ES2234560T3

ES2234560T3 - Variante mutante del factor de crecimiento de tipo insulina (igf-i).

Info

Publication number: ES2234560T3
Application number: ES00901397T
Authority: ES
Inventors: Yves Dubaquie; Paul J. Fielder; Henry B. Lowman; Deborah L. Mortensen
Original assignee: Genentech Inc
Current assignee: Genentech Inc
Priority date: 1999-01-06
Filing date: 2000-01-05
Publication date: 2005-07-01
Anticipated expiration: 2020-01-05
Also published as: DE60016560D1; US7105167B2; CA2356109C; PT1141014E; US20110003746A1; DK1141014T3; US6403764B1; IL143866A; CA2356109A1; JP2002535968A; ATE284415T1; JP2006328074A; DE60016560T2; AU2224500A; AU762351B2; JP3971108B2; US20020160955A1; EP1141014A1; WO2000040613A9; EP1141014B1

Abstract

Variante de IGF-I, en la que el resto de aminoácido en la posición 49 del IGF-I humano con secuencia natural está sustituido con un resto de alanina o de glicina. En una forma de realización, la invención proporciona una variante de IGF-I en la que el resto de aminoácido en la posición 49 del IGF-I humano con secuencia natural está sustituido por un resto de alanina o de glicina. Asimismo en la presente memoria se proporciona una composición que comprende la variante en un portador, preferentemente un portador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, esta composición está esterilizada. Además en la presente memoria se proporciona un procedimiento para tratar un trastorno caracterizado por la disregulación de los ejes GH/IGF en un mamífero que comprende la administración al mamífero de una cantidad eficaz de la variante descrita anteriormente. Preferentemente el mamífero es humano y preferentemente el trastorno es un trastorno renal, más preferentemente insuficiencia renal. En la presente memoria el péptido se puede administrar solo o junto con un agente activo para el trastorno en concreto que se está tratando, por ejemplo, un agente activo en el riñón tal como BQ-123 para los trastornos renales. Asimismo en la presente memoria se contempla un kit que comprende un recipiente que contiene una composición farmacéutica que contiene el péptido en éste e instrucciones que orientan al usuario a utilizar la composición destinada al tratamiento de un trastorno caracterizado por la disregulación de los ejes GH/IGF en un mamífero. Si el trastorno es un trastorno real, este kit además puede comprender opcionalmente un recipiente que contiene una molécula activa para el riñón.

Description

Variante mutante del factor de crecimiento de tipo insulina (IGF-I).

Antecedentes de la invención Campo de la invención

La presente invención se refiere a la utilización de determinados agonistas de los factores de crecimiento de tipo insulina (IGF) para tratar varios trastornos.

Descripción de los antecedentes y técnica relacionada

Los factores de crecimiento de tipo insulina I y II (IGF-I e IGF-II, respectivamente) median múltiples efectos in vivo, incluyendo la proliferación celular, la diferenciación celular, la inhibición de la muerte celular y la actividad de tipo insulina (estudiada en Clark y Robinson, Cytokine Growth Factor Rev., 7: 65-80 (1998); Jones y Clemmons, Endocr.Rev., 16: 3-34 (1995)). La mayoría de estas respuestas mitógenas y metabólicas se inician mediante la activación del receptor del IGF-I, un heterotetrámero-\alpha_{2}\beta_{2} estrechamente relacionado con el receptor de insulina (McInnes y Sykes, Biopoly., 43: 339-366 (1998); Ullrich et al., EMBO J., 5: 2503-2512 (1986)). Ambas proteínas son miembros de la superfamilia del receptor de la tirosina cinasa y comparten cascadas comunes de señalización intracelular (Jones y Clemmons, supra). Se han aislado receptores híbridos de IGF-insulina, pero su función es desconocida. Los receptores de IGF-I y de insulina se unen a sus ligandos específicos con afinidad nanomolar. IGF-I e insulina pueden inter-reaccionar con sus receptores no afines respectivos, a pesar de una afinidad inferior de 100 a 1000 veces (Jones y Clemmons, supra). La estructura cristalina que describe parte de la fracción extracelular del receptor de IGF-I ha sido descrita recientemente (Garrett et al. Nature, 394: 395-399 (1998)).

Independientemente de la insulina, la actividad y la vida media de IGF-I se modulan mediante seis proteínas de enlace a IGF-I (IGFBP 1 a 6) y quizás además mediante una clase de proteínas relacionadas a distancia (Jones y Clemmons, Supra; Baxter et al., Endocrinology 139: 4036 (1998)). Las IGFBP pueden inhibir o potenciar la actividad de IGF, dependiendo de si son solubles o están asociadas a la membrana celular (Bach y Rechler, Diabetes Reviews, 3:38-61 (1995). Las IGFBP se unen a IGF-I e IGF-II con afinidades y especificidades variables (Jones y Clemmons, supra; Bach y Rechler, supra). Por ejemplo, IGFBP-3 se une a IGF-I y a IGF-II con afinidad similar, mientras que IGFBP-2 e IGFBP-6 se unen a IGF-II con una afinidad mucho mayor que a IGF-I (Bach y Rechler, supra; Oh et al. Endocrinology, 132, 1337-1344 (1993)).

Las IGFBP clásicas tienen un peso molecular que oscila entre 22 y 31 kDa y contienen un total de 16 a 20 cisteínas en sus dominios con terminal amino y carboxi conservados (Bach y Rechler, Supra; Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8: 45-62 (1997); Martin y Baxter, Curr. Op. Endocrinol. Diab., 16-21 (1994)). El dominio central que contiene ambas zonas ricas en cisteína se conserva sólo débilmente y contiene los puntos de escisión de las proteasas específicos para IGFBP (Chernausek et al. J. Biol. Chem., 270: 11377-11382 (1995)); Clemmons, supra; Conover, Prog. Growth Factor Res., 6:301-309 (1995)). Se puede conseguir más regulación de las IGFBP mediante fosforilación y glucosilación (Bach y Rechler, supra; Clemmons, supra). No está disponible ninguna estructura de alta resolución para ningún miembro íntegro de la familia IGFBP. Sin embargo, se han descrito recientemente las estructuras por RMN de los dos fragmentos N-terminales de IGFBP-5 que conservan la actividad de enlace de IGF (Kalus et al., EMBO J., 17: 6558-6572 (1998)).

IGF-I es una proteína de 70 aminoácidos de una sola cadena con gran homología con la proinsulina. A diferencia de otros miembros de la superfamilia de la insulina, la zona C de las IGFs no se separa proteolíticamente tras la traducción. Se han descrito las estructuras de IGF-I por RMN en solución (Cooke et al., Biochemistry, 30: 5484-5491 (1991); Hua et al., J. Mol. Biol., 259:297-313 (1996)), mini-IGF-I (variante modificada genéticamente que carece de la cadena C; DeWolf et al., Protein Science, 5:2193-2202 (1996)) e IGF-II (Terasawa et al., EMBO J., 13:5590-5597 (1994); Torres et al., J. Mol. Biol., 248: 385-401 (1995)). Está generalmente aceptado que se utilizan distintos epítopos en IGF-I para unirse al receptor y a las proteínas de enlace. Se ha demostrado en los modelos animales que los mutantes de IGF inactivos para el receptor pueden desplazar el IGF-I endógeno de las proteínas de enlace y generar de este modo un efecto in vivo del IGF-I puro (Loddick et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95:1894-1898 (1998); Lowman et al., Biochemistry, 37: 8870-8878 (1998)). Mientras los residuos Y24, Y29, Y31 e Y60 están implicados en el enlace de receptor, los mutantes IGF del mismo aún se enlazan con las IGFBP (Bayne et al., J. Biol.. Chem., 265:15648-15652 (1990); Bayne et al., J. Biol.. Chem., 264:11004-11008 (1989); Cascieri et al., Biochemistry, 27:3229-3233 (1988); Lowman et al., supra.

Además, ha descubierto que una variante diseñada (1-27, gly^{4}, 38-70)-hIGF-I, en la que los restos 28 a 37 de la zona C del IGF-I humano se sustituyen por un puente de glicina de cuatro restos, se une a las IGFBP pero no a los receptores de IGF (Bar et al., Endocrinology, 127:3243-3245 (1990)).

Múltiples estudios de mutagénesis han estudiado la caracterización del epítopo de enlace a IGFBP en IGF-I (Bagley et al., Biochem. J., 259:665-671 (1989); Baxter et al., J. Biol.. Chem., 267:60-65 (1992); Bayne et al., J. Biol.. Chem., 263:6233-6239 (1988); Clemmons et al., J. Biol. Chem., 265:12210-12216 (1990); Clemmons et al., Endocrinology, 131:890-895 (1992); Oh et al., supra). En resumen, se observaron que los restos 3 y 4 N-terminales y la zona helicoidal que comprende los restos 8 a 17 eran importantes para el enlace a las IGFBP. Además, se ha identificado un epítopo que afecta a los restos 49 a 51 en el enlace a IGFBP-1, -2 y -5 (Clemmons et al., Endocrinology, supra, 1992). Además, se demostró que una forma truncada natural de IGF-I que carece de los tres primeros aminoácidos N-terminales (denominada des(1-3)-(IGF-I) se une a IGFBP-3 con una afinidad 25 veces inferior (Heding et al., J. Biol. Chem, 271:13948-13952 (1996); patentes U.S. nº 5.077.276; nº 5. 164.370 y nº 5.470.828).

En un intento de caracterizar las contribuciones al enlace de los restos de aminoácidos expuestos en la hélice N-terminal, se construyeron varios mutantes de IGF-I con alanina (Jansson et al., Biochemistry, 36:4108-4117 (1997)). Sin embargo los espectros con dicroismo circular de estas proteínas mutantes presentaban cambios estructurales en comparación con la IGF-I natural, dificultando el asignar claramente las contribuciones al enlace de IGFBP a las cadenas laterales mutadas. En un estudio muy reciente se adoptó un enfoque diferente en el que se probó en IGF-I el epítopo de enlace a IGFBP-1 mediante espectroscopia de RMN heteronuclear (Jansson et al., J. Biol. Chem., 273: 24701-24707 (1998)). Los autores identificaron además los restos R36, R37 y R50 que están implicados operativamente en el enlace a IGFBP-1.

Se han expuesto otras variantes de IGF-I. Por ejemplo, en la bibliografía del documento, WO 96/33216 se describe una variante truncada con 1 a 69 restos de IGF-I auténtico. La patente EP 742.228 expone dos superagonistas de IGF-I con dos cadenas que son derivados de IGF-I natural de una sola cadena con un dominio C abreviado. Los análogos de IGF-I tienen la fórmula BC^{n}, A en la que B es el dominio B de IGF-I o un análogo funcional del mismo. C es el dominio C de IGF-I o un análogo funcional del mismo, n es el número de aminoácidos en el dominio C y es de aproximadamente 6 a aproximadamente 12 y A es el dominio A de IGF-I o un análogo operativo del mismo.

Además, Cascieri et al., Biochemistry, 27:3229-3233 (1988) da a conocer cuatro mutantes de IGF-I, tres de los cuales presentan afinidad reducida al receptor de IGF-I tipo 1. Estos mutantes son: (Phe^{23}, Phe^{24}, Tyr^{25})IGF-I que es equipotente al IGF-I humano en su afinidad a los receptores de IGF de los tipos 1 y 2 y de insulina), (Leu^{24})IGF-I y (Ser^{24})IGF-I (que presentan una afinidad menor que IGF-I por el receptor de IGF-I de tipo 1 humano de la placenta, que el receptor de insulina de la placenta y que el receptor IGF-I tipo 1 de las células de rata y ratón) y el desoctapéptido (Leu^{24})IGF-I (en el que la pérdida de aromaticidad en la posición 24 se combina con la deleción de la zona D con terminal carboxi de hIGF-I, que presenta menor afinidad que (Leu^{24})IGF-I para el receptor de tipo I y mayor afinidad para el receptor de insulina). Estos cuatro mutantes presentan afinidades normales para la proteínas de enlace al suero.

Bayne et al., J. Biol. Chem., 264:11004-11008 (1988) da a conocer tres análogos estructurales de IGF-I: (1-62)IGF-I que carece de la zona D de IGF-I de 8 aminoácidos con terminal carboxilo; (1-27, Gly^{4}, 38-70)IGF-I, en el que los restos 28 a 37 de la zona C de IGF-I están sustituidos por un puente de glicina de cuatro restos; y (1-27, Gly^{4}, 38-62) IGF-I, con una sustitución de glicina en la zona C y una deleción de la zona D. Peterkofsky et al., Endocrinology, 128:1769-1779 (1991) da a conocer los datos que utilizan el Gly^{4} mutante de Bayne et al., Supra, Vol. 264. La patente U.S. nº 5.714.460 se refiere a la utilización de IGF-I o a un compuesto que aumenta el nivel activo de IGF-I para tratar la lesión neural.

Cascieri et al., J. Biol. Chem., 264:2199-2202 (1989) da a conocer tres análogos de IGF-I en los que los restos específicos en la zona A de IGF-I están sustituidos por los restos correspondientes en la cadena A de insulina. Los análogos son: (Ile^{41}, Glu^{45}, Gln^{46}, Thr^{49}, Ser^{50}, Ile^{51}, Ser^{53}, Tyr^{55} y Gln^{58})IGF-I, un mutante de la cadena A en el que el resto 41 cambia de treonina a isoleucina y se sustituyen los restos 42 a 56 de la zona A; (Thr^{49}, Ser^{50}, Ile^{51})IGF-I; y (Tyr^{55}, Gln^{58})IGF-I.

El documento WO 94/04569 da a conocer una molécula de enlace específica, aparte de la IGFBP natural, que es capaz de fijarse a IGF-I y puede aumentar la actividad biológica de IGF-I. El documento WO 98/45427 publicado el 15 de octubre de 1998 y Lowman et al., supra, dan a conocer los agonistas de IGF-I identificados por la exposición al fago. Asimismo, el documento 97/39032 da a conocer unos inhibidores de ligando de las IGFBP y procedimientos para su utilización. Además, la patente U.S. nº 5.891.722 da a conocer anticuerpos con afinidad de enlace para la IGFBP-1 libre y dispositivos y procedimientos para la detección de IGFBP-1 libre y una ruptura en una membrana fetal basada en la presencia de fluido amniótico en una secreción vaginal, indicada por la presencia de IGFBP-1 en la secreción vaginal.

A pesar de todos estos esfuerzos, la vista del epítopo de enlace a IGFBP en IGF-I ha permanecido difusa y con baja resolución. Los estudios anteriores implicaron con mucha frecuencia inserciones de zonas homólogas de insulina en IGF-I o truncamientos de proteínas (p. ej., des(1-3)-IGF-I), no diferenciando entre los efectos atribuidos a los determinantes de plegamiento incorrecto y de enlace real. La combinación de los resultados de estos estudios es más complicada por el hecho de que se utilizaron diferentes técnicas para analizar la formación del complejo de las formas mutantes de IGF con las IGFBP, oscilando desde los análisis del enlace del ligando radiomarcado a los análisis del biodetector.

Está bien demostrado que el sistema GH/IGF/IGFBP está implicado en la regulación anabólica y metabólica y que los defectos en este sistema pueden afectar desfavorablemente el crecimiento, la fisiología y el control glucémico (Jones et al., Endocr. Rev., 16: 3-34 (1995); Davidson, Endocr. Rev., 8:115-131 (1987); Moses, Curr. Opin. Endo. Diab., 4:16-25 (1997)). Los datos más recientes sugieren una función ampliada para las IGFBP en la regulación tanto de los niveles en el plasma como de la bioactividad de GH e IGF-I (Jones et al., supra; Lewitt et al., Endocrinology, 129:2254-2256 (1991); Rosenfield et al., "IGF-I treatment of syndromes of growth hormone insensitivity" en The insuline-like growth factors and their regulatory proteins. Eds. Baxter RC, Gluckman PD, Rosenfield, RG. Excerpta Medica, Amsterdam, 1994), págs. 357-464; Lee et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 216:319-357 (1997); Cox et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 135:1913-1920 (1995); Lewitt et al., Endocrinology, 133:1797-1802 (1993)). Las alteraciones en los niveles de IGFBP pueden conducir a manifestaciones clínicas de exceso o insuficiencia de IGF y contribuir asimismo a la resistencia a la GH (Barreca et al., JCEM, 83: 3534-3541 (1998); Shmueli et al., Hepatology, 24: 127-133 (1996); Murphy et al. Prog. Growth Factor Res., 6:425-432 (1996); Rajkumar et al., Endocrinology, 136: 4039-4034 (1995); Hall et al., Acta Endocrinol. (Copenh.), 118: 321-326 (1988); Ross et al., Clin. Endocrinol., 35:47-54 (1991); Scharf et al., J. Hepatology, 25:689-699 (1996)).

Las dos IGFBP que parecen ser más sensibles a la regulación de la actividad biológica de ambos IGFs y GH son IGFBP-1 e IGFBP-3. IGFBP-3 parece ser la IGFBP más sensible para la regulación de los niveles totales de IGF-I e IGF-II en el plasma. IGFBP-3 es una proteína dependiente de GH y se reduce en los casos de insuficiencia o resistencia a GH (Jones et al., supra; Rosenfield et al., supra; Scharf et al., supra). Se cree generalmente que IGFBP-1 es un inhibidor de la actividad de IGF y aumenta en la mayoría de los casos de estados resistentes a GH tales como diabetes, insuficiencia renal, insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia hepática, nutrición escasa, síndromes de emaciación y la mayoría de estados catabólicos (Lewitt et al. 1993, supra; Barreca et al., supra; Scharf et al., supra; Bereket et al., Endocrinology, 137: 2238-2245 (1996); Crown y Holly, Clin. Nutrit. 14: 321-328 (1995); Underwood y Bakeljauw, J. Int. Med., 234: 571-577 (1993); Thrailkill et al., J. Clin. Endo. Metab., 82(4): 1181-1187 (1997)). La mayoría de estas enfermedades están caracterizadas por el siguiente perfil bioquímico: control de glucosa confuso, inflamación, niveles de IGFBP-1 en exceso, niveles de IGFBP-3 bajos, baja bioactividad de IGF y niveles de GH en exceso (Jones et al., supra; Barreca et al., supra; Shmueli et al., supra; Murphy et al., supra; Rajkumar et al., supra; Hall et al., supra; Ross et al., supra; Bereket et al., supra; Crown y Holly, supra; Bereket et al., Clinical Endocrinology, 45(3): 321-326 (1996); Batch et al., J. Clin. Endo. Metab., 73: 964-968 (1991); Powell et al., The South-west Pediatric Nephrology Study Group, Kidney Int., 51: 1970-1979 (1997)).

Los glucocorticoides se han asociado a una disminución en la síntesis de proteínas y a un aumento en el catabolismo de proteínas (Simmons et al., J. Clin. Invest., 73: 412-420 (1984)) y a un aumento de excreción de nitrógeno en la orina (Sapir et al., Clin. Sci. Mol. Med., 53: 215-220 (1977). Estos efectos pueden ser mediados en parte por una disminución en la secreción de la hormona de crecimiento (Trainer et al., J. Endocrinol., 134: 513-517 (1991)) o por acción directa de los glucocorticoides en el nivel del tejido (Baron et al., Am. J. Physiol., 263: E489-E492 (1992)), produciendo interferencias con la producción local de IGF-I e IGFBP (McCarthy et al., Endocrinology, 126: 1569-1575 (1990); Lee et al., supra) y antagonismo de la acción de insulina (Horber et al., Diabetes, 40: 141-149 (1991)). Los estudios anteriores en ratas han demostrado que la acción catalítica de los análogos de glucocorticoides, tal como la dexametasona, puede ser contrarrestada por el IGF-I recombinante humano y sus análogos (Tomas et al., Biochem. J., 282: 91-97 (1992)). Además, se ha demostrado que la insulina mejoran el catabolismo de las proteínas (Woolfson et al., N. Eng. J. Med., 300: 14-17 (1979)).

