JPH08301899A - Ｉｇｆ−１スーパーアゴニスト - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 インスリンおよびＩＧＦ−１の活性を有する
合成ペプチド(ＩＧＦ−１類縁体)、該類縁体の組換え生
産に有用な合成および半合成ＤＮＡ配列、組換えＤＮＡ
ベクターおよび形質転換宿主細胞、ならびに該類縁体を
含む医薬製剤を提供すること。 【解決手段】 式： ＢＣⁿ,Ａ (１) ［式中、ＢはＩＧＦ−１のＢドメインまたはその機能的
類縁体；ＣはＩＧＦ−１のＣドメインまたはその機能的
類縁体；ｎはＣドメイン中のアミノ酸の数であり、約６
〜約１２；およびＡはＩＧＦ−１のＡドメインまたはそ
の機能的類縁体である］で示されるＩＧＦ−１類縁体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、インスリンおよび
ＩＧＦ−１の活性を有する合成ペプチドに関する。また
本発明は、該ペプチドの産生に有用な組換えＤＮＡ化合
物、ベクターおよび形質転換細胞系に関する。さらに本
発明は、ヒトの心身の苦悩の治療における該ペプチドの
使用方法に関する。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】ソマ
トメジンＣとしても知られるＩＧＦ−１は、成長ホルモ
ンの活性を仲介し、かつインスリン様活性を有する血清
ポリペプチドである。ハンベル(Humbel,R.E.)(１９９０
年)「European Journal of Biochemistry」１９０,４４５
〜４６２“インスリン様成長因子ＩおよびＩＩ”。ＩＧ
Ｆ−１は、そのインスリン様活性および軟骨におけるＳ
Ｏ₄ ^2-取り込みの刺激活性が知られている。したがっ
て、ＩＧＦ−１は成長促進物質としても糖尿病の治療薬
としても有用である。ＩＧＦ−１は、ヒトの成長ホルモ
ン欠乏症の治療、家畜の発育速度の増加、筋肉の相対的
割合の増加もしくは食物変換効率の改良、ヒトのやけど
後,感染または他の外傷などの重篤な異化状態における
体タンパク質の損失の抑制、ヒトおよび動物の創傷治癒
の改善、および培養細胞の成長の援助に用いることがで
きる。ＩＧＦ−１は、やけど、骨外傷、感染、癌、嚢胞
性腺維症、デュシェン筋ジストロフィー、ベッカージス
トロフィー、常時染色体の劣性ジストロフィー、多発性
筋炎ならびに他の筋障害およびエイズなどの組織破壊を
伴う疾患の治療に用いることができる。ＩＧＦ−１は、
哺乳類のタンパク質蓄積不全の治療に用いることができ
る。ＩＧＦ−１が有効な欠乏症あるいは不全としては、
未熟児性関連欠乏症、成長ホルモン欠乏症、ソマトメジ
ン欠乏症、やけど,感染,癌,嚢胞性腺維症,デュシェン筋
ジストロフィー,ベッカージストロフィー,常時染色体の
劣性ジストロフィー,多発性筋炎ならびに他の筋障害お
よびエイズに関連するものが挙げられる。ＩＧＦ−１を
用いて、赤血球産生を刺激することができ、したがって
ＩＧＦ−１はヒトの発育不全の治療および異化状態に伴
う負の窒素出納の制限に有用である。したがって、天然
のＩＧＦ−１の活性よりも強い活性を有するＩＧＦ−１
類縁体を得ることが望まれる。このような類縁体は、イ
ンスリンおよびＩＧＦ−１活性の両方の欠乏症である糖
尿病などの異化状態の治療に対して適用しうる有効性を
有する。

【０００３】ＩＧＦ−１の構造−活性の相関関係につい
て、合成的、半合成的および生合成的手法からのアプロ
ーチがなされている。ディマーチ(DiMarchi,R.D.)ら
は、十分なＩＧＦ−１受容体親和性を達成するためにＣ
ドメインが重要であることを報告した。ディマーチらの
“インスリン様成長因子Ｉとの構造的相同性に基づく速
作用インスリンの合成”,「１９９１年６月１６〜２１
日マサチューセッツ州ケンブリッジにて開催された第１
２回アメリカン・ペプチド・シンポジウムの会報：化学
および生物学；ペプチド類」(１９９２年),スミス(Smit
h,J.A.)およびリヴィエール(Rivier,J.E.)編,２６〜２
８,ＥＳＣＯＭ,レイデン。インスリンの二鎖ＩＧＦ−１
等価物が、インスリンおよびＩＧＦ−１受容体に対し
て、インスリンおよびＩＧＦ−１とほとんど等しい親和
性を有することが報告された。インスリン残基と相当な
置換性をもつ、さらに別の二鎖ＩＧＦ−１関連ペプチド
が製造されている。すべての場合において、これらのヘ
テロ二量体ＩＧＦ−１のＩＧＦ−１受容体に対する親和
性は、類似のＩＧＦ−１リガンドと比べて低い値を示し
た。ＩＧＦ−１類縁体の生合成は、単鎖ペプチドのみに
焦点を合わせて行われてきた。キャサイエリ(Cascieri,
M.A.)らの(１９８８年)「Biochemistry」,２７：３２２
９〜３２３３；ベイン(Bayne,M.L.)らの(１９８８年)
「J.Biol.Chem.」,２４９：１１００４〜１１００８。

【０００４】本発明者らは、驚くべきことに、ＩＧＦ−
１分子を分割してＣドメインを完全に除去するとＩＧＦ
−１の活性が低下し、Ｃドメインを部分的に除去すると
スーパーアゴニストが得られることを見出した。この観
察は、プロインスリンのＣドメインを逐次除去していっ
た場合に、インスリン受容体親和性が着実に増加したと
いうインスリン受容体における観察結果と対照的であ
る。これら２つの相同性の高い受容体が、異なる挙動を
するということは全く予期し得ないことであった。すな
わち本発明者らは、ＩＧＦ−１受容体へのスーパーアゴ
ニストであり、さらなる利点として、天然のＩＧＦ−１
よりもインスリン活性が非常に大きい特殊なＩＧＦ−１
類縁体を提供するに至った。

【課題を解決するための手段】

【０００５】本発明は、天然の単鎖ＩＧＦ−１の誘導体
である、短縮されたＣドメインを有する二鎖ＩＧＦ−１
スーパーアゴニストを提供する。また本発明は、これら
の類縁体の組換え生産に有用な合成および半合成ＤＮＡ
配列、組換えＤＮＡベクターおよび形質転換宿主細胞を
提供する。また本発明は、これらのＩＧＦ−１類縁体を
含む医薬製剤を提供する。また本発明は、種々の治療上
の適用におけるこれらの類縁体の使用方法を提供する。

【０００６】 本発明は、式： ＢＣⁿ,Ａ (１) ［式中、ＢはＩＧＦ−１のＢドメインまたはその機能的
類縁体；ＣはＩＧＦ−１のＣドメインまたはその機能的
類縁体；ｎはＣドメイン中のアミノ酸の数であり、約６
〜約１２；およびＡはＩＧＦ−１のＡドメインまたはそ
の機能的類縁体である］で示されるＩＧＦ−１類縁体を
提供する。

