PL219335B1

PL219335B1 - Pochodna insuliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól, jej zastosowanie oraz zawierająca ją kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL219335B1
Application number: PL385586A
Authority: PL
Inventors: Piotr Borowicz; Andrzej Płucienniczak; Jerzy Mikołajczyk; Tadeusz Głąbski; Dariusz Kurzynoga; Diana Mikiewicz-Syguła; Anna Wojtowicz-Krawiec; Marcin Zieliński; Małgorzata Kęsik-Brodacka; Violetta Adamczewska-Cecuda; Iwona Sokołowska; Grażyna Płucienniczak; Dorota Stadnik; Jarosław Antosik; Jacek Pstrzoch; Justyna Bernat; Wojciech Sławiński; Tomasz Pawlukowiec; Jacek Stępniewski; Monika Bogiel
Original assignee: Inst Biotechnologii I Antybiotyków
Priority date: 2008-07-04
Filing date: 2008-07-04
Publication date: 2015-04-30
Also published as: WO2010002283A3; EA201170149A1; EP2321344A2; PL2371853T3; EP2371853A3; PL385586A1; EP2371853A2; JP2011526886A; CN102083855A; CA2729938C; CA2729938A1; EA023559B1; US20140121353A1; WO2010002283A9; US8618048B2; WO2010002283A2; EP2371853B1; US20110136736A1

Abstract

Ujawniono nowe biosyntetyczne analogi rekombinowanej insuliny ludzkiej o przedłużonym działaniu terapeutycznym, które mogą znaleźć zastosowanie w profilaktyce i terapii cukrzycy.

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe biosyntetyczne analogi rekombinowanej insuliny ludzkiej o przedłużonym działaniu terapeutycznym lub ich farmaceutycznie dopuszczalne sole, które mogą znaleźć zastosowanie w profilaktyce i terapii cukrzycy, zawierająca je kompozycja farmaceutyczna oraz ich zastosowanie do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania cukrzycy.

Insulina i jej rozmaite pochodne są stosowane w dużych ilościach w leczeniu cukrzycy i często wytwarzane w dużej skali przemysłowej. Chociaż znanych jest wiele różnych modyfikowanych pochodnych insuliny i preparatów farmaceutycznych o różnych profilach działania, to stale poszukiwany jest lek, dzięki któremu możliwe byłoby utrzymywanie stałego poziomu glukozy w organizmie ludzkim w ciągu długiego okresu czasu.

Dla osiągnięcia efektu opóźnionego i/lub przedłużonego działania niektóre preparaty zwykłej insuliny ludzkiej zawierają specyficzne dodatki, np. różne ilości protaminy, białka tworzącego z insuliną nierozpuszczalny kompleks osadzający się w tkance podskórnej, z którego stopniowo uwalnia się insulina.

W terapii cukrzycy znane są różne pochodne insuliny ludzkiej zawierające dodatkowe aminokwasy lub zmienioną sekwencję niektórych aminokwasów. Zmiany pierwszorzędowej struktury insuliny wpływają na jej strukturę drugo- i trzeciorzędową, które wywołują zmiany właściwości chemicznych i biologicznych, a te z kolei wywołują efekty farmakokinetyczne i farmakodynamiczne. Zmiany te mają różny charakter, prowadzą do przyspieszania lub opóźniania i przedłużania działania podawanej zmodyfikowanej insuliny. Aktywną formą insuliny jest postać monomeryczna, która łatwo przenika do krwi po iniekcji podskórnej. Jak wiadomo egzogenna insulina ludzka ma w roztworze postać heksameryczną, która po podaniu dysocjuje na dimery i następnie monomery przed przeniknięciem do krwioobiegu. Do pochodnych insuliny o przyśpieszonym działaniu należą lispro-insulina (Humalog®), w której sekwencja prolina(28)-lizyna(29) w łańcuchu B została odwrócona. Ze względów sterycznych utrudnia to tworzenie dimerów insuliny w roztworze. Drugą taką pochodną insuliny jest insulina, w której prolina w pozycji 28 w łańcuchu B została zastąpiona kwasem asparaginowym. Wprowadzony w ten sposób ładunek ujemny zmniejsza możliwość samoasocjacji monomerów insuliny. Obie te pochodne insuliny są dzięki swojej strukturze szybciej wchłaniane.

Analogi rekombinowanej insuliny ludzkiej o przedłużonym działaniu konstruuje się przedłużając łańcuch B zasadowymi aminokwasami lub acylując grupę ε-aminową w lizynie w łańcuchu B kwasem alifatycznym o kilkunastu atomach węgla. Wprowadzenie dodatkowych zasadowych aminokwasów zmienia niektóre właściwości chemiczne lub fizyczne insuliny. Najważniejszą zmianą jest przesunięcie punktu izoelektrycznego w stosunku do niemodyfikowanej naturalnej insuliny z 5,4 do zakresu od około 5,5 do około 8,5, co jest wynikiem wprowadzenia dodatkowych dodatnich ładunków do cząsteczki. Konsekwencją tego jest zmniejszenie rozpuszczalności analogów w obojętnym środowisku wodnym i wynikająca z tego konieczność stosowania środowiska słabo kwaśnego do wytwarzania preparatów farmaceutycznych zawierających tak zmodyfikowaną insulinę.