Se han dado a conocer asimismo las terapias de combinación. Por ejemplo, Fuller et al., Biochem. Soc. Trans., 19: 277S (1991) describe la utilización de insulina e IGF para estimular la síntesis de proteínas cardíacas. Umpleby et al., Europ. J. Clin. Invest., 24: 337-344 (1994) da a conocer el tratamiento de perros en ayunas durante la noche con insulina e IGF para determinar los efectos sobre el metabolismo de las proteínas. Además, la patente U.S. nº 5.994.303 da a conocer la utilización de una combinación de insulina e IGF-I para contrarrestar una disminución en el balance de nitrógeno y en la síntesis de proteínas.

Con respecto a la insuficiencia renal, se informa que IGF-I ejerce varias acciones en el riñón (Hammerman y Miller, Am. J. Physiol., 265: F1-F14 (1993)). Se ha reconocido durante décadas que el aumento del tamaño del riñón observado en los pacientes con acromegalia va acompañado de un incremento significativo de la tasa de filtración glomerular (O'Shea y Layish, J. Am. Soc. Neohrol., 3: 157-161 (1992)). La patente U.S. nº 5.273.961 da a conocer un procedimiento de tratamiento profiláctico de mamíferos en situación de riesgo de insuficiencia renal aguda. La infusión del péptido en seres humanos con función renal normal aumenta la tasa de filtración glomerular y la circulación renal de plasma (Guler et al., Acta Endocrinol., 121: 101-106 (1989); Guler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 2868-2872 (1989); Hirschberg et al., Kidney Int., 43: 387-397 (1993); patente U.S. nº 5.106.832). Además, los seres humanos con función renal moderadamente reducida responden a corto plazo (cuatro días) a la administración de IGF-I aumentando sus tasas de filtración glomerular y de circulación del plasma renal. Así pues, IGF-I es un agente terapéutico potencial en el marco de la insuficiencia renal crónica (O'Shea et al., Am. J. Physiol., 264: F917-F922 (1993)).

La utilización de IGF-I o de sus análogos para tratar a los mamíferos que padecen trastornos renales tales como la nefropatía policística e indicios relacionados, displasias renales y/o hipoplasias renales se describen en la patente U.S. nº 5.985.830. Esta patente informa además que IGF-I es un agente eficaz para aumentar el desarrollo glomerular y del riñón en los mamíferos que padecen lesión crónica de órganos.

Además, se puede aumentar la función renal durante un periodo de días por administración de IGF-I en el marco de la insuficiencia renal crónica terminal. Esto es importante, ya que la insuficiencia renal crónica terminal es una enfermedad que únicamente se puede tratar con diálisis o trasplante y la incidencia de la misma está aumentando rápidamente. Los diabéticos y los ancianos tienden a padecer esta enfermedad. Aproximadamente el sesenta por ciento de los pacientes con insuficiencia renal crónica terminal están en hemodiálisis, aproximadamente el diez por ciento están en diálisis peritoneal y aproximadamente el treinta por ciento restante reciben un trasplante. La terapia de diálisis se inicia en más de 50.000 pacientes cada año en los Estados Unidos. Un 25% adicional de pacientes que han alcanzado la insuficiencia renal terminal se les deniega el acceso a la diálisis cada año. El coste del cuidado de estos pacientes en diálisis es por término medio actualmente más de 200 millones de dólares al mes. Además, los pacientes presentan una forma de vida discapacitada en la diálisis. A pesar del hecho de que IGF-I puede aumentar la función renal en aquellos que padecen insuficiencia renal crónica terminal, los incrementos de la tasa de filtración glomerular y de circulación del plasma renal producidos por IGF-I a corto plazo no persisten durante la administración a largo plazo y la incidencia de los efectos secundarios es elevada (Miller et al., Kidney International, 46: 201-207 (1994)).

Las dinámicas de interacción de IGF-I con los tejidos sensibles son complejas y comprendidas de manera incompleta. La actividad biológica de la circulación de IGF-I está regulada por los niveles de las IGFBP en el plasma, que tanto aumentan como inhiben las acciones de IGF-I (Cohick y Clemmons; Annu. Rev. Physiol., 55: 131-153 (1993); Kupfer et al., J. Clin. Invest., 91: 391-396 (1993)). Además, las IGFBP presentes en los tejidos regulan la interacción del IGF-I circulante con su receptor. La densidad del receptor del IGF-I en el tejido se altera mediante cambios en los niveles de IGF-I circulante. En el riñón, los numerosos receptores de IGF-I están inversamente relacionados con los niveles de IGF-I circulante (Hise et al., Clin. Sci., 83: 223-239 (1991)).

Es conocido que en algunas circunstancias los niveles elevados de IGF-I están relacionados o son causa directa de cambios a largo plazo en la función renal. Por ejemplo, los aumentos de insulina y las depuraciones por PAH que acompañan a las elevaciones de GH e IGF-I en circulación en pacientes con acromegalia se mantienen durante años (Ikkos et al., Acta Endocrinol., 21: 226-236 (1956)). Un aumento en la eliminación de creatinina se produjo en los 12 primeros días de administración de IGF-I a un enano de Laron insensible a GH. El aumento fue progresivo durante los 59 días siguientes (Walker et al., J. Pediatr., 121: 641-646 (1992)).

GH estimula la síntesis de IGFBP-3 en el hígado (Hammerman y Miller, supra; Cohick y Clemmons, supra; Kupfer et al., supra). Se cree que la reducción de los niveles de GH en circulación resultante de la inhibición por IGF-I de la liberación de GH por la pituitaria produce la disminución de IGFBP-3 en circulación en seres humanos a los que se ha administrado IGF-I. Debido a su insensibilidad a GH, los niveles de IGFBP-3 son bajos y se aumentan mediante IGF-I en enanos de Laron (Kenety et al., Acta Endocrinol., 128: 144-149 (1993)). Esta u otra diferencia en el sistema efector de IGF-I podría explicar la ausencia de refractariedad de IGF-I en estos individuos.

Walker et al. Supra, observó que IGF-I aumentaba la excreción urinaria de calcio o el volumen urinario. Miller et al., supra, no apreció dicho efecto. IGF-I aumenta asimismo el transporte de ortofosfato a través de la membrana del límite del cepillo tubular próximo (Quigley y Baum, J. Clin. Invest., 88: 368-374 (1991)). Los pacientes con acromegalia de larga duración presentaban hipertrofia renal apreciable y presentaban tasa de filtración glomerular supranormales, lo que sugiere que la hiperfiltración que acompaña las elevaciones de larga duración de GH e IGF-I en circulación en seres humanos no produce lesiones en el riñón (Ikkos et al., Supra; Hoogenberg et al., Acta Endocrinol., 129: 151-157 (1993)).

La administración intermitente de IGF-I para tratar los trastornos crónicos tal como la insuficiencia renal crónica se da a conocer en las patentes U.S. nº 5.565.428 y nº 5.741.776.

En las condiciones clínicas, los niveles de IGF-I en circulación son normales en la insuficiencia renal crónica (CRF) pre-terminal y disminuyeron ligeramente en la nefropatía terminal (Powell et al. Am. J. Kidney Dis., 10: 287-292 (1987); Blum et al., Pediatr. Nephrol., 5: 539-544 (1991); Tönshoff et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 80: 2684-2691 (1995); Tönshoff et al., Pediatr. Nephrol., 5: 269-274 (1996)). En cambio, IGFBP-1, IGFBP-2 y fragmentos de IGFBP-3 de bajo peso molecular aumentan en el suero de la insuficiencia renal crónica en relación con el grado de disfunción renal (Lee et al., Pediatr. Res., 26: 308-315 (1989); Liu et al., J. Clin. Endocrinol. Metab., 70: 620-628 (1990); Powell et al., Pediatr. Res., 33: 136-143 (1993)). La acción biológica de IGF-I esta mediada por el receptor de IGF tipo I. Debido a que las IGFBP se unen a las IGFs con afinidades similares o mayores a las del receptor de IGF tipo I, el exceso de IGFBP insaturadas de alta afinidad en el suero de CRF tiene capacidad para inhibir la acción de IGF en tejidos diana compitiendo con el receptor de IGF tipo I para el enlace de IGF (Tönshoff et al., Prog. Growth Factor Res., 6: 481-491 (1996)). De hecho, se ha identificado aumento de niveles de IGFBP en CRF como inhibidores de bioactividad de IGF tanto in vitro (Blum et al., supra) como in vivo (Tönshoff et al., supra, 1995).

Se conoce poco acerca de las tasas de producción de IGF-I y de las IGFBP en CRF. Se ha sugerido que la constelación de IGFBP aumentada sobre los IGFs normales indica una tasa de secreción de IGF-I reducida en CRF, porque es de esperar que en condiciones normales un aumento de capacidad de enlace de IGF se sature inmediatamente por los IGFs producidos en el hígado (Blum, Acta Paediatr. Scand. [Supl.] 379: 24-31 (1991)). El análisis previo de los niveles de IGFBP en el plasma en el marco de la CRF clínica ha sugerido asimismo que un aumento de la tasa de producción de IGFBP-2 puede contribuir a niveles de IGFBP elevados en el plasma de CRF (Tönshoff et al., Supra, 1995). Estas dos hipótesis fueron probadas analizando la expresión génica del IGF-I hepático y los niveles en el plasma de IGFBP-1, -2, -3 y -4 en un modelo de uremia experimental en rata y analizando la expresión génica de IGFBP-1, -2 y -4 en el hígado y en el riñón (Tönshoff et al., Endocrinology, 138: 938-946 (1997)). Los autores observaron que IGF-1 hepático disminuía, la IGFBP-1 aumentaba y que la expresión génica de IGFBP-2 se producía en la uremia experimental.

Para los estudios completos del efecto de IGF-I en el riñón, véase, p. ej., (Hammerman y Miller, Am. J. Physiol., 265: F1-F14 (1993) y Hammerman y Miller, J. Am. Soc. Nephrol., 5: 1-11 (1994).

El tratamiento de pacientes con disregulación de los ejes GH/IGF, incluyendo los trastornos renales, con IGF-I puede no tener éxito debido a la distribución anormal de las IGFBP, principalmente los niveles elevados de IGFBP-1. Por consiguiente, un mutante de IGF-I con una afinidad reducida a IGFBP-1 sin pérdida de capacidad para unirse a IGFBP-3 podría ser una terapia única y eficaz para las enfermedades clínicas caracterizadas por dicha disregulación.

Sumario de la invención

Por consiguiente, en una forma de realización, la invención proporciona una variante de IGF-I en la que el resto de aminoácido en la posición 49 del IGF-I humano con secuencia natural está sustituido por un resto de alanina o de glicina.

Asimismo en la presente memoria se proporciona una composición que comprende la variante en un portador, preferentemente un portador farmacéuticamente aceptable. Preferentemente, esta composición está esterilizada.

Además en la presente memoria se proporciona un procedimiento para tratar un trastorno caracterizado por la disregulación de los ejes GH/IGF en un mamífero que comprende la administración al mamífero de una cantidad eficaz de la variante descrita anteriormente. Preferentemente el mamífero es humano y preferentemente el trastorno es un trastorno renal, más preferentemente insuficiencia renal.

En la presente memoria el péptido se puede administrar solo o junto con un agente activo para el trastorno en concreto que se está tratando, por ejemplo, un agente activo en el riñón tal como BQ-123 para los trastornos renales.

Asimismo en la presente memoria se contempla un kit que comprende un recipiente que contiene una composición farmacéutica que contiene el péptido en éste e instrucciones que orientan al usuario a utilizar la composición destinada al tratamiento de un trastorno caracterizado por la disregulación de los ejes GH/IGF en un mamífero. Si el trastorno es un trastorno real, este kit además puede comprender opcionalmente un recipiente que contiene una molécula activa para el riñón.

Para la identificación de los péptidos en la presente memoria, el IGF-I humano se presentó en forma monovalente en partículas filamentosas de fagómido (patentes U.S. nº 5.750.373 y nº 5.821.047) y se realizó una mutagénesis de exploración con alanina completa del mismo (Cunningham y Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989); patente U.S. nº 5.834.250) por exposición al fago ("turbo-ala scan") (Cunningham et al., EMBO J., 13: 2508-2515 (1994); Lowman, Methods Mol. Biol., 87: 249-264 (1998)). Se utilizaron fagómidos con IGF mutante para cartografiar los determinantes del enlace en IGF-I para IGFBP-1 e IGFBP-3. La exploración con alanina pone de manifiesto determinantes con especificidad para estas proteínas de enlace, de manera que se generan variantes de IGF específicos de la proteína de enlace que se unen específicamente a IGFBP-1 o IGFBP-3 para modular su vida media de eliminación, mejorar la estabilidad proteolítica o alterar su distribución del tejido in vivo. Estos mutantes deberían ser también útiles para cartografiar el punto de enlace operativo para el receptor de IGF, cuya estructura cristalina se publicó recientemente (Garret et al. supra). Además, puede resultar interesante cartografiar los epítopos de varios anticuerpos de enlace a IGF o para otros péptidos o proteínas que se unen a IGF-I.

Breve descripción de los dibujos

Las Figuras 1A y 1B presentan un ELISA del fago de la variante, IGF-I de GIS-A70V, que se une a IGFBP-1 (Fig. 1A) y a IGFBP-3 (Fig. 1B). Se incubaron placas de microvaloración con 1 \mug/ml de IGFBP-1 (Fig. 1A) o IGFBP-3 (Fig. 1B) con partículas de fago que se exponen a GIS-A70V en presencia de las cantidades indicadas de proteína soluble competitiva, IGFBP-1 (Fig. 1A) o IGFBP-3\cdot (Fig. 1B). El nivel inhibidor máximo de la mitad (IC_{50}) del competidor, es decir el nivel inhibidor de competidor que produjo el enlace máximo de la mitad de los fagómidos en este particular experimento, está indicada por la IGFBP respectiva.

La Figura 2 presenta la pérdida o ganancia de afinidad de IGFBP a los mutantes de IGF-1 analizada por el ELISA del fago. Los valores relativos de IC_{50} (IC_{50mut}/ IC_{50 GIS-A70V}) de cada mutante de IGF-I con alanina (cambios de afinidad de cada mutante para las proteínas de enlace con respecto a GIS-A70V de IGF-I) se presentan para IGFBP-1 (barras negras) e IGFBP)-3 (barras blancas). Los datos se toman de la Tabla 1 más adelante. Los valores relativos de IC_{50} <1 indican ganancia o afinidad; los valores >1 indican pérdida de afinidad. El asterisco indica que estas variantes particulares no fueron expuestas al fago, como se interpreta por el enlace al anticuerpo.

Las Figuras 3A y 3B presentan la especificidad de enlace de la variante F49A de IGF-I expuesta en el fago a IGFBP-1 y -3, respectivamente, en ELISA competitivo del fago. Se fijaron partículas de fagómido que se exponen a F49A (cuadrados) a placas recubiertas con IGFBP-3 en presencia de las cantidades indicadas de IGFBP-1 (Fig. 3A) o IGFBP-3 (Fig. 3B) solubles. Se realizó el mismo experimento en paralelo con la variante GIS-A70V (círculos) de IGF-I tipo natural que presenta el fago. Véanse las Tablas I y II más adelante para los valores absolutos de IC_{50}: Los puntos de datos son la media \pm desviación estándar, n=2. Se recubrieron placas inmunosorbentes con 1 \mug/ml de IGFBP-3 y se realizó el ELISA tal como se describe en los Ejemplos más adelante utilizando fago de IGF-1 natural (WT, círculos) y fago F49A de IGF (F49A, cuadrados) en paralelo. Los experimentos se realizaron por duplicado y los puntos de datos se presentan como media \pm desviación estándar.

La Figura 4 da a conocer una alineación de la secuencia del IGF-I humano con secuencia natural (denominado wtlGF) (SEC ID nº: 1), de la proinsulina humana con secuencia natural (denominada proinsulina) (SEC ID nº: 2) y de la insulina humana con secuencia natural (denominada insulina (cadena B) seguida de insulina (cadena A) (SEC ID nº: 3). Los asteriscos y los puntos indican la identidad de secuencia y la similitud de secuencia, respectivamente, en las posiciones de aminoácidos indicadas entre las tres secuencias.

Las Figuras 5A a 5D presentan un análisis con biodetector del enlace de IGFBP a las variantes inmovilizadas de IGF-I. Se presentan los detectorgramos para IGFBP-1 (Figs. 5A, 5C) o IGFBP-3 (Figs. 5B, 5D) que se fijan a IGF-I natural inmovilizado (Figs. 5A, 5B) o la variante F49A de IGF (Figs. 5C, 5D). Los niveles de ligando en cada experimento fueron 1 \muM, 500 nM y 250 nM. Véase la Tabla II para los parámetros cinéticos.

Las Figuras 6A a 6B presentan un modelo de los epítopos de enlace operativos para IGFBP-1 e IGFBP-3, respectivamente, en la superficie de IGF-I. Las cadenas laterales de aminoácidos se clasificaron según su contribución relativa a la energía de enlace (Tabla I) y están coloreadas de la forma siguiente: sin efecto (gris); 2 a 5 veces menos de afinidad aparente (amarillo); 5 a 10 veces (naranja); 10 a 100 veces (rojo brillante); >100 veces (rojo oscuro). Si estaban disponibles, se utilizaban las cifras de los experimentos por ELISA con fagos de la Tabla I, más adelante. Se utilizaron datos de BIACORE^{TM} en lugar de las variantes V11A, R36A y P39A (Tabla II). Se representó la estructura por RMN de IGF-I (Cooke et al. supra) utilizando el programa Insight II^{TM} (MSI, San Diego, CA). El epítopo de enlace para IGFBP-1 (Fig. 6A) está situado en la cara "superior" e "inferior" de la hélice N-terminal (restos 8 a 17), conectado mediante el resto F49 energéticamente importante. Para IGFBP-3 (Fig. 6B), las cadenas laterales individuales de IGF-I contribuyen muy poco a la energía de enlace. El epítopo de enlace se ha desplazado del terminal N y nuevamente incluye G22, F23 e Y24.

La Figura 7 presenta la cantidad de IGFBP-1 fijada, determinada en un experimento de enlace BIACORE^{TM} competitivo, representado frente al nivel de la variante de IGF para E3A/F49A (cuadrados) y F49A (círculos).

Las Figuras 8A y 8B presentan, respectivamente, la actividad calculada de IGF-I en unidades nM para varias variantes de IGF-I a los niveles de las variantes de 13 nM (alta) y 1,3 nM (baja) utilizando análisis de densidad óptica KIRA de IGF-I. Se comparó la señal obtenida para cada variante de IGF con la de una serie de dilución patrón de IGF-I natural y se publicó en función de un nivel aparente de IGF-I correspondiente a la actividad observada.

Las Figuras 9A y 9B presentan las curvas de activación del receptor para F49A de IGF-I (Fig. 9A) y E3A/F49A (Fig. 9B) así como para IGF-I natural, medidas utilizando diluciones en serie en análisis KIRA. Las variantes están representadas por cuadrados y el IGF-I natural esta representado por círculos.

Las Figuras 10A y 10B presentan una evaluación de las propiedades farmacológicas preliminares de F49A y E3A/F49A de IGF-I, radiomarcados y administrados por vía intravenosa a ratas. La Figura 10A presenta un ciclo de tiempo del ritmo al que se eliminan ambas moléculas de la sangre de los animales, en el que los cuadrados representan IGF-I natural, los círculos representan E3A/F49A de IGF-I y los rombos representan F49A de IGF-I. La Figura 10B presenta la proporción tejido a sangre para estas dos variantes de IGF en diferentes órganos, a saber, riñón, hígado, bazo, corazón y páncreas, a los 5, 15 y 30 minutos, en la que la barras llenas representan a IGF-I natural, las barras de puntos representan IGF-I de E3A/F49A y las barras con franjas representan IGF-I de F49A.

