JP2002535967A

JP2002535967A - インシュリン様成長因子（ｉｇｆ）ｉ変異体

Info

Publication number: JP2002535967A
Application number: JP2000592320A
Authority: JP
Inventors: ドゥバクイエ，イブ; ロウマン，ヘンリー
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-01-06
Filing date: 2000-01-05
Publication date: 2002-10-29
Also published as: EP1141015A1; US20040033952A1; US20040033951A1; ES2329220T3; JP2005139203A; IL186608A; AU2719400A; CA2356257A1; IL143834A0; JP4467549B2; DE60042550D1; US6509443B1; IL186608A0; CY1109452T1; PT1141015E; JP2007045829A; DK1141015T3; US20030191065A1; US20040023883A1; CA2356257C

Abstract

(57)【要約】ＩＧＦＢＰ-１及びＩＧＦＢＰ-３に選択的に結合するＩＧＦ-Ｉ及びインシュリン変異体が提供される。これらのアゴニスト変異体は、例えば、各々ＩＧＦ-Ｉ及びインシュリンの半減期を向上させる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】（発明の分野）この発明は、インシュリン様成長因子（ＩＧＦ）のアゴニストとして有用な分
子、並びにＩＧＦ様インシュリン分子に関する。より詳細には、これらの分子は
、ＩＧＦ又はインシュリンと一又は複数のＩＧＦ結合性タンパク質との相互作用
を阻害する。例えばこのような分子は、ＩＧＦ又はインシュリンが、例えば高血
糖性、肥満関連、神経性、心臓性、腎性、免疫性、及び同化作用性疾患の治療の
ために使用される任意の方法において使用できる。

【０００２】（背景及び関連技術の説明）インシュリン様成長因子Ｉ及びＩＩ（各々、ＩＧＦ-Ｉ及びＩＩ）は、細胞増
殖、細胞分化、細胞死の阻害、及びインシュリン様活性を含む多数の効果をイン
ビボで媒介する（Clark及びRobinson, Cytokine Growth Factor Rev., 7: 65-80
(1996); Jones及びClemmons, Endocr. Rev., 16: 3-34 (1995)に概説されてい
る）。これらの分裂促進的及び代謝的反応の殆どは、インシュリンレセプターに
密接に関連するα_２β_２-ヘテロテトラマーであるＩＧＦ-Ｉレセプターの活性化
によって開始される（McInnes及びSykes, Biopoly., 43: 339-366 (1998); Ullr
ich等, EMBO J., 5: 20503-2512 (1986)）。両方のタンパク質がチロシンキナー
ゼレセプタースーパーファミリーのメンバーであり、共通の細胞内シグナル伝達
カスケードを有する（Jones及びClemmons, 上掲）。ＩＧＦ-インシュリンハイブ
リッドレセプターが単離されたが、それらの機能は不明である。ＩＧＦ-Ｉ及び
インシュリンレセプターはそれらの特異的なリガンドにナノモル親和性で結合す
る。ＩＧＦ-Ｉ及びインシュリンは、それら各々の非同系レセプターと交差反応
するが１００−１０００倍低い親和性である（Jones及びClemmons, 上掲）。Ｉ
ＧＦ-Ｉレセプターの細胞外部分の一部を描写する結晶構造が最近報告された（G
arrett等, Nature. 394: 395-399 (1998)）。

【０００３】インシュリンとは異なり、ＩＧＦ-Ｉの活性及び半減期は６個のＩＧＦ-Ｉ結合
性タンパク質（ＩＧＦＢＰ-１−６）により、そしておそらく関連性のより薄い
クラスのタンパク質によって更に改変される（Jones及びClemmons, 上掲; Baxte
r等, Endocrinology, 139: 4036 (1998)）。ＩＧＦＢＰは、それらが可溶性か細
胞膜結合性かによって、ＩＧＦ活性を阻害又は増強する（Bach及びRechler, Dia
betes Review, 3: 38-61 (1995)）。ＩＧＦＢＰは、種々の親和性及び特異性で
ＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩに結合する（Jones及びClemmons, 上掲; Bach及びRec
hler, 上掲）。例えば、ＩＧＦＢＰ-３は類似の親和性でＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-
ＩＩに結合するが、ＩＧＦＢＰ-２及びＩＧＦＢＰ-６はＩＧＦ-ＩＩに対してそ
れらがＩＧＦ-Ｉに結合するよりも非常に高い親和性で結合する（Bach及びRechl
er, 上掲; Oh等, Endocrinology, 132, 1337-1344 (1993)）。

【０００４】古典的なＩＧＦＢＰは２２−３１ｋＤａの範囲の分子量を持ち、それらの保存
されたアミノ-及びカルボキシ-末端ドメインに合計１６−２０のシステインを含
む（Bach及びRechler, 上掲; Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8: 45-
62 (1997); Martin及びBaxter, Curr. Op. Endocrinol. Diab., 16-21 (1994)）
。両方のシステインリッチ領域を連結している中心ドメインは弱く保存されるの
みで、ＩＧＦＢＰ特異的プロテアーゼのための切断部位を含んでいる（Chernaus
ek等, J. Biol. Chem., 270: 11377-11382 (1995); Clemmons, 上掲; Conover,
Prog. Growth Factor Res., 6: 310-309 (1995)）。ＩＧＦＢＰのさらなる調節
は、リン酸化及びグリコシル化によって達成されうる（Bach及びRechler, 上掲;
Clemmons, 上掲）。ＩＧＦＢＰファミリーの任意の無処理のメンバーについて
利用可能な高分解能構造は存在しない。しかしながら、ＩＧＦ結合活性を保持す
るＩＧＦＢＰ-５からの２つのＮ-末端断片のＮＭＲ構造が最近報告された。（Ka
lus等, EMBO J., 17: 6558-6572 (1998)）。

【０００５】ＩＧＦ-Ｉは一本鎖の７０アミノ酸タンパク質であり、プロインシュリンと高
い相同性を持つ。インシュリンスーパーファミリーの他のメンバーとは異なり、
ＩＧＦのＣ領域は翻訳後にタンパク質分解的に除去されない。ＩＧＦ-Ｉ（Cooke
等, Biochemistry, 30: 5484-5491 (1991); Hua等, J. Mol. Biol., 259: 297-3
13 (1996)）、ミニ-ＩＧＦ-Ｉ（Ｃ鎖を欠く操作変異体；DeWolf等, J. Mol. Bio
l., 5: 2193-2202 (1996)）、及びＩＧＦ-ＩＩ（Terasawa等, EMBO J., 13: 559
0-5597 (1994); Torres等, J. Mol. Biol., 248: 385-401 (1995)）の溶液ＮＭ
Ｒ構造が報告された。ＩＧＦ-Ｉ上の異なるエピトープがレセプター及び結合性
タンパク質に結合することは一般に認められている。動物モデルにおいて、レセ
プター不活性ＩＧＦ変異体が結合性タンパク質からの内因性ＩＧＦ-Ｉと置換で
き、インビボで全体としてのＩＧＦ-Ｉ効果を生ずることが示された（Loddick等
, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1894-1898 (1998); Lowman等, Biochemist
ry, 37: 8870-8878 (1998)）。残基Ｙ２４、Ｙ２９、Ｙ３１、及びＹ６０はレセ
プター結合に関係しているが、そのＩＧＦ変異体もＩＧＦＢＰに結合する（Bayn
e等, J. Biol. Chem., 265: 15648015652 (1990); Bayne等, J. Biol. Chem., 2
64: 11004-11008 (1989); Cascieri等, Biochemistry, 27: 3229-3233 (1988):
Lowman等, 上掲）。さらに、ヒトＩＧＦ-ＩのＣ領域の残基２８−３７が４残基グリシン架橋で置
換された(1-27, gly⁴, 38-70)-ｈＩＧＦ-Ｉと命名された変異体が、ＩＧＦＢＰ
には結合するがＩＧＦレセプターには結合しないことが発見された（Bar等, End
ocrinology, 127: 3243-3245 (1990)）。

【０００６】多数の突然変異誘発実験がＩＧＦ-Ｉ上のＩＧＦＢＰ結合性エピトープの特徴
付けのためになされてきた（Bagley等, Biochemm. J., 259: 665-671 (1989); B
axter等, J. Biol. Chem., 267: 60-65 (1992); Bayne等, J. Biol. Chem., 263
: 6233-6239 (1988); Clemmons等, J. Biol. Chem., 265: 12210-12216 (1990);
Clemmons等Endocrinology, 131: 890-895 (1992); Oh等, 上掲）。要するに、
Ｎ-末端残基３及び４及び残基８−１７を含む螺旋領域がＩＧＦＢＰへの結合に
とって重要であることがわかった。さらに、ＩＧＦＢＰ-１、-２及び-５への結
合において残基４９−５１を含むエピトープが同定された（Clemmons等, Endocr
inology, 上掲, 1992）。さらに、最初の３つのＮ-末端アミノ酸を欠くＩＧＦ-
Ｉの天然発生の切断形態（des81-3)-ＩＧＦ-Ｉと呼ばれる）が、ＩＧＦＢＰ-３
に２５倍低い親和性で結合することが示された（Heding等, J. Biol. Chem., 27
1: 13948-13952 (1996); 米国特許第5,077,276号; 同5,164,370号; 同5,470,828
号）。

【０００７】Ｎ-末端螺旋において露出されたアミノ酸残基の結合性寄与を特徴づける試み
において、ＩＧＦ-Ｉの幾つかのアラニン変異体が構築された（Jansson等, Bioc
hemistry, 36: 4108-4117 (1997)）。しかしながら、これらの変異体タンパク質
の円二色性スペクトルは、野生型ＩＧＦ-Ｉに比較して構造的な変化を示し、Ｉ
ＧＦＢＰ結合性寄与を変異した側鎖に明確に割り当てることを困難にした。異な
るアプローチが極く最近の研究で行われ、そこではＩＧＦ-Ｉ上のＩＧＦＢＰ-１
結合性エピトープが異核ＮＭＲスペクトル法によってプローブされた（Jansson
等, J. Biol. Chem., 273: 24701-24707 (1998)）。著者はさらに、残基Ｒ３６
、Ｒ３７及びＲ５０がＩＧＦＢＰ-１への結合に機能的に含まれると同定した。

【０００８】他のＩＧＦ-Ｉ変異体も開示されている。例えば、特許文献において、WO 96/3
3216は標準品のＩＧＦ-Ｉの残基１−６９を持つ切断変異体を記載している。EP
742,228は、天然発生の省略されたCドメインを持つ一本鎖ＩＧＦ-Ｉの誘導体で
ある二本鎖ＩＧＦ-Ｉスーパーアゴニストを開示している。ＩＧＦ-Ｉ類似物は式
：ＢＣ^ｎ,Ａであり、ここでＢはＩＧＦ-ＩのＢドメイン又はその機能的類似物で
あり、ＣはＩＧＦ-ＩのＣドメイン又はその機能的類似物であり、ｎはＣドメイ
ンのアミノ酸数であって約６から約１２までであり、ＡはＩＧＦ-ＩのＡドメイ
ン又はその機能的類似物である。

【０００９】さらに、Cascieri等, Biochemistry, 27: 3229-3233 (1988)はＩＧＦ-Ｉの４
つの変異体を開示し、そのうち３つは１型ＩＧＦレセプターに対して低下した親
和性を持つ。これらの変異体は：(Phe²³, Phe²⁴, Tyr²⁵)ＩＧＦ-Ｉ（１及び２型
ＩＧＦ及びインシュリンレセプターへの親和性においてヒトＩＧＦ-Ｉと等価）
、(Leu²⁴)ＩＧＦ-Ｉ及び(Ser²⁴)ＩＧＦ-Ｉ（ヒト胎盤１型ＩＧＦレセプター、胎
盤インシュリンレセプター、及びラット及びマウス細胞の１型ＩＧＦレセプター
に対して低い親和性を持つ）、及びデスオクタペプチド(Leu²⁴)ＩＧＦ-Ｉ（位置
２４における芳香性の喪失がｈＩＧＦ-Ｉのカルボキシ末端Ｄ領域の欠失と組み
合わされており、１型レセプターには(Leu²⁴)ＩＧＦ-Ｉより低い親和性、インシ
ュリンレセプターには高い親和性を持つ）である。これら４つの変異体は、ヒト
血清結合性タンパク質に対して正常な親和性を持つ。

【００１０】 Bayne等, J. Biol. Chem., 264: 11004-11008 (1988)は、ＩＧＦ-Ｉの３つの
構造的類似物：ＩＧＦ-Ｉのカルボキシ-末端８アミノ酸Ｄ領域を欠く(1-62)ＩＧ
Ｆ-Ｉ；ＩＧＦ-ＩのＣ領域の残基２８−３７が４残基グリシン架橋で置換された
(1-27, Gly⁴, 38-70)ＩＧＦ-Ｉ；及びＣ領域グリシン置換及びＤ領域欠失を持つ
(1-27, Gly⁴, 38-62)ＩＧＦ-Ｉを開示している。Peterkofsky等, Endocrinology
, 128: 1769-1779 (1991)は、Bayne等, 上掲, Vol. 264のＧｌｙ^４変異体を用い
たデータを開示している。米国特許第5,714,460号は、神経障害の治療のために
ＩＧＦ-Ｉ又はＩＧＦ-Ｉの活性濃度を上昇させる化合物を使用することに言及し
ている。 Cascieri等, J. Biol. Chem., 264: 2199-2202 (1989)は、３つのＩＧＦ-Ｉ類
似物を開示し、そこでは、ＩＧＦ-ＩのＡ領域の特定の残基がインシュリンＡ鎖
の対応する残基で置換されている。これらの類似物は：(Ile⁴¹, Glu⁴⁵, Gln⁴⁶,
Thr⁴⁹, Ser⁵⁰, Ile⁵¹, Ser⁵³, Tyr⁵⁵, Gln⁵⁶)ＩＧＦ-Ｉという、残基４１がトレ
オニンからイソロイシンに変化し、Ａ領域の残基４２−５６が置換されたＡ鎖変
異体；(Thr⁴⁹, Ser⁵⁰, Ile⁵¹)ＩＧＦ-Ｉ；及び(Tyr⁵⁵, Gln⁵⁶)ＩＧＦ-Ｉである
。 WO 94/04569は、ＩＧＦ-Ｉに結合でき、ＩＧＦ-Ｉの生物学的活性を向上させ
ることができる天然ＩＧＦＢＰ以外の特異的結合性分子を開示している。1998年
10月15日に発行されたWO 98/45427及びLowman等, 上掲は、ファージディスプレ
ーで同定されたＩＧＦ-Ｉアゴニストを開示している。また、WO 97/39032はＩＧ
ＦＢＰのリガンド阻害剤及びそれらの使用法を開示している。

【００１１】市販されているヒトインシュリンには様々な形態があり、作用期間及び作用開
始において異なるが、天然ヒト配列を有している。Jens Brange, Galenics of I
nsulin, The Phisico-chemical and Pharmaceutical Aspects of Insulin and I
nsulin Preparations (Springer-Verlag, New York, 1987), page 17-40。レギ
ュラーインシュリンは透明な中性溶液であり、四量体インシュリンを含有する。
それは作用期間が短く、作用開始は注入の０．５時間以内に起こり、作用期間は
６−８時間である。イソフェン・インシュリンとも呼ばれるＮＰＨ(national Pr
otamine Hagedorn)インシュリンは、インシュリン−プロ他明複合体の結晶懸濁
物である。これらの結晶は、インシュリン四量体当たりに約０．９モルのプロ他
明及び２個の亜鉛を含有する。Dodd等, Pharmaceutical Research, 12: 60-68 (
1993)。ＮＰＨ-インシュリンは中間作用のインシュリンであり；その作用開始は
１．５時間以内であり、作用期間は１８−２６時間である。７０／３０インシュ
リンは７０％ＮＰＨ-インシュリン及び３０％通常インシュリンからなる。また
、セミレンテ(Semilente)インシュリン（亜鉛インシュリン複合体の非晶質沈殿
物）、ウルトラレンテ(Ultralente)インシュリン（亜鉛インシュリン結晶懸濁物
）、及びレンテ(Lente)インシュリン（非晶質及び結晶質インシュリン粒子の３
：７混合物）もある。利用可能な種々の型のインシュリンの中で、ＮＰＨ-、７
０／３０、及びレギュラーインシュリンが最も広く使用されるインシュリンであ
り、各々１９９６年のインシュリン処方の３６％、２８％、及び１５％である。

【００１２】組換えＤＮＡ技術及びペプチド化学の使用は、広範なアミノ酸置換を持つイン
シュリン類似物の生成を可能にし、インシュリンの薬物動態の改変を目的として
インシュリンのＩＧＦ様修飾がなされた（Brang等, Nature, 333: 679 (1988);
Kang等, Diabetes Care, 14: 571: (1991); DiMarchi等, "Synthesis of fast-a
cting insulin analog based upon structural homology with insulin-like gr
owth factor-I", in: Peptides: Chemistry and Biology, Proceedings of the
Twelfth American Peptide Symposium, J.A. Smith and J.E. River, eds. (ESC
OM, Leiden, 1992), pp. 26-28; Weiss等, Biochemistry, 30: 7373 (1991); Ho
wey等, Diabetes, 40: (Supp 1) 423A (1991); Slieker及びSundell, Diabetes,
40: (Supp 1) 168A (1991); Cara等, J. Biol. Chem., 265: 17820 (1990); Wo
lpert等, Diabetes, 39: (Supp 1) 140A (1990); Bornfeldt等, Diabetologia,
34: 307 (1991); Drejer, Diadetes/Metabolism Reviews, 8: 259 (1992); Slie
ker等, Adv. Experimental Med. Biol., 343: 25-32 (1994)）。そのようなイン
シュリン類似物の一例は、Humalog(商品名)インシュリン（速効性単量体インシ
ュリン溶液、インシュリンＢ鎖上のＬｙｓ(Ｂ２８)及びＰｒｏ(Ｂ２９)アミノ酸
の変換による）であり、最近Eli Lilly and Companyにより市場に導入された。
臨床試験及び市場における最近のインシュリン変異体の概説は、Barnett及びOwe
ns, Lancet, 349: (1997)に見られる。

【００１３】上掲のSlieker等, 1994は、種々のＩＧＦ及びインシュリン変異体のＩＧＦＢ
Ｐ、ＩＧＦレセプター、及びインシュリンレセプターへの結合性を記載し、特に
、(Phe³⁸, Arg³⁹, Sre⁴⁰)インシュリン、(Glu⁴, Gln¹⁶, Phe¹⁷)インシュリン、
及び(Glu⁴, Gln¹⁶, Phe¹⁷, Phe³⁸, Arg³⁹, Sre⁴⁰)インシュリン（ここで用いる
成熟インシュリンの番号付けはＢ鎖における連続した番号付け（残基１−３０）
、及びそれに続くＡ鎖における連続した番号付け（残基３１−５１）からなり；
これらは各々プロインシュリンの１−３０と番号付けされた残基及び残基６６−
８６に対応する。Ｆｉｇ４参照）を含む幾つかの変異の組み合わせを通してイン
シュリンにＩＧＦＢＰ結合性を付与することを試みている。しかしながら、これ
らの変異体のＩＧＦ結合性タンパク質へ結合性については弱い親和性しか見られ
ず、インシュリン−レセプター親和性は野生型インシュリンに比較して低下して
いた（Slieker等, 上掲）。

【００１４】以前の報告はインシュリンの結合性タンパク質への如何なる親和性も発見でき
なかったが、一つのグループがBIAcore(商品名)実験による２５１+/-９１ｎＭの
インシュリンのＩＧＦＢＰ-３に対する弱い親和性を測定した（Heding等, 上掲
）。これら全ての努力にもかかわらず、ＩＧＦ-Ｉ上のＩＧＦＢＰ結合性エピトー
プの視野は散在的で低分解能のままであった。以前の研究は、同族インシュリン
のＩＧＦ-Ｉ及びタンパク質切断物（例えば、des(1-3)-ＩＧＦ-Ｉ）への挿入を
含むことが多く、誤った折り畳みと真正の結合性決定基との間を区別していなか
った。これら全ての研究結果の組み合わせは、変異ＩＧＦ形態とＩＧＦＢＰとの
複合体形成の分析に、放射線標識リガンド結合アッセイからバイオセンサー分析
までの範囲の異なる技術が使用されていたという事実によって更に複雑にされて
いた。この分野には、治療又は診断目的のために、ＩＧＦ又はインシュリンアゴニス
トとして作用する分子、及びＩＧＦ結合性タンパク質と高い親和性及び特異性で
結合する分子に対する必要性が存在する。

