ES2329220T3 - Variantes mutantes del factor de crecimiento similar a insulina (igf) i. - Google Patents

Variantes mutantes del factor de crecimiento similar a insulina (igf) i. Download PDF

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Abstract

Una variante de IGF-1 que comprende una alanina en posición 3.

Description

Variantes mutantes del factor de crecimiento similar a insulina (IGF) I.
Antecedentes de la invención Campo de la invención
Esta invención se refiere a moléculas útiles como agonistas de los factores de crecimiento similares a insulina (IGF), así como a moléculas de insulina similares a IGF. Más particularmente, estas moléculas inhiben la interacción de un IGF o insulina con una o más de las proteínas de unión a IGF. Dichas moléculas pueden usarse, por ejemplo, en cualquier método en el que se usen los IGF o insulinas, por ejemplo, en el tratamiento de trastornos hiperglucémicos, relacionados con la obesidad, neurológicos, cardiacos, renales, inmunológicos y anabólicos.
Descripción de antecedentes y técnica relacionada
Los factores de crecimiento similares a insulina I y II (IGF-I e IGF-II, respectivamente) median múltiples efectos in vivo, incluyendo la proliferación celular, la diferenciación celular, la inhibición de la muerte celular y la actividad similar a insulina (revisados en Clark y Robinson, Cytokine Growth Factor Rev., 7: 65-80 (1996); Jones y Clemmons, Endocr. Rev., 16: 3-34 (1995)). La mayoría de estas respuestas mitógenas y metabólicas se inician por activación del receptor de IGF-I, un \alpha_{2}\beta_{2}-heterotetrámero estrechamente relacionado con el receptor de insulina (McInnes y Sykes, Biopolv., 43: 339-366 (1998); Ullrich et al., EMBO J., 5: 2503-2512 (1986)). Ambas proteínas son miembros de la superfamilia de receptores tirosina quinasa y comparten cascadas de señalización intracelular comunes (Jones y Clemmons, anteriormente). Se han aislado receptores híbridos de IGF-insulina pero se desconoce su función. Los receptores de IGF-I e insulina se unen a sus ligandos específicos con afinidad nanomolar. El IGF-I y la insulina pueden presentar reacciones cruzadas con sus receptores no afines respectivos, aunque a una afinidad 100-1000 veces menor (Jones y Clemmons, anteriormente). Se ha descrito recientemente la estructura cristalina que describe parte de la porción extracelular del receptor de IGF-I (Garrett et al., Nature, 394: 395-399 (1998)).
A diferencia de la insulina, la actividad y la semivida de IGF-I están moduladas por seis proteínas de unión a IGF-I (IGFBP 1-6) y quizá además por una clase de proteínas más distantemente relacionadas (Jones y Clemmons, anteriormente; Baxter et al., Endocrinology, 139: 4036 (1998)). Las IGFBP pueden inhibir o potenciar la actividad de IGF dependiendo de si están solubles o asociadas a membrana celular (Bach y Rechler, Diabetes Reviews, 3: 38-61 (1995)). Las IGFBP se unen a IGF-I e IGF-II con afinidades y especificidades variables (Jones y Clemmons, anteriormente; Bach y Rechler, anteriormente). Por ejemplo, la IGFBP-3 se une a IGF-I e IGF-II con una afinidad similar, mientras que la IGFBP-2 y la IGFBP-6 se unen a IGF-II con una afinidad mucho mayor que con la que se unen a IGF-I (Bach y Rechler, anteriormente; Oh et al., Endocrinology, 132, 1337-1344
(1993)).
Las IGFBP clásicas tienen una masa molecular que varía entre 22-31 kDa y contiene un total de 16-20 cisteínas en sus dominios amino- y carboxi-terminales conservados (Bach y Rechler, anteriormente; Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8: 45-62 (1997); Martin y Baxter, Curr. Op. Endocrinol. Diab., 16-21 (1994)). El dominio central que conecta ambas regiones ricas en cisteína está sólo débilmente conservado y contiene los sitios de escisión para proteasas específicas de IGFBP (Chemausek et al., J. Biol. Chem., 270: 11377-11382 (1995); Clemmons, anteriormente; Conover, Prog. Growth Factor Res., 6: 301-309 (1995)). Puede conseguirse una regulación adicional de las IGFBP mediante fosforilación y glicosilación (Bach y Rechler anteriormente; Clemmons, anteriormente). No existe una estructura de alta resolución disponible para ningún miembro intacto de la familia de IGFBP. Sin embargo, se han descrito recientemente las estructuras de RMN de dos fragmentos N-terminales de IGFBP-5 que conservan la actividad de unión a IGF (Kalus et al., EMBO J., 17: 6558-6572 (1998)).
El IGF-I es una proteína de cadena sencilla de 70 aminoácidos con alta homología con la proinsulina. A diferencia de los otros miembros de la superfamilia de la insulina, la región C del IGF no se elimina proteolíticamente después de la traducción. Se han descrito las estructuras de RMN en solución de IGF-I (Cooke et al., Biochemistry, 30: 5484-5491 (1991); Hua et al., J. Mol. Biol., 259: 297-313 (1996)), mini-IGF-I (una variante modificada por ingeniería genética que carece de la cadena C; DeWolf et al., Protein Science, 5: 2193-2202 (1996)) e IGF-II (Terasawa et al., EMBO J., 13: 5590-5597 (1994); Torres et al., J. Mol. Biol., 248: 385-401 (1995)). Generalmente está aceptado que se usan epítopos diferentes sobre IGF-I para unirse a proteínas receptores y de unión. Se ha demostrado en modelos animales que mutantes de IGF inactivos para receptor son capaces de desplazar el IGF-I endógeno de las proteínas de unión y de este modo generar un efecto neto de IGF-I in vivo (Loddick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 1894-1898 (1998); Lowman et al., Biochemistry, 37: 8870-8870 (1998)). Aunque los restos Y24, Y29, Y31 e Y60 están implicados en la unión a receptor, los mutantes de IGF de los mismos todavía se unen a IGFBP (Bayne et al., J. Biol. Chem., 265: 15648-15652 (1990); Bayne et al., J. Biol. Chem., 264: 11004-11008 (1989); Casciere et al., Biochemistry, 27: 3229-3233 (1988); Lowman et al., anteriormente).
Además, se ha descubierto que una variante denominada (1-27,gly^{4},38-70)-hIGF-I, en la que los restos 28-37 de la región C del IGF-I humano se sustituyen por un puente de glicina de cuatro restos, se une a IGFBP pero no a receptores de IGF (Bar et al., Endocrinology, 127: 3243-3245 (1990)).
Una multitud de estudios de mutagénesis han abordado la caracterización del epítopo de unión a IGFBP en IGF-I (Bagley et al., Biochem. J., 259: 665-671 (1989); Baxter et al., J. Biol. Chem., 267: 60-65 (1992); Bayne et al., J. Biol. Chem., 263: 6233-6239 (1988); Clemmons et al., J. Biol. Chem., 265: 12210-12216 (1990); Clemmons et al., Endocrinology, 131: 890-895 (1992); Oh et al., anteriormente). En resumen, se descubrió que los restos N-terminales 3 y 4 y la región helicoidal que comprende los restos 8-17 eran importantes para la unión a las IGFBP. Además, se ha identificado un epítopo que implica a los restos 49-51 en la unión a IGFBP-1, -2 y -5 (Clemmons et al., Endocrinology, anteriormente, 1992). Además, se demostró que una forma truncada de IGF-1 de origen natural que carece de los tres primeros aminoácidos N-terminales (denominada des(1-3)-IGF-I) se unía a IGFBP-3 con una afinidad 25 veces menor (Heding et al., J. Biol. Chem., 271: 13948-13952 (1996); Patentes de Estados Unidos Nº 5.077.276; 5.164.370; 5.470.828).
En un intento por caracterizar las contribuciones a la unión de restos aminoacídicos expuestos en la hélice N-terminal, se construyeron varios mutantes de alanina de IGF-I (Jansson et al., Biochemistry, 36: 4108-4117 (1997)). Sin embargo, los espectros de dicroísmo circular de estas proteínas mutantes mostraban cambios estructurales en comparación con IGF-I de tipo silvestre, haciendo difícil asignar con claridad contribuciones a la unión con IGFBP a las cadenas laterales mutadas. Se adoptó una estrategia diferente en un estudio muy reciente en el que el epítopo de unión a IGFBP-1 en IGF-I se sondó mediante espectroscopía de RMN heteronuclear (Jansson et al., J. Biol. Chem., 273: 24701-24707 (1998)). Los autores identificaron además que los restos R36, R37 y R50 estaban implicados en la unión a IGFBP-1.
Se han descrito otras variantes de IGF-I. Por ejemplo, en la bibliografía de patentes, el documento WO 96/33216 describe una variante truncada que tiene los restos 1-69 del IGF-I auténtico. El documento EP 742.228 describe superagonistas de IGF-I de dos cadenas que son derivados del IGF-I de cadena sencilla de origen natural que tiene un dominio C abreviado. Los análogos de IGF-I son de la fórmula: BC^{n},A donde B es el dominio B de IGF-I o un análogo funcional del mismo, C es el dominio C de IGF-I o un análogo funcional del mismo, n es el número de aminoácidos en el dominio C y es de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 y A es el dominio A de IGF-I o un análogo funcional del mismo.
Además, Cascieri et al., Biochemistry, 27: 3229-3233 (1988) describe cuatro mutantes de IGF-I, teniendo tres de ellos una afinidad reducida con el receptor de IGF Tipo 1. Estos mutantes son: (Phe^{23},Phe^{24},Tyr^{24})IGF-I (que es equipotente al IGF-I humano en su afinidad con los receptores de IGF Tipos 1 y 2 y de insulina), (Leu^{24})IGF-I y (Ser^{24})IGF-I (que tienen una afinidad menor que el IGF-I con el receptor de IGF Tipo 1 placentario humano, el receptor de insulina placentario y el receptor de IGF Tipo 1 de células de rata y ratón) y desoctapéptido (Leu^{24})IGF-I (en el que la pérdida de aromaticidad en la posición 24 se combina con la deleción de la región D carboxilo-terminal de hIGF-I, que tiene menor afinidad que el (Leu^{24})IGF-I por el receptor Tipo 1 y mayor afinidad por el receptor de insulina). Estos cuatro mutantes tienen afinidades normales por proteínas de unión séricas humanas.
Bayne et al., J. Biol. Chem., 264: 11004-1008 (1988) describe tres análogos estructurales de IGF-I: (1-62)IGF-I, que carece de la región D carboxilo-terminal de 8 aminoácidos de IGF-I; (1-27,Gly^{4},38-70)IGF-I, en el que los restos 28-37 de la región C de IGF-I se sustituyen por un puente de glicina de cuatro restos; y (1-27,Gly^{4},38-62), con una sustitución de glicina en la región C y una deleción en la región D. Peterkofsky et al., Endocrinology, 128: 1769-1779 (1991) describe datos que usan el mutante Gly^{4} de Bayne et al., anteriormente, Vol. 264. La Patente de Estados Unidos Nº 5.714.460 se refiere al uso de IGF-I o de un compuesto que aumente la concentración activa de IGF-I para tratar lesiones neurales.
Cascieri et al., J. Biol. Chem., 264: 2199-2202 (1989) describe tres análogos de IGF-I en los que se sustituyen restos específicos en la región A de IGF-I con los restos correspondientes en la cadena A de insulina. Los análogos son: (Ile^{41},Glu^{45},Gln^{46},Thr^{49},Ser^{50},Ile^{51},Ser^{53},Tyr^{55},Gln^{56})IGF-I, un mutante de cadena A en el que el resto 41 se cambia de treonina a isoleucina y se sustituyen los restos 42-56 de la región A; (Thr^{49},Ser^{50},Ile^{51})IGF-I; y (Tyr^{55},Gln^{56})
IGF-I.
El documento WO 94/04569 describe una molécula de unión específica distinta de una IGFBP natural que es capaz de unirse a IGF-I y puede aumentar la actividad biológica de IGF-I. El documento WO98/45427 publicado el 15 de octubre de 1998 y Lowman et al., anteriormente, describen agonistas de IGF-I identificados por presentación en fagos. Además, el documento WO 97/39032 describe inhibidores de ligando de IGFBP y métodos para su uso.
Existen diversas formas de insulina humana en el mercado que difieren en la duración de la acción y el comienzo de la acción, pero que tienen la secuencia humana nativa. Jens Brange, Galenics of Insulin, The Physico-chemical and Pharmaceutical Aspects of Insulin and Insulin Preparations (Springer-Verlag, Nueva York, 1987), páginas 17-40. La insulina Regular es una solución neutra transparente que contiene insulina hexamérica. Es de acción corta, su comienzo de acción se produce a las 0,5 horas después de la inyección y la duración de la acción es de aproximadamente 6-8 horas. La insulina NPH (Protamina Neutra de Hagedorn), también denominada Insulina Isofánica, es una suspensión cristalina de complejo de insulina-protamina. Estos cristales contienen aproximadamente 0,9 moléculas de protamina y dos átomos de cinc por hexámero de insulina. Dodd et al., Pharmaceutical Research, 12: 60-68 (1993). La insulina NPH es una insulina de acción intermedia; su comienzo de acción se produce en 1,5 horas y su duración de acción es de 18-26 horas. La insulina 70/30 está compuesta por insulina NPH al 70% e insulina Regular al 30%. También existen insulina Semilenta (precipitado amorfo de complejo de insulina con cinc), insulina Ultralenta (suspensión cristalina de insulina con cinc) e insulina Lenta (una mezcla 3:7 de partículas de insulina amorfas y cristalinas). De los diversos tipos de insulinas disponibles, las insulinas más ampliamente usadas son insulina NPH. 70/30 y Regular, que representan el 36%, 28% y 15%, respectivamente, de las prescripciones de insulina en 1996.
El uso de tecnología de ADN recombinante y química de péptidos ha permitido la generación de análogos de insulina con una amplia diversidad de sustituciones de aminoácidos y se han realizado modificaciones similares a IGF en insulina con el fin de modificar la farmacocinética de la insulina (Brang et al., Nature, 333: 679 (1988); Kang et al., Diabetes Care, 14. 571 (1991); DiMarchi et al., "Synthesis of a fast-acting insulin analog based upon structural homology with insulin-like growth factor-I", en: Peptides: Chemistry and Biology, Proceedings of the Twelfth American Peptide Symposium, J. A. Smith y J. E. Rivier, eds. (ESCOM, Leiden, 1992), págs. 26-28; Weiss et al., Biochemistry, 30: 7373 (1991); Howey et al., Diabetes, 40: (Sup 1) 423A (1991); Slieker y Sundell, Diabetes, 40: (Sup 1) 168A (1991); Cara et al., J. Biol. Chem., 265: 17820 (1990); Wolpert et al., Diabetes, 39 (Sup 1) 140A (1990); Bornfeldt et al., Diabetologia, 34: 307 (1991); Drejer, Diabetes/Metabolism Reviews, 8: 259 (1992); Slieker et al., Adv. Experimental Med. Biol., 343: 25-32 (1994). Un ejemplo de dicho análogo de insulina es insulina Humalog^{TM} (solución de insulina monomérica de acción rápida como resultado de la reversión de los aminoácidos Lys(B28) y Pro(B29) en la cadena B de insulina) que se introdujo recientemente en el mercado por Eli Lilly and Company. Se encuentra una revisión de los mutantes de insulina recientes en ensayos clínicos y en el mercado en Barnett y Owens, Lancet, 349: (1997).
Slieker et al., 1994, anteriormente, describen la afinidad de unión de diversas variantes de IGF e insulina a IGFBP, receptor de IGF y receptor de insulina y, en particular, buscaban conferir la capacidad de unión a IGFBP a la insulina a través de varias combinaciones de mutaciones, incluyendo: (Phe^{38},Arg^{39},Ser^{40})insulina, (Glu^{4},Gln^{16},Phe^{17})insulina y (Glu^{4},Gln^{16},Phe^{17},Phe^{38},Arg^{39},Ser^{40})insulina (la numeración de la insulina madura usada en este documento consiste en la numeración consecutiva en la cadena B (restos 1-30), seguida de la numeración consecutiva en la cadena A (restos 31-51); esto se corresponde con los restos enumerados como 1-30 y los restos 66-86, respectivamente, de la proinsulina; consúltese la Fig. 4 en este documento). Sin embargo, se descubrió una afinidad solamente débil para estas variantes que se unen a las proteínas de unión a IGF y se redujo la afinidad del receptor con la insulina en comparación con la insulina de tipo silvestre (Slieker et al., anteriormente).
Aunque publicaciones anteriores no pudieron encontrar ninguna afinidad de la insulina por las proteínas de unión, un grupo ha medido una débil afinidad de 251 +/- 91 nM de la insulina por IGFBP-3 mediante experimentos de BIAcore^{TM} (Heding et al., anteriormente):
Conover, C. A. Potentiation of Insulin-Like Growth Factor (IGF) Action by IGF-Binding Protein 3: Studies of Underlying Mechanism. Endocrinology 1992; 130 (6): 3191-3199 describe una variante de IGF E3Q.
El documento WO 989/05822 describe variantes de IGF E3G,Q,K,L,R.
King, R. et al. Production and characterization of recombinant insulin-like growth factor-I (IGF-I) and potent analogues of IGF-I, with Gly or Arg substituted for Glu3, following their expression in Escherichia coli as fusion proteins. Journal of Molecular Endocrinology 1992; 8 (1): 29-41 describe variantes de IGF E3G y E3R.
A pesar de todos estos esfuerzos, la visión del epítopo de unión a IGFBP en IGF-I puede continuar siendo difusa y de una resolución reducida. Los estudios anteriores implicaban más frecuentemente inserciones de regiones de insulina homólogas en IGF-I o truncamientos proteicos (por ejemplo, des(1-3)-IGF-I), sin diferenciar entre los efectos atribuidos a un plegamiento erróneo y determinantes de la unión reales. La combinación de los resultados de todos estos estudios se complica adicionalmente por el hecho de que se usaron diferentes técnicas para analizar la formación de complejo de las formas de IGF mutantes con las IGFBP, variando de ensayos de unión de ligando radiomarcado a análisis biodetectores.