Obok oczywistych korzyści wynikających z wprowadzenia dodatkowych zasadowych aminokwasów obserwuje się jednak niekorzystne zmniejszenie stabilności nowych analogów, wynikające przede wszystkim z zachodzącej w środowisku kwaśnym dezamidacji asparaginy w pozycji A21.

Problem ten rozwiązywany jest drogą wymiany A21Asn na inny aminokwas, taki m.in. jak kwas asparaginowy, glicyna, alanina, treonina i inne. Jednym z takich analogów jest pochodna rekombinowanej insuliny ludzkiej, w której w łańcuchu A asparagina(21) została zastąpiona glicyną(21) oraz do C-końca łańcucha B zostały przyłączone dwie reszty argininy. Jest to tak zwana pochodna glarginowa insuliny, wytwarzana pod nazwą Lantus® (opis patentowy St. Zjedn. Am. nr 5.656.722).

W naszych badaniach stwierdziliśmy, że podobne do obecnej już na rynku pochodnej glarginowej działanie biologiczne wykazuje pochodna insuliny ludzkiej, w której do C-końca w łańcuchu B zostały przyłączone reszta lizyny (B31 Lys) i argininy (B32Arg). Wstępne badania na zwierzętach wykazały, że preparat ten nazwany lizarginsuliną charakteryzował się przedłużonym działaniem i płaskim profilem uwalniania naśladującym wydzielanie naturalnej insuliny, a z klinicznego punktu widzenia redukcją hipoglikemii nocnych. Ze względu na wybitne podobieństwo do insuliny ludzkiej a także do proinsuliny można się było spodziewać dobrych wyników badań, umożliwiających etap po etapie rozwój kandydata na lek i jego ostateczną komercjalizację. Istotne jest, ze sekwencja LizArg w C-końcu łańcucha B insuliny ludzkiej występuje w proinsulinie ludzkiej, oraz że należy się spodziewać przekształcenia lizarg-insuliny w insulinę ludzką pod wpływem obecnej karboksypeptydazy C. Oznacza to,

PL 219 335 B1 że pierwszym metabolitem lizarg-insuliny w organizmie ludzkim może być insulina ludzka o dobrze poznanych i akceptowanych właściwościach, nawet w przypadku egzogennego hormonu. Przeprowadzone zostały rozszerzone badania przedkliniczne na szczurach, które potwierdziły długotrwałe działanie nowego analogu insuliny.

Okazało się jednak, że pochodna ta obok korzystnego działania biologicznego charakteryzuje się jednak niewystarczającą stabilnością w kwaśnych roztworach iniekcyjnych. Podstawową przyczyną niedostatecznej stabilności przejawiającej się przede wszystkim dezamidacją jest obecność w C-końcu łańcucha A reszty asparaginy, gdzie w kwaśnym środowisku wodnym może zachodzić autokatalizowana protonem grupy karboksylowej dezamidacja.

Stąd też celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowych analogów insuliny, które charakteryzowałyby się odpowiednią stabilnością w kwaśnych roztworach (pH 3,5 - 5) iniekcyjnych, wykazując jednocześnie pożądaną aktywność biologiczną. Pożądane jest zwłaszcza, żeby wykazywały one cechy działania biologicznego naturalnej insuliny. Szczególnie istotne jest również, aby początek działania nowych pochodnych był praktycznie natychmiastowy tuż po podaniu pacjentowi, przy jednoczesnym umożliwieniu przedłużonego uwalniania części podanej dawki. Dzięki temu możliwe byłoby zapewnienie zarówno przyspieszonego jak i przedłużonego w czasie działania preparatu farmaceutycznego zawierającego takie analogi insuliny.

Określony powyżej cel został nieoczekiwanie osiągnięty w niniejszym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest pochodna insuliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól charakteryzująca się tym, że jest analogiem rekombinowanej insuliny ludzkiej o punkcie izoelektrycznym 5 - 8,5 posiadającym odpowiednią stabilnością w kwaśnych (pH 3,5 - 5) roztworach iniekcyjnych i wzorze 1:

Gly-Ile-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-Ile-Cys-Ser-Leii-Tyr-Gln-Leu' 12 3 4 5 6 7\\ 8 9 w 11 12 13 ₁₄ 15 16

Glu-Asn-Tyr-Cys-R I

18 19 20 S

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leu-Tyr1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16

Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr-R¹17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

gdzie R oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza obojętny L-aminokwas wybrany z grupy obejmującej Gly, Ala, Ser, Thr lub grupę NH₂;

a R¹ oznacza B31Lys-B32Arg lub B31Arg-B32Arg lub B31Arg, przy czym B3Asn może być ewentualnie zastąpiony innym aminokwasem, korzystnie Glu.