【００１５】（発明の概要）従って、一実施態様では、本発明は、天然配列ヒトＩＧＦ-Ｉの位置３、４、
５、７、１０、１４、１７、２３、２４、２５、４３、４９又は６３のアミノ酸
、あるいはそれらのアミノ酸と位置１２又は１６又は１２と１６の両方との組み
合わせ、あるいはそれらの任意の組み合わせが、前記位置７の任意のアミノ酸又
は前記位置７以外の任意の位置のアラニン、グリシン、又はセリン残基で置換さ
れたＩＧＦ-Ｉ変異体を提供する。

【００１６】一つの好ましい実施態様では、前記位置１６及び４９のアミノ酸が置換されて
ＩＧＦＢＰ-３への結合剤が得られる。ＩＧＦＢＰ-３への結合剤を得る他の好ま
しい実施態様は、位置３及び７における変異を含む変異体である。またさらに好ましい実施態様では、前記位置２４のチロシンがロイシンでさら
に置換されるか又は前記位置３１のチロシンがアラニンで置換されるか、又はそ
の両方が置換されて、レセプター結合性が破壊又は防止される。最も好ましくは
、前記位置２４及び３１の両方のチロシンが置換される。他の実施態様では、本発明は長い半減期のＩＧＦ様インシュリンを提供し、そ
こでは、天然配列ヒトプロインシュリンの位置１のフェニルアラニンが欠失され
るか（des(1)-プロインシュリン）、又は天然配列ヒトプロインシュリンの位置
４のグルタミンがグルタミン酸で置換されるか、又は天然配列ヒトプロインシュ
リンの位置１７のロイシンがフェニルアラニンで置換されるか、又は天然配列ヒ
トプロインシュリンの位置２５のフェニルアラニンがチロシンで置換されるか、
又は天然配列ヒトプロインシュリンの位置２６のチロシンがフェニルアラニンで
置換されるか、又は天然配列ヒトプロインシュリンの位置７３のトレオニンがフ
ェニルアラニンで置換されるか、又はこれらの任意の組み合わせが含まれる。

【００１７】好ましくは、ＩＧＦ様インシュリンについて、前記位置４、１７、２６及び／
又は７３のアミノ酸が置換されてＩＧＦＢＰ-１特異的変異体が生成されるか、
又は位置１のアミノ酸が欠失され位置２５、２６及び／又は７３のアミノ酸が置
換されてＩＧＦＢＰ-３特異的変異体が生成される。また他の実施態様では、本発明はＩＧＦ様インシュリンが提供され、そこでは
、位置１のフェニルアラニンが欠失されるか、又は天然配列ヒト成熟インシュリ
ンの位置４のグルタミンがグルタミン酸で置換されるか、又は天然配列ヒト成熟
インシュリンの位置１７のロイシンがフェニルアラニンで置換されるか、又は天
然配列ヒト成熟インシュリンの位置２５のフェニルアラニンがチロシンで置換さ
れるか、又は天然配列ヒト成熟インシュリンの位置２６のチロシンがフェニルア
ラニンで置換されるか、又は天然配列ヒト成熟インシュリンの位置３８のトレオ
ニンがフェニルアラニンで置換されるか、又はこれらの任意の組み合わせが含ま
れる（注：ここで使用される成熟インシュリンの番号付けは、Ｂ鎖における連続
した番号付け（残基１−３０）、及びそれに続くＡ鎖の番号付け（残基３１−５
１）からなる）。

【００１８】好ましい実施態様では、上記成熟インシュリンの位置４、１７、２６及び３８
のアミノ酸が置換されて、ＩＧＦＢＰ-１特異性の変異体が生成される。他の実施態様では、上記成熟インシュリンの位置１のアミノ酸が欠失され、上
記成熟インシュリンのアミノ酸が位置２５、２６及び３８で置換されて、ＩＧＦ
ＢＰ-３特異性の変異体を生成する。

【００１９】またここでは、上記のペプチドの一つを担体、好ましくは製薬的に許容される
担体中に含んでなる組成物も提供される。好ましくは、この組成物は無菌である
。これらのペプチドの用途は、外因性又は内因性のＩＧＦ又はインシュリンの生
物学的活性の少なくとも１つを解放又は亢進する全ての用途を含む。それらは、
ＩＧＦ-Ｉ又はインシュリン等のＩＧＦが有用な状態の治療、阻止、又は防止、
即ち、下記のような、有効量のペプチドを哺乳動物に投与することによるＩＧＦ
疾患又はインシュリン疾患の治療で使用できる。

【００２０】さらに、本発明では、哺乳動物における生物学的に活性なＩＧＦ又はインシュ
リンの血清及び組織レベルを向上させる方法が提供され、それは当該哺乳動物に
上記のペプチドの有効量を投与することを含んでなる。哺乳動物は好ましくはヒ
トである。また好ましいのは、ペプチドがＩＧＦ-Ｉに類似している場合、それ
を好ましくは体重増加を生ずるのに有効な量を投与することにより哺乳動物にお
ける同化作用が向上されることである。さらに好ましいのは、ペプチドが投与さ
れた後に血糖コントロールがなされることである。本発明のペプチドは、単独で、又は他の試薬、例えばＧＨ、ＧＨ放出ペプチド
（ＧＨＲＰ）、ＧＨ放出因子（ＧＨＲＦ）、ＧＨ放出ホルモン（ＧＨＲＨ）、Ｇ
Ｈ分泌促進物質、ＩＧＦ、ＩＧＦＢＰと組み合わせたＩＧＦ、ＩＧＦＢＰ、ＧＨ
結合性タンパク質（ＧＨＢＰ）と組み合わせたＧＨ、インシュリン、又は血糖降
下薬（下記の定義のチアゾリジンジオンなどのインシュリン感作剤を含む）とと
もに投与することができる。

【００２１】本発明の他の態様では、哺乳動物における血糖コントロールをする方法が提供
され、それは当該哺乳動物に一又は複数の上記ペプチドの有効量を投与すること
を含む。好ましくは、ペプチドは哺乳動物における血漿インシュリン分泌及び血
液グルコースレベルも低下させる。また好ましくは、哺乳動物は糖尿病などの高
血糖疾患に罹患している。この方法は、当該哺乳動物に血糖降下薬又はインシュ
リンの有効量を投与することを更に含むことができる。また、哺乳動物における生物学的に活性なＩＧＦの血清及び組織レベルを上昇
させる方法、又は哺乳動物における同化作用を向上させる方法、又は哺乳動物に
おける糖血症を抑制する方法も提供され、それらは当該哺乳動物に、ここのペプ
チドを含有する組成物の有効量を投与することを含む。また本発明では、本発明のペプチドを含有する製薬組成物を収容した容器及び
当該組成物の利用を使用者に指示する指示書を具備するキットも考慮される。こ
のキットは、場合によっては、ＧＨ、ＧＨＲＰ、ＧＨＲＦ、ＧＨＲＨ、ＧＨ分泌
促進剤、ＩＧＦ、ＩＧＦＢＰと複合させたＩＧＦ、ＩＧＦＢＰ、ＧＨＢＰに複合
させたＧＨ、インシュリン、又は血糖降下薬を収容した容器を更に具備してもよ
い。

【００２２】本発明のペプチドの同定のために、ヒトＩＧＦ-Ｉを繊維状ファージミド粒子
上に一価で表示させ（米国特許第5,750,373号及び同5,821,047号）、その完全な
アラニンスキャンニング突然変異誘発（Cunningham及びWells, Science,244:108
1-1085(1989); 米国特許第5,834,250号)をファージディスプレー（「ターボ-ala
スキャン」）（Cunningham等, EMBO J., 13: 2508-2515 (1994); Lowman, Metho
ds Mol. Biol., 87: 249-264 (1998)）により実施した。変異体ＩＧＦファージミ
ドを、ＩＧＦ-Ｉ上のＩＧＦＢＰ-１及びＩＧＦＢＰ-３に対する結合性決定基の
マッピングに使用した。アラニンスキャニングは、これらの結合性タンパク質に
対する特異性決定基を明らかにし、結合性タンパク質特異的ＩＧＦ変異体又はＩ
ＧＦＢＰ-１又はＩＧＦＢＰ-３に特異的に結合するインシュリン変異体を生成し
て、それらのクリアランス半減期を調節し、タンパク質分解的安定性を向上させ
、又はそれらのインビボでの組織分布を改変する。これらの変異体は、結晶構造
が最近報告されたＩＧＦレセプター（Garrett等, 上掲）に対する機能的結合部
位のマッピングにも有用である。さらに、種々のＩＧＦ結合性抗体又はＩＧＦ-
Ｉに結合する他のペプチド又はタンパク質のエピトープのマッピングも興味の対
象となりうる。

【００２３】（好ましい実施態様の説明）Ａ．定義ここで使用される「哺乳動物」は哺乳類に分類される任意の動物を意味し、ヒ
ト、家畜及び農業用動物、動物園、スポーツ、又はペット動物、例えばイヌ、ウ
マ、ネコ、ヒツジ、ブタ、ウシなどを含む。好ましくは、ここでの哺乳動物はヒ
トである。用語「非成熟」は、周産期年齢（出生時低体重乳児など）から思春期
までの哺乳動物を意味し、後者は、全成長潜在能力に達していないものである。ここで使用される「ＩＧＦ」は、天然のインシュリン様成長因子-Ｉ及び天然
インシュリン様成長因子-ＩＩ並びにそれらの天然変異体、他にdes(1-3)ＩＧＦ-
Ｉとしても知られる脳ＩＧＦ（brain IGF)を意味する。

【００２４】ここで使用される場合の「ＩＧＦ-Ｉ」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及び
ヒトを含む任意の供給源、好ましくはヒトからのインシュリン様成長因子-Ｉを
指し、外因性投与に言及する場合は、天然、合成、又は組換えの任意の供給源か
らである。「天然配列」ヒトＩＧＦ-Ｉは、Ｆｉｇ４（配列番号：１）に示され
る配列であり、例えば、、1987年8月5日発行のEP 230,869; 1984年12月19日発行
のEP 128,733; 又は1988年10月26日発行のEP 288, 451に記載された方法によっ
て調製される。より好ましくは、この天然配列ＩＧＦ-Ｉは、組換え生産され、
ジェネンテク，インク．，サウスフランシスコ，カリフォルニアから臨床実験
用に入手可能である。ここで使用される「ＩＧＦ-ＩＩ」は、ウシ、ヒツジ、ブタ、ウマ、及びヒト
を含む任意の供給源、好ましくはヒトからのインシュリン様成長因子-ＩＩを指
し、外因性投与に言及する場合は、天然、合成、又は組換えの任意の供給源から
である。これは、例えばEP 128,733に記載された方法によって調製できる。

【００２５】「ＩＧＦＢＰ」又は「ＩＧＦ結合性タンパク質」は、循環性であるか否かによ
らず（即ち、血清又は組織中）、ＩＧＦ-Ｉ又はＩＧＦ-ＩＩに通常は結合又は接
着又は複合体形成するタンパク質又はポリペプチドを指す。このような結合性タ
ンパク質はレセプターを含まない。この定義は、ＩＧＦＢＰ-１、ＩＧＦＢＰ-２
、ＩＧＦＢＰ-３、ＩＧＦＢＰ-４、ＩＧＦＢＰ-５、ＩＧＦＢＰ-６、Ｍａｃ２５
（ＩＧＦＢＰ-７）、及びプロスタサイクリン刺激因子（ＰＳＦ）又は内皮細胞
特異的分子（ＥＳＭ-１）、並びにＩＧＦＢＰに高い相同性を持つ他のタンパク
質を包含する。Ｍａｃ２５は、例えば、Swisshelm等, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 92: 4471-4476 (1995)及びOh等, J. Biol. Chem., 271: 30322-30325 (199
6)に記載されている。ＥＳＭ-１は、Lassalle等, J. Biol. Chem., 271: 20458-
20464 (1996)に記載されている。他の同定されたＩＧＦＢＰについては、例えば
、1990年6月27日発行のEP 375,438; 1990年5月23日発行のEp 369,943; 1989年10
月5日発行のWO 89/09268; Wood等, Molecular Endocrinilogy, 2: 1176-1185 (1
988); Brinkman等, The EMBO J., 7: 2417-2423 (1988); Lee等, Mol. Endocrin
ol., 2: 404-411 (1988); Brewer等, BBRC, 152: 1289-1297 (1988); 1988年12
月7日発行のEP 294,021; Baxter等, BBRC, 147: 408-415 (1987); Leung等, Nat
ure, 330: 537-543 (1987); Martin等, J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986
); Baxter等, Comp. Biochem. Physiol., 91B: 229-235 (1988); 1989年9月21日
発行のWO 89/08667; 1989年10月19日発行のWO 89/09792; Binkert等, EMBO J.,
8: 2491-2502 (1989)を参照のこと。

【００２６】用語「体液」は、哺乳動物、好ましくはヒトからの液体の生物学的試料を意味
する。このような液体は、血清、血漿、リンパ液、滑液、卵胞液、精液、羊水、
乳、全血、尿、脳脊髄液、唾液、痰、涙、汗、粘液、組織培養培地、組織抽出液
、及び細胞抽出液を含む。ここで使用される「ヒトＩＧＦレセプター」は、ヒトに見られるＩＧＦに対す
る任意のレセプターであり、ヒトＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩの両方が結合するヒ
トにおける１型及び２型ＩＧＦレセプター、例えば胎盤１型ＩＧＦ-Ｉレセプタ
ーなどを含む。「ペプチド」は、ＩＧＦ-Ｉアゴニスト、ＩＧＦ-Ｉ変異体、インシュリンアゴ
ニスト、インシュリン変異体、又は少なくとも２つのアミノ酸を有するＩＧＦ様
インシュリンを含み、少なくとも約５０のアミノ酸を持つポリペプチドを含む。
この定義はペプチド変異体、それらの塩、又は光学異性体を包含する。

【００２７】ここで使用される「インシュリン」は、任意の種からのインシュリンの任意の
形態であり、天然又は合成又は組換えで誘導されるものである。例えば、レギュ
ラーインシュリン、ＮＰＨインシュリン、７０／３０インシュリン、セミレンテ
インシュリン、ウルトラレンテインシュリン、又はレンテインシュリンとして処
方してもよい。インシュリンがＩＧＦ様インシュリン又はここのＩＧＦ-Ｉ変異
体とともに投与される場合、それは好ましくはレギュラーインシュリン、ＮＰＨ
インシュリン、７０／３０インシュリン、又はHUMOLOG(商品名)ブランドのイン
シュリンである。

【００２８】「プロインシュリン」は、Ａ、Ｂ、及びＣペプチドを含むインシュリンを意味
し、その天然配列をＦｉｇ４（配列番号：２）に示す。プロインシュリンの「成
熟インシュリン」への変換は、Ｒ３１からＲ６５までの領域の切除によって起こ
る。得られた成熟インシュリンのアミノ-末端ペプチドはＢ鎖と呼ばれ、カルボ
キシ-末端ペプチドはＡ鎖と呼ばれる。鎖は２つの鎖間ジスルフィドによって互
いに保持されている。成熟インシュリンは可溶性タンパク質である。ここの成熟
インシュリン変異体の番号付けは、Ｂ鎖における連続した番号付け（残基１−３
０）に次いでＡ鎖における連続した番号付け（残基３１−５１）からなる。「天
然配列」ヒトプロインシュリンはＦｉｇ４に示す配列（配列番号：２）を持ち、
「天然配列」ヒト成熟インシュリンはＦｉｇ４に示す配列（配列番号：３）を持
つ。「ＩＧＦ様インシュリン」は、下記の「ＩＧＦ疾患」及び下記の形態において
列挙するような生物学的活性を含むＩＧＦ-Ｉの生物学的活性の少なくとも一つ
を擬態するペプチドである。

【００２９】「ＩＧＦ疾患」は、ＩＧＦでの治療から恩恵を受ける任意の状態であり、限定
されないが、例えば、肺疾患、下記のような高血糖疾患、腎臓疾患、例えば急性
及び慢性腎不全、末期慢性腎不全、糸球体腎炎、間質性腎炎、腎盂腎炎、糸球体
硬化症、例えば、糖尿病患者におけるキンメルスティール‐ウィルソン及び腎臓
移植後の腎不全、糖尿病、ＧＨ-不全、ターナー症候群、ラロン症候群、短身、
加齢に関連した望ましくない徴候、例えば糖尿病及び脂肪量対除脂肪比率の上昇
、免疫学的疾患、例えばＣＤ４数の減少及び免疫寛容の低下を含む免疫不全又は
化学治療誘発性組織傷害、骨髄移植、心臓構造又は機能の疾患又は不全、例えば
心不全及び鬱血性心不全、ニューロン性、神経性、又は神経筋性疾患、例えば、
末梢神経障害、多発性硬化症、筋ジストロフィー、又は筋緊張性ジストロフィー
、及び外傷又は創傷を含む任意の状態によって生ずる萎縮に関連する異化状態又
は細菌又はＨＩＶなどのヒトウイルス等での感染、創傷、皮膚疾患、修復を必要
とする腸構造及び機能などを含む。治療されるＩＧＦ疾患は、上記の疾患の２又
はそれ以上の組み合わせでもよい。ここで治療の標的とする好ましい疾患は、糖
尿病及び肥満、心臓機能不全、腎疾患、神経性疾患、全ての身体成長疾患、及び
免疫学的疾患である。

【００３０】「インシュリン疾患」は、インシュリンでの治療により恩恵を受ける状態、例
えば高血糖疾患などである。ここで使用される場合の「高血糖疾患」は、糖尿病の全ての形態及びインシュ
リン耐性からもたらされる疾患、例えばＩ型及びＩＩ型糖尿病、並びに重篤なイ
ンシュリン耐性、高インシュリン血症及び高脂血症、例えば、肥満患者、及びイ
ンシュリン耐性糖尿病、例えばマンデンホール症候群、ヴェルナー症候群、妖精
症、脂肪組織萎縮性糖尿病、及び他の脂肪組織萎縮症を意味する。好ましい高血
糖疾患は糖尿病、特にＩ型及びＩＩ型糖尿病である。「糖尿病」自体は、十分な
生産又は利用を含む炭水化物代謝の進行性疾患を意味し、高血糖及び糖尿によっ
て特徴付けられる。

【００３１】ここで使用される場合の「治療」は、治癒的処置、予防的療法及び防止的療法
の両方を意味する。治療が必要なものとは、既に疾患に罹っているもの、並びに
疾患に罹りやすい又は疾患が診断されているもの又は疾患が防止されているもの
を含む。連続的治療又は投与は、少なくとも毎日を基にした治療を意味し、一又
は複数の日で治療が中断されない。間欠的治療又は投与、あるいは間欠形式での
治療又は投与とは、連続的ではないが周期的な治療を意味する。本発明の治療措
置は、連続的又は間欠的のいずれかとできる。

【００３２】ここで使用される場合の「血糖降下薬」は、グルコース代謝の調節に有用な化
合物、好ましくは経口薬を意味する。ここでヒト用により好ましいのは、インシ
ュリン及びスルホニルウレア類の経口血糖降下薬であり、膵臓によるインシュリ
ンの分泌を起こす。例は、グリブリド、グリピジド、及びグリクラジドを含む。
さらに、インシュリン感受性を亢進し又はインシュリン感受性にする薬剤、例え
ばビグアニド（メトホルミン及びフェンホルミンを含む）及びチアゾリデネジオ
ン、例えばREZULIN(商品名)（トログリタゾン）ブランドのインシュリン感作薬
、及びＰＰＡＲγ核レセプターに結合する他の化合物がこの定義に包含され、ま
た好ましくもある。

【００３３】ここで使用される「活性な」又は「生物学的に活性な」ＩＧＦは、内因性ＩＧ
Ｆの血清及び組織レベルの変化の文脈においては、そのレセプターに結合する、
又はここで内因性又は外因性ＩＧＦと呼ばれるもののような生物学的活性などの
生物学的活性を生じさせるＩＧＦを意味する。「成長ホルモン放出ペプチド又は因子」（「ＧＨＲＰ」又は「ＧＨＲＦ」）は
以下に記載される分泌促進物質である。「成長ホルモン放出ホルモン」（「ＧＨ
ＲＨ」）は、細胞又は組織からＧＨを放出させる任意のホルモンであり得る。「
成長ホルモン結合性タンパク質と組み合わされた成長ホルモン」（「ＧＨ」プラ
ス「ＧＨＢＰ」）は、その結合タンパク質の一つと複合体形成した、又は結合し
たＧＨを意味する。同様に、「ＩＧＦ結合性タンパク質と組み合わされたＩＧＦ
」（「ＩＧＦ」プラス「ＩＧＦＢＰ」）は、そのＩＧＦＢＰの一つと複合体形成
した、又は結合したＩＧＦを意味する。

