−ＮＢ２　、Ｇ
ＲＦ　（１−４０）−Ｐｈｅ−ＯＲおよびＧＲＦ（１−
４０）−Ｐｈｅ−Ｇｉｎ−ＮＪ１２がＧｌイＦ（１−４
０）−０Ｈと同様な効力（２フアクタ一以内）を示すこ
とを最近報告している。

動物の成長は、生物調整（ｂｉｏ−ｒｅｇｕｌａｔｏｒ
ｙ）分子のカスケード（ｃａｓｃａｄｅ　）によシ調橿
されると信じられている。すなわち、視床下部はＧ　Ｒ
ノ・”を生産し、次いでＧＲＦは下垂体に作用して成長
ホルモンを放出させる。下垂体はソマトスタチンおよび
インシュリン成長因子（ＩＧＦ）による負フィードバッ
ク制御のもとに維持される。Ｇ　Ｒｐ゛は著しく活性で
あることがわかり、はぼ５゜ｆｒｎｏｌｅ／、ｐすなわ
ち７５ｐｇ／ｍｅのＥＤ’、ｏを示し、そして血液中に
マイクログラ入／−レベルの成長候補の領域のほとんど
において治療学的に利用することができる。このような
治療学的用途の例は、下垂体性矯小発育症の処置、成長
ホルモンの生産の異常から生ずる糖尿病の処置、創傷癒
合の増進、やけどの処置および老化過程の遅延である。

成長ホルモン自体に比べて好適な効力をもつため、ＧＲ
Ｆは農業分野において同様に主要な利点を有するであろ
う。農業の用途は、たとえば、肉のだめに飼育される家
禽または動物の発育を刺激して、よシ早い時期に市場に
出すことができるようにするか、おるいはまだ飼育期間
当りよシ大きい動物を生産できるようにする方法論を提
起することを包含するでろろう。さらに、ＧＲＦは乳牛
の牛乳の生産を刺激しかつニワトリの産卵を増加させる
のに有用であろう。

種々の形態のＧ　ＲＦは固相せたは溶液相のペプチド合
成法によシ合成できる分子大きさをもつが、これらの治
療学的に価値ある物質を経済的に犬規佼で製造するため
には、組み換えＤ　Ａ’　Ａ技術を使用すること（ｒま
好ましいと信じられる。既知のＤＮ７４組み換え技術を
用いると、Ｇ　Ｒｋ’の栴造コードを官有する１）ＮＡ
配列を、プロモーター−オペレーター配列およびリポソ
ーム結合部位の暗合解読配列を含む適当な調節要素の調
節のもとに複製可能な発現媒質（ｒｅｐｌｉｃａｂｌｅ
　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｖｅｈｉ−ｃｌｃ　）中にそ
う入することができるであろう。次いで発現媒質を使用
して宿主微生物、たとえば、バクテリアまたは吐乳動物
の細胞を形質転換し、これらを生育させがっＧＲＦが表
現されるであろう条件に暴露させる。

不都合なことには、組み換えＤＮＡ技術にょるＧＲＦの
生産を妨害する、いくつかの潜在的問題が存在する。Ｇ
ＲＦの分子大きさのポリペプチドは、これより大きいタ
ンパク質分子に比べて、バクテリアたとえばＥ、　ｃｏ
ｌｉ中に存在するブチアーゼによシ分解される傾向が強
いことが観測された。

その上、完全には理解されない理由のために、転写およ
び翻訳を調節する細胞の機構はよシ大きい鎖のＤＮＡで
よシ効率的にはたらき、こうしてＧＲＦのような小さい
ポリペプチドの発現を許容されうるレベルにすることは
困難となる。ＧＲＦを組み換えＤＮＡ技術によシ生産す
る場合に克服しなくてはならないさらに他の問題は、Ｅ
、ｃｏｌｉのようなバクテリア宿主により生産された他
のバクテリアのタンパク質および内毒素からＧＲＦを精
製および単離する適当な手段を発見するということであ
る。

ＧＲＦのアミノ酸配列を暗号化するＤＮＡ配列を、アミ
ノ酸配列が仰られている大きいタンパク質のアミノ酸配
列を暗号化する１ノ４八′Ａと結合し、この結合された
ｉ）　Ｎ　Ａ配列を、融合されたタンパク質の発現の目
的で、発現ベクトル中にそう入することが提案された。

融合されたタンパク質は、ＧＲＦ単独よりも、バクテリ
アのグロテアーゼによる分解に対して感受性に劣るであ
ろう。既知の発現ベクトル、たとえばインターフェロン
のタンパク質において高いレベルで発現されうろことが
知られている融合タンパク質を選択し、これにより融合
されたＧ　Ｒｆｉ’の発現の高いレベルを得ることがで
きるであろう。