Korzystnie pochodna insuliny lub jej fizjologicznie dopuszczalna sól według wynalazku charakteryzuje się tym, że:

2 1

R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza Gly a R¹ oznacza B31

Lys-B32Arg, albo

2 1

R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza Ala a R¹ oznacza B31

Lys-B32Arg, albo

2 1

R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza Ser a R¹ oznacza B31

Lys-B32Arg, albo

2 1

R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza Thr a R¹ oznacza B31

Lys-B32Arg, albo

PL 219 335 B1

2 1

R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R , w którym R oznacza grupę NH₂ a R oznacza

B31Lys-B32Arg, albo

R we wzorze 1	oznacza	grupę o	₂ wzorze Asn-R², w	₂ którym R²	oznacza	Gly a R¹	oznacza
B31Arg-B32Arg, albo R we wzorze 1	oznacza	grupę o	₂ wzorze Asn-R², w	₂ którym R²	oznacza	Ala a R¹	oznacza
B31Arg-B32Arg, albo R we wzorze 1	oznacza	grupę o	₂ wzorze Asn-R², w	₂ którym R²	oznacza	Thr a R¹	oznacza
B31Arg-B32Arg, albo R we wzorze 1	oznacza	grupę o	₂ wzorze Asn-R², w	₂ którym R²	oznacza	Ser a R¹	oznacza
B31Arg-B32Arg, albo 2 2 1 R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R , w którym R oznacza grupę NH₂ a R	oznacza
B31Arg-B32Arg, albo R we wzorze 1	oznacza	grupę o	₂ wzorze Asn-R², w	₂ którym R²	oznacza	Gly a R¹	oznacza
B31Arg, albo R we wzorze 1	oznacza	grupę o	₂ wzorze Asn-R², w	₂ którym R²	oznacza	Ala a R¹	oznacza
B31Arg, albo R we wzorze 1	oznacza	grupę o	₂ wzorze Asn-R², w	₂ którym R²	oznacza	Thr a R¹	oznacza
B31Arg, albo R we wzorze 1	oznacza	grupę o	₂ wzorze Asn-R², w	₂ którym R²	oznacza	Ser a R¹	oznacza

B31Arg, albo

2 1

B31Arg, albo

2 1

R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza Gly, R¹ oznacza B31 Lys-B32Arg, a B3Asn został zastąpiony B3Glu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest kompozycja farmaceutyczna charakteryzująca się tym, że zawiera efektywnie działającą ilość pochodnej insuliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli według wynalazku, jak zdefiniowano powyżej. Korzystnie, kompozycja farmaceutyczna według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera od 10 do 50 μg/ml cynku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie pochodnej insuliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli według wynalazku, zdefiniowanych powyżej, do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania cukrzycy.

Jak opisano wcześniej, w przypadku glarginy problem niskiej stabilności rozwiązano poprzez wymianę asparaginy na glicynę. Badania mające na celu otrzymanie analogu insuliny wykazującego przedłużone działanie i stabilność w kwaśnych roztworach iniekcyjnych według wynalazku poszły w innym kierunku. W celu zablokowania odpowiedzialnej za niską stabilność grupy karboksylowej otrzymane zostały nowe pochodne lizarginy z przekształconą w różny sposób grupą karboksylową w reszcie asparaginowej z wykorzystaniem metod inżynierii genetycznej i transformacji enzymatycznej. W wyniku przeprowadzonych badań, nieoczekiwanie ustalono, że podobne do pochodnej glarginowej i lizarginowej właściwości chemiczne i biologiczne wykazują pochodne insuliny ludzkiej o wzorze 1, w której łańcuch A w C-końcu został przedłużony o resztę obojętnego aminokwasu (A22) lub grupa karboksylowa asparaginy została przekształcona w grupę karboksyamidową a do C-końca w łańcuchu B zostały przyłączone reszty lizyny i argininy (B31Liz-B32Arg), lub dwie reszty argininy (B31Arg-B32Arg) albo jedna reszta argininy (B31Arg). Otrzymane w ten sposób nowe analogi charakteryzują się odpowiednią stabilnością w kwaśnych roztworach (pH 3,5 - 5) iniekcyjnych, wykazując jednocześnie pożądaną aktywność biologiczną.

Wprowadzone modyfikacje spowodowały nieoczekiwanie przesunięcie punktu izoelektrycznego do pH od 5 do 8 i tym samym zmniejszenie rozpuszczalności nowej pochodnej insuliny w fizjologicznym pH miejsca iniekcji. Powoduje to wytrącenie mikrodepozytu pochodnej insuliny w tkance podskórnej i następnie jej stopniowe, powolne wydzielanie do krwi, przez co utrzymywanie poziomu terapeutycznego trwa przez dłuższy czas. Istotne jest również, że początek działania nowych pochodnych według niniejszego wynalazku, jest praktycznie natychmiastowy, co oznacza, że związki te nieoczekiwanie wykazują cechy działania biologicznego znanych analogów insuliny zarówno o przyspieszonym jak i przedłużonym czasie działania. Przykładami pochodnych insuliny o wzorze 1 są takie jak, ale nie wyłącznie, przedstawione poniżej.

