JPH0786120B2

JPH0786120B2 - ポリペプチド

Info

Publication number: JPH0786120B2
Application number: JP59041481A
Authority: JP
Inventors: ア−サ−・エム・フエリツクス; エドガ−・ピ−・ハイマ−
Original assignee: エフ・ホフマン−ラロシユアーゲー
Priority date: 1983-03-07
Filing date: 1984-03-06
Publication date: 1995-09-20
Anticipated expiration: 2010-09-20
Also published as: AU574064B2; IL71150A; ATE53220T1; AU2526884A; CA1254000A; IL71150A0; DK162130C; EP0121764B1; ZA841638B; EP0121764A3; IE840537L; DK162130B; JPS59176238A; IE57097B1; DE3482387D1; DK151884D0; EP0121764A2; DK151884A; NZ207378A

Description

【発明の詳細な説明】ソーク研究所（Salk Institute）のグイレミン（Guille
min）博士および共同研究者らは、彼らが成長ホルモン
放出因子（growth hormonereleasing factor）（GRF;Sc
ience218,585〔Nov.5,1982〕）と呼ぶ、一連の関連物質
の単離、合成および生物理学的活性を報告した。この因
子は科学者らにより数十年間にわたつて求められてきた
が、このような探索は、このような物質の天然に存在す
る量が微小なために、現在まで報告のないものであつ
た。

GRFの単離の成功は、一部分、先端巨大症に関連する膵
臓腫瘍による大量のGRFの異所性生産の発見によるもの
であつた。膵臓腫瘍から誘導されたGRFの３つの形態が
観測された。３つの形態は、長さが44,40および37アミ
ノ酸の３つの同族の（homologous）ペプチドから成り、
アミノ末端において同一であり、そしてカルボキシル末
端の停止点において異なる。44−アミノ酸GRFはカルボ
キシ末端にアミド基を有することにおいてさらに区別さ
れ、これに対して他の２つの形態はその末端に遊離のカ
ルボキシ基を有する。アミド基を除去して44アミノ酸GR
Fの遊離酸の形態を生成すると、生物学的活性が有意に
損失される。

GRF（１−44）のアミド化形態は、明らかに親分子であ
り、そして試験管内で最高の生物学的活性をもつことが
示された。しかしながら、すべての３種類のペプチドは
生体内で事実上等しい効力をもつことがわかつた。GRF
からアミノ末端チロシンを除去すると、生物活性が完全
に失われることがさらに示され、このことから分子の活
性なコア（core）は最初のアミノ末端アミノ酸で開始す
ることが明らかにされた。

リビアー（Rivier）ら（Nature300，276-278、November
18,1982）は、合成的に製造されたGRF(1-29)-NH₂，GRF
(1-32)-NH₂，GRF(1-39)-NH₂，GRF(1-40)-NH₂，GRF(1-4
0)-Phe-NH₂，GRF(1-40)-Phe-OHおよびGRF(1-40)-Phe-Gl
n-NH₂がGRF(1-40)-OHと同様な効力（２フアクター）以
内を示すことを最近報告している。

動物の成長は、生物調整（bio-regulatory）分子のカス
ケード（cascade）により調整されると信じられてい
る。すなわち、視床下部はGRFを生産し、次いでGRFは下
垂体に作用して成長ホルモンを放出させる。下垂体はソ
マトスタチンおよびインシユリン成長インシ（IGF）に
よる負フイードバツク制御のもとに維持される。GRFは
著しく活性であることがわかり、ほぼ50fmole/mlすなわ
ち75pg/mlのED₅₀を示し、そして血液中にマイクログラ
ム/mlレベルの成長因子を放出することがわかつた。こ
うして、GRFは成長ホルモンによる処置に現在考えられ
ている候補の領域のほとんどにおいて治療学的に利用す
ることができる。このような治療学的用途の例は、下垂
体性矮小発育症の処置、成長ホルモンの生産の異常から
生ずる糖尿病の処置、創傷癒合の増進、やけどの処置お
よび老化過程の遅延である。成長ホルモン自体に比べて
好適な効力をもつため、GRFは農業分野において同様の
主要な利点を有するであろう。農業の用途は、たとえ
ば、肉のために飼育される家禽または動物の発育を刺激
して、より早い時期に市場に出すことができるようにす
るか、あるいはまた飼育期間当りより大きい動物を生産
できるようにする方法論を提起することを包含するであ
ろう。さらに、GRFは乳牛の牛乳の生産を刺激しかつニ
ワトリの産卵を増加させるのに有用であろう。