La Figura 11 presenta los espectros con dicroismo circular de IGF-I natural (círculos), IGF-I de F49A (cuadrados) y IGF-I de E3A/F49A (rombos).

Descripción de las formas de realización preferidas A. Definiciones

Tal como se utiliza en la presente memoria, "mamífero" para los fines del tratamiento se refiere a cualquier animal clasificado como mamífero, incluyendo al hombre y a los animales domésticos y de granja y a los animales de zoológico, para deportes o domesticados, tales como perros, caballos, gatos, ovejas, cerdos, vacas, etc. El mamífero preferido en la presente memoria es el hombre. La expresión "no adulto" se refiere a los mamíferos que están en edad perinatal (tales como los lactantes de bajo peso al nacer) hasta la edad de la pubertad, siendo estos últimos los que todavía no han alcanzado el desarrollo potencial completo.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "IGF" se refiere al factor-I de crecimiento de tipo insulina natural y al factor-II de crecimiento de tipo insulina natural así como a las variantes de los mismos, tal como la variante IGF cerebral, conocida de otro modo como des(1-3)IGF-I.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "IGF-I" se refiere al factor-I de crecimiento de tipo insulina de algunas especies, incluyendo la bovina, ovina, porcina, equina y humana, preferentemente la humana, y refiriéndose a la administración exógena, de cualquier origen, ya sea natural, sintético o recombinante. El IGF-I humano con "secuencia natural", cuya secuencia se presenta en la Figura 4 (SEC ID nº: 1), se prepara, p. ej., por el procedimiento descrito en la patente EP 230.869 publicado el 5 de agosto de 1987; patente EP 128.733 publicada el 19 de diciembre de 1984; o la patente EP 288.451 publicada el 26 de octubre de 1988. Más preferentemente, este IGF-I con secuencia natural se produce de manera recombinante y está disponible en Genentech, Inc., South San Francisco, CA para las investigaciones clínicas.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "IGF-II" se refiere al factor-II de crecimiento de tipo insulina de algunas especies, incluyendo la bovina, ovina, porcina, equina y humana, preferentemente la humana, y refiriéndose a la administración exógena, de cualquier origen, ya sea natural, sintético o recombinante. Se puede preparar por el procedimiento descrito, p. ej., en la patente EP 128.733.

Una "IGFBP" o una "proteína de enlace a IGF" se refiere a una proteína o polipéptido normalmente asociado a, o fijado o acomplejado con, IGF-I o IGF-II, esté o no en circulación (es decir, en el suero o en el tejido). Dichas proteínas de enlace no incluyen los receptores. Esta definición incluye IGFBP-1, IGFBP-2, IGFBP-3, IGFBP-4, IGFBP-5, IGFBP-6, Mac 25 (IGFBP-7) y el factor estimulante de prostaciclina (PSF) o la molécula específica de las células endoteliales (ESM-1), así como otras proteínas con gran homología con las IGFBP. Mac 25 está descrita, por ejemplo, en Swisshelm et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 4472-4476 (1995) y Oh et al., J. Biol. Chem., 271: 30322-30325 (1996). PSF se describe en Yamauchi et al., Biochemical Journal, 303: 591-598 (1994). ESM-1 está descrito en Lassalle et al., J. Biol. Chem., 271: 20458-20464 (1996). Para otras IGFBP identificadas, véase, p. ej., la patente EP nº 375.438 publicada el 27 de junio de 1990; la patente EP nº 369.493 publicada el 23 de mayo de 1990; la patente WO 89/09268 publicada el 5 de octubre de 1989; Wood et al., Molecular Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988); Brinkman et al., The EMBO J., 7: 2417-2423 (1988); Lee et al., Mol. Endocrinol., 2: 404-411 (1988); Brewer et al., BBRC, 152: 1289-1297 (1988); la patente EP nº 294.021 publicada el 7 de diciembre de 1988; Baxter et al., BBRC, 147: 408-415 (1987); Leung et al., Nature, 330: 537-543 (1987); Martin et al., J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986); Baxter et al., Comp. Biochem. Physiol., 91B: 229-235 (1988); el documento WO 89/08667 publicado el 21 de septiembre de 1989; el documento WO 89/09792 publicado el 19 de octubre de 1989; y Binkert et al. EMBO J., 8: 2497-2502 (1989).

La expresión "fluido corporal" se refiere a una muestra biológica de líquido de un mamífero, preferentemente de un ser humano. Dichos fluidos incluyen los fluidos acuosos tales como suero, plasma, fluido linfático, fluido sinovial, fluido folicular, fluido seminal, fluido amniótico, leche, sangre completa, orina, fluido cerebroespinal, saliva, esputo, lágrimas, sudor, mocos, medio de cultivo del tejido, extractos de tejido y extractos celulares.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "receptor de IGF humano" se refiere a cualquier receptor para un IGF observado en el hombre e incluye los receptores de IGF tipo 1 y tipo 2 en el hombre al que se unen ambos IGF-I e IGF-II humanos, tal como el receptor de IGF-I tipo I de la placenta, etc.

Los "péptidos" incluyen una variante agonista de IGF-I/IGF-I que tiene por lo menos dos aminoácidos e incluyen polipéptidos que tienen por lo menos aproximadamente 50 aminoácidos. La definición incluye derivados de péptidos, sus sales o sus isómeros ópticos.

Un "trastorno caracterizado por la disregulación de los ejes GH/IGF" se refiere a una enfermedad en un mamífero que implica, o produce, anomalías en el sistema GH/IGF/IGFBP, que está implicada en la regulación de la homeostasis anabólica y catabólica. Dichos trastornos están caracterizados por anomalías en el crecimiento, la fisiología y/o el control glucémico y aquellos que presentan manifestaciones clínicas de exceso o insuficiencia de IGF y/o resistencia a y/o insuficiencia de GH, manifestándose esta última por niveles reducidos de IGFBP-3 y/o aumento de niveles de IGFBP-1. Los ejemplos incluyen trastornos tales como trastornos hiperglucémicos, trastornos renales, insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia hepática, nutrición escasa, síndrome de Tumer, síndrome de Down, síndromes de emaciación que implica una disminución de la síntesis de proteínas, tales como la emaciación del SIDA y los estados catabólicos caracterizados por el aumento de los niveles de IGFBP (tales como niveles de IGFBP-I) en comparación con dichos niveles en un mamífero sin dicho trastorno, como por ejemplo una enfermedad crítica, un trastorno que implica una disminución en el balance del nitrógeno y el catabolismo de las proteínas por exceso de glucocorticoides. Un ejemplo de éstos con un exceso de glucocorticoides es el de un paciente para el que se desea un mantenimiento o crecimiento sustancialmente normales tal como en los mamíferos neonatos y prepuberales expuestos a la terapia de hormonas esteroides a alta dosis, tal como los niños con síndrome nefrótico o atrofia vellosa total. Están implicadas más sinergias, por ejemplo, en las que se tratan el catabolismo y un trastorno renal porque el tratamiento minimiza la pérdida de peso que puede acompañar con frecuencia a la aparición de insuficiencias renales o favorecer el aumento de crecimiento del paciente que está siendo tratado para otro trastorno, de particular importancia cuando el paciente no es un adulto.

La mayoría de estas enfermedades están caracterizadas por el perfil bioquímico siguiente: control desordenado de glucosa, inflamación, niveles de IGFBP-1 en exceso, niveles bajos de IGFBP-3, baja bioactividad de IGF y niveles de GH en exceso. La determinación de dichas enfermedades se puede efectuar por los medios clínicos habituales, por ejemplo, ELISA para los niveles de moléculas, química clínica, RIA o bioanálisis (véase, por ejemplo, Jones et al., supra; Davidson, supra; Moses, et al., supra; Lewitt et al., 1991 supra; Rosenfield et al., supra; Lee et al., 1997, supra; Cox et al., supra; Lewitt et al., 1993, supra; Barreca et al., supra; Shmueli et al., supra; Murphy et al., supra; Rajkumar et al., supra; Hall et al., supra; Ross et al., supra; Scharf et al., supra; Bereket et al., Endocrinology, supra; Crown y Holly, supra; Underwood y Backeljauw, supra; Thrailkill et al., supra; Bereket et al., Clinical Endocrinology, supra; Batch et al., supra y Powell et al., 1997, supra).

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "trastornos hiperglucémicos" se refiere a todas las formas de diabetes, tales como la diabetes tipo I y tipo II, así como a la hiperinsulinemia e hiperlipidemia, p. ej., individuos obesos y diabetes resistente a la insulina, tales como el síndrome de Mendelhall, el síndrome de Werner, sonambulismo, diabetes lipoatrófica y otras lipoatrofias. El trastorno hiperglucémico preferido es la diabetes, especialmente la diabetes tipo I y tipo II. La propia "diabetes" se refiere a una enfermedad evolutiva del metabolismo de los carbohidratos que implica la producción o utilización inadecuada de la insulina y se caracteriza por hiperglucemia y glucosuria.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "agente hipoglucémico" se refiere a secretágogos, preferentemente a los agentes orales, que producen la secreción de insulina por el páncreas e insulina. Los agentes hipoglucémicos orales más preferidos en la presente memoria para utilización humana son la insulina y la clase sulfonilurea. Los ejemplos comprenden gliburida, glipizida y gliclazida. Además, los agentes que aumentan su sensibilidad a la insulina, tales como las biguanidas, están comprendidos en esta definición y también son preferidos.

Tal como se utiliza en la presente memoria, "insulina" se refiere a cualquier tipo de insulina de algunas especies, incluyendo la bovina, ovina, porcina, equina y preferentemente humana, y de cualquier origen, ya sea natural, sintético o recombinante. En la presente memoria son adecuados todos los fármacos de insulina descritos, por ejemplo, en Diabetes Mellitus - Theory and Practice, cuarta edición, Harold Rifkin, MD, Ed. (Elsevier, New York, 1990), Capítulo 29 y U.S. Pharmacist, 18 (Supl. de Nov.) págs. 38-40 (1993). Se incluyen todas las diversas formas de insulina en el mercado, tales como las mencionadas en Jens Brange, Galenics of Insuline, The Physico-chemical and Pharmaceutical Aspects of Insulin and Insulin Preparations (Springer-Verlag, New York, 1987), páginas 17-40. Éstas incluyen la insulina Regular, la insulina NPH (Neutral Protamine Hagedom), denominada también insulina de isofano, 70/30 de insulina, compuesta de 70% de insulina NPH y 30% de insulina Regular, insulina Semilente, insulina Ultralente, insulina Lente y la insulina Humalog. En la presente memoria para utilización animal se prefiere esta forma de insulina de la especie en concreto que se está tratando, tal como la insulina humana para el tratamiento del hombre.

Un "trastorno renal" se define en la presente memoria como la insuficiencia renal asociada a los antecedentes de la insuficiencia renal aguda o crónica que opcionalmente puede requerir diálisis, incluyendo pero sin limitarse a, por ejemplo, los trastornos renales crónicos, tales como la insuficiencia renal crónica, la insuficiencia renal crónica terminal, la glomerulonefritis primaria y secundaria, el síndrome nefrítico, la nefritis intersticial, la pielonefritis, glomerulosclerosis, p. ej., Kimmelstiel-Wilson en pacientes diabéticos y la insuficiencia renal tras el trasplante de riñón; así como la insuficiencia renal aguda y la necrosis tubular aguda debida a la isquemia; la disfunción renal asociada a la diabetes o a las nefropatías autoinmunitarias; reacciones desfavorables a los fármacos nefrotóxicos o renotóxicos inmunosupresores administrados para el trasplante de órganos; los episodios de rechazo agudo en pacientes tras el trasplante de riñón; la nefropatía policística e indicios relacionados; las displasias renales; las hipoplasias renales; las anomalías renales congénitas; otros trastornos en los que está indicado el aumento de desarrollo glomerular tales como la columna vertebral bífida, riñón único, retardo del desarrollo interuterino, síndromes pediátricos con anomalías del crecimiento (p. ej., síndrome de Turner y síndrome de Down) y similares; trastornos en los que está indicado el aumento del desarrollo del riñón tales como los que padecen alteración orgánica crónica, los que se han sometido al trasplante de un riñón pequeño (en el que se extirpa el crecimiento ulterior del órgano), pacientes que padecen de intoxicación del túbulo renal, pacientes que se han recibido quimioterapia (p. ej., pacientes de cáncer) y similares; y observaciones físicas tales como uremia, proteinuria y anuria. Dicho trastorno se beneficiaría necesariamente del tratamiento con IGF-I, y es preferentemente la insuficiencia renal crónica pre-terminal o terminal o la insuficiencia renal crónica.

Tal como se utiliza en la presente memoria, una "molécula activa para el riñón" es la que favorece la reabsorción y la retención de electrolitos o actúa de otro modo para tratar un trastorno renal. Se proporcionan ejemplos más adelante.

Tal como se utiliza en la presente memoria el término "tratamiento" se refiere tanto al tratamiento terapéutico como al profiláctico o a las medidas preventivas. Los que necesitan tratamiento incluyen los que ya padecen el trastorno así como los que son propensos a padecer el trastorno o se les ha diagnosticado el trastorno o a los que se les debe prevenir del trastorno. Tratamiento o administración seguido se refiere al tratamiento por lo menos diario sin interrupción del tratamiento durante uno o más días. Tratamiento o administración intermitente, o tratamiento o administración de modo intermitente, se refiere al tratamiento que no es seguido, sino de naturaleza más bien cíclica. En la presente memoria el régimen de tratamiento puede ser seguido o intermitente.

Tal como se utiliza en la presente memoria, IGF "activo" o "biológicamente activo" en el contexto del cambio de niveles de suero y tejido del IGF endógeno se refiere al IGF que se une a su receptor o sino da lugar a que se produzca una actividad biológica, tales como las actividades biológicas del IGF endógeno o exógeno referidas en la presente memoria.

B. Modos de poner en práctica la invención

La invención en la presente memoria se refiere, en un aspecto, a una variante de IGF-I en la que el aminoácido de IGF-I humano natural en la posición 49 del IGF-I humano con secuencia natural se sustituye por un resto de alanina o de glicina. Preferentemente, el aminoácido en cuestión se sustituye por un resto de alanina.

Los péptidos de la presente invención se pueden preparar por síntesis química o empleando tecnología recombinante. Estos procedimientos son conocidos en la técnica. Para péptidos cortos (p. ej., menos de 50 restos) o los que contienen aminoácidos no naturales o raros tales como D-Tyr, ornitina, ácido aminoadípico y similares, es preferible la síntesis química, especialmente la síntesis en fase sólida. Los procedimientos recombinantes se prefieren para los polipéptidos más largos. Cuando se seleccionan procedimientos recombinantes, se puede construir un gen sintético de novo o puede mutarse un gen natural, por ejemplo, mediante mutagénesis en casete. A continuación se indican a título de ejemplo los procedimientos recombinantes generales.

A partir de un IGF purificado y de su secuencia de aminoácidos, por ejemplo, se puede producir una variante de IGF que es un mutante de peptidilo de una molécula precursora de IGF utilizando técnicas con ADN recombinante. Estas técnicas contemplan, de forma simplificada, coger el gen, natural o sintético, codificar el péptido; insertarlo en un vector apropiado, insertar el vector en una célula anfitriona apropiada; cultivar la célula anfitriona apropiada para originar la expresión del gen; y recuperar o aislar el péptido producido de este modo. Preferentemente, el péptido recuperado se purifica a continuación en un grado adecuado.

Algo más particularmente, la secuencia de ADN que codifica una variante peptidilo de IGF se clona y se manipula de modo que pueda expresarse en un anfitrión conveniente. El ADN que codifica polipéptidos precursores se puede obtener a partir de un banco genómico, a partir de un ADNc procedente del ARNm de las células que expresan el péptido, o por síntesis construyendo la secuencia de ADN (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2ª ed.), Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y., 1989).

El ADN precursor se inserta a continuación en un plásmido o vector apropiado que se utiliza para transformar una célula anfitriona. En general, se utilizan los vectores del plásmido que contienen la replicación y las secuencias de control que proceden de la especie compatible con la célula anfitriona junto con esos anfitriones. El vector lleva normalmente un punto de replicación, así como las secuencias que codifican las proteínas o péptidos que son capaces de proporcionar la selección fenotípica en las células transformadas.

Por ejemplo, se puede transformar el E. coli utilizando pBR322, plásmido derivado de una especie de E. coli (Mandel et al., J. Mol. Biol. 53: 154 (1970)). El plásmido pBR322 contiene genes con resistencia a la ampicilina y tetraciclina y proporciona de este modo medios fáciles para la selección. Otros vectores incluyen diferentes características tales como los diferentes activadores, que con frecuencia son importantes en la expresión. Por ejemplo, los plásmidos pKK223-3, pDR720 y pPL-lambda representan vectores de expresión con los activadores tac, trp o P_{L} que están disponibles actualmente (Pharmacia Biotechnology).

Un vector preferido es pB0475. Este vector contiene el origen de la replicación para el fago y E. coli lo que le permite trasladarse entre dichos anfitriones, facilitando de este modo tanto la mutagénesis como la expresión (Cunningham et al., Science, 243: 1330-1336 (1989); patente U.S. nº 5.580.723). Otros vectores preferidos son pR1T5 y pR1T2T (Pharmacia Biotechnology). Estos vectores contienen los activadores apropiados seguidos por el dominio Z de la proteína A, permitiendo a los genes insertados en los vectores expresarse como proteínas de fusión.

Se pueden construir otros vectores preferidos utilizando técnicas normalizadas combinando los rasgos pertinentes de los vectores descritos anteriormente. Los rasgos pertinentes incluyen el activador, el punto de unión al ribosoma, el gen de decorsina u omatina o la fusión del gen (el dominio Z de la proteína A y decorsina u omatina y su enlazador), los marcadores con resistencia al antibiótico y los orígenes apropiados de replicación.

La célula anfitriona puede ser procariótica o eucariótica. Los procariotas son preferidos para las secuencias de clonación y expresión del ADN para producir el polipéptido precursor del IGF-I, los péptidos sustituidos en el segmento, los péptidos sustituidos en el resto y las variantes del péptido. Por ejemplo, se puede utilizar la cepa 294 de E. coli K12 (ATCC nº 31446) así como de E. coli B, E. coli X1776 (ATCC nº 31537) y E. coli c600 y c600hfl, E. coli W3110 (F-, gamma- y protótrofo/ATCC nº 27325), bacilos tales como Bacillus subtilis y otras enterobacteriáceas tales como Salmonella typhimurium o Serratia marcesans y varias especies de Pseudomonas. El procariota preferido es E. coli W3110 (ATCC nº 27325). Cuando se expresan mediante procariotas los péptidos contienen normalmente una metionina N-terminal o una formil-metionina y no están glucosilados. En el caso de las proteínas de fusión los restos de metionina N-terminal o de formil-metionina en el terminal amino de la proteína de fusión o en la secuencia señal de la proteína de fusión. Estos ejemplos, desde luego, pretenden ser ilustrativos más bien que limitativos.

Además de procariotas, se pueden utilizar organismos eucariotas, tales como cultivos de levaduras o células procedentes de organismos pluricelulares. En la práctica, cualquiera de dichos cultivos celulares es operable. Sin embargo, el mayor interés ha existido por las células de vertebrados y la propagación de las células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejido) ha llegado a ser un procedimiento reproducible. Tissue Culture, Academic Press, editores Kruse y Patterson (1973). Ejemplos de dichas líneas de células anfitrionas son las células VERO y HeLa, las líneas celulares del ovario de hamster chino (CHO), las líneas celulares W138, 293, BHK, COS-7 y MDCK.