Existe la necesidad en la técnica de moléculas que actúen como agonistas de IGF o insulina y también de moléculas que se unan a proteínas de unión a IGF con gran afinidad y especificidad para fines terapéuticos o de diagnóstico.
Sumario de la invención
Por consiguiente, en una realización, la invención proporciona una variante de IGF-I que comprende una alanina en la posición 3, en la que además se sustituye un aminoácido en la posición 4, 5, 7, 10, 17, 23, 24, 25, 43, 49 ó 63, o cualquiera de dichos aminoácidos en combinación con un aminoácido en cualquiera de las posiciones 12 ó 16, o tanto 12 como 16, del IGF-I humano de secuencia nativa, o cualquier combinación de los mismos, con cualquier aminoácido en dicha posición 7 con un resto de alanina, glicina o serina en cualquier posición distinta de dicha posición 7.
En una realización preferida, los aminoácidos en dichas posiciones 16 y 49 se sustituyen para obtener agentes de unión a IGFBP-3. Otra realización preferida para obtener agentes de unión a IGFBP-3 es una variante que contiene mutaciones en las posiciones 3 y 7.
Se describe que la tirosina en dicha posición 24 puede sustituirse con leucina, o la tirosina en dicha posición 31 puede sustituirse con alanina, o pueden sustituirse ambas, para alterar o impedir la unión a receptor. Más preferiblemente, pueden sustituirse ambas tirosinas en dichas posiciones 24 y 31.
La invención describe una insulina similar a IGF de semivida prolongada en la que se deleciona la fenilalanina en la posición 1 de la proinsulina humana de secuencia nativa (des(1)-proinsulina), o la glutamina en posición 4 de la proinsulina humana de secuencia nativa se sustituye con ácido glutámico, o la leucina en posición 17 de la proinsulina humana de secuencia nativa se sustituye con fenilalanina, o la fenilalanina en la posición 25 de la proinsulina humana de secuencia nativa se sustituye con tirosina, o la tirosina en la posición 26 de la proinsulina humana de secuencia nativa se sustituye con fenilalanina, o la treonina en posición 73 de la proinsulina humana de secuencia nativa se sustituye con fenilalanina, o cualquier combinación de las mismas.
Preferiblemente, para la insulina similar a IGF, los aminoácidos en dichas posiciones 4, 17, 26 y/o 73 pueden sustituirse para generar mutantes específicos de IGFBP-1, o el aminoácido en la posición 1 puede delecionarse y los aminoácidos en las posiciones 25, 26 y/o 73 pueden sustituirse para generar mutantes específicos de IGFBP-3.
En otra realización más, la invención describe una insulina similar a IGF en la que se deleciona la fenilalanina en posición 1 (des(1)-insulina), o la glutamina en posición 4 de la insulina madura humana de secuencia nativa se sustituye con ácido glutámico, o la leucina en posición 17 de la insulina madura humana de secuencia nativa se sustituye con fenilalanina, o la fenilalanina en la posición 25 de la insulina madura humana de secuencia nativa se sustituye con tirosina, o la tirosina en posición 26 de la insulina madura humana de secuencia nativa se sustituye con fenilalanina, o la treonina en posición 38 de la insulina madura humana de secuencia nativa se sustituye con fenilalanina, o cualquier combinación de las mismas (Nota: la numeración de la insulina madura usada en este documento se refiere a la numeración consecutiva de la cadena B (restos 1-30), seguida de la numeración consecutiva en la cadena A (restos 31-51)).
Pueden sustituirse aminoácidos de la insulina madura anterior en las posiciones 4, 17, 26 y 38 para generar un mutante que sea específico para IGFBP-1.
El aminoácido en la posición 1 de la insulina madura anterior puede delecionarse y los aminoácidos de la insulina madura anterior en las posiciones 25, 26 y 35 pueden sustituirse, para generar un mutante que sea específico para IGFBP-3.
También se proporciona en este documento una composición que comprende uno de los péptidos descritos anteriormente en un vehículo, preferiblemente un vehículo farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente, esta composición es estéril.
Los usos de estos péptidos incluyen todos los usos que liberen o potencien al menos una actividad biológica de IGF o insulina exógenos o endógenos. Pueden usarse en el tratamiento, la inhibición o la prevención de afecciones en las que sea útil un IGF tal como IGF-I o insulina, es decir, en el tratamiento de un trastorno de IGF o un trastorno de insulina por administración de una cantidad eficaz del péptido a un mamífero, como se describe a continuación.
Se describe adicionalmente en este documento un método para aumentar los niveles séricos y tisulares de IGF o insulina biológicamente activos en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un péptido como se ha descrito anteriormente. El mamífero es preferiblemente un ser humano. También se describe cuando la administración del péptido, si está mimetizando al IGF-1, preferiblemente en una cantidad eficaz para producir un aumento de peso corporal, provoca un aumento en el anabolismo del mamífero. Se describe además que se efectúa un control de la glucemia en el mamífero después de que se administre el péptido.
El péptido de este documento puede administrarse en solitario o junto con otro agente, tal como GH, un péptido liberador de GH (GHRP), un factor liberador de GH (GHRF), una hormona liberadora de GH (GHRH), un secretagogo de GH, un IGF, un IGF en combinación con una IGFBP, una IGFBP, GH en combinación con una proteína de unión a GH (GHBP), insulina o un agente hipoglucemiante (que incluye en la definición siguiente un agente sensibilizante a la insulina tal como tiazolidinodiona).
Se describe un método para efectuar un control de la glucemia en un mamífero que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de uno o más de los péptidos anteriores. Preferiblemente, el péptido también puede reducir la secreción de insulina plasmática y los niveles de glucosa en sangre en un mamífero. También preferiblemente, el mamífero puede tener un trastorno hiperglucémico tal como diabetes. Este método puede comprender además administrar al mamífero una cantidad eficaz de un agente hipoglucemiante o insulina.
También se describe un método para aumentar los niveles séricos y tisulares de IGF biológicamente activo en un mamífero o un método para aumentar el anabolismo en un mamífero, o un método para controlar la glucemia en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de la composición que contiene el péptido de este documento.
También se contempla en este documento un kit que comprende un recipiente que contiene una composición farmacéutica que contiene el péptido de este documento e instrucciones que indican al usuario cómo utilizar la composición. Este kit puede comprender opcionalmente además un recipiente que contiene una GH, un GHRP, un GHRF, una GHRH, un secretagogo de GH, un IGF, un IGF formando un complejo con una IGFBP, una IGFBP, una GH formando un complejo con una GHBP, insulina o un agente hipoglucemiante.
Para la identificación de los péptidos de este documento, se presentó monovalentemente IGF-I humano en partículas de fagémido filamentoso (Patentes de Estados Unidos Nº 5.750.373 y 5.821.047) y se realizó una mutagénesis mediante alanina completa del mismo (Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989); Patente de Estados Unidos Nº 5.834.250) mediante presentación en fagos ("turbo-barrido con alanina") (Cunningham et al., EMBO J. 13: 2508-2515 (1994); Lowman, Methods Mol. Biol., 87: 249-264 (1998)). Los fagémidos con IGF mutante se usaron para cartografiar los determinantes de unión en IGF-I para IGFBP-1 e IGFBP-3. El barrido con alanina pone de manifiesto determinantes de especificidad para estas proteínas de unión, para generar variantes de IGF específicas de proteína de unión o variantes de insulina que se unan específicamente a IGFBP-1 o IGFBP-3 para modular su semivida de aclaramiento, mejorar su estabilidad proteolítica o alterar su distribución tisular in vivo. Estos mutantes también deberían ser útiles para cartografiar el sitio de unión funcional para el receptor de IGF, cuya estructura cristalina se ha descrito recientemente (Garrett et al., anteriormente). Además, puede ser de interés cartografiar los epítopos de diversos anticuerpos de unión a IGF o de otros péptidos o proteínas que se unen a IGF-I.
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Breve descripción de los dibujos
Las Figuras 1A y 1B muestran un ELISA de fagos de la variante, G1S-A70V IGF-I, que se une a IGFBP-1 (Fig. 1A) e IGFBP-3 (Fig. 1B). Se incubaron placas de microtitulación recubiertas con IGFBP-1 (Fig. 1A) o IGFBP-3 (Fig. 1B) 1 \mug/ml con partículas de fago que presentaban G1S-A70V en presencia de las cantidades indicadas de proteína competidora soluble, IGFBP-1 (Fig. 1A) o IGFBP-3 (Fig. 1B). La concentración inhibidora semimáxima (CI_{50}) de competidor, es decir, la concentración inhibidora de competidor que daba como resultado una unión semimáxima del fagémido en ese experimento particular, se indica para la IGFBP respectiva.
La Figura 2 muestra la pérdida o ganancia de afinidad por IGFBP para los mutantes de IGF-1 ensayados mediante ELISA de fagos. Se muestran los valores relativos de CI_{50} (CI_{50mut}/CI_{50G1S-A70V}) de cada mutante de alanina de IGF-I (cambios de afinidad de cada mutante por las proteínas de unión con respecto a IGF-I G1S-A70V) para IGFPB-1 (barras rellenas) e IGFBP-3 (barras en blanco). Los datos se toman a partir de la Tabla I a continuación. Los valores relativos de CI_{50} <1 indican aumento de afinidad; valores >1 indican pérdida de afinidad. El asterisco indica que estas variantes particulares no se presentaron en fagos a juzgar por la unión de anticuerpos.
Las Figuras 3A y 3B muestran la especificidad de unión de la variante de IGF-I F49A presentada en fago con IGFBP-1 y -3, respectivamente, en un ELISA de fagos competitivo. Se unieron partículas de fagémidos que presentaban F49A (cuadrados) a placas recubiertos con IGFBP-3 en presencia de las cantidades indicadas de IGFBP-1 (Fig. 3A) o IGFBP-3 (Fig. 3B) solubles. El mismo experimento se realizó en paralelo con fagos que presentaban la variante de IGF-I similar al tipo silvestre G1S-A70V (círculos). Véanse las Tablas I y II a continuación para valores de CI_{50} absolutos. Los puntos de datos son la media \pm desviación típica, n = 2. Se recubrieron placas inmunoabsorbentes con IGFBP-3 1 \mug/ml y se realizaron ELISA como se describe en los Ejemplos a continuación usando fago de IGF-I de tipo silvestre (WT, círculos) y fago de IGF-F49A (F49A, cuadrados) en paralelo. Los experimentos se realizaron por duplicado y los puntos de datos se muestran como media \pm desviación típica. Los valores de CI_{50} del experimento real se indican en la figura.
La Figura 4 describe un alineamiento de secuencias de IGF-I humano de secuencia nativa (denominado wtIGF) (SEC ID Nº: 1), proinsulina humana de secuencia nativa (denominada proinsulina) (SEC ID Nº: 2) e insulina humana de secuencia nativa (denominada insulina (cadena B) seguida de insulina (cadena A)) (SEC ID Nº: 3). Los asteriscos y puntos indican la identidad de secuencia y la similitud de secuencia, respectivamente, en las posiciones aminoacídicas indicadas entre las tres secuencias.
Las Figuras 5A-5D muestran un análisis biodetector de la unión de IGFBP a variantes de IGF-I inmovilizadas. Se muestran sensogramas para la unión de IGFBP-1 (Figs. 5A, 5C) o IGFBP-3 (Figs. 5B, 5D) a IGF-I de tipo silvestre inmovilizado (Figs. 5A, 5B) o variante de IGF F49A (Figs. 5C, 5D). Las concentraciones de ligando en cada experimento eran de 1 \muM, 500 nM y 250 nM. Véase la Tabla II para los parámetros cinéticos.
Las Figuras 6A-6B muestran un modelo de los epítopos de unión funcionales para IGFBP-1 e IGFBP-3, respectivamente, en la superficie de IGF-I. Se clasificaron las cadenas laterales de aminoácidos de acuerdo con su contribución relativa en energía de unión (Tabla I) y se colorearon de la forma siguiente: sin efecto (gris); pérdida de afinidad aparente de 2-5 veces (amarillo); de 5-10 veces (naranja); de 10-100 veces (rojo claro); >100 veces (rojo oscuro). Si estaban disponibles, se usaron los números de los experimentos de ELISA de fagos en la Tabla I a continuación. Se usaron en su lugar los datos de BIAcore^{TM} para las variantes V11A, R36A y P39A (Tabla II). La estructura de RMN de IGF-I (Cooke et al., anteriormente) se representó usando el programa Insight II^{TM} (MSI, San Diego, CA). El epítopo de unión para IGFBP-1 (Fig. 6A) se localiza en la superficie "superior" e "inferior" de la hélice N-terminal (restos 8-17), conectado mediante el resto energéticamente importante F49. Para IGFBP-3 (Fig. 6B), las cadenas laterales de IGF-I individuales contribuyen muy poco a la energía de unión. El epítopo de unión se ha separado del extremo N-terminal e incluye de nuevo G22, F23, Y24.
Descripción de las realizaciones preferidas A. Definiciones
Como se usa en este documento, el término "mamífero" para los fines de tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo seres humanos, domésticos y animales de granja y animales de zoo, deportivos o de compañía, tales como perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc. El mamífero preferido en este documento es un ser humano. El término "no adulto" se refiere a mamíferos que van desde la edad perinatal (tal como lactantes de bajo peso al nacimiento) hasta la edad de la pubertad, siendo éstos últimos los que no han alcanzado todavía el potencial de crecimiento total.
Como se usa en este documento, el término "IGF" se refiere al factor de crecimiento similar a insulina nativo I y al factor de crecimiento similar a insulina nativo II, así como a variantes naturales de los mismos tales como IGF cerebral, conocido de otro modo como des(1-3)IGF-I.
Como se usa en este documento, el término "IGF-I" se refiere al factor de crecimiento similar a insulina I de cualquier especie, incluyendo bovina, ovina, porcina, equina y humana, preferiblemente humana y, si se hace referencia a una administración exógena, de cualquier origen ya sea natural, sintético o recombinante. La expresión IGF-I humano "de secuencia nativa" cuya secuencia se muestra en la Fig. 4 (SEC ID Nº: 1) se prepara, por ejemplo, mediante el proceso descrito en el documento EP 230.869 publicado el 5 de agosto de 1987; el documento EP 128.733 publicado el 19 de diciembre de 1984; o el documento EP 288.451 publicado el 26 de octubre de 1988. Más preferiblemente, este IGF-I de secuencia nativa se produce de forma recombinante y está disponible en Genentech, Inc., South San Francisco, CA para investigaciones clínicas.
Como se usa en este documento, el término "IGF-II" se refiere al factor de crecimiento similar a insulina-II de cualquier especie, incluyendo bovina, ovina, porcina, equina y humana, preferiblemente humana y, si se hace referencia a una administración exógena, de cualquier origen ya sea natural, sintético o recombinante. Puede prepararse por el método descrito en, por ejemplo, el documento EP 128.733.
Una "IGFBP" o una "proteína de unión a IGF" se refieren a una proteína o polipéptido normalmente asociado con o unido o formando un complejo con IGF-I o IGF-II, ya esté o no en circulación (es decir, en suero o tejido). Dichas proteínas de unión no incluyen receptores. Esta definición incluye IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, Mac-25 (IGFBP-7) y factor estimulante de prostaciclina (PSF) o molécula específica de células endoteliales (ESM-1), así como otras proteínas con alta homología con IGFBP. Se describe Mac 25, por ejemplo, en Swisshelm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4472-4476 (1995) y Oh et al., J. Biol. Chem., 271: 30322-30325 (1996). Se describe PSF en Yamauchi et al., Biochemical Journal, 303: 591-598 (1994). Se describe ESM-1 en Lassalle et al., J. Biol. Chem., 271: 29458-20464 (1996). Para otras IGFBP identificadas, véase, por ejemplo, el documento EP 375.438 publicado el 27 de junio de 1990; el documento EP 369.943 publicado el 23 de mayo de 1990; el documento WO 89/09268 publicado el 5 de octubre de 1989; Wood et al., Molecular Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988); Brinkman et al., The EMBO J., 7: 2417-2423 (1988); Lee et al., Mol. Endocrinol., 2: 404-411 (1988), Brewer et al., BBRC, 152: 1289-1297 (1988); documento EP 294.021 publicado el 7 de diciembre de 1988; Baxter et al., BBRC, 147: 408-415 (1987); Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987); Martin et al., J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986); Baxter et al., Comp. Biochem. Physiol., 91B: 229-235 (1988); documento WO 89/08667 publicado el 21 de septiembre de 1989; documento WO 89/09792 publicado el 19 de octubre de 1989; y Binkert et al., EMBO J., 8: 2497-2502 (1989).
La expresión "fluido corporal" se refiere a una muestra biológica de fluido de un mamífero, preferiblemente de un ser humano. Dichos fluidos incluyen fluidos acuosos tales como suero, plasma, líquido linfático, líquido sinovial, líquido folicular, líquido seminal, fluido amniótico, leche, sangre completa, orina, líquido cefalorraquídeo, saliva, esputo, lágrimas, sudor, moco, medio de cultivo de tejidos, extractos tisulares y extractos celulares.
Como se usa en este documento, la expresión "receptor de IGF humano" se refiere a cualquier receptor para un IGF que se encuentra en seres humanos, e incluye los receptores de IGF Tipo 1 y Tipo 2 en seres humanos a los que se une tanto IGF-I como IGF-II humano, tal como el receptor de IGF-I Tipo I placentario, etc.
Los "péptidos" incluyen un agonista de IGF-I, variante de IGF-I, agonista de insulina, variante de insulina o insulina similar a IGF que tiene al menos dos aminoácidos e incluye polipéptidos que tienen al menos aproximadamente 50 aminoácidos. La definición incluye derivados de péptidos, sus sales o isómeros ópticos.