PL 219 335 B1

A22Gly - insulina ludzka - B31Lys,B32Arg

A22Ala	B31Lys,B32Arg
A22Thr	B31Lys,B32Arg
A22Ser	B31Lys,B32Arg
A21Asn-NH2	B31Lys,B32Arg
A22Gly	B31Arg,B32Arg
A22Ala	B31Arg,B32Arg
A22Thr	B31Arg,B32Arg
A22Ser	B31Arg,B32Arg
A21Asn-NH2	B31Arg,B32Arg
A22Gly	B31Arg
A22Ala	B31Arg
A22Thr	B31Arg
A22Ser	B31Arg
A21Asn-NH2	B31Arg
A22Gly	B3Glu,B31Lys,B32Arg

Analogi insuliny o wzorze 1 wytwarzano drogą manipulacji genetycznych wykorzystując standardowe metody inżynierii genetycznej.

Dla tego celu skonstruowane zostały warianty genu insuliny ludzkiej przy wykorzystaniu technik genetycznych takich jak np. reakcja miejscowo-specyficznej mutagenezy. Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5), jako matrycę wykorzystano DNA plazmidowe pIGALZUINS - P5/ZUINS.

Mieszaniną reakcyjną transformowano komórki kompetentne Escherichia coli DH5a. Plazmid zawierający określony wariant genu insuliny ludzkiej izolowano i sekwencjonowano, w celu sprawdzenia poprawności sekwencji nukleotydowej. Plazmid ze zmodyfikowanym genem proinsuliny ludzkiej używano do transformacji komórek kompetentnych E. coli DH5a i przeprowadzano hodowlę bakteryjną na podłożu LB z dodatkiem ampicyliny (0,01 mg/ml) w objętości 500 ml, temp. 37°C, 200 obr/min w czasie 18 h. Przygotowano materiał bakteryjny do banku szczepów, próby w stosunku 1:1 hodowli bakteryjnej i 40% glicerolu zdeponowano w temp. -70 °C.

Wytwarzane na drodze ekspresji w powyższych szczepach E.coli warianty preproinsuliny izolowano po rozbiciu komórek w postaci ciałek inkluzyjnych, które następnie poddawano standardowym procesom eliminacji białek fuzyjnych. Uzyskany po renaturacji roztwór białka hybrydowego z analogiem insuliny poddawano kontrolowanemu działaniu trypsyny, analogicznie jak w przypadku szeregu metod znanych uprzednio i opisanych np. przez Kemmlera i wsp. w J. Biol. Chem., Vol. 246, str. 67866791 (1971) lub w patentach US 6686177 lub US 6100376. Otrzymane analogi insuliny poddawano procesowi oczyszczania przy zastosowaniu znanych metod, przede wszystkim chromatografii niskociśnieniowej, ultrafiltracji i/lub HPLC. Z oczyszczonego w dostatecznym stopniu roztworu analogu insuliny wytrącano produkt.

Dla otrzymywania pochodnych A21Asn-NH₂ oraz A20Cys-NH₂ stosowano enzymy α-amidujące (α-AE, ang. α-amidating enzyme) katalizujące przemianę naturalnie występujących w organizmach żywych prohormonów, które są substratami reakcji przekształconymi w aktywne formy α-amidowe.

Enzym PAM ang. „peptidylglicine α-amidating monooxygenase” jest proteazą o podwójnej aktywności oznaczonej jako aktywność PHM (α-wodoro-monoutleniacz) oraz PAL (aktywność peptydoaminoglikolowa) (schemat nr 1), która pozwala na otrzymanie C-końcowego amidu. Zbadano, iż połowa hormonów peptydowych takich jak oksytocyna czy wazopresyna wymagają do osiągnięcia swojej optymalnej aktywności C-końcowej grupy amidowej. W reakcji tej grupa amidowa pochodzi z C-końcowej reszty glicyny, która jest tu bezpośrednim prekursorem reakcji (Satani i in., 2003; Miller i in., 1992).

Η H U

Prekursor z Gly

Pochodna hydroksylowa glioksylan

PL 219 335 B1

Schemat 1. Schemat reakcji α-amidacji peptydu przez aktywną proteazę PAM (wg. Sataniego i in., 2003).

Proteaza PAM - jest to białko występujące m. in. w organizmach eukariotycznych o różnej długości łańcucha aminokwasowego. W niniejszym projekcie zastosowano proteazę pochodzącą z organizmu ludzkiego Homo sapiens, w którym występuje 6 genów kodujących białka o aktywności proteazy α-amidującej.