【０００７】用語の定義 これまでの記載において、Ｂ、Ｃ、ＡおよびＤは、ＩＧ
Ｆ−１分子のサブユニットを意味する。ＢはＩＧＦ−１
のＢドメインを意味する。ＣはＩＧＦ−１のＣドメイン
を意味する。ＡはＩＧＦ−１のＡドメインを意味する。
ＤはＩＧＦ−１のＤドメインを意味する。ＢＣＡＤ Ｉ
ＧＦ−１という表現は、第１のアミノ酸配列(アミノ末
端からカルボキシ末端まで)がＩＧＦ−１のＢドメイン
であり、ＢドメインがＩＧＦ−１のＣドメインに連結
し、ＣドメインがＩＧＦ−１のＡドメインに連結し、Ａ
ドメインがＩＧＦ−１のＤドメインに連結して単鎖隣接
ペプチドユニットを形成している状態を示す。Ｂ(８)な
どの番号を付したアミノ酸残基は、ＩＧＦ−１のＢドメ
インの８番の位置に存在するアミノ酸を示す。ＩＧＦ−
１中の特殊な残基の番号付けは、ＩＧＦ−１の公知の分
子に対する慣例的な番号の付け方にしたがって行う。た
とえば上記の例の場合、たとえアミノ酸が問題にしてい
る特殊な類縁体のＢドメインにおいて８番目の残基でな
いとしても、Ｂ(８)という名称は一貫して保持される。
構造中のコンマ(すなわち、ＢＣ,Ａ)は、たとえ分子が
ジスルフィド結合によって一緒になっているとしても、
ポリペプチド骨格構造中に裂け目が存在することを示
す。全ＩＧＦ−１構造から一つの文字が欠如しているの
は、問題にしている特殊な分子中に特定のサブユニット
が存在しないことを示す。名称中の上つき文字(すなわ
ち、ＢＣ¹²,Ａ)は、Ｃドメインのアミノ酸の数が１２で
あるという、そのサブユニット中のアミノ酸の数を示
す。後記のｂおよびａは、それぞれインスリンのｂ鎖お
よびａ鎖を意味し、ｃは、プロインスリン(ｂｃａ)にお
いてｂおよびａを結合する連結ペプチドを意味する。

【０００８】幾つかのＩＧＦ−１およびインスリン構築
物を作成し、そのＩＧＦ−１活性の検定を行った。天然
のヒトインスリンおよびプロインスリンも比較のために
含まれている。その結果を下記表Ｉに要約する。

【表１】 ＩＧＦ−１類縁体の活性 構築物¹ IGF-1活性(%)² インスリン活性(%)² 比率³ BCAD(IGF-1) １００ １.２ ８３ ＢＣＡ ７７ ２.４ ３２ ＢＣ¹²＊,Ａ １２７ ９.８ １３ ＢＣ¹⁰＊,Ａ １８６ １６ １２ ＢＣ⁸＊,Ａ １４１ １６ ８.８ ＢＣ⁶＊,Ａ ５７ １８ ３.２ Ｂ,Ａ ７.７ １８ ０.４３ b,a(インスリン) ０.３７ １００ ０.００３７ bca(プロインスリン) ＜０.１ ２.４ ＜０.４１ ¹)天然に存在するヒトペプチドを用いてすべての構築物を作成した。 ²)実施例５の記載にしたがって測定した。 ³)比率＝ＩＧＦ−１活性÷インスリン活性 ＊)これらの実施例において、上つき文字は、Ｎ末端残基で始まるＣドメイン のアミノ酸残基の数がこれらの数値に対応することを意味する。

【０００９】上記データは、Ｃドメインを保有するＩＧ
Ｆ−１の“分割された”(すなわち、二鎖)誘導体が、単
鎖ＩＧＦ−１分子と比べて、より活性が大きいことを示
している。該データはまた、Ｃドメインにアミノ酸が６
個以上存在することが、ＩＧＦ−１受容体における最大
活性を引き出す必須条件であることも示している。天然
のＢＣＡＤ(ＩＧＦ−１)と比較すると、約１０±２個の
残基がＣドメインの最適長さであることは明らかであ
る。Ｃドメインが、インスリン活性ではなくＩＧＦ−１
活性にとって必須であることに注目することが重要であ
る。実際、インスリン活性は、ＩＧＦ−１のＣドメイン
のアミノ酸を６個まで短縮することによって最大化さ
れ、さらにアミノ酸を削除しても変化しない。

【００１０】天然に存在するペプチドｂ,ａ(インスリ
ン)およびＢＣＡＤ(ＩＧＦ−１)を、類縁体という面に
おいて互いに比較すると、明確な分子の構造上の差異が
あることがわかる。単鎖ＩＧＦ−１(ＢＣＡ)と比較する
と構築物Ｂ,ＡにはＩＧＦ−１のＣドメインが欠如して
いることから、ＩＧＦ−１受容体との相互作用にはＣド
メインが必須であることがわかる。Ｃドメインの大きさ
が１０以下に減少するにつれて、二鎖ＩＧＦ−１類縁体
のＩＧＦ−１受容体への結合親和性は付随的に減少す
る。他の重要な点は、インスリン受容体親和性が、ＩＧ
Ｆ−１受容体親和性と同時に変化しうることを認識する
ことである。結果として、ＩＧＦ−１受容体への親和認
識性および選択性を高めることにおいて、ＩＧＦ−１の
Ｃドメインが重要な役割を果していると推断することが
できる。インスリン受容体親和性は、主としてＡドメイ
ンに対するＣドメインの共有結合によって調節される
が、Ｃドメインの直線的大きさもある程度は関与してい
る。この後者の特徴は、ＢＣ¹²,Ａが、天然に存在する
単鎖型のＩＧＦ−１と比較すると、ＩＧＦ−１受容体親
和性が僅かに低くなり、受容体選択性が大きく増加して
いることから証明される。Ｃドメインが１０残基以上に
伸びると、活性が低下した。その例として、ＢＣ¹⁰,Ａ
に対するＢＣ¹²,Ａおよびｂ,ａに対するｂｃａが挙げら
れる。

【００１１】インスリン受容体およびＩＧＦ−１受容体
は、ある生物学的機能を分担しているように思われる。
各受容体は、代謝的およびマイトジェン的細胞活性を仲
介する能力を有する。外傷などが原因となる急性の異化
的生理状態を、ＩＧＦ類およびインスリンを投与するこ
とによって逆行させることができる。同様に、糖尿病な
どの慢性の異化的状態のための最適療法には、インスリ
ンおよびＩＧＦ−１などのこのようなホルモン因子の正
常化が必要である。驚くべきことに本発明者らは、ヘテ
ロ二量体ＩＧＦ−１構築物の製造によって、ＩＧＦ−１
自体よりも活性の大きなペプチドを誘導しうることを見
出した。ＢＣＡ鎖において、ＣドメインとＡドメインの
連結点に、ただ１つの裂け目が存在することによって、
比較対照となる単鎖ＢＣＡのほとんど２倍の活性をもつ
独特の新規なＩＧＦ−１ペプチドがもたらされる。二鎖
ＩＧＦ−１類縁体は、単鎖ペプチド類と比較して、さら
に別の能力をも持つ。これらのペプチドは相当に大きな
インスリン活性を有する。Ｃドメインの残基を２〜６個
に短縮することによって、最大インスリン活性を得るた
めのほとんど最適なサイズが、容易に実現される。ＩＧ
Ｆ−１活性は、最初のＣドメイン残基の削除から、Ｃド
メインの長さが１０アミノ酸残基である最大活性点に至
るまで増加する。配列をさらに削除すると、ＩＧＦ−１
活性は減少する。新規および独特なＩＧＦ−ペプチドＢ
Ｃ¹⁰,Ａが、最大のＩＧＦ−１およびインスリン活性が
得られる最良の構築物であることがわかる。このタイプ
のＩＧＦ−１類縁体は、ＩＧＦ−１受容体に対する活性
がより大きいＩＧＦ−１と比較した場合、独特の能力を
もち、同時に、より大きいインスリン活性を付与しうる
のである。