【００３４】Ｂ．発明の実施の形態ここで本発明は、一態様において、天然配列ヒトＩＧＦ-Ｉの選択された位置
における一又は複数のアミノ酸が置換されたＩＧＦ-Ｉ変異体に関する。特に、
位置３、４、５、７、１０、１４、１７、２３、２４、２５、４３、４９及び／
又は６３の１又は複数のアミノ酸、あるいは前記位置のアミノ酸と位置１２及び
／又は１６における一方又は両方のアミノ酸が置換される。位置７における置換
は任意のアミノ酸であり、位置７以外の任意の位置での置換はアラニン、グリシ
ン、又はセリン残基のいずれかである。好ましくは、問題とするアミノ酸はアラ
ニン、グリシン、又はセリンで置換される。

【００３５】一つの好ましい変異体は、位置１６及び４９のアミノ酸が置換されている。他
の好ましい変異体は、位置３及び７のアミノ酸が置換されている。好ましくは、
位置４９及び６３のアミノ酸は単独で置換されない。他の好ましい実施態様では、変異体は、位置２４のチロシンがロイシンで、又
は位置３１のチロシンがアラニンでさらに置換されている。最も好ましくは、両
方のチロシン残基が置換される。さらに本発明は、他の態様において、２つのタイプのＩＧＦ様インシュリンを
提供する。そのような実施態様の一方では、天然配列ヒトプロインシュリンの位
置１のフェニルアラニンが欠失され、又は天然配列ヒトプロインシュリンの位置
４のグルタミンがグルタミン酸で置換され、又は天然配列ヒトプロインシュリン
の位置１７のロイシンがフェニルアラニンで置換され、又は天然配列ヒトプロイ
ンシュリンの位置２５のフェニルアラニンがチロシンで置換され、又は天然配列
ヒトプロインシュリンの位置２６のチロシンがフェニルアラニンで置換され、又
は天然配列ヒトプロインシュリンの位置７３のトレオニンがフェニルアラニンで
置換され、又はこれらの任意の組み合わせがなされている。

【００３６】好ましい組み合わせは、前記位置４及び１７のアミノ酸が置換されたもの、又
は前記位置４及び２６のアミノ酸が置換されたもの、又は前記位置４及び７３の
アミノ酸が置換されたもの、又は前記位置１７及び２６のアミノ酸が置換された
もの、又は前記位置２６及び７３のアミノ酸が置換されたもの、又は前記位置１
７及び７３のアミノ酸が置換されたもの、又は前記位置４、１７及び２６のアミ
ノ酸が置換されたもの、又は前記位置４、２６及び７３のアミノ酸が置換された
もの、又は前記位置４、１７及び７３のアミノ酸が置換されたもの、又は前記位
置１７、２６及び７３のアミノ酸が置換されたもの、又は前記位置１のアミノ酸
が欠失され、前記位置２５のアミノ酸が置換されたもの、又は前記位置１のアミ
ノ酸が欠失され、前記位置２６のアミノ酸が置換されたもの、又は前記位置１の
アミノ酸が欠失され、前記位置７３のアミノ酸が置換されたもの、又は前記位置
１のアミノ酸が欠失され、前記位置２５及び２６のアミノ酸が置換されたもの、
又は前記位置１のアミノ酸が欠失され、前記位置２５及び７３のアミノ酸が置換
されたもの、又は前記位置１のアミノ酸が欠失され、前記位置２６及び７３のア
ミノ酸が置換されたもの、又は前記位置１のアミノ酸が欠失され、前記位置２５
、２６及び７３のアミノ酸が置換されたものである。

【００３７】最も好ましいのは、前記位置４、１７、２６及び３８のアミノ酸が置換され、
ＩＧＦＢＰ-１選択性とされた変異体、又は前記位置１のアミノ酸が欠失され、
前記位置２５、２６及び３８のアミノ酸が置換され、ＩＧＦＢＰ-３選択性とさ
れた変異体である。他のタイプのＩＧＦ様インシュリンは可溶性成熟インシュリンに基づく。この
場合、同じ変異は上記のプロインシュリンのようになされるが、番号付けが変化
する場合もある。即ち、天然配列ヒト成熟インシュリンの位置４のグルタミンが
グルタミン酸で置換され、又は天然配列ヒト成熟インシュリンの位置１７のロイ
シンがフェニルアラニンで置換され、又は天然配列ヒト成熟インシュリンの位置
２５のフェニルアラニンがチロシンで置換され、又は天然配列ヒト成熟インシュ
リンの位置２６のチロシンがフェニルアラニンで置換され、又は天然配列ヒト成
熟インシュリンの位置３８のトレオニンがフェニルアラニンで置換され、又はこ
れらの任意の組み合わせがなされる。

【００３８】ＩＧＦＢＰ-１選択性変異体については、前記位置４、１７、２６及び３８の
アミノ酸が置換され、ＩＧＦＢＰ-３選択性変異体については、前記位置１のア
ミノ酸が欠失され前記位置２５、２６及び３８のアミノ酸が置換される。本発明のペプチドは、化学合成により又は組換え技術を用いて製造しうる。こ
れらの方法は当該分野で知られている。化学合成、特に固相合成は、短い（例え
ば、５０残基未満の）ペプチド又はＤ-Ｔｙｒ、オルニチン、アミノアジピン酸
などの非天然又は異常なアミノ酸を含むものに好ましい。組換え手法は、より長
いポリペプチドに好ましい。組換え手法が選択される場合、合成遺伝子は新規に
構築されてもよく、又は天然遺伝子を、例えばカセット突然変異誘発により突然
変異させてもよい。以下は、一般的な組換え手法の例示である。精製したＩＧＦ又はインシュリン及びそのアミノ酸配列から、例えば、ＩＧＦ
又はインシュリン親分子のペプチド変異体であるＩＧＦ又はインシュリン変異体
を組換えＤＮＡ技術を用いて製造してもよい。これらの技術は、単純化した形態
において、天然又は合成のいずれかで、ペプチドをコードする遺伝子を取り；そ
れを適切なベクターに挿入し；ベクターを適切な宿主細胞に挿入し；宿主細胞を
培養して遺伝子の発現を起こし；次いで産生されたペプチドを回収又は単離する
ことを考える。好ましくは、回収されたペプチドは、次いで適当な程度まで精製
される。

【００３９】幾分より詳しくは、ペプチジルＩＧＦ変異体をコードするＤＮＡは、適した宿
主で発現するようにクローン化及び操作される。親ペプチドをコードするＤＮＡ
は、ゲノムライブラリー、ペプチドを発現する細胞のｍＲＮＡ由来のｃＤＮＡ、
又は合成的に構築されたＤＮＡ配列によって得ることが可能である（Sambrook等
., Molecular Cloning: A Laboratory Manual(2ded.), Cold Spring Harbor Lab
oratory, N.Y., 1989）。次いで、親ＤＮＡは、宿主細胞の形質転換に使用される適切なプラスミド又は
ベクターへ挿入される。一般には、宿主との関連において、宿主と適合する種由
来の複製及びコントロール配列を含むプラスミドベクターが使用される。ベクタ
ーは、通常、形質転換細胞の形質選択を提供できるタンパク質又はペプチドをコ
ードする配列並びに複製部位を持つ。

【００４０】例えば、大腸菌は、大腸菌由来のプラスミドであるｐＢＲ３２２を使用するこ
とによって形質転換される（Mandel等., J.Mol.Biol. 53: 154(1970)）。プラス
ミドは、アンピシリン及びテトラサイクリン耐性遺伝子を含み、そしてそれ故に
選択が容易な方法を提供する。他のベクターは、発現にしばしば重要な異なった
プロモーターのような、異なった特徴を含む。例えば、プラスミドｐＫＫ２２３
-３、ｐＤＲ７２０、及びｐＰＬ-ラムダは、ｔａｃ、ｔｒｐ、又はＰ_Ｌプロモー
ターを持つ、現在入手可能な発現ベクターである（Pharmacia biotechnology）
。好ましいベクターはｐＢ０４７５である。このベクターは、宿主間を往復する
ことを可能にするファージ及び大腸菌の為の複製開始点を有し、それによって突
然変異誘発及び発現の両方を促進にする（Cunningham等., Science, 243: 1330-
1336(1989); U.S.Pat. No. 5,580,723）。他の好ましいベクターは、ｐＲ１Ｔ５
及びｐＲ１Ｔ２Ｔである（Pharmacia Biotechnology）。これらのベクターは、
挿入された遺伝子が融合タンパク質として発現できるように、プロテインＡのＺ
ドメインに続く適切なプロモーターが含まれている。

【００４１】他の好ましいベクターは、前記したベクターの適切な特徴を組み合わせること
による標準的技術を使用しての構築が可能である。適切な特徴とは、プロモータ
ー、リボゾーム結合部位、デコルシン(decorsin)又はオルナチン(ornatin)遺伝
子、或いは遺伝子融合（プロテインＡのＺドメイン及びデコルシン又はオルナチ
ンとそのリンカー）、抗生物質耐性マーカー、及び適切な複製開始点を含む。

【００４２】宿主細胞は、原核生物又は真核生物でよい。原核生物は、親ＩＧＦ−Ｉポリペ
プチド、断片置換ペプチド、及びペプチド変異体を生産する為に、ＤＮＡ配列を
クローニング及び発現の為に好ましい。例えば、大腸菌Ｋ−１２株２９４（ＡＴ
ＣＣＮｏ．３１４４６）は、大腸菌Ｂ、大腸菌Ｘ１７７６（ＡＴＣＣＮｏ．
３１５３７）、及び大腸菌ｃ６００及びｃ６００ｈｆｌ、大腸菌Ｗ３１１０（Ｆ
−、ガンマ、原栄養／ＡＴＣＣＮｏ．２７３２５）、枯草菌のような桿菌、ネ
ズミチフス菌又はセラチア・マルセッセンス菌のような腸内細菌，及び様々なシ
ュードモナス属と同様に使用される。好ましい原核生物は、大腸菌Ｗ３１１０（
ＡＴＣＣ２７３２５）である。原核生物において発現された場合、ペプチドはＮ
末端メチオニン又はホルミルメチオニンを含み、グリコシル化されていない。融
合タンパク質の場合は、Ｎ末端メチオニン又はホルミルメチオニンが融合タンパ
ク質のアミノ末端に、又は融合タンパク質のシグナル配列が存在する。これらの
例は、限定的というよりも実証となることを意図されている。原核生物に加えて、酵母培養菌、又は多細胞生物由来の細胞のような真核生物
を使用することができる。基本的には、そのような全ての細胞が機能する。しか
し、関心は脊椎動物細胞についてがもっとも大きく、培養（組織培養）での脊椎
動物細胞の増殖は再現性のある方法になっている（Tissue Culture, Academic P
ress, Kruse and Patterson, editors(1973)）。そのような有用な宿主細胞系は
、ＶＥＲＯ及びＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系、
Ｗ１３８,２９３，ＢＨＫ、ＣＯＳ-７、及びＭＤＣＫ細胞系である。

【００４３】前記方法の変形は、所望するペプチドをコードする遺伝子が、ベクター中で、
他のタンパク質又は他のタンパク質の断片をコードする遺伝子又と関連している
場合に、遺伝子融合の使用を考慮する。これは、所望するペプチドが他のタンパ
ク質又はペプチドと融合し、宿主細胞によって生産される結果をもたらす。「他
の」タンパク質又はペプチドとは、多くの場合、細胞からの分泌が可能なタンパ
ク質又はペプチドであり、所望するペプチドの培養液からの単離及び精製を可能
にし、所望するペプチドが菌体内に止まる場合に生じる宿主細胞を破壊する必要
性を除く。あるいは、融合タンパク質は細胞内に発現することも可能である。高
度に発現される融合タンパク質を使用するのが有用である。遺伝子融合の使用は、必須ではないが、大腸菌における異種ペプチドの発現並
びに後のこれら遺伝子産物の精製を容易にする（Harris, Genetic Engineering,
Willianson, R., Ed.(Academic Press, London, Vol.4, 1983), p.127; Ljungu
ist等., Eur.J.Biochem., 186: 557-561(1989)及びLjungquist等., Eur.J.Bioch
em., 186: 563-569(1989)）。プロテインＡ融合は、プロテインＡの結合、より
詳しくはプロテインＡのＺドメインのＩｇＧへの結合が融合タンパク質の精製の
為の「親和性ハンドル」を提供することから頻繁に使用される。多くの異種タン
パク質が大腸菌内で直接に発現されると分解されることが知られているが、融合
タンパク質として発現された場合は安定である（Marston, Biochem J., 240: 1(
1986)）。

【００４４】融合タンパク質は、メチオニン、又はヒドロキシアミン、アスパラギン及びグ
リシン残基間を切断する臭化シアンのような化学薬品を使用することによって切
断が可能である。標準的な組換えＤＮＡ技術を使用することにより、これらアミ
ノ酸をコードするヌクレオチド塩基対は、所望するペプチドをコードする遺伝子
の５' 末端の直前に挿入することができる。あるいは、融合タンパク質のタンパク質分解による切断を使用することが可能
である（Cater, Protein Purification: From Molecular Mechanism to Large-S
cale Process, Ladish等., eds.(American Chemical Society Symposium Series
No.427,1990), Ch13, page 181-193）。

【００４５】第Ｘａ因子、トロンビン、及びサブチリシン又はその変異体、他の多数のプロ
テアーゼが、融合タンパク質の切断に首尾よく使用されている。典型的には、プ
ロテアーゼによる切断を受けやすいペプチドリンカーは、「他の」のタンパク質
（例えばプロテインＡのＺドメイン）と所望するペプチドとの間に挿入される。
組換えＤＮＡ技術を使用すると、リンカーをコードするヌクレオチド塩基対は、
他のタンパク質をコードする遺伝子又は遺伝子断片の間に挿入される。タンパク
質分解による正確なリンカーを含む部分精製融合タンパク質の切断は、その結果
、天然融合タンパク質、又は還元型或いは変性融合タンパク質について実施する
ことができる。ペプチドは、融合タンパク質として発現した場合は、適切に折り畳まれる又は
折り畳まれないことがある。さらに、切断部位を含有する特定のペプチドリンカ
ーは、プロテアーゼへ接触可能又は接触不可能であることがある。これれらの要
因が、融合タンパク質を変性及び再折り畳みするべきか否か、もしそうならば、
これらの手段を切断の前又は後のいずれに用いるかを決定する。

【００４６】変性及び再折り畳みが必要な場合、通常は、ペプチドは塩酸グアニジンのよう
なカオトロピック剤によって処理され、その後、例えばペプチドが天然構造へと
再折り畳みされるような適切な割合、ｐＨ、及び温度において、還元及び酸化型
ジチオスレイトール又はグルタチオンを含有する酸化還元バッファーによって処
理される。ペプチドが組換えＤＮＡ技術によって調製されない場合は、ペプチドは、一般
的に、Merrifield, J.Am.Chem.Soc., 85: 2149(1963)に記載されているような固
相合成法によって調製されるが、当該技術分野において周知である他の同等な化
学合成法も使用可能である。固相合成は、保護されたα−アミノ酸を適合する樹
脂と連結することによってＣ-末端から開始する。そのような開始物質は、α-ア
ミノ基が保護されたアミノ酸をクロロメチル化された樹脂又はヒドロキシメチル
化された樹脂にエステル結合すること、又はＢＨＡ樹脂或いはＭＢＨＡ樹脂にア
ミド結合することによって調製が可能である。ヒドロキシメチル樹脂の調製方法
は、Bodansky等., Chem.Ind.(London), 38: 1597-1598(1966)に記載されている
。クロロメチル化樹脂は、BioRad Laboratories, Richmond, CA 及び Lab. syst
em, Inc.より入手可能である。そのような樹脂の調製方法は、Stwart等., "Sold
Phase Peptide Synthesis"(Freeman and Co., San Francisco 1969), Chapter
1, pp.1-6 に記載されている。ＢＨＡ及びＭＢＨＡ樹脂支持体は、商業的に入
手可能で、一般的には、合成される所望のポリペプチドがＣ-末端に置換されて
いないアミドを有している場合のみに使用される。

【００４７】アミノ酸は、ペプチド結合の形成に関する技術分野において周知の技術を使用
することによりペプチド鎖とカップリングされる。一つの方法は、カルボキシル
基がペプチド断片の遊離のＮ-末端アミノ基とより反応しやすい誘導体にアミノ
酸を変換することを含む。例えば、アミノ酸は、保護されたアミノ酸とクロロギ
酸エチル、クロロギ酸フェニル、クロロギ酸sec-ブチル、クロロギ酸イソブチル
、塩化ピバロイル又は同様の酸塩化物との反応によって混合無水物への変換が可
能である。あるいは、アミノ酸は、２,４,５-トリクロロフェニルエステル、ペ
ンタクロロフェニルエステル、ペンタフルオロフェニルエステル、ｐ-ニトロフ
ェニルエステル、Ｎ-ヒドロキシスクシンイミドエステル、又は１-ヒドロキシベ
ンゾトリアゾールから形成されるエステルなどの活性型エステルへの変換が可能
である。他のカップリング法は、Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド又はＮ,Ｎ'-
ジイソプロピルカルボジイミドなどの適したカップリング剤を使用することを含
む。他のカップリング剤で、当業者に明らかなものは、E.Gross and J.Meienhof
er, The Peptide: Analysis, Structure, Biology, Vol.Ｉ: Major Method of P
eptide Bond Formation(Academic Press, New York, 1979)に記載されている。

【００４８】ペプチド合成に使用される各々のアミノ酸のα-アミノ酸基は、側鎖がそれら
の活性α-アミノ機能に関与することを防ぐ為に、カップリング反応中は保護さ
れるべきことを認識すべきである。また、或るアミノ酸が反応性の側鎖官能基（
例えば、メルカプト(スルフヒドリル）、アミノ、カルボキシル、及びヒドロキ
シル）を有すること、そして、そのような官能基も、初期及びそれに続くカップ
リング段階において、適した保護基によって化学反応から保護しなければならな
いことも認識すべきである。当該技術分野で知られている適した保護基は、Gros
s and .Meienhofer, The Peptide: Analysis, Structure, Biology, Vol.3:" Pr
otection of Functional Group in Peptide Synthesis"(Academic Press, New Y
ork, 1981)に記載されている。

【００４９】ペプチド合成に使用される特定の側鎖保護基の選択では、次の一般的規則が順
守される。α-アミノ保護基は、（ａ）カップリング反応に用いられる条件下に
おいては、α-アミノ機能を不活性にしなければならない、（ｂ）カップリング
反応後には、側鎖保護基を除去せずペプチド断片の構造を改変しない条件下で容
易に除去可能でなけれならない、そして（ｃ）カップリング直前の活性化に当た
ってはラセミ化の可能性を除去しなければならない。側鎖保護基は、（ａ）カッ
プリング反応に用いられる条件下においては、側鎖官能基を不活性にしなければ
ならない、（ｂ）α-アミノ保護基の除去に用いられる条件下では安定でなけれ
ならない、そして（ｃ）所望のアミノ酸ペプチドが完成した際には、ペプチド鎖
の構造を改変しない条件下で容易に除去可能でなければならない。

【００５０】当業者には、ペプチド合成に有用なことが知られた保護基が、それらの除去に
用いる試薬との反応性において変化することは明らかであろう。例えば、トリフ
ェニルメチル及び２-(p-ビフェニリル)イソプロピルオキシカルボニルは非常に
不安定で、温和な酸性条件下で切断できる。他の保護基、例えばｔ-ブチルオキ
シカルボニル（ＢＯＣ）、ｔ-アミルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカ
ルボニル、及びｐ-メトキシベンジルオキシカルボニルはより安定性であり、そ
れらの除去のために、酢酸中のトリフルオロ酢酸、塩酸、三フッ化ホウ素などの
中程度に強い酸を必要とする。さらに他の保護基、例えばベンジルオキシカルボ
ニル（ＣＢＺ又はＺ）、ハロベンジルオキシカルボニル、ｐ-ニトロベンジルオ
キシカルボニルシクロアルキルオキシカルボニル、及びイソプロピルオキシカル
ボニルは、不安定性が更に小さく、それらの除去には、トリフルオロ酢酸中のフ
ッ化水素、臭化水素、又はホウ化トリフルオロ酢酸といった更に強い酸を必要と
する。有用なアミノ酸保護基のクラスの中には以下が含まれる：