Como se usa en este documento, el término "insulina" se refiere a cualquier forma de insulina de cualquier especie, ya se obtenga de forma nativa o de forma sintética o recombinante. Puede formularse, por ejemplo, como insulina Regular, insulina NPH, insulina 70/30, insulina Semilenta, insulina UltraLenta o insulina Lenta. Si se va a administrar una insulina junto con una insulina similar a IGF o una variante de IGF-I de este documento, preferiblemente es insulina Regular, insulina NPH, insulina 70/30 o insulina de marca HUMALOG^{TM}.
El término "proinsulina" se refiere a insulina que contiene el péptido A, B y C, cuya secuencia nativa se muestra en la Figura 4 (SEC ID Nº: 2). La conversión de proinsulina en "insulina madura" se produce por escisión de la región de R31 a R65. El péptido amino-terminal resultante de la insulina madura se denomina cadena B y el péptido carboxi-terminal cadena A. Las cadenas se mantienen unidas mediante dos disulfuros intercatenarios. La insulina madura es una proteína soluble. La numeración para las variantes de insulina madura de este documento consiste en la numeración consecutiva de la cadena B (restos 1-30), seguida de la numeración consecutiva de la cadena A (restos 31-51). La proinsulina humana "de secuencia nativa" tiene la secuencia (SEC ID Nº: 2) que se muestra en la Fig. 4 y la insulina madura humana "de secuencia nativa" tiene la secuencia (SEC ID Nº: 3) que se muestra en la Fig. 4.
La "insulina similar a IGF" es un péptido que simula al menos una de las actividades biológicas del IGF-I, incluyendo las actividades biológicas enumeradas en "trastorno de IGF" y en los Modos a continuación. Preferiblemente, dicha insulina similar a IGF es de acción prolongada.
Un "trastorno de IGF" es cualquier afección que se beneficiaría del tratamiento con un IGF, incluyendo, pero sin limitación, por ejemplo, enfermedades pulmonares, trastornos hiperglucémicos como se exponen a continuación, trastornos renales tales como insuficiencia renal aguda y crónica, insuficiencia real crónica en fase terminal, glomerulonefritis, nefritis intersticial, pielonefritis, glomerulosclerosis, por ejemplo, Kimmelstiel-Wilson en pacientes diabéticos e insuficiencia renal después de trasplante de riñón, obesidad, insuficiencia de GH, síndrome de Turner, síndrome de Laron, corta estatura, síntomas indeseables asociados con el envejecimiento tales como obesidad y proporciones de masa grasa respecto a magra aumentadas, trastornos inmunológicos tales como inmunodeficiencias incluyendo recuentos de CD4 disminuidos y tolerancia inmune disminuida o lesiones tisulares inducidas por quimioterapia, trasplante de médula ósea, enfermedades o insuficiencias de la estructura o función cardiaca, tales como disfunciones cardiacas e insuficiencia cardiaca congestiva, trastornos neuronales, neurológicos o neuromusculares, por ejemplo, neuropatía periférica, esclerosis múltiple, distrofia muscular o distrofia miotónica y estados catabólicos asociados con desgaste causados por cualquier afección, incluyendo, por ejemplo, traumatismos o heridas o infecciones tales como con una bacteria o virus humano tal como el VIH, heridas, trastornos de la piel, estructura y función intestinal que necesite restablecimiento y así sucesivamente. El trastorno de IGF que se trate puede ser una combinación de dos o más de los trastornos anteriores. Los trastornos preferidos fijados como objetivo para el tratamiento en este documento son diabetes y obesidad, disfunciones cardiacas, trastornos renales, trastornos neurológicos, trastornos de crecimiento de todo el cuerpo y trastornos inmunológicos.
Un "trastorno de insulina" es una afección que se beneficiaría del tratamiento con una insulina, tal como trastornos hiperglucémicos.
Como se usa en este documento, la expresión "trastornos hiperglucémicos" se refiere a todas las formas de diabetes y trastornos que son el resultado de una resistencia a insulina, tales como diabetes de Tipo I y Tipo II, así como resistencia grave a la insulina, hiperinsulinemia e hiperlipidemia, por ejemplo, sujetos obesos y diabetes insulinorresistente, tal como Síndrome de Mendenhall, Síndrome de Werner, enanismo, diabetes lipoatrófica y otras lipoatrofias. El trastorno hiperglucémico preferido es diabetes, especialmente diabetes Tipo I y Tipo II. La propia "diabetes" se refiere a una enfermedad progresiva del metabolismo de los hidratos de carbono que implica una producción o utilización inadecuada de la insulina y se caracteriza por hiperglucemia y glucosuria.
Como se usa en este documento, el término "tratamiento" se refiere tanto a tratamiento terapéutico como a medidas profilácticas o preventivas. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya presentan el trastorno así como los propensos a tener el trastorno o diagnosticados con el trastorno o aquellos en los que se va a prevenir el trastorno. El tratamiento o la administración consecutiva se refieren a un tratamiento al menos diario sin interrupción en el tratamiento de uno o más días. El tratamiento o administración intermitente, o el tratamiento o administración de forma intermitente, se refieren a un tratamiento que no es consecutivo sino cíclico por naturaleza. El régimen de tratamiento en este documento puede ser consecutivo o intermitente.
Como se usa en este documento, la expresión "agente hipoglucemiante" se refiere a compuestos que son útiles para regular el metabolismo de la glucosa, preferiblemente agentes orales. Son más preferidos en este documento para uso en seres humanos la insulina y la clase de sulfonilureas de agentes hipoglucemiantes orales que provocan la secreción de insulina por el páncreas. Los ejemplos incluyen gliburida, glipizida y glicazida. Además, se incluyen en esta definición y también se prefieren agentes que mejoran la sensibilidad a la insulina o que son sensibilizantes a la insulina, tales como biguanidas (incluyendo metformina y fenformina) y tiazolidinodionas tales como el agente sensibilizante a la insulina de marca REZULIN^{TM} (troglitazona) y otros compuestos que se unen al receptor nuclear PPAR\gamma.
Como se usan en este documento, las expresiones IGF "activo" o "biológicamente activo", en el contexto de cambio de los niveles séricos y tisulares de IGF endógeno, se refieren a IGF que se une a su receptor o que causa de otro modo que se produzca una actividad biológica, tal como las actividades biológicas del IGF endógeno o exógeno a las que se hace referencia en este documento.
Se describen a continuación "péptidos o factores liberadores de hormona del crecimiento" ("GHRP" o "GHRF") como secretagogos. Una "hormona liberadora de hormona del crecimiento" ("GHRH") puede ser cualquier hormona que libere GH a partir de las células o tejidos. La expresión "hormona del crecimiento en combinación con una proteína de unión a hormona del crecimiento" ("GH" más "GHBP") se refiere a una GH formando un complejo con o asociada de otro modo a una de sus proteínas de unión. De forma similar, la expresión "IGF en combinación con una proteína de unión a IGF" ("IGF" más "IGFBP") se refiere a un IGF formando un complejo con o asociado de otro modo a una de sus IGFBP.
B. Modos para realizar la invención
La invención de este documento se refiere, en un aspecto, a una variante de IGF-I que comprende una alanina en posición 3, en la que se sustituyen uno o más aminoácidos del IGF-I humano de secuencia nativa en posiciones seleccionadas. En concreto, se sustituyen uno o más aminoácidos en las posiciones 4, 5, 7, 10, 14, 17, 23, 24, 25, 43, 49 y/o 63, o uno o más aminoácidos en las posiciones anteriores junto con uno o ambos aminoácidos de las posiciones 12 y/o 16. La sustitución en la posición 7 es con cualquier resto aminoacídico y la sustitución en cualquier posición distinta a la posición 7 es con un resto de alanina, glicina o serina. Preferiblemente, los aminoácidos en cuestión se sustituyen por una alanina, glicina o serina.
Una variante preferida tiene sustituidos los aminoácidos en las posiciones 16 y 49. Otra variante preferida tiene sustituidos los aminoácidos en las posiciones 3 y 7. Preferiblemente, los aminoácidos en las posiciones 49 y 63 no se sustituyen individualmente.
En otra realización preferida, la variante tiene adicionalmente su tirosina en posición 24 sustituida con leucina y se describe que su tirosina en posición 31 puede sustituirse con alanina. Más preferiblemente, pueden sustituirse ambos restos de tirosina.
La invención describe además dos tipos de insulina similares a IGF. En un tipo, se deleciona la fenilalanina en posición 1 de la proinsulina humana de secuencia nativa, o se sustituye la glutamina en la posición 4 de la proinsulina humana de secuencia nativa con ácido glutámico, o se sustituye la leucina en la posición 17 de la proinsulina humana de secuencia nativa con fenilalanina, o se sustituye la fenilalanina en posición 25 de la proinsulina humana de secuencia nativa con tirosina, o se sustituye la tirosina en posición 26 de la proinsulina humana de secuencia nativa con fenilalanina, o se sustituye la treonina en posición 73 de la proinsulina humana de secuencia nativa con fenilalanina o se realiza cualquier combinación de las mismas.
Una combinación preferida es una en la que se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 4 y 17. Se describen combinaciones adicionales, en las que se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 4 y 26, o en las que se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 4 y 73, o en las que se sustituyen los aminoácidos en las posiciones 17 y 26, o en las que se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 26 y 73, o en las que se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 17 y 73, o en las que se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 4, 17 y 26, o en las que se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 4, 26 y 73, o en las que se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 4, 17, y 73, o en las que se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 17, 26 y 73, o en las que se deleciona el aminoácido en posición 1 y se sustituye el aminoácido en dicha posición 25, o en las que se deleciona el aminoácido en posición 1 y se sustituye el aminoácido en dicha posición 26, o en las que se deleciona el aminoácido en posición 1 y se sustituye el aminoácido en dicha posición 73, o en las que se deleciona el aminoácido en posición 1 y se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 25 y 26, o en las que se deleciona el aminoácido en posición 1 y se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 25 y 73, o en las que se deleciona el aminoácido en posición 1 y se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 26 y 73, o en las que se deleciona el aminoácido en posición 1 y se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 25, 26 y 73.
Se describe una variante en la que se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 4, 17, 26 y 73 que es selectiva para IGFBP-1, o en la que se deleciona el aminoácido en la posición 1 y se sustituyen los aminoácidos en dichas posiciones 25, 26 y 73, para que sea selectiva para IGFBP-3.
El otro tipo de insulina similar a IGF se basa en insulina madura soluble. En este caso, se realizan las mismas mutaciones que anteriormente para la proinsulina, pero la numeración varía en determinados casos. Por lo tanto, la glutamina en posición 4 de la insulina madura humana de secuencia nativa pues sustituirse con ácido glutámico, o la leucina en posición 17 de la insulina madura humana de secuencia nativa puede sustituirse con fenilalanina, o la fenilalanina en posición 25 de la insulina madura humana de secuencia nativa pues sustituirse por tirosina, o la tirosina en posición 26 de la insulina madura humana de secuencia nativa puede sustituirse con fenilalanina, o la treonina en posición 38 de la insulina madura humana de secuencia nativa puede sustituirse con fenilalanina, o puede realizarse cualquier combinación de las mismas.
Para mutantes selectivos para IGFBP-1 pueden sustituirse los aminoácidos en dichas posiciones 4, 17, 26 y 38, y para mutantes selectivos para IGFBP-3, puede delecionarse el aminoácido en la posición 1 y pueden sustituirse los aminoácidos en dichas posiciones 25, 26 y 38.
Los péptidos de esta invención pueden generarse por síntesis química o por empleo de tecnología recombinante. Estos métodos se conocen en la técnica. Se prefiere síntesis química, especialmente síntesis en fase sólida para péptidos cortos (por ejemplo, de menos de 50 restos) o los que contienen aminoácidos no naturales o poco habituales tales como D-Tyr, Ornitina, ácido aminoadípico y similares. Se prefieren procedimientos recombinantes para péptidos más largos. Cuando se seleccionan procedimientos recombinantes, puede construirse un gen sintético de novo o puede mutarse un gen natural, por ejemplo, mediante mutagénesis de casete. A continuación se exponen procedimientos recombinantes generales ejemplares.
A partir de un IGF o insulina purificada y su secuencia de aminoácidos, por ejemplo, puede producirse una variante de IGF o insulina que sea un mutante peptidilo de una molécula parental de IGF o insulina usando técnicas de ADN recombinante. Estas técnicas contemplan, de forma simplificada, tomar el gen, ya sea natural o sintético, que codifica el péptido; insertarlo en un vector apropiado; insertar el vector en una célula hospedadora apropiada; cultivar la célula hospedadora para provocar la expresión del gen; y recuperar o aislar el péptido producido por la misma. Preferiblemente, el péptido recuperado se purifica después hasta un grado adecuado.
Algo más particularmente, la secuencia de ADN que codifica una variante peptidilo de IGF o insulina se clona y se manipula de modo que pueda expresarse en un hospedador conveniente. Puede obtenerse ADN que codifica polipéptidos parentales a partir de una genoteca genómica, a partir de ADNc obtenido a partir de ARNm de células que expresan el péptido o por construcción sintética de la secuencia de ADN (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989).
El ADN parental se inserta después en un plásmido o vector apropiado que se usa para transformar una célula hospedadora. En general, se usan vectores plasmídicos que contienen secuencias de replicación y de control que proceden de una especie compatible con la célula hospedadora en relación con esos hospedadores. El vector lleva comúnmente un sitio de replicación, así como secuencias que codifican proteínas o péptidos que son capaces de proporcionar una selección fenotípica en células transformadas.
Por ejemplo, puede transformarse E. coli usando pBR322, un plásmido procedente de una especie de E. coli (Mandel et al., J. Mol. Biol. 53: 154 (1970)). El plásmido pBR322 contiene genes para resistencia a ampicilina y tetraciclina y, por lo tanto, proporciona medios sencillos para la selección. Otros vectores incluyen características diferentes tales como diferentes promotores que con frecuencia son importantes en la expresión. Por ejemplo, los plásmidos pKK223-3, pDR720 y pPL-lambda representan vectores de expresión con los promotores tac, trp o P_{L} que están actualmente disponibles (Pharmacia Biotechnology).
Un vector preferido es pB0475. Este vector contiene orígenes de replicación para fago y E. coli que permiten servir de lanzadera entre dichos hospedadores, facilitando de este modo tanto la mutagénesis como la expresión (Cunningham et al., Science, 243: 1330-1336 (1989); Patente de Estados Unidos Nº 5.580.723). Son otros vectores preferidos pRIT5 y pR1T2T. Estos vectores contienen promotores apropiados seguidos por el dominio Z de la proteína A, permitiendo que los genes insertados en los vectores se expresen como proteínas de fusión.
Otros vectores preferidos pueden construirse usando técnicas convencionales por combinación de los rasgos pertinentes de los vectores descritos anteriormente. Los rasgos pertinentes incluyen el promotor, el sitio de unión al ribosoma, el gen de decorsina u ornatina o una fusión de genes (el dominio Z de la proteína A y decorsina u ornatina y su enlazador), los marcadores de resistencia a antibióticos y los orígenes de replicación apropiados.
La célula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Se prefieren procariotas para clonar y expresar secuencias de ADN para producir polipéptido IGF-I parental, péptidos con segmentos sustituidos, péptidos con restos sustituidos y variantes de péptidos. Por ejemplo, puede usarse E. coli K12 cepa 294 (ATCC Nº 31446), así como E. coli B, E. coli X1776 (ATCC Nº 31537) y E. coli c600 y c600hfl, E. coli W3110 (F-, gamma-, protótrofa/ATCC Nº 27325), bacilos tales como Bacillus subtilis y otras enterobacterias tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans y diversas especies de Pseudomonas. El procariota preferido es E. coli W3110 (ATCC 27325). Cuando se expresan mediante procariotas los péptidos contienen típicamente una metionina o una formilmetionina N-terminal y no están glicosilados. En el caso de proteínas de fusión, la metionina o formilmetionina N-terminal reside en el extremo amino terminal de la proteína fusión o la secuencia señal de la proteína de fusión. Por supuesto, estos ejemplos pretenden ser ilustrativos más que limitantes.
Además de procariotas, pueden usarse organismos eucariotas tales como cultivos de levaduras o células procedentes de organismos multicelulares. En principio, es factible cualquier cultivo celular de este tipo. Sin embargo, el interés ha sido mayor en células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) se ha convertido en un procedimiento reproducible. Tissue Culture, Academic Press, Kruse y Patterson, editores (1973). Son ejemplos de dichas líneas celulares hospedadoras útiles células VERO y HeLa, líneas celulares de Ovario de Hámster Chino (CHO), líneas celulares W138, 293, BHK, COS-7 y MDCK.
Una variación de los procedimientos anteriores contempla el uso de fusiones de genes, donde el gen que codifica el péptido deseado se asocia, en el vector, con un gen que codifica otra proteína o un fragmento de otra proteína. Esto da como resultado que se produzca el péptido deseado por la célula hospedadora como una fusión con otra proteína o péptido. La "otra" proteína o péptido es con frecuencia una proteína o péptido que puede secretarse por la célula, haciendo posible aislar y purificar el péptido deseado a partir del medio de cultivo y eliminar la necesidad de destruir las células hospedadoras que surge cuando el péptido deseado permanece en el interior de la célula. Como alternativa, la proteína de fusión puede expresarse intracelularmente. Es útil usar proteínas de fusión que se expresen a altas concentraciones.
El uso de fusiones de genes, aunque no es esencial, puede facilitar la expresión de péptidos heterólogos en E. coli, así como la purificación posterior de esos productos génicos (Harris, en Genetic Engineering, Williamson, R., Ed. (Academic Press, Londres, Vol. 4, 1983), pág. 127; Ljungquist et al., Eur. J. Biochem., 186: 557-561 (1989) y Ljungquist et al., Eur. J. Biochem., 186: 563-569 (1989). Se usan con frecuencia fusiones con proteína A debido a que la unión de la proteína A o, más específicamente, el dominio Z de la proteína A, a IgG proporciona un "asa de afinidad" para la purificación de la proteína fusionada. También se ha demostrado que muchas proteínas heterólogas se degradan cuando se expresan directamente en E. coli, pero son estables cuando se expresan como proteínas de fusión. Marston, Biochem., 240: 1 (1986).