【００１２】本発明はさらに、式(１)で示されるＩＧＦ
−１の機能的類縁体を提供する。機能的類縁体とは、天
然に存在するその分子または化合物と同様の機能的特性
を有するが、修飾された構造をもつ分子を意味する。機
能的類縁体には、親分子と同様の機能的特性および反応
性を有するフラグメントも(親分子に加えて)包含され
る。このような機能的類縁体は、ペプチドの特徴を変更
するように設計することもできるが、通例は、その天然
に存在するペプチド同じ性質の生物学的活性を示す。機
能的類縁体は通常、人工的に工作された変化体である
が、このような機能的類縁体には、ペプチドアミノ酸配
列の天然に存在するアロタイプまたは中間種変化体も包
含される。

【００１３】このような機能的類縁体は、ＩＧＦ−１類
縁体をコードするＤＮＡを修飾し、その後、該ＤＮＡを
組換え細胞培養において発現させることによって製造す
ることができる。公知の配列を有するＤＮＡにおいて、
予定の部位における置換突然変異を作製する技術は公知
である(たとえば、Ｍ１３プライマー突然変異誘発な
ど)。機能的類縁体ペプチドをコードするＤＮＡに作製
する突然変異は、読み取り解読枠の外に設置してはなら
ず、二次的ｍＲＮＡ構造を産生しうる相補的領域を創造
しないのが好ましい。ＩＧＦ−１の機能的類縁体は一般
に、ペプチドのアミノ酸配列を特殊な限定された作法で
修飾することによって創造される。アミノ酸配列変化体
を導入する部位は予め決定しておくが、突然変異それ自
体は予め決定する必要はない。たとえば、所定の部位に
おける突然変異の作業を最適化するために、標的コドン
または領域においてランダム突然変異を行い、得られる
機能的類縁体をスクリーニングして所望の活性の最適な
組み合わせを得る。

【００１４】ペプチドの機能的類縁体は通例、１個(ま
たは２〜３個)のアミノ酸残基の欠失、挿入または置換
によって生産される。天然に存在するアミノ酸に対する
このような修飾は、下記表２にしたがって行われる。

【表２】

【００１５】機能または免疫学的同一性における実質的
変化は、表２の置換と比較して、保存性がより低い置換
を選択すること［すなわち、(ａ)ポリペプチドバックボ
ーンの二次あるいは三次構造；(ｂ)残基の電荷または疎
水性；または(ｃ)側鎖の嵩を維持する効果においてより
有意に相異する残基を選択すること］によって生じ得
る。ポプチドの特性が最大に変化することが一般に予期
される置換とは、(ａ)親水性残基が、疎水性残基によっ
て置換される；(ｂ)システインまたはプロリンが、その
他のいずれかの残基と置換される；(ｃ)荷電側鎖を有す
る残基が、中性残基と置換される；または(ｄ)疎水性側
鎖を有する残基が、αカルボニルにおける立体化学を変
化させるような小さい疎水性側鎖のひとつと置換される
ような置換である。

【００１６】いろいろなアミノ酸修飾がＩＧＦ−１の一
次構造に導入されてきた。これらの機能的類縁体は、各
タイプの糖尿病の治療に有用であり、商業的(特に、組
換え)生産を促進し、および／またはより望ましい医薬
製剤を提供するための多種多様な望ましい特徴を示し
た。アップルバウム(Applebaum)らの米国特許第４８７
６２４２号(１９８９年１０月２４日登録)には、血清成
分への親和性が低下されていると同時にＩ型受容体への
親和性を保有していることによって高レベルのＩＧＦ−
１活性を有するヒトＩＧＦ−１類縁体が記載されてい
る。ウエダ(Ueda)らの米国特許第４７４５１７９号(１
９８８年５月１７日登録)には、臭化シアンの適用によ
って生産を簡単化するＶal₅₉−ＩＧＦ−１類縁体が記載
されている。ベイン(Bayne)およびキャサイエリの欧州
特許公開番号ＥＰ−３７９３３８(１９９０年７月２５
日公開)には、報告によるとＩ型インスリン受容体に結
合する能力は保有しているが、２８Ｋ ＩＧＦ結合タン
パク質への結合能力が低下しているヒトＩＧＦ−１の類
縁体が記載されている。ここに記載されたＩＧＦ類縁体
は、３Ｔ３細胞中でＤＮＡ合成を刺激することにおい
て、天然のＩＧＦ−１の１００倍の大きさの活性をもつ
ことが報告されている。多くのその他の特許、特許出願
および刊行物は、当業者が容易に入手して化合物(１)の
一次構造への有用な修飾を行うことができる。たとえ
ば、日本特許公開番号０１−０５０８９９(１９８９年
２月２７日公開：住友製薬ＫＫ)；米国特許第４７６９
３６１号(１９８８年９月６日登録)；日本特許公開番号
０１−０６３５９７(住友製薬ＫＫ)；日本特許公開番号
６２−１９０１９９(藤沢薬品工業ＫＫ)；日本特許公開
番号６２−１６９７３３(藤沢薬品工業ＫＫ)；米国特許
第５０７００７５号(１９９１年１２月３日登録)；米国
特許第５０７７２７６号(１９９１年１２月３１日登
録)；および欧州特許公開番号ＥＰ−３４６４２９(１９
８９年１２月２０日公開)。本発明は、式(１)で示され
るＩＧＦ−１の機能的類縁体に行われる、このような公
知のＩＧＦ−１のハイブリッド機能的類縁体の構造の修
飾をも包含する。

【００１７】本発明の好ましい具体例においては、ＩＧ
Ｆ−１類縁体(１)のサブユニットのアミノ酸配列は、Ｉ
ＧＦ−１のＡドメインの天然に存在する配列、ＩＧＦ−
１のＢドメインの天然に存在する配列およびＩＧＦ−１
のＣドメインの天然に存在する配列の短縮型からなる。
本発明の別の具体例は、サル、ブタ、ウシ、モルモッ
ト、サカナまたはアヒルなどの別種の動物のＩＧＦ−１
類縁体から誘導されたＩＧＦ−１分子の機能的類縁体に
関する。本発明のさらに好ましい具体例においては、
Ｂ、ＣおよびＡは、天然のヒトＩＧＦ−１の配列から誘
導される。本発明の最も好ましい具体例においては、Ｉ
ＧＦ−１類縁体(１)は、ＢＣ¹⁰,Ａという構造をもつ。

【００１８】ＩＧＦ−１類縁体(１)は、下記(ａ)または
(ｂ)のいずれの方法を用いて構築してもよい。 (ａ)単鎖ＩＧＦ−１前駆体を化学的および酵素的に逐次
切断して所望のＩＧＦ−１類縁体を得る。 (ｂ)独立したＩＧＦ−１ペプチドサブユニット鎖から組
み立てる。 単鎖(ＢＣＡまたはＢＣＡＤ)ＩＧＦ−１前駆体および／
または独立したＢ、Ｃ、ＡまたはＤドメインは、固相ペ
プチド合成法、液相ペプチド合成法または組換えＤＮＡ
法によって生産することができる。

【００１９】天然源から完全なＩＧＦ−１分子を単離し
てもよい(欧州特許公開番号ＥＰ−２０９３３１、１９
８７年１月２１日公開を参照；天然源からのＩＧＦ−１
の精製が記載されている)。日本特許公開番号０１−０
６３５９７(１９８９年３月９日公開)には、アミノ酸ユ
ニットの縮合によるＩＧＦ−１誘導体の合成が記載され
ている。次いで、完全なＩＧＦ−１分子を化学的または
酵素的に切断し、化合物(１)を得る。化合物(１)はま
た、それぞれＢＣⁿおよびＡドメインを固相合成法ある
いは組換えＤＮＡ法によって独立したサブユニットとし
て生産し、当業者には公知の技術を用い、独立した２つ
の鎖から組換えヒトインスリンを組み立る際に行ったも
のと同様の仕方にて、該２つのサブユニットから化合物
(１)を組み立ててもよい。固相ペプチド合成技術は、当
業者には公知である。たとえば、ゲッセルシェン(Gesel
lschen,P.D.)およびサンテレ(Santerre,R.F.)の“化学
的およびバイオテクノロジーの手段によるペプチドおよ
びタンパク質の合成",「Peptide and DrugDelibery」,リ
ー(Lee,V.H.L)編,チャプター２(１９９１年),マーセル
・デッカー,ニューヨーク,ＮＹ１００１６；一般的なも
のとしては「Methods in Enzymology」,v.１８５(１９
９０年),およびゲデル(Goeddel,D.V)編を参照。