種々の形態のGRFは固相または溶液相のペプチド合成法
により合成できる分子大きさをもつが、これらの治療学
的に価値ある物質を経済的に大規模で製造するために
は、組み換えDNA技術を使用することは好ましいと信じ
られる。既知のDNA組み換え技術を用いると、GRFの構造
コードを含有するDNA配列を、プロモーター−オペレー
ター配列およびリボソーム結合部位の暗号解読配列を含
む適当な調節要素の調節のもとに複数可能な発現ベヒク
ル（replicable expression vehicle）中にそう入する
ことができるであろう。次いで発現ベヒクルを使用して
宿主微生物、たとえば、バクテリアまたは哺乳動物の細
胞を形質転換し、これらを生育させかつGRFが表現され
るであろう条件に暴露させる。

不都合なことには、組み換えDNA技術によるGRFの生産を
妨害する、いくつかの潜在的問題が存在する。GRFの分
子大きさのポリペプチドは、これより大きい蛋白質分子
に比べて、バクテリアたとえばE.coli中に存在するプロ
テアーゼにより分解される傾向が強いことが観測され
た。その上、完全には理解されない理由のために、転写
および翻訳を調節する細胞の機構はより大きい鎖のDNA
でより効率的にはたらき、こうしてGRFのような小さい
ポリペプチドの発現を許容されうるレベルにすることは
困難となる。GRFを組み換えDNA技術により生産する場合
に克服しなくてはならないさらに他の問題は、E.coliの
ようなバクテリア宿主により生産された他のバクテリア
のタンパク質および内毒素からGRFを精製および単離す
る適当な手段を発見するということである。

GRFのアミノ酸配列を暗号化するDNA配列を、アミノ酸配
列が知られている大きいタンパク質のアミノ酸配列を暗
号化するDNAと結合し、この結合されたDNA配列を、融合
されたタンパク質の発現の目的で、発現ベクター中にそ
う入することが提案された。融合されたタンパク質は、
GRF単独よりも、バクテリアのプロテアーゼによる分解
に対して感受性に劣るであろう。既知の発現ベクター、
たとえばインターフエロンのタンパク質において高いレ
ベルで発現されうることが知られている融合タンパク質
を選択し、これにより融合されたGRFの発現の高いレベ
ルを得ることができるであろう。

その上、インターフエロンのタンパク質上の抗原部位を
選択的に認識しかつそれと結合するモノクローナル抗体
を入手できるので、融合タンパク質を含有する粗製バク
テリア抽出液をカラムに通し、このカラムにおいてモノ
クローナル抗体を固体の支持体へ結合させ、次いで適当
な溶離剤で結合した融合タンパク質を溶離することによ
り、融合されたGRF−インターフエロンタンパク質を便
利に精製することができるであろう。

一旦融合タンパク質が精製されると、GRFポリペプチド
を融合されたインターフエロン（または他の融合された
タンパク質）から切り離し、単離しなくてはならないで
あろう。臭化シアンの切り離しは、このような切り離し
を実施できる最も簡単な方法であろう。臭化シアンはメ
チオニン残基のカルボキシ部位を選択的に切り離すの
で、インターフエロンのカルボキシ末端アミノ酸残基の
ためのコドンの直後にかつGRFの最初のアミノ酸残基の
ためのコドンの直前に、メチオニンのためのヌクレオチ
ドコドンを挿入することにより、結合されたDNA配列を
構成することが必要であろう。

組み換え技術によりGRFを生産する前述の方法は欠点を
もつ。すなわち、グイレミン（Guilemin）博士により同
定されたGRFポリペプチド配列は、位置27に単一のメチ
オニン残基を含有する。こうして、発現された融点タン
パク質からGRFを遊離するための臭化シアンの切り離し
は、GRFポリペプチド自体を同時に切り離さないで実施
することはできないであろう。