その上、インターフェロンのタンパク値上の抗原部位を
選択的に認識しかつそれと結合するモノクローナル抗体
を入手できるので、融合タンパク質を含イ１する粗製バ
クテリア抽出液をカラムに通し、このカラムにおいてモ
ノクローナル抗体を固体の支持体へ結合させ、次いで適
当な溶離剤で結合した融合タンパク質を溶離することに
より、融合されだＧＲＦ−インターフェロンタンノくり
質を便利に精製することができるであろう。

一旦融合タンノくり質が精製されると、ＧＲＦポリペプ
チドを融合されたインターフェロン（または他の融合さ
れたタンパク質）から切り離し、卑離しなくてはならな
いであろう。臭化シアンの切り離しは、このような切シ
離しを実施できる最も簡単な方法でるろう。臭化シアン
はメチオニン残基のカルボキシ部位を選択的に切り離す
ので、インターフェロンのカルボキシ末端アミノ酸残基
のためのコドンの直後にかつＧＲＦの最初のアミノ酸残
基のだめのコドンの直前に、メチオニンのだめのヌクレ
オチドコドンを挿入することにより、結合されたＤＮＡ
配列を構成することが必要でろろう。

組み換え技術によりＧ　ＲＦを生産する前述の方法は欠
点をもつ。すなわち、グイレミン（Ｃｓｂｉｌｅ−ｍ、
ｉｎ　）博士により同定されたＧ　ＲＦポリペプチド配
列ｔま、位１６２７に単一のメチオニン残基を含有する
。こうして、発現された融点タンパク質からＧｌ？ｐ゛
を遊離するだめの臭化シアンの切り離しは、Ｇ　Ｒ１′
’ポリサプチド自体を同時に切り離さないで実施するこ
とはでき寿いであろう。

本発明は、ＧＲＦ分子の位ｗ２７のメチオニン残基を異
なる適当に選択されたアミノ酸残基により、ルｙ長ホル
モン放出活性を損失しないで、置換することができると
いう発見に基づく。とくに、位置２７のメチオニン残基
がロイシンまたはノルロイシンにより置換されたＧ　Ｒ
ｆｉ’に相当するアミノ酸配列を有するポリペプチドは
、完全な生物学的ン古性を有することが発見された。さ
らに、かつ非常に篤ろくべきことには、メチオニンが位
置２７のロイシンで置換された４４−アミノ酸ＧＲＦ類
似体のカルボキシ末端遊離酸の形態は、天然のカルボキ
シ末端アミド化ａＲｐ　（ｔ　−４４）の生物学的活性
に等しいかあるいはそれより大きい生物学的活性を有す
ることが発見された。

こうして、本発明の教示によれば、活性なポリペプチド
が臭化シアンにより内部的に切り離される恐れなくかつ
完全な生物学的活性を回復するために最終のアミド化工
程を実施する必要なく、上に概説した組み換え技術によ
シ生産可能な、成長ホルモン放出活性を有するポリペプ
チドが提供される。

本発明の天然ｃ　Ｒｐのロイシンおよびノルロイシン類
似体は、メチオニンスルホキンドに酸化されうる天然Ｇ
　ＲＦのメチオニン残基のように、ロイシン／ノルロイ
シン残基が酸化されないかぎシ、天然ＧＲＦよりもさら
に利点を有する。したがって、不発すＪのポリペプチド
は、天然Ｇ　、ＲＦよりも安２ざであると信じられる。

本明細ラリおよび小許詫求のφα囲において使用する「
ＧＲＦ」という語は、次のアミン作、配列を有するポリ
ペプチドであるヒト成長ホルモン放出因子　（５ｃｉｅ
ｎｃｅ　　２−二１ｊ３　　５８５．　　Ｎｏｖｅｔｎ
、ｂｅｒ　　５．　　］　　９　８２） エ フ’ｙｒ−Ａｔ　　ａ−Ａｓｐ−ｙｌｌａ−１１ｅ−Ｐ
ｈｅ−Ｔｈ、ｒ−Ａｓｎ０ （、；ｌｎ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｌｙｓ
−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ５ −Ｇｉｎ−Ａｓｐ−ＩＩｅ−Ａｆｃｔ−５ｅｒ−Ａｒｇ
−Ｇｌｎ、−壮たｄうこ全ポリペプチドの少々くとも最
初の２８アミノ酸を有しかつ成長ホルモン放出活性を表
わす生物学的に活性な断片を意味する。添え付量「−０
１１」および「−ＮＨ２」が「Ｇ　ＲＦ　Ｊの次に使用
されている場合、それらはそれぞれポリペプチドの遊離
酸の形態およびアミドの形態を意味し、そして添え付量
が使用されていない場合、この表現は両者の形態を包含
することを意図する。