Una variación de los procedimientos anteriores contempla la utilización de fusiones de genes en las que el gen que codifica el péptido deseado está asociado, en el vector, con un gen que codifica otra proteína o un fragmento de otra proteína. Esto da como resultado que el péptido deseado que es producido por la célula anfitriona como una fusión con otra proteína o péptido. La "otra" proteína o péptido es con frecuencia una proteína o péptido que puede ser segregado por la célula, permitiendo aislar y purificar el péptido deseado en el medio de cultivo y eliminar la necesidad de destruir las células anfitrionas que surgen cuando el péptido deseado permanece dentro de la célula. Como alternativa, la proteína de fusión se puede expresar intracelularmente. Es útil utilizar las proteínas de fusión que se expresan mucho.

La utilización de fusiones de genes, aunque no es esencial, puede facilitar la expresión de péptidos heterólogos en E. coli así como la purificación posterior de estos productos génicos (Harris, en Genetic Engineering, Williamson, R., Ed. (Academic Press, Londres, Vol. 4, 1983), pág. 127; Ljungquist et al., Eur. J. Biochem., 186: 557-561 (1989) y Ljungquist et al., Eur. J. Biochem., 186: 563-569 (1989)). Las fusiones de proteína A se utilizan con frecuencia porque el enlace de la proteína A, o más específicamente el dominio Z de la proteína A, a IgG proporciona un "indicador de afinidad" para la purificación de la proteína fusionada. Se ha demostrado también que muchas proteínas heterólogas se degradan cuando se expresan directamente en E. coli, pero son estables cuando se expresan como proteína de fusión, Marston, Biochem J., 240: 1 (1986).

Las proteínas de fusión se pueden escindir utilizando productos químicos, tal como el bromuro de cianógeno, que se escinde en una metionina o hidroxilamina, que se escinde entre un resto de Asn y Gly. Utilizando la metodología normalizada del ADN recombinante, se pueden insertar pares de bases del nucleótido que codifican estos aminoácidos justo antes del extremo 5' del gen que codifica el péptido deseado.

Como alternativa, se puede emplear la escisión proteolítica de la proteína de fusión (Carter, en Protein Purification: From Molecular Mechanisms to Large-Scale Processes. Ladisch et al. (American Chemical Society Symposium Series nº 427, 1990), cap. 13, páginas 181-193).

Se han utilizado con éxito proteasas tales como el Factor Xa, trombina y subtilisina y sus mutantes y numerosas otras para escindir las proteínas de fusión. Normalmente, un enlazador de péptidos que sea sensible a la escisión por la proteasa utilizada se inserta entre la "otra" proteína (p. ej., el dominio Z de la proteína A) y el péptido deseado. Utilizando la metodología del ADN recombinante, los pares de bases del nucleótido que codifican el enlazador se insertan entre los genes o los fragmentos del gen que codifican las otras proteínas. La escisión proteolítica de la proteína de fusión parcialmente purificada que contiene el enlazador correcto se puede realizar entonces en la proteína de fusión natural o en proteína de fusión reducida o desnaturalizada.

El péptido puede o no estar plegado de forma apropiada cuando se expresa como proteína de fusión. Asimismo, el enlazador específico del péptido que contiene el punto de escisión puede o no ser accesible a la proteasa. Estos factores determinan si la proteína de fusión debe estar desnaturalizada y replegada, y si es así, si estos procedimientos se emplean antes o después de la escisión.

Cuando se necesitan la desnaturalización y el replegamiento, se trata el péptido normalmente con un caótropo, tal como un HCl de guanidina y a continuación se trata con un tampón redox, que contiene, ditiotreitol o glutatión reducido y oxidado en las proporciones, pH y temperatura apropiados, de modo que el péptido se repliega a su estructura natural.

Cuando los péptidos no se preparan utilizando la tecnología del ADN recombinante, se preparan preferentemente utilizando la tecnología de la síntesis en fase sólida tal como la descrita generalmente por Merrifield, J. Am. Chem. Soc., 85: 2149 (1963), aunque se pueden emplear otras técnicas químicas equivalentes conocidas en la materia. La síntesis en fase sólida se inicia en el terminal C del péptido acoplando un aminoácido \alpha protegido a una resina adecuada. Dicho material de partida se puede preparar uniendo un aminoácido protegido en el amino \alpha mediante un enlace éster a una resina clorometilada o a una resina de hidroximetilo, o mediante un enlace amida a una resina BHA o a una resina MBHA. La preparación de la resina de hidroximetilo está descrita por Bodansky et al., Chem. Ind. (Londres), 38: 1597-1598 (1966). Las resinas clorometiladas están disponibles en el comercio en BioRad Laboratories, Richmond, CA y en Lab. Systems, Inc. La preparación de dicha resina está descrita por Stewart et al., "Solid Phase Peptide Synthesis" (Freeman & Co., San Francisco, 1969), capítulo 1, págs. 1-6. Los soportes de las resinas BHA y MBHA están disponibles en el comercio y se utilizan generalmente sólo cuando el péptido deseado que se está sintetizando posee una amida insustituida en el terminal C.

Los aminoácidos se acoplan a la cadena del péptido utilizando técnicas bien conocidas en la materia para la formación de enlaces péptido. Un procedimiento implica transformar el aminoácido en un derivado que haga más sensible al grupo carboxilo a la reacción con el grupo amino N-terminal libre del fragmento de péptido. Por ejemplo, el aminoácido puede transformarse en un anhídrido mixto mediante la reacción de un aminoácido protegido con cloroformiato de etilo, cloroformiato de fenilo, cloroformiato de sec-butilo, cloroformiato de isobutilo, cloruro de pivaloilo o cloruros ácidos similares. Como alternativa, el aminoácido se puede transformar en un éster activo tal como un éster de 2,4,5-triclorofenilo, un éster de pentaclorofenilo, un éster de pentafluorfenilo, un éster de p-nitrofenilo, un éster de N-hidroxisuccinimida o un éster formado a partir de 1-hidroxibenzotriazol.

Otro procedimiento de acoplamiento implica la utilización de un agente de acoplamiento adecuado tal como N,N'-diciclohexilcarbodiimida o N,N'-diisopropil-carbodiimida. Otros agentes de acoplamiento apropiados, evidentes para los expertos en la materia, se dan a conocer en E. Gross y J. Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Vol. 1: Major Methods of Peptide Bond Formation (Academic Press, Nueva York, 1979).

Debe reconocerse que el grupo \alpha-amino de cada aminoácido empleado en la síntesis del péptido debe protegerse durante la reacción de acoplamiento para evitar las reacciones secundarias que afectan a su función \alpha-amino activa. Debe reconocerse asimismo que determinados aminoácidos contienen grupos funcionales reactivos con cadena lateral (p. ej., sulfhrilo, amino, carboxilo e hidroxilo) y que dichos grupos funcionales deben protegerse asimismo con grupos protectores adecuados para impedir que tenga lugar una reacción química en este punto tanto en la etapa de acoplamiento inicial como en las posteriores. Grupos protectores adecuados, conocidos en la técnica, están descritos en Gross y Meienhofer, The Peptides: Analysis, Structure, Biology, Vol. 3: "Protection of Functional Groups in Peptide Synthesis" (Academic Press, Nueva York, 1981).

En la selección de un determinado grupo protector con cadena lateral que debe utilizarse en la síntesis de péptidos, se siguen las reglas generales siguientes. Un grupo protector \alpha-amino (a) debe hacer inerte la función \alpha-amino en las condiciones empleadas en la reacción de acoplamiento, (b) debe ser fácilmente separable tras la reacción de acoplamiento en condiciones que no se separen los grupos protectores con cadena lateral y no alteren la estructura del fragmento del péptido, y (c) debe eliminarse la posibilidad de racemización en el momento de la activación inmediatamente antes del acoplamiento. Un grupo protector con cadena lateral (a) debe hacer inerte el grupo funcional con cadena lateral en las condiciones empleadas en la reacción de acoplamiento, (b) debe ser en las condiciones empleadas para separar el grupo protector \alpha-amino, y (c) debe ser fácilmente separable en el momento de la terminación del péptido de los aminoácidos deseados en condiciones de reacción que no alteren la estructura de la cadena del péptido.

Es evidente para los expertos en la materia que los grupos protectores conocidos por ser útiles en la síntesis de péptidos oscilarán en reactividad con los agentes empleados para su separación. Por ejemplo, determinados grupos protectores tales como trifenilmetilo y 2-(p-bifenilil)isopropilisocarbonilo son muy lábiles y se pueden escindir en condiciones ácidas suaves. Otros grupos protectores, tales como t-butiloxicarbonilo (BOC), t-amiloxicarbonilo, adamantil-oxicarbonilo y p-metoxibenciloxicarbonilo son menos lábiles y requieren ácidos moderadamente fuertes tal como trifluoracético, clorhídrico o trifluoruro de boro en ácido acético, para su separación. Otros grupos protectores todavía, tales como benciloxicarbonilo (CBZ o Z), halobenciloxicarbonilo, p-nitrobenciloxicarbonilo, cicloalquiloxi-carbonilo e isopropiloxicarbonilo, son aún menos lábiles y requieren ácidos más fuertes, tales como el fluoruro de hidrógeno, bromuro de hidrógeno o trifluoracetato de boro en ácido trifluoracético, para su separación. Entre las clases de grupos protectores de aminoácidos se incluyen:

(1): para un grupo a-amino, (a) los grupos protectores aromáticos tipo uretano, tal como fluorenilmetiloxicarbonilo (FMOC)CBZ, y CBZ sustituido, tales como, p. ej., p-clorobenciloxicarbonilo, p-6-nitrobenciloxicarbonilo, p-bromobenciloxicarbonilo y p-metoxibenciloxicarbonilo, o-clorobenciloxicarbonilo, 2,4-diclorobenciloxicarbonilo, 2,6-diclorobenciloxicarbonilo y similares; (b) los grupos protectores alifáticos tipo uretano, tales como BOC, t-amiloxicarbonilo, isopropiloxicarbonilo, 2-(p-bifenilil)-isopropiloxicarbonilo, aliloxicarbonilo y similares; (c) los grupos protectores de cicloalquilo tipo uretano, tales como ciclopentiloxicarbonilo, adamantiloxicarbonilo y ciclohexiloxicarbonilo; y d) aliloxicarbonilo. Los grupos protectores \alpha-amino preferidos son BOC o FMOC.

(2): para el grupo amino con cadena lateral presente en Lys, la protección puede consistir en cualquiera de los grupos mencionados anteriormente en (1) tales como BOC, p-clorobenciloxicarbonilo, etc.

(3): para el grupo guanidino de Arg, la protección puede ser mediante nitro, tosilo, CBZ, adamantiloxicarbonilo, 2,2,5,7,8-pentametilcroman-6-sulfonilo o 2,3,6-trimetil-4-metiloxifenilsulfonilo o BOC.

(4): para el grupo hidroxilo de Ser, Thr o Tyr, la protección puede ser, por ejemplo, mediante alquilo C_{1}-C_{4}, tal como t-butilo; bencilo (BZL); BZL sustituido, tales como p-metoxibencilo, p-nitrobencilo, p-clorobencilo, o-clorobencilo y 2,6-clorobencilo.

(5): para el grupo carboxilo de Asp o Glu, la protección puede ser, por ejemplo, mediante esterificación utilizando grupos tales como BZL, t-butilo, ciclohexilo, ciclopentilo y similares.

(6): para el nitrógeno del imidazol de HIs, se emplea de forma adecuada el grupo tosilo.

(7): para el grupo hidroxilo fenólico de Tyr, se emplea de forma adecuada un grupo protector c tetrahidropiranilo, terc-butilo, tritilo, BZL, clorobencilo, 4-bromobencilo o 2,6-diclorobencilo. El grupo protector preferido es 2,6-diclorobencilo.

(8): para el grupo amino de la cadena lateral de Asn o Gln, se emplea preferentemente xantilo (Xan).

(9): para Met, el aminoácido se deja preferentemente sin proteger.

(10): para el grupo tio de Cys, se emplea normalmente p-metoxibencilo.

Se protege el aminoácido C-terminal, p. ej., Lys, en la posición N-amino mediante un grupo protector seleccionado de forma apropiada, en el caso de Lys, BOC. El BOC-Lys-OH se puede acoplar en primer lugar a la bencilhidrilamina o a la resina clorometilada según el procedimiento indicado en Horiki et al., Chemistry Letters, 165-168 (1978) o utilizando isopropilcarbodiimida a aproximadamente 25ºC durante 2 horas en agitación. Después del acoplamiento del aminoácido protegido con BOC en el soporte de resina, se separa el grupo protector \alpha-amino, utilizando ácido trifluoracético (TFA) en cloruro de metileno o TFA solo. La desprotección se realiza a una temperatura comprendida entre aproximadamente 0ºC y la temperatura ambiente. En la bibliografía se describen otros reactivos de escisión habituales, tal como HCl en dioxano y las condiciones de separación de los grupos protectores \alpha-amino específicos.

Tras la separación del grupo protector \alpha-amino, se acoplan paso a paso en el orden deseado el \alpha-amino restante y los aminoácidos protegidos con cadena lateral. Como alternativa para añadir cada aminoácido por separado en la síntesis, alguno se puede acoplar a otro antes de la adición al sintetizador en fase sólida. La selección de un reactivo de acoplamiento apropiado está dentro de la experiencia en la materia. N,N'-diciclohexil-carbodiimida o diisopropilcarbodiimida es particularmente adecuado como reactivo de acoplamiento.

Cada aminoácido o secuencia de aminoácidos protegido se introduce en exceso en el reactor en fase sólida y se realiza el acoplamiento de forma adecuada en un medio de dimetilformamida (DMF) o CH_{2}Cl_{2} o mezclas de los mismos. Si se produce un acoplamiento incompleto, se repite el procedimiento de acoplamiento antes de la separación del grupo protector N-amino antes del acoplamiento del aminoácido siguiente. Se puede controlar el éxito de la reacción de acoplamiento en cada etapa de síntesis. Un procedimiento preferido de control de la síntesis es mediante la reacción con ninhidrina, descrito por Kaiser et al., Anal. Biochem., 34: 595 (1970). Las reacciones de acoplamiento se pueden realizar automáticamente utilizando procedimientos bien conocidos, por ejemplo, un sintetizador de péptidos BIOSEARCH 9500^{TM}.

Una vez finalizada la secuencia de péptidos deseada, el péptido protegido debe escindirse del soporte de la resina, y se deben separar todos los grupos protectores. La reacción de escisión y la separación de los grupos protectores se lleva a cabo de forma adecuada simultáneamente o paso a paso. Cuando el soporte de la resina es una resina de poliestireno cloro-metilada el enlace que ancla el péptido a la resina es un enlace éster formado entre el grupo carboxilo libre y el resto C-terminal y uno de los muchos grupos clorometilo presentes en la matriz de la resina. Se valorará que el enlace del anclaje pueda escindirse mediante reactivos que son conocidos por ser capaces de romper un enlace éster y de penetrar en la matriz de la resina.

Un procedimiento especialmente conveniente es mediante tratamiento con fluoruro de hidrógeno anhidro líquido. Este reactivo no solo escindirá el péptido de la resina sino que además separará todos los grupos protectores. Así pues, la utilización de este reactivo proporcionará directamente el péptido totalmente desprotegido. Cuando se utiliza la resina clorometilada, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno produce la formación de los ácidos libres del péptido. Cuando se utiliza la resina de benzhidrilamina, el tratamiento con fluoruro de hidrógeno produce directamente las aminas libres del péptido. La reacción con fluoruro de hidrógeno en presencia de anisol y sulfuro de dimetilo a 0ºC durante una hora separará simultáneamente los grupos protectores con cadena lateral y liberará el péptido de la resina.

Cuando se desea escindir el péptido sin separar los grupos protectores el péptido-resina protegido puede experimentar metanólisis para dar el péptido protegido en el que se metila el grupo carboxilo C-terminal. A continuación se hidroliza el éster metílico en condiciones alcalinas suaves para dar el grupo carboxilo C-terminal libre. Se separan a continuación los grupos protectores en la cadena de péptido mediante tratamiento con un ácido fuerte, tal como el fluoruro de hidrógeno líquido. Una técnica particularmente útil para la metanólisis es la de Moore et al., Peptides, Proc. Fifth Amer. Pept. Symp., M. Goodman y J. Meienhofer, Eds., (John Wiley, N.Y., 1977), págs. 518-521, en la que el péptido-resina protegido se trata con metanol y cianuro de potasio en presencia de éter corona.

Otro procedimiento para la escisión del péptido protegido de la resina cuando se emplea resina clorometilada es mediante amonólisis o por tratamiento con hidrazina. Si se desea se puede hidrolizar la amida o la hidrazida C-terminal resultante al grupo carboxilo C-terminal libre, y los grupos protectores se pueden separar de manera convencional.

Se reconoce asimismo que el grupo protector presente en el grupo \alpha-amino N-terminal se puede separar preferentemente antes o después de escindir el péptido protegido del soporte.

La purificación de los péptidos de la invención se consigue normalmente utilizando procedimientos convencionales tal como la HPLC de preparación (incluyendo la HPLC en fase inversa) u otras técnicas cromatográficas conocidas tales como la difusión en gel, intercambio iónico, cromatografía de partición, cromatografía por afinidad (incluyendo columnas con anticuerpos monoclonales) o la distribución a contra corriente.

Los péptidos de la presente invención se pueden estabilizar por polimerización. Esto se puede llevar a cabo reticulando las cadenas de monómeros con agentes de reticulación polifuncionales, ya sea directa o indirectamente, mediante polímeros multifuncionales. Normalmente, se reticulan dos polipéptidos sustancialmente idénticos en sus terminales C ó N utilizando un agente de reticulación bifuncional. El agente se utiliza para reticular los grupos amino o carboxilo terminales. Generalmente, ambos grupos carboxilo terminales o ambos grupos amino terminales se reticulan uno con otro, aunque el grupo amino alfa de un polipéptido se reticula con el grupo carboxilo terminal del otro polipéptido mediante selección del agente de reticulación apropiado. Preferentemente se sustituyen los polipéptidos en el terminal C con cisteína. En condiciones bien conocidas en la técnica se puede formar un enlace disulfuro entre las cisteínas terminales, reticulando de este modo las cadenas de polipéptido. Por ejemplo, se forman convenientemente puentes disulfuro por oxidación de las cisteínas libres catalizada por metales o por sustitución nucleófila de un resto de cisteína modificado de forma adecuada. La selección del agente de reticulación dependerá de las similitudes de las cadenas laterales reactivas de los aminoácidos presentes en los polipéptidos. Por ejemplo, la reticulación del disulfuro no se preferiría si la cisteína estuviese presente en el polipéptido en otros puntos adicionales aparte del terminal-C. Asimismo están comprendidos dentro del alcance de esta memoria los péptidos reticulados con puentes metileno.

Los puntos de reticulación adecuados en los péptidos, aparte de los grupos amino N-terminal y carboxilo C-terminal incluyen los grupos carboxilo épsilon observados en los restos de lisina, así como los grupos amino, imino, carboxilo, sulfhidrilo e hidroxilo localizados en las cadenas laterales de los restos internos de los péptidos o de los restos introducidos en las secuencias adyacentes. La reticulación se consigue de forma adecuada mediante agentes de reticulación añadidos externamente, p. ej., utilizando cualquiera de los numerosos reactivos conocidos por los expertos en la materia, por ejemplo, el tratamiento del polipéptido mediante carbodiimida. En la bibliografía se encuentran otros ejemplos de agentes de reticulación multifuncional (normalmente bifuncional) adecuados.