本発明は、GRF分子の位置27のメチオニン残基を異なる
適当に選択されたアミノ酸残基により、成長ホルモン放
出活性を損失しないで、置換することができるという発
見に基づく。とくに、位置27のメチオニン残基がロイシ
ンまたはノルロイシンにより置換されたGRFに相当する
アミノ配列を有するポリペプチドは、完全な生物学的活
性を有することが発見された。さらに、かつ非常に驚ろ
くべきことには、メチオニンが位置27のロイシンで置換
された44−アミノ酸GRF類似体のカルボキシ末端遊離酸
の形態は、天然のカルボキシ末端アミド化GRF（１−4
4）の生物学的活性に等しいかあるいはそれより大きい
生物学的活性を有することが発見された。

こうして、本発明の教示によれば、活性なポリペプチド
が臭化シアンにより内部的に切り離される恐れなくかつ
完全な生物学的活性を回復するために最終のアミド化工
程を実施する必要なく、上に概説した組み換え技術によ
り生産可能な、成長ホルモン放出活性を有するポリペプ
チドが提供される。

本発明の天然GRFのロイシンおよびノルロイシン類自体
は、メチオニンスルホキシドに酸化されうる天然GRFの
メチオニン残基のように、ロイシン／ノルロイシン残基
が酸化されないかぎり、天然GRFよりもさらに利点を有
する。したがつて、本発明のポリペプチドは、天然GRF
よりも安定であると信じられる。

本明細書および特許請求の範囲において使用する「GR
F」という語は、次のアミノ酸配列を有するポリペプチ
ドであるヒト成長ホルモン放出因子（Science218,585,N
ovember 5,1982）または完全ポリペプチドの少なくとも最初の28アミノ酸
を有しかつ成長ホルモン放出活性を表わす生物学的に活
性な断片を意味する。添え付号「−OH」および「−N
H₂」が「GRF」の次に使用されている場合、それらはそ
れぞれポリペプチドの遊離酸の形態およびアミドの形態
を意味し、そして添え付号が使用されていない場合、こ
の表現は両者の形態を包含することを意図する。GRFの
類似体は「GRF」の前のカツコ内に置換されたアミノ酸
を記載することにより示される。こうして、たとえば、
（Leu²⁷)-GRFは、ロイシン残基が位置27においてメチオ
ニンと置換されているGRF（遊離であるかあるいはアミ
ド化されたカルボキシル末端をもつ）に相当するアミノ
酸配列をもつポリペプチドを示す。「GRF」の次のカツ
コ内の数字は、アミノ酸残基の位置の番号を与えること
により、完全ポリペプチドの断片を示す。たとえば、GR
F（１−40）は完全配列の最初の40アミノ酸を有する断
片を示す。

本発明は、アミノ酸配列がGRFの少なくとも最初の28ア
ミノ酸に相当するポリペプチドに関し、ここで位置27の
メチオニン残基は、ポリペプチドが臭化シアンにより切
り離されるのを防止すると同時にポリペプチドに成長ホ
ルモン放出活性を保持させるように選択された、異なる
アミノ酸により置換されている。適当な置換アミノ酸
は、構造的にメチオニンに類似するが、臭化シアンによ
り認識されずかつ切り離されないもの、すなわち、ロイ
シン、イソロイシン、ノルロイシンおよびバリンであ
る。置換基として、遊離酸の形態で完全な成長ホルモン
放出活性を有する完全な長さのポリペプチドを生成する
ことが発見された、ロイシンおよびノルロイシンを用い
ることが好ましい。とくに、41〜44のアミノ酸の配列を
もつGRFのLeu²⁷類似体は興味がある。

本発明のポリペプチドは、前に既説した、組み換えDNA
技術により製造することができ、あるいは常用の固相ま
たは溶液相のペプチド合成により製造することができ
る。とくに興味のある化合物（Leu²⁷)-GRF(1-44)-OH
は、固相ペプチド合成手順により、固相として４−（ヒ
ドロキシメチル）−フエニルアセトアミドメチル（＝PA
M）ポリ（スチレン−コ−ジビニルベンゼン）樹脂を用
いて製造された。このポリペプチドは調製用高圧液体ク
ロマトグラフイー（pre−parative high pressure liqu
id chromatography）（HPLC）により精製され、２種類
の分析用HPLC系、等電点電気泳動および高電圧薄層電気
泳動により均質であることが示され、そして期待するア
ミノ酸組成を与えた。対応するアミド（Leu²⁷)-GRF(1-4
4)-NH₂は、類似の方法で、固相ペプチド合成のための固
体の支持体としてベンズヒドリルアミン樹脂を用いるこ
とにより製造された。当業者は認識するように、PAM樹
脂を使用するとき、固体の支持体からポリペプチドを除
去するためのHFを用いる処理は末端カルボキシル基を有
するポリペプチドを生成し、これに対してベンズヒドリ
ルアミン樹脂からポリペプチドを除去するためのHFを用
いる処理は末端アミド基を有するポリペプチドを生成す
る。