Las proteínas de fusión pueden escindirse usando compuestos químicos tales como bromuro de cianógeno, que escinde en una metionina, o hidroxilamina, que escinde entre un resto Asn y Gly. Usando metodología de ADN recombinante convencional, las pares de bases de nucleótidos que codifican estos aminoácidos pueden insertarse justo antes del extremo 5' del gen que codifica el péptido deseado.
Como alternativa, se puede emplear escisión proteolítica de la proteína de fusión (Carter, en Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes, Ladisch et al., eds. (American Chemical Society Symposium Series Nº 427, 1990), Cap. 13, páginas 181-193).
Se han usado con éxito proteasas tales como Factor Xa, trombina y subtilisina o sus mutantes y varias otras para escindir proteínas de fusión. Típicamente, se inserta un enlazador peptídico que es susceptible de escindirse por la proteasa usada entre la "otra" proteína (por ejemplo, el dominio Z de la proteína A) y el péptido deseado. Usando metodología de ADN recombinante, se insertan las pares de bases de nucleótidos que codifican el enlazador entre los genes o fragmentos génicos que codifican las otras proteínas. Después puede realizarse la escisión proteolítica de la proteína de fusión parcialmente purificada que contiene el enlazador correcto en la proteína de fusión nativa o la proteína de fusión reducida o desnaturalizada.
El péptido puede o no estar apropiadamente plegado cuando se expresa como una proteína de fusión. Además, el enlazador peptídico específico que contiene el sitio de escisión puede o no estar accesible para la proteasa. Estos factores determinan si la proteína de fusión debe desnaturalizarse y volver a plegarse y, si es así, si estos procedimientos se emplean antes o después de la escisión.
Cuando es necesaria la desnaturalización y el replegamiento, el péptido se trata típicamente con un caótropo, tal como guanidina HCl y después se trata con un tampón redox que contiene, por ejemplo, ditiotreitol o glutatión reducido y oxidado a las proporciones, pH y temperatura apropiados, de modo que el péptido se vuelva a plegar en su estructura nativa.
Cuando los péptidos no se preparan usando tecnología de ADN recombinante, se preparan preferiblemente usando síntesis en fase sólida, tal como la descrita en general por Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1963), aunque pueden emplearse otras síntesis químicas equivalentes conocidas en la técnica. La síntesis en fase sólida se inicia a partir del extremo C-terminal del péptido por acoplamiento de un \alpha-aminoácido protegido a una resina adecuada. Dicho material de partida puede prepararse por unión de un aminoácido con extremo \alpha-amino-protegido mediante un enlace éster a una resina clorometilada o una resina de hidroximetilo, o mediante un enlace amida a una resina de BHA o resina de MBHA. La preparación de la resina de hidroximetilo se describe por Bodansky et al., Chem. Ind. (London), 38: 1597-1598 (1996). Están disponibles en el mercado resinas clorometiladas en BioRad Laboratories, Richmond, CA y en Lab. Systems, Inc. La preparación de dicha resina se describe por Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco, 1969), Capítulo 1, págs. 1-6. Están disponibles en el mercado soportes de resina de BHA y MBHA y se usan generalmente sólo cuando el polipéptido deseado que se está sintetizando tiene una amida no sustituida en el extremo C-terminal.
Los aminoácidos se acoplan a la cadena peptídica usando procedimientos bien conocidos en la técnica para la formación de enlaces peptídicos. Un método implica convertir el aminoácido en un derivado que hará al grupo carboxilo más susceptible a la reacción con el grupo amino N-terminal libre del fragmento peptídico. Por ejemplo, el aminoácido puede convertirse en un anhídrido mixto por reacción de un aminoácido protegido con cloroformato de etilo, cloroformato de fenilo, cloroformato de sec-butilo, cloroformato de isobutilo, cloruro de pivaloílo o cloruros de ácidos similares. Como alternativa, el aminoácido puede convertirse en un éster activo tal como un éster de 2,4,5-triclorofenilo, un éster de pentaclorofenilo, un éster de pentafluorofenilo, un éster de p-nitrofenilo, un éster de N-hidroxisuccinimida o un éster formado a partir de 1-hidroxibenzotriazol.
Otro método de acoplamiento implica el uso de un agente de acoplamiento adecuado tal como N,N'-diciclohexilcarbodiimida o N,N'-diisopropil-carbodiimida. Otros agentes de acoplamiento apropiados evidentes para los especialistas en la técnica se describen en E. Gross y J. Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Vol. 1: Major Methods of Peptide Bond Formation (Academic Press, Nueva York, 1979).
Debe reconocerse que el grupo \alpha-amino de cada aminoácido empleado en la síntesis peptídica debe protegerse durante la reacción de acoplamiento para evitar reacciones secundarias que impliquen su función \alpha-amino activa. Debería reconocerse que ciertos aminoácidos contienen grupos funcionales de cadena lateral reactivos (por ejemplo, sulfhidrilo, amino, carboxilo e hidroxilo) y que dichos grupos funcionales también deben protegerse con grupos protectores adecuados para evitar que se produzca una reacción química en ese sitio durante las etapas de acoplamiento tanto inicial como posterior. Se describen grupos protectores adecuados conocidos en la técnica en Gross y Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Vol. 3: "Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis" (Academic Press, Nueva York, 1981).
En la selección de un grupo protector de cadena lateral particular a usar en la síntesis de los péptidos, se siguen las reglas generales siguientes. Un grupo protector \alpha-amino (a) debe volver a la función \alpha-amino inerte en las condiciones empleadas en la reacción de acoplamiento, (b) debe ser fácilmente eliminable después de la reacción de acoplamiento en condiciones que no eliminarán los grupos protectores de cadena lateral y no alterarán la estructura del fragmento peptídico y (c) debe eliminar la posibilidad de racemización tras la activación inmediatamente anterior al acoplamiento. Un grupo protector de cadena lateral (a) debe volver al grupo funcional de la cadena lateral inerte en las condiciones empleadas en la reacción de acoplamiento, (b) debe ser estable en las condiciones empleadas en la eliminación del grupo protector \alpha-amino y (c) debe ser fácilmente eliminable tras la finalización del péptido aminoacídico deseado en condiciones de reacción que no alterarán la estructura de la cadena peptídica.
Será evidente para los especialistas en la técnica que los grupos protectores que se sabe que son útiles para la síntesis peptídica variarán en reactividad con los agentes empleados para su eliminación. Por ejemplo, ciertos grupos protectores tales como trifenilmetilo y 2-(p-bifeninil)isopropiloxicarbonilo son muy lábiles y pueden escindirse en condiciones ácidas suaves. Otros grupos protectores, tales como t-butiloxicarbonilo (BOC), t-amiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo y p-metoxibenciloxicarbonilo son menos lábiles y requieren ácidos moderadamente fuertes, tales como trifluoroacético, clorhídrico o trifluoruro de boro en ácido acético para su eliminación. Otros grupos protectores más, tales como benciloxicarbonilo (CBZ o Z), halobenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, cicloalquiloxicarbonilo e isopropiloxicarbonilo, son incluso menos lábiles y requieren ácidos más fuertes, tales como fluoruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno o trifluoroacetato de boro en ácido trifluoroacétito para su eliminación. Entre las clases de grupos protectores de aminoácidos útiles se incluyen:
(1) para un grupo \alpha-amino, (a) grupos protectores de tipo uretano aromáticos, tales como CBZ de fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC) y CBZ sustituido, tal como, por ejemplo, p-clorobenciloxicarbonilo, p-6-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo y p-metoxibenciloxicarbonilo, o-clorobenciloxicarbonilo, 2,4,-diclorobenciloxicarbonilo, 2,6-diclorobenciloxicarbonilo y similares; (b) grupos protectores de tipo uretano alifáticos, tales como BOC, t-amiloxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, 2-(p-bifenilil)-isopropiloxicarbonilo, aliloxicarbonilo y similares; (c) grupos protectores de tipo uretano de cicloalquilo tales como ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo y ciclohexiloxicarbonilo; y d) aliloxicarbilo. Los grupos protectores de \alpha-amino preferidos son BOC o FMOC.
(2) para el grupo amino de la cadena lateral presente en Lys, la protección puede ser mediante cualquiera de los grupos mencionados anteriormente en (1) tales como BOC, p-clorobenciloxicarbonilo, etc.
(3) para el grupo guanidino de Arg, la protección puede ser mediante nitro, tosilo, CBZ, adamantiloxilocarbonilo, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo o 2,3,6-trimetil-4-metoxifenilsulfonilo o BOC.
(4) para el grupo hidroxilo de Ser, Thr o Tyr, la protección puede ser, por ejemplo, mediante alquilo C1-C4, tal como t-butilo; bencilo (BZL); BZL sustituido; tal como p-metoxibencilo, p-nitrobencilo, p-clorobencilo, o-clorobencilo y 2,6-diclorobencilo.
(5) para el grupo carboxilo de Asp o Glu, la protección puede ser, por ejemplo, por esterificación usando grupos tales como BZL, t-butilo, ciclohexilo, ciclopentilo y similares.
(6) para el nitrógeno de imidazol de His, se emplea convenientemente el resto tosilo.
(7) para el grupo hidroxilo fenólico de Tyr, se emplea convenientemente un grupo protector tal como tetrahidropiranilo, terc-butilo, tritilo, BZL, clorobencilo, 4-bromobencilo o 2,6-diclorobencilo. El grupo protector preferido es 2,6-diclorobencilo.
(8) para el grupo amino de cadena lateral de Asn o Gln, se emplea preferiblemente xantilo (Xan).
(9) para Met, el aminoácido se deja preferiblemente sin proteger.
(10) para el grupo tio de Cys, se emplea típicamente p-metoxibencilo.
El aminoácido C-terminal, por ejemplo, Lys, se protege en la posición N-amino mediante un grupo protector seleccionado apropiadamente, en el caso de Lys, BOC. El BOC-Lys-OH puede acoplarse primero a la resina de bencihidrilamina o clorometilada de acuerdo con el procedimiento expuesto en Horiki et al., Chemistry Letters, 165-168 (1978) o usando isopropilcarbodiimida a aproximadamente 25ºC durante 2 horas con agitación. Después del acoplamiento del aminoácido protegido con BOC al soporte de resina, se elimina el grupo protector \alpha-amino, como mediante el uso de ácido trifluoroacético (TFA) en cloruro de metileno o TFA en solitario. La desprotección se realiza a una temperatura de entre aproximadamente 0ºC y la temperatura ambiente. Se describen en la bibliografía otros reactivos de escisión convencionales, tales como HCl en dioxano, y condiciones para la eliminación de grupos protectores \alpha-amino específicos.
Después de la eliminación del grupo protector \alpha-amino, los aminoácidos \alpha-amino y de cadena lateral protegidos restantes se acoplan progresivamente en el orden deseado. Como alternativa a la adición de cada aminoácido por separado en la síntesis, algunos pueden acoplarse entre sí antes de la adición al sintetizador en fase sólida. La selección de un reactivo de acoplamiento apropiado se incluye en la técnica especialista. Es particularmente adecuado como reactivo de acoplamiento la N,N'-diciclohexilcarbodiimida o la diisopropilcarbodiimida.
Cada aminoácido o secuencia de aminoácidos protegida se introduce en el reactor en fase sólida en exceso y el acoplamiento se realiza convenientemente en un medio de dimetilformamida (DMF) o CH_{2}Cl_{2} o mezclas de los mismos. Si se produce un acoplamiento incompleto, el procedimiento de acoplamiento se repite antes de la eliminación del grupo protector N-amino antes del acoplamiento del siguiente aminoácido. Puede controlarse el éxito de la reacción de acoplamiento en cada fase de la síntesis. Un método preferido de control de la síntesis es mediante la reacción de ninhidrina, como se describe por Kaiser et al., Anal. Biochem, 34: 595 (1970). Las reacciones de acoplamiento pueden realizarse automáticamente usando métodos bien conocidos, por ejemplo, un sintetizador de péptidos BIOSEARCH 9500^{TM}.
Tras la finalización de la secuencia peptídica deseada, el péptido protegido debe escindirse del soporte de resina y deben eliminarse todos los grupos protectores. La reacción de escisión y eliminación de los grupos protectores se realiza convenientemente de forma simultánea o progresiva. Cuando el soporte de resina es una resina de poliestireno clorometilada, el enlace que ancla al péptido a la resina es un enlace éster formado entre el grupo carboxilo libre del resto C-terminal y uno de los muchos grupos clorometilo presentes en la matriz de resina. Se apreciará que el enlace de anclaje puede escindirse por reactivos que se sabe que son capaces de romper un enlace éster y de penetrar en la matriz de resina.
Un método especialmente conveniente es por tratamiento con fluoruro de hidrógeno anhídrido líquido. Este reactivo no sólo escindirá el péptido de la resina, sino que también eliminará todos los grupos protectores. Por lo tanto, el uso de este reactivo proporcionará directamente el péptido totalmente desprotegido. Cuando se usa la resina clorometilada, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno da como resultado la formación de los ácidos peptídicos libres. Cuando se usa la resina de bencihidrilamina, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno da como resultado directamente en las aminas peptídicas libres. La reacción con fluoruro de hidrógeno en presencia de anisol y dimetilsulfuro a 0ºC durante una hora eliminará simultáneamente los grupos protectores de cadena lateral y liberará el péptido de la resina.
Cuando se desee escindir el péptido sin eliminar los grupos protectores, el péptido protegido-resina pueden experimentar metanolisis para dar el péptido protegido, en el que se metila el grupo carboxilo C-terminal. El éster de metilo se hidroliza después en condiciones alcalinas suaves para dar el grupo carboxilo C-terminal libre. Los grupos protectores en la cadena peptídica se eliminan después por tratamiento con un ácido fuerte, tal como fluoruro de hidrógeno líquido. Una técnica particularmente útil para metanolisis es la de Moore et al., Peptides, Proc. Fifth Amer. Pept. Symp., M. Goodman y J. Meienhofer, Eds, (John Wiley, N. Y., 1977), págs. 518-521, en la que el péptido protegido-resina se tratan con metanol y cianuro de potasio en presencia de éter corona.
Otro método para escindir el péptido protegido de la resina cuando se emplea la resina clorometilada es por amoniolisis o por tratamiento con hidrazina. Si se desea, la amida o hidrazida C-terminal resultante puede hidrolizarse en el resto carboxilo C-terminal y los grupos protectores pueden eliminarse convencionalmente.
También se reconocerá que el grupo protector presente en el grupo \alpha-amino N-terminal puede eliminarse preferentemente antes o después de que se escinda el péptido protegido del soporte.
La purificación de los polipéptidos de la invención se consigue típicamente usando procedimientos convencionales tales como HPLC preparativa (incluyendo HPLC de fase inversa) u otras técnicas cromatográficas conocidas tales como exclusión molecular, intercambio iónico, cromatografía de partición, cromatografía de afinidad (incluyendo columnas de anticuerpos monoclonales) o distribución contracorriente.
Los péptidos de esta invención pueden estabilizarse por polimerización. Esto puede conseguirse por reticulación de cadenas monoméricas con agentes de reticulantes polifuncionales, directamente o indirectamente, a través de polímeros multifuncionales. Generalmente, dos polipéptidos sustancialmente idénticos se reticulan en sus extremos C- o N-terminales usando un agente reticulante bifuncional. El agente se usa para reticular los grupos amina y/o carboxilo terminales. Generalmente, ambos grupos carboxilo terminales o ambos grupos amino terminales se reticulan entre sí, aunque por selección del agente reticulante apropiado el alfa-amino de un polipéptido se reticula con el grupo carboxilo terminal del otro polipéptido. Preferiblemente, los polipéptidos se sustituyen en sus extremos C-terminales con cisteína. En condiciones bien conocidas en la técnica puede formarse un enlace disulfuro entre las cisteínas terminales, reticulando de este modo las cadenas polipeptídicas. Por ejemplo, se forman convenientemente puentes disulfuro por oxidación catalizada por metales de las cisteínas libres o por sustitución nucleófila de un resto de cisteína convenientemente modificado. La selección del agente reticulante dependerá de las identidades de las cadenas laterales reactivas de los aminoácidos presentes en los polipéptidos. Por ejemplo, no se preferirá reticulación con disulfuro si está presente cisteína en el polipéptido en sitios adicionales distintos del extremo C-terminal. También se incluyen en el alcance de la misma péptidos reticulados con puentes de metileno.
Los sitios de reticulación adecuados en los péptidos, aparte de los grupos amino N-terminal y carboxilo C-terminal, incluyen grupos épsilon-amino que se encuentran restos de lisina, así como grupos amino, imino, carboxilo, sulfhidrilo e hidroxilo localizados en las cadenas laterales de restos internos de los péptidos o restos introducidos en secuencias flanqueantes. La reticulación mediante agentes reticulantes añadidos externamente se consigue convenientemente, por ejemplo, usando cualquiera de varios reactivos familiares para los especialistas en la técnica, por ejemplo, mediante tratamiento con carbodiimida del polipéptido. Se encuentran en la bibliografía otros ejemplos de agentes reticulantes multifuncionales adecuados (generalmente bifuncionales).
Los péptidos de esta invención también pueden estabilizarse conformacionalmente por ciclación. Los péptidos generalmente se ciclan por unión covalente de los dominios N- y C-terminales de un péptido con el dominio correspondiente de otro péptido de esta invención para formar ciclooligómeros que contengan dos o más secuencias peptídicas repetidas, teniendo cada péptido interno sustancialmente la misma secuencia. Además, se reticulan péptidos ciclados (ciclooligómeros o ciclomonómeros) para formar estructuras cíclicas 1-3 que tienen de 2 a 6 péptidos comprendidos en las mismas. Preferiblemente los péptidos no se unen covalentemente a través de grupos \alpha-amino y carboxilo de la cadena principal (de cabeza a cola), sino que más bien se reticulan a través de las cadenas laterales de restos localizados en los dominios N- y C-terminal. Por lo tanto, los sitios de enlace estarán generalmente entre las cadenas laterales de los restos.