【００５１】（１）α-アミノ酸基については、（ａ）芳香族ウレタン型保護基、例えばフ
ルオレニルメチルカルボニル（ＦＭＯＣ）ＣＢＺ、及び置換されたＣＢＺ、例え
ばｐ-クロロベンジルオキシカルボニル、ｐ-６-ニトロベンジルオキシカルボニ
ル、ｐ-ブロモベンジルカルボニル及びｐ-メトキシベンジルオキシカルボニル、
ｏ-クロロベンジルオキシカルボニル、２,４-ジクロロベンジルオキシカルボニ
ル、２,６-ジクロロベンジルオキシカルボニルなど；（ｂ）脂肪族ウレタン型保
護基、例えばＢＯＣ、ｔ-アミルオキシカルボニル、イソプロピルオキシカルボ
ニル、２-(ｐ-ビフェニリル)-イソプロピルオキシカルボニル、アリールオキシ
カルボニルなど；（ｃ）シクロアルキルウレタン型保護基、例えばシクロペンチ
ルオキシカルボニル、アダマンチルオキシカルボニル、及びシクロへキシルオキ
シカルボニル；及び（ｄ）アリルオキシカルボニル。好ましいα-アミノ保護基
はＢＯＣ及びＦＭＯＣである。（２）Ｌｙｓに存在する側鎖アミノ基については、保護は、ＢＯＣ、ｐ-クロ
ロベンジルオキシカルボニル等といった上記（１）に述べた任意の基によってな
される。（３）Ａｒｇのグアニジド基については、保護は、ニトロ、トシル、ＣＢＺ、
アダマンチルオキシカルボニル、２,２,５,７,８-ペンタメチルクロマン-６-ス
ルホニル又は２,３,６-トリメチル-４-メトキシフェニルスルホニル、又はＢＯ
Ｃによってなされる。（４）Ｓｅｒ、Ｔｈｒ、又はＴｙｒのヒドロキシル基については、保護は、例
えば、Ｃｌ−Ｃ４アルキル、例えばｔ-ブチル；ベンジル（ＢＺＬ）；置換ＢＺ
Ｌ、例えばｐ-メトキシベンジル、ｐ-ニトロベンジル、ｐ-クロロベンジル、ｏ-
クロロベンジル、及び２,６-ジクロロベンジル。（５）Ａｓｐ又はＧｌｕのカルボキシル基については、保護は、例えば、ＢＺ
Ｌ、ｔ-ブチル、シクロへキシル、シクロペンチルなどの基を用いたエステル化
によってなされる。（６）Ｈｉｓのイミダゾール窒素については、トシル部が好ましく使用される
。（７）Ｔｙｒのフェノール性ヒドロキシル基については、テトラヒドロピラニ
ル、tert-ブチル、トリチル、ＢＺＬ、クロロベンジル、４-ブロモベンジル、又
は２,６-ジクロロベンジルなどの保護基が好ましく使用される。好ましい保護基
は２,６-ジクロロベンジルである。（８）Ａｓｎ又はＧｌｎの側鎖アミノ基については、キサンチル（Ｘａｎ）が
好ましく用いられる。（９）Ｍｅｔについては、アミノ酸は好ましくは保護せずに残す。（１０）Ｃｙｓのチオ基については、ｐ-メトキシベンジルが典型的に用いら
れる。

【００５２】Ｃ-末端アミノ酸、例えばＬｙｓは、Ｎ-アミノ位置において適切に選択された
保護基、Ｌｙｓの場合はＢＯＣによって保護される。ＢＯＣ-Ｌｙｓ-ＯＨは、最
初にベンジルヒドリルアミン又はクロロメチル化樹脂に、Horiki等, Chemistry
Letters, 165-168 (1978)に記載された方法に従って又はイソプロピルカルボジ
イミドを用いて約２５℃で２時間攪拌しながら結合させる。ＢＯＣ保護アミノ酸
の樹脂支持体への結合に続いて、α-アミノ酸保護基を、塩化メチレン中のトリ
フルオロ酢酸（ＴＦＡ）又はＴＦＡ単品を用いるなどして除去する。脱保護は、
約０℃から室温までの温度で実施する。他の標準的な開裂試薬、例えばジオキサ
ン中のＨＣｌ、及び特定のα-アミノ保護基の除去条件は文献に記載されている
。

【００５３】 α-アミノ保護基の除去の後、残ったα-アミノ及び側鎖保護アミノ酸を望まれ
る順序で段階的に結合させる。合成において各アミノ酸を別々に添加する代わり
に、固相合成機に添加する前に互いに結合させてよいものもある。適当なカップ
リング試薬は当業者の技量の範囲内である。カップリング試薬として特に好まし
いのは、Ｎ,Ｎ'-ジシクロヘキシルカルボジイミド又はジイソプロピルカルボジ
イミドである。各保護アミノ酸又はアミノ酸配列は固相反応器に過剰に導入し、ジメチルホル
ムアミド（ＤＭＦ）又はＣＨ_２Ｃｌ_２又はそれらの混合物の媒体中でカップリン
グを適切に実施させる。不完全なカップリングが生じた場合、次のアミノ酸のカ
ップリングに先立つＮ-アミノ保護基を除去する前にカップリング方法を繰り返
す。合成の各段階でのカップリング反応の成功を監視してもよい。合成を監視す
る好ましい方法は、Kaiser等, Anal. Biochem., 34: 595 (1970)に記載されたニ
ンヒドリン反応である。カップリング反応は、周知の方法、例えばBIOSEARCH 95
00(商品名)ペプチド合成機を使用して自動的に実施できる。

【００５４】所望のペプチド配列が完成したら、保護ペプチドを樹脂支持体から切断し、全
ての保護基を除去しなければならない。切断反応及び保護基の除去は、同時に又
は段階的に好ましく達成される。樹脂支持体がクロロメチル化ポリスチレン樹脂
である場合、ペプチドを樹脂に繋留している結合は、Ｃ-末端残基の遊離カルボ
キシル基と樹脂マトリクス上に存在する多数のクロロメチル基の一つの間のエス
テル結合である。繋留結合は、エステル結合を切断でき樹脂マトリクスを透過で
きることが知られた試薬によって切断できる。

【００５５】一つの特に便利な方法は、液体無水フッ化水素での処理による。この試薬はペ
プチドを樹脂から切断するだけでなく、全ての保護基を除去するであろう。従っ
て、この試薬を使用することは、完全に脱保護されたペプチドを直接に生じる。
クロロメチル化樹脂を使用した場合、フッ化水素処理は遊離のペプチド酸の形成
をもたらす。ベンズヒドリルアミン樹脂を使用した場合、フッ化水素処理により
直接に遊離のペプチドアミンとなる。アニソール及びジメチルスルホキシドの存
在下での０℃で１時間のフッ化水素との反応は、同時に側鎖保護基を除去し、樹
脂からペプチドを解放する。保護基を除去することなくペプチドを切断することが望まれる場合、保護ペプ
チド−樹脂にメタノール分解を施して、Ｃ-末端カルボキシル基がメチル化され
た保護ペプチドを生成させることができる。このメチルエステルは、次いで、温
和なアルカリ条件下で遊離のＣ-末端カルボキシル基を与える。次いで、ペプチ
ド鎖上の保護基を液体フッ化水素などの強酸で処理することにより除去する。メ
タノール分解についての特に有用な技術は、Moore等, Peptides, Proc. Fifth A
mer. Pept. Symp., M. Goodman及びJ. Meinhofer, 編, (John Wiley, N.Y., 197
7), p. 518-521のものであり、そこでは保護ペプチド−樹脂がクラウンエーテル
の存在下でメタノール及びシアン化カリウムで処理される。

【００５６】クロロメチル化樹脂を使用した場合に保護されたペプチドを樹脂から切断する
他の方法は、加アンモニア分解又はヒドラジンでの処理である。必要ならば、得
られるＣ-末端アミド又はヒドラジドは加水分解して遊離のＣ-末端カルボキシル
部とでき、保護基は従来技術により除去できる。また、Ｎ-末端α-アミノ基に存在する保護基も、保護ペプチドが支持体から切
断される前又は後に優先的に除去してよいと認められる。本発明のポリペプチドの精製は、典型的には従来の手法、例えば分離用ＨＰＬ
Ｃ（逆相ＨＰＬＣを含む）又は他の周知のクロマトグラフィ技術、例えばゲル浸
透、イオン交換、分配クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ（モノ
クローナル抗体カラムを含む）、又は向流分配によって達成される。

【００５７】本発明のペプチドは、重合によって安定化させてもよい。これは、モノマー鎖
を多官能性架橋試薬で直接的に、又は多官能性ポリマーを介して間接的に架橋さ
せることにより達成される。通常は、２つの実質的に同一のポリペプチドが、二
官能性架橋試薬を用いてそれらのＣ-又はＮ-末端において架橋される。試薬は、
末端アミノ及び／又はカルボキシル基を架橋するために使用される。一般に、両
末端カルボキシル基又は両末端アミノ基が互いに架橋するが、適切な架橋試薬を
選択することにより、一方のポリペプチドのアルファアミノが他方のポリペプチ
ドの末端カルボキシル基と架橋する。好ましくは、ポリペプチドはそれらのＣ-
末端においてシステインで置換されている。この分野で良く知られた条件下で、
末端システイン間でジスルフィド結合が形成され、それによりポリペプチド鎖が
架橋される。例えば、ジスルフィド架橋は、遊離のシステインの金属触媒酸化に
より又は適切に修飾されたシステイン残基の求核置換によって便利に形成される
。架橋試薬の選択は、ポリペプチドに存在するアミノ酸の反応性側鎖の個性に依
存するであろう。例えば、ジスルフィド架橋は、システインがポリペプチドのＣ
-末端以外のさらなる部位に存在する場合には好ましくないであろう。また、こ
の範囲には、メチレン架橋で架橋したペプチドも包含される。

【００５８】Ｎ-末端アミノ及びＣー末端カルボキシル基以外の、ペプチド上の好適な架橋部
位は、リジン残基上に見られるイプシロンアミノ基、並びにペプチドの内部残基
又はフランキング配列に導入された残基の側鎖に位置するアミノ、イミノ、カル
ボキシル、スルフヒドリル及びヒドロキシル基を含む。外部から添加された架橋
試薬を介する架橋は、例えば、当業者に馴染み深い多くの試薬を用いて、例えば
、ポリペプチドのカルボジイミド処理を介して適当に達成される。好適な多官能
性（通常は二官能性）架橋試薬の他の例は文献に見いだされる。本発明のペプチドは、環化によって立体配置的に安定化させてもよい。ペプチ
ドは通常、一のペプチドの−及びＣ-末端ドメインを本発明の他のペプチドの対
応するドメインに共有結合させることにより環化され、２又はそれ以上の反復ペ
プチド配列を含み、各反復ペプチドが実質的に同じ配列を有するシクロ-オリゴ
マーを形成する。さらに、環化したペプチド（シクロ-オリゴマー又はシクロ-モ
ノマーのいずれか）は、架橋して１−３の環状構造を形成し、その中には２から
６のペプチドが含まれる。ペプチドは好ましくはα-アミノ及び主鎖カルボキシ
ル基（頭部から尾部）を介して共有結合せず、−及びＣ-末端ドメインに位置す
る残基の側鎖を介して架橋する。よって結合部位は一般に残基の側鎖間になるで
あろう。

【００５９】ここで考慮されるようなモノ-又はポリ環化ペプチドを調製するために、多く
の好適な方法自体は知られている。Ｌｙｓ／Ａｓｐ環化は、Ｌｙｓ／Ａｓｐにつ
いてＦｍｏｃ／９-フルオレニルメチル（ＯＦｍ）側鎖保護を持つ固相支持体上
でＮａ-ＢＯＣ-アミノ酸を用いて達成され；この方法は、環化に続くピペリジン
処理によって完了する。Ｇｌｕ及びＬｙｓ側鎖も、環状又は二環状ペプチドの調製において架橋され；
このペプチドはｐ-メチルベンズヒドリルアミン樹脂上の固相化学によって合成
される。ペプチドは樹脂から切断されて脱保護される。環状ペプチドは、希釈メ
チルホルムアミド中のジフェニルホスホリルアジドを用いて形成される。これに
代わる方法については、Schiller等, Peptide Protein Res., 25: 171-177 (198
5)を参照のこと。米国特許第4,547,489号参照。

【００６０】ジスルフィド架橋又は環化されたペプチドは従来の方法により生成される。Pe
lton等（J. Med. Chem., 29: 2370-2375 (1986)）の方法は、シクロ-モノマーの
調製についてPelton等に記載された希釈反応混合物よりも濃厚な溶液中で反応を
実施することにより多くの割合でシクロ-オリゴマーが生成されることを除いて
好ましい。同じ化学は、ダイマー又はシクロ-オリゴマー又はシクロ-モノマーの
合成に有用である。また有用なのはチオメチレン架橋である。Lebl及びHruby, T
etrahedron Letters, 25: 2067-2068 (1984)。また、Cody等, J. Med. Chem., 2
8: 583 (1985)参照。望ましい環状又は重合性ポリペプチドは、ゲル濾過に次ぐ逆相高圧液体クロマ
トグラフィ又は他の従来の手法により精製される。ペプチドは滅菌濾過され、従
来からの薬理学的に許容される媒体中に処方される。

【００６１】ここに記載するプロセス必要とされる出発材料は文献で知られているか、又は
周知の方法及び周知の出発材料から調製できる。４つの異なる置換基に結合した炭素原子から生成されたペプチドが不斉の場合
、ペプチドはジアステレオマー、エナンチオマー又はそれらの混合物として存在
しうる。上記の合成は、出発材料又は中間体としてラセミ化合物、エナンチオマ
ー又はジアステレオマーを用いてもよい。そのような合成から得られるジアステ
レオマー生成物は、クロマトグラフィ又は結晶化法によって分離しうる。同様に
、エナンチオマー混合物は、同様の技術又はこの分野で知られた他の技術によっ
て分離してよい。各不斉炭素原子は、存在する場合は、２つの立体配置Ｒ又はＳ
の一方でよく、それらともに本発明の範囲内である。

【００６２】本発明のペプチドは、ＩＧＦＢＰに選択的に結合する。ＩＧＦ又はインシュリ
ン分子について多くの用途があることは当業者に知られている。従って、ＩＧＦ
又はインシュリン作用をアンタゴナイズする目的での本発明のペプチドの投与は
、外因性ＩＧＦ又はインシュリン自体の投与と同じ効果又は用途を有し得る。Ｉ
ＧＦ及びインシュリンのこれらの用途は以下を含むが、これらは上で定義した疾
患に付加しても同じであってもよい：正常及び下垂体機能低下の動物における全
身体、骨格、及び筋肉成長速度の向上；異化段階（絶食、窒素制限、コルチコス
テロイドレベルの上昇、及び／又は糖尿病）における体重及び窒素喪失の防止；
抹消及び中枢神経系（ＣＮＳ）変性疾患の治療及びＣＮＳ損傷又は傷害の後の神
経保護又は修復の促進；心臓再生；癌悪液質の逆転、血管新生の阻害；胃腸管の
再生；乳房機能の刺激；代謝ストレス、ＧＨ活性における加齢関連疾患、及び成
熟ＧＨ欠乏症といったＧＨのＩＧＦ-Ｉ依存性作用の中和；成人発症糖尿病の治
療；及び／又は特定のＩＧＦ欠乏症の治療。

【００６３】本発明のペプチドが有用な更なる及び特定の疾患は、成長疾患、例えばＧＨ-
耐性短身、ＧＨ-非感受性症候群、骨粗鬆症、及び異化状態；治療が組織又は細
胞、例えば末梢神経及び支持細胞、神経及びグリアを含む中枢神経系細胞、及び
オリゴデンドログリア、筋肉、皮膚、及び骨などの他の細胞の再生を必要とする
疾患；心臓疾患、例えば心臓虚血、心臓筋障害、及び鬱血性心臓疾患；高血糖性
疾患、例えばインシュリン依存性及び非インシュリン依存性真性糖尿病及び極度
のインシュリン耐性；及び腎不全などの腎疾患を含む。またこれらは、老齢なヒ
トの同化反応の刺激、グルココルチコイドの異化副作用の防止、骨粗鬆症の治療
、免疫系の刺激、肥満の抑制、創傷治癒の促進、骨折(bond fracture)修復の促
進、成長遅滞の治療、成長遅滞をもたらす腎障害又は不全の治療、成長ホルモン
欠乏児を含む生理学的短身の治療、慢性疾患に関連した短身の治療、肥満及び肥
満に関連した成長遅滞の治療、プラーダー‐ヴィリ症候群及びターナー症候群に
関連する成長遅滞の治療、火傷患者の入院における回復及び緩解の促進、子宮内
成長遅滞、骨格形成異常、副腎皮質機能亢進症、及びクッシング症候群の治療、
拍動性成長ホルモン放出の誘発、ストレス患者における成長ホルモンの置換、骨
軟骨異形成症、ヌーナン症候群、精神分裂病、鬱病、末梢神経障害、ＡＬＳ、抑
鬱、アルツハイマー病、脱髄疾患、多発性硬化症、及び遅滞創傷治癒の治療、免
疫系の刺激、心理的倒錯の治療、肺機能不全及び人工呼吸器依存症の治療、大手
術後のタンパク質異化反応の減衰、癌又はＡＩＤＳなどの慢性疾患による悪液質
及びタンパク質喪失の抑制、ＩＩ型及びＩ型糖尿病を含む高インシュリン血症の
治療、排卵誘発のためのアジュバント治療、胸腺発育の刺激及び加齢関連胸腺機
能低下の防止、免疫抑制患者の治療、骨髄移植患者の治療、筋肉強度、可動化、
筋肉機能の疾患、筋ジストロフィー、皮膚厚維持、及び代謝恒常性の改善、急性
及び慢性腎不全を含む腎機能及び恒常性の亢進、骨芽細胞、骨再構築、及び骨成
長の刺激、免疫系の刺激、及び家畜における成長促進を含む。種々のＩＧＦ-Ｉ
の用途は、WO 94/04569; WO 96/33216; 及びBondy, Ann Intern. Med., 120: 59
3-601 (1994)に見いだされる。

【００６４】一例において、ペプチドは、ブタ、ウシ、ヒツジなどの商業的に重要な動物に
投与し、それらの成長の速度及び程度及びそれらの餌を体組織に変換する効率を
亢進及び増進することができる。ペプチドは、成体及び小児にインビボで投与し
てＩＧＦ又はインシュリン作用を刺激することができる。本発明のペプチドは、経口、非経口（例えば、筋肉内、腹膜内、静脈内、又は
皮下注射又は注入、又は移植）、鼻、肺、膣、直腸、舌下、又は局所投与経路を
含む任意の適切な技術により哺乳動物に投与してよく、各投与経路に適した投与
形態に製剤化できる。特定の投与経路は、例えば、ペプチドの使用で知覚される
又は予測される副作用を含む患者の医学的履歴、投与されるペプチドの型、及び
矯正される特定の疾患に依存するであろう。最も好ましくは、投与は連続的注入
（例えば、徐放装置又はミニポンプ、例えば浸透ポンプ又は皮膚パッチを用いる
）、又は注射（例えば、静脈内又は皮下手段を用いる）である。

【００６５】治療に使用されるペプチドは、個々の患者の臨床的状態（特にペプチド治療の
副作用）、送達部位、投与方法、投与計画、及び実務者に知られた他の要因を考
慮して、良好な医学的実務に合致する形式で製剤化され投薬される。ここでの目
的のためのペプチドの「有効量」は、従って、そのような考慮により決定され、
哺乳動物に対する薬剤の生物学的利用能及び所望の効果をもたらす量でなければ
ならない。好ましい投与は、ＩＧＦ-Ｉ又はインシュリンの効果を再現するために、４−
８週間に渡り、１日におよそ２回の慢性的投与することである。注射が好ましい
が、連続的皮下（ＳＣ）注入用の注入装置を使用した慢性的注入も用いられる。
また、静脈内バッグ溶液も用いられる。糖尿病のための適切な投薬において鍵と
なる要因は、血中グルコースを適当な正常範囲まで低下させることにより、又は
医療実務者が適当であると認めた糖尿病の治療の測定のための他の基準により測
定された場合に得られる結果である。

【００６６】一般的な提案として、非経口投与されたペプチドの用量当たりの製薬的有効量
は、用量−応答曲線によって測定できる範囲内であろう。例えば、ＩＧＦＢＰに
結合した又は血中のＩＧＦは、治療すべき哺乳動物の体液中で測定されて用量が
決定される。あるいは、患者に増加した量のペプチドを投与し、ＩＧＦ-Ｉ及び
ＩＧＦ-ＩＩについての患者のレベルをチェックすることもできる。用いられる
ペプチド量は、これらのＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩの血清レベルに基づいてモル
ベースで計算することができる。ヒト血清に存在するＩＧＦＢＰからのＩＧＦト
レーサーの置換術について下記の実施例を参照のこと。特に、ペプチドの適切な
用量を決定する一つの方法は、体液又は血液などの生物学的液体におけるＩＧＦ
レベルの測定を必要とする。それらのレベルの測定は、ＲＩＡ及びＥＬＩＳＡを
含む任意の手段により実施することができる。ＩＧＦレベルを測定した後、液体
を、１回又は複数回用量を用いてペプチドと接触させる。この接触工程の後、液
体中のＩＧＦレベルを再測定する。液体のＩＧＦレベルが、投与される分子につ
いて所望の効果を生ずるのに十分な量低下した場合、この分子の用量を最大の効
果を生ずるまで調節することができる。この方法は、インビトロ又はインビボで
実施してよい。このましくは、この方法はインビボで実施され、即ち、哺乳動物
から液体が抽出されてＩＧＦレベルが測定された後、本発明のペプチドが哺乳動
物に１回又は複数回用量を用いて投与され（即ち、接触工程が哺乳動物への投与
により実施され）、次いでＩＧＦレベルが哺乳動物から抽出された液体から再測
定される。