−ＧＲＦの類似体は「ＧＲＦ」の前のカッコ内に置換さ
れたアミノ酸を記載することによシ示される。

こうして、たとえば、（Ｌｅｒｂ”）−ＧＲＦは、ロイ
シン残基が位置２７においてメチオニンと置換されてい
るＧＲＦ　（遊離であるかあるいはアミド化されたカル
ボキシル末端をもつ）に相当するアミノ酸配列をもつポ
リペプチドを示す。ｆ−Ｇ　ＲＦＪの次のカッコ内の数
学は、アミノ酸残基の位置の番号を与えることにより、
完全ポリペプチドの断片を示す。たとえば、ＧＲＦ（１
−４０）は完全配列の最初の４０アミノ敵を有する断片
を示す。

本発明は、アミノ酸配列がＧ　、／＜　Ｆの少なくとも
工；ノ初の２８アミノ「夛に相当するポリペプチドに関
し、ここで位置２７のメチオニン残基は、ポリペプチド
が臭化シアンにより切シト［セされるのを防１１−する
と同時にポリペプチドに成長ホルモン放出活性を保持さ
せるように選択された、異なるアミノ酸により置換され
ている。適当かｆＣ挨アミノ酸は、心と端的にメチオニ
ンに類似するが、臭化シアンにより認識されずかつ切り
離されないもの、すガわチ、ロイシン、イソロイシン、
ノルロイシンおよびバリンである。置換基として、遊陥
酸の形態で完全な成長ホルモン放出活性を有する完全な
長さのポリペプチドを生成することが発見された、ロイ
シンおよびノルロイシンを用いることが好ましい。とく
に、４１〜４４のアミノ酸の配列をもつに　ｌ＜　／・
□のＬｅυ、２７類似体は興味がある。

本発明のポリペプチド（り、前に既設した、組み換えＩ
）　Ｎ　Ａ技術により製造することができ、あるいば常
用の固相または溶液相のペプチド合成により製造するこ
とができる。とくに興味のある化合物（Ｌｅｕ２７）　
−ＧＲＦ　（１−４４）−Ｏｌｌは、同相ペプチド合成
手順により、固相として４−（ヒドロキシメチル）−フ
ェニルアセトアミドメチル（＝ｐＡｐＢポ＋）＜スチレ
ンーコージビニルベンゼン）樹脂を用いて製造された。

このポリペプチドはｇ＝用高圧液体クロマトグラフィー
（ｐｒｅ−ｐａｒａｔＡｖｅ　ｈｉｇｈ　ｐｒｅｓｓｒ
ｂｒｅ　１ｉｑｕｉｄ　ｃｈｒｏｒｎ、ａ−ｔｏｇｒａ
ｐｈｙ　）　　（Ｂ　ｐ　Ｌ　Ｃ）により精製され、２
種類の分析用Ｅ　Ｐ　Ｌ　Ｃ’系、等電点電気泳動およ
び高電圧薄層電気泳動により均質であることが示され、
そして期待するアミノ酸組成を与えた。対応するアミド
（Ｌｅｕ”）　−ＧＲＦ　（４−４４）　−ＭＥ２は、
類似の方法で、固相ペプチド合成のための固体の支持体
としてベンズヒドリルアミン樹脂を用いることにより製
造された。当業者は認識するように、ＰＡＡｆ樹脂を使
用するとき、固体の支持体からポリペプチドを除去する
だめの１１　Ｆを用いる処理は末端カルボキシル基を有
するポリペプチドを生成し、これに対してベンズヒドリ
ルアミン樹脂からポリペプチドを除去するだめの１１　
Ｆ　ｆ用いる処理は末端アミド基を有するポリペプチド
を生成する。

これらのポリペプチドの精製は、ペプチド化学において
よく知られている手順ヲ用いて実施することができる。

前に示したように、固相合１メから得られるポリペプチ
ドは調製用ＩＩ　ｐ　Ｌ　Ｃ’によシ精列することがで
きるが、他の既知のクロマトグラフ法たとえはゲル透過
クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフイーお
よび分配クロマトグラフィーを用いることもできる。

本発明のポリペプチド類は、成長ホルモン放出活性をも
つ。それゆえ、それらは成長に関係する疾患たとえば下
垂体性短小発育症および成長ホルモンの生産の異常から
生ずる糖尿病の処置に有用である。また、それらは肉の
生産のために飼育される動物の成長を刺激するために使
用することができる。