Se conocen muchos métodos adecuados por sí mismos para preparar péptidos mono- o policiclados como se contemplan en este documento. Se ha realizado la ciclación de Lys/Asp usando Na-Boc-aminoácidos en soporte en fase sólida con protección de cadena lateral con Fmoc/9-fluorenil-metilo (OFm) para Lys/Asp; se completa el proceso mediante tratamiento con piperidina seguido de ciclación.
También se han reticulado cadenas laterales de Glu y Lys en la preparación de péptidos cíclicos o bicíclicos: el péptido se sintetiza mediante química en fase sólida en una resina de p-metilbencihidrilamina. El péptido se escinde de la resina y se desprotege. El péptido cíclico se forma usando difenilfosforilazida en metilformamida diluida. Para un procedimiento alternativo, véase Schiller et al., Peptide Protein Res., 25: 171-177 (1985). Véase también la Patente de Estados Unidos Nº 4.547.489.
Se generan péptidos reticulados o ciclados con disulfuro mediante métodos convencionales. El método de Pelton et al. (J. Med._Chem., 29: 2370-2375 (1986)) es adecuado excepto por que se produce una proporción mayor de ciclooligómeros realizando la reacción en soluciones más concentradas que la mezcla de reacción diluida descrita por Pelton et al., para la producción de ciclomonómeros. La misma química es útil para la síntesis de dímeros o ciclooligómeros o ciclomonómeros. También son útiles puentes de tiometileno. Lebl y Hruby, Tetrahedron Letters, 25: 2067-2068 (1984). Véase también Cody et al., J. Med. Chem., 28: 583 (1985).
Los péptidos cíclicos o poliméricos deseados se purifican por filtración en gel seguida de cromatografía líquida de alta presión de fase inversa u otros procedimientos convencionales. Los péptidos se esterilizan por filtración y se formulan en vehículos convencionales farmacológicamente aceptables.
Los materiales de partida necesarios para los procesos descritos en este documento se conocen en la bibliografía o pueden prepararse usando métodos conocidos y materiales de partida conocidos.
Si en los péptidos que se están generando los átomos de carbono unidos a cuatro sustituyentes no idénticos son asimétricos, entonces los péptidos pueden existir como diastereoisómeros, enantiómeros o mezclas de los mismos. Las síntesis descritas anteriormente pueden emplear racematos, enantiómeros o diastereómeros como materiales de partida o intermedios. Los productos diastereoméricos resultantes de dichas síntesis pueden separarse por métodos cromatográficos o de cristalización. Asimismo, pueden separarse mezclas de productos enantioméricos usando las mismas técnicas o por otros métodos conocidos en la técnica. Cada uno de los átomos de carbono asimétricos cuando está presente, puede estar en una de dos configuraciones (R o S) y ambos se incluyen en el alcance de la presente invención.
Se demuestra que los péptidos de esta invención se unen selectivamente a IGFBP. Los especialistas en la técnica saben que existen muchos usos para moléculas de IGF o insulina. Por lo tanto, la administración de los péptidos de esta invención con el fin de agonizar una acción de IGF o insulina pueden tener los mismos efectos o usos que la propia administración de un IGF o insulina exógena. Estos usos de IGF e insulina incluyen los siguientes, que pueden ser adicionales o iguales a los trastornos que se han definido anteriormente: aumento del ritmo del crecimiento de todo el cuerpo, hueso y músculo en animales normales e hipopituitarios; protección del peso corporal y de la pérdida de nitrógeno durante estados catabólicos (tales como ayuno, limitación de nitrógeno, niveles elevados de corticosteroides y/o diabetes); regeneración renal; tratamiento de trastornos degenerativos del sistema nervioso periférico y central (SNC) y estimulación de la neuroprotección o la reparación después de daño o lesión del SNC; tratamiento de la hipoxia; estimulación de la cicatrización de heridas; regeneración cardiaca; reversión de caquexia por cáncer; inhibición de la angiogénesis; regeneración del tracto gastrointestinal; estimulación de la función mamaria; contrarrestado de acciones dependientes de IGF-I de GH tales como estrés metabólico, disminuciones relacionadas con la edad en la actividad de GH y deficiencia de GH en el adulto; tratamiento de diabetes de comienzo en la madurez; y/o tratamiento de una deficiencia de IGF específica.
Los trastornos adicionales y específicos para los que son útiles los péptidos de este documento incluyen trastornos del crecimiento tales como corta estatura resistente a GH, síndrome de insensibilidad a GH, osteoporosis y estados catabólicos; trastornos en los que el tratamiento requiere regeneración de tejidos o células, por ejemplo, nervios periféricos y células de soporte, células del sistema nervioso central incluyendo nervios y glía y otras células tales como oligodendrocitos, músculo, piel y hueso; trastornos cardiacos, por ejemplo, isquemia cardiaca, miopatía cardiaca y trastornos cardiacos congestivos; trastornos hiperglucémicos tales como diabetes mellitus insulinodependiente y no insulinodependiente y resistencia extrema a la insulina; y trastornos renales tales como insuficiencia renal. Éstos también incluyen la estimulación de una respuesta anabólica en seres humanos de edad avanzada, prevención de efectos secundarios catabólicos de glucocorticoides, tratamiento de osteoporosis, estimulación del sistema inmune, reducción de la obesidad, aceleración de la cicatrización de heridas, aceleración de la reparación de fracturas unidas, tratamiento del retraso de crecimiento, tratamiento de insuficiencia renal o insuficiencia resultante en retraso del crecimiento, tratamiento de corta estatura fisiológica, incluyendo niños deficientes en hormona del crecimiento, tratamiento de corta estatura asociada con enfermedad crónica, tratamiento de la obesidad y retraso del crecimiento asociados con la obesidad, tratamiento del retraso del crecimiento asociado con el síndrome de Prader-Willi y síndrome de Turner, aceleración de la recuperación y reducción de la hospitalización de pacientes quemados, tratamiento del retraso del crecimiento interuterino, displasia esquelética, hipercortisolismo y síndrome de Cushing, inducción de liberación de hormona del crecimiento pulsátil, reemplazo de hormona del crecimiento en pacientes estresados, tratamiento de osteocondrodisplasias, síndrome de Noonans, esquizofrenia, depresión, neuropatía periférica, ALS, depresión, enfermedad de Alzheimer, enfermedades de desmielinización, esclerosis múltiple y retraso en la cicatrización de heridas, estimulación del sistema inmune, tratamiento de depravación psicosocial, tratamiento de disfunción pulmonar y dependencia de ventilador, atenuación de la respuesta catabólica de proteínas después de una cirugía mayor, reducción de la caquexia y la pérdida de proteína debida a una enfermedad crónica tal como cáncer o SIDA, tratamiento de hiperinsulinemia incluyendo diabetes Tipo II y Tipo I, tratamiento adyuvante para inducción de la ovulación, estimulación del desarrollo tímico y prevención de la disminución de la función tímica relacionada con la edad, tratamiento de pacientes inmunosuprimidos, tratamiento de pacientes trasplantados con médula ósea, mejora en la resistencia muscular, movilidad, enfermedades de la función muscular, distrofia muscular, mantenimiento del espesor de la piel y homeostasis metabólica, aumento de la función real y homeostasis incluyendo insuficiencia renal agua y crónica, estimulación de osteoblastos, remodelado óseo y crecimiento de cartílago, estimulación del estime inmune y estimulación del crecimiento en ganado. Se encuentran diversos usos de IGF-I, por ejemplo, en los documentos WO 94/04569; WO 96/33216; y Bondy, Ann Intern. Med., 120: 593-601 (1994).
En un ejemplo, los péptidos pueden administrarse a mamíferos de importancia comercial tales como suidos, ganado, ovejas y similares para acelerar y aumentar su ritmo y grado de crecimiento y la eficacia de su conversión de pienso en tejido corporal. Los péptidos pueden administrarse in vivo a adultos y niños para estimular la acción de IGF o insulina.
Los péptidos de esta invención pueden administrarse al mamífero por cualquier técnica adecuada, incluyendo vías de administración oral, parenteral (por ejemplo, inyección o infusión intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea o implante), nasal, pulmonar, vaginal, rectal, sublingual o tópica y pueden formularse en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración. La vía específica de administración dependerá, por ejemplo, de la historia médica del paciente, incluyendo cualquier efecto secundario percibido o previsto usando el péptido, el tipo de péptido que se administra y el trastorno particular a corregir. Más preferiblemente, la administración es por infusión continua (usando, por ejemplo, dispositivos de liberación lenta o minibombas tales como bombas osmóticas o parches dérmicos) o mediante inyección (usando, por ejemplo, medios intravenosos o subcutáneos).
El péptido a usar en terapia se formulará y dosificarán de una forma que concuerde con la buena práctica médica, teniendo en cuenta el estado clínico del paciente individual (especialmente los efectos secundarios de tratamiento con el péptido), el sitio de suministro, el método de administración, la programación de administración, y otros factores conocidos por los especialistas. Las "cantidades eficaces" del péptido para los fines de este documento se determinan, por lo tanto, mediante dichas consideraciones y deben ser cantidades que den como resultado la biodisponibilidad de los fármacos para el mamífero y el efecto deseado.
Una administración preferida es una administración crónica de aproximadamente dos veces al día durante 4-8 semanas para reproducir los efectos de IGF-I o insulina. Aunque se prefiere inyección, también puede emplearse infusión crónica usando un dispositivo de infusión para infusiones subcutáneas (SC) continuas. También puede emplearse una solución de bolsa intravenosa. El factor clave en la selección de una dosis apropiada para la diabetes es el resultado obtenido, que se mide por disminuciones en la glucosa en sangre para aproximarse al intervalo normal, o mediante otros criterios para medir el tratamiento de la diabetes según se consideran apropiados por el especialista médico.
Como una propuesta general, la cantidad total farmacéuticamente eficaz del péptido administrado por vía parenteral por dosis estará en un intervalo que pueda medirse mediante una curva de respuesta a la dosis. Por ejemplo, pueden medirse los IGF unidos a IGFBP o en la sangre en fluidos corporales del mamífero a tratar para determinar la dosificación. Como alternativa, se pueden administrar cantidades crecientes del péptido al paciente y comprobar los niveles séricos del paciente para IGF-I e IGF-II. La cantidad de péptido a emplear puede calcularse en una base molar basándose en estos niveles séricos de IGF-I e IGF-II. Véase el Ejemplo a continuación sobre el desplazamiento de indicador de IGF-I de IGFBP presentes en suero humano. En concreto, un método para determinar una dosificación apropiada del péptido implica medir niveles de IGF en un fluido biológico tal como un fluido corporal o sanguíneo. La medición de dichos niveles puede realizarse por cualquier medio, incluyendo RIA y ELISA. Después de medir los niveles de IGF, el fluido se pone en contacto con el péptido, usando dosis individuales o múltiples. Después de esta etapa de contacto, los niveles de IGF se vuelven a medir en el fluido. Si los niveles de IGF en el fluido han disminuido en una cantidad suficiente para producir la eficacia deseada para la que se va a administrar la molécula, entonces la dosis de la molécula puede ajustarse para producir una eficacia máxima. Este método puede realizarse in vitro o in vivo. Preferiblemente, este método se realiza in vivo, es decir, después de que se extraiga el fluido de un mamífero y se midan los niveles de IGF, el péptido de este documento se administra al mamífero usando dosis individuales o múltiples (es decir, la etapa de contacto se consigue por administración a un mamífero), y después los niveles de IGF se vuelven a medir a partir del fluido extraído del mamífero.
Otro método para determinar la dosificación es usar anticuerpos contra el péptido u otro método de detección para el péptido en el formato de LIFA. Esto permitiría la detección de IGF endógenos o exógenos unidos a IGFBP y la cantidad de péptido unido a la IGFBP.
Otro método para determinar la dosificación sería medir el nivel de IGF "libre" o activo en sangre. Para algunos usos el nivel de IGF "libre" sería un marcador adecuado de dosis o dosificación eficaces y efectivas.
Por ejemplo, se describe un método para detectar IGF o insulina endógena o exógena unida a una proteína de unión a IGF o la cantidad del péptido de este documento, o detectar el nivel de IGF no unido o insulina no unida en un fluido biológico. Este método comprende:
(a) poner en contacto el fluido con 1) un medio para detectar el péptido que sea específico para el péptido (tal como un primer anticuerpo específico para los epítopos del péptido) unido a un vehículo en fase sólida, de modo que en presencia del péptido los sitios de unión a IGF permanecen disponibles sobre el péptido para la unión a la proteína de unión a IGF, formando de este modo un complejo entre el medio y la proteína de unión a IGF; 2) el péptido durante una periodo de tiempo suficiente para saturar todos los sitios de unión a IGF disponibles sobre la proteína de unión a IGF, formando de este modo un complejo saturado;
(b) poner en contacto el complejo saturado con un segundo medio marcado de forma detectable que es específico para la proteína de unión a IGF (tal como un segundo anticuerpo específico para los epítopos de la IGFBP) que esté disponibles para la unión cuando el péptido se una a la proteína de unión a IGF; y
(c) analizar cuantitativamente la cantidad de los medios marcados unidos como medida de la IGFBP en el fluido biológico y, por lo tanto, medida de la cantidad de péptido unido y proteína de unión a IGF, IGF unido o insulina unida y proteína de unión a IGF, o IGF activo o insulina activa presente en el fluido.
Dados los métodos anteriores para determinar dosificaciones, en general, puede estimarse la cantidad de péptido que puede emplearse, es decir, podría usarse de aproximadamente 10 \mug/kg/día a 200 \mug/kg/día, basándose en kg de peso corporal de paciente aunque, como se ha indicado anteriormente, esto se someterá en gran medida a discreción terapéutica.
Se describe un método adicional para estimar la distribución de IGF sobre IGFBP específicas, por ejemplo, sobre IGFBP-1 o IGFBP-3 usando el formato de LIFA.
El péptido se administra convenientemente mediante un sistema de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de composiciones de liberación sostenida incluyen matrices poliméricas, semipermeables en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o microcápsulas. Las matrices de liberación sostenida incluyen poliláctidos (Patente de Estados Unidos Nº 3.773.919, documento EP 58.481), copolímeros de ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli(2-hidroxietilmetacrilato) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res. 15: 167-277 (1981), y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), acetato de etilenvinilo (Langer et al., anteriormente) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (documento EP 133.988). Las composiciones de liberación sostenida también incluyen un péptido inmovilizado liposomalmente. Se preparan liposomas que contienen el péptido por métodos conocidos por sí mismos: documento DE 3.218.121; Epstein et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4030-4034 (1980); documentos EP 52.322; EP 36.676; EP 88.046; EP 143.949; EP 142.641; Solicitud de Patente Japonesa 83-118008; Patentes de Estados Unidos Nº 4.485.045 y 4.544.545; y documento EP 102.324. Generalmente, los liposomas son del tipo unilaminar pequeño (de aproximadamente 200 a 800 Angstroms), en los que el contenido lipídico es superior a aproximadamente el 30 por ciento en moles de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada para la terapia más eficaz.
También pueden emplearse péptidos PEGilados que tengan una vida más prolongada basándose en, por ejemplo, la tecnología de conjugado descrita en el documento WO 95/32003 publicado el 30 de noviembre de 1995.
Para administración parenteral, en una realización, el péptido se formula generalmente por mezcla de cada uno en el grado deseado de pureza en una forma de dosificación unitaria inyectable (solución, suspensión o emulsión) con un vehículo farmacéuticamente o parenteralmente aceptable, es decir, uno que no sea tóxico para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas y que sea compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, preferiblemente la formulación no incluye agentes oxidantes ni otros péptidos que se sabe que son perjudiciales para polipéptidos.
Generalmente, las formulaciones se preparan por contacto del péptido uniformemente e íntimamente con vehículos líquidos o vehículos sólidos finamente divididos o ambos. Después, si es necesario, el producto se conforma en la formulación deseada. Preferiblemente, el vehículo es un vehículo parenteral, más preferiblemente una solución que es isotónica con la sangre del destinatario. Los ejemplos de dichos vehículos excipientes incluyen agua, solución salina, solución de Ringer, una solución tamponada y solución de dextrosa. También son útiles en este documento vehículos no acuosos tales como aceites fijos y oleato de etilo.
El vehículo contiene convenientemente cantidades minoritarias de aditivos tales como sustancias que aumenten la isotonicidad y la estabilidad química. Dichos materiales no son tóxicos para los destinatarios a las dosificaciones y concentraciones empleadas e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (de menos de aproximadamente diez restos), por ejemplo, poliarginina o tripéptidos; proteínas tales como albúmina sérica, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona; glicina, aminoácidos tales como ácido glutámico, ácido aspártico, histidina o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros hidratos de carbono incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa, trehalosa o dextrinas; agentes quelantes tales como EDTA; alcoholes de azúcares tales como manitol o sorbitol; contraiones tales como sodio; tensioactivos no iónicos tales como polisorbatos, poloxámeros o polietilenglicol (PEG); y/o sales neutras, por ejemplo, NaCl, KCl, MgCl_{2}, CaCl_{2}, etc.
Típicamente, el péptido se formula en dichos vehículos a un pH de o de aproximadamente 4,5 a 8. Se entenderá que el uso de ciertos de los excipientes, vehículos o estabilizantes anteriores dará como resultado la formación de sales del péptido. La preparación final puede ser un líquido estable o un sólido liofilizado.
Se analizan a continuación formulaciones típicas de los péptidos como composiciones farmacéuticas. Se preparan un compuesto de aproximadamente 0,5 a 500 mg del péptido o mezcla de péptidos, como la forma de ácido o base libre o como una sal farmacéuticamente aceptable, con un vehículo, soporte, excipiente, aglutinante, conservante, estabilizante, saporífero, etc., fisiológicamente aceptable según exija la práctica farmacéutica aceptada. La cantidad de ingrediente activo en estas composiciones es tal que se obtiene una dosificación adecuada en el intervalo
indicado.