これらのポリペプチドの精製は、ペプチド化学において
よく知られている手順を用いて実施することができる。
前に示した用に、固相合成から得られるポリペプチドは
調製用HPLCにより精製することができるが、他の既知の
クロマトグラフ法たとえばゲル透過クロマトグラフイ
ー、イオン交換クロマトグラフイーおよび分配クロマト
グラフイーを用いることもできる。

本発明のポリペプチド類は、成長ホルモン放出活性をも
つ。それゆえ、それらは成長に関係する疾患たとえば下
垂体性矮小発育症および成長ホルモンの生産の異常から
生ずる糖尿病の処置に有用である。また、それらは肉の
生産のために飼育される動物の成長を刺激するために使
用することができる。

本発明のポリペプチド類の適当な投与量は、処置される
個々の患者および状態に依存して多少変化するであろ
う。正常な成長に関連する成長ホルモンの既知の循環レ
ベルおよびポリペプチドの成長ホルモン放出活性に基づ
いて適当な投与量を決定することができる。本発明の
（Leu²⁷)-GRF-OHは試験管内で投与した（Leu²⁷)-GRF-OH
の量の10倍以上の程度のレベルで成長ホルモンを放出す
ることが示されたので、成長ホルモンを同じ目的で直接
投与する場合よりも、かなり少ない投与量を効果的に用
いることができることはきわめて明らかである。成長に
関係する疾患の処置のために投与する量は、また、成長
ホルモンの生産の不十分度に依存して個々に多少変化す
るであろう。一般に、患者の体重に基づいて、約0.5μg
/kgの投与量は、成長ホルモンの所望の放出を刺激する
ために十分である。家畜類の正常よりも大きい成長活性
を刺激するために用いる投与量は、ヒトにおける下垂体
性矮小発育症のような成長ホルモンの欠乏の場合におい
て正常の成長を回復するために用いる投与量よりも、か
なり多い（体重1kg当りに）であろう。

こうして、本発明によれば、正常な成長に関連するレベ
ルの成長ホルモンの生産を刺激するために十分な量の
（Leu²⁷)-GRFまたは（Nle²⁷)-GRFを投与することからな
る、成長ホルモンの不十分な生産により特徴づけられる
成長に関連する疾患を処置する方法が提供される。

成長ホルモンの正常なレベルは固体間でかなり変化しそ
して、所定の固体について、循環する成長ホルモンのレ
ベルは１日の間にかなり変化する。大人において、成長
ホルモンの正常な血清レベルは約０〜10ng/mlの間で変
化することが報告されている。子供において、成長ホル
モンの正常な血清レベルは約０〜20ng/mlの間で変化す
ることが報告されている。

（Leu²⁷)-GRFまたは（Nle²⁷)-GRFを用いて下垂体性矮小
発育症を効果的に処置するために、処置量は正常な成長
の期間に投与される。女性において、この期間は一般に
メンスの開始期間を越えて延長されない。こうして、女
性の処置は、固体に依存して、約12〜16歳の年齢の前に
実施すべきである。男性において、成長の刺激は思春期
を越えたかなり長い期間にわたつて可能である。こうし
て、男性の効果的な処置は通常約18〜19歳までの年令で
ありそして、ある個々の場合において、約25歳までであ
る。

また、本発明は、正常な成長に関連するよりも高いレベ
ルで成長ホルモンの生産を刺激するために十分な量の
（Leu²⁷)-GRFまたは（Nle²⁷)-GRFを投与することによ
り、動物の成長速度を増大する方法を提供する。