【００２０】

【発明の実施の形態】ＩＧＦ−１類縁体ペプチドは、ア
プライド・バイオシステムズ(Applied Biosystems)４３
０Ａペプチド合成機(カリフォルニア９４４０４フォス
ター・シティーのアプライド・バイオシステムズ社から
購入)を用いる固相法によって合成した。Ｂocアミノ酸
樹脂およびその他の試薬は、アプライド・バイオシステ
ムズ社製のものおよびその他市販されているものを用い
た。ダブルカップルプロトコルを用いる連続的なＢocの
化学反応および酢酸無水物によるキャッピングを、所望
のＢoc−アミノ酸−４−(オキソメチル)−フェニルアセ
トアミドメチル［ＰＡＭ］樹脂に適用する。予め作製し
たヒドロキシベンゾトリアゾールエステルを用い、アス
パラギン、ヒスチジン、グルタミン、アルギニン、［α
−(ｐ−ヒドロキシフェニル)酢酸］、［β−(ｐ−ヒド
ロキシフェニル)プロピオン酸］、ｐ−ヒドロキシ安息
香酸、ｐ−ヒドロキシ桂皮酸およびｐ−ヒドロキシフェ
ノキシ酢酸をカップリングさせた。予め作製した対称無
水物を用い、その他の残基すべてを、ジシクロカルボジ
イミド(ＤＣＣ)とカップリングさせた。

【００２１】側鎖の保護には下記の保護基を用いた。Ａ
rg：トシル、Ａsp：シクロヘキシル、Ｃys：４−メチル
ベンジル、Ｇlu：シ クロヘキシル、Ｈis：ベンジルオキシメチル(ＢＯＭ)、
Ｌys：２−クロロベンジルオキシカルボニル、Ｓer：ベ
ンジル、Ｔhr：ベンジル、Ｔyr：２−ブロモベンジルオ
キシカルボニル。Ｂocの脱保護は、塩化メチレン中、ト
リフルオロ酢酸(ＴＦＡ)を用いて行った。合成完了後、
該ペプチドを脱保護し、約１０％のメタクレゾールまた
は５％のメタクレゾールおよび５％のチオクレゾールを
含有する無水フッ化水素(ＨＦ)にて樹脂から切断した。
後記実施例１に示すように、Ｍet(Ｏ)を含有するペプチ
ジル樹脂に対し、ＴＦＡ、ＤＭＳおよびＨＣｌを用いる
操作を行った後、樹脂から切断した。後記実施例１およ
び２に示すように、ＨＦを除去した後、エチルエーテル
でペプチド／樹脂を洗浄し、ペプチドの亜硫酸分解を行
った。精製は、後記実施例４に示す方法で行った。

【００２２】式(１)で示されるペプチドの合成は、固相
ペプチド合成法または組換え法によって行うことができ
るが、高収率で行うには組換え法が好ましい。ＩＧＦ−
１の組換え合成が報告されている。ディマーチらの(１
９８９年)「J.Cellular Biochemistry」,８６：２８３
〜２９４。ＩＧＦ−１ペプチドの組換え産生における基
本的なステップは下記のとおりである。 ａ)ＩＧＦ−１類縁体(１)をコードする合成または半合
成ＤＮＡを構築し； ｂ)ＩＧＦ−１類縁体の発現に適した作法によって発現
ベクターへ該ＤＮＡを組込み(直接あるいは融合タンパ
ク質として)； ｃ)該発現ベクターで適当な真核または原核宿主細胞を
形質転換し； ｄ)該形質転換またはトランスフェクションされた宿主
細胞を、ＩＧＦ−１ペプチドの産生に好適な条件下で培
養し；ついで ｅ)組換え産生されたＩＧＦ−１類縁体を回収し、精製
する。

【００２３】組換え手段によるＩＧＦ−１分子(もしく
は独立したサブユニット)の産生を選択する場合は、所
望のＩＧＦ−１前駆体をコードするＤＮＡ配列を得るこ
とが必要である。該ＤＮＡコーディング配列は、完全合
成、半合成または天然のＩＧＦ−１のｃＤＮＡを修飾す
うることによって得られる。その遺伝子のインビトロま
たはインビボ転写および翻訳の結果としてＩＧＦ−１ペ
プチドが産生される合成遺伝子は、公知の技術によって
構築することができる。遺伝暗号には天然の縮重がある
ために、手頃な大きさであるがまだ数の限定されていな
いＤＮＡ配列を用いて、ＩＧＦ−１ペプチドをコードす
るように構築しうることを当業者であれば理解するであ
ろう。合成的方法論によってＩＧＦ−１ペプチドをコー
ドする遺伝子を創製することができる。このような合成
的遺伝子構築の方法論は、当業者には公知である。ブラ
ウン(Brown)らの(１９７９年)「酵素学における方法」,
アカデミック・プレス,Ｎ.Ｙ.,Vol.６８,１０９〜１５
１。常套のＤＮＡ合成装置(アプライド・バイオシステ
ムズから市販,フォスター・シティ,カリフォルニア)を
用いて、合成ＩＧＦ−１ペプチド遺伝子に対応するＤＮ
Ａ配列を産生することができる。ウエダ(Ueda)らの(米
国特許第５０１９５００号：１９９１年５月２８日登
録)には、ヒトＩＧＦ−１の組換え産生に有用な合成遺
伝子が記載されている。

【００２４】所望のコードおよびコントロール配列を含
む適当なベクターの構築には、標準の連結反応技術を用
いる。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを
切断し、必要な操作を加え、所望の形体に再連結し、必
要とするプラスミドを得る。所望のＩＧＦ−１の翻訳を
成し遂げるために、適当な制限エンドヌクレアーゼを用
いて、ＩＧＦ−１ペプチドＤＮＡをコードする配列を適
当な組換えＤＮＡ発現ベクターに挿入する。これらの増
殖物からの単離および発現プラスミドへの組込みを促進
するために、転写産物の両端に制限エンドヌクレアーゼ
切断部位を有するように、合成ＩＧＦ−１類縁体をコー
ドする配列を設計する。公知の技術によって、所望のベ
クターへの該配列の結合を促進するために、合成リンカ
ーを用いて該コード配列を容易に修飾することができ
る。使用した特定のエンドヌクレアーゼを、使用される
発現ベクターの制限エンドヌクレアーゼ切断パターンに
よって決まる。転写解読およびＩＧＦ−１ペプチドの発
現が正確に行われるようにするために、コントロール配
列をともなうＩＧＦ−１ペプチドコード配列を正確に配
向するように制限部位を選択する。

【００２５】一般に、宿主細胞に適合する動物種由来の
プラスミドベクター(プロモーターおよびコントロール
配列を含む)を該宿主とともに用いる。通常、ベクター
は、形質転換細胞において表現型の選択を可能にする複
製部位およびマーカー配列を保有する。ＩＧＦ−１ペプ
チドコード配列は、発現ベクターのプロモーターおよび
リボソーム結合部位(これらの両方はＩＧＦ−１ペプチ
ドが発現されるべき宿主細胞において機能的である)を
含む正しい転写解読枠内に位置するように配置する。プ
ロモーター−オペレーター領域はそれ自身が誘導された
遺伝子のＡＴＧ出発コドンを占有しているので、該領域
はＩＧＦ−１ペプチドをコードするＤＮＡ配列のＡＴＧ
出発コドンと同じ配列配向性で配置されるのが好まし
い。