【００６７】用量を決定するための他の方法は、ペプチドに対する抗体又はＬＩＦＡ形式で
のペプチドのための他の検出方法を使用することである。これは、ＩＧＦＢＰに
結合した外因性又は内因性ＩＧＦ及びＩＧＦＢＰに結合したペプチド量の検出を
可能にするであろう。用量を決定する他の方法は、血中の「遊離」又は活性なＩＧＦのレベルを測定
することであろう。幾つかの用途のために、「遊離の」ＩＧＦレベルは、有効性
及び有効用量又は投薬量の適切なマーカーとなりうる。例えば、ＩＧＦ結合性タンパク質に結合した内因性又は外因性ＩＧＦ又はイン
シュリン又は本発明のペプチドの量の検出、又は生物学的液体の非結合ＩＧＦ又
は非結合インシュリンの検出について一つの方法が記載されている。この方法は
以下を含む：（ａ）液体を、１）固相担体に固着させた当該ペプチドに特異的なペプチド検
出手段（ペプチド上のエピトープに特異的な第１の抗体など）であって、ペプチ
ドの存在下でペプチド上のＩＧＦ結合部位がＩＧＦ結合性タンパク質のために利
用可能に残されており、それにより当該手段とＩＧＦ結合性タンパク質との間で
複合体が形成される手段；及び２）当該ペプチドと、ＩＧＦ結合性タンパク質上
の全ての利用可能なＩＧＦ結合部位が飽和するのに十分な時間接触させ、それに
より飽和複合体を形成し；（ｂ）飽和複合体を、検出可能に標識された第２の手段であって、ＩＧＦ結合
性タンパク質に特異的であり（ＩＧＦＢＰ上のエピトープに特異的な第２の抗体
など）、ペプチドがＩＧＦ結合性タンパク質に結合したときに結合に利用可能で
ある手段と接触させ；次いで、（ｃ）結合した標識手段の量を、生物学的液体中のＩＧＦＢＰの尺度として、
従って結合したペプチド及びＩＧＦ結合性タンパク質、結合したＩＧＦ又は結合
したインシュリン及びＩＧＦ結合性タンパク質、又は液体内に存在する活性ＩＧ
Ｆ又は活性インシュリンの量の尺度として定量的に分析する。

【００６８】上記の用量決定方法が与えられれば、一般に、用いられるペプチド量が見積も
られ、即ち、患者体重に基づいて、１０μｇ／ｋｇ／日から２００μｇ／ｋｇ／
日が用いられるが、上記したように、これは治療上の自由裁量を大いに受けるで
あろう。特定のＩＧＦＢＰ、例えばＩＧＦＢＰ-１又はＩＧＦＢＰ-３に対するＩＧＦの
分布をＬＩＦＡ形式を用いて評価するさらなる方法が提供される。ペプチドは、徐放系によって好ましく投与される。徐放性組成物の好ましい例
は、成形物品、例えばフィルム、マイクロカプセルの形状の半透性ポリマーマト
リクスを含む。徐放性マトリクスはポリラクチド（米国特許第3,773,919号、EP
58,481）、Ｌ-グルタミン酸とガンマ-エチル-Ｌ-グルタメートとのコポリマー（
Sidman等, Biopolymers, 22: 547-556 (1983)）、ポリ(２-ヒドロキシエチルメ
タクリレート)（Langer等, J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981)及びL
anger, Chem. Tech., 12: 98-105 (!982)）、エチレンビニルアセテート（Lange
r等, 上掲）又はポリ-Ｄ-(-)-３-ヒドロキシブチル酸（EP 133,988）を含む。徐
放性組成物は、リポソーム捕捉されたペプチドも含む。ペプチドを包含するリポ
ソームは、それ自体周知の方法によって調製される：DE 3,218,121; Epstein等,
Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang, 等Proc. Nat
l. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); EP 52,322; EP36,676; EP 88,0
46; EP 143,949; EP 142,641;日本国特許出願83-118008; 米国特許第4,485,045
号及び同4,544,545号; 及びEP 102,324。通常、リポソームは小さい（約２００
〜８００オングストローム）単ラメラ型であり、脂質含有量は約３０モルパーセ
ントコレステロールより大きいが、選択される比率は最も効果的な治療のために
調節される。より長い寿命を持つＰＥＧ化(PEGylated)ペプチドも、例えば、1995年11月30
日発行のWO 95/32003に記載された抱合技術に基づいて使用することができる。

【００６９】非経口投与について、一実施態様では、ペプチドは一般に各々を所望の純度で
単位投薬注射形態（溶液、懸濁液、又は乳化液）で、製薬的、又は非経口的に許
容される担体、即ち、用いる用量及び濃度で受容者に無毒性であり製剤の他の成
分と適合性であるものと混合することにより製剤化される。例えば、製剤は好ま
しくは酸化剤及びポリペプチドに有害であることが知られた他のペプチドを含ま
ない。一般に、製剤は、ペプチドを液体担体又は微細に分けた固体担体又はその両方
と均一かつ密に接触させることにより調製される。次いで、必要ならば、生成物
を所望の製剤に成形する。好ましくは、担体は非経口用担体、より好ましくは患
者の血液と等張の溶液である。このような担体媒体の例は、水、食塩水、リンゲ
ル液、緩衝溶液、及びデキストロース溶液を含む。不揮発性オイル及びオレイン
酸エチルなどの非水性媒体も、ここで有用である。

【００７０】担体は、好ましくは等張性及び化学的安定性を向上させる物質等の少量の添加
剤を含有する。このような物質は、用いる用量及び濃度で受容者に無毒性であり
、リン酸塩、クエン酸塩、コハク酸塩、酢酸、及び他の有機酸又はその塩等のバ
ッファー；アスコルビン酸等の酸化防止剤；低分子量（約１０残基未満）ポリペ
プチド、例えばポリアルギニン又はトリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン、
又は免疫グロブリンなどのタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマ
ー；グリシン；グルタミン酸、アスパラギン酸、ヒスチジン、又はアルギニン等
のアミノ酸；セルロース又はその誘導体、グルコース、マンノース、トレハロー
ス、又はデキストリンを含む単糖類、二糖類、及び他の炭水化物；ＥＤＴＡ等の
キレート化剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等
の対イオン；ポリソルベート、ポロキサマー、又はポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）等の非イオン性界面活性剤；及び／又は中性塩、例えばＮａＣｌ、ＫＣｌ
、ＭｇＣｌ_２、ＣａＣｌ_２等である。ペプチドは典型的にはこのような媒体中に、約４．５から８のｐＨで製剤化さ
れる。上記の賦形剤、担体、又は安定化剤の或るものを使用することがペプチド
の塩の形成をもたらすことが理解されるであろう。最終的な調製物は安定な液体
又は凍結乾燥固体であってよい。

【００７１】製薬組成物としてのペプチドの典型的な製剤を以下に議論する。約０．５から
５ｍｇのペプチド又はペプチドの混合物が、遊離の酸又は塩基の形態又は製薬的
に許容される塩の形態で、生理学的に許容される媒体、単体、賦形剤、結合剤、
防腐剤、安定化剤、芳香剤などとともに、許容される製薬実務に従って配合され
る。これらの組成物中の活性成分の量は、表示した範囲の適切な用量が得られる
ものである。治療用投与に使用されるペプチドは無菌でなければならない。無菌性は、滅菌
濾過膜（例えば、０．２ミクロン膜）を通す濾過により容易に達成される。治療
用組成物は一般に、無菌のアクセスポートを具備する容器、例えば、皮下注射針
で貫通可能なストッパーを持つ静脈内溶液バッグ又はバイアル内に配される。

【００７２】ペプチドは通常、単位又は複数回用量の容器、例えば密封されたアンプル又は
バイアルに、水溶液として又は凍結乾燥された再構成用製剤として保存される。
凍結乾燥された製剤の例として、１０-ｍＬバイアルは、５ｍＬの滅菌濾過され
た１％(w/v)のペプチド水溶液が充填され、得られた混合物が凍結乾燥される。
注入用溶液は、凍結乾燥されたペプチドを静菌性の注射用水を用いて再構成する
ことにより調製される。ここのペプチドと、血中の全ＩＧＦ又はインシュリンを増加させる又はペプチ
ドの効果を向上させる一又は複数の適当な試薬との組み合わせ治療も本発明の一
部である。これらの試薬は一般に、ここのペプチドが生成されたＩＧＦ又はイン
シュリンを放出することを可能にし、成長促進剤を含む。

【００７３】この目的のための成長促進剤は、これらに限られないが、哺乳動物における内
因性ＧＨの放出を促進して血中のＩＧＦ濃度を上昇させるＧＨ分泌促進物質を含
む。例はＴＲＨ、ジエチルスチルベストロール、テオフィリン、エンケファリン
、Ｅシリーズプロスタグランジン、ＶＩＰ-セクレチン-グルカゴン-ＧＲＦファ
ミリーのペプチド、及び米国特許第4,411,890号に記載されたようなＧＨＲＰ-６
、ＧＨＲＰ-１等の他のＧＨ分泌促進物質、及び米国特許第5,206,235号に記載さ
れたもののようなベンゾ-融合ラクタムを含む。1996年5月23日発行のWO 96/1514
8も参照のこと。他の成長促進剤は、ＧＨＲＰ、ＧＨＲＦ、及びＧＨ及びそれら
の類似物を含む。例えば、ＧＨＲＰは、ともに1995年6月29日に発行されたWO 95
/17422及びWO 95/17423; Bowers, J. Pediatr. Endocrinol., 6: 21-31 (1993);
及び Schoen等, Annual Reports in Medical Chemistry, 28: 177-186 (1993)
に記載されている。ＧＨＲＦ及びその類似物は、例えば、1996年11月28日に発行
されたWO 96/37514に記載されている。さらに、ＧＨＲＨ、任意のＩＧＦＢＰ、長鎖ＧＨ、ＧＨプラスＧＨＢＰ、イン
シュリン、又は血糖降下薬も、この目的のために、本発明のペプチドと組み合わ
せて用いることができる。さらに、ＩＧＦ-Ｉ又はＩＧＦ-ＩＩ又はＩＧＦとＩＧ
ＦＢＰ、例えばＩＧＦＢＰ-３に複合したＩＧＦ-Ｉも、本発明のペプチドととも
に用いることができる。例えば、1994年8月4日発行のWO 94/16723 に記載された
ような担体中にＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦＢＰを含有する製薬組成物は、当該ペプチ
ドと組み合わせて用いることができる。実体を、ペプチドに続けて又は同時に投
与することができる。さらに、食事又は運動の計画といったＩＧＦ状態を操作す
る他の手段も、本発明の一部としての組み合わせ治療と考えることもできる。

【００７４】インシュリンも投与される場合、上記したようなインシュリンの任意の製剤又
は型とすることができる。それらの使用されるインシュリンの正確な用量は治療
上の自由裁量を大いに受け、例えば、疾患の型、患者の臨床プロフィール、用い
るＩＧＦ-Ｉ変異体又はＩＧＦ様インシュリンの型及び量、インシュリンの型な
どに依存するが、一般的には約０．５から５００単位／日のインシュリンである
。例として、ヒトの糖尿病治療のためには、ＮＰＨインシュリンは、好ましくは
１日に２回皮下で、約５から５０単位／注射（即ち、約０．２〜２ｍｇ）の用量
である。さらに、製剤は、スルホニルウレア等の血糖降下薬の有効量とともに好ましく
投与される。血糖降下薬は、非経口、経鼻、経口、又は他の有効な経路を含む適
切な技術によって哺乳動物に投与される。最も好ましくは、投与は経口経路によ
る。例えば、Upjohnから１．２５、２．５、及び５ｍｇ錠剤濃度で市販されてい
るMICRONASE(商品名)錠剤（グリブリド）は経口投与に適している。この治療に
配されたＩＩ型糖尿病のための通常の維持用量は、一般的に１日当たり約１．２
５から２０ｍｇであり、それは、適当と認められた場合に１回投薬又は１日を通
して分割して与えられる。Phisician's Desk Reference, 2563-2565 (1995)。処
方に利用可能なグリブリドをベースとする錠剤の他の例は、GLYNASE(商品名)ブ
ランド薬（Upjohn）及びDIABETA(商品名)ブランド薬（Hoechst-Russel）を含む
。GLUCOTROL(商品名)（Pratt）は、５-及び１０-ｍｇ強度で利用可能なギリピジ
ド(１-シクロヘキシル-３-(ｐ-(２-(５-メチルピラジンカルボキサミド)エチル)
フェニル)スルホニル)ウレア)錠剤であり、食事制限に続いて血糖降下治療を必
要とするＩＩ型糖尿病又は他のスルホニルウレアに対する反応が止まった患者に
対しても処方される。Phisician's Desk Reference, 1902-1903 (1995)。スルホ
ニルウレア以外の他の血糖降下薬、例えばビグアニド（例えばメトホルミン又は
フェンホルミン）又はチアゾリジンジオン（例えば、トログリトゾン）、又はイ
ンシュリン作用に影響する他の薬剤も用いられる。チアゾリジンジオンがペプチ
ドとともに用いられる場合、現在使用されているのと同じレベル又は幾分低いレ
ベルで用いられ、それはペプチド単独又はジオンとともに見られる効果に関して
調節され得る。単独で用いられるトログリタゾン（REZULIN(商品名)）の典型的
な用量は、１日当たり約１００−１０００ｍｇ、より好ましくは２００−８００
ｍｇ／日であり、この範囲は本発明に適用可能である。例えば、Ghazzi等, Diab
etes, 46: 433-439 (1997)参照。トログリタゾンより強いインシュリン感作薬で
ある他のチアゾリジンジオンも、より低い用量で用いられよう。

【００７５】さらに、本発明は、それがペプチドである場合の、ペプチドをコードする核酸
を用いた、哺乳動物治療のための遺伝子治療の使用も考慮する。一般に、遺伝子
治療は、哺乳動物におけるＩＧＦ又はインシュリンレベルを上昇（又は過剰発現
）させるために用いられる。ペプチドをコードする核酸は、この目的のために使
用される。アミノ酸配列が知られれば、遺伝子コードの縮重を用いて幾つかの核
酸分子を生成でき、遺伝子治療に使用するためにそれを選択できる。核酸（ベクターに作用可能に含まれるもの）を、遺伝子治療を目的として患者
の細胞に導入するのに２つの主要な方法：インビボ及びエキソビボがある。イン
ビボ送達のために、核酸は患者に、通常はペプチドが必要とされる部位に直接注
入される。エキソビボ治療のためには、患者の細胞が取り出され、核酸がこれら
の単離された細胞に導入され、改変された細胞が患者に、直接に、又は例えば患
者に移植された多孔性膜にカプセル化されることにより投与される。例えば、米
国特許第4,892,538号及び同5,283,187号参照。

【００７６】核酸を生存可能な細胞に導入するために利用可能な種々の技術がある。この技
術は、核酸がインビトロで培養された細胞、又は目的とする宿主の細胞内にイン
ビボで移入されるかに応じて変わる。核酸のインビトロでの哺乳動物細胞への移
入に適した技術は、リポソームの使用、エレクトロポレーション、マイクロイン
ジェクション、細胞融合、ＤＥＡＥ-デキストラン、リン酸カルシウム沈殿法等
を含む。遺伝子のエキソビボ送達用に共通に用いられるベクターはレトロウイル
スである。現在好ましいインビボ格差に入技術は、ウイルスベクター（アデノウイルス、
単純ヘルペスＩウイルス、又はアデノ関連ウイルスなど）及び脂質ベースの系（
遺伝子の脂質媒介移入に有用な脂質は、例えば、ＤＯＴＭＡ、ＤＯＰＥ及びＤＣ
-Ｃｈｏｌである）。核酸供給源を標的細胞を標的化する試薬、例えば細胞表面
タンパク質又は標的細胞に特異的な抗体、標的細胞上のレセプターのリガンド等
とともに提供するのが望ましい状況も存在する。リポソームが用いられる場合、
エンドサイトーシスを伴って細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質を、例
えば、特定の細胞型向性のカプシドタンパク質又はその断片、サイクリングで内
部移行を受けるタンパク質に対する抗体、及び細胞内局在化を標的とし細胞内半
減期を向上させタンパク質の標的化のために及び／又は取り込みを促進するため
に用いてもよい。レセプター媒介エンドサイトーシスの技術は、例えば、Wu等,
J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); 及び Wagner等, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990)により記載されている。現在知られている遺伝
子作成及び遺伝子治療プロトコールの概説については、Anderson等, Science, 2
56: 808-813 (1992)を参照。また、WO 93/25673及びそこに挙げられた参考文献
も参照のこと。

【００７７】本発明ではキットも考慮される。典型的なキットは、製薬的に許容されるバッ
ファー中にペプチドを含有するペプチド製剤のための容器、好ましくはバイアル
、及び使用者に製薬製剤の利用を指示する指示書、例えば製品挿入物又はラベル
を具備する。キットは場合によっては、ＧＨ、ＧＨＲＰ、ＧＨＲＨ、ＧＨ分泌促
進物質、ＩＧＦ、ＩＧＦＢＰに複合したＩＧＦ、ＩＧＦＢＰ、ＧＨＢＰに複合し
たＧＨ；インシュリン、又は血糖降下薬のための容器、好ましくはバイアルを具
備する。本発明の他の実施態様では、哺乳動物の特定部位から離れた、又はそれに向か
う内因性ＩＧＦ又はインシュリンを検出する方法が提供され、それは哺乳動物に
、当該部位で優勢な又は存在しないＩＧＦＢＰに特異的な本発明のペプチドの有
効量を投与することを含む。この目的のための「部位」は、心臓などの特定の組
織又は器官、又は脳特異的ＩＧＦＢＰを介する脳を含む。部位における優勢(pre
valence)とは、問題とするＩＧＦＢＰが当該部位に局在化し、当該部位のＩＧＦ
ＢＰの実質的な又は生物学的に重要な部分を構成することを示す。この効能は、
本発明に示されるペプチドのＩＧＦＢＰ-１対ＩＧＦＢＰ-３についての特異性に
従う。本発明は、以下の実施例を参照することにより、さらに良く理解されるであろ
う。しかし、それらは本発明の範囲を制限すると解釈されない。ここに述べた全
ての文献及び特許は、明示して参考に取り入れるものとする。

【００７８】実施例1 ＩＧＦ−Ｉ及び構造変異体のアラニン-スキャンニング突然変異誘発序：アラニン−スキャンニング突然変異誘発（上掲のCunningham及びWells）を用
いてＩＧＦ-Ｉの各側鎖のベータ炭素を越えた部分を取り除いた。ついでＩＧＦ
ＢＰ-１又はＩＧＦＢＰ-３に対するペプチドの結合の自由エネルギーへのこれら
の原子の寄与を競合ファージＥＬＩＳＡ法によって検査した。このアッセイでは
、ＩＧＦＢＰ-１又はＩＧＦＢＰ-３が、ＩＧＦ-ファージ変異体がＩＧＦＢＰ-１
又はＩＧＦＢＰ-３被覆免疫吸着プレートへ結合するのを阻害するために使用さ
れる。結合タンパク質の一連の滴定から、結合性（ＩＣ_５０）を計算することが
できる。幾つかの変異体はまたBIAcore(商品名)アッセイにおける直接結合性に
ついても調べた。次の２つの組の実施例では、共通のα-アミノ酸は、中間体及び最終生成物を
指すときに、標準的な一文字又は三文字アミノ酸コードによって記述される。共
通のα-アミノ酸とはｍＲＮＡの指示下でタンパク質に組み込まれるアミノ酸を
意味する。標準的な略語は、Merck Index, 10th Edition, pp Misc-2−Misc-3に
列挙されている。特に断らない限り、共通のα-アミノ酸はアルファ炭素原子に
おいて天然即ち「Ｌ」立体配置を有している。コードに「Ｄ」が先行する場合、
これは共通のα-アミノ酸の反対のエナンチオマーを表している。ノルロイシン
（Nle）及びオルニチン（Orn）のような改変された又は普通でないα-アミノ酸
は米国特許商標庁オフィシャルガゼット１１１４ＴＭＯＧ、1990年5月15日に記
載されているように示した。以下に記載するＩＧＦ変異体を用いた実験の結果に基づいて、ここに請求され
たタイプの分子が治療される患者における活性ＩＧＦレベルを上昇させるであろ
うと予測される。