本発明のポリペプチド類は、常用の製薬学的配合技術に
より調製することができる、人間または動物の製薬学的
組成物の形で投与される。静脈内、皮下、筋肉内または
腹腔内の投与に適する組成物を用いることができる。製
薬学的な使用に適する投与形態は、約0.01〜約0.5mgの
（Leu²⁷)-GRF-OHであり、これは無菌の水または生理食
塩水で復元するために凍結乾燥することができる。組成
物は、（Leu²⁷)-GRF-OHの安定性を維持するために、約
6.0以下のpHに維持すべきである。処置される種からの
血清アルブミン（たとえば、人間からのヒト血清アルブ
ミン、乳牛の場合においてウシ血清アルブミンなど）は
他の既知の製薬学的補助薬と一緒に存在することもでき
る。

以下の実施例により、本発明をさらに説明する。これら
の実施例は、本発明の範囲をいかなる方法においても限
定するものと解釈してはならない。特に述べないかぎ
り、すべての部および百分率は重量により、そしてすべ
ての温度はセ氏である。

実施例において、Ｌ−立体配置の光学的に活性な保護さ
れたアミノ酸を用いた。保護されたアミノ酸は、シリカ
ゲルＧ板を用いる薄層クロマトグラフイーにより検査
し、塩素−TDMで展開した。保護基について次の略号を
用いる： BOC＝ｔ−ブチルオキシカルボニルＺ＝ベンジルオキシカルボニル 2ClZ＝２−クロロベンジルオキシカルボニル Bzl＝ベンジル 2,6−Cl₂-Bzl＝2,6−ジクロロベンジル Tos＝ｐ−トルエンスルホニル実施例（Leu²⁷)-GRF(1-44)-OHの製造商業的に入手できる自動
化された固相ペプチド合成装置を用いて、アミノ酸の順
次の結合により、（Leu²⁷)-GRF(1-44)-OHを調製した。N
^α-Boc-アミノ酸をこの合成において使用した。三官能
性アミノ酸を、次のように保護した：N^α-Boc-Lys(2Cl
Z)，N^α-Boc-Asp(OBzl)，N^α-Boc-Glu(OBzl)，N^α-Boc-
Ser(Bzl)，N^α-Boc-Thr(Bzl)，N^α-Boc-Tyr(2,6-Cl₂-Bz
l）。

Boc-Leu-4-（オキシメチル）−フエニルアセトアミドメ
チル樹脂を、J.Org.Chem.43，2845-2852（1978）に記載
されているようにして、Boc-Leu-4-（オキシメチル）−
フエニル酢酸をアミノメチルポリ（スチレン−コ−ジビ
ニルベンゼン）樹脂（10g、0.714ミリモル/g）へ結合す
ることにより調製した。乾燥した樹脂の加水分解物のア
ミノ酸分析は、0.135ミリモル/gのポリ（スチレン−コ
−ジビニルベンゼン）の置換を示した。次いでBoc-Leu
結合樹脂を自動化合成装置の反応器へ入れ、ここで（Le
u²⁷)-GRF-OHの残りのアミノ酸の各々を樹脂結合アミノ
酸の鎖へ、この鎖のＮ末端を脱保護しかつ成長する鎖の
Ｎ末端におけるペプチド結合の形成を促進する条件下
で、次のアミノ酸を順次に反応させることによつて、順
次に結合させた。４倍過剰量の各Boc−アミノ酸および
ジシクロヘキシルカーボジイミド（DCC）を各結合工程
において使用し、そしてBoc基の脱保護は塩化メチレン
中の50％のトリフルオロ酢酸（TFA）で処理することに
より達成した。

こうして、10gのBoc-Leu-4-（オキシメチル）−フエニ
ルアセトアミドメチル樹脂を反応器へ加え、そして次の
プロトコール（protocol）を用いて各連続するアミノ酸
を結合した。

（１）塩化メチレン中の50％のTFAで１分間処理す
る；（２）新らしい塩化メチレン中の50％のTFAで20分間
処理する；（３）塩化メチレンで１分間４回洗浄する；（４）塩化メチレン中の８％のジイソプロピルエチル
アミン（DIEA）で洗浄する；（５）塩化メチレンで１分間洗浄する；（６）工程４および５を反復する；（７）２−プロパノールで１分間２回洗浄する；（８）塩化メチレンで１分間６回洗浄する；（９）塩化メチレン中の４当量のBoc−アミノ酸（50m
l/g）と５分間反応させ、次いで４当量のDCCと20分間反
応させる；（10）塩化メチレン中の１％のDIEAで10分間処理す
る；（11）塩化メチレンで２分間処理する；（12）工程10および11を反復する；（13）塩化メチレンで２分間６回洗浄する。