【００２６】融合タンパク質としてのＩＧＦ−１ペプチ
ドの発現に関しては、幾つかの例が公知である。たとえ
ば、米国特許第５０２８５３１号(１９９１年７月２日
登録；本発明の参考文献である)には、融合タンパク質
としてのヒトＩＧＦ−１の製造が記載されている。日本
特許公開番号６３−２６３０８５(１９８８年１０月３
１日公開)には、ＩＧＦ−１ペプチドを含む融合タンパ
ク質としてヒトＩＧＦ−１を産生し、次いで該融合ＩＧ
Ｆ−１から保護ペプチドを除去して成熟ＩＧＦ−１を得
る方法が記載されている。このような方法論は、本発明
のＩＧＦ−１ペプチドの産生に応用することができる。

【００２７】単鎖ＢＣＡまたはＢＣＡＤ ＩＧＦ−１構
造(固相合成法または組換え法にて調製)を経由し、次い
で酵素的または化学的に切断する方法によって化合物
(１)を製造することができる。多数のペプチダーゼ(た
とえばカルボキシペプチダーゼ)は、特異的部位でポリ
ペプチドを切断する、あるいはペプチド鎖のアミノまた
はカルボキシ末端からペプチドを分断することが知られ
ている。さらに、特定の化学製品(たとえば臭化シアン
(ＣＮＢｒ))は、特異的部位でポリペプチド鎖を切断す
る。トリプトファン残基の欠如した組換え産物は、たと
えばＩＧＦ−１では、トリプトファン残基をコードする
コドンを、前駆体融合タンパク質に(ＩＧＦ−１ペプチ
ドの第１残基の先に直接に)結合させることによって得
られる。たとえば、ディマーチらの米国特許第４７４５
１７８号(１９８８年５月１７日登録；本発明の参考文
献である)には、濃度０．１４Ｍの有機スルホキシド、
濃度０．１２ＭのＨＣｌおよび水を含む最大濃度０．１
５〜０．５５のＴＦＡ溶液中にて、ペプチドまたはタン
パク質を処理することによって、該ペプチドまたはタン
パク質をトリプトファン残基の位置で選択的に切断する
方法が記載されている。当業者であれば、部位特異的内
部切断部位を結合するためのアミノ酸配列(および組換
え手段を採用する場合であれば合成または半合成コード
配列)に必要な修飾を認識するであろう。

【００２８】天然の配列のＩＧＦ−１分子において、分
断可能なアミノ末端リーダー配列を結合するための配列
の修飾を行うことによって、特徴的なアミノ末端メチオ
ニン残基がない分子を得ることができる。たとえば、シ
ュン(Hsiung)の欧州特許公開番号ＥＰ−３６１９５６
(１９９０年４月４日公開)には、小さい分子量のタンパ
ク質を発現させるための、タンパク質誘導体をコードす
るＤＮＡ配列に対する修飾、次いで行う余分のアミノ酸
の切断による天然タンパク質の生産が記載されている。
この方法を用い(たとえば、ＣＮＢｒまたはヒドロキシ
ルアミン)、余分の配列を切断して天然のタンパク質を
生産することができる。たとえば、ディマーチらの欧州
特許公開番号ＥＰ−２２０９５８(１９８７年５月６日
公開)には、式：Ｈ−Ｘ−Ｐro−ＩＧＦ１［式中、Ｘは
天然に存在するアミノ酸である］で示されるペプチドの
設計が記載されている。得られたＨ−Ｘ−Ｐro−［ＩＧ
Ｆ−１］は、(ａ)非プロトン性溶媒中で弱酸性条件下に
置くか、または(ｂ)水性緩衝液中で中性もしくはアルカ
リ性条件下に置いてＨ−Ｘ−Ｐro部分のジケトピペラジ
ンが形成されると同時にペプチドが切断・放出されるこ
とにより、容易に切断して天然ＩＧＦ−１化合物または
類縁体を単離することができる。同様に、ミラー(Mille
r)らの欧州特許公開番号ＥＰ−４４１９５５(１９９１
年８月２１日公開)には、ＩＧＦ−１ペプチドへの正に
荷電したリーダー配列［ここで、このリーダー配列は奇
数のリシン、アルギニンまたはヒスチジン残基からなる
が、次の段階でジアミノペプチダーゼ(好ましい)を用い
て除去しうる１〜３個のリシン残基が好ましい］の添加
が開示されている。スクライバー(Skriver)らの国際公
開番号ＷＯ９２０３４７７(１９９２年３月５日公開)に
は、ジアミノペプチダーゼを用いて分断して成熟ＩＧＦ
−１を生産しうる、ＡlaＧlu−ＩＧＦ−１(ＡlaＧluア
ミノ末端伸長ＩＧＦ−１)の組換え産物が記載されてい
る。

【００２９】ＩＧＦ−１の産生方法の一例が、ケイン(C
ain)らの米国特許第５１０４７９６号(１９９２年４月
１４日登録)に記載されており、ここには、ＩＧＦ−１
を産生する高力価発酵過程が開示されている。ＩＧＦ−
１または類縁体は、グラム陰性菌を用いる組換え操作を
行って産生することもできる。ウォン(Wong)およびビッ
トナー(Bittner)の米国特許第５０８４３８４号に、グ
ラム陰性菌中での遺伝子の発現を伴うＩＧＦ−１の産生
方法が記載されており、該遺伝子の発現とは、lamＢま
たはompFシグナルペプチドコード配列をコードする第１
のＤＮＡ配列がＩＧＦ−１をコードする第２のＤＮＡ配
列に作動的に結合し、その結果としてグラム陰性菌の細
胞周辺腔へＩＧＦ−１が分泌されることである。

【００３０】該ＩＧＦ−１ペプチドは、真核発現系を用
いる組換え操作を行って産生することもできる。グリネ
ル(Grinnell)の欧州特許公開番号ＥＰ−４７８３３３
(１９９２年４月１日公開)には、真核細胞における水泡
性口内炎ウイルスプロモーター(ＶＳＶ)の制御下でのＩ
ＧＦ−１の産生方法が記載されている。真核発現系の利
点は、分泌されたタンパク質産物が得られることであ
る。もしこのような結果を所望するならば、翻訳された
シグナルペプチドをコードする配列に結合するようにＩ
ＧＦ−１のコード配列を修飾することが必要である。一
般に、タンパク質が宿主のペリプラズムまたは培養培地
へ輸送される分泌過程の一部として、シグナルペプチド
は残りのタンパク質部分からタンパク質分解的に切断さ
れる。

【００３１】シグナルペプチドが原核細胞系および真核
細胞系の両方において分泌タンパク質の細胞外分泌を促
進することは当業界においては公知である。大腸菌にお
いて、通常は細胞質ゾル性のタンパク質に異種のシグナ
ルペプチドを付加すると、通常は細胞質ゾル性のタンパ
ク質の細胞外輸送が行われることが明らかにされている
［マクインタイヤ(McIntyre)らの(１９８７年)「J.Biol.
Chem.」,２６２：８４１６〜８４２２］。代替のシグナ
ルペプチド配列が、異種のコード配列と作用しうること
は当業界においては公知である。このような融合タンパ
ク質の組換え産生は、該タンパク質をコードする配列の
５'および転写解読枠内に、宿主有機体に適するシグナ
ルペプチドをコードするＤＮＡ配列を付加することによ
って達成することができる。