【００７９】材料と方法：ファージミドベクターの作成と突然変異誘発成熟ヒトＩＧＦ−Ｉをコードする遺伝子を、ＰＣＲプライマー5'-AGCTGCTTTGA
TATGCATCTCCCGAAACTCTGTGCGGT-3'（配列番号：４）及び5'-GAGCGATCTGGGTCTAGAC
AGATTTAGCGGGTTTCAG-3'（配列番号：５）を用いてｐＢＫＩＧＦ２Ｂ（米国特許
第5,342,763号）から増幅した。得られた断片をＮｓｉＩ及びＸｂａＩで切断し
、予めＮｓｉＩ及びＸｂａＩで消化したｐＨ０７５３中に結合させた。ｐＨ０７
５３はｐｈＧＨａｍ-ｇ３の誘導体（Lowman等, Biochemistry, 30: 10832-10838
(1991)）であり、アルカリホスファターゼプロモータ（ＰｈｏＡ）領域の更な
るＸｂａＩ部位がオリゴヌクレオチド5'-AAAAGGGTATGTAGAGGTTGAGGT-3'（配列番
号：６）を用いて欠失させられている。ＩＧＦ-Ｉオープンリーディングフレー
ムを含む連結ベクターｐＨ０７５３をｐＩＧＦ-ｇ３と命名した。これは、大腸
菌バクテリオファージＭ１３由来の遺伝子ＩＩＩタンパク質の断片（残基２４９
−４０６）に融合した二重突然変異Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖを有するＩＧＦ-Ｉをコード
している。このＩＧＦ-ＩのＩＧＦＢＰ-１及び-３への結合性は野生型ＩＧＦ-Ｉ
と区別できないことが分かった。アラニン突然変異誘発は鋳型として一本鎖プラ
スミドｐＩＧＦ-ｇ３を用いて実施した（Kunkel等, Methods Enzymol., 204: 12
5-139 (1991)）。システインとアラニンを除くＩＧＦ-Ｉの全ての残基が個々に
アラニンに置換された。得られた作成物をＤＮＡ配列決定によって検証した。

【００８０】ファージに表示されたＩＧＦ変異体のＩＧＦＢＰ-１及び-３への結合性（ファー
ジＥＬＩＳＡ）免疫吸着プレート（Nunc, MAXISOR P(商品名)、96ウェル）を、ｐＨ7.2のＰＢ
Ｓバッファー中1μg/mLのＩＧＦＢＰ-１又はＩＧＦＢＰ-３を100μl/ウェルで用
いて4℃にて一晩かけて被覆した。ついでプレートを室温で2時間、0.5%のＴＷＥ
ＥＮ２０(商品名)／ＰＢＳ（結合バッファーとしても使用）で阻害した（ウシ血
清アルブミンのようなタンパク質様阻害剤は潜在的なＩＧＦ又はＩＧＦＢＰ汚染
を防止するために避けた）。ファージミドベクターで新しく形質転換した大腸菌
細胞（XL1-Blue, Stratagene）をＭ１３-ＶＣＳヘルパーファージ（Stratagene
）の存在下で5mLの２ＹＴ培地（上掲のSambrook等）中で一晩かけて増殖させた
。ファージ粒子を収集し、Cabilly, S. (編), Combinatorial Peptide Library
Protocols (Humena Press Inc.: Totowa, NJ, 1009), pp.249-264中のLowman, H
.B., 「Pharge Dsiplay of Peptide Libraries on Protein Scaffolds」に記載
されたようにしてＰＢＳバッファー中に再懸濁させた。ついで、ファージ濃度を
規格化し、各変異体に対して0.2−0.4の最大ＥＬＩＳＡシグナルを生じさせた（
上掲のCabilly, S. (編)のLowman）。可溶型競合体の３倍連続希釈物を、予め決
定した濃度でファージを含む結合バッファー（0.5%のＴＷＥＥＮ(商品名)２０／
ＰＢＳ）で非吸着マイクロタイタープレート（Nunc, F, 96ウェル）上に調製し
た。競合タンパク質の希釈範囲はＩＧＦＢＰ-１に対して5μM及びＩＧＦＢＰ-３
に対して500nMで出発して6オーダーの規模まで拡張した。阻止後、固定化した標
的を含むプレートを0.05%のＴＷＥＥＮ(商品名)／ＰＢＳバッファーで洗浄し、
ついで室温で１時間の間80μl/ウェルの前もって混合されているファージ−競合
体溶液と共にインキュベートした。洗浄後、結合したファージを、0.5%のＴＷＥ
ＥＮ(商品名)／ＰＢＳ中に一次ウサギ抗ファージポリクローナル抗体と二次ヤギ
抗ウサギモノクローナル抗体−セイヨウワサビペルオキシダーゼ抱合体を含む溶
液を８０μｌ／ウェル用いて検出した。ｏ-フェニレンジアミン（Sigma）とテト
ラメチルベンジジン（Kirkegaard及びPerry）を色素生産物質として使用し、生
成物をそれぞれ492及び450nmで検出した。ＩＣ_５０値は、結合データを基準飽和
曲線に一致させることにより決定された（上掲のCabilly, S. (編)のLowman）。
各ＩＧＦ-Ｉ変異体の少なくとも二つの個々のクローンが検定された。表Ｉの数
は個々に評価されたＩＣ_５０値の平均+-標準偏差を表している。

【００８１】ＩＧＦＢＰ-１及びＩＧＦＢＰ-３の発現と精製 Mortensen等, Endocrinology, 138: 2073-2080 (1997)により記載されている
ようにして、ヒトＩＧＦＢＰ-１をＣＨＯ細胞中で発現させ、条件培地から精製
した。組換えヒトＩＧＦＢＰ-３をまたクローニングし、哺乳動物細胞で発現さ
せた（Wood等, Mol. Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988)）。条件培地からの
精製は、ＩＧＦアフィニティーカラム（Martin及びBaxter, J. Biol. Chem., 26
1:8754-8760 (1986)）を用いて、本質的にＩＧＦＢＰ-１に対して記述された手
順に従った。

【００８２】可溶型ＩＧＦ-Ｉ変異体の発現と精製プラスミドｐＢＫＩＧＦ２Ｂ（米国特許第5,342,763号）はＰ_ｐｈｏＡプロモ
ータの制御下でｌａｍＢのリーダーペプチドに融合したヒト野生型ＩＧＦ-Ｉを
発現する。部位特異的突然変異誘発の簡単化のために、ファージｆｌ複製起点（
fl ori）をプラスミドｐＢＫＩＧＦ２Ｂ中に導入した。そのために、fl oriを含
む466bpのＢａｍＨＩ断片をｐＨ０７５３から切除し（上掲のLowman,1991）、プ
ラスミドｐＢＫＩＧＦ２ＢをＥｃｏＲＩで線形化した。ベクターと断片の双方を
クレノー酵素で処理して、平滑末端連結に先立って制限部位オーバーハングに充
填した。Ｍ１３ＶＣＳヘルパーファージの存在下で一本鎖ファージミドＤＮＡを
つくり出す能力について正しい作成物を選択した。得られたファージミドベクタ
ーをｐＢＫＩＧＦ２Ｂ-ｆｌ-ｏｒｉと名付け、Kunkel等, Methods Enzymol., 20
4: 125-139 (1991)の手順を使用して対象のＩＧＦ-Ｉala-変異体を作成するため
に鋳型として用いた。突然変異誘発の各工程はＤＮＡ配列決定により確認した。

【００８３】ＩＧＦ-Ｉ変異体の発現は、ＩＧＦ-Ｉ野生型に対して記述されているようなも
の（Joly等, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2773-2777 (1998)）であったが
、オキシドレダクターゼの一過性の過剰発現を伴わなかった。精製手順は、過去
のプロトコールに基づき（Cleland, J. L. (編), Protein Folding In Vivo and
In Vitro (American Chemical Society, Washington,DC, 1993), pp.178-188)
中の Chang及びSwartz, "Single-Step Solubilization and Folding of IGF-1 A
ggregates from Escherichia coli）、僅かに適合化させた。典型的には、6gの
湿った細胞ペースト（24時間成長させた2リットルの低リン酸培地と等価）を5mM
のＥＤＴＡを含むｐＨ7.5の25mMのトリス-ＨＣｌの150ml中に再懸濁させた。細
胞をマイクロフルイダイザー（Microfluidics Corp., Newton, MA）中で溶解さ
せ、蓄積したＩＧＦ-Ｉ凝集物を含む屈折粒子を12000xgでの遠心分離により収集
した。屈折粒子を溶解バッファーで2回、1%のＮ-ラウロイル-サルコシン（Sigma
）を含む溶解バッファーで2回洗浄して膜タンパク質を抽出し、溶解バッファー
で再び2回洗浄した。洗浄した屈折体を、2Mの尿素、100mMのＮａＣｌ、20%のＭ
ｅＯＨ、及び2mMのＤＴＴを含むｐＨ10.4の50mMのＣＡＰＳ（３-(シクロヘキシ
ルアミノ)-１-プロパンスルホン酸；Sigma）バッファー中におよそ2mg/mlで再懸
濁させた。この手順は、屈折体の可溶化とそれに続くＩＧＦ-Ｉ変異体の酸化再
折り畳みを組み合わせたたものである（上掲のChangとSwartz）。室温で3時間後
、リフォールディング溶液を、50kDaの分子量カットオフ性を持つマイクロコン
セントレーター膜（Centricon, Amicon）を通して濾過した。殆どの単量体ＩＧ
Ｆ-Ｉが溶出液中に回収される一方、より高分子量の汚染物は未透過物中に濃縮
された。この時点で、ＩＧＦ-Ｉ画分は、ＳＤＳ-ＰＡＧＥ分析から判断したとこ
ろ、＞95%の純度であった。ＩＧＦスワップ（二つの非天然ジスルフィドを含む
；Hober等, Biochemistry, 31: 1749-1756 (1992)；Miller等, Biochemistry, 3
2: 5203-5213 (1993)）から正しくジスルフィド結合したＩＧＦ-Ｉを分離するた
めに、リフォールディング溶液を5%の酢酸で酸性化し、4ml/分でDynamax(商品名
)Ｃ１８半調製用ＨＰＬＣカラム（Varian；10.0mmID）に充填した。バッファー
はＨ_２Ｏ／0.1%ＴＦＡ（Ａ）及びアセトニトリル／0.1%ＴＦＡ（Ｂ）であった。
ジスルフィド異性体の分離は次の勾配：0−30%Ｂを20分、30−45%Ｂを60分を適
用して達成された。ＩＧＦ-スワップに対する未変性ＩＧＦ-Ｉの比は各変異体に
対して通常は約2:1であり、ＩＧＦ-スワップは未変性ＩＧＦ-Ｉより早い勾配で
溶出した。各変異体の分子量は質量分析により検証した。ＨＰＬＣ精製後に、試
料を凍結乾燥し、100mMのＨＥＰＥＳバッファー、ｐＨ7.4中に約1mg/mlで再構成
した。

【００８４】バイオセンサーによる反応速度測定ＩＧＦＢＰ-１とＩＧＦＢＰ-３に対するＩＧＦ変異体の結合親和性を、BIAcor
e(商品名)-2000実時間反応速度相互作用分析システム（Biacore, Inc., Piscata
way, NJ）を使用して会合（ｋ_ａ）速度と解離（ｋ_ｄ）速度を測定することによ
り決定した。カルボキシメチル化デキストランバイオセンサーチップ（CM5, BIA
core Inc.）を供給者の指示に従ってＥＤＣ（Ｎ-エチル-Ｎ'-(３-ジメチルアミ
ノプロピル)-カルボジイミドヒドロクロリド）及びＮＨＳ（Ｎ-ヒドロキシスク
シンイミド）で活性化させた。固定化については、20mMの酢酸ナトリウム、ｐＨ
4.8中のＩＧＦ変異体を50μg/mlの濃度でバイオセンサーチップに注入し、およ
そ450−600RU（共鳴応答単位）の共有的に結合したタンパク質を生成した。未反
応群は1Mのエタノールアミンの注入で阻害した。反応速度の測定を、25℃で20μ
l/分の流量を用いて、流れるバッファー（ＰＢＳ、0.05%Ｔｗｅｅｎ２０、0.1%
卵白アルブミン、0.1%アジ化ナトリウム）中ＩＧＦＢＰ-１又はＩＧＦＢＰ-３の
何れかの2倍の連続希釈物（1μMで開始）を注入することにより実施した。会合
速度（ｋ_ａ）と解離速度（ｋ_ｄ）はBIAcore(商品名)評価ソフトウェア3.0バージ
ョンにおいて1:1のラングミュアー（Langmuir）(商品名)会合モデルを用いて別
個に計算した。平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）はｋ_ｄ／ｋ_ａとして計算した。

【００８５】結果ＩＧＦ-１の一価ファージディスプレーＩＧＦ-Ｉの７０のアミノ酸残基の迅速かつ包括的なアラニンスキャンのため
に、タンパク質がファージＭ１３の表面に一価的に表示（ディスプレー）される
かどうかが最初に測定された（Bass等, Proteins, 8:309-314 (1990)）。ファー
ジディスプレー技術は迅速な一本鎖ＤＮＡ突然変異誘発の利点と得られた変異体
タンパク質の簡単な精製とを、対応するファージ粒子を単に単離することによっ
て組み合わせたものである（例えば上掲のCunningham等, 1994）。成熟ヒトＩＧ
Ｆ-ＩがＭ１３遺伝子ＩＩＩ産物のカルボキシ末端ドメインに融合されたベクタ
ーが作成された。この作成物は大腸菌の細胞膜周辺腔に融合タンパク質を向かわ
せ、タンパク質の一価表示を可能にするｓｔＩＩシグナル配列を含んでいる（上
掲のBass等；上掲のLowman等, 1991）。クローニングのために、ＩＧＦ-１の最
初のアミノ酸と最後のアミノ酸を変化させ；得られた変異体Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖは
続くアラニンスキャンニング突然変異誘発のための鋳型作成物として使用した。

【００８６】ＩＧＦ-ＩＧ１Ｓ-Ａ７０Ｖを表示するファージ粒子を単離し、ＩＧＦＢＰに
対するその親和性についての結合競合ファージＥＬＩＳＡ法において検定したと
き、その実験で決定されたＩＣ_５０はＩＧＦＢＰ-１に対しては8.5nM、ＩＧＦＢ
Ｐ-３に対しては0.5nMであった（Ｆｉｇ１）。これらの値は野生型ＩＧＦ-Ｉを
使用するBIAcore(商品名)実験により決定された解離定数（上掲のHeding等）と
よく一致している。放射活性イムノアッセイ（ＲＩＡ）により測定された野生型
ＩＧＦ-Ｉ親和性は、ＩＧＦＢＰ-１に対して〜2.8nM、ＩＧＦＢＰ-３に対して〜
0.8nMであり、更にファージＥＬＩＳＡ法から導かれたＩＣ_５０値を裏付けてい
る。また、ＩＧＦ-ＩＧ１Ｓ-Ａ７０Ｖを表示するファージ粒子は、ミクロタイ
タープレート上に固定した１１の独立したモノクローナルマウス抗ＩＧＦ-Ｉ抗
体によって効率的に捕捉された。これらの結果を併せると、表示されたＩＧＦ変
異体が正しく折り畳まれ、ファージ粒子の表面上で接近可能であることが示唆さ
れる。

【００８７】ＩＧＦＢＰ-１及びＩＧＦＢＰ-３へのＩＧＦ-Ｉ結合のＡｌａ-スキャンニング突
然変異誘発Ｇ１Ｓ-Ａ７０ＶＩＧＦ-Ｉの全ての残基を、4個の未変性アラニン及び6個のシ
ステインを除いて、記述したＧ１Ｓ-Ａ７０ＶＩＧＦ-ＩｇＩＩＩベクターを鋳型
として使用して１個のアラニンで置換した。また、単一変異体Ｓ１Ｇ及びＶ７０
Ａ及び野生型ＩＧＦ-Ｉを復活させる二重変異体を作成した。これらの作成物の
各々が大腸菌において発現され、ファージ上に表示された。ＩＧＦＢＰ-１とＩ
ＧＦＢＰ-３への結合性に対するＩＣ_５０値はＦｉｇ１に示したような競合ファ
ージＥＬＩＳＡ法によって測定した。各変異体の少なくとも二つの異なったクロ
ーンを試験した。得られたＩＣ_５０値は表Ｉに列挙し、Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖに対す
る各変異体に対するＩＣ_５０の減少又は増加はＦｉｇ２にグラフで表す。

【００８８】 ^ａ星印で示した変異体は、文書中に記載した抗体実験で判定した場合に、ファー
ジ上に成功裏に表示されなかった（n.d.）。相対的ＩＣ５０は、ＩＣ_５０mut／
ＩＣ_{５０G1S-A70V}と定義した。相対的特異性は、各変異体についての相対的ＩＣ _{５０ＩＧＦＢＰ-１} ／ＩＣ_{５０ＩＧＦＢＰ-３}と定義した。

【００８９】アラニン変異体の大部分はファージＥＬＩＳＡ法においてＩＣ_５０値の僅かな
変化を生じただけであった。重要なことは、野生型ＩＧＦ-Ｉがバックグラウン
ドにおいてアラニン置換が実施されたＧ１Ｓ-Ａ７０Ｖと同じ親和性をＩＧＦＢ
Ｐ-１とＩＧＦＢＰ-３に対して示したことである。アラニンに変化したときほん
の僅かな残基だけが有意な（＞10倍）親和性の損失を引き起こした：ＩＧＦＢＰ
-１結合に対してはＥ３、Ｇ７、Ｌ１０、Ｖ１１、Ｆ２５、Ｒ３６、Ｐ３９、Ｆ
４９及びＰ６３；ＩＧＦＢＰ-３結合に対してＶ１１、Ｒ３６、Ｐ３９、及びＰ
６３。グリシンとプロリンのａｌａ-置換はタンパク質骨格の構造的な攪乱に至
りうることを述べておく（Di Cera, Chem. Rev., 98: 1563-1591 (1998)）。結合親和性における極く僅かな緩やかな改善がアラニン置換によって見出され
た。Ｓ１Ａ，Ｄ１２Ａ及びＤ４５ＡはＩＧＦＢＰ-１結合性においておよそ2倍の
増加を示す一方、Ｓ３５Ａ及びＴ４１ＡはＩＧＦＮＢＰ-３に対して同様の効果
を示した。しかしながら、ＩＣ_５０値の2倍の変化がこれらの実験における精度
の限界である。

【００９０】ＩＧＦＢＰ特異性決定因子Ｅ３Ａ、Ｇ７Ａ、Ｌ１０Ａ、Ｆ２５Ａ及びＦ４９はＩＧＦＢＰ-１対ＩＧＦＢ
Ｐ-３の結合において差次的な効果を示した。これらの５つのＩＧＦ-Ｉ単一アラ
ニン変異体において、ＩＧＦＢＰ-１の相対ＩＣ_５０はＩＧＦＢＰ-３のものとは
4倍以上異なっていた（Ｆｉｇ２；表Ｉ、相対的特異性）。Ｅ３ＡとＦ４９Ａは
この群において最も大きな相対特異性因子を示した。Ｅ３のアラニン置換はＩＧ
ＦＢＰ−３の親和性には実質的に効果を持っておらず（1.4倍）、ＩＧＦＢＰ-１
への結合は34倍弱められている。更に劇的なことには、Ｆ４９Ａの親和性はＩＧ
ＦＢＰ-１に対しては100倍以上減少しているがＢＰ-３に対しては3.6倍だけであ
る。この結果は、ファージＥＬＩＳＡ法による直接の比較において示した。ＩＧ
Ｆ-ＩＦ４９Ａを表示するファージ粒子を可溶型ＩＧＦＢＰ-１（Ｆｉｇ３Ａ）
又はＩＧＦＢＰ-３（Ｆｉｇ３Ｂ）の存在下でＩＧＦＢＰ-３被覆ウェルに添加し
た。ＩＧＦ-ＩＧ１Ｓ-Ａ７０Ｖを表示している対照ファージと比較して、Ｆ４
９Ａの結合曲線はＩＧＦＢＰ-１競合において２乗以上シフトした（Ｆｉｇ３Ａ
）。これに対して、結合曲線はＩＧＦＢＰ-３競合においては同様であり、ＩＣ
_５０値の差異はファクター4未満であった（Ｆｉｇ３Ｂ）。よって、Ｅ３とＦ４
９はＩＧＦ-Ｉ分子においてＩＧＦＢＰ-１結合のための二つの主要な特異性決定
因子である。