このプロトコールの例外として、Boc-Gln-OHを予備形成
された対称無水物（ジメチルホルムアミド（DMF）中の
６当量）として結合し、次いで急速洗浄し、Boc基の除
去後、中和してピロリドンカルボン酸（Pca）の形成を
最小とし、そして脱保護されたGln残基をDMF中で予備形
成された対称無水物と結合して、Pcaの形成をさらに最
小とし、そしてBoc-Asn-OH（DMF中の６当量）を１時間D
CC−１−ヒドロキシベンゾトリアゾール法（Chem.Ber.1
03，788-798（1979）およびInt.J.Peptide Protein Re
s.7，495-501（1975））により結合して、ニトリルの形
成を現象させた。位置28においてSer（Bzl）を結合した
後、1gのペプチド−樹脂（ほぼ100μモルであると推定
される）を（Leu²⁷)-GRF-OHの合成に使用し、そして残
りを他のGRF類似体（Leu²⁷は他のアミノ酸残基で置換さ
れている）の製造のために除去した。

結合効率は、各サイクル後、ニンヒドリン法（Analytic
al Biochem,34，595-598（1970）により監視し、そして
一般に２回の結合後完全であると判断された。多結合を
必要とした注意書きした例外は、次のとおりであつた：
（１） 10％DMF-CH₂Cl₂中のBoc−Arg（Tos）のAla⁴²，
Gly³⁹およびLys¹²への結合；（２） Boc−Lys（２−Cl
Z）のVal¹³への結合；（３） Boc-Asp（OBzl）のIle²⁶
への結合；（４） Boc-LeuのLeu²³；および（５）Boc
−Ser（Bzl）のArg²⁹への結合。最後のアミノ酸残基のB
oc基は、J.Am.Chem.Soc.98，2324-2328（1976）に記載
される手順により除去し、そしてペプチド−樹脂を乾燥
した。得られる側鎖保護されたペプチド−樹脂（ほぼ80
μモル）を無水の液体HFで処理して、側鎖を脱保護しか
つペプチドを樹脂から解放した。ペプチド−樹脂をクレ
ゾール（10％）、ジメチル−サルフアイド（65％）およ
びHF（25％）の混合物で０℃において１時間処理し、次
いでｐ−クレゾール（10％）およびHF（90％）で０℃に
おいて２時間処理した。仕上げた後、332mgの粗製（Leu
²⁷)-GRF-OHが得られた。この物質の一部分（50mg）を準
調製用HPLC系によりホワツトマン・パーチシル（Whatma
n Partisil）Ｍ−9 ODS−３カラム（0.94×50cm）を用
いて精製した。このカラムを0.5％TFA/H₂O／CH₃CN30％
から45％までのCH₃CNの直線勾配のモードにおいて２時
間3ml/分の流速で溶離した。分画（3ml）を集め、そし
てアリコートを分析用HPLCにより分析した。精製物は56
〜58分において出現し、分画を合わせ、蒸発させ、そし
て凍結乾燥した。粗製物質の残部を同じ方法で精製し、
合計16.8mgの生成物が得られた。側面の帯の分画（side
-band fraction）をプールし、蒸発させ、凍結乾燥し、
再びクロマトグラフイーにかけると、合計18.5mgの純粋
な物質（５％）が得られた。精製された生成物は、２種
の分析用HPLC系において均質であることが示され、等電
点電気泳動分析において陰極へ移動して、そして高電圧
薄層電気泳動により均質であつた（R_Arg＝0.18）。トリ
プシン消化のペプチドのマツピング（mapping）は、次
の残基からなる期待される主要な断片を与えた：（１−
11），（13-20），（22-29），（30-38），（39-41）お
よび（42-43）。追加の断片は、部分的のトリプシンの
切り離しにより生じうる。