本発明のポリペプチド類の適当な投与量は、処置される
個々の患者および状態に依存して多少変化するでろろう
。正常な成長に関連する成長ホルモンの既知の循環レベ
ルおよびポリペプチドの成長ホルモン放出活性に基づい
て適当な投与量を決定することができる。本発明の（Ｌ
ｅｒｂ２７）　−Ｇ　ＲＦ−ＯＨは試験管内で投与した
（　Ｌｅｕ、”）　−Ｇ　Ｒｐ−ｏＨＯ量の１０倍以上
の程度のレベルで成長ホルモンを放出することが示され
たので、成長ホルモンを同じ目的で直接投与する場合よ
シも、かなり少ない投Ｊｊ量を効果的に用いることがで
きること（′：１きわめて明らかである。成長に関係す
る疾、ｑ、・、の処置のために投カする量は、捷だ、成
長ホルモンの生Ｊ９−の小中分度に依存して個々に多少
変化するでろろう。一般に、患者の体重に基づいて、４
￥）　０．５μｇ／ｋｇの投与量は、成長ホルモンの所
望の放出を刺激するだめに十分である。家畜類の正常よ
りも大きい成長活性を例数するために用いる投−Ｌｉ量
ｄ１、ヒトにおける下垂体性短小発育症のような成長ホ
ルモンの欠乏の場合において正常−の成長を回後するた
めに用いる投与量よりも、がなシ多い（体重１　ｋｇ当
シに）であろう。

こうして、本発明によれば、正常な成長に関連するレベ
ルの成長ホルモンの生産を刺激するために十分な址の、
（Ｌｅｒｂ２７）　−Ｇ　ＲＦまたは（Ｎｌｅ２７）−
に　Ｒに’　ｆ、（投与することからなる、成長ホルモ
ンの不十分な生産により特徴づけられる成長に関連する
疾患を処置する方法が提供される。

成長ホルモンの正常なレベルは個体間でかなり変化しそ
して、所定の個体について、循環する成長ホルモンのレ
ベルは１日の間にかなり変化する。

大人において、成長ホルモンの正常な血清レベルは約０
〜１ｏｎｌｊ／ｍＡの間で変化することが報告されてい
る。子供において、成長ホルモンの正常な血清レベルは
約Ｏ〜２０　ｎ　ｇ／ｍｅの間で変化することが報告さ
れている。

（Ｌｅｖ、２７）−ＧＲＦまたは（Ｎｌｅ２１）　−Ｇ
ＲＦを用いて下垂体性短小発育症を効果的に処置するた
めに、処置量は正常な成長の期間に投与される。

女性において、この期間は一般にメンタの開始期間を越
えて延長されない。こうして、女性の処置は、個体に依
存して、約１−２〜１６歳の年令の前に実施すべきであ
る。男性において、成長の刺激は思春期を越えたかなり
長い期間にわたって可能でめる。こうして、男性の効果
的な処置は通常約１８〜１９歳ぽでの年令でありそして
、ある個々の場合において、約２５歳までである。

丑／こ、本発明は、正常な成長に関連するよりも高いレ
ベルで成長ホルモンの生産を刺激するために十分な是の
（ＬｅｌＬ”）　−Ｇ　ＲＰ’　または（Ｎｌｅ”）−
Ｇ　／ｌ’　ｌ・゛を投与することにより、動物の成長
運度を増大する方法を提供する。

不発明のポリペプチド類は、常用の製薬学的配合技術に
より調製することができる、人間または動物の製薬学的
組成物の形で投与される。静脈内、皮下、筋肉内または
腹腔内の投与に適する組成物を用いることができる。製
薬学的な使用に適する投与形態は、約００１〜約０．５
　ｍ９の（Ｌｅｕ”）−Ｃ；　Ｊ（Ｆ　−ＯＨで必シ、
これは無菌の水または生理父塙水で復元するために凍結
乾燥することができる。組成物は、（Ｌｅｒｂ２７）−
ＧＲＦ、ＯＥの安定性を維持するために、約６．０以下
のｐＨに維持すべきである。処置される種からの血清ア
ルブミン（たとえば、人間からのヒト血清アルブミン、
乳牛の場合においてウシ血清アルブミンなど）は他の既
知の製薬学的補助薬と一緒に存在するとともできる。

以下の実施例により、本発明をさらに説明する；これら
の実施例は、本発明の範囲をいかなる方法においても限
定するものと解釈してはならない。

特に述べないかぎり、すべての部および百分率は１、量
により、そしてすべての温度はセ氏である。

実施例において、Ｌ−立体配置の光学的に活性な保藤さ
れたアミノ酸を用いた。保護されたアミノ酸は、シリカ
ゲルＧ板を用いる薄層クロマトグラフィーによ−り検査
し、塩素−ＴＤＭで展開した。

保繰基について次の略号を用いる： ＢＯＣ，＝ｔ−ブチルオキシカルボニルＺ　−−−ヘア
　シルオキシカルボニル２　（、’　／　Ｚ二２−クロ
Ｉコベンジルオキシ力ルボニルノ）ｚｌ−ヘンシル ２　、６−　Ｃ”１２−ｄｚ　ｌ−２＋　６−ジクＯロ
ベンジル７’　ｏ　ｓ二ｐ−トルエンスルホニル′−Ｉ
（施ｔ′１」 （Ｌｅｕ”）−ＧＪｉＦ　（１−４４）−ＯＨの製造１
’１．：ｋＡ’ｃ的に人手できる自動化された固相ペプ
チド合成゛良ｔ；ｅ娑用いて、アミノ削の順次の結合に
より、（Ｌｅｖ、”）　　−Ｇ／（Ｆ（１−４４）−Ｏ
ノアをＨｚ’Ｊしし／ヒ。　Ｎ　　　−Ｂ　ｏ　ｃ−ア
ミノ酸をこの合成において・訣用した。