【００３２】同様に、ＩＧＦ−１類縁体構造にシグナル
ペプチドを結合しうることは当業界において公知であ
る。本発明の好ましい実施態様においては、使用したシ
グナルペプチドは、宿主細胞系の分泌タンパク質本来の
シグナルペプチドである。さらに、該シグナル配列は完
全合成配列であってもよい。本発明の発現ベクターで宿
主細胞を形質転換し、プロモーターの誘発、形質転換物
の選択または遺伝子の増殖に適当なように変更された慣
例の栄養培地中で培養することができる。温度、ｐＨな
どの培養条件は、発現のために選択された宿主細胞に対
してこれまでに適用された条件であり、当業者には明白
であろう。前述のベクターを用いて細胞を形質転換する
技術は当業界において公知であり、マニアチス(Maniati
s)らの(１９８９年)「モレキュラー・クローニング：ア
・ラボラトリーズ・マニュアル」,コールド・スプリン
グ・ハーバー・プレス,コールド・スプリング・ハーバ
ー研究所,コールド・スプリング・ハーバー,ニューヨー
クまたは「カレント・プロトコルズ・イン・モレキュラ
ー・バイオロジー」,オースベル(Ausubel)ら編,ジョン
・ウイリー・アンド・サンズ,ニューヨーク(１９８９
年)および増補などの一般的参考文献に見出すことがで
きる。

【００３３】原核生物以外にも、酵母培養物などの真核
微生物が使用可能である。幾つかの他の菌株も一般に利
用可能であるが、サッカロミセス・セレビシアエまたは
普通のパン酵母が、最も普通に用いられる真核微生物で
ある。サッカロミセスでの発現には、プラスミドＹＲｐ
７［ＡＴＣＣ−４００５３,スティンコン(Stinchcomb)
らの(１９７９年)「Nature」,２８２：３９；キングス
マン(Kingsman)らの(１９７９年)「Gene」,７：１４
１；チェンパー(Tschemper)らの(１９８０年)「Gene」,
１０：１５７］が、通例、用いられる。バール(Barr)ら
の米国特許第４２７２３３？号(１９８４年１１月１日
登録)には、酵母を用いたヒトＩＧＦ−１の組換え産生
方法が記載されている。この方法は、宿主によって認識
された分泌リーダーおよび切断シグナル配列をもつ固有
の転写解読枠に結合したＩＧＦ−１をコードする構造遺
伝子を有する宿主細胞を成長させ、分泌されたヒトＩＧ
Ｆ−１を培地から単離することを特徴とする。同様に、
ベインおよびキャサイエリの欧州特許公開番号ＥＰ−３
７９３３８(１９９０年７月２５日公開)には、酵母を用
いたヒトＩＧＦ類縁体の組換え産生方法が記載されてい
る。ホーレンベルグ(Hollenberg)およびシュトラッサー
(Strasser)の欧州特許公開番号ＥＰ−３９４５３８(１
９９０年１０月３１日公開)には、ＩＧＦ−１またはそ
の類縁体を産生しうる形質転換されたシュワニオミセス
酵母細胞が記載されている。

【００３４】ＩＧＦ−１ペプチド化合物の製剤は、「ペ
プチド・アンド・プロテイン・ドラッグ・デリバリ
ー」,リー(Lee,V.H.)編,マーセル−デッカー,ニューヨ
ークなどに見出すことができる一般的製剤原理にしたが
って設計すればよい。たとえば、ＩＧＦ−１類縁体(１)
を慣例の医薬用担体および賦形剤と混合し、錠剤、カプ
セル剤、エリキシル剤、懸濁剤、シロップおよびカシェ
剤などの剤形で使用することができる。ＩＧＦ−１類縁
体化合物を含む組成物は、約０.１〜９０重量％の活性
化合物を含有し、さらに一般的には約１０〜３０重量％
を含有する。該組成物には、コーンスターチまたはゼラ
チン、ラクトース、スクロース、微結晶セルロース、カ
オリン、マンニトール、リン酸ジカルシウム、塩化ナト
リウムおよびアルギン酸などの通常の担体および賦形剤
が含まれてよい。本発明製剤に通例用いる崩壊剤として
は、クロスカルメロース、微結晶セルロース、コーンス
ターチ、ナトリウムスターチ、グリコール酸塩およびア
ルギン酸が挙げられる。使用しうる錠剤結合剤として
は、アカシアゴム、メチルセルロース、カルボキシメチ
ルセルロースナトリウム、ポリビニルピロリドン(Povid
one)、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、スクロー
ス、スターチおよびエチルセルロースなどが挙げられ
る。使用しうる滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシ
ウムまたはその他のステアリン酸金属塩、ステアリン
酸、液状シリコン、タルク、ワックス、オイルおよびコ
ロイド状シリカなどが挙げられる。ペパーミント、冬緑
油、チェリーフレーバーなどのフレーバーを用いること
もできる。投与剤形を見かけ上さらに魅力的にするた
め、あるいは製品を見分ける補助とするために、着色剤
を加えるのが望ましい。

【００３５】静脈内(ＩＶ)投与用には、水溶性形状の化
合物(１)を、通例用いられる静脈内投与用液体のひとつ
に溶解し、注入によって投与することができる。このよ
うな液体としては、たとえば生理的食塩水、リンゲル溶
液または５％デキストロース溶液を用いることができ
る。フィンケナウアー(Finkenaur)の米国特許第４１７
９４９７号には、生物学的活性が損失しないようにペプ
チドを安定化するための水溶性ポリサッカライドを含
む、ＩＧＦ−１含有水性医薬組成物が記載されている。
筋肉内投与用には、適当な可溶性塩の形状の化合物(１)
(たとえば塩酸塩など)の滅菌製剤を、発熱物質なしの水
(蒸留水)、生理的食塩水または５％グルコース溶液など
の医薬的希釈剤に溶解し、投与することができる。適当
な不溶性形状の本発明化合物を調製し、水性基剤または
の医薬的に許容しうる油性基剤(たとえばオレイン酸エ
チルなどの長鎖脂肪酸のエステル)に懸濁して投与して
もよい。

【００３６】経口投与用には、蒸留水または脱イオン水
などの希釈剤とともに配合した、適当な塩形状の化合物
(１)(たとえば塩酸塩など)の滅菌製剤が特に有用であ
る。本発明化合物(１)を鼻腔内投与するのが望ましい場
合もある。ＩＧＦ−１の鼻腔内吸収に有用な製剤は、当
業界では公知である。たとえば、日本特許公開番号２−
０７８６３２(１９９０年３月１９日公開)には、ＩＧＦ
−１の鼻腔用製剤が記載されている。このような製剤に
は、０.１〜１０％のＩＧＦ−１および０.０５〜２重量
％のカルボキシビニルポリマーが含まれる。日本特許公
開番号２−０００２１４(１９９０年１月５日公開)に
も、インスリン様成長因子Ｉおよびスクロース脂肪酸エ
ステルを含む小人症治療用の鼻腔用製剤が記載されてい
る。

【００３７】治療上の適用においては、徐々に放出する
製剤として本発明化合物を投与するのが望ましい場合が
ある。本発明化合物(１)をこのような遅延放出製剤とし
て製剤する方法は、当業界においては公知であり、この
問題に関する一般的なテキストに見出すことができる。
たとえば、ギストリッチ(Geistlich)の国際公開番号Ｗ
Ｏ９０−０３８１０(１９９０年４月１９日公開)には、
ＩＧＦ−１および／または他の成長因子を含有する水性
溶液で膨潤したヒドロゲルを含む創傷治癒用の徐放性組
成物が記載されている。これらの組成物は、一般に、シ
ート形状の創傷用包帯として、遊離皮膚移植用の創傷基
剤の調製における外科処置時、形成外科術における分離
植皮片除去後のドナー部位の治療時、および表層の手術
傷の被覆において用いられ、剥き出しの栄養緩徐な組織
が乾燥しきるのを防ぐ。さらに、チュー(Chu)らの米国
特許第４９５０４８３号(１９９０年８月２１日登録)に
は、創傷治癒を促進するのに有用なＩＧＦ−１および／
または他の成長因子を含み、生体活性剤を放出するコラ
ーゲンインプラントが記載されている。