Los péptidos de la presente invención se pueden estabilizar también en función de la conformación por ciclación. Los péptidos se ciclan normalmente uniendo con enlace covalente los dominios - y C-terminal de un péptido con el correspondiente dominio de otro péptido de la presente invención con el fin de formar ciclo-oligómeros que contienen dos o más secuencias de péptidos iteradas, teniendo sustancialmente cada péptido interno la misma secuencia. Además, los péptidos ciclados (ya sean ciclo-oligómeros o ciclo-monómeros) se reticulan para formar 1 a 3 estructuras cíclicas que tienen de 2 a 6 péptido comprendidos en éstas. Preferentemente los péptidos no se unen por enlaces covalentes mediante un aminoácido y grupos carboxilo de cadena principal (cabeza con cola), sino más bien se reticulan mediante las cadenas laterales de los restos localizados en los dominios - y C-terminal. Los puntos de enlace estarán por lo tanto generalmente entre las cadenas laterales de los restos.

Se conocen de por sí muchos procedimientos adecuados para preparar péptidos mono- o poli-ciclados tal como se contempla en la presente memoria. La ciclación Lys/Asp se ha llevado a cabo utilizando Na-Boc-aminoácidos en soporte de fase sólida con protección de la cadena lateral de Fmoc/9-fluorenilmetilo (OFm) para Lys/Asp; el procedimiento se completa mediante tratamiento con piperidina seguido de ciclación.

Las cadenas laterales con Glu y Lys se han reticulado preparando péptidos cíclicos o bicíclicos: el péptido se sintetiza mediante química en fase sólida o una resina de p-metilbencilhidrilamina. Se escinde el péptido de la resina y se desprotege. Se forma el péptido cíclico utilizando difenilfosforilazida en metilformamida diluida. Par un procedimiento alternativo, véase Schiller et al., Peptide Protein Res., 25: 171-177 (1985). Véase también la patente U.S. nº 4.547.489.

Se generan disulfuro reticulado o péptidos ciclados por procedimientos convencionales. El procedimiento de Pelton et al. (J. Med. Chem., 29: 2370-2375 (1986) es adecuado, excepto que se produzca una proporción mayor de ciclo-oligómeros conduciendo la reacción a soluciones más concentradas que la mezcla de reacción diluida descrita por Pelton et al., para la producción de ciclo-monómeros. La misma química es útil para la síntesis de dímeros o ciclo-oligómeros o ciclo-monómeros. Asimismo son útiles los puentes tiometileno. Lebl y Hruby, Tetrahedron Letters, 25: 2067-2068 (1984). Véase también Cody et al., J. Med. Chem., 28: 583 (1985).

Los péptidos cíclicos o poliméricos deseados se purifican por filtración en gel seguida de cromatografía líquida de alta presión en fase inversa o por otros procedimientos convencionales. Se ultrafiltran los péptidos y se formulan en vehículos convencionales farmacéuticamente aceptables.

Los materiales de partida requeridos para los procedimientos descritos en la presente memoria son conocidos en la bibliografía o se pueden preparar utilizando procedimientos conocidos y materiales de partida conocidos.

Si en los péptidos que se están creando los átomos de carbono unidos a cuatro sustituyentes no idénticos son asimétricos, entonces los péptidos pueden existir como diasteroisómeros, enantiómeros o mezclas de los mismos. Las síntesis descritas anteriormente pueden emplear racematos, enantiómeros o diastereoisómeros como materiales de partida o productos intermedios. Los productos diastereoisoméricos resultantes de dichas síntesis se pueden separar por procedimientos cromatográficos o de cristalización. Asimismo, se pueden separar las mezclas de productos enantioméricos utilizando las mismas técnicas o por otros procedimientos conocidos en la materia. Cada uno de los átomos de carbono asimétricos, cuando está presente, puede estar en una o dos configuraciones R) o S) y ambas están comprendidas dentro del alcance de la presente invención.

Los péptidos de la presente invención se pueden administrar al mamífero mediante cualquier técnica adecuada, incluyendo las vías de administración oral, parenteral (p. ej., intramuscular, intraperitoneal, intravenosa o inyección, infusión o implante subcutáneo), nasal, pulmonar, vaginal, rectal, sublingual o tópica, y se pueden formular en formas de dosificación apropiadas para cada vía de administración. La vía de administración específica dependerá, p. ej., de los antecedentes clínicos del paciente, incluyendo cualquiera de los efectos secundarios percibidos o previstos utilizando el péptido, del tipo de péptido que se administre y del tipo particular de trastorno que haya que corregir. Más preferentemente, la administración es mediante infusión continua (utilizando p. ej., dispositivo o minibombas de liberación lenta tales como bombas osmóticas o parches cutáneos), o mediante inyección (utilizando p. ej., medios intravenosos o subcutáneos).

El péptido que se debe utilizar en la terapia se formulará y dosificará de modo coherente con las buenas prácticas médicas, teniendo en cuenta el cuadro clínico de cada paciente (especialmente los efectos secundarios del tratamiento con el péptido), el tipo de trastorno, el punto de administración, el procedimiento de administración, el programa de administración y otros factores conocidos por los especialistas. Las "cantidades eficaces" del péptido para los fines de la presente memoria se determinan por lo tanto mediante tales consideraciones y deben ser cantidades que produzcan biodisponibilidad de los fármacos en el mamífero y el efecto deseado.

Una administración preferida consiste en una administración de larga duración de aproximadamente dos veces al día durante 4 a 8 semanas para producir los efectos de IGF-I. Aunque se prefiere la inyección, se puede emplear asimismo la infusión de larga duración utilizando un dispositivo de infusión para infusiones subcutáneas (SC) continuas. Se puede emplear también una infusión intravenosa en bolsa. El factor clave para seleccionar una dosis apropiada para el trastorno en cuestión es el resultado obtenido, medido, en el caso de la diabetes, por ejemplo, por las disminuciones de la glucosa en la sangre con el fin de aproximarse al intervalo normal o por otros criterios para medir el tratamiento del trastorno tal como estime apropiado el especialista médico.

Como propuesta general, la cantidad farmacéuticamente eficaz del péptido administrado por vía parenteral por dosis estará comprendida en el intervalo que se pueda medir mediante una curva de dosis-respuesta. Por ejemplo, los IGFs unidos a las IGFBP o en la sangre se pueden medir en los fluidos corporales del mamífero que se debe tratar para determinar la dosificación. Como alternativa, se pueden administrar cantidades crecientes del péptido al paciente y comprobar los niveles de IGF-I e IGF-II en el suero del paciente. La cantidad de péptido que se puede emplear se puede calcular en base molar referida a estos niveles de IGF-I e IGF-II en el suero. Véase el Ejemplo 3 más adelante en el desplazamiento del trazador de IGF-I de las IGFBP presentes en el suero humano.

Específicamente, un procedimiento para determinar la dosificación apropiada del péptido conlleva la medición de los niveles de IGF en un fluido biológico tal como un fluido corporal o la sangre. La medición de dichos niveles se puede realizar por algunos medios, incluyendo RIA y ELISA. Después de medir los niveles de IGF, se pone en contacto el fluido con el péptido utilizando dosis únicas o múltiples. Tras esta etapa de contacto, se vuelven a medir los niveles de IGF en el fluido. Si los niveles de IGF en el fluido han disminuido en una cantidad suficiente para producir la eficacia deseada para la cual se debe administrar la molécula, entonces se puede ajustar la dosis de la molécula para producir la eficacia máxima. Este procedimiento se puede realizar in vitro o in vivo. Preferentemente, este procedimiento se realiza in vivo, es decir tras extraer el fluido del animal y medir los niveles de IGF, según esta memoria el péptido se administra al mamífero utilizando una sola o dosis múltiples (esto es, la etapa de puesta en contacto se consigue mediante la administración al mamífero) y a continuación se vuelven a medir los niveles de IGF en el fluido extraído del mamífero.

Otro procedimiento para determinar la dosificación consiste en utilizar anticuerpos contra el péptido u otro procedimiento de detección del péptido en formato LIFA. Esto permitiría la detección de los IGFs endógenos o exógenos unidos a la IGFBP y la cantidad de péptido unido a la IGFBP.

Otro procedimiento para determinar la dosificación sería medir el nivel de IGF "libre" o activo en la sangre. Para algunas utilizaciones el nivel de IGF "libre" sería un marcador adecuado de eficacia y de dosis o dosificación eficaces.

Por ejemplo, se describe un procedimiento para detectar IGF endógeno o exógeno unido a una proteína de enlace al IGF o la cantidad de péptido en éste o para detectar el nivel de IGF no unido en un fluido biológico. Este procedimiento comprende:

(a): poner en contacto el fluido con 1) un medio para detectar el péptido que es específico del péptido (tal como un primer anticuerpo específico de los epítopos en el péptido) unido a un portador en fase sólida, de modo que en presencia del péptido permanezcan disponibles los puntos de enlace al IGF en el péptido para el enlace a la proteína de enlace al IGF, formando de este modo un complejo entre el medio y la proteína de enlace a IGF; y 2) el péptido durante un periodo de tiempo suficiente para saturar todos los puntos de enlace al IGF disponibles en la proteína de enlace al IGF, formando de este modo un complejo saturado;

(b): poner en contacto el complejo saturado con un segundo medio marcado de forma detectable que es específico de la proteína de enlace al IGF (tal como un segundo anticuerpo específico de los epítopos en la IGFBP) que están disponibles para el enlace cuando el péptido se une a la proteína de enlace al IGF; y

(c): analizar cuantitativamente la cantidad del medio marcado unido como medida de la IGFBP en el fluido biológico, y por consiguiente como medida de la cantidad de péptido unido y de proteína de enlace al IGF, IGF unido y proteína de enlace al IGF o IGF presente en el fluido.

Dados los procedimientos anteriores para la determinación de las dosis, en general, se puede estimar la cantidad de péptido que se puede emplear, es decir, se puede utilizar desde aproximadamente 10 \mug/kg/día a 200 \mug/kg/día, referidas por kg de peso corporal del paciente, aunque, como se indicó anteriormente, esto estará sometido a mucha discreción terapéutica. Por ejemplo, en el tratamiento de la insuficiencia renal crónica, la dosis diaria es con preferencia aproximadamente 10 a 160 \mug/kg, más preferentemente 20 a 100 \mug/kg y con más preferencia aproximadamente 25 a 75 \mug/kg.

Se proporciona otro procedimiento para estimar la distribución de los IGFs en las IGFBP específicas, p. ej., en IGFBP-1 o IGFBP-3 utilizando un formato LIFA.

El péptido se administra de manera adecuada mediante un sistema de liberación lenta. Los ejemplos adecuados de composiciones de liberación lenta incluyen las matrices de polímero semipermeable en forma de artículos moldeados, p. ej., películas o microcápsulas. Las matrices de liberación lenta incluyen las polilactidas (patente U.S. nº 3.773.919, patente EP 58.481), copolímeros del ácido L-glutámico y gamma-etil-L-glutamato (Sidman et al., Biopolymers, 22, 547-556 (1983), poli(metacrilato de 2-hidroxietilo) (Langer et al., J. Biomed. Mater. Res., 15: 167-277 (1981) y Langer, Chem. Tech., 12: 98-105 (1982), acetato de viniletileno (Langer et al., supra) o ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico (patente EP 133.988). Las composiciones de liberación lenta comprenden también un péptido atrapado en liposomas. Los liposomas que contienen al péptido se preparan por procedimientos conocidos por sí mismos: patente DE 3.218.121; Epstein et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 82: 3688-3692 (1985); Hwang et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 77: 4034-4034 (1980); patentes EP nº 52.322; EP nº 36.676; EP nº 88.046; EP nº 143.949; EP nº 142.641; solicitud de patente japonesa nº 83-118008; patentes U.S. nº 4.485.045 y nº 4.544.545; y patente EP nº 102.324. Normalmente, los liposomas son de tipo unilaminar pequeño (de o aproximadamente 200 a 800 Angstroms) en los cuales el contenido en lípido es mayor de aproximadamente 30 por ciento mol. de colesterol, ajustándose la proporción seleccionada a la terapia más eficaz.

Se pueden emplear también péptidos PEGilados con una vida más larga, basados en, p. ej., la tecnología del conjugado descrita en el documento WO 95/32003 publicado el 30 de noviembre de 1995.

Para la administración parenteral, en una forma de realización, el péptido se formula generalmente mezclando cada uno en el grado de pureza deseado en una forma inyectable de dosis unitaria (solución, suspensión o emulsión) con un portador, farmacéutica o parenteralmente aceptable, es decir, uno que no sea tóxico para los receptores a las dosis y niveles empleados y sea compatible con otros ingredientes de la formulación. Por ejemplo, la formulación preferentemente no incluye agentes oxidantes y otros péptidos que se conoce que son perjudiciales para los polipéptidos.

Generalmente, las formulaciones se preparan poniendo en contacto el péptido uniforme e íntimamente con portadores líquidos o portadores sólidos finamente divididos o ambos. A continuación, si es necesario, se moldea el producto en la formulación deseada. Preferentemente el portador es parenteral, más preferentemente una solución que es isotónica con la sangre del receptor. Ejemplo de dichos vehículos portadores comprenden agua, solución salina, solución de Ringer, una solución tamponada y solución de dextrosa. Los vehículos no acuosos, tales como los aceites fijados y el oleato de etilo, son asimismo útiles en la presente memoria.

El portador contiene apropiadamente cantidades menores de aditivos tales como sustancias que potencian la isotonicidad y la estabilidad química. Dichos materiales no son tóxicos para los receptores en las dosis y niveles empleados, e incluyen tampones tales como fosfato, citrato, succinato, ácido acético y otros ácidos orgánicos o sus sales; antioxidantes tales como ácido ascórbico; polipéptidos de bajo peso molecular (menos de aproximadamente diez restos), p. ej., poliarginina o tripéptidos; proteínas tales como albúmina de suero, gelatina o inmunoglobinas; polímeros hidrófilos tal como polivinilpirrolidona; glicina; aminoácidos tales como ácido glutámico, ácido aspártico, histidina o arginina; monosacáridos, disacáridos y otros carbohidratos, incluyendo celulosa o sus derivados, glucosa, manosa, trehalosa o dextrinas; agentes quelantes tal como EDTA; alcoholes de azúcar tales como sorbitol o manitol; contra-iones tal como sodio; tensioactivos no-iónicos tales como polisorbatos, poloxámeros o polietilenglicol (PEG); y/o sales neutras, p. ej., NaCl, KCl, MgCl_{2}, CaCl_{2}, etc.

El péptido se formuló normalmente en dichos vehículos a un pH desde o aproximadamente 4,5 a 8. Se entiende que la utilización de algunos de los excipientes, portadores o estabilizantes anteriores producirá la formación de las sales del péptido. La preparación final puede ser un líquido estable o un sólido liofilizado.

Las formulaciones típicas de los péptidos como composiciones farmacéuticas se exponen a continuación. Aproximadamente 0,5 a 500 mg del péptido o mezcla de péptidos, como forma de ácido o base libre o como una sal farmacéuticamente aceptable se compone con un vehículo, portador, excipiente, aglutinante, conservante, estabilizante, esencia, etc., fisiológicamente aceptable tal como se denomina en la práctica farmacéutica aceptada. La cantidad de ingrediente activo en estas composiciones es tal que se obtiene una dosis adecuada en el intervalo indicado.

El péptido que se debe utilizar para la administración terapéutica debe estar esterilizado. La esterilidad se consigue fácilmente mediante filtración a través de membranas de filtración esterilizadas (p. ej., membranas de 0,2 micras). Generalmente las composiciones terapéuticas se colocan en un recipiente con una boca de acceso esterilizada, por ejemplo, una bolsa o vial con solución intravenosa que tiene un tapón perforable mediante una aguja de inyección hipodérmica.

El péptido se almacenará generalmente en recipientes en unidades o multi-dosis, por ejemplo, ampollas o viales sellados, en forma de solución acuosa o formulación liofilizada para su redisolución. Como ejemplo de formulación liofilizada, se rellenan viales de 10 ml con 5 ml de solución acuosa al 1% (p/v) de péptido ultrafiltrada, y se liofiliza. la mezcla resultante. La solución para infusión se prepara redisolviendo el péptido liofilizado utilizando agua bacteriostática para inyectables.

También forman parte de la presente invención la terapia de combinación con el péptido en esta memoria y uno o más reactivos apropiados que aumentan el IGF total en la sangre y potencian el efecto del péptido. Estos reactivos permiten generalmente al péptido en la presente memoria liberar el IGF generado. Por ejemplo, es deseable administrar juntamente con el péptido otras moléculas activas. Por ejemplo, en las enfermedades de emaciación o catabólicas, el péptido se puede administrar junto con un arexígeno tal como MEGASE^{TM}.

Además, para su administración el péptido se administra de forma apropiada acoplado a un receptor, anticuerpo o fragmento de anticuerpo.

La terapia de combinación adicional debe incluir una hormona de crecimiento tales como la hormona de crecimiento humana, IGFBP-3 ó IGFBP-5.

En el tratamiento de trastornos hiperglucémicos, el péptido se administra adecuadamente junto con una cantidad eficaz de un agente hipoglucémico tal como una sulfonilurea o cualquier tipo de insulina. El agente hipoglucémico se administra al mamífero por cualquier técnica adecuada incluyendo la vía parenteral, intranasal, oral o por cualquier otra vía eficaz. Más preferentemente, la administración es por vía oral. Por ejemplo, los comprimidos de MICRONASE^{TM} (gliburida) comercializados por Upjohn en niveles por comprimido de 1,25, 2,5 y 5 mg son adecuados para la administración oral. La dosis de mantenimiento adecuada para diabéticos tipo II, ubicados en esta terapia, generalmente está comprendida en el intervalo entre o aproximadamente 1,25 a 20 mg al día, que se puede administrar en una sola dosis o dividida a lo largo del día como se estime apropiado [Physician's Desk Reference, 2563-2565 (1995)]. Otros ejemplos de comprimidos basados en gliburida disponibles para su prescripción incluyen el fármaco de marca GLYNASE^{TM} (Upjohn) y el fármaco de marca DIABETA^{TM}(Hoechst-Roussel). GLUCOTROL^{TM} (Pratt) es la denominación comercial de un comprimido de glipizida (1-ciclohexil-3-[p-[2-(carboxamida de 5-metilpirazina)etil]fenil]sulfonil]urea) disponible en dosis tanto de 5 como de 10 mg y se receta asimismo para diabéticos tipo II que requieren terapia hipoglucémica tras control dietético o en pacientes que han dejado de responder a otras sulfonilureas
[Physician's Desk Reference, 1902-1903 (1995)]. También se pueden emplear otros agentes hipoglucémicos además de las sulfonilureas, tales como las biguanidas (p. ej., metformina y fenformina) o troglitozonas u otros fármacos que afectan la acción de la insulina.

En el tratamiento de la insuficiencia cardíaca congestiva, se pueden utilizar inhibidores de ACE junto con el
péptido de la presente memoria reduciendo la resistencia vascular generalizada y aliviando la congestión circulatoria. Los inhibidores de ACE incluyen pero no se limitan a los especificados por las denominaciones comerciales de Accupril® (quinapril), Altace® (ramipril), Capoten® (captopril), Lotensil® (benazepril), Monopril® (fosinopril), Vasoprec® (enalapril) y Zestril®(lisinopril). Un ejemplo de inhibidor de ACE es el comercializado bajo la denominación comercial Capoten®. Este inhibidor de ACE, genéricamente denominado captopril, se denomina químicamente 1-(2S)-3-mercapto-2-metilpropionil]-L-prolina.