三１雪止・１テ１−アミノ１朦を、次のように保護した
：Ａｒ−Ｂｏｃ−Ｌ’ｙｓ　（２ＣｌＺ）　、Ａ’α−
Ｂｏｃ−Ａｓｐ（ＯＢｚｌ）。

△′α畳Ｊｏｃ−Ｇｌｕ（ＯＢｚｌ）、Ｎα−１３ｏｃ
−５ｅｒ（Ｂｚｌ）。

α ｉ＼’　　　−Ｂｏｃ−７’１Ｌｒ（）３ｚｌ）　　、
Ｎ　　　−Ｂｏｃ−Ｔｙｒ（２，６−（、’ｌ、　−Ｂ
ｚｌ　）。

／Ｊｏｃ−Ｌｅｗ　−４−（オキシメチル）−フェニル
アセトアミドメチル樹脂を、Ｊ　、Ｏｒｇ、Ｃｈｅｔｎ
、、　４３゜２８４５−２８５２　（１９７８）に記載
されているようにして、Ｂｏｃ−Ｌｅｕ−４−（オキシ
メチル）−フェニル酢酸をアミノメチルポリ（スチレン
ーコージビニルベンゼン）樹脂（１０，９，０，７１４
ミリモル／ｇ）へ結合することよシ調製した。乾燥した
樹脂の加水分解物のアミノ酸分析は、０．１３５ミリモ
ル／Ｉ！のポリ（スチレンーコージビニルベンゼン）の
置換を示した。次いでＢｏ　ｃ−Ｌｅｒｂ結合樹脂を自
動化合成装置の反応器へ入れ、ここで（Ｌｇｕ２７）−
ＧＲＦ−ＯＨ（ｒ）残りノアミノ酸の各々を樹脂結合ア
ミノ酸の鎖へ、この鎖のＮ末端を脱保臘しかつ成長する
鎖のＮ末端におけるペプチド結合の形成を促進する条件
下で、次のアミノ酸を順次に反応させることによって、
順次に結合させた。４倍過剰量の各Ｂｏｃ−アミノ酸お
よびジシクロへキシルカーポジイミド（ＤＣＣ）を各結
合工程において使用し、そして１３　ｏ　ｃ基の脱保護
は塩化メチレン中の５０係のトリフルオロ酢酸（７”　
１′’　Ａ　）で処理することにより達成した。

こうして、］、　Ｏ０，９のノ）ｏｃ−Ｌｅｒｔ　−４
−（オキシメチル）−フェニルアセトアミドメチル拉］
）指を反応器へ加え、そして次のプロトコール（ｐｒｏ
ｔｏｃｏｌ）を用いて各連続するアミノ酸を結合した。

（１）塩化メチレン中の５０係のＴ　Ｉ’　Ａで１分間
処理する； （２）　　新らしい塩化メチレン中の５０　％のＴ　Ｆ
　Ａで２０分間処理する； （３）塩化メチレンで１分［４１４回洗浄する；（４）
　　ＹＨ化メチレン中の８％のジイソプロピルエチルア
ミン（Ｊ）　Ｉ　Ｅ　Ａ　）で洗浄する；（５）Ｋｌｌ
ｊ化メナレンで１分間洗浄する；（６）　　工程４およ
び５を反復する；（７）２−グロパノールで１分出］２
回洗浄する；（８）塩化メチレンで１分間６回洗浄する
；（９）塩化メチレン中の４当量のＢｏｃ−アミノ酸（
５０ｍｌ／、！７）と５分間反応させ、次いで４当量の
ＤＣＣと２００分間反応せる； Ｑ［）塩化メチレン中の１％のＤＩＥＡで１０分間処理
する； （ＩＩ）塩化メチレンで２分間処理する；Ｏ２工程１０
および１１を反復する； ０３）塩化メチレンで２分間６回洗浄する。

このプロトコールの例外として、Ｈｏｃ−Ｇｌｎ−ＯＲ
を予備形成された対称無水物（ジメチルボルムアミド（
ＤＭＦ）中の６当量）として結合し、次いで急速洗浄し
、Ｂｏｃ基の除去後、中和してピロリドンカルボン酸（
ｐｃａ）の形成を最小とし、そして脱保護されたＧｔｎ
残基をＤＭＦ中で予備形成された対称無水物と結合して
、ｐｃａの形成をさらに最小とし、そしてＢｏ　ｃ−Ａ
８ｎ−０１１（Ｊ）　Ａｌ　ｌ’中ノロ　−Ｍ　−ｆＡ
：　）　ｋ　１時１ｉｆ１１）　ＣＣ−１−ヒ）”ロキ
ソベンン゛トリアソ゛−ル法（Ｃｈｅｔｒｔ、１３ｅｒ
、　１０３．７８８−７９８　（１９７９）およびＩｎ
ｔＪ。