El péptido a usar para la administración terapéutica debe ser estéril. La esterilidad se consigue fácilmente por filtración a través de membranas de filtración estériles (por ejemplo, membranas de 0,2 micrómetros). Las composiciones terapéuticas se colocan generalmente en un recipiente que tiene un orificio de acceso estéril, por ejemplo, una bolsa de solución o intravenosa o vial que tenga un tampón perforable mediante una aguja de inyección hipodér-
mica.
Generalmente, el péptido se almacenará en recipientes individuales o multidosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, como una solución acuosa o como una formulación liofilizada para reconstitución. Como ejemplo de una formulación liofilizada, se cargan viales de 10 ml con 5 ml de solución acuosa de péptido al 1% (p/v) esterilizada por filtración y la mezcla resultante se liofiliza. La solución de infusión se prepara por reconstitución del péptido liofilizado usando agua para inyección bacteriostática.
También es parte de esta invención la terapia de combinación con el péptido de este documento y otros uno o más reactivos apropiados que aumenten el IGF o insulina total en la sangre o aumenten el efecto del péptido. Estos reactivos permiten generalmente que el péptido de este documento libere el IGF o la insulina generados e incluyen agentes promotores del crecimiento.
Los agentes promotores del crecimiento para este fin incluyen, pero sin limitación, secretagogos de GH que promueven la liberación de GH endógena en mamíferos para aumentar las concentraciones del IGF en la sangre. Los ejemplos incluyen TRH, dietilestilbestrol, teofilina, enquefalinas, prostaglandinas de la serie E, péptidos de la familia de VIP-secretina-glucagón-GRF y otros secretagogos de GH tales como GHRP-6, GHRP-1 como se describe en la Patente de Estados Unidos Nº 4.411.890 y lactamos benzo-condensados tales como los descritos en la Patente de Estados Unidos Nº 5.206.235. Véase también, por ejemplo, el documento WO 96/15148 publicado el 23 de mayo de 1996. Otros agentes promotores del crecimiento incluyen GHRP, GHRF, GH y sus análogos. Por ejemplo, se describen GHRP en los documentos WO 95/17422 y WO 95/17423, publicados ambos el 29 de junio de 1995; Bowers. J. Pediatr. Endocrinol., 6: 21-31 (1993); y Schoen et al., Annual Reports in Medicinal Chemistry, 28: 177-186 (1993). Se describen GHRF y sus análogos, por ejemplo, en el documento WO 96/37514 publicado el 28 de noviembre de 1996.
Además, puede emplearse GHRH, cualquiera de las IGFBP, GH de acción prolongada, GH más GHBP, insulina o un agente hipoglucemiante junto con el péptido de este documento con este fin. Además, también puede emplearse IGF-I o IGF-II o un IGF con una IGFBP tal como IGF-I formando un complejo con IGFBP-3 con el péptido de este documento. Por ejemplo, pueden usarse composiciones farmacéuticas que contienen IGF-I e IGFBP en un vehículo como se describe en el documento WO 94/16723 publicado el 4 de agosto de 1994, junto con el péptido. Las entidades pueden administrarse de forma secuencial o simultánea con el péptido. Además, también se considera que son tratamientos de combinación como parte de esta invención otros medios de manipulación del estado de IGF, tales como regímenes de dieta o ejercicio.
Si también se administra insulina, puede ser cualquier formulación o tipo de insulina que se ha indicado anteriormente. La dosis exacta de dicha insulina a usar está sujeta en gran medida a discreción terapéutica y depende de, por ejemplo, el tipo de trastorno, el perfil clínico del paciente, el tipo y la cantidad de variante de IGF o insulina similar a IGF empleada, el tipo de insulina, etc., pero generalmente es de aproximadamente 0,5 a 500 unidades/día de insulina. Como ejemplo, para el tratamiento de diabetes en seres humanos, la dosis de insulina NPH es preferiblemente de aproximadamente 5 a 50 unidades/inyección (es decir, de aproximadamente 0,2 a 2 mg) dos veces al día por vía subcutánea.
Además, la formulación se administra convenientemente junto con una cantidad eficaz de un agente hipoglucemiante tal como una sulfonilurea. El agente hipoglucemiante se administra al mamífero por cualquier técnica adecuada incluyendo por vía parenteral, vía intranasal, vía oral o por cualquier otra vía eficaz. Más preferiblemente, la administración es por la vía oral. Por ejemplo, son adecuadas para la administración oral comprimidos MICRONASE^{TM} (gliburida) comercializados por Upjohn en concentraciones de comprimidos de 1,25, 2,5 y 5 mg. La dosis de mantenimiento habitual para diabéticos de Tipo II, sometidos a esta terapia, está generalmente en el intervalo de aproximadamente 1,25 a 20 mg por día, que pueden administrarse como una dosis individual o dividida por todo el día según se considere apropiado. Physician's Desk Reference, 2563-2565 (1995). Otros ejemplos de comprimidos basados en gliburida disponibles para prescripción incluyen fármaco de marca GLYNASE^{TM} (Upjonh) y fármaco de marca DIABETA^{TM} (Hoeschst-Roussel). El GLUCOTROL^{TM} (Pratt) es la marca comercial para un comprimido de glipizida (1-ciclohexil-3-(p-(2-(5-metilpirazincarboxamida)etil)fenil)sulfonil)urea) disponible en potencias de 5 y 10 mg, y también se prescribe para diabéticos Tipo II que requieren terapia hipoglucemiante después de control dietético o en pacientes que han dejado de responder a otras sulfonilureas. Physician's Desk Reference, 1902-1903 (1995). Pueden emplearse también otros agentes hipoglucemiantes distintos de las sulfonilureas tales como las biguanidas (por ejemplo, metformina y fenformina) o tiazolidinodionas (por ejemplo, troglitozona), u otros fármacos que afectan a la acción de insulina. Si se emplea una tiazolidinodiona con el péptido, se usa al mismo nivel que se usa actualmente o a niveles algo inferiores, que pueden ajustarse por los efectos observados con el péptido en solitario o junto con la diona. La dosis típica de troglitazona (BEZULIN^{TM}) empleada por sí misma es de aproximadamente 100-1000 mg por día, más preferiblemente de 200-800 mg/día y este intervalo es aplicable en este documento. Véase, por ejemplo, Ghazzi et al., Diabetes, 46: 433-439 (1997). Otras tiazolidinodionas que son agentes sensibilizantes a la insulina más potentes que la troglitazona se emplearían a dosis menores.
Además, la invención contempla el uso de terapia génica para tratar a un mamífero, usando un ácido nucleico que codifica el péptido, si es un péptido. Generalmente, se usa terapia génica para aumentar (o sobreexpresar) niveles de IGF o insulina en el mamífero. Pueden usarse ácidos nucleicos que codifican el péptido para este fin. Una vez que se conoce la secuencia de aminoácidos, se pueden generar varias moléculas de ácido nucleico usando la degeneración del código genético y seleccionar cuáles usar para terapia génica.
Existen dos estrategias principales para introducir el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente para los fines de terapia génica: in vivo y ex vivo. Para el suministro in vivo, el ácido nucleico se inyecta directamente en el paciente, habitualmente en el sitio en el que es necesario el péptido. Para el tratamiento ex vivo, se extraen las células del paciente, se introduce el ácido nucleico en estas células aisladas y las células modificadas se administran al paciente directamente o, por ejemplo, encapsuladas en membranas porosas que se implantan en el paciente. Véanse, por ejemplo, las Patentes de Estados Unidos Nº 4.892.538 y 5.283.187.
Existen una diversidad de técnicas disponibles para introducir ácidos nucleicos en células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere a células cultivadas in vitro, o in vivo a las células del hospedador deseado. Las técnicas adecuadas para la transferencia de ácido nucleico a células de mamífero in vitro, incluyen el uso de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, método de precipitación con fosfato de calcio, etc.. Un vector comúnmente usado para el suministro ex vivo del gen es un retrovirus.
Las técnicas de transferencia de ácido nucleico in vivo actualmente preferidas incluyen transfección con vectores virales (tales como adenovirus, virus Herpes simple I o virus adenoasociados) y sistemas basados en lípidos (son lípidos útiles para la transferencia del gen mediada por lípidos DOTMA, DOPE y DC-Chol, por ejemplo). En algunas situaciones es deseable proporcionar la fuente de ácido nucleico con un agente que se dirija a las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de membrana de superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se emplean liposomas, pueden usarse proteínas que se unen a una proteína de membrana de superficie celular asociada con endocitosis para dirigir y/o facilitar la captación, por ejemplo, proteínas de la cápsida o fragmentos de las mismas trópicos por un tipo celular particular, anticuerpos para proteínas que experimentan internalización en el ciclado y proteínas que se dirigen a una localización intracelular y aumentan la semivida intracelular. La técnica de endocitosis mediada por receptor se describe, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990). Para una revisión de los protocolos de marcado génico y terapia génica actualmente conocidos, véase Anderson et al., Science, 256: 808-813 (1992). Véase también el documento WO 93/25673 y las referencias citadas en el mismo.
También se contemplan kits para esta invención. Un kit típico comprendería un recipiente, preferiblemente un vial, para la formulación de péptido que comprende el péptido en un tampón farmacéuticamente aceptable e instrucciones, tal como un prospecto o etiqueta de producto, que indique al usuario cómo utilizar la formulación farmacéutica. El kit incluye opcionalmente un recipiente, preferiblemente un vial, para una GH, una GHRP, una GHRH, un secretagogo de GH, un IGF, un IGF formando un complejo con una IGFBP, una IGFBP, una GH formando un complejo con una GHBP; insulina o un agente hipoglucemiante.
En otra realización de este documento, se describe un método para dirigir IGF o insulina endógena lejos de o hacia un sitio particular en un mamífero, que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz del péptido de este documento que es específica para una IGFBP que sea prevalente en o está ausente del sitio. Los "sitios" para este fin incluyen tejidos u órganos específicos tales como el corazón, o tal como el cerebro mediante IGFBP específicas de cerebro. La prevalencia en el sitio indica que la IGFBP en cuestión se localiza en el sitio y constituye una porción sustancial o biológicamente importante de la IGFBP en el sitio. Esta indicación viene de la especificidad por IGFBP-1 frente a IGFBP-3 de los péptidos demostrada en este documento.
La invención se entenderá más completamente por referencia a los siguientes ejemplos. No obstante, no deberían interpretarse como limitantes del alcance de la invención. Todas las citas bibliográficas y de patentes mencionadas en este documento se incorporan expresamente como referencia.
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Ejemplo I
Mutagénesis mediante Alanina de IGF-I y Variantes Estructurales Introducción
Se usó una estrategia de mutagénesis mediante alanina (Cunningham y Wells, anteriormente) para eliminar esa porción de cada cadena lateral de IGF-I más allá del carbono beta. La contribución de estos átomos a la energía libre de unión del péptido a IGFBP-1 o a IGFBP-3 se evaluó después mediante ELISA de fagos competitivo. En este ensayo, se usó IGFBP-1 o IGFBP-3 para inhibir la unión de los mutantes de fagos de IGF a una placa inmunoabsorbente recubierta con IGFBP-1 o IGFBP-3. Puede calcularse la unión (CI_{50}) a partir de una serie de titulación de proteína de unión. También se evaluaron algunos mutantes para unión directa en ensayos de BIAcore^{TM}.
En los dos conjuntos de ejemplos siguientes, pueden describirse \alpha-aminoácidos comunes mediante el código de aminoácidos convencional de una letra o de tres letras cuando se hace referencia a productos intermedios y finales. Por \alpha-aminoácidos comunes se entienden los aminoácidos incorporados en proteínas bajo la dirección del ARNm. Se enumeran abreviaturas convencionales en el Índice Merck, 10ª Edición, págs. Misc-2-Misc-3. A menos que se designe otra cosa, los \alpha-aminoácidos comunes tienen la configuración natural o "L" en el átomo de carbono alfa. Si el código está precedido por una "D" esta se refiere al enantiómero opuesto del \alpha-aminoácido común. Los \alpha-aminoácidos modificados o pocos habituales tales como norleucina (Nle) y ornitina (Om) se designan como se describe en la U.S. Patent and Trademark Office Official Gazette 1114 TMOG, 15 de mayo de 1990.
Basándose en los resultados de experimentos que usan el mutante de IGF descrito a continuación, se predice que las moléculas del tipo que se reivindica en este documento deberían aumentar los niveles de IGF activo en un sujeto que se trate.
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Materiales y Métodos Construcción de vector fagémido y mutagénesis
Se amplificó el gen que codifica el IGF-I humano maduro a partir de pBKIGF2B (Patente de Estados Unidos Nº 5.342.763) usando los cebadores de PCR 5'-AGC TGC TTT GAT ATG CAT CTC CCG AAA CTC TGT GCG GT-3' (SEC ID Nº: 4) y 5'-GAG CGA TCT GGG TCT AGA CAG ATT TAG CGG GTT TCA G-3' (SEC ID Nº: 5). El fragmento resultante se cortó con Nsil y XbaI y se ligó en pH0753 previamente digerido con NsiI y XbaI. El pH0753 es un derivado de phGHam-g3 (Lowman et al., Biochemistry, 30: 10832-10838 (1991)) en el que se ha delecionado el sitio adicional XbaI en la región promotora de la fosfatasa alcalina (PhoA) usando el oligonucleótido 5'-AAA AGG GTA TGT AGA GGT TGA GGT-3' (SEC ID Nº: 6). El vector ligado pH0753 que contiene la fase de lectura abierta de IGF-I se denominó plGF-g3. Codifica IGF-I que lleva la doble mutación G1S-A70V fusionada con un fragmento de la proteína del gen III (restos 249-406) del bacteriófago de E. coli M 13. Se descubrió que la unión de esta variante de IGF-I a IGFBP-I y -3 era indistinguible del IGF-I de tipo silvestre. Se realizó mutagénesis mediante alanina usando plásmido de cadena sencilla plGF-g3 como molde (Kunkel et al., Methods Enzymol., 204: 125-139 (1991)). Todos los restos del IGF-I excepto las cisteínas y alaninas se sustituyeron individualmente por alanina. Las construcciones resultantes se verificaron mediante secuenciación de ADN.
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Unión de mutantes de IGF presentados en fagos a IGFBP-1 y -3 (ELISA de fagos)
Se recubrieron placas inmunoabsorbentes (Nunc, MAXISORP^{TM}, 96 pocillos) con 100 \mul/pocillo de IGFBP-1 o IGFBP-3 1 \mug/ml en tampón PBS a pH 7,2 a 4ºC durante una noche. Después, las placas se bloquearon con TWEEN 20^{TM} al 0,5%/PBS (también usado como tampón de unión) durante 2 horas a temperatura ambiente (se evitaron agentes bloqueantes proteicos como albúmina sérica bovina para evitar una contaminación potencial con IGF o IGFBP). Se cultivaron durante una noche células E. coli (XL1-Blue, Stratagene) recién transformadas con vector fagémido en 5 ml de medio 2YT (Sambrook et al., anteriormente) en presencia de fago auxiliar M13-VCS (Stratagene). Se recogieron partículas de fago y se resuspendieron en tampón PBS como se describe en Lowman, H. B., "Phage Display of Peptide Libraries on Protein Scaffolds", en Cabilly, S. (ed.), Combinatorial Peptide Library Protocols (Humana Press Inc.: Totowa, NJ, 1998), págs. 249-264. Después, se normalizaron las concentraciones de fago para dar una señal de ELISA máxima de 0,2-0,4 para cada mutante (Lowman, en Cailly, S. (ed.), anteriormente). Se prepararon diluciones seriadas de tres veces de competidor soluble sobre placas de microtitulación no absorbentes (Nunc, F, 96 pocillos) con tampón de unión (TWEEN^{TM} 20 al 0,5%/PBS) que contenía fago a las concentraciones determinadas previamente. El intervalo de dilución de proteína competidora abarcaba seis órdenes de magnitud, partiendo de 5 \muM para IGFBP-1 y 500 nM para IGFBP-3. Después del bloqueo, las placas que contenían diana inmovilizada se lavaron con tampón TWEEN^{TM} al 0,05%/PBS y se incubaron posteriormente con 80 \mul/pocillo de las soluciones de fago-competidor premezcladas durante una hora a temperatura ambiente. Después del lavado, se detectó el fago unido con 80 \mul/pocillo de una solución que contenía un anticuerpo policlonal primario de conejo anti-fago y un anticuerpo monoclonal secundario de cabra anti-conejo conjugado con peróxidasa de rábano picante en TWEEN 20^{TM} al 0,5%/PBS. Se usó o-fenilendiamina (Sigma) y tetrametilbencidina (Kirkegaard y Perry) como sustratos cromogénicos, dando como resultado la detección de producto a 492 y 450 nm, respectivamente. Se determinaron los valores de CI_{50} por ajuste de los datos de unión a una curva de saturación genérica (Lowman, en Cabilly, S. (ed.), anteriormente). Se ensayaron al menos dos clones individuales de cada mutante de IGF-I. Los números de la Tabla I representan media \pm desviación típica de valores de CI_{50} calculados individualmente.
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Expresión y purificación de IGFBP-1 e IGFBP-3
Se expresó IGFBP-1 humana en células CHO y se purificó a partir del medio acondicionado como se describe por Mortensen et al., Endocrinology, 138: 2073-2080 (1997). También se ha clonado IGFBP-3 humana recombinante y se ha expresado en células de mamífero (Wood et al., Mol. Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988)). La purificación a partir de medio acondicionado seguía esencialmente el procedimiento descrito para IGFBP-1, con el uso de una columna de afinidad de IGF (Martin y Baxter, J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986)).