₁

Podstawową właściwością fizykochemiczną pochodnych A20R-B30R¹, biosyntetycznego analogu insuliny, która odróżnia je od insuliny ludzkiej, jest wartość jej punktu izoeloektrycznego, wynosząca od około 5 do około 8. Oznacza to dobrą rozpuszczalność związku w roztworach o pH kwaśnym do słabo kwaśnego. Właściwość ta pozwoliła na przygotowanie kompozycji - roztworów nowych pochodnych insuliny w pH kwaśnym.

Solą analogu insuliny ludzkiej według wynalazku może być na przykład sól metalu alkalicznego lub sól amoniowa.

Przeznaczona do podawania kompozycja według wynalazku jest przygotowywana w postaci roztworu i zawiera; efektywnie działającą ilość biosyntetycznego analogu insuliny ludzkiej o wzorze 1, lub jego farmakologicznie dopuszczalnej soli oraz substancje pomocnicze, takie jak; czynniki izotonizujące, czynniki konserwujące, czynniki stabilizujące, ewentualnie czynnik buforujący.

Ilość zastosowanej w kompozycji według wynalazku substancji aktywnej wynosi około 1 -1600, korzystnie 10-1200, szczególnie korzystnie 10-500 lU/ml.

Dla kompozycji farmaceutycznej według wynalazku wartość pH roztworu wynosi od około 3,5 do około 5, korzystnie 4,5.

Generalnie, środkami pomocniczymi w kompozycjach według wynalazku są takie same substancje, jakie stosuje się w preparatach zawierających znaną rekombinowaną insulinę ludzką.

Substancją izotonizującą według wynalazku może być każda substancja, która pozwala na otrzymywanie roztworu izoosmotycznego w stosunku do osocza krwi ludzkiej. Do typowych środków izotonizujących stosowanych w farmacji należą takie jak chlorek sodowy, mannitol, glicyna i gliceryna. Korzystne jest stosowanie gliceryny.

Użytecznymi czynnikami konserwującymi do stosowania w kompozycji według wynalazku są związki wybrane z grupy, do której należą takie jak m-krezol, fenol, lub ich mieszaniny.

Nowe pochodne, podobnie jak rekombinowana normalna insulina ludzka, są stabilizowane dodatkiem jonów cynku, wprowadzanych do roztworu w postaci między innymi chlorku lub tlenku cynku. Zawartość cynku może wynosić od około 5 μg/ml, do około 150 μg/ml.

Opracowano przykładowy następujący skład kompozycji zawierających pochodne rekombinowanej insuliny ludzkiej według wynalazku; 10-500 lU/ml biosyntetycznego analogu insuliny ludzkiej o wzorze 1 lub jego farmakologicznie dopuszczalna sól, 16 mg/ml gliceryny, 3 mg/ml m-krezolu, 10-50 μg/ml cynku oraz woda do iniekcji do 1 ml.

Dla lepszego wyjaśnienia istoty wynalazku niniejszy opis został uzupełniony o szczegółowe omówienie jego przykładowych realizacji obejmujące również załączony wykaz sekwencji oraz figury, z których:

Figura 1 przestawia strukturę plazmidu p5/ZUINSGIy kodującego białko rekombinowanej insuliny ludzkiej INSGIy(22A);

Figura 2 przedstawia sekwencję nukleotydową i aminokwasową plazmidu p5/ZUINSGIy(22A);

Figura 3 przedstawia wyniki obrazujące reakcję szczurów normoglikemicznych na podanie badanych preparatów insuliny (grupy badane n=10).

P r z y k ł a d 1.

Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSGIy(22A).

Do konstrukcji rekombinowanego genu insuliny INSGIy(22A) użyto plazmidu p5/ZUINS, w którym fragment DNA kodujący prekursor insuliny jest dołączony do zmodyfikowanego genu syntetycznej ubikwityny. W genie ubikwityny kodony dla argininy zostały zamienione na kodony dla alaniny oraz do C-końca genu ubikwityny dołączony został dodatkowy kodon dla argininy. Peptyd stanowiący część ubikwityny jest nośnikiem dla prekursora insuliny, warunkującym dużą wydajność syntezy białka fuzyjnego w E. coli. Region kodujący modyfikowane białko fuzyjne ubikwityna-insulina ludzka umieszczony jest pod kontrolą promotora pms (WO05066344 A2). Plazmid posiada gen oporności na ampicylinę. Do konstrukcji wektora p5/ZUINS wykorzystano plazmid pIGAL1, którego sekwencja znajduje się w Banku Genów pod numerem AY424310.

PL 219 335 B1

Gen insuliny INSGly(22A) różni się od wzorcowego genu insuliny ludzkiej tym, że ma dołączony dodatkowy kodon GGT do C-końca łańcucha A. W rezultacie sekwencja aminokwasowa łańcucha A zostaje wydłużona w pozycji 22 o resztę aminokwasową Gly - glicynę.