Para los trastornos renales, se puede administrar el péptido adecuadamente con una molécula activa para el riñón que favorezca la reabsorción y retención de electrolitos tales como, p. ej., péptido auricular natriurético (ANP), análogos de ANP o algunas variantes de los mismos con o sin actividad receptora, urodilatina, péptido natriurético humano tipo B (BNP), antagonista del receptor angiotensina, vasopresina y sus análogos y antagonistas de endotelina tales como anticuerpos o antagonistas del péptido. Un ejemplo es BQ-123 (Ihara et al., Life Science, 50: 247-250 (1992); documento JP 51-94254A, publicado el 3 de agosto de 1993; Webb et al., Biochim. Biophys. Res. Comm., 185: 887-892 (1992)), polipéptido cíclico que es un potente y específico bloqueador de receptores de endotelina A y bloquea solamente la actividad hipertrófica producida por la endotelina-1, no por CT-1, LIF de ratón o fenilefrina. Otro ejemplo es el compuesto precursor de BQ-123 descrito por Ihara et al., Biochem. Biophys. Res. Comm., 178: 132-137 (1991). Otros ejemplos incluyen los descritos en las patentes EP nº 647.236; EP nº 647.449; EP nº 633.259 (derivados de fenil-sulfonil-amino-pirimidina); EP nº 601.386 (compuestos de sulfonamida); patente U.S. nº 5.292.740 (fenilsulfonamidopirimidinas); y la patente U.S. nº 5.270.313 (derivados de fenil-sulfonil-aminopirimidina). Además, los inhibidores de la enzima transformadora de angiotensina (ACE) pueden ser beneficiosos juntamente con el tratamiento de IGF-I de los trastornos renales.

Además, se consideran asimismo que otros medios de manipulación del estado de IGF, tales como regímenes alimenticios o de ejercicio, son tratamientos de combinación como parte de la presente invención. Por ejemplo, se puede administrar el péptido al mamífero, junto con una dieta alta en calorías o alimentos tal como ENSURE^{TM} sin o junto con complementos nutritivos, tales como los complementos de cetoácido.

En la presente memoria la invención contempla asimismo la utilización de la terapia génica para el tratamiento de un mamífero, utilizando el ácido nucleico que codifica el péptido. Generalmente, la terapia génica se utiliza para aumentar (o sobreexpresar) los niveles de IGF en el mamífero. Con este objeto se pueden utilizar los ácidos nucleicos que codifican el péptido. Una vez se conoce la secuencia de aminoácidos, se pueden generar varias moléculas de ácido nucleico utilizando la degeneración del código genético y seleccionar cuál utilizar para la terapia génica.

Existen dos métodos principales para obtener el ácido nucleico (opcionalmente contenido en un vector) en las células del paciente para los objetivos de la terapia génica: in vivo y ex vivo. Para la administración in vivo, se inyecta directamente en el paciente el ácido nucleico, normalmente en el punto en que se necesita el péptido. Para el tratamiento ex vivo, se extraen las células del paciente, se introduce el ácido nucleico en estas células aisladas y se administran las células modificadas al paciente directamente o, por ejemplo, encapsuladas dentro de membranas porosas que se implantan en el paciente. Véanse, p. ej., las patentes U.S. nº 4.832.538 y nº 5.283.187.

Existe una variedad de técnicas disponible para introducir ácidos nucleicos en las células viables. Las técnicas varían dependiendo de si el ácido nucleico se transfiere in vitro o in vivo a las células cultivadas en las células del anfitrión deseado. Para la transferencia in vitro de las células al interior del mamífero las técnicas adecuadas incluyen la utilización de liposomas, electroporación, microinyección, fusión celular, DEAE-dextrano, el método de precipitación con fosfato de calcio, etc. Un vector utilizado frecuentemente para la administración del gen ex vivo es el retrovirus.

Las técnicas de transferencia in vivo de ácidos nucleicos preferidas actualmente incluyen la transfección con vectores víricos (tales como adenovirus, virus I del Herpes simple o virus adeno-asociados) y sistemas basados en lípidos (lípidos útiles para la transferencia mediada por lípidos del gen son, por ejemplo, DOTMA, DOPE y DC-Chol). En algunas situaciones es deseable proporcionar la procedencia del ácido nucleico con un agente que dirija las células diana, tal como un anticuerpo específico para una proteína de la membrana de la superficie celular o la célula diana, un ligando para un receptor en la célula diana, etc. Cuando se emplean liposomas, se pueden utilizar proteínas que se unen a una proteína de la membrana de la superficie celular relacionadas con la endocitosis para dirigir y/o facilitar la absorción, p. ej., de las proteínas de la cápside o de fragmentos de la misma, tropas para un tipo determinado de célula, anticuerpos que experimentan interiorización en la ciclación y proteínas que dirigen la localización intracelular y potencian la vida media intracelular. La técnica de la endocitosis mediada por el receptor está descrita, por ejemplo, por Wu et al., J. Biol. Chem., 262: 4429-4432 (1987); y Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 3410-3414 (1990). Para el estudio de los protocolos conocidos de marcado del gen y de la terapia génica, véase Anderson et al., Science, 255: 808-813 (1992). Véase también el documento WO 93/25673 y las referencias citadas en éste.

También se contemplan kits para la presente invención. Un kit típico debería comprender un recipiente, preferentemente un vial, para la formulación del péptido que comprende el péptido en un tampón farmacéuticamente aceptable e instrucciones, tales como un prospecto o etiqueta del producto, orientando al usuario a utilizar la formulación farmacéutica para el tratamiento de un trastorno caracterizado por la disregulación de los ejes GF/IGF en un mamífero. El kit incluye opcionalmente un recipiente, preferentemente un vial, para una molécula de la combinación, tal como una molécula activa en el riñón para la insuficiencia renal.

La invención se entenderá completamente con relación a los siguientes ejemplos. Sin embargo, no debiera considerarse limitativo el alcance de la invención. Toda la bibliografía y las citas de patentes mencionadas en la presente memoria se incorporan expresamente a la presente memoria como referencias.

Ejemplo 1 Mutagénesis por exploración con alanina de IGF-I y variantes estructurales Introducción

Se utilizó un método de mutagénesis por exploración con alanina (Cunningham y Wells, supra) para separar el fragmento de cada cadena lateral del IGF-I del carbono beta. A continuación se evaluó por ELISA competitivo del fago la contribución de estos átomos a la energía libre de enlace del péptido para IGFBP-1 o para IGFBP-3. En este ensayo, se utilizó IGFBP-1 o IGFBP-3 para inhibir los mutantes del fago IGF a partir de la placa inmunosorbente recubierta con IGFBP-1 o IGFBP-3. A partir de una serie de valoración de la proteína de enlace, se puede calcular el enlace (IC_{50}). Se evaluó asimismo el enlace directo de algunos mutantes en ensayos BIACORE^{TM}.

En los ejemplos, se pueden describir \alpha-aminoácidos corrientes mediante un código patrón de una a tres letras del aminoácido al referirse a productos intermedios y a productos finales. \alpha-aminoácidos corrientes significa aquellos aminoácidos incorporados en las proteínas bajo la dirección del ARNm. Las abreviaturas habituales se dan en The Merck Index, 10ª edición, págs. Misc-2 a Misc-3. A menos que se diseñen de otro modo los aminoácidos corrientes presentan la configuración natural o "L" en el átomo de carbono alfa. Si el código está precedido por una "D" significa el enantiómero opuesto al \alpha-aminoácido corriente. Los alfa-aminoácidos modificados o raros tales como la norleucina (Nle) y la ornitina (Orn) se diseñan tal como se describe en la patente U.S. y la Trademark Office Official Gazette 1114 TMOG, 15 de Mayo de 1990.

Basándose en los resultados de los experimentos que utilizan el mutante de IGF descrito a continuación, se prevé que las moléculas del tipo reivindicado en la presente memoria debieran aumentar los niveles de IGF activo en el paciente en tratamiento.

Materiales y procedimientos Construcción del vector fagómido y mutagénesis

Se amplió el gen que codifica el IGF maduro humano a partir de pBKIGF2B (patente U.S. nº 5.342.763) utilizando los cebadores de PCR 5'-AGC TGC TTT GAT ATG CAT CTC CCG AAA CTC TGT GCG GT-3' (SEC ID nº: 4) Y 5'-GAC CGA TCT GGG TCT AGA CAG ATT TAG CGG GTT TCA G-3' (SEC ID nº: 5). El fragmento resultante se cortó con NsiI y XbaI y se ligó en pH753 digerido previamente con NsiI y XbaI. pH0753 es un derivado de phGHam-g3 (Lowman et al., Biochemistry, 30: 10832-10838 (1991)) en el que el punto XbaI adicional en la zona del activador de la fosfatasa alcalina (PhoA) ha sido eliminado utilizando el oligonucleótido 5'-AAA AGG GTA TGT AGA GGT TGA GGT-3' (SEC ID nº: 6). El vector pH0753 ligado que contiene el marco de lectura abierto de IGF-I se denominó pIGF-g3. Éste codifica a IGF-I protegiendo la doble mutación G1S-A70V fusionada a un fragmento de la proteína del gen III (restos 249 a 406) del bacteriófago M13 de E. coli. Se observó que el enlace de esta variante de IGF-I a IGFBP-1 y -3 era indistinguible del IGF-I natural. Se realizó la mutagénesis con alanina utilizando plásmido pIGF-g3 de una sola cadena como plantilla (Kunkel et al., Methods Enzimol., 204: 125-139 (1991)). Todos los restos de IGF-I a excepción de las cisteínas y alaninas se sustituyeron uno a uno por alanina. Las creaciones resultantes se verificaron mediante secuenciado del ADN.

Enlace de mutantes de IGF desplegados en el fago para IGFBP-1 y -3 (ELISA del fago)

Se recubrieron placas inmunosorbentes (Nunc, MAXISOR P^{TM}, 96 pocillos) con 100 \mul/pocillo de 1 \mug/ml de IGFBP-1 ó IGFBP-3 en tampón PBS, pH 7,2 a 4ºC durante la noche. Se bloquearon a continuación las placas con TWEEN 20^{TM} al 0,5%/PBS (utilizado también como tampón de enlace) durante 2 horas a temperatura ambiente (se evitaron los agentes de bloqueo proteicos como albúmina de suero bovino para impedir la contaminación potencial por IGF o IGFBP). Células de E. coli (XL1-Blue, Stratagene) recién transformadas con vector de fagómido se cultivaron durante la noche en 5 ml de medio 2YT (Sambrook et al., supra) en presencia del fago cooperador M13-VCS
(Stratagene). Se recogieron las partículas y se volvieron a poner en suspensión en tampón de PBS tal como se describe en Lowman, H.B., "Phage Display of Peptide Libraries on Protein Scaffolds", en Cabilly, S. (ed.), Combinatorial Peptide Library Protocols (Humana Press Inc.: Totowa, NJ, 1988), págs. 249-264. A continuación se normalizaron los niveles de fago para dar una señal máxima en ELISA de 0,2 a 0,4 para cada mutante (Lowman, en Cabilly, S. (ed.), supra). Se prepararon diluciones en serie tres veces del competidor soluble en placas de microvaloración no absorbentes (Nunc, F, 96 pocillos) con tampón de enlace (TWEEN^{TM} al 0,5%/PBS) conteniendo fago en las condiciones determinadas anteriormente. El intervalo de dilución de la proteína competidora se amplió más de seis órdenes de magnitud, partiendo de 5 \muM para IGFBP-1 y 500 nM para IGFBP-3. Tras el bloqueo, las placas conteniendo la diana inmovilizada se lavaron con tampón TWEEN^{TM} 20 al 0,05%/PBS y posteriormente se incubaron con 80 \mul/pocillo de las soluciones fago/competidor pre-mezcladas durante 1 hora a temperatura ambiente. Tras el lavado, se detectó el fago ligado con 80 \mul/pocillo de una solución que contenía un anticuerpo policlonal primario anti-fago de conejo y un conjugado secundario anticuerpo-rábano picante monoclonal anti-conejo de cabra en TWEEN^{TM} 20 al 0,5%/PBS. Se utilizaron o-fenilendiamina (Sigma) y tetrametilbencidina (Kirkegaard y Perry) como sustratos cromógenos, dando como resultado la detección del producto a 492 y 450 nm, respectivamente. Se determinaron los índices IC_{50} ajustando los datos de enlace a una curva de saturación genérica (Lowman, en Cabilly, S. (ed.), supra). Por lo menos se analizaron dos clones individuales de cada mutante de IGF-I. En la Tabla I los números representan la media \pm desviación estándar de los índices IC_{50} evaluados individualmente.

Expresión y purificación de IGFBP-1 e IGFBP-3

Se expresó IGFBP-1 humana en células de CHO y se purificó en el medio acondicionado descrito por Mortensen et al., Endocrinology, 138: 2073-2080 (1997). También se ha clonado IGFBP-3 recombinante humana y expresado en células de mamífero (Wood et al., Endocrinology, 2: 1176-1185 (1988)). La purificación en el medio acondicionado siguió esencialmente el procedimiento descrito para IGFBP-1, con la utilización de una columna de afinidad a IGF (Martin y Baxter, J. Biol. Chem., 261: 8754-8760 (1986)).

Expresión y purificación de los mutantes solubles de IGF-I

El plásmido pBKIGF2B (patente U.S. nº 5.342.763) expresa el IGF-I natural humano fusionado en el péptido principal de lamB bajo el control del activador P_{pho}A. Para facilidad de la mutagénesis dirigida al punto se introdujo en el plásmido pBKIGF2B el fago f1 origen de la replicación (f1 ori). Para este fin se escidió un fragmento BamHI de 466 bp que contiene el f1 ori en pH0753 (Lowman et al., supra 1991), mientras que el plásmido pBKIGF2B se linealizó con EcoRI. El vector y el fragmento se trataron ambos con la enzima de Klenow para rellenar los salientes del punto de restricción antes de la ligadura al extremo truncado. Se seleccionaron las creaciones correctas según la capacidad para producir ADN fagómido de una sola cadena en presencia del fago colaborador M13VCS. El vector fagómido resultante se denominó pBKIGF2B-fl-ori y se utilizó como plantilla para construir los mutantes en ala de IGF-I de interés (véase Tabla II) utilizando el procedimiento de Kunkel et al., Methods Enzymol., 204: 125-139 (1991)). Cada etapa de mutagénesis se confirmó mediante secuenciado del ADN.

La expresión de los mutantes de IGF-I fue como la descrita para el IGF-I natural (Joly et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 95: 2773-2777 (1998)), pero sin sobreexpresión transitoria de oxidorreductasas. El procedimiento de purificación se basó en un protocolo anterior (Chang y Swartz, "Single-Step Solubilization and Folding of IGF-I Aggregates from Escherichia coli" in Cleland, J.L. (ed), Protein Folding in Vivo and in Vitro (American Chemical Society, Washington, DC, 1993), págs. 177-188), con adaptaciones menores. Normalmente, se volvieron a poner en suspensión 6 g de la pasta húmeda de células (equivalente a 2 litros de medio bajo en fosfato cultivado durante 24 h) en 150 ml de Tris HCl 25 mM pH 7,5 que contenía EDTA 5 mM. Se lisaron las células en un microfluidizador (Microfluidics Corp., Newton, MA) y se recogieron por centrifugación a 12.000 \times g las partículas refractarias que contenían agregados de IGF-I acumulados. Se lavaron dos veces las partículas refractarias con tampón de lisis, dos veces con tampón de lisis conteniendo N-lauroil-sarcosina (Sigma) al 1% para extraer las proteínas de la membrana y de nuevo dos veces con tampón de lisis. Se volvieron a poner en suspensión los cuerpos refractarios lavados en aproximadamente 2 mg/ml en tampón CAPS 50 mM (ácido 3-(ciclohexilamino)-1-propanosulfónico; Sigma) pH 10,4 que contenía urea 2 M, NaCl 100 mM, MeOH al 20% y DTT 2 mM. Este procedimiento combina la solubilización de los cuerpos refractarios y el posterior replegamiento oxidativo de los mutantes de IGF-I (Chang y Swartz, supra). Tras tres horas a temperatura ambiente se filtraron las soluciones de repleglamiento a través de las membranas del microconcentrador (Centricon, Amicon) con un corte en el peso molecular de 50 kDa. Se recuperó la mayor parte del IGF-I monomérico en el eluido, mientras se concentraban en lo retenido los contaminantes de mayor peso molecular. En este momento las fracciones de IGF-I eran >95% de pureza, según se interpreta a partir del análisis SDS-PAGE. Para separar correctamente el IGF-I unido al disulfuro del IGF-I procedente del intercambio del IGF (que contiene dos disulfuros no naturales; Hober et al., Biochemistry, 31: 1749-1756 (1992); Miller et al., Biochemistry, 32: 5203-5213 (1993)), se acidificaron las soluciones de replegamiento con ácido acético al 5% y se cargaron en una columna HPLC de semipreparación Dymamax^{TM} C18 (Varian; D.I. 10,0 mm) a 4 ml/min. Los tampones eran H_{2}O/TFA al 0,1% (A) y acetonitrilo/ TFA al 0,1% (B). La separación de los isómeros del disulfuro se consiguió aplicando el gradiente siguiente: 0 a 30% de B en 20 min, 30 a 45% de B en 60 min. La proporción de IGF-I natural a IGF-intercambio fue normalmente alrededor de 2:1 para cada mutante, eluyendo con IGF-intercambio antes en el gradiente que el IGF-I natural. Se comprobó la masa molecular de cada mutante por espectrometría de masas. Tras la purificación por HPLC, se liofilizaron las muestras y se redisolvieron en aproximadamente 1 mg/ml en tampón HEPES 100 mM, pH 7,4.

Mediciones con el biodetector cinético

Se determinaron las afinidades de enlace de las variantes de IGF para IGFBP-1 e IGFBP-3 utilizando un sistema de análisis por interacción cinética en tiempo real BIACORE^{TM} 2000 (Biacore, Inc., Piscataway, NJ) para medir los índices de asociación (k_{a}) y disociación (k_{d}). Se activaron los chips del biodetector de dextrano carboximetilado (CM5, BIAcore Inc.) con EDC (hidrocloruro de N-etil-N'-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida) y NHS (N-hidroxisuccinimida) según las instrucciones del proveedor. Para la inmovilización, se inyectaron en el chip del biodetector los mutantes de IGF en acetato de sodio 20 mM, pH 4,8, a un nivel de 50 \mug/ml para dar aproximadamente 450 a 600 RU (unidades de respuesta a la resonancia) de la proteína acoplada por enlace covalente. Se bloquearon los grupos sin reaccionar con una inyección de etanolamina 1 M. Se realizaron mediciones cinéticas, inyectando dos veces diluciones en serie (empezando en 1 \muM) de IGFBP-1 o IGFBP-3 en tampón de control (PBS, Tween 20 al 0,05%, ovoalbúmina al 0,1% y azida de sodio al 0,1%) a 25ºC utilizando un caudal de 20 \mul/min. Se calcularon los índices de asociación (k_{a}) y los índices de disociación (k_{d}) por separado utilizando un modelo de asociación de Langmuir^{TM} 1:1 en el programa informático de evaluación DIACOPE^{TM} v. 3.0. Se calculó la constante de disociación (K_{D}) como
k_{d}/k_{a}.

Resultados Exposición monovalente del fago de IGF-1

Para una exploración en alanina rápida y comprensible de los 70 restos de IGF-I se determinó en primer lugar si se podría exponer de forma monovalente la proteína en la superficie del fago M13 (Bass et al., Proteins, 8: 309-314 (1990)). La tecnología de exposición del fago combina la ventaja de la rápida mutagénesis del ADN de una sola cadena con una fácil purificación de la proteína mutante resultante, simplemente por aislamiento de las correspondientes partículas de fago (p. ej., Cunningham et al., 1994, supra). Se construyó un vector en el que se fusionó IGF-I maduro humano al dominio del terminal carboxi del gen III producto de M13. Esta creación incluye una secuencia con señal stII que dirige la proteína de fusión al espacio periplásmico de E. coli y permite la exposición monovalente de la proteína (Bass et al., supra; Lowman et al., supra, 1991). Con objeto de clonación se cambiaron el primer y último aminoácidos de IGF-I; se utilizó GIS-A70V mutante resultante como creación de plantilla para la posterior mutagénesis por exploración con alanina.