GRFの生物学的に活性な断片のLeu²⁵類似体、たとえば、
（Leu²⁷)-GRF(1-40)，（Leu²⁷)-GRF(1-39)，（Leu²⁷)-G
RF(1-32)または（Leu²⁷)-GRF(1-29)は同様な方法で、単
に樹脂を所望の化合物の最後のアミノ酸へ結合し、そし
て固相ペプチド合成装置をプログラミングして、次のア
ミノ酸から最後のアミノ酸までの順次の結合を開始しか
つＮ末端に向かつて作用しもどすことによつて調製する
ことができる。たとえば、（Leu²⁷)-GRF(1-32)を製造し
ようとするとき、樹脂をグリシンへ結合させ、合成装置
により結合された第１アミノ酸はグルタミンであり、結
合された第２アミノ酸はグルタミンであり、このように
して連続させる。

以上に述べた方法またはそれと同様の方法によって得ら
れる本発明のポリペプチドのアミノ酸分析値または分子
量の測定結果を示せば次のとおりである。

［Leu²⁷]-GRF(1-44)-NH₂ アミノ酸分析値:Asp,4.24（４）;Thr,1.08（１）;Ser,
3.94（４）;Glu,6.92（７）;Gly,2.98（３）;Ala,4.78
（５）;Val,0.97（１）;Ile,1.97（２）;Leu,5.97
（６）;Tyr,2.01（２）;Phe,0.99（１）;Lys,1.92
（２）;Arg,6.12（６）．［Leu²⁷]-GRF(1-44)-OH アミノ酸分析値:Asp,3.85（４）;Thr,0.83（１）;Ser,
3.75（４）;Glu,7.27（７）;Gly,3.30（３）;Ala,4.68
（５）;Val,1.02（１）;Ile,I.88（２）;Leu,6.25
（６）;Tyr,1.80（２）;Phe,0.86（１）;Lys,2.07
（２）;Arg,6.51（６）．［Leu²⁷]-GRF(1-40)-OH フアスト・アトム・ボムバードメント・マス・スペクト
ロメトリー（fast atom bombardementmass spectrometr
y）により測定した分子量： Calculated:4527.04;Found 4526,25(M+H)⁺ アミノ酸分析値:Asp,4.09（４）;Thr,1.09（１）;Ser,
4.05（４）;Glu,7.18（７）;Gly,3.02（３）;Ala,3.90
（４）;Val,1.02（１）;Ile,1.93（２）;Leu,5.17
（５）;Tyr,1.87（２）;Phe,0.94（１）;Lys,1.93
（２）;Arg,3.84（４）．（Leu²⁷]-GRF(1-44)-OHの生物学てき活性を、先端巨大
症にかかつた固体のひと膵臓腫瘍から単離された天然GR
F(1-44)-NH₂の生物学的活性と比較した〔ソーク研究所
（Salk Institute）の標準hp-GRF-NH₂(NL-A-10）〕。こ
の生物学的活性についての検定は、組織培地中のラツト
下垂体細胞中の成長ホルモンの生産を刺激する能力に基
づき、次の方法で実施した。

30〜40匹のスプレイグーダウリー（Sprague-Dawley）ラ
ツト（175g）からの下垂体を、弾頭後に無菌的に切除し
た前葉を集め、無菌Hepes緩衝液（pH7.35）中で３回洗
浄、そしてコラゲナーゼ（4mg/ml）およびデイスーゼdi
spase（2mg/ml）を含有する20〜30mlのHepes緩衝液（0.
025モル、pH7.35）中に37℃において分散させた。パス
ツールピペツトでおだやかに100〜110分間かきまぜかつ
すりつぶした後、分散した細胞を遠心（150xg,4分）に
より分離し、そしてノイラミニダーゼ（８μg/ml）およ
び200μg/mlのエチレンジニトロ四酢酸二ナトリウム塩
を含有するHepes緩衝液、pH7.35、中に10分間再懸濁さ
せた。細胞をプレイテイング媒質（plating medium）で
２回洗浄し、多くぼみ板（multiwell−plate）上に次の
規定する媒質を用いてプレテイングした（1.5×10⁵個の
細胞/ml）:F−12/DMEM/BGjb（6:3:1）（Gibco:430-1700
／430-1600／320-2591）および2gBSA/1,2.38gHepes/1お
よび50mgゲンタマイシン/1。各ウエル中の媒質に（Leu
²⁷)-GRF(1-44)-OHまたは自然GRF(1-44)-NH₂のいずれか
を媒質1ml当り3.1〜200fmolの範囲の濃度で補充した。
対照ウエルは補充物質を含有しなかつた。プレイテイン
グは、細胞の急速な固定を確保するために２％の胎児の
子牛血清を加えたこの媒質を用いて実施した。第４日目
に、胎児子牛血清を含まない規定した媒質で細胞を２回
洗浄した。最後に、900μｌの規定した媒質と、100μｌ
の各個々の処置物質を含有する同一媒質とを、各ウエル
に加え、３回の反復実験を行つた。３時間のインキユベ
ーシヨン後、媒質を集め、必要に応じて希釈して、ラツ
トの成長ホルモンについての放射線免疫検定（RIAs）を
実施した。このRIAsはシンハ（Sinha）の抗ネズミGH免
疫血清を用いて実施した。