W celu zmodyfikowania genu kodującego sekwencję insuliny ludzkiej poprzez dołączenie kodonu GGT (Gly) na jego C-końcu, zaplanowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej:

GLYG

5' AACTACTGCAATGGTTAAGTCGACTCTAGC 3’

Gly STOP

GLYD

5’ GTAGCTAGAGTCGACTTAACCATTGCAG 3’

Gly

Przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5) przeprowadzono reakcję mutagenezy punktowej, jako matrycę zastosowano DNA plazmidowe p5/ZUINS. Mieszaniną reakcyjną transformowano komórki kompetentne Escherichia coli DH5α. Plazmid p5/ZUINSGIy(22A) izolowano i sekwencjonowano, w celu sprawdzenia obecności nukleotydów GGT kodujących glicynę oraz poprawności sekwencji plazmidu. Plazmid ze zmodyfikowanym genem proinsuliny ludzkiej p5/ZUINSGIy(22A) użyto do transformacji komórek kompetentnych E. coli DH5α i przeprowadzono hodowlę bakteryjną w podłożu LB z dodatkiem ampicyliny (0,01 mg/ml) w objętości 500 ml, temp. 37°C, 200 obr/min w czasie 18 h. Przygotowano materiał bakteryjny do banku szczepów, próby w stosunku 1:1 hodowli bakteryjnej i 40% glicerolu zdeponowano w temp. -70°C.

Konstrukcja genetyczna plazmidu p5/ZUINSGIy(22A).

Plazmid p5/ZUINSGIy(22A) ma wielkość 4775 par zasad i jest zbudowany z następujących sekwencji regulatorowych oraz genów:

- od 374 pz do 1234 pz zlokalizowany jest gen oporności na ampicylinę AMP R,

- od 4158 pz do 4323 pz znajduje się region kodujący promotor pms,

- od 4327 pz do 4554 pz zawarta jest sekwencja kodująca modyfikowany gen ubikwityny syntetycznej ZUBl,

- od 4558 pz do 4722 pz znajduje się sekwencja kodująca gen insuliny INSGIy(22A),

- od 4729 pz do 4775 pz zlokalizowany jest region kodujący terminator transkrypcji Ter.

Strukturę plazmidu p5/ZUINSGIy(22A) kodującego białko rekombinowanej insuliny ludzkiej lNSGly(22A) przedstawiono schematycznie na Fig.1.

P r z y k ł a d 2.

Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSGIy(22A)Arg(31B).

Do konstrukcji rekombinowanego genu INSGIy(22A)Arg(31B) wykorzystano plazmid p5/ZUINSGIy(22A). Gen insuliny INSGIy(22A)Arg(31B) charakteryzuje się tym, że ma zamieniony kodon AAG (Lys) na kodon CGT (Arg) w pozycji 31 łańcucha B.

W celu zmodyfikowania genu kodującego sekwencję insuliny ludzkiej INSGIy(22A) zaplanowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej:

ARGG

5’ CTAAAACACGTCGCGGCATCGTTGAACAG 3 Arg

ARGD

5’ CGATGCCGCGACGTGTTTTAGGAGTGTAG 3'

Arg

Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5). Izolację i sprawdzenie poprawności sekwencji nukleotydowej plazmidu oraz otrzymanie bakterii E. coli DH5α z plazmidem p5/ZUINSGIy(22A)Arg(31 B) wykonano tak jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 3.

Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSSer(22A)Arg(31B).

Do konstrukcji rekombinowanego genu INSSer(22A)Arg(31B) wykorzystano plazmid p5/ZUINSGIy(22A)Arg(31B). Gen insuliny INSSer(22A)Arg(31B) różni się od genu insuliny INSGIy(22A)Arg(31B) zamianą kodonu GGT (Gly) na kodon TCT (Ser) w pozycji 22 łańcucha A.

W celu zmodyfikowania genu kodującego sekwencję insuliny ludzkiej INSGIy(22A)Arg(31B) poprzez zamianę kodonu GGT (Gly) na kodon TCT (Ser) w pozycji 22 łańcucha A, zaplanowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej;

PL 219 335 B1

SERG

5’ CAATTCTTAAGGATCCTCTAG 3’

Ser STOP

SERD

5’ CTTAAGAATTGCAGTAGTTCTCCAG 3’

Ser

Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5). Izolację i sprawdzenie poprawności sekwencji nukleotydowej plazmidu oraz otrzymanie bakterii E. coli DH5α z plazmidem p5/ZUINSSer(22A)Arg(31 B) wykonano tak jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 4.

Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSAIa(22A).

Do konstrukcji rekombinowanego genu INSAIa(22A) wykorzystano plazmid p5/ZUINS. Gen insuliny INSAIa(22A) różni się od wzorcowego genu insuliny ludzkiej dołączeniem kodonu GGT do C-końca łańcucha A. W rezultacie sekwencja aminokwasowa łańcucha A zostaje wydłużona w pozycji 22 o resztę aminokwasową Ala - alaninę.