Cuando se aislaron G1S-A70V de IGF-1 que se exponen a las partículas de fago y se analizó su afinidad a las IGFBP por ELISA con fago de competencia de enlace los IC_{50} determinados en este experimento fueron 8,5 nM para IGFBP-1 y 0,5 nM para IGFBP-3 (Fig. 1). Estos valores están de acuerdo con las constantes de disociación determinadas por experimentos BIACORE^{TM} utilizando IGF-I natural (Heding et al., supra). Las afinidades de IGF-I natural determinadas por inmunoanálisis radioactivo (RIA) son \sim2,8 nM para IGFBP-1 y \sim0,8 nM para IGFBP-3, apoyando además los valores de IC_{50} procedentes del ELISA del fago. Además, las partículas de fago que se exponen a G1S-A70 V de IGF-1 fueron capturadas eficazmente por 11 anticuerpos anti-IGF-I de ratón monoclonales independientes inmovilizados en placas de microvaloración. Estos resultados sugieren conjuntamente que la variante de IGF expuesta se pliega correctamente y es accesible en la superficie de las partículas del fago.

Mutagénesis por exploración con Ala del enlace de IGF-I a IGFBP-1 e IGFBP-3

Todos los restos de G1S-A70V de IGF-I a excepción de las cuatro alaninas y seis cisteínas naturales fueron sustituidos uno a uno por alanina, utilizando el vector gIII de G1S-A70V de IGF-I como plantilla. Además, se construyeron los mutantes individuales S1G y V70A e IGF-I natural que restablecen la doble mutación. Cada una de estas creaciones se expresó en E. coli y fue expuesta al fago. Se determinaron los valores de IC_{50} para el enlace a IGFBP-1 e IGFBP-3 mediante ELISA competitivo del fago tal como se muestra en la Fig. 1. Se analizaron por lo menos dos clones diferentes de cada mutante. En la Tabla I se enumeran los valores resultantes de IC_{50} y en la Fig. 2 se representa gráficamente cada mutante con respecto a G1S-A70V.

TABLA I

1

TABLA I (continuación)

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2

La mayoría de los mutantes proporcionaron únicamente cambios menores en los valores de IC_{50} en el ELISA con fago. IGF-I natural presentó, de manera importante, las mismas afinidades a IGFBP-1 e IGFBP-3 que G1S-A70V en cuyo fondo se llevaron a cabo las sustituciones de alanina. (Tabla I, Fig. 2). Sólo unos pocos restos produjeron pérdidas considerables (> 10 veces) de afinidad cuando se cambiaron por alanina: E3, G7, L10, V11, F25, R36, P39, F49 y P63 para el enlace de IGFBP-1; V11, R36, R39 y P63 para el enlace de IGFBP-3. Se ha indicado que las sustituciones por ala de las glicinas y prolinas pueden conducir a perturbaciones estructurales del fondo de la proteína (Di Cera, Chem. Rev., 98: 1563-1591 (1998)).

Solamente unas pocas mejoras modestas en la afinidad del enlace se observaron por sustituciones de la alanina. S1A, D12A y D45A presentaban un aumento de aproximadamente el doble en el enlace de IGFBP-1, mientras que S35A y T41A presentaban un efecto similar para IGFBP-3. Sin embargo, cambios dobles en los valores de IC_{50} están en el límite de precisión de estos experimentos.

Determinantes de especificidad de IGFBP

E3A, G7A, L10A, F25A y F49 presentaron un efecto diferencial en el enlace a IGFBP-1 frente a IGFBP-3. Para estos cinco mutantes de IGF-I con una sola alanina el IC_{50} relativo para IGFBP-1 se diferenciaba en más de 4 veces de uno de IGFBP-3 (Fig. 2; Tabla I, especificidad relativa). E3A y F49A presentaron los mayores factores de especificidad relativa de este grupo. La sustitución de alanina de E3 no tuvo prácticamente ningún efecto sobre la afinidad de IGFBP-3 (1,4 veces), mientras que el enlace a IGFBP-1 se debilitó 34 veces. Aún más drástica, la afinidad de F49A se redujo más de 100 veces para IGFBP-1 pero sólo 3,6 veces para BP-3. Este resultado se ilustró en una comparación directa mediante el ELISA del fago. Se añadieron partículas de fago que se expusieron a F49A de IGF-I a pocillos recubiertos con IGFBP-3 en presencia de IGFBP-1 (Fig. 3A) o IGFBP-3 (Fig. 3B). En comparación con el fago de referencia que se expone a G1S-A70V de IGF-1, la curva de enlace de F49A se desplazó más de dos órdenes de magnitud en la competencia por IGFBP-1 (Fig. 3A). En cambio, las curvas de enlace fueron similares en la competencia por IGFBP-3 y los valores de IC_{50} se diferenciaron en menos de un factor de 4 (Fig. 3B). De esta manera, E3 y F49 son los dos determinantes de especificidad principales para el enlace de IGFBP-1 en la molécula de IGF-1.

Los restos G7, L10 y F25 parecían ser importantes para el enlace de ambos IGFBP, aunque presentando una pérdida más pronunciada de afinidad para IGFBP-1 que para IGFBP-3 cuando se sustituyen por alaninas. No se identificó ningún determinante de especificidad significativo para IGFB-3, como por ejemplo un enlace del mutante mucho más fuerte a IGFBP-1 que a IGFBP-3. Sin embargo, las mutaciones E9A, D12A, F23A, Y24A, T29A, S34A y D45A presentaron efectos ligeramente mayores (aproximadamente 2 veces) en el enlace de IGFBP-3 que en el de IGFBP-1.

Mediciones por BIACORE^{TM} de mutantes de IGF solubles purificados

Para la validación de los resultados obtenidos por ELISA del fago, se expresaron mutantes de alanina específicos y se purificaron para el análisis analítico utilizando un instrumento BIACORE^{TM}. Se determinó que la constante de disociación (K_{D}) de IGF-I natural era 13 nM para IGFBP-1 y 1,5 nM para IGFBP-3 (Figs. 5A y 5B; Tabla II). La diferencia de afinidad para las IGFBP se debe a una velocidad de asociación (k_{a}) 10 veces más rápida de IGF-I a IGFBP-3 (3,2 \times 10^{5} frente a 3,2 \times 10^{4} M^{-1}s^{-1}). Estos valores se corresponden bien con los valores absolutos de IC_{50} determinados por ELISA del fago (Figs. 1A y 1B; Tabla I). Como era de esperar, el mutante doble G1S-A70V presentó los parámetros cinéticos esencialmente indistinguibles de tipo natural (Tabla II).

Se examinaron V11A, R36A y P39A debido a que estas variantes no habían sido expuestas correctamente al fago, basándose en los experimentos de reconocimiento del anticuerpo (véase anteriormente). R36A y P39A presentaban cinéticas naturales para ambas proteínas de enlace, mientras que V11A presentó una reducción de 5 veces de afinidad tanto para IGFBP-1 como para IGFBP-3.

Además, se decidió examinar la variante T4A del IGF soluble. Este resto había estado implicado en el enlace de IGFBP en las primeras publicaciones (Bayne et al., supra, J. Biol. Chem., 263; Clemmons et al., supra, 1990), pero había presentado efectos molestos en los exámenes del fago en la presente memoria. El aumento en los valores de K_{d} de T4A en comparación con IGF-I natural fue aproximadamente 2 a 3 veces mayores que las relaciones IC_{50} determinadas mediante ELISA del fago (Tabla II). Se observó una discrepancia mayor entre los resultados obtenidos por el fago y los análisis del biodector para F16A. En este caso los dos procedimientos se diferenciaban en un factor de 4.

Se ha demostrado que las mutaciones en la primera zona \alpha-helicoidal presentan un efecto desestabilizante de la estructura de la proteína del IGF (Jansson et al., supra, 1997). Sin estar limitados por ninguna teoría, se cree que la proteína de fusión g3 en la superficie del fago puede ser más estable que la proteína soluble purificada, replegada. Esto se apoya en los resultados de BIACORE^{TM} obtenidos para F25A y F49A, dos restos localizados fuera de la hélice N-terminal estructuralmente sensible. Los cambios respectivos en K_{D} y los valores de IC_{50} están de excelente acuerdo para estos dos mutantes (Tabla II). Se confirmó el efecto diferencial de F49A en el enlace a las IGFBP por análisis BIACORE^{TM}. Se midió una disminución de afinidad de 70 veces para el enlace de IGFBP-1 (Fig. 5C; Tabla II), mientras que el enlace de IGFBP-3 se redujo solamente 4 veces (Fig. 5D; Tabla II).

TABLA II

3

Función de los restos N-terminales de IGF-I

Sorprendentemente, la interacción de IGFBP-3 estuvo mucho menos afectada por las sustituciones de alanina que la interacción con IGFBP-1, a pesar del hecho de que IGFBP-3 se une a IGF-1 con una afinidad aproximadamente 10 veces mayor. Aparte de P63A, ningún mutante de alanina presentó una reducción > 6 veces en la afinidad a IGFBP-3 (Figura 2 y Tabla 1).

Se había demostrado anteriormente en los experimentos con el biodetector que des(1-3)-IGF-I se une a IGFBP-3 con una afinidad reducida 25 veces (Heding et al., supra). Esta forma natural de IGF-I carece de los tres primeros restos N-terminales y presenta una potencia mitógena aumentada, debido supuestamente a su reducción en el enlace de IGFBP (Bagley et al., supra). Ya que ninguna de las tres primeras cadenas laterales de aminoácidos parecen contribuir con ninguna energía al enlace de IGFBP-3 (Tabla I) pero no obstante des(1-3)-IGF-I está comprometido en el enlace de IGFBP-3, sin limitarse por ninguna teoría, se supone que pueden estar implicadas las interacciones del eje
central.

Esta hipótesis se probó exponiendo el fago a un mutante triple de alanina (Ala(1-3)-IGF-I), sustituyendo los tres primeros aminoácidos N-terminales. Si el eje central en esta zona contribuye a la interacción con IGFBP-3 este mutante debería poder unirse. El enlace a IGFBP-I, sin embargo, debería reducirse debido a la carencia de la cadena lateral de E3 (Tabla 1). Como referencia se generó el mutante des(1-2)-IGF-I, examinando algunas interacciones potenciales del eje central con IGFBP-1 en las posiciones 1 y 2. Como era de esperar, Ala(1-3)-IGF-I presentó una afinidad a IGFBP-1 disminuida similar a E3A pero ningún cambio en la afinidad a IGFBP-3 (Tabla 1; Fig. 2). Para des(1-2)-IGF-I, no se observó ninguna diferencia de afinidad para ambas proteínas del enlace. Combinados con las observaciones en des(1-3)-IGF-I (Heding et al., supra), estos resultados sugieren, sin limitación por ninguna teoría, que el eje central del péptido entre el resto 3 y 4 de IGF-I media importantes interacciones con IGFBP-3.

Exposición

Los epítopos de enlace funcionales de IGFBP-1 e IGFBP-3 en la superficie de IGF-1 han sido probados por mutagénesis de exploración con alanina. Ambos epítopos de enlace se ilustran en la Figura 6. Las interacciones individuales de la cadena lateral de IGF-I desempeñan una función mucho más importante en el enlace a IGFBP-1 que a IGFBP-3. Se observan dos parches de enlace principales para IGFBP-1 (Fig. 6A). Uno está situado en la cara superior de la hélice N-terminal (compuesto de G7, L10, V11, L14, F15, 143 y V44) y uno en la cara inferior (compuesto de E3, T4, L5, F16, V17 y L54). Estos dos parches de enlace forman un puente con F49 y R50. Para IGFBP-3, el epítopo de enlace es más difuso y se ha desplazado para incluir G22, G23 e Y24 (Fig. 6B). El enlace de IGFBP-3 es generalmente mucho menos sensible a las sustituciones de alanina. De hecho, la mayor reducción en la afinidad (aparte de P63A, véase a continuación) es una disminución de 6 veces observada en G7A. Este resultado es intrigante ya que IGFBP-3 se une con una afinidad 10 veces mayor a IGF-I que IGFBP-1. Lo más probable, sin limitación por ninguna teoría, es que las interacciones que se originan procedentes del eje central de la cadena principal de IGF-I están contribuyendo al enlace de IGFBP-3. Esta hipótesis está además sustentada por los experimentos con el mutante Ala(1-3)-IGF. Mientras que las sustituciones simples y triples de alanina no presentan ningún efecto sobre el enlace de IGFBP-3, la deleción de los tres primeros aminoácidos produjo una disminución de afinidad de 25 veces (Bagley et al., supra; Clemmons et al., supra, 1992; Heding et al., supra). En resumen, IGF-I utiliza diferentes modos de enlace para asociarse a IGFBP-1 e IGFBP-3: unas pocas interacciones de la cadena lateral de aminoácidos son importantes para el enlace a IGFBP-1, mientras que las interacciones del eje central parecen desempeñar una función energética mayor para el enlace a IGFBP-3.

Una publicación reciente ha investigado el epítopo de enlace en IGF-I para IGFBP-1 por espectroscopía de RMN heteronuclear (Jansson et al., supra, 1998). Los autores observaron que los restos 29, 30, 36, 37, 40, 41, 63, 65 y 66 de IGF-I entre otros experimentaban perturbaciones de desplazamiento químico en el acomplejamiento con IGFBP-1 a 30ºC. Además, Jansson y colaboradores identificaron que R36, R37 y R50 forman parte del epítopo de enlace operativo y examinaron estos mutantes de alanina en experimentos con BIACORE^{TM}. El mayor cambio de afinidad observado por estos autores fue una disminución de 3 veces para R50A. Sin embargo, debido a la flexibilidad estructural de IGF-I ya observada en el primer estudio por RMN de la hormona (Cooke et al., supra), Jansson et al. fueron capaces de asignar completamente muchos restos en el espectro por RMN, incluyendo R49.

En estudios similares de las interfases proteína-proteína se observó que solamente unos pocos restos con cadena lateral contribuyen a la mayor parte de la energía libre de enlace (Clackson y Wells, Science, 267: 383-386 (1995); Kelley et al., Biochemistry, 34: 10383-10392 (1995)). Se cree que lo mismo es cierto para la interacción IGF-IGFBP-1. Sin embargo, aquí, como se indicó para el factor del tejido que se une al factor VIIa, la magnitud de los valores de la energía libre de enlace (\Delta\DeltaG) procedentes de las cadenas laterales importantes es más pequeño que en el caso de la hormona de crecimiento (Kelley et al., supra). Los restos con contribuciones predominantes de \Delta\DeltaG no se agruparon en la superficie de IGF-I como en la interfase hormona de crecimiento-receptor (Clackson y Wells, supra), sino que aún formaron un epítopo de enlace continuo de IGFBP-1 (Fig. 6A). En cambio, el epítopo de enlace de IGFBP-3 en IGF-I fue discontinuo y las cadenas laterales contribuyeron con energías de enlace individuales muy modestas.

La sustitución de P63 por alanina en IGF-I produce una disminución de afinidad para ambas proteínas de enlace que no se puede medir en el intervalo de nivel utilizado en los ELISA de competencia del fago. Sin embargo, el resto P63 está situado en el lado opuesto de la molécula de IGF-I con respecto al epítopo de enlace principal. Además, se ha indicado que las sustituciones con alanina de las glicinas y prolinas pueden conducir a cambios estructurales (Di Cera, supra). Además, Jansson et al., 1998, supra, llegaron a la conclusión de que la parte C-terminal de IGF-I no está implicada en los contactos directos de IGFBP-1, sino que más bien experimentan cambios conformacionales indirectos en la formación del complejo. Una caracterización extensiva de los puntos de enlace del anticuerpo en IGF-I ha sido realizada por Mañes et al., Endocrinology, 138: 905-915 (1997). Ellos demostraron el enlace simultáneo de IGFBP-1 o -3 a IGF-I en el complejo con anticuerpos que reconocen el dominio D del C-terminal. Estos resultados apoyan además las primeras observaciones de que el dominio D, que comienza en el resto P63, no está implicado en el enlace de IGFBP-1 o -3 (Bayne et al., supra, 1988).

La principal discrepancia entre la relación de IC_{50} obtenida por ELISA del fago y un resultado de BIACORE^{TM} se observó con el resto F16. Como ya se mencionó la sustitución de este resto por alanina produjo cambios estructurales en la molécula de IGF-I (Jansson et al., supra, 1997). El mismo efecto se observó con la K_{D} en los resultados de BIACORE^{TM}, pero la disminución de afinidad fue menos pronunciada en los experimentos por ELISA del fago (véase Tabla II). Ambas mediciones por BIACORE^{TM} utilizaron IGF-F16A que se había replegado durante el procedimiento de purificación (Jansson et al., supra, 1997). En la exposición del fago, sin embargo, la proteína de interés se transpone de forma natural por el sistema de secreción de E. coli. La abundancia baja de proteína en la exposición monovalente al fago (<1 molécula por partícula de fago) puede desfavorecer la agregación y plegamiento erróneo. Además, la fusión de IGF-I a la proteína truncada del fago g3 puede ejercer un efecto estabilizante en la estructura natural del péptido.

La mayoría de IGF-I en la circulación se observa en el complejo con IGFBP-3 y una tercera proteína denominada subunidad lábil al ácido (ALS) (Bach y Rechler, supra; Clemmons, Cytokine Growth Factor Rev., 8, 45-62 (1997); Jones y Clemmons, supra). Este complejo ternario de peso molecular 150 kD no puede atravesar las paredes de los vasos sanguíneos y actúa como una reserva circulante para los IGF. Mediante este mecanismo la vida media de IGF-I disminuye drásticamente (Simpson et al., Growth Horm IGF Res, 8: 83-95 (1998)). Los niveles de IGFBP-3 son regulados de forma positiva por IGF-1. La función de IGFBP-1, en cambio, está menos clara. Esta clase de proteínas de enlace generalmente es menos abundante que IGFBP-3, y sus niveles son regulados de forma negativa por la insulina (Bach y Rechler, supra; Clemmons, supra, 1997; Jones y Clemmons, supra).

Basándose en los resultados de la presente memoria, se obtienen las variantes específicas para IGFBP de IGF-1. La combinación de varias mutaciones de alanina genera una variante que se une a IGFBP-1 muy débilmente mientras que conserva el enlace de alta afinidad de IGFBP-3. El diseño de las variantes específicas de IGFBP-1 que no se unen ya a IGFBP-3, puede implicar la presentación del fago de IGF-1 y la aleatorización de los aminoácidos en posiciones específicas (Cunningham et al., 1994, supra; Lowman y Wells, J. Mol. Biol., 243: 564-578 (1993)).

Conclusión

Se han identificado los restos en IGF-I importantes para el enlace a IGFBP-1 e IGFBP-3. Se observó que varios restos determinan la especificidad de enlace de un determinado IGFBP. Publicaciones recientes (Loddick et al., supra; Lowman et al., Biochemistry, supra, 1998)) han descrito estudios animales en los que se generaron grupos de IGF-I "libre" biodisponible aumentados por desplazamiento del IGF-I endógeno de las proteínas de enlace. Las variantes de IGF-I específicas de IGFBP se pueden utilizar para diagnóstico y terapia tal como se describe en la presente memoria.

Ejemplo 2 Caracterización de determinados mutantes con respecto al tratamiento de trastornos renales Construcción de mutantes de IGF-I

En el Ejemplo 1 (y en Dubaquie y Lowman, Biochemistry, 38: 6386 (1999)) se identifican los mutantes de IGF-I en los que se redujo la afinidad de enlace a IGFBP-1, IGFBP-3 o ambas proteínas de enlace. En particular, la mutagénesis por exploración con alanina de IGF-I identificó ácido glutámico 3 (E3) y fenilalanina 49 (F49), así como fenilalanina 16 (F16) y fenilalanina 25 (F25) en algún grado, como determinantes de especificidad para el enlace a IGFBP-1. Los resultados de la exploración con alanina de la presentación del fago sugirieron que ambas cadenas laterales en las posiciones 3 y 49 contribuyen selectivamente con considerable energía de enlace a la formación del complejo con IGFBP-1 (pérdida de afinidad de \sim30 veces para E3A, \sim100 veces para F49A), mientras que su contribución a la energía de enlace para IGFBP-3 no es detectable (E3A) o menor (\sim4 veces para F49A) (véase Ejemplo 1 y Dubaquié y Lowman, supra).