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Expresión y purificación de mutantes de IGF-1 solubles
El plásmido pBKIGF2B (Patente de Estados Unidos Nº 5.342.763) expresa IGF-I de tipo silvestre humano fusionado al péptido líder de lamB bajo el control del promotor P_{pho}A. Para facilitar la mutagénesis dirigida se introdujo el origen de replicación de fago f1 (fl ori) en el plásmido pBKIGF2B. Para este fin se escindió un fragmento de BamHI de 466 pb que contenía el f1 ori de pH0753 (Lowman et al., anteriormente, 1991), mientras que el plásmido pBKIGF2B se lianealizó con EcoRI. Tanto el vector como el fragmento se trataron con enzima Klenow para rellenar salientes de sitios de restricción antes de la ligación de extremos romos. Se seleccionaron construcciones correctas por la capacidad para producir ADN de fagémido monocatenario en presencia de fago auxiliar M13VCS. El vector fagémido resultante se denominó pBKIGF2B-fl-ori y se usó como molde para construir los mutantes de alanina de IGF-I de interés (véase la Tabla II) usando el procedimiento de Kunkel et al., Methods Enzymol., 204: 125-139 (1991)). Cada etapa de mutagénesis se confirmó mediante secuenciación de ADN.
La expresión de mutantes de IGF-I era como se ha descrito para el tipo silvestre de IGF-I (Joly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2773-2777 (1998)), pero sin la sobreexpresión transitoria de oxidorreductasas. El procedimiento de purificación se basaba en un protocolo previo (Chang y Swartz, "Single-Step Solubilization and Folding of IGF-I Aggregates from Escherichia coli" en Cleland, J. L (ed.), Protein Folding In Vivo and In Vitro (American Chemical Society, Washington, DC, 1993), págs. 178-188), con adaptaciones minoritarias. Típicamente, se resuspendieron 6 g de un concentrado celular húmedo (equivalente a 2 litros de medio bajo en fosfato cultivado durante 24 h) en 150 ml de Tris-HCI 25 mM, pH 7,5 que contenía EDTA 5 mM. Las células se lisaron en un microfluidificador (Microfluidics Corp., Newton, MA) y se recogieron partículas refractarias que contenían agregados de IGF-I acumulados por centrifugación a 12.000 x g. Las partículas refractarias se lavaron dos veces con tampón de lisis, dos veces con tampón de lisis que contenía N-lauroil-sarcosina al 1% (Sigma) para extraer proteínas de membrana y dos veces con tampón de lisis de nuevo. Los cuerpos refractarios lavados se resuspendieron a aproximadamente 2 mg/ml en tampón CAPS (ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfónico; Sigma) 50 mM a pH 10,4, que contenía urea 2 M, NaCI 100 mM, MeOH al 20% y DTT 2 mM. Este procedimiento combina la solubilización de cuerpos refractarios y posterior replegamiento oxidativo de mutantes de IGF-I (Chang y Swartz, anteriormente). Después de 3 h a temperatura ambiente las soluciones de replegamiento se filtraron a través de membranas microconcentradoras (Centricon, Amicon) con un límite de peso molecular de 50 kDa. La mayoría del IGF-I monomérico se recuperó en el eluído, mientras que los contaminantes de mayor peso molecular se concentraron en el material retenido. En este punto, las fracciones de IGF-I tenían una pureza >95%, a juzgar por el análisis de SDS-PAGE. Para separar correctamente el IGF-I unido por disulfuros del IGF-cambio (que contiene dos disulfuros no nativos; Hober et al., Biochemistry, 31: 1749-1756 (1992); Miller et al., Biochemistry, 32: 5203-5213 (1993)), las soluciones de replegamiento se acidificaron con ácido acético al 5% y se cargaron en una columna de HPLC semipreparativa C18 Dynamax^{TM} (Varian: DI 10,0 mm) a 4 ml/min. Los tampones eran H_{2}O/TFA al 0,1% (A) y acetonitrilo/TFA al 0,1% (B). La separación de los isómeros disulfuro se consiguió por aplicación del siguiente gradiente: 0-30% B en 20 min, 30-45% B en 60 min. La proporción de IGF-I nativo respecto a IGF-cambio era habitualmente de aproximadamente 2:1 para cada mutante, eluyéndose el IGF-cambio antes en el gradiente que el IGF-I nativo. La masa molecular de cada mutante se verificó mediante espectrometría de masas. Después de la purificación por HPLC, las muestras se liofilizaron y se reconstituyeron a aproximadamente 1 mg/ml en tampón HEPES 100 mM, a pH 7,4.
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Medición Cinética Biodetectora
Las afinidades de unión de las variantes de IGF para IGFBP-1 e IGFBP-3 se determinaron usando un sistema de análisis de interacción cinética a tiempo real BIAcore^{TM}-2000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) para medir las velocidades de asociación (k_{a}) y disociación (k_{d}). Se activaron microplacas biodetectoras de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con EDC (clorhidrato de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) y NHS (N-hidroxisuccinimida) de acuerdo con las instrucciones del proveedor. Para la inmovilización, se inyectaron mutantes de IGF en acetato de sodio 20 mM, pH 4,8, sobre la microplaca biodetectora a una concentración de 50 \mug/ml para dar aproximadamente 450-600 RU (unidades de respuesta de resonancia) de proteína acoplada covalentemente. Se bloquearon los grupos sin reaccionar con una inyección de etanolamina 1 M. Se realizaron mediciones cinéticas por inyección de diluciones seriadas de dos veces (partiendo de 1 \muM) de IGFBP-1 o IGFBP-3 en tampón de procesamiento (PBS, Tween 20 al 0,05%, ovoalbúmina al 0,1%, azida sódica al 0,1%) a 25ºC usando un caudal de 20 \mul/min. Se calcularon las velocidades de asociación (k_{a}) y velocidades de disociación (k_{d}) por separado usando un modelo de asociación de Langmuir^{TM} 1:1 en el programa informático de evaluación BIAcore^{TM} v. 3.0. La constante de disociación en equilibrio (K_{D}) se calculó como k_{d}/k_{a}.
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Resultados Presentación monovalente de IGF-I en fagos
Para un barrido con alanina rápido y exhaustivo de los 70 restos aminoacídicos del IGF-I, se determinó primero si la proteína podía presentarse monovalentemente en la superficie del fago M13 (Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)). La tecnología de presentación en fagos combina la ventaja de la mutagénesis rápida de ADN monocatenario con la facilidad de purificación de la proteína mutante resultante, simplemente por aislamiento de las partículas de fago correspondientes (por ejemplo, Cunningham et al., 1994, anteriormente). Se construyó un vector en el que se fusionó IGF-I humana madura con el dominio carboxi-terminal del producto del gen III de M 13. Esta construcción incluye la secuencia señal stII que dirige la proteína de fusión hacia el espacio periplásmico de E. coli y permite la presentación monovalente de la proteína (Bass et al., anteriormente; Lowman et al., anteriormente, 1991). Para fines de clonación se cambiaron el primer y el último aminoácido del IGF-1; el mutante resultante G1S-A70V se usó como construcción de molde para la posterior mutagénesis mediante alanina.
Cuando se aislaron partículas de fago que presentaban IGF-I G1S-A70V y se evaluaron en un ELISA de fagos de competición por la unión para determinar su afinidad hacia IGFBP, la CI_{50} determinada en ese experimento era de 8,5 nM para IGFBP-1 y de 0,5 nM para IGFBP-3 (Figura 1). Estos valores concuerdan mucho con las constantes de disociación determinadas mediante experimentos de BIAcore^{TM} usando IGF-I de tipo silvestre (Heding et al., anteriormente). Las afinidades de IGF-I de tipo silvestre determinadas mediante inmunoensayos radiactivos (RIA) son de \sim2,8 nM para IGFBP-1 y -0,8 nM para IGFBP-3, confirmando adicionalmente los valores de CI_{50} obtenidos a partir del ELISA de fagos. Además, las partículas de fagos que presentaban IGF-I o G1S-A70V se capturaban eficazmente por 11 anticuerpos monoclonales de ratón anti-IGF-1 independientes inmovilizados sobre placas de microtitulación. Estos resultados sugerían en su conjunto que la variante de IGF presentada estaba correctamente plegada y accesible en la superficie de las partículas de fago.
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Mutagénesis mediante alanina de la unión de IGF-I a IGFBP-1 e IGFBP-3
Todos los restos del IGF-I G1S-A70V excepto las cuatro alaninas y las seis cisteínas nativas se sustituyeron individualmente por alanina usando el vector G1S-A70V IGF-I gIII descrito como molde. Además, se construyeron los mutantes individuales S1G y V70A y la doble mutación que restituye el IGF-I de tipo silvestre. Cada una de estas construcciones se expresaba en E. coli y se presentaba en fagos. Se determinaron los valores de CI_{50} para la unión a IGFBP-1 e IGFBP-3 por ELISA de fagos competitivo como se muestra en la Figura 1. Se ensayaron al menos dos clones diferentes de cada mutante. Los valores de CI_{50} resultantes se enumeran en la Tabla I y la pérdida o ganancia en CI_{50} para cada mutante con respecto a G1S-A70V se representa gráficamente en la Figura 2.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA I
1
2
3
La mayoría de los mutantes de alanina producían sólo cambios minoritarios en los valores de CI_{50} en el ELISA de fagos. De forma importante, el IGF-I de tipo silvestre mostraba las mismas afinidades por IGFBP-1 e IGFBP-3 que G1S-A70V, en cuyo fondo se realizaron las sustituciones con alanina (Tabla I, Figura 2). Sólo unos pocos restos causaban pérdidas considerables (> 10-veces) en la afinidad cuando se cambiaban a alanina: E3, G7, L10, V11, F25, R36, P39, F49 y P63 por la unión a IGFBP-1; V11, R36, P39 y P63 por la unión a IGFBP-3. Se ha señalado que las sustituciones con alanina de glicinas y prolinas pueden conducir a alteraciones estructurales de la estructura proteica (Di Cera, Chem. Rev., 98: 1563-1591 (1998)).
Se descubrieron sólo unas pocas mejoras modestas en la afinidad de unión mediante sustituciones con alanina. S1A, D12A y D45A mostraban un aumento de aproximadamente 2 veces en la unión a IGFBP-1, mientras que S35A y T41A mostraban un efecto similar para IGFBP-3. Sin embargo, cambios de 2 veces en valores de CI_{50} están en el límite de exactitud de estos experimentos.
Determinantes de especificidad de IGFBP
E3A, G7A, L10A, F25A y F49 mostraban un efecto diferencial en la unión a IGFBP-1 frente a IGFBP-3. Para estos cinco mutantes de alanina individuales de IGF-I, la CI_{50} relativa para IGFBP-1 difería en más de 4 veces de la de para IGFBP-3 (Figura 2; Tabla I, especificidad relativa). E3A y F49A mostraban los mayores factores de especificidad relativa en este grupo. La sustitución con alanina de E3 no tenía prácticamente ningún efecto sobre la afinidad por IGFBP-3 (1,4 veces) mientras que la unión a IGFBP-1 se debilitaba 34 veces. Aún más drástica, la afinidad de F49A se reduce más de 100 veces para IGFBP-1 pero sólo 3,6 veces para BP-3. Este resultado se ilustró en comparación directa mediante ELISA de fagos. Se añadieron partículas de fagos que presentaban IGF-I F49A a pocillos recubiertos con IGFBP-3 en presencia de IGFBP-1 (Figura 3A) o IGFBP-3 (Figura 3B) soluble. En comparación con fago de control que presentaba IGF-I G1S-A70V, la curva de unión de F49A cambiaba más de dos órdenes de magnitud en la competición con IGFBP-1 (Figura 3A). Por el contrario, las curvas de unión eran similares en la competición con IGFBP-3 y los valores de CI_{50} diferían en menos de un factor de 4 (Figura 3B). Por lo tanto E3 y F49 son dos determinantes de especificidad principales para la unión a IGFBP-1 en la molécula de IGF-I.
Los restos G7, L10 y F25 parecían ser importantes para la unión de ambas IGFBP, aunque mostraban una pérdida de afinidad menos pronunciada por IGFBP-1 que por IGFBP-3 cuando se sustituían por alaninas. No se identificó ningún determinante de especificidad significativo para IGFBP-3, tal como un mutante que se une mucho más estrechamente a IGFBP-1 que a IGFBP-3. Sin embargo, las mutaciones E9A, D12A, F23A, Y24A, T29A, S34A y D45A tenían efectos ligeramente mayores (de aproximadamente 2 veces) sobre IGFBP-3 que sobre la unión a IGFBP-1.
Mediciones de BIAcore^{TM} de mutantes de IGF solubles purificados
Para validar los resultados obtenidos mediante el ELISA de fagos, se expresaron mutantes de alanina específicos y se purificaron para análisis cinético usando un instrumento BIAcore^{TM}. Se determinó que la constante de disociación (K_{D}) de IGF-I de tipo silvestre era de 13 nM para IGFBP-1 y de 1,5 nM para IGFBP-3 (Figuras 5A y 5B; Tabla II). La diferencia de afinidad por las IGFBP se debe a una velocidad de asociación 10 veces más rápida (k_{a}) de IGF-I a IGFBP-3 (3,2 x 10^{5} frente a 3,2 x 10^{4} M^{-1}s^{-1}). Estos resultados se corresponden bien con los valores absolutos de CI_{50} determinados mediante el ELISA de fagos (Figuras 1A y 1B; Tabla I). Como se esperaba, el doble mutante G1S-A70V mostraba parámetros cinéticos esencialmente indistinguibles del tipo silvestre (Tabla II).
Se ensayaron V11A, R36A y P39A porque estas variantes no se habían presentado correctamente en fagos basándose en los experimentos de reconocimiento de anticuerpos (véase anteriormente). R36A y P39A mostraban cinéticas de tipo silvestre para ambas proteínas de unión, mientras que V11A mostraba una reducción de 5 veces en la afinidad tanto por IGFBP-1 como por IGFBP-3.
Además, se decidió examinar la variante de IGF soluble T4A. Este resto se ha implicado en la unión a IGFBP en publicaciones anteriores (Bayne et al., anteriormente, J. Biol. Chem., 263; Clemmons et al., anteriormente, 1990), pero ha demostrado efectos modestos en los ensayos de fagos de este documento. El aumento en los valores de K_{D} de T4A respecto al IGF-I de tipo silvestre era de aproximadamente 2-3 veces mayor que las proporciones de CI_{50} determinadas mediante el ELISA de fagos (Tabla II). Se observó una mayor discrepancia entre los resultados obtenidos por el análisis de fagos y el biodetector para F16A. En este caso, los dos métodos diferían en un factor de 4.
Se ha demostrado que mutaciones en la primera región \alpha-helicoidal tienen un efecto desestabilizante sobre la estructura proteica del IGF (Jansson et al., anteriormente, 1997). Sin limitarse a teoría alguna, se piensa que la proteína de fusión g3 en la superficie del fago podría ser más estable que la proteína soluble replegada purificada. Esto se confirma por los resultados de BIAcore^{TM} obtenidos para F25A y F49A, dos restos localizados fuera de la hélice N-terminal estructuralmente sensible. Los cambios respectivos en valores de K_{D} y CI_{50} concuerdan de forma excelente para estos dos mutantes (Tabla II). El efecto diferencial de F49A sobre la unión a las IGFBP se confirmó mediante el análisis de BIAcore^{TM}. Se midió una disminución de 70 veces en la afinidad por la unión a IGFBP-1 (Figura 5C; Tabla II), mientras que la unión a IGFBP-3 se redujo sólo 4 veces (Figura 5D; Tabla II).
TABLA II Parámetros Cinéticos para la Interacción de Variantes de IGF-I Purificadas con IGFBP-1 y -3 Determinados mediante Análisis de BIAcore^{TM \ a}
4
Papel de los restos N-terminales de IGF-I
Sorprendentemente, la interacción con IGFBP-3 se veía generalmente menos afectada por las sustituciones con alanina que la interacción con IGFBP-1, a pesar del hecho de que IGFBP-3 se une a IGF-I con una afinidad aproximadamente 10 veces mayor. Aparte de P63A, ningún mutante de alanina presentaba una reducción >6 veces en la afinidad por IGFBP-3 (Figura 2 y Tabla I).
Se había demostrado previamente en experimentos de biodetector que el des(1-3)-IGF-I se une a IGFBP-3 con una afinidad 25 veces reducida (Heding et al, anteriormente). Esta forma de origen natural de IGF-I carece de los primeros tres restos N-terminales y muestra una potencia mitógena aumentada, presumiblemente debido a su reducción en la unión a IGFBP (Bagley et al., anteriormente). Puesto que ninguna de las tres primeras cadenas laterales de aminoácidos parecen contribuir con energía alguna a la unión de IGFBP-3 (Tabla I), pero no obstante el des(1-3)-IGF-I está comprometido en la unión a IGFBP-3, sin limitarse a teoría alguna, se formula la hipótesis de que podrían estar implicadas interacciones de cadena principal.
La hipótesis se ensayó presentando en fagos un mutante triple de alanina (Ala(1-3)-IGF-I), sustituyendo los primeros tres aminoácidos N-terminales. Si la estructura en esa región contribuye la interacción con IGFBP-3 este mutante debería ser capaz de unirse. La unión a IGFBP-1, sin embargo, debería reducirse debido a la ausencia de la cadena lateral E3 (Tabla I). Como control, se generó el mutante des(1-2)-IGF-I, ensayando para cualquiera interacción de cadena principal potencial con IGFBP-1 en las posiciones 1 y 2. Como se esperaba, el Ala(1-3)-IGF-I mostraba una afinidad por IGFBP-1 disminuida similar a E3A pero ningún cambio en la afinidad por IGFBP-3 (Tabla 1; Figura 2). Para des(1-2)-IGF-1, no se observaron diferencias en la afinidad por ambas proteínas de unión. Combinados con las observaciones sobre des(1-3)-IGF-I (Heding et al, anteriormente), estos resultados sugieren, sin limitación a teoría alguna, que la cadena principal peptídica entre el resto 3 y 4 de IGF-I media interacciones importantes con IGFBP-3.