Ｐｅ７ｒｔｉｄｅ　　Ｊ’ｒｏｔｅｉｎ　Ｒｅｓ、７．
４９５−５ＯＬ（１９７５））にょ多結合して、ニトリ
ルの形成を減少させた。位１〆〆２８において５ｅｒ（
Ｂｚｌ）を結合した後、ＩＩのペプチド−樹脂（蔭は１
００μモ）ｌ／　Ｔあると推知される）を（Ｌｅｗ”　
）　−Ｑ、　、７？ｐ　−ｏ　ｉｔの合成に使用し、そ
して残りを他のＧＲＦ却似体（Ｌａｕ、”は他のアミノ
酸残基で’ｌｉｔ　換されている）の製造のために除去
した。

結合効率は、谷ザイクル後、ニンヒドリン法（Ａｎａ、
１ｌｔｉｃａｌ　Ｅｊｉｏｃｈｅｒｎ、、　３４　、５
９５−５９８（１９７０）により監視し、そして一般に
２回の結合後完全であると判断された。多結合を必要と
しだ圧意書きした例外は、次のとおりであった：（ＩＮ
Ｏ％７．ｌＡグＦ　−Ｃ’１１２Ｃ１２中のＢｏｃ−Ａ
ｒｇ（Ｔｏｓ）のＡｌａ４２．Ｇｌｙ３９およびＬｙＳ
１２への結合；（２）Ｂｏｃ−Ｌｙｓ（２−ＣｌＺ）の
Ｖａ１１３への結合；（３）Ｂｏｃ−Ａｓ７ｙ（ＯＢｚ
ｌ）（７）Ｉｌ’ｅ２６への結合；（４）Ｂｏｃ−Ｌｅ
ｕのＬｅｕ”　；および（５）Ｂｏｃ−５ｅｒ（Ｂｚｌ
）のＡ、ｇ２９への結合。最後のアミノ酸残基のＢｏｃ
基は、Ｊ。

Ａｍ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｃ、９８．２３２４−２３２８　
（１９７６）に記載される手順によ、り除去し、そして
ペプチド−樹脂を乾燥した。得られる側鎖保護されたペ
プチド−樹脂（はぼ８０μモル）を無水の液体ＩＩ　１
？で処理して、側鎖を脱保護しかつペプチドを樹脂から
解放した。ペプチド−樹脂をクレゾ−／Ｌ＝（１０％）
、ジメチル−サルファイド（６５係）およびＩＩＦ（２
５％）の混合物で０℃において１時間処理し、次いでｐ
−クレゾール（１０％）および１ｆＦ（９０％）で０　
’Ｃにおいて２時間処理した。仕上げた後、３３２　ｍ
ｇｔの粗製（Ｌｅ１Ｌ２７）−ＧＲＦ−０１１が得られ
た。この物質の一部分（５゜Ｅり）を埠、ｉ４ｊ％ｊ用
Ｈｐ　Ｌ　Ｃ系によりホワットマン・バーチ’ｙル（Ｉ
Ｆ’ｈａｔｍａｎ　ｐａ、ｒｔｉｓｉｉ　）　Ｍ　−９
０１）Ｓ−３カラム（０，９４ｘ５０ｃ＋ｎ）を用いて
精製した。このカラムを０５チＴ　Ｆ　Ａ　／　Ｉｆ　
２０　／Ｃ１１３ＣＮ３０係から４５係までのＣｌｌ３
６Ｎの直綜勾配のモードにおいて２時間３ｍｆ／分の流
速で溶離した。

分画（３ｒｒｔｔ）を集め、そしてアリコートを分析用
１１　ｐ　Ｌ　Ｃにより分析した。生成物は５６〜５８
分において出現し、分画を合わせ、蒸発させ、そして凍
結乾燥した。粗製物質の残部を同じ方法で精製し、合計
１６．８１＋９の生成物が得られた。側面の帯の分画（
５ｉｄｅ−ｂａｎｔｉ　ｆｒａｃｔｉｏｎ　）をプール
し、蒸発させ、凍結乾燥し、再びクロマトグラフィーに
かけると、合”Ｂ１１５５ｍ９の純粋な物質（５係）が
１（すられた。精製された生成物は、２種の分析用ＩＩ
　７）　Ｌ　Ｃ系において均質であることが示され、等
電点電気泳動分析において陰極へ移動し、そして高電圧
薄層電気泳動によシ均質であった（ＲＡｒｇ−Ｏ，１８
）。トリプ／ン消化のペプチドのマツピング（？ｎｃＬ
芹１ｎ（１）は、次の残基からなる期待される主要な断
片を与えた：　（１−１１）、（１３−２０）、（２’
２−２９）、（３０−３８）　＋（３９−４１）および
（４２−４３）。追加の断片は、部分的のトリプシンの
切り離しにより生じうる。