W celu zmodyfikowania genu kodującego sekwencję insuliny ludzkiej poprzez dołączenie kodonu GGT (Ala) na jego C-końcu, zaplanowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej;

ALAG

5’ CAATGCTTĄĄGGATCCTCTAG 3'

Ala STOP

ALAD

5’ CTTAAGCATTGCAGTAGTTCTCCAG 3’

Ala

Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5). Izolację i sprawdzenie poprawności sekwencji nukleotydowej plazmidu oraz otrzymanie bakterii E. coli DH5α z plazmidem p5/ZUINSAIa(22A) wykonano tak jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 5.

Konstrukcja plazmidu p5/ZUINSGIy(22A)Glu(3B).

Do konstrukcji rekombinowanego genu INSGIy(22A)Glu(3B) wykorzystano plazmid p5/ZUINSGIy(22A). Gen insuliny INSGIy(22A)Glu(3B) różni się od genu insuliny INSGIy(22A) zamianą kodonu AAC (Asn) na kodon GAA (Glu) w pozycji 3 łańcucha B.

W celu zmodyfikowania genu kodującego sekwencję insuliny ludzkiej INSGIy(22A) poprzez zamianę kodonu AAC (Asn) na kodon GAA (Glu) w pozycji 3 łańcucha B, zaplanowano następujące primery do reakcji mutagenezy punktowej:

GLUG

5’ GTCGAACAGCACCTGTGTGGTTC 3’

Glu

GLUD

5’ GCTGTTCGACAAAACGAGGACCTGC 3’

Glu

Reakcję mutagenezy punktowej przeprowadzono przy użyciu zestawu firmy Stratagene (nr kat. 200518-5). Izolację i sprawdzenie poprawności sekwencji nukleotydowej plazmidu oraz otrzymanie bakterii E. coli DH5α z plazmidem p5/ZUINSGIy(22A)Glu(31 B) wykonano tak jak w przykładzie 1.

P r z y k ł a d 6.

Badania aktywności na modelu zwierzęcym

Analog A22Gly-B31Lys,32Arg rekombinowanej insuliny ludzkiej (Insulina GKR) podobnie jak Gensulin N wykazuje przedłużony okres działania przy czym hipoglikemia u szczurów normoglikemicznych ma podobny przebieg. Istotne różnice w działaniu hipoglikemicznym obu preparatów występują po 0.5 i 1 godzinie od chwili podania (tab. 1, ryc. 1). W tym czasie obserwuje się szybki i głęboki spadek stężenia glukozy po insulinie GKR. Szczyt działania GKR oraz GENSULINY N występuje w 2 godzinie.

Badania wstępne potwierdziły, że insulina GKR jest czynnym preparatem o przedłużonym okresie działania hipoglikemicznego, działanie to występuje po krótkim okresie utajenia. Obniżenie poziomu glukozy po podaniu insuliny GKR obserwowano do 12 godzin, natomiast poziomy glukozy po 24 godzinach mieściły się w granicach wyjściowych. Wyniki reakcji szczurów normoglikemicznych na podanie badanych preparatów insuliny (uwzględniając wartości średnie) przedstawiono w tabeli 1 i na fig. 3.

PL 219 335 B1

Tabela 1 Reakcja szczurów normoglikemicznych na podanie badanych preparatów insuliny (grupy badane n=10)

PL 219 335 B1

Wykaz sekwencji <110> Instytut Biotechnologii i Antybiotyków <120> Nowe analogi insuliny o przedłużonym działaniu <130> 571/RW ’ ' ’ <160> 18 <170> Patentln version 3.3 <210> 1 <211> 22 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> mutant łańcucha A insuliny <400> 1 ’

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn Gly 20 ' <210> 2 <211> 22 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> mutant łańcucha A insuliny <400> 2

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Cys Asn Ala 20 <210> 3 <211> 22 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> mutant łańcucha A insuliny <400> 3

Gly Ile Val Glu Gin Cys	Cys	Thr	Ser	Ile 10	Cys	Ser	Leu	Tyr Gin Leu 15
1	5
Glu Asn Tyr Cys Asn Ser
	20
<210>	4
<211>	21
<212>	PRT
<213> <220>	artificial
<223>	mutant Łańcucha A insuliny
<220> <221>	MISC FEATURE
<222>	(21)..(21)
<223>	Xaa = amid Asn
<400>	4
Gly Ile Val Glu Gin Cys	Cys	Thr	Ser	Ile	Cys	Ser	Leu	Tyr	Gin	Leu
1	5				10					15

Glu Asn Tyr Cys Xaa 20

PL 219 335 B1 <210> 5 <211> 20 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> mutant łańcucha A insuliny <220>

<221> misc_feature <222> [20)..(20) <223> Xaa = amid Lys <400> 5

Gly Ile Val Glu Gin Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gin Leu 15 10 15

Glu Asn Tyr Xaa 20 <21Q> 6 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> mutant łańcucha B insuliny <400> 6