自然GRF(1-44)-NH₂および（Leu²⁷)-GRF(1-44)-OHについ
ての検定の結果を、下表に記載する。

この表のデータから明らかなように、（Leu²⁷)-GRF(1-4
4)-OHはGRF(1-44)-NH₂と同じレベルであるいはそれより
わずかに高いレベルで成長ホルモン放出活性を示した。
ソーク研究所（Salk-Institute）の標準と比較した（Le
u²⁷)-GRF(1-44)-OHの相対的効力は、上のデーターのコ
ンピユーター分析により1.063であると決定された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (56)参考文献特開昭59−139347（ＪＰ，Ａ) ″ＰｅｐｔｉｄｅａｓＰｏｔｅｎｔｉａｌＤｒｕｇｓａｎｄＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ″（ＰｒｏｃｅｅｄｍｇｓｏｆＡｍｅｒｉｃａｎＰｅｐｔｉｄｅｓＳｙｍｐｏｓｉｕｍ，８ｔｈ，1983）Ｐ．853−856（1983) ＴｈｅＥｎｄｏｃｒｉｎｅＳｏｃｉｅｔｙ，65ｔｈＡｎｎｕａｌＭｅｅｔｉｎｇ，ＰｒｏｇｒａｍＡｎｄＡｂｓｔｒａｃｔｓ，（1983年６月８−10日) Ｐ．154

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】一般式（Leu²⁷)-GRF 式中、GRFは天然のヒト成長ホルモン放出因子の完全配
列の少なくとも最初の28アミノ酸を表わし、そしてこの
分子のカルボキシル末端は遊離酸またはアミドの形であ
る、のポリペプチド。
【請求項２】GRFが天然のヒト成長ホルモン放出因子の
１−41ないし１−44のアミノ酸配列を表わす特許請求の
範囲第１項記載のポリペプチド。
【請求項３】（Leu²⁷)-GRF(1-44)-OHである特許請求の
範囲第１項記載のポリペプチド。
【請求項４】（Leu²⁷)-GRF(1-44)-NH₂である特許請求の
範囲第１項記載のポリペプチド。
【請求項５】ヒトにおける成長に関係する疾患の処置に
使用する特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記載の
ポリペプチド。
【請求項６】動物の成長速度を増加するために動物の処
置に使用する特許請求の範囲第１〜４項のいずれかに記
載のポリペプチド。
【請求項７】（ａ）溶液相ペプチド合成により合成さ
れた対応するアミノ酸配列の適当に保護されたポリペプ
チドの保護基を、常法により切り離すか、あるいは（ｂ）固相ペプチド合成により合成された対応するア
ミノ酸配列の適当に側鎖保護された樹脂結合ポリペプチ
ドを、無水の液体HFと反応させる、ことを特徴とする一般式（Leu²⁷)-GRF 式中、GRFは天然のヒト成長ホルモン放出因子の完全配
列の少なくとも最初の28アミノ酸を表わし、そしてこの
分子のカルボキシル末端は遊離酸またはアミドの形であ
る、のポリペプチドの製造方法。
【請求項８】一般式（Leu²⁷)-GRF 式中、GRFは天然のヒト成長ホルモン放出因子の完全配
列の少なくとも最初の28アミノ酸を表わし、そしてこの
分子のカルボキシル末端は遊離酸またはアミドの形であ
る、のポリペプチドを有効成分として含有することを特徴と
するヒト以外の動物の成長を正常よりも高いレベルに増
加させるための処置剤。