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Discusión
Los epítopos de unión funcionales a IGFBP-1 e IGFBP-3 sobre la superficie de IGF-I se han sondado por mutagénesis mediante alanina. Ambos epítopos de unión se ilustran en la Figura 6. Las interacciones de cadena lateral de IGF-I individuales desempeñan un papel mucho más importante para la unión a IGFBP-1 que a IGFBP-3. Se descubrieron dos territorios de unión principales para IGFBP-1 (Figura 6A). Uno se sitúa en la superficie superior de la hélice N-terminal (compuesta por G7, L10, V11, L14, F25.143 y V44) y uno en la superficie inferior (compuesta por E3, T4, L5, F16, V17 y L54). Estos dos territorios de unión están unidos por F49 y R50. Para IGFBP-3, el epítopo de unión es más difuso y ha cambiado para incluir G22, F23 e Y24 (Figura 6B). La unión de IGFBP-3 generalmente es mucho menos sensible a las sustituciones con alanina. De hecho, la mayor reducción en afinidad (aparte de P63A, véase a continuación), es una disminución de 6 veces observada para G7A. Este resultado es intrigante puesto que IGFBP-3 se une con una afinidad 10 veces mayor a IGF-I que IGFBP-1. Muy probablemente, sin limitación a teoría alguna, las interacciones que se originan a partir de la estructura de cadena principal de IGF-I están contribuyendo a la unión de IGFBP-3. Esta hipótesis se confirma adicionalmente mediante los experimentos con el mutante de Ala(1-3)-IGF. Mientras que las sustituciones con alanina individuales y triples no tienen efecto sobre la unión a IGFBP-3, la deleción de los 3 primeros aminoácidos daba como resultado una disminución de la afinidad de 25 veces (Bagley et al., anteriormente; Clemmons et al., anteriormente, 1992; Heding et al., anteriormente). En resumen, el IGF-I usa diferentes modos de unión para asociarse con IGFBP-1 e IGFBP-3: unas cuantas interacciones de cadena lateral de aminoácidos son importantes para la unión a IGFBP-1, mientras que las interacciones de cadena principal parecen desempeñar un papel energético principal para la unión a IGFBP-3.
Una publicación reciente ha investigado el epítopo de unión sobre IGF-I para IGFBP-1 mediante espectroscopía de RMN heteronuclear (Jansson et al., anteriormente, 1998). Los autores descubrieron que los restos de IGF-I 29, 30, 36, 37, 40, 41, 63, 65 y 66 entre otros, experimentaban alteraciones por desplazamiento químico tras la formación de complejo con IGFBP-1 a 30ºC. Además, Jansson y colaboradores identificaron que R36, R37 y R50 eran parte del epítopo de unión funcional y ensayaron esos mutantes de alanina en experimentos de BIAcore^{TM}. El mayor cambio en la afinidad observado por estos autores era una disminución de 3 veces para R50A. Sin embargo, debido a la flexibilidad estructural de IGF-I ya observada en el primer estudio de RMN de la hormona (Cooke et al., anteriormente), Jansson et al. fuero incapaces de asignar completamente muchos restos en el espectro de RMN, incluyendo F49.
En estudios similares de superficies de contacto proteína-proteína se descubrió que sólo unos pocos restos de cadena lateral contribuían a la masa de energía libre de unión (Clackson y Wells, Science, 267: 383-386 (1995); Kelley et al., Biochemistry, 34: 10383-10392 (1995)). Esto mismo es cierto para la interacción de IGF-IGFBP-1. Sin embargo, en este documento, como se observó para la unión de factor tisular a factor VIIa, la magnitud de los valores de energía libre de unión (\Delta\DeltaG) procedentes de cadenas laterales importantes es menor que en el caso de la hormona de crecimiento (Kelley et al., anteriormente). Los restos con contribuciones de \Delta\DeltaG predominantes no se agrupaban en la superficie de IGF-I como en la superficie de contacto de hormona de crecimiento-receptor (Clackson y Wells, anteriormente), pero aun así formaban un epítopo de unión a IGFBP-1 continuo (Figura 6A). Por el contrario, el epítopo de unión a IGFBP-3 en IGF-I era discontinuo y las cadenas laterales contribuían con energías de unión individuales muy modestas.
La sustitución de P63 por alanina en IGF-I da como resultado una afinidad disminuida por ambas proteínas de unión que no puede medirse en el intervalo de concentración usado en el ELISA de fagos de competición. Sin embargo, el resto P63 se localiza en el lado opuesto de la molécula de IGF-I con respecto al epítopo de unión principal. Además, se ha observado que las sustituciones con alanina de glicinas y prolinas pueden conducir a cambios estructurales (Di Cera, anteriormente). Además, Jansson et al., 1998, anteriormente, concluyeron que la parte C-terminal de IGF-I no está implicada en los contactos directos con IGFBP-1 sino que experimenta cambios conformacionales indirectos tras la formación de complejo. Se ha realizado una caracterización exhaustiva de sitios de unión a anticuerpo en IGF-I por Manes et al., Endocrinology, 138: 905-915 (1997). Mostraron la unión simultánea de IGFBP-1 ó -3 a IGF-I en complejo con anticuerpos que reconocen el dominio D C-terminal. Estos resultados confirman adicionalmente observaciones anteriores de que el dominio D, que comienza con el resto P63, no está implicado en la unión de IGFBP-1 ó -3 (Bayne et al., anteriormente, 1988).
La discrepancia principal entre una proporción de CI_{50} obtenida mediante ELISA de fagos y un resultado de BIAcore^{TM} se observó con el resto F16. Como ya se ha mencionado la sustitución de este resto por alanina inducía cambios estructurales en la molécula de IGF-I (Jansson et al., anteriormente, 1997). Se observó el mismo efecto con la K_{D} en los resultados de BIAcore^{TM} pero la disminución de afinidad era menos pronunciada en los experimentos de ELISA de fagos (véase la Tabla II). Ambas mediciones de BIAcore^{TM} usaban IGF-F16A que se había vuelto a plegar durante el procedimiento de purificación (Jansson et al., anteriormente, 1997). En la presentación en fagos, sin embargo, la proteína de interés se transloca de forma natural por la maquinaria de secreción de E. coli. La reducida abundancia de proteína en la presentación monovalente en fagos (<1 molécula de partícula de fago) puede desfavorecer la agregación y el plegamiento erróneo. Además, la fusión de IGF-I con la proteína de fago g3 truncada podría ejercer un efecto estabilizante sobre la estructura nativa del péptido.
La mayoría del IGF-1 en la circulación se encuentra en complejo con IGFBP-3 y una tercera proteína denominada subunidad ácido-lábil (ALS) (Bach y Rechler, anteriormente: Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8: 45-62 (1997); Jones y Clemmons, anteriormente). Este complejo ternario de peso molecular de 150 kD es incapaz de atravesar las paredes vasculares y actúa como un depósito circulante para IGF. Mediante este mecanismo la semivida del IGF-I se aumenta drásticamente (Simpson et al., Growth Horm IGF Res, 8: 83-95 (1998)). Los niveles de IGFBP-3 se regulan positivamente por IGF-I. El papel de IGFBP-1, por el contrario, está menos claro. Esta clase de proteínas de unión generalmente es menos abundante que IGFBP-3 y sus niveles están regulados negativamente por la insulina (Bach y Rechler, anteriormente; Clemmons, anteriormente, 1997; Jones y Clemmons, anteriormente). Basándose en los resultados de este documento, se obtienen variantes de IGF-I específicas de IGFBP. La combinación de varias mutaciones de alanina genera una variante que se une a IGFBP-1 muy débilmente al tiempo que conserva alta afinidad de unión de IGFBP-3. El diseño de variantes específicas para IGFBP-1 que ya no se unan a IGFBP-3 puede implicar la presentación en fagos de IGF-I y la aleatorización de aminoácidos en posiciones específicas (Cunningham et al., 1994, anteriormente; Lowman y Wells, J. Mol. Biol., 243: 564-578(1993)).
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Conclusión
Se han identificado restos en IGF-I importantes para la unión a IGFBP-1 e IGFBP-3. Se descubrió que varios restos determinan la especificad de unión por una IGFBP particular. Publicaciones recientes (Loddick et al., anteriormente; Lowman et al., anteriormente 1998)) han descrito estudios animales en los que se generaron combinaciones aumentadas de IGF-I "libre" biodisponible por desplazamiento del IGF-I endógeno de las proteínas de unión. Pueden usarse variantes de IGF-I específicas de IGFBP de forma diagnóstica y terapéutica como se ha descrito anteriormente.
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Ejemplo 2
Insulinas Similares a IGF
Se ha descrito que la insulina tiene una débil afinidad de 251 +/- 91 nM por IGFBP-3, según se mide mediante experimentos de BIAcore^{TM} (Heding et al., anteriormente). Por lo tanto, en comparación con el complejo de alta afinidad con IGF-I (0,23 nM), la insulina se une 1000 veces más débilmente. Por lo tanto, la insulina presenta probablemente el armazón estructural correcto necesario para unirse a IGFBP y si se introducen algunos restos correctos, se mejorará la unión.
Cascieri et al., Endocrinology, anteriormente, describen una reducción de la afinidad de aproximadamente 1000 veces para proteína de unión con sustitución de la región N-terminal de insulina sobre IGF-I, al contrario que los datos de barrido con alanina de este documento (la afinidad de tipo silvestre de Ala(1-3)IGF-I por IGFBP-3 (Tabla 1)), que sugiere que otras sustituciones próximas al extremo N-terminal de IGF-I deberían permitir la unión a IGFBP-3. Esto se debe probablemente a un resto adicional, Phe^{-1}, presente en el extremo N-terminal del híbrido IGF/insulina, (Phe^{-1},Val^{1},Asn^{2},Gln^{3},His^{4},Ser^{8},His^{9},Glu^{12},Tyr^{15},Leu^{16})IGF-I (la numeración es la de Cascieri et al., Endocrinology, anteriormente, para IGF-I). Se espera que la deleción de Phe^{1} en la proinsulina o insulina mejore la unión a IGFBP-3. Basándose en los resultados del barrido con alanina, se obtuvo una mejora adicional en la unión a IGFBP-3 realizando mutaciones (numeración de proinsulina) F25Y, Y26F y T73F, ya que las sustituciones de estas cadenas laterales en IGF-I afectan a la unión a IGFBP-3 (Tabla I) y la proinsulina (así como la insulina) difiere del IGF-I en estos sitios (Figura 4). Se espera que la unión de insulina o proinsulina a IGFBP-1 mejore mediante las mutaciones Q4E, L17F, Y26F y T49F, ya que las sustituciones de estas cadenas laterales en IGF-I afectan a la unión a IGFBP-1 (Tabla I) y la proinsulina (así como la insulina) difiere del IGF-I en estos sitios (Figura 4).
Slieker et al., anteriormente, propusieron que podían producirse análogos de acción prolongada de insulina por modificación por ingeniería genética de insulina para que se una a factores endógenos. Dichos complejos, por analogía con los complejos de IGF:IGFBP (véase por ejemplo, Cascieri et al., Endocrinology, anteriormente) podrían aclararse más lentamente de la circulación que la hormona libre. Sin embargo, las variantes de insulina que describieron tenían sólo una escasa afinidad de unión por IGFBP y una afinidad reducida por el receptor de insulina (Slieker et al., anteriormente). Por definición de los determinantes de unión para IGFBP-1 e IGFBP-3 a mayor resolución que los estudios anteriores, se obtuvieron por ingeniería genética variantes de proinsulina e insulina diferentes que conservan la unión a receptor pero que consiguen una afinidad significativa por IGFBP.
También se ha presentado en fagos la proinsulina humana. Por lo tanto, pueden medirse fácilmente las afinidades de unión de mutantes de un solo sitio y de múltiples sitios mediante las técnicas descritas anteriormente.
La conversión de proinsulina en insulina se produce por escisión de la región de R31 a R65 (incluyendo los restos mencionados). El péptido amino-terminal resultante de la insulina madura se denomina cadena B y el péptido carboxi-terminal cadena A. Las cadenas se mantienen unidas por dos disulfuros intercatenarios. El sistema de numeración anterior se refiere a la proinsulina humana de secuencia nativa, cuya secuencia se muestra en la Figura 4 en comparación con la secuencia nativa del IGF-I humano. Si los mutantes de proinsulina presentados en fagos se unen con éxito a las IGFBP, estas mutaciones se introducen en la insulina soluble madura.
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Ejemplo 3
Tratamiento de Seres Humanos con IGF-I Humano
Este ejemplo muestra el principio de cómo un péptido administrado exógenamente que se une a una o más de las IGFBP actúa desplazando el IGF endógeno y cómo dosificar un péptido de este documento para su uso en seres humanos.
En este estudio, se administró a diabéticos Tipo II humanos IGF-I humano recombinante o placebo mediante inyección dos veces al día a cuatro dosis (10, 20, 40 u 80 \mug/kg) durante 12 semanas. Se extrajeron muestras de sangre, antes, cada dos semanas durante y después (EP) de las 12 semanas de tratamiento. Se midieron las concentraciones de IGF-I, IG F-lI e IGFBP-3 en todas las muestras excepto por que no se midió el IGF-II en las muestras tomadas de los pacientes tratados con 10 \mug/día de IGF-I.
La Figura 43 del documento WO 98/45427 muestra las concentraciones de IGF-I en la sangre de los pacientes. El descubrimiento inesperado era el efecto de "meseta" de administrar 40 y 80 \mug de IGF-I; se alcanzó la misma concentración sanguínea total de IGF-I con estas dos dosis.
La Figura 44 del documento WO 98/45427 muestra las concentraciones de IGF-II en la sangre de los pacientes. Al contrario que los niveles en aumento de IGF-I, los niveles de IGF-II disminuyeron casi en un patrón de reflejo exacto respecto al aumento en las concentraciones de IGF-I. Como con el estancamiento de las concentraciones crecientes de IGF-I, las concentraciones decrecientes de IGF-II también alcanzaron una meseta.
La Figura 45 del documento WO 98/45427 muestra las concentraciones de IGFBP-3 en la sangre de los pacientes. Al contrario que los cambios claros en los patrones de IGF-I e IGF-II en la sangre, las concentraciones de IGFBP-3 no mostraban un patrón claro o estadísticamente significativo de cambio.
La inspección de las Figuras 43 y 44 del documento WO 98/45427 puso de manifiesto que las concentraciones totales de IGF (IGF-I más IGF-II) mostraban escaso cambio con tratamiento. Esto se debía a que el aumento en las concentraciones de IGF-I coincidía estrechamente con la caída de las concentraciones de IGF-II. La inspección de las tres Figuras muestra que los cambios relacionados con la dosis en las concentraciones de IGF-I e IGF-II en la sangre de los pacientes no se acompañaban de una capacidad de la proteína de unión IGFBP-3 reducida (IGFBP-3 es la proteína de unión principal en la sangre).
La explicación obvia para la caída de la concentración de IGF-II y el estancamiento de las concentraciones de IGF-I e IGF-II es que existe una cantidad finita de capacidad de proteína de unión a IGF y en este experimento las dosis de IGF-I usadas causaban un desplazamiento relacionado con la dosis de IGF-II de las proteínas de unión.
Una ampliación lógica de las observaciones de este ejemplo es esperar que cualquier molécula con la capacidad de aumentar los niveles de IGF activo mostraría actividades similares a las mostradas por IGF-I en este Ejemplo. Además, a partir de las dosis de IGF-I usadas y las concentraciones de IGFBP e IGF-I e IGF-II demostradas, es sencillo calcular cuánto péptido debería administrarse para aumentar los niveles de IGF endógeno activo. El tamaño molar relativo a IGF-I, la afinidad del péptido por la IGFBP y su biodisponibilidad serían otras variables tenidas en cuenta para llegar a dosis que aumentasen el IGF activo en un ser humano.
La presente invención se ha analizado por necesidad en este documento con referencia a ciertos métodos y materiales específicos. Debe entenderse que la discusión de estos métodos y materiales específicos no constituye de ningún modo ninguna limitación del alcance de la presente invención, que se extiende a cualquiera y todos los materiales y métodos alternativos adecuados para conseguir los objetivos de la presente invención.
<110> Genentech, Inc.
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<120> VARIANTES DE PROTEÍNAS
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<130> P1712R1PCT
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<141> 05-01-2005
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<160> 6
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<210> 1
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<211> 70
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<400> 1
5 
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens 
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<212> ADN
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<220>
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<223> Cebador sintetizado
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agctgctttg atatgcatct cccgaaactc tgtgcggt 
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38 
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<223> Cebador sintetizado
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gagcgatctg ggtctagaca gatttagcgg gtttcag 
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<221> Artificial
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<222> 1-24
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<223> Oligonucleótido sintetizado
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<400> 6
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aaaagggtat gtagaggttg aggt 
\hfill
24

Claims (17)

1. Una variante de IGF-1 que comprende una alanina en posición 3.
2. La variante de IGF-I de la reivindicación 1 que comprende además una sustitución de aminoácido en cualquiera de las posiciones 12 ó 16, o ambas, donde el aminoácido sustituido se selecciona del grupo que consiste en un resto de alanina, glicina y serina.
3. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, en la que además el aminoácido en posición 4 se sustituye con serina.
4. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en la que además el aminoácido en posición 5 se sustituye con un resto de alanina, glicina o serina.
5. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que además el aminoácido en posición 7 se sustituye con cualquier aminoácido.
6. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en la que además el aminoácido en posición 10 se sustituye con un resto de alanina, glicina o serina.
7. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en la que además el aminoácido en posición 14 se sustituye con un resto de alanina, glicina o serina.
8. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que además el aminoácido en posición 17 se sustituye con un resto de alanina, glicina o serina.
9. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en la que además el aminoácido en posición 23 se sustituye con un resto de alanina, glicina o serina.
10. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en la que además el aminoácido en posición 24 se sustituye con un resto de alanina, glicina o serina o una leucina.
11. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en la que además el aminoácido en posición 25 se sustituye con un resto de alanina, glicina o serina.
12. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en la que además el aminoácido en posición 43 se sustituye con un resto de alanina, glicina o serina.
13. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en la que además el aminoácido en posición 49 se sustituye con un resto de alanina, glicina o serina.
14. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en la que además el aminoácido en posición 63 se sustituye con un resto de alanina, glicina o serina.
15. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 14, en la que se sustituyen los aminoácidos en las posiciones 16 y 49.
16. La variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 2 a 15, en la que el IGF-I es IGF-I humano, cuya secuencia se muestra en la SEC ID Nº: 1.
17. Una composición que comprende la variante de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 en un vehículo.
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