Phe

Val

Asn

Gin

His

Leu

Cys

Ser

His

Leu

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr Leu

1

5

10

15

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Lys

Arg

25 30 <210> 7 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> mutant łańcucha B insuliny <400> 7

Phe 1

Val

Asn

Gin

His 5

Leu

Cys

Ser

His

Leu 10

Val

Glu

Ala

Leu

Tyr Leu 15

Val

Cys

Gly

Glu

Arg

Gly

Phe

Tyr

Thr

Pro

Lys

Thr

Arg

25 30 <210> 8 <211> 31 <212> PRT <213> artificial <220>

<223> mutant łańcucha B insuliny <400> 8

Phe Val Gly Gin His Leu Cys Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr Leu 15 10 15

Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro Lys Thr Lys Arg 20 25 30 <210> 9 <211> 35 <212> DNA

PL 219 335 B1

Claims

1. Pochodna insuliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalna sól, znamienna tym, że jest analogiem rekombinowanej insuliny ludzkiej o punkcie izoelektrycznym 5 - 8,5 charakteryzującym się odpowiednią stabilnością w kwaśnych (pH 3,5 - 5) roztworach iniekcyjnych i wzorze 1:

s-s

I I

Gly-lle-Val-Glu-Gln-Cys-Cys-Thr-Ser-lle-Cys-Ser-Leu-Tyr-Gln-Leu~

12 3 4 5 6 7\^ S 9 w 11 12 13 u 15 16 ^s I S

Glu-Asn-Tyr-Cys-R I

17 18 19 20 S

Phe-Val-Asn-Gln-His-Leu-Cys-Gly-Ser-His-Leu-Val-Glu-Ala-Leii-Tyr1 2 3 4 5 6 7 8 g 10 11 12 13 14 15 16

Leu-Val-Cys-Gly-Glu-Arg-Gly-Phe-Phe-Tyr-Thr-Pro-Lys-Thr- R¹

17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 wzór 1 gdzie R oznacza grupę o wzorze Asn-R^A, w którym R² oznacza obojętny L- aminokwas wybrany z grupy obejmującej Gly, Ala, Ser, Thr lub grupę NH2; a R^A oznacza B31 Lys-B32Arg lub B31ArgB32Arg lub B31Arg, przy czym B3Asn może być ewentualnie zastąpiony innym aminokwasem, korzystnie Glu.

2. Pochodna insuliny lub jej fizjologicznie dopuszczalna sól według zastrz. 1, znamienna tym, że:

2 2 1

R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza Gly a R¹ oznacza B31 Lys-B32Arg, albo

2 2 1

R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza Ala a R¹ oznacza B31 Lys-B32Arg, albo

2 2 1

R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza Ser a R¹ oznacza B31 Lys-B32Arg, albo

2 2 1

R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza Thr a R¹ oznacza B31 Lys-B32Arg, albo

2 2 1

B31Lys-B32Arg, alboR we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza Gly a R¹oznacza B31Arg-B32Arg, albo R we wzorze 1 oznacza grupę o ₂ wzorze Asn-R², w ₂ którym R² oznacza Ala a R¹ oznacza B31Arg-B32Arg, albo R we wzorze 1 oznacza grupę o ₂ wzorze Asn-R², w ₂ którym R² oznacza Thr a R¹ oznacza B31Arg-B32Arg, albo R we wzorze 1 oznacza grupę o ₂ wzorze Asn-R², w ₂ którym R² oznacza Ser a R¹ oznacza B31Arg-B32Arg, albo 22 R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza grupę NH 2 a R¹ oznacza B31Arg-B32Arg, albo R we wzorze 1 oznacza grupę o ₂ wzorze Asn-R², w ₂ którym R² oznacza Gly a R¹ oznacza B31Arg, albo R we wzorze 1 oznacza grupę o ₂ wzorze Asn-R², w ₂ którym R² oznacza Ala a R¹ oznacza B31Arg, albo R we wzorze 1 oznacza grupę o ₂ wzorze Asn-R², w ₂ którym R² oznacza Thr a R¹ oznacza B31Arg, albo R we wzorze 1 oznacza grupę o ₂ wzorze Asn-R², w ₂ którym R² oznacza Ser a R¹ oznacza B31Arg, albo 22 R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza grupę NH 2 a R¹ oznacza

B31Arg, albo

PL 219 335 B1

2 2 1

R we wzorze 1 oznacza grupę o wzorze Asn-R², w którym R² oznacza Gly, R¹ oznacza B31

Lys-B32Arg, a B3Asn został zastąpiony B3Glu.

3. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera efektywnie działającą ilość pochodnej insuliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli według zastrz. 1 albo 2.

4. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 3, znamienna tym, że zawiera 10 do 50 μg/ml cynku.

5. Zastosowanie pochodnej insuliny lub jej farmaceutycznie dopuszczalnej soli według zastrz. 1 albo 2 do wytwarzania leku do leczenia lub zapobiegania cukrzycy.