【００３８】さらにまた本発明化合物の単位投与剤形と
して、該化合物、好ましくはその塩を適当な希釈剤に溶
解させた溶液にして滅菌シールしたアンプルが挙げられ
る。単位投与剤形あたりの化合物の濃度は、化合物の特
別な形態およびその溶解度ならびに医師によって処方さ
れた用量によって、約１％〜約５０％の間で変化しう
る。本発明方法を実施するにおいて、化合物(１)は、一
日一回投与または複数回投与にて投与することができ
る。治療養生において、長期間にわたる投与を行っても
よい。一用量当たりの量または全投与量は、疾患の性質
および重篤度、患者の年齢および体調、ならびに患者の
該化合物に対する寛容性などの因子に依存して変化す
る。本発明投与方法は、有効量のＩＧＦ−１類縁体を約
１〜１０００μg／kgの用量で生体に投与することを特
徴とする。好ましい活性化合物の用量は、約１０〜１０
０μg／kgである。ヒト成人に対する代表的な一日当た
りの用量は、約０.５〜５mgである。該治療法の実施に
あたっての簡便な方法は、化合物(１)を静脈内注入にて
投与することである。この操作では、本発明化合物の適
当な塩の滅菌製剤を、５％デキストロース溶液などの生
理的溶液と組み合わせ、得られる溶液をゆっくりと静脈
内注入する。別法として、ピギーバック法で静脈内注入
を行うこともできる。インスリン療法に類似した療法に
おいては、皮下筋肉内注射によって、ＩＧＦ−１および
その類縁体をより簡便に投与することができる。本発明
化合物の別の好ましい製剤は、経皮パッチである。この
ような経皮パッチを用いて、投与量を制御しながら本発
明化合物を継続的または断続的に注入することができ
る。薬剤デリバリーのための経皮パッチの製造法および
使用方法は、当業界においては公知である。継続的、断
続的または要時デリバリーのためのパッチを製造するこ
とができる。

【００３９】前記化合物(１)を含む医薬製剤は、治療効
果のために生体に投与することができる。ＩＧＦ−１
は、そのインスリン様活性および軟骨によるＳＯ₄ ^2-の
取り込みの刺激活性が知られており、細胞におけるタン
パク質およびＤＮＡの合成を増強することができる。し
たがって、ＩＧＦ−１は成長促進物質としても糖尿病の
治療薬としても有用である。ＩＧＦ−１は、ヒトの成長
ホルモン欠乏症の治療、家畜の発育速度の増加、筋肉の
相対的割合の増加もしくは食物変換効率の改良、ヒトの
やけど後,感染または他の外傷などの重篤な異化状態に
おける体タンパク質の損失の抑制、ヒトおよび動物の創
傷治癒の改善、および培養細胞の成長の援助に用いるこ
とができる。本発明化合物は、やけど、骨外傷、感染、
癌、嚢胞性腺維症、デュシェン筋ジストロフィー、骨粗
鬆症、ベッカージストロフィー、常時染色体の劣性ジス
トロフィー、多発性筋炎ならびに他の筋障害およびエイ
ズなどの組織破壊を伴う疾患の治療に用いることができ
る。本発明化合物は、哺乳類のタンパク質蓄積不全の治
療に用いることができる。本発明化合物が有効な疾患と
しては、未熟児性関連欠乏症、成長ホルモン欠乏症、ソ
マトメジン欠乏症、やけど、感染、癌、嚢胞性腺維症、
デュシェン筋ジストロフィー、ベッカージストロフィ
ー、常時染色体の劣性ジストロフィー、多発性筋炎なら
びに他の筋障害に関連するものが挙げられる。本発明化
合物は、赤血球産生の刺激剤として有用であり、したが
って本発明化合物はヒトの発育不全の治療および異化状
態に伴う負の窒素出納の制限に有用である。フロエシュ
(Froesch)らの米国特許第５１０６８３２号には、糸球
体濾過および腎臓血漿流の改善に対するＩＧＦ−１を含
む医薬製剤の使用が記載されており、該製剤は、腎臓疾
患の患者の治療および腎臓疾患治療用の合剤の製造に用
いることができる。本発明のＩＧＦ−１類縁体は同様に
有用である。国際公開番号ＷＯ９１１８６２１−１(１
９９１年１２月１２日公開)には、成長ホルモンとＩＧ
Ｆ−１および／またはその類縁体の組み合わせを用いる
哺乳動物の成長の増加方法が記載されており、このよう
な組み合わせで用いると、ＩＧＦ−１また成長ホルモン
の当量を単独で使用する場合の成長の増加よりも、用量
が少なくてよいことが記載されている。本発明のＩＧＦ
−１類縁体は同様に有用である。このような組み合わせ
治療はまた、成長ホルモン単独で治療すると高インスリ
ン血症／高血糖症がアナボリック効果を引き下げる糖尿
病の治療においても有用である。

【００４０】

【実施例】

実施例１ ＩＧＦ−１のＡドメイン(“Ａ”)(Ｓ−ＳＯ₃ ^-)₄の製造 ダブルカップリングおよび無水酢酸キャッピングサイク
ル、アプライド・バイオシステムズ４３０Ａペプチド合
成機(カリフォルニア州フォスター・シティのアプライ
ド・バイオシステムズから市販されている)、０.６３g
のＢoc−Ａla−ＰＡＭ樹脂を用いてペプチドの固相合成
(０.５ミリモルスケール)を行った。予め作製したヒド
ロキシベンゾトリアゾールエステルを用いてアルギニン
をカップリングさせた。予め作製した対称無水物を用い
て、他のすべてのアミノ酸をＤＣＣとカップリングさせ
た。ディマーチらの米国特許第４８５３２５４号(全記
載内容が本発明の参考文献である)に記載の操作に従っ
て、ペプチジル樹脂を約１mg/mlの濃度でＴＦＡに懸濁
し、次いでジメチルスルフィド(１０容量％)および１２
Ｍ ＨＣｌ(１容量％)を加え、ペプチジル樹脂［Ｍet
(０)含有］を還元した(Ｍet)。１時間反応させた後、サ
ンプルを濾過し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で洗浄し、室温にて減圧乾
燥した。５％メタクレゾールおよび５％パラチオクレゾ
ールを含有する２０mlの無水ＨＦを用いて０℃で１時間
処理し、ペプチドを脱保護し、樹脂から切断した。減圧
蒸留によって揮発物を除去した後、ペプチド／樹脂をエ
チルエーテルで洗浄し、減圧乾燥した。０.２Ｍトリ
ス、０.１Ｍ四チオン酸ナトリウムおよび０.１Ｍ亜硫酸
ナトリウムを含有する５０mlの８Ｍグアニジン塩酸塩を
添加してペプチド／樹脂を亜硫酸分解し、ｐＨ８.６に
て３時間激しく撹拌した。切断された樹脂を濾去した
後、３×８７cmのファルマシアＧ−１０セファデックス
(登録商標Sephadex)カラムおよび０.０５Ｍ重炭酸アン
モニウムを用いてサンプルを脱塩した。所望の画分を集
め、凍結乾燥した。ペプチドを４０mlの０.１Ｍ重炭酸
アンモニウムに溶解し、２.１２×２５cmのデュポンゾ
ルバックス(登録商標Zorbax)Ｃ８逆相ＨＰＬＣカラムに
て、アセトニトリル／０.１Ｍ重炭酸アンモニウムの直
線勾配を用いて精製した。適当な画分を集め、凍結乾燥
した。