ＧＲＦの生物学的に活性な断片のＬｅｒｂ２５類似体、
たとえば、（Ｌｅｒｂ２７）−ＧＲＦ　（１−４０）　
、　（Ｌｅｌｌ、”）−ＧＲＦ　（１−３９）　、　（
Ｌｅｕ”）−ＧＲＦ（１−３２）　４たは（Ｌｅｕ２７
）−ＧＲＦ（１−２９）は、同様な方法で、単に樹脂を
所望の化合物の最後のアミノ酸へ結合し、そして同相ペ
プチド合成装置をプログラミングして、次のアミノ酸か
ら最後のアミノ酸までの順次の結合を開始しかつＮ末端
に向かって作用しもどすことによって調製することがで
きる。だとえば、（Ｌｅｕ”）　−ＧＲＦ　（１−３２
）をム）９遺しようとするとき、樹脂をグリシンへ結合
させ、合成装置により結合された第２アミノ自はグルタ
ミンであり、ｆｆｉ’、１合された第２アミノ自り（は
グルタミンであｐｌこの上うに＋−，て連続させる。

（Ｌｅｕ２７）　−ＧＲＦ　（１−４４）　−０１ｆノ
／−’ｐ！ｉ’ｇ学的活ゼ（ミを、先端巨大症にかかっ
たイ固体のヒト膵、）ｔ、伐ｉｊｑテ（易から即離され
た天然ＧＲＦ（１−４４）−Ｎ　１１　、、の生物学的
活性と比軸した〔ソータ研究所（，５ａｌｋ　　Ｉｎ５
ｔｉｔｕｔｅ　　）　　の、！票準ｈ７＞−ＧＲノー’
　−＃ノ１２（、Ｎ’Ｌ−Ａ−ｔ　ｏ　）　）。この生
物学的活性についての検定は、糾織培地中のラット下垂
体訓胞中の成長ホルモンの生産を刺激する能力に基づき
、次の方法で実）ｊｉｕ　ｌ〜だ。

３０〜４０匹のスプレイクーーダウリ−（５ｐ−ｒａ、
ｇｕａ−ｊ）ａｗｌ　ａ？Ｊ）ラット（１７ＦＭ’）か
らの下垂体を、断頭後に無菌的に切除した。前葉を集め
、無菌１１ｅｐｅｓ緩衝液（ｐＨ７，３５）中で３回洗
浄し、そしてコラゲナーゼ（４■／＋＋＋ｇ）およびデ
ィスパーゼｄｉｓｐａｓｅ　（２ｍ９７　ｍｅ　）を含
有する２０〜３０ｍ１のＨｅｙｙｅｓ　Ｍ衝ｇ（ｏ、　
０２　ｓ−Ｅル、ｐＨ７，３５）中に３７°Ｃにおいて
分散させた。パスツールピペットでおだやかに１００〜
１１０分間がき１ぜがつすシつぶした後、分散した細胞
を遠心（１５゜ｘｉ　、４分）によシ分離し、そしてノ
イラミニダーセ（８μ、９　／　ｍｅ、’　）および２
００μｉ　／　ｍ／！のエチレンジニトロ四酢酸二ナト
リウム塩を貧有するＨｅｐｅｓ緩衝液、ｐ１１７．３５
、中に１０分１ｔｊｊ再懸濁させた。細胞をグレイティ
ング媒質（ｐｌａｔｉｎｇｍｅｄｉｕｍ　）で２回洗浄
し、多くぼみ板（ｔｎｕ　ｌ　ｔ　ｉｗｅ　１ｌ−ｐｌ
ａｔｅ　）上に次の規定する媒質を用いてプレテイング
した（　１．、ｓ　Ｘ　１０５個の細胞／ｍｉ）：ｐ−
１２／）Ｊ）ＭＥＮ／ＢＧｊ　ｂ　（６：　３　：　１
　）（Ｇｉｂｃｏ：４３０−１７００／４３０−１６０
０／３２０−２５９１）および２　ｇＢｓＡ’／　１　
、２．３８９１ノｅｐｅｓ　／　１および５０ｍ９ゲン
タマイシン／１゜各ウェル中の媒質に（Ｌｅｒｂ’“）
−Ｇ、／ＬＦ（１−４４）−□Ｊｉ甘たは自然ＧＲＦ（
１−４４）−Ｎ１１２のいずれかを媒質１ｍｌ轟シ３１
〜２００ｆｒｎ、ｏｌの範囲の濃度で補充した。対照ウ
ェルは補充物質を會有しなかった。プレイティングは、
細胞の急速な固定を確保するために２係の胎児の子牛血
清を加えたこの媒質を用いて実施しだ。第４日目に、胎
児子牛血清を含まない規定した媒質で細胞を２回洗浄し
た。最後に、９００μ４９嫂ボした媒質と、１００μｌ
の各個々の処置物質を含有する同一媒質とを、各ウェル
に加え、３回の反復実験を行った。３時間のインギュベ
ーション後、媒質を集め、必要に応じて希釈して、ラッ
トの成長ホルモンについての放射線免疫検定（ＲＩＡｓ
）を実施した。このＲＩＡ　ｓはシンハ（Ｓｉｎｈα）
の抗ネズミＧｌｌ免疫血清を用いて実施しだ。