Se podía alcanzar probablemente más especificidad mejorada para IGFBP-3 por mutación acumulada de IGF-I, porque los efectos de las mutaciones puntuales son a menudo aditivos con respecto a su contribución a la energía libre de enlace (Wells, Biochemistry 29: 8509 (1990)). Por consiguiente, se construyó un mutante doble de IGF-I, E3A/F49A, combinando las mutaciones puntuales de E3A y F49A en una sola molécula. Aunque F16A presentaba un pequeño efecto de especificidad a IGFBP (Ejemplo 1 y Dubaquie y Lowman, supra), se construyó también el mutante doble F16A/F49A.

Asimismo se construyó un nuevo mutante puntual de IGF-1, Y31C, conteniendo un único supuesto cisteinil tiol desemparejado, para facilitar la inmovilización específica en el punto de IGF-I para los ensayos de enlace. Se seleccionó Y31C porque está fuera de los epítopos de enlace para IGFBP-1 e IGFBP-3 (Dubaquie y Lowman, supra). Esta técnica de inmovilización asegura una población uniforme del ligando (Cunningham y Wells, J. Mol. Biol., 234: 554 (1993)) para el enlace por el analito inyectado (es decir., la proteína de enlace IGF). La ventaja de este procedimiento sobre el acoplamiento de la amina empleado anteriormente es que el terminal N de IGF-I no está bloqueado y libre de los enlaces amina potenciales para la matriz del chip. Esto puede ser especialmente importante para los análisis de enlace de IGFBP-1, que se cree que interactúan con las cadenas laterales del terminal N de IGF-1 (Dubaquie y Lowman, supra). Y31C expuesto al fago presentaba afinidades de tipo natural tanto para IGFBP-1 como para IGFBP-3, apoyando la idea de que la zona alrededor del resto 31 es importante en el enlace del receptor, pero no forma ningún contacto con las proteínas de enlace (Bayne et al., J. Biol. Chem., 264: 11004 (1988), supra; Bayne et al., J. Biol. Chem., 265: 15648 (1989), supra).

Se expresaron, purificaron y replegaron variantes de IGF-1 con una sola alanina, incluyendo F49A, así como el mutante doble E3A/F49A para dar el isómero de disulfuro apropiado como se deduce del análisis por HPLC (Ejemplo 1 en la presente memoria y Dubaquié y Lowman, supra). Estas variantes fueron examinadas en ensayos de enlace específico- enlace de proteína y de activación del receptor.

Afinidad de enlace de IGFBP-1 e IGFBP-3

Las afinidades de enlace de estas variantes para IGFBP-1 e IGFBP-3 se compararon con las del IGF-1 natural utilizando análisis por BIACORE^{TM}. Se realizaron experimentos cinéticos con enlace de IGFBP-3 a IGF-I inmovilizado o variantes (Tabla III) tal como se describe en el Ejemplo 1 y en Dubaquié y Lowman, supra, y se compararon con IGF-I de F49A e IGF-I natural. En este análisis, el mutante doble E3A/F49A fue aproximadamente 20 veces más débil en la afinidad de enlace a IGFBP-3 que el tipo natural y el mutante doble F16A/F49A fue aproximadamente 66 veces más débil (Tabla III).

TABLA III

4

Para las mediciones del enlace de IGFBP-1 a IGF-I, se realizaron experimentos cinéticos utilizando una variante de IGF-I con una sola cisteína, Y31C, que se inmovilizó en la superficie del chip del detector mediante un enlace disulfuro (BIACORE^{TM} System Manual Supplement, 5a-1, Pharmacia (1991)). Los resultados son coherentes (Tabla IV) con la afinidad de enlace medida utilizando IGF-I natural inmovilizado por acoplamiento no específico de la amina al chip del biodetector (Ejemplo I y Dubaquié y Lowman, supra).

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TABLA IV

5

El enlace de F49A y E3A/F49A a IGFBP-1 fue demasiado débil para mediciones cinéticas exactas. Por consiguiente, se realizó un análisis de enlace competitivo (documento WO 98/45427 publicado el 15 de octubre de 1998) para estimar las correspondientes afinidades. Se utilizó la variante de IGF-I con una sola cisteína, Y31C, la cual se inmovilizó en una superficie del chip del biodector BIACORE^{TM} como se describió anteriormente. Los experimentos competitivos de enlace que dan valores (IC_{50}) de nivel inhibidor máximos de la mitad se realizaron de la forma siguiente: IGFBP-1 50 nM se incubó con una serie de dilución de la variante de IGF deseada. Estas soluciones de la mezcla de proteína se incubaron a 5 \mul/min en un chip B1 que contenía Y31C de IGF-1 acoplado a la cisteína (200 unidades de respuesta). Se determinó la cantidad de IGFBP-1 unido sustrayendo el enlace no específico después de una inyección de 20 minutos y se representó frente al nivel de la variante de IGF (Fig. 7). Los resultados se presentan en la Tabla V.

TABLA V

6

En comparación con IGF-1 natural, F49A y E3A/F49A han disminuido gravemente las afinidades de enlace para IGFBP-1. F49A se unió a IGFBP-1 con un IC_{50} de 1,6\pm0,2 \muM (Tabla V), conservando una constante de disociación de alta afinidad (K_{D}) de 6,3\pm1,7 nM para IGFBP-3 (Tabla III). Se observó que el enlace de E3A/F49A a IGFBP-1 era aún más débil, con un IC_{50} estimado de 64\pm9 \muM (Tabla V), mientras que presentaba solamente afinidad moderadamente reducida (K_{D}= 22,2\pm10,3 nM) para IGFBP-3 (Tabla III). Estas mediciones in vitro sugieren que ninguna variante de IGF se asociaría de forma estable con IGFBP-1 en condiciones fisiológicas.

Ensayos KIRA de activación del receptor de IGF tipo I

El ensayo de activación del receptor de cinasa (KIRA) controla específica y cuantitativamente el alcance de la fosforilación del receptor citoplásmico del receptor IGF en la estimulación extracelular por el ligando (Sadick et al., J. Pharm. Biomed. Analysis, 19 (6): 883-891 (1998)). Se analizaron varias variantes de IGF, G1S/A70V, T4A, V11A, F16A, F25A, F16A/F49A, R36A, P39A y F49A, en ensayos de activación del receptor de un solo nivel. Las afinidades de enlace de IGFBP-1 e IGFBP-3 de estas variantes, excepto para F16A/F49A, se indican en la Tabla II y en Dubaquié y Lowman, supra. La Tabla VI resume las afinidades y especificidades relativas para las mediciones por BIACORE^{TM}.

Para el ensayo KIRA, se estimaron aproximadamente los niveles de la variante a 13 nM ("nivel alto") o a 1,3 nM ("bajo nivel"), basándose en las mediciones de densidad óptica. La señal obtenida para cada variante de IGF se comparó con la de las series de dilución patrón de IGF-I natural y se publicó desde el punto de vista de un nivel aparente de IGF-I correspondiente con la actividad observada en el ensayo KIRA (Figs. 8A a 8B). Aunque no se midieron las potencias relativas exactas, estos resultados demuestran que todos los mutantes analizados mantienen la capacidad para activar el receptor de tipo I de IGF.

TABLA VI

7

La Tabla VI demuestra que, además de F49A, F16A y F25A están ambos sustancialmente reducidos en la afinidad para IGFBP-1, pero menos de este modo para IGFBP-3. Ambos conservan todavía la actividad biológica basada en los ensayos KIRA (Fig. 8).

Para la determinación de la potencia relativa de F49A y de E3A/F49A, se midió su capacidad para activar el receptor de IGF tipo I utilizando diluciones en serie en ensayos KIRA. Como se presenta en las Figs. 9A a 9B, tanto F49A como E3A/F49A presentan curvas de activación del receptor de IGF que son indistinguibles del IGF-I natural. Los niveles eficaces máximos de la mitad (EC_{50}) fueron 20,0\pm1,3 ng/ml para F49A, 19,8\pm0,5 ng/ml para E3A/F49A, y 18,9\pm0,2 ng/ml y 19,8\pm0,6 ng/ml para IGF-I de tipo natural. Estos resultados sugieren firmemente que ambos mutantes de IGF son completamente biológicamente activos.

Depuración de la sangre y acumulación renal de las variantes de IGF-I en ratas

La acumulación de moléculas de IGF activas en el riñón podría ser potencialmente beneficiosa en la insuficiencia renal crónica o aguda. Estos estados patológicos se caracterizan por niveles anormalmente elevados de IGFBP-1 e IGFBP-2, combinadas con una reducción de la síntesis de IGF-I, conduciendo finalmente al catabolismo celular (Tönshoff et al., supra, 1997).

Para evaluar las propiedades farmacológicas preliminares de IGF-I de F49A y de E3A/F49A, se radiomarcaron ambas proteínas y se administraron por vía intravenosa a ratas. La Figura 10A presenta un ciclo de tiempo de la velocidad a la que ambas moléculas se purifican en la sangre de los animales. Como es de esperar debido a sus afinidades de IGFBP disminuidas, ambas variantes se depuraron a una velocidad más rápida en comparación con el IGF-1 humano natural. Es interesante que el mutante doble (E3A/F49A) se depuró más rápido que el mutante simple (F49A), correlacionándose bien con las respectivas afinidades para la proteína de enlace principal en el suero, IGFBP-3 (Tabla III). La Figura 10B presenta la proporción tejido a sangre para las variantes de IGF en diferentes órganos. La mayoría de las moléculas de IGF marcadas por radioactividad se detectaron en el riñón, mientras que los niveles de radioactividad en el hígado, bazo, corazón y páncreas fueron mucho menores. Es evidente que las variantes F49 y E3A/F49A se acumulan a niveles estadísticamente significativos más elevados en el riñón en comparación con IGF-I natural.

Análisis del decroísmo circular de las variantes de IGF-I

Se analizaron los espectros del IGF-1 de F49A y E3A/F49A para probar si las mutaciones introducidas producen cambios mayores en la estructura de la proteína. La desestabilización estructural podría conducir a un aumento de sensibilidad proteolítica, proporcionando una explicación alternativa para las velocidades de depuración de la sangre más rápidas de las variantes de IGF. Como se demuestra en la Fig. 11, sin embargo, ambos mutantes tienen espectros prácticamente idénticos al registrado para el IGF-I natural. Los espectros CD ponen de manifiesto los elementos tanto de la hélice á como de la espiral aleatoria, como es de esperar a partir de la espectroscopía por RMN de IGF-I (Cooke et al., Biochemistry, 30: 5484, (1991)). La estabilidad térmica de IGF-I no se pudo determinar con precisión por dicroísmo circular, debido supuestamente al contenido relativamente alto (\sim30%) de espiral aleatoria (Jansson et al., Biochemistry, 36, 4108 (1997)) ya presente a temperatura ambiente. El hecho de que los espectros CD de ambas variantes no presentaban desviación significativa en el IGF-I natural es una indicación de que las mutaciones introducidas no alteran la estructura general del IGF-I.

Conclusión

A partir de las pruebas presentadas anteriormente, sería de esperar que los mutantes simples y dobles de IGF-I F16A, F16G, F16S, F25A, F25G, F25S, F49A, F49G, F49S, E3A/F49A, E3A/F49G, E3G/F49A, E3G/F49G, E3A/
F49S, E3S/F49A, E3S/F49S, E3G/F49S, y E3S/F49G serían eficaces para el tratamiento de un trastorno caracterizado por la disregulación en los ejes GH/IGF, ya que los mutantes sustituidos con alanina presentan una afinidad reducida para IGFBP-1 sin pérdida sustancial de capacidad para unirse a IGFBP-3 y son biológicamente activos en base a muchos análisis. Además, es de esperar que dichos mutantes sean eficaces en el tratamiento de los trastornos renales ya que F49A y E3A/F49A se acumulan en niveles estadísticamente más significativos en el riñón en comparación con el IGF-I natural y en comparación con otros órganos, ya que los mutantes sustituidos con alanina solamente se unen de manera débil y existe un aumento de la expresión génica de IGFBP-1 e IGFBP-2 en la uremia experimental (Tönshoff et al., supra, 1997).

Ejemplo 3 Tratamiento de pacientes humanos

Este ejemplo presenta el principio de cómo un péptido administrado por vía exógena que se une a uno o más de las IGFBP actúa desplazando los IGFs endógenos y cómo dosificar un péptido en la presente memoria para su utilización en pacientes humanos.

En este estudio se administró a diabéticos humanos tipo II IGF-I humano recombinante o placebo mediante inyección dos veces al día en cuatro dosis (10, 20, 40 u 80 \mug/kg) durante 12 semanas. Se extrajeron muestras de sangre, antes, cada dos semanas y después (EP) de 12 semanas de tratamiento. Se midieron los niveles de IGF-I, IGF-II e IGFBP-3 en todas las muestras, a excepción de IGF-II que no se midió en las muestras extraídas de los pacientes tratados con 10 \mug/día de IGF-I.

La Figura 43 del documento WO 98/45427 presenta los niveles de IGF-I en la sangre de los pacientes. El descubrimiento inesperado fue el efecto "meseta" de la administración de 40 y 80 \mug de IGF-I; el mismo nivel total en sangre de IGF-I se alcanzó con estas dos dosis.

La Figura 44 del documento WO 98/45427 presenta los niveles de IGF-II en la sangre de los pacientes. En contraste con el aumento de niveles de IGF-I, los niveles de IGF-II descienden en casi un modelo de imagen en el espejo con el aumento en los niveles de IGF-I. Como en el efecto meseta del aumento de niveles de IGF-I, la disminución de los niveles de IGF-II también alcanzó una meseta.

La Figura 45 del documento WO 98/45427 presenta los niveles de IGFBP-3 en la sangre de los pacientes. En contraste con los cambios evidentes en los modelos de IGF-I e IGF-II en la sangre, los niveles de IGFBP-3 no presentaban un modelo de cambio claro o estadísticamente significativo.

La inspección de las figuras 43 y 44 del documento WO 98/45427 pone de manifiesto que los niveles de IGF totales (IGF-I más IGF-II) presentaron pocos cambios con el tratamiento. Esto era debido al aumento en los niveles de IGF-I estrechamente compatibles con la disminución del nivel de IGF-II. La inspección de las tres figuras demuestra que los cambios relacionados con la dosis en los niveles de IGF-I e IGF-II en la sangre fuera de los pacientes no fueron acompañados por una capacidad reducida de proteína de enlace IGFBP-3 (IGFBP-3 es la principal proteína de enlace en la sangre).

La explicación obvia para la disminución del nivel de IGF-II y del efecto meseta de los niveles de IGF-I e IGF-II, es que existe una cantidad finita de capacidad de la proteína de enlace a IGF y en este experimento las dosis de IGF-I utilizadas produjeron un desplazamiento de IGF-II relacionado con la dosis de las proteínas de enlace.

Una ampliación lógica de las observaciones de este Ejemplo consiste en esperar que cualquier molécula con capacidad para aumentar los niveles de IGF activo presentaría actividades similares a las mostradas para IGF-I en este Ejemplo. Además, a partir de las dosis de IGF-I utilizadas en los niveles de IGFBP, IGF-I e IGF-II demostrados, es sencillo calcular cuánto péptido se debería administrar para aumentar los niveles de IGF endógeno activo. El tamaño molar correspondiente a IGF-I, la afinidad del péptido para la IGFBP y su biodisponibilidad serían otras variables consideradas para llegar a las dosis que aumentan el IGF activo en un ser humano.

La presente invención tiene necesidad de ser expuesta en la presente memoria con relación a determinados procedimientos y materiales específicos. Debe entenderse que la exposición de estos procedimientos y materiales específicos no constituye de ninguna manera ninguna limitación del alcance de la presente invención, que se extiende a alguno y todos los materiales y procedimientos alternativos adecuados para llevar a cabo los objetivos de la presente invención.

<110> GENENTECH, Inc.

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<120> VARIANTES DE PROTEÍNA

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<130> P1712R1-1PCT

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<141> 2000-01-05

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<160> 6

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<210> 1

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<211> 70

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 1

8

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<210> 2

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<211> 86

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 2

9

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<210> 3

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<211> 51

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<212> PRT

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<213> Homo Sapiens

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<400> 3

10

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<210> 4

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<211> 38

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<221> Artificial

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<222> 1-38

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<223> Cebador sintetizado

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

agctgctttg atatgcatct cccgaaactc tgtgcggt

\hfill

38

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<210> 5

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<211> 37

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<221> Artificial

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<222> 1-37

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<223> Cebador sintetizado

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

gagcgatctg ggtctagaca gatttagcgg gtttcag

\hfill

37

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<210> 6

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Artificial

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<220>

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<221> Artificial

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<222> 1-24

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<223> Oligonucleótido sintetizado

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaaagggtat gtagaggttg aggt

\hfill

24

Claims

1. Variante de IGF-I, en la que el resto de aminoácido en la posición 49 del IGF-I humano con secuencia natural está sustituido con un resto de alanina o de glicina.

2. Variante según la reivindicación 1, en la que el resto de aminoácido en la posición 49 del IGF-I humano con secuencia natural está sustituido con un resto de alanina.

3. Composición que comprende la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 en un portador.

4. Composición según la reivindicación 3, que comprende además una molécula activa para el riñón.

5. Composición según la reivindicación 3 ó 4, en la que el portador está esterilizado.

6. Utilización de la variante según cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2 o de la composición según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 5, para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un trastorno caracterizado por la disregulación de los ejes GH/IGF en un mamífero que comprende la administración al mamífero de una cantidad eficaz de dicha variante.

7. Utilización según la reivindicación 6, en la que el trastorno es un trastorno hiperglucémico, un trastorno renal, insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia hepática, nutrición escasa, síndrome de emaciación o un estado catabólico en el que los niveles de IGFBP-1 aumentan en comparación con dichos niveles en un mamífero sin dicho trastorno.

8. Utilización según la reivindicación 7, en la que el trastorno es un trastorno renal.

9. Utilización según la reivindicación 8, en la que el trastorno renal es una insuficiencia renal crónica o aguda.

10. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en la que además se debe administrar al mamífero una cantidad eficaz de una molécula activa para el riñón.

11. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, en la que el mamífero es un ser humano.

12. Kit que comprende un recipiente que contiene la composición farmacéutica que contiene la variante de las reivindicaciones 1 ó 2 e instrucciones que orientan al usuario a utilizar la composición para el tratamiento de un trastorno caracterizado por la disregulación de los ejes GH/IGF en un mamífero.

13. Kit según la reivindicación 12, en el que el trastorno es un trastorno hiperglucémico, un trastorno renal, insuficiencia cardíaca congestiva, insuficiencia hepática, nutrición escasa, síndrome de emaciación o un estado catabólico en el que los niveles de IGFBP-1 aumentan en comparación con dichos niveles en un mamífero sin dicho trastorno.

14. Kit según la reivindicación 13, en el que el trastorno es un trastorno renal.

15. Kit según la reivindicación 14, en el que el trastorno renal es una insuficiencia renal crónica o aguda.

16. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 15, que comprende además un recipiente que contiene una molécula activa para el riñón.

17. Kit según cualquiera de las reivindicaciones 12 a 16, en la que el mamífero es un ser humano.

18. Procedimiento para la preparación de un medicamento destinado al tratamiento de un trastorno caracterizado por la disregulación de los ejes GH/IGF en un mamífero, estando dicho procedimiento caracterizado por la utilización, como constituyente esencial de dicho medicamento, de una variante de IGF-I tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2.