【００９１】残基Ｇ７、Ｌ１０及びＦ２５は、アラニンによって置換されたときＩＧＦＢＰ
-３に対するよりもＩＧＦＢＰ-１に対する親和性の顕著な損失を示したが、両方
のＩＧＦＢＰの結合に対して重要であると思われた。ＩＧＦＢＰ-３に対しては
、ＩＧＦＢＰ-３に対してよりもＩＧＦＢＰ-１に対してより強く結合する変異体
のような、有意な特異性決定因子は特定されなかった。しかし、変異Ｅ９Ａ、Ｄ
１２Ａ、Ｆ２３Ａ、Ｙ２４Ａ、Ｔ２９Ａ、Ｓ３４Ａ及びＤ４５ＡはＩＧＦＢＰ-
１結合性についてよりもＩＧＦＢＰ-３に対して僅かに大きな（約2倍の）効果を
有していた。

【００９２】精製された可溶型ＩＧＦ変異体のBIAcore(商品名)測定ファージＥＬＩＳＡ法によって得られた結果の妥当性の確認のために、特異的
アラニン変異体を発現させ、BIAcore(商品名)装置を用いた反応速度分析のため
に精製した。野生型ＩＧＦ-Ｉの解離定数（Ｋ_Ｄ）はＩＧＦＢＰ-１に対しては13
nMで、ＩＧＦＢＰ-３に対しては1.5nMであると決定された（Ｆｉｇ５Ａと５Ｂ；
表ＩＩ）。ＩＧＦＢＰに対する親和性の差異は、ＩＧＦＢＰ-３に対するＩＧＦ-
Ｉの10倍速い会合速度（ｋ_ａ）のためである（3.2ｘ10^５対3.2ｘ10^４M^−１s^−１）。これらの結果はファージＥＬＩＳＡによって測定された絶対ＩＣ_５０値とよ
く対応している（Ｆｉｇ１Ａ及び１Ｂ；表Ｉ）。予想されるように、二重変異体
Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖは野生型とは本質的に区別ができない反応速度パラメータを示
した（表ＩＩ）。

【００９３】Ｖ１１Ａ、Ｒ３６Ａ及びＰ３９Ａは、これらの変異体はファージに正しく表示
されなかったので、抗体認識実験（上を参照）に基づいて試験した。Ｒ３６Ａと
Ｐ３９Ａは双方の結合タンパク質に対して野生型の速度を示したが、Ｖ１１Ａは
ＩＧＦＢＰ-１とＩＧＦＢＰ-３の双方に対して親和性の5倍の減少を示した。更に、可溶型ＩＧＦ変異体Ｔ４Ａを試験することが決定された。この残基は以
前の刊行物（上掲のBayne等, J. Biol. Chem., 263; 上掲のClemmons等, 1990）
においてはＩＧＦＢＰ結合に関連していたが、ここでのファージアッセイでは小
幅な効果を示していた。野生型ＩＧＦ-Ｉに対するＴ４ＡのＫ_Ｄ値の増加はファ
ージＥＬＩＳＡ法により測定されたＩＣ_５０比よりおよそ2−3倍高かった（表Ｉ
Ｉ）。ファージ及びバイオセンサー分析により得られた結果の間の大きな矛盾は
Ｆ１６Ａに対して見られた。この場合、二つの方法は4因子だけ異なっていた。

【００９４】最初のα-螺旋領域における変異はＩＧＦタンパク質構造に不安定化効果を有
していることが示されている（上掲のJansson等, 1997）。如何なる理論にも制
約を受けるものではないが、ファージの表面上のｇ３融合タンパク質は再び折り
畳まれ精製された可溶型タンパク質よりも更に安定であるかもしれないと思われ
る。これは、二つの残基が構造的に感受性のＮ-末端螺旋の外側に位置している
Ｆ２５ＡとＦ４９Ａに対して得られたBIAcore(商品名)の結果によって裏付けら
れている。Ｋ_ＤとＩＣ_５０におけるそれぞれの変化はこれらの二つの変異体に対
して優れた一致を示している（表ＩＩ）。ＩＧＦＢＰへの結合に対するＦ４９Ａ
の差次的効果はBIAcore(商品名)分析によって確認された。70倍の親和性の減少
がＩＧＦＢＰ-１結合に対して測定されたが（Ｆｉｇ５Ｃ；表ＩＩ）、ＩＧＦＢ
Ｐ-３結合性は4倍だけ減少した（Ｆｉｇ５Ｄ；表ＩＩ）。

【００９５】 ^ａ解離定数（Ｋ_Ｄmut／Ｋ_Ｄwt）における相対的変化は、ファージディスプレー
により決定した相対的ＩＣ_５０値（ＩＣ_５０mut／ＩＣ_{５０G1S-A70V}）（表Ｉ）
と比較した。

【００９６】Ｎ-末端ＩＧＦ-Ｉ残基の役割驚いたことに、ＩＧＦＢＰ-３の相互作用は、ＩＧＦＢＰ-３がおよそ10倍高い
親和性をもってＩＧＦ-Ｉに結合するという事実にも拘わらず、ＩＧＦＢＰ-１と
の相互作用よりも、アラニン置換により影響を受ける度合いは一般にかなり少な
かった。Ｐ６３Ａとは別に、何れのアラニン変異体もＩＧＦＢＰ-３親和性の＞6
倍の低減を示さなかった（Ｆｉｇ２と表Ｉ）。バイオセンサーの実験においてdes(1-3)-ＩＧＦ-Ｉが25倍低減した親和性でも
ってＩＧＦＢＰ-３に結合することが過去に示されている（上掲のHeding等）。
ＩＧＦ-Ｉのこの天然に生じる型は最初の３つのＮ-末端残基を欠いており、おそ
らくはＩＧＦＢＰ結合性の低減のために分裂促進能力の増加を示す（上掲のBagl
ey等）。最初の３つアミノ酸側鎖の何れもＩＧＦＢＰ-３の結合に対するエネル
ギーを助長しないにもかかわらず（表Ｉ）、des(1-3)-ＩＧＦ-ＩがＩＧＦＢＰ-
３結合において妥協されるので、如何なる理論に制約されるものではないが、骨
格相互作用が関与しているとの仮説が立てられる。

【００９７】この仮説は、最初の３個のＮ-末端アミノ酸を置換する三重アラニン変異体（A
la(1-3)-ＩＧＦ-Ｉ）をファージ上に表示することにより試験された。その領域
の骨格がＩＧＦＢＰ-３との相互作用に寄与しているならば、この変異体は結合
できなければならない。しかし、ＩＧＦＢＰ-１への結合性はＥ３側鎖の欠落の
ために低減していなければならない（表Ｉ）。位置１及び２におけるＩＧＦＢＰ
-１との潜在的な骨格の相互作用を試験するため、対照としてdes(1-2)-ＩＧＦ-
Ｉ変異体を産生した。予想されたように、Ala(1-3)-ＩＧＦ-ＩはＥ３Ａと同様に
ＩＧＦＢＰ-１親和性を減少させたが、ＩＧＦＢＰ-３親和性における変化は示さ
なかった（表Ｉ；Ｆｉｇ２）。des(1-2)-ＩＧＦ-Ｉに対しては、双方の結合タン
パク質に対して親和性の差は観察されなかった。des(1-3)-ＩＧＦ-Ｉ（上掲のHe
ding等）に関する知見と併せると、これらの結果は、如何なる理論にも限定され
るものではないが、ＩＧＦ-Ｉの残基３及び４の間のペプチド骨格がＩＧＦＢＰ-
３との重要な相互作用を媒介することを示唆している。

【００９８】検討ＩＧＦ-Ｉの表面上の機能性ＩＧＦＢＰ-１及びＩＧＦＢＰ-３結合エピトープ
がアラニンスキャンニング突然変異誘発により立証された。両方の結合エピトー
プはＦｉｇ６に示されている。個々のＩＧＦ-Ｉ側鎖相互作用はＩＧＦＢＰ-３に
対してよりもＩＧＦＢＰ-１への結合に対して更に重要な役割を果たしている。
二つの主要な結合パッチがＩＧＦＢＰ-１に対して見いだされる（Ｆｉｇ６Ａ）
。一つが（Ｇ７、Ｌ１０、Ｖ１１、Ｌ１４、Ｆ２５、Ｉ４３、及びＶ４４からな
る）Ｎ末端ヘリックスの上面に位置し、一つが（Ｅ３、Ｔ４、Ｌ５、Ｆ１６、Ｖ
１７及びＬ５４からなる）下面に位置している。これらの二つの結合パッチはＦ
４９とＲ５０によって架橋されている。ＩＧＦＢＰ-３に対しては、結合エピト
ープはより散在性であり、Ｇ２２、Ｆ２３及びＹ２４を含むようにずれている（
Ｆｉｇ６Ｂ）。ＩＧＦＢＰ-３の結合性は一般にアラニン置換にはあまり感受性
ではない。実際、親和性の最も大なる減少は（Ｐ６３Ａの他は、以下参照）Ｇ７
Ａに対して見られる6倍の減少である。最もありそうなことは、如何なる理論に
も制約を受けるものではないが、ＩＧＦ-Ｉ主鎖骨格に由来する相互作用がＩＧ
ＦＢＰ-３の結合性に寄与していることである。この仮説は更にAla(1-3)-ＩＧＦ
変異体での実験により実証される。単一及び三重アラニン置換はＩＧＦＢＰ-３
結合性への効果を持たないが、最初の３個のアミノ酸の欠失の結果、25倍の親和
性の減少があった（上掲のBagley等；上掲のClemmons等；上掲のHeding等）。要
約すると、ＩＧＦ-Ｉは異なった結合様式を用いてＩＧＦＢＰ-１とＩＧＦＢＰ-
３に結合し；数個のアミノ酸側鎖の相互作用がＩＧＦＢＰ-１への結合に重要で
ある一方、骨格相互作用がＩＧＦＢＰ-３への結合に対して主要な活動的な役割
を担うように思われる。

【００９９】最近の刊行物では、異核ＮＭＲスペクルによるＩＧＦＢＰ-１に対するＩＧＦ-
Ｉの結合エピトープが調査されている（上掲のJansson等, 1998）。著者はとり
わけＩＧＦ-Ｉ残基２９、３０、３６、３７、４０、４１、６３、６５、及び６
６が30℃でのＩＧＦＢＰ-１との複合体形成時に化学シフトによる攪乱を受ける
ことを見いだしている。更に、Janssonと共同研究者はＲ３６、Ｒ３７及びＲ５
０が機能性結合エピトープの一部であると特定し、BIAcore(商品名)実験でその
アラニン変異体を試験した。著者により観察された親和性の最も大きな変化はＲ
５０Ａに対する3倍の減少であった。しかし、ホルモンの最初のＮＭＲでの研究
において既に観察されているＩＧＦ-Ｉの構造上の柔軟性のために（上掲のCooke
等）、Jansson等は、Ｆ４９を含む多くの残基をＮＭＲスペクトルに完全には指
定することはできなかった。

【０１００】タンパク質−タンパク質界面の同様な研究において、僅かな側鎖残基だけが大
部分の結合自由エネルギーに寄与することが見いだされた（Clackson及びWells,
Science, 267:383-386 (1995); Kelley等, Biochemistry, 34: 10383-10392 (1
995)）。同じことがＩＧＦ−ＧＦＢＰ-１相互作用に対しても当てはまる。しか
し、ここでは、ＶＩＩａ因子への組織因子の結合に対して注目されたように、重
要な側鎖に由来する結合自由エネルギー値の大きさ（ΔΔＧ）は成長ホルモンの
場合よりも小さい（上掲のKelley等）。支配的なΔΔＧの寄与を持つ残基は成長
ホルモン-レセプター界面におけるようにＩＧＦ-Ｉ表面上でクラスター形成しな
いが（上掲のClackson及びWells）、連続的なＩＧＦＢＰ-１結合エピトープをな
お形成した（Ｆｉｇ６Ａ）。これに対して、ＩＧＦ-Ｉ上のＩＧＦＢＰ-３結合エ
ピトープは不連続であり、側鎖は個々の結合エネルギーに極めて小幅に寄与した
。

【０１０１】ＩＧＦ-ＩにおけるアラニンによるＰ６３の置換により、競合ファージＥＬＩ
ＳＡにおいて使用された濃度範囲で測定できない両方の結合タンパク質の親和性
の減少が生じた。しかし、残基Ｐ６３は主結合エピトープに対してＩＧＦ-Ｉ分
子の反対側に位置している。更に、グリシンとプロリンのアラニン置換が構造変
化に至りうることが着目された（上掲のDi Cera）。また、上掲のJansson等, 19
98は、ＩＧＦ-ＩのＣ-末端部分は直接のＩＧＦＢＰ-１接触には関与していない
が、むしろ複合体生成時に間接的な立体配置変化を受けると結論した。ＩＧＦ-
Ｉ上の抗体結合部位の広範な特徴付けはManes等, Endocrinology, 138: 905-915
(1997)によりなされている。彼らは、Ｃ-末端Ｄドメインを認識する抗体との複
合体におけるＩＧＦ-ＩへのＩＧＦＢＰ-１又は-３の同時の結合を示した。これ
らの結果は、残基Ｐ６３で始まるＤドメインがＩＧＦＢＰ-１又は-３の結合に関
与していないという以前の知見を更に裏付けている（上掲のBayne等, 1988）。

【０１０２】ファージＥＬＩＳＡにより得られたＩＣ_５０比とBIAcore(商品名)の結果の間
の主たる矛盾は残基Ｆ１６で観察された。既に述べたように、アラニンによるこ
の残基の置換によりＩＧＦ-Ｉ分子の構造変化が誘導された（上掲のJansson等,
1997）。同じ効果がBIAcore(商品名)の結果におけるＫ_Ｄで見られたが、親和性
の減少はファージＥＬＩＳＡ実験ではそれ程顕著ではなかった（表ＩＩを参照）
。双方のBIAcore(商品名)の測定では精製工程の間に再び折り畳まれたＩＧＦ-Ｆ
１６Ａが使用された（上掲のJansson等, 1997）。しかし、ファージディスプレ
ーでは、対象のタンパク質は大腸菌の分泌機構によって自然に転位置される。一
価ファージディスプレーにおける低タンパク質量（ファージ粒子当たり＜１分子
）は凝集及び誤った折り畳みを嫌う。また、切断したｇ３ファージタンパク質へ
ＩＧＦ-Ｉを融合させるとペプチドの未変性構造に安定化効果を働かせたかもし
れない。

【０１０３】循環中のＩＧＦ-Ｉの大部分はＩＧＦＢＰ-３と酸不安定サブユニット（ＡＬＳ
）と名付けられた第３のタンパク質との複合体として見いだされる（上掲のBach
とRechler；Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8:45-62 (1997); 上掲の
JonesとClemmons）。150kDの分子量のこの三元複合体は脈管構造壁を横断できず
、ＩＧＦに対する循環リザーバとして作用する。この機構によってＩＧＦ-Ｉの
半減期が劇的に増加する（Simpson等, Grwoth Horm IGF Res, 8: 83-95 (1998)
）。ＩＧＦＢＰ-３の量はＩＧＦ-Ｉによってポジティブに調節される。これに対
してＩＧＦＢＰ-１の役割はそれ程明確ではない。このクラスの結合タンパク質
は一般にはＩＧＦＢＰ-３程豊富ではなく、その量はインスリンによりネガティ
ブに調節される（上掲のBachとRechler；上掲のClemmons, 1997; 上掲のJonesと
Clemmons）。ここでの結果に基づいて、ＩＧＦ-ＩのＩＧＦＢＰ特異的変異体が得られる。
幾つかのアラニン変異の組み合わせが、ＩＧＦＢＰ-３の高親和性結合性を保持
しながら非常に弱くＩＧＦＢＰ-１に結合する変異体を産生する。ＩＧＦＢＰ-３
にもはや結合しないＩＧＦＢＰ-１特異的変異体のデザインはＩＧＦ-Ｉのファー
ジディスプレーと特定の位置でのアミノ酸の無作為化を含みうる（上掲のCunnin
gham等；LowmanとWells, J. Mol. Biol., 243:564-578 (1993)）。

【０１０４】結論：ＩＧＦＢＰ-１とＩＧＦＢＰ-３への結合に対して重要なＩＧＦ-Ｉの残基を同
定した。特定のＩＧＦＢＰに対する結合特異性を決定する幾つかの残基が見いだ
された。最近の刊行物（上掲のLoddick；上掲のLowman等, 1998）では、生物学
的利用能のある「遊離の」ＩＧＦ-Ｉの増加プールが結合タンパク質から内在性
ＩＧＦ-Ｉを置換することにより産生された動物実験が報告されている。ＩＧＦ
ＢＰ特異的ＩＧＦ-Ｉ変異体は上記のように診断又は治療のために使用すること
ができる。

【０１０５】実施例２ＩＧＦ様インシュリンインシュリンは、BIAcore(商品名)実験で測定した場合に、ＩＧＦＢＰ-３に対
して251+/-91nMの弱い親和性を持つと報告された（Heding等, 上掲）。即ち、Ｉ
ＧＦ-Ｉとの高親和性複合体（0.23nM）に比較して、インシュリンは1000倍弱く
結合する。従って、インシュリンはＩＧＦＢＰに結合するのに必要な正しい構造
骨格を提示していると思われ、幾つかの正しい残基が導入されると結合性は向上
するであろう。 Cascier等, Endocrinology, 上掲は、ここのアラニンスキャンニングデータ（
ＩＧＦＢＰ-３に対するAla(1-3)ＩＧＦ-Ｉの野生型親和性（表Ｉ））とは異なり
、インシュリンのＮ-末端領域のＩＧＦ-Ｉへの置換で結合性タンパク質への親和
性の約1000倍の低下を報告し、これは、ＩＧＦ-ＩのＮ-末端近傍の置換がＩＧＦ
ＢＰ-３結合を可能にすることを示唆している。これは、ＩＧＦ／インシュリン
ハイブリッド（Phe^-1, Val¹, Asn², Gln³, His⁴, Ser⁸, His⁹, Glu¹², Tyr¹⁵, L
eu¹⁶）ＩＧＦのＮ-末端に存在する付加残基、Phe^-1によると思われる（番号付け
は、Cascier等, Endocrinology, 上掲のＩＧＦ-Ｉについてのものである）。プ
ロインシュリン又はインシュリンにおけるPhe¹の欠失は、ＩＧＦＢＰ-３への結
合性を向上させると予想される。アラニンスキャンニングの結果に基づいて、Ｉ
ＧＦＢＰ-３への結合性のさらなる向上は、突然変異（プロインシュリン番号付
け）F25Y、Y26F、及びT73Fの作成によって得られるが、これは、ＩＧＦ-Ｉにお
けるこれらの側鎖の置換がＩＧＦＢＰ-３結合性に影響し（表Ｉ）、プロインシ
ュリン（並びにインシュリン）がこれらの部位においてＩＧＦ-Ｉと相違するか
らである（Ｆｉｇ４）。インシュリン又はプロインシュリンのＩＧＦＢＰ-１へ
の結合性は、突然変異Q4E、L17F、Y26F、及びT49Fによって向上すると予想され
、これは、ＩＧＦ-Ｉにおけるこれらの側鎖の置換がＩＧＦＢＰ-１結合性に影響
し（表Ｉ）、プロインシュリン（並びにインシュリン）がこれらの部位において
ＩＧＦ-Ｉと相違するからである（Ｆｉｇ４）。

【０１０６】上掲のSlieker等は、インシュリンの長時間作用性類似物が、インシュリンを
内因性因子に結合するように操作することによって製造されうることを提案した
。ＩＧＦ-Ｉ：ＩＧＦＢＰ複合体（例えば、Cascier等, Endocrinology, 上掲参
照）での類推により、そのような複合体は、遊離のホルモンより遅く循環からク
リアされるであろう。しかしながら、彼らが報告したインシュリン変異体は、Ｉ
ＧＦＢＰに対して僅かな親和性、そしてインシュリンレセプターに対して低下し
た親和性しか持たなかった（Slieker等, 上掲）。以前の研究より高い分解能で
のＩＧＦＢＰ-１及びＩＧＦＢＰ-３に対する結合性決定基の特定により、レセプ
ター結合性を保持するが、ＩＧＦＢＰに対して有意な親和性を達成する異なるプ
ロインシュリン及びインシュリン変異体が操作された。