自然ＧＲＦ（１−４４）−ＮＨ，、および（Ｌｅｗ２７
）−ＧＲＦ（１−４４）−０Ｈについての検定の結果を
、下表に記載する。

対照　　　　　　　８２８２− ３゜１　　　１１７　　１３３　１４３　１６２６．３
　　　１５８　　１６７　１９３　２０４１２．５　　
　２１０　　２２３　２５６　２７２２５．０　　　２
６１　　２７０　３１８　３２９５０．０　　　　３４
３　　３４２　４１８　４１７１００．０　　、　　４
３３　　４２３　５２８　５１６２００．０　　　　５
２２　　５３２！　　６３７　６４９この衣のデータか
ら明らかなように、（Ｌｅｕ２７）−Ｇ　ｊ（Ｆ　Ｃ１
−４４）　−０ＨにＧＲＦ　（１−４’４　）−八’／
／２　と同じレベルであるいはそれよりわずかに高いレ
ベルで成長ホルモン放出活性を示した。

ソーク研究所（５ａｌｋ−１ｎｓｔｉｔｕｔｅ　）の標
屋と比！咬した（Ｌｅｔｂ”　）　−ＧＲＦ　（１’−
４４）　−ＯＨの相対的効力は、上のデークーのコンピ
ューター分析により】０６３であると決定された。

ゼルシャフト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １一般式 ％式％） 式中、ＧＲＦは天然のヒト成長ホルモン放出因子の死金
   配列の少々くとも最初の２８アミノ岐を衣わし、そして
   この分子のカルボギシル末端は遊離酸１だはアミドの形
   である、 のポリペプチド。 ２、　０　ＲＦは天然のヒト成長ホルモン放出因子の１
   −４１ないし１−４４のアミノ酸配列を表わす特訂：Ｆ
   ’ｆ求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ３、　　（Ｌｅｕ”）−ＧＩ？Ｆ（１−４４）−０Ｈテ
   ’Ｅ：＝ル％許情求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ４、　　（ＬｇｌＬ”）−ＧＲＦ（１−４４）−Ａ’Ｈ
   ２である特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 ５　ヒトにおける成長に関係する疾患の処置に使用する
   特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポリペプ
   チド。 ６　動物の成長速度を増加するために動物の処置に使用
   する特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポリ
   ペプチド。 ７、（ａ）溶液相ペプチド合成によシ合成された対応す
   るアミノ酸配列の適当に保護されたポリペプチドの保護
   基を、常法により切り離すか、あるいは （ｂ）　　同相ペプチド合成によシ合成された対応する
   アミノ酸配列の適当に側鎖保護された樹脂結合ポリペプ
   チドを、無水の液体ＨＦと反応させる、 ことを特徴とする特許 （Ｌ　ｅ　ｕ”　）　−ＧＲＦおよび（Ａ’　ｌ　ｅ２
   ７）　　ＧＲＦ式中、ＧＲＦは天然のヒト成長ホルモン
   放出因子の完全配列の少なくとも最初の２８アミノ酸を
   表わし、そしてこの分子のカルボキシル末端は遊離酸ま
   たはアミドの形である、 のポリペプチドの製造方法。 ８　特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポリ
   ペプチドを、不活性な無毒の生理学的に適合性の担体物
   質と混合することを特徴とする製薬学的組成物の調製方
   法。 ９　特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポリ
   ペプチドの有効量と、不活性な無毒の生理学的に適合性
   の担体物質とを含有する非経口用投薬学的組成物。 １０　担体物質がヒト血清アルブミンである特許請求の
   範囲柁９項記載の組成物。 １１、　　ヒトにおける成長に関係する疾患の処置にお
   ける特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポリ
   ペプチドの使用。 １２、成長速度を正常よシ上のレベルに増加するだめの
   動物の処置における特許請求の範囲第１〜４項のいずれ
   かに記載のポリペプチドの使用。 １３、特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポ
   リペプチドの有効量を投与することからなる、ヒトにお
   ける成長ホルモンの不十分な生産に関連する成長に関係
   する疾患を処置する方法。 １４　特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載のポ
   リペプチドの有効量を投与することからなる、動物の成
   長を正常より上のレベルに増加する方法。 １５、　　ことに実施例を参照して後述する新規なポリ
   ペプチド類およびそれらの製造方法。