【００４１】実施例２ ＩＧＦ−１のＢＣ¹⁰ドメイン(Ｓ−ＳＯ₃ ^-)₃の製造 ダブルカップリングおよび無水酢酸キャッピングサイク
ル、アプライド・バイオシステムズ４３０Ａペプチド合
成機(カリフォルニア州フォスター・シティのアプライ
ド・バイオシステムズから市販されている)、０.６６g
のＢoc−Ａla−ＰＡＭ樹脂を用いてペプチドの固相合成
(０.５ミリモルスケール)を行った。予め作製したヒド
ロキシベンゾトリアゾールエステルを用いてアルギニ
ン、アスパラギンおよびグルタミンをカップリングさせ
た。予め作製した対称無水物を用いて、他のすべてのア
ミノ酸をＤＣＣとカップリングさせた。１０％メタクレ
ゾールを含有する２５mlの無水ＨＦを用いて０℃で１時
間処理し、ペプチドを脱保護し、樹脂から切断した。減
圧蒸留によって揮発物を除去した後、ペプチド／樹脂を
エチルエーテルで洗浄し、減圧乾燥した。０.２Ｍトリ
ス、０.１Ｍ四チオン酸ナトリウムおよび０.１Ｍ亜硫酸
ナトリウムを含有する５０mlの８Ｍグアニジン塩酸塩を
添加してペプチド／樹脂を亜硫酸分解し、ｐＨ８.６に
て３時間激しく撹拌した。切断された樹脂を濾去した
後、３×８７cmのファルマシアＧ−１０セファデックス
カラムおよび０.０５Ｍ重炭酸アンモニウムを用いてサ
ンプルを脱塩した。所望の画分を集め、凍結乾燥した。
ペプチドを４０mlの０.１Ｍ重炭酸アンモニウムに溶解
し、２.１２×２５cmのデュポンゾルバックスＣ８逆相
ＨＰＬＣカラムにて、アセトニトリル／０.１Ｍ重炭酸
アンモニウムの直線勾配を用いて精製した。適当な画分
を集め、凍結乾燥した。

【００４２】実施例３ ジスルフィド結合によるＢＣ¹⁰,Ａ対の形成 チャンス(Chance)らの“組換えＤＮＡ技術および新規な
鎖組み合わせ操作を用いるヒトインスリンの産生”,「P
EPTIDES:Synthesis-Structure-Function」,リッチ(Ric
h,D.H.)およびグロス(gross,E.)編(１９８１年),ピアス
・ケミカル・コーポレイション,ロックフォード,イリノ
イ州,７２１〜７２８頁に記載の操作に実質的に従っ
て、２１mgの凍結乾燥したＢＣ¹⁰Ｓ−スルホン酸塩(実
施例２で製造したもの)を、１８mgのＩＧＦ−１のＡド
メイン(Ｓ−ＳＯ₃ ^-)₄(実施例１で製造したもの)と結合
させた。各ペプチドを約７mg/mlの濃度で０.１Ｍグリシ
ン,ｐＨ１０.５に溶解し、濾過し、４℃に冷却し、次い
で１５５μlの０.１Ｍ ＤＴＴ／０.１Ｍグリシン溶液を
添加して結合させた。４℃で２４時間撹拌した後、ＨＣ
ｌを用いてｐＨを３に調節して反応を停止した。

【００４３】実施例４ ＢＣ¹⁰,Ａの精製 反応を停止した(酸性化による)ペプチド鎖連結サンプル
を２.６×５６cmのファルマシアセファデックスＧ−５
０ＳＦカラムを通して溶離することにより、部分的に
(不完全に)精製し、脱塩した。溶離は１Ｍ ＨＯＡｃを
用い、４℃で行った。選んだ画分を集め、０.４６×２
５cmのデュポンゾルバックスＣ８カラムにて、室温で、
アセトニトリル／０.１Ｍ ＮａＨ₂ＰＯ₄,ｐＨ２.３の直
線勾配を用いてさらに精製した。精製水で所望の画分を
２倍に希釈し、ウォーターズＣ１８セプパク(登録商標S
epPak)(ミルフォード,ＭＡ)を用いて脱塩した。５０％
アセトニトリル中の０.１％ＴＦＡを用いてサンプルを
溶離した。溶出液を凍結乾燥して０.５mgの純粋なタン
パク質を得た。アミノ酸分析およびＦＡＢマススペクト
ロメトリー(ＦＡＢ／ＭＳ)によって該物質を同定した。
ＦＡＢ／ＭＳの結果から分子量６６４３(理論値６６４
４)が得られた。モル単位としてアスパラギン酸を採用
したアミノ酸組成は、下記のとおりである。Ａsp５.０
(５)；Ｔhr２.０(２)；Ｓer４.０(４)；Ｇlu５.２
(５)；Ｐro３.３(３)；Ｇly７.４(７)；Ａla４.２
(４)；１/２Ｃys４.９(６)；Ｖal２.７(３)；Ｍet０.７
３(１)；Ｉle０.６５(１)；Ｌeu５.１(５)；Ｔyr２.９
(３)；Ｐhe４.０(４)；Ｌys１.１(１)；Ａrg５.９
(６)。

【００４４】実施例５ ＩＧＦ−１およびインスリンのラジオレセプターアッセ
イ操作 グルップソ(Gruppso)らの(１９８８年)「Clin.Endocri
n.and Metab.」,３７：１９４〜１９７に教示されてい
る内容に実質的に従って、インスリンおよびＩＧＦ−１
活性の測定を行った。簡単に述べると、３０〜５０μg
のヒト胎盤膜タンパク質を、約１０フェムトモルの［
¹²⁵Ｉ］リガンドとともに、最終容量５００μlの１００
mＭＨＥＰＥＳ,ｐＨ７.８,１２０mＭ ＮａＣｌ,５mＭ
ＫＣｌ,１.２mＭ ＭｇＳＯ₄,８mＭグルコースおよび０.
２５％ＢＳＡ中で４℃にて２４時間インキュベートし
た。細胞採集器(スカトロン(Ｓkatron),リエル(Lier),
ノルウェー)を用い、０.１％ポリエチレンイミンで前処
理したガラスファイバーフィルター上に膜を集める。Ｅ
Ｃ₅₀値決定用のプレフィット／アリフィット(登録商標P
refit/Alifit)ソフトウェアを用いて４パラメーターモ
デルに置換曲線を適合させることによって結合データを
分析した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 リー・ファン アメリカ合衆国60148イリノイ州ロンバー ド、ノース・ロンバード・アベニュー418 番 (72)発明者 ハーラン・ビオール・ロング アメリカ合衆国46032インディアナ州カー メル、エデン・プレイス3624番

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式： ＢＣⁿ,Ａ (１) ［式中、ＢはＩＧＦ−１のＢドメインまたはその機能的
   類縁体；ＣはＩＧＦ−１のＣドメインまたはその機能的
   類縁体；ｎはＣドメイン中のアミノ酸の数であり、約６
   〜約１２；およびＡはＩＧＦ−１のＡドメインまたはそ
   の機能的類縁体である］で示されるＩＧＦ−１類縁体。
2. 【請求項２】 Ｂ、ＣおよびＡがヒトＩＧＦ−１から誘
   導されたものであり、ｎ＝１０である請求項１に記載の
   化合物。
3. 【請求項３】 有効成分として請求項１または２に記載
   のＩＧＦ−１類縁体またはその医薬的に許容しうる塩を
   含み、かつ１種または２種以上のその医薬的に許容しう
   る担体を含む医薬製剤。