【０１０７】ヒトのプロインシュリンもファージ上に表示されている。従って、単一部位及
び複数部位変異体の結合親和性が上記の技術によって容易に測定できる。プロインシュリンのインシュリンへの変換は、R31からR65の領域（上述の残基
を含む）の切除によって起こる。得られた成熟インシュリンのアミノ-末端ペプ
チドはＢ鎖、カルボキシ-末端はＡ鎖と呼ばれる。これらの鎖は２つの鎖間ジス
ルフィドによってともに保持される。上記の番号付け系は、天然配列ヒトプロイ
ンシュリンを参照するもので、その配列はヒトＩＧＦ-Ｉの天然配列と比較して
Ｆｉｇ４に示した。プロインシュリン変異体がＩＧＦＢＰに成功裏に結合するフ
ァージ上に表示された場合、これらの変異は可溶性の成熟インシュリンに導入さ
れる。

【０１０８】実施例３ヒトＩＧＦ-Ｉでのヒトの治療この実施例は、一又は複数のＩＧＦＢＰに結合する外来的に投与されたペプチ
ドが、内因性ＩＧＦを置換するためにどのように作用するか、及びヒトでの使用
のためにここのペプチドをどのように投薬するかの原理を示す。この実験において、ヒトＩＩ型糖尿病患者に、組換えヒトＩＧＦ-Ｉ又はプラ
シーボが４種の用量（10、20、40又は80μg/kg）で１２週間、１日に２回ずつ注
射することによって投与された。血液試料は、12週間の処理の前、2週間毎、及
び後（ＥＰ）に取り出した。ＩＧＦ-Ｉ、ＩＧＦ-ＩＩ、及びＩＧＦＢＰ-３の濃
度を全ての試料において測定したが、ＩＧＦ-ＩＩは、10μg/日のＩＧＦ-Ｉで処
理した患者から取った試料では測定しなかった。

【０１０９】 WO 98/45427の図４３は、患者の血液におけるＩＧＦ-Ｉの濃度を示している。
予測されない発見は、40及び80μgのＩＧＦ-Ｉ投与の「プラトー」効果であり；
これら２つの用量で同じＩＧＦ-Ｉの全血中濃度に達した。 WO 98/45427の図４４は、患者の血液におけるＩＧＦ-ＩＩの濃度を示している
。ＩＧＦ-Ｉレベルの上昇とは異なり、ＩＧＦ-ＩＩレベルはＩＧＦ-Ｉ濃度の上
昇とほぼ鏡像パターンで降下した。ＩＧＦ-Ｉ濃度上昇のプラトー化と同様に、
ＩＧＦ-ＩＩ濃度降下もプラトーに達した。 WO 98/45427の図４５は、患者の血液におけるＩＧＦＢＰ-３血中のＩＧＦ-Ｉ
及びＩＧＦ-ＩＩのパターンにおける明らかな変化とは異なり、ＩＧＦＢＰ-３の
濃度は統計的に有意な又は明らかな変化のパターンを示さなかった。

【０１１０】 WO 98/45427の図４３及び４４の検査により、全ＩＧＦ濃度（ＩＧＦ-Ｉプラス
ＩＧＦ-ＩＩ）は処理によって殆ど変化しないことが明らかとなった。これは、
ＩＧＦ-Ｉ濃度の上昇がＩＧＦ-ＩＩの降下と密接に合致することによる。３つ全
ての図を検査することにより、患者の血液におけるＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ濃
度の用量に関連した変化が、ＩＧＦＢＰ-３結合性タンパク質容量の減少を伴わ
ないことが示された（ＩＧＦＢＰ-３は血中の主要な結合性タンパク質である）
。ＩＧＦ-ＩＩ濃度の低下、及びＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩ濃度のプラトー化に
ついての明らかな説明は、ＩＧＦ結合性タンパク質容量の限界量が存在し、この
実験において使用したＩＧＦ-Ｉの用量が結合性タンパク質からのＩＧＦ-ＩＩの
用量に関連した置換を起こしたことである。

【０１１１】活性ＩＧＦのレベルを向上させる能力を持つ任意の分子が、この実施例でＩＧ
Ｆ-Ｉについて示されたものに類似する活性を示すと予測することは、この実施
例における観察の論理的な拡張である。さらに、使用したＩＧＦ-Ｉの用量及び
示したＩＧＦＢＰ及びＩＧＦ-Ｉ及びＩＧＦ-ＩＩの濃度から、活性な内因性ＩＧ
Ｆのレベルを向上させるためにどれくらいのペプチドを与えるべきかを計算する
ことは簡単である。ＩＧＦ-Ｉに比較した分子サイズ、ペプチドのＩＧＦＢＰに
対する親和性、及びその生体利用性は、ヒトにおいて活性ＩＧＦを増加させた用
量に到達するのに考慮される他の変数である。本発明は、ここでやむを得ず或る特定の方法及び材料を参照して議論した。こ
れらの特定の方法及び材料の議論は本発明の範囲の一切の制限を構成するもので
はなく、本発明の目的を達成するのに適した任意かつ全ての代わりうる材料及び
方法に拡張されるものである。

【配列表】

【図面の簡単な説明】

【Ｆｉｇ１Ａ及び１Ｂ】ＩＧＦＢＰ-１（Ｆｉｇ１Ａ）及びＩＧＦＢＰ-３
（Ｆｉｇ１Ｂ）に結合する変異体、Ｇ１Ｓ-Ａ７０ＶＩＧＦ-ＩのファージＥＬ
ＩＳＡを示す図である。1μg/mlのＩＧＦＢＰ-１（Ｆｉｇ１Ａ）又はＩＧＦＢＰ
-３（Ｆｉｇ１Ｂ）でコートしたミクロタイタープレートを、Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖを
表示するファージ粒子とともに、表示した量の可溶性競合タンパク質、ＩＧＦＢ
Ｐ-１（Ｆｉｇ１Ａ）又はＩＧＦＢＰ-３（Ｆｉｇ１Ｂ）の存在下でインキュベー
トした。競合物の半最大阻害濃度（ＩＣ_５０）、即ち、その特定の実験において
ファージミドの半最大結合をもたらす競合物の阻害濃度を各ＩＧＦＢＰについて
示した。

【Ｆｉｇ２】ファージＥＬＩＳＡにより試験したＩＧＦ-Ｉ変異体につい
てのＩＧＦＢＰ親和性の低下又は向上を示す図である。各ＩＧＦ-Ｉアラニン変
異体の相対的ＩＣ_５０値（ＩＣ_{５０ｍｕｔ}／ＩＣ_{５０Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖ}）（ＩＧ
Ｆ-ＩＧ１Ｓ-Ａ７０Ｖ）に対する結合性タンパク質についての各変異体の親和性
変化）をＩＧＦＢＰ-１（黒棒）及びＩＧＦＢＰ-３（白棒）について示した。デ
ータは下記の表１から取った。相対的ＩＣ_５０＜１は親和性の向上；値＞１は親
和性の低下を示す。星印は、これら特定の変異体が、抗体結合性で判断した場合
、ファージ上に表示されていなかったことを示す。

【Ｆｉｇ３Ａ及び３Ｂ】競合的ファージＥＬＩＳＡにおける、ファージ上
に表示されたＩＧＦ-Ｉ変異体Ｆ４９Ａの、各々ＩＧＦＢＰ-１及びＩＧＦＢＰ-
３に対する結合特異性を示す図である。Ｆ４９Ａ（四角）を表示するファージミ
ド粒子は、ＩＧＦＢＰ-３でコートしたプレートに、表示した量の可溶性ＩＧＦ
ＢＰ-１（Ｆｉｇ３Ａ）又はＩＧＦＢＰ-３（Ｆｉｇ３Ｂ）の存在下で結合した。
野生型様ＩＧＦ-Ｉ変異体Ｇ１Ｓ-Ａ７０Ｖ（丸印）を表現するファージで同じ実
験を平行して行った。絶対的なＩＣ_５０値については下記の表Ｉ及びＩＩを参照
のこと。データ点は、平均+-標準偏差、n=2である。免疫吸着プレートを1μg/ml
のＩＧＦＢＰ-３でコートし、野生型ＩＧＦ-Ｉファージ（ＷＴ、丸印）及び異ｆ
ｇ-Ｆ４９Ａファージ（Ｆ４９Ａ、四角）を平行して用いて下記の実施例に記載
したようにＥＬＩＳＡを実施した。実験は２回行い、データ点は平均+-標準偏差
で示した。実際の実験におけるＩＣ_５０値を図に示した。

【Ｆｉｇ４】天然配列ヒトＩＧＦ-Ｉ（ｗｔＩＧＦと称する）（配列番号
：１）、天然配列ヒトプロインシュリン（プロインシュリンと称する）（配列番
号：２）、及び天然配列ヒトインシュリン（インシュリン（Ｂ鎖）に次いでイン
シュリン（Ａ鎖）と称する）（配列番号：３）の配列アラインメントを示す図で
ある。星印及び傍点は、各々３つの配列間での表示したアミノ酸位置での配列同
一性及び配列相同性を示す。

【Ｆｉｇ５Ａ-５Ｄ】固定化ＩＧＦ-Ｉ変異体へのＩＧＦＢＰ結合のバイオ
センサー分析を示す。センサーグラムは、固定化した野生型ＩＧＦ-Ｉ（Ｆｉｇ
５Ａ、５Ｂ）又はＦ４９Ａ変異体（Ｆｉｇ５Ｃ、５Ｄ）へのＩＧＦＢＰ-１（Ｆ
ｉｇ５Ａ、５Ｃ）又はＩＧＦＢＰ-３（Ｆｉｇ５Ｂ、５Ｄ）の結合について示し
た。核実験のリガンド濃度は、1μM、500nM、及び250nMであった。速度論的パラ
メータについては表ＩＩを参照のこと。

【Ｆｉｇ６Ａ-６Ｂ】各々ＩＧＦ-Ｉ表面上のＩＧＦＢＰ-１及びＩＧＦＢ
Ｐ-３についての機能的結合エピトープのモデルを示す図である。アミノ酸鎖は
、それらの結合エネルギー（表Ｉ）に対する相対的寄与に従って分類し、次のよ
うに色分けした：効果無し（灰色）；見かけの親和性の２−５倍の低下（黄色）
；５−１０倍（橙色）；１０−１００倍（明赤色）；＞１００倍（暗赤色）。利
用可能なら場合は、下記の表ＩのファージＥＬＩＳＡ実験からの数を使用した。
Ｖ１１Ａ、Ｒ３６Ａ及びＰ３９Ａ変異体（表ＩＩ）に代えてBIAcore(商品名)デ
ータを使用した。ＩＧＦ-ＩのＮＭＲ構造（Cooke等, 上掲）を、プログラムInsi
ght II(商品名)（MSI, San Diego, CA）を用いて表現した。ＩＧＦＢＰ-１につ
いての結合エピトープ（Ｆｉｇ６）は、Ｎ-末端螺旋（残基８−１７）の「上」
及び「下」表面に位置し、エネルギー的に重要な残基Ｆ４９によって連結されて
いる。ＩＧＦＢＰ-３については（Ｆｉｇ６Ｂ）、個々のＩＧＦ-Ｉ側鎖は極くわ
ずかしか結合エネルギーに寄与しない。結合性エピトープはＮ-末端から移動し
、新たにＧ２２、Ｆ２３、Ｙ２４を包含する。

【手続補正書】特許協力条約第３４条補正の翻訳文提出書

【提出日】平成１２年１２月７日（２０００．１２．７）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 9/00 Ａ６１Ｐ 37/00 25/00 43/00 １１１ 37/00 Ｃ０７Ｋ 14/62 43/00 １１１Ｃ１２Ｎ 15/00 ＡＣ０７Ｋ 14/62 Ａ６１Ｋ 37/36 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ，ＵＧ，ＺＷ )，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＤＭ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者ドゥバクイエ，イブアメリカ合衆国カリフォルニア 94132，サンフランシスコ，アーバーロードライブ 329 (72)発明者ロウマン，ヘンリーアメリカ合衆国カリフォルニア 94018，エルグラナダ，サンワンアベニュー 400，ボックス 2556 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA02 CA04 DA06 EA03 HA01 HA17 4C084 AA01 AA02 AA07 BA01 BA08 BA20 CA01 CA53 DB58 MA01 MA52 MA55 MA59 MA60 MA66 NA14 ZA012 ZA372 ZA812 ZB072 ZC032 ZC212 ZC352 ZC412 ZC542 4H045 AA10 AA30 BA10 CA40 DA38 EA20 FA74

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】天然配列ヒトＩＧＦ-Ｉの位置３、４、５、７、１０、１４
、１７、２３、２４、２５、４３、４９又は６３のアミノ酸、あるいはそれらの
アミノ酸と位置１２又は１６又は１２と１６の両方との組み合わせ、あるいはそ
れらの任意の組み合わせが、前記位置７の任意のアミノ酸又は前記位置７以外の
アラニン、グリシン、又はセリン残基で置換されたＩＧＦ-Ｉ変異体。
【請求項２】前記位置３のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変異体
。
【請求項３】前記位置４のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変異体
。
【請求項４】前記位置５のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変異体
。
【請求項５】前記位置７のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変異体
。
【請求項６】前記位置１０のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変異
体。
【請求項７】前記位置１４のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変異
体。
【請求項８】前記位置１７のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変異
体。
【請求項９】前記位置２３のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変異
体。
【請求項１０】前記位置２４のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変
異体。
【請求項１１】前記位置２５のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変
異体。
【請求項１２】前記位置４３のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変
異体。
【請求項１３】前記位置４９のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変
異体。
【請求項１４】前記位置６３のアミノ酸が置換された請求項１に記載の変
異体。
【請求項１５】前記位置１６及び４９のアミノ酸が置換された請求項１に
記載の変異体。
【請求項１６】前記位置３及び７のアミノ酸が置換された請求項１に記載
の変異体。
【請求項１７】前記位置２４のチロシンがロイシンで、又は前記位置３１
のチロシンがアラニンで、又はそれら両方がさらに置換された請求項１５に記載
の変異体。
【請求項１８】前記位置２４のチロシンがロイシンで、又は前記位置３１
のチロシンがアラニンで、又はそれら両方がさらに置換された請求項１６に記載
の変異体。
【請求項１９】両方のチロシンが置換された請求項１７に記載の変異体。
【請求項２０】両方のチロシンが置換された請求項１８に記載の変異体。
【請求項２１】天然配列ヒトＩＧＦ-Ｉの位置３、４、５、７、１０、１
４、１７、２３、２４、２５又は４３のアミノ酸、あるいはそれらの任意の組み
合わせが、前記位置７の任意のアミノ酸又は前記位置７以外のアラニン、グリシ
ン、又はセリン残基で置換されたＩＧＦ-Ｉ変異体。
【請求項２２】天然配列ヒトＩＧＦ-Ｉの位置３、４、５、７、１０、１
４、１７、２３、２４、２５、４３又は４９のアミノ酸、あるいはそれらの任意
の組み合わせが、前記位置７の任意のアミノ酸又は前記位置７以外のアラニン、
グリシン、又はセリン残基で置換されたＩＧＦ-Ｉ変異体。
【請求項２３】天然配列ヒトＩＧＦ-Ｉの位置３、４、５、７、１０、１
４、１７、２３、２４、２５、４３又は６３のアミノ酸、あるいはそれらの任意
の組み合わせが、前記位置７の任意のアミノ酸又は前記位置７以外のアラニン、
グリシン、又はセリン残基で置換されたＩＧＦ-Ｉ変異体。
【請求項２４】天然配列ヒトプロインシュリンの位置１のフェニルアラニ
ンが欠失された、又は天然配列ヒトプロインシュリンの位置４のグルタミンがグ
ルタミン酸で置換された、又は天然配列ヒトプロインシュリンの位置１７のロイ
シンがフェニルアラニンで置換された、又は天然配列ヒトプロインシュリンの位
置２５のフェニルアラニンがチロシンで置換された、又は天然配列ヒトプロイン
シュリンの位置２６のチロシンがフェニルアラニンで置換された、又は天然配列
ヒトプロインシュリンの位置７３のトレオニンがフェニルアラニンで置換された
、又はこれらの任意の組み合わせを含むＩＧＦ様のインシュリン。
【請求項２５】前記位置１のアミノ酸が欠失され、前記位置２５のアミノ
酸が置換された請求項２４に記載のインシュリン。
【請求項２６】前記位置１のアミノ酸が欠失され、前記位置２６のアミノ
酸が置換された請求項２４に記載のインシュリン。
【請求項２７】前記位置１のアミノ酸が欠失され、前記位置７３のアミノ
酸が置換された請求項２４に記載のインシュリン。
【請求項２８】前記位置１のアミノ酸が欠失され、前記位置２５及び２６
のアミノ酸が置換された請求項２４に記載のインシュリン。
【請求項２９】前記位置１のアミノ酸が欠失され、前記位置２５及び７３
のアミノ酸が置換された請求項２４に記載のインシュリン。
【請求項３０】前記位置１のアミノ酸が欠失され、前記位置２６及び７３
のアミノ酸が置換された請求項２４に記載のインシュリン。
【請求項３１】前記位置１のアミノ酸が欠失され、前記位置２５、２６及
び７３のアミノ酸が置換された請求項２４に記載のインシュリン。
【請求項３２】前記位置４及び１７のアミノ酸が置換された請求項２４に
記載のインシュリン。
【請求項３３】前記位置４及び２６のアミノ酸が置換された請求項２４に
記載のインシュリン。
【請求項３４】前記位置４及び７３のアミノ酸が置換された請求項２４に
記載のインシュリン。
【請求項３５】前記位置１７及び２６のアミノ酸が置換された請求項２４
に記載のインシュリン。
【請求項３６】前記位置１７及び７３のアミノ酸が置換された請求項２４
に記載のインシュリン。
【請求項３７】前記位置２６及び７３のアミノ酸が置換された請求項２４
に記載のインシュリン。
【請求項３８】前記位置４、１７及び２６のアミノ酸が置換された請求項
２４に記載のインシュリン。
【請求項３９】前記位置４、１７及び７３のアミノ酸が置換された請求項
２４に記載のインシュリン。
【請求項４０】前記位置４、２６及び７３のアミノ酸が置換された請求項
２４に記載のインシュリン。
【請求項４１】前記位置１７、２６及び７３のアミノ酸が置換された請求
項２４に記載のインシュリン。
【請求項４２】天然配列ヒトプロインシュリンの位置１のフェニルアラニ
ンが欠失された、又は天然配列ヒトプロインシュリンの位置４のグルタミンがグ
ルタミン酸で置換された、又は天然配列ヒトプロインシュリンの位置２５のフェ
ニルアラニンがチロシンで置換された、又は天然配列ヒトプロインシュリンの位
置２６のチロシンがフェニルアラニンで置換された、又は天然配列ヒトプロイン
シュリンの位置７３のトレオニンがフェニルアラニンで置換された、又はこれら
の任意の組み合わせを含むＩＧＦ様のインシュリン。
【請求項４３】位置１のフェニルアラニンが欠失された、又は天然配列ヒ
ト成熟インシュリンの位置４のグルタミンがグルタミン酸で置換された、又は天
然配列ヒト成熟インシュリンの位置１７のロイシンがフェニルアラニンで置換さ
れた、又は天然配列ヒト成熟インシュリンの位置２５のフェニルアラニンがチロ
シンで置換された、又は天然配列ヒト成熟インシュリンの位置２６のチロシンが
フェニルアラニンで置換された、又は天然配列ヒト成熟インシュリンの位置３８
のトレオニンがフェニルアラニンで置換された、又はこれらの任意の組み合わせ
を含むＩＧＦ様のインシュリン。
【請求項４４】前記位置４、１７、２６及び３８のアミノ酸が置換された
請求項４３に記載のインシュリン。
【請求項４５】前記位置１のアミノ酸が欠失され、前記位置２５、２６及
び３８のアミノ酸が置換された請求項４３に記載のインシュリン。
【請求項４６】位置１のフェニルアラニンが欠失された、又は天然配列ヒ
ト成熟インシュリンの位置４のグルタミンがグルタミン酸で置換された、又は天
然配列ヒト成熟インシュリンの位置２５のフェニルアラニンがチロシンで置換さ
れた、又は天然配列ヒト成熟インシュリンの位置２６のチロシンがフェニルアラ
ニンで置換された、又は天然配列ヒト成熟インシュリンの位置３８のトレオニン
がフェニルアラニンで置換された、又はこれらの任意の組み合わせを含むＩＧＦ
様のインシュリン。
【請求項４７】請求項１に記載の変異体を担体中に含んでなる組成物。
【請求項４８】請求項２４に記載のインシュリンを担体中に含んでなる組
成物。
【請求項４９】請求項４３に記載のインシュリンを担体中に含んでなる組
成物。