JP5052345B2 - 改善されたアポｅ類似体群およびそれらの使用方法 - Google Patents

Description

１．関連出願の相互参照
本出願は、参照によりその全体が本明細書で援用される、２００４年９月２日出願の米国仮特許出願第６０／６０６，５０６号明細書、２００４年９月９日出願の同第６０／６０８，１４８号明細書、および２００４年９月２日出願の同第６０／６０６，５０７号明細書の優先権を主張する。本出願は、参照によりその全体が本明細書で援用される、１９９９年３月１日出願の米国特許出願第０９／２６０，４３０号明細書、２００１年９月２１日出願の同第０９／９５７，９０９号明細書、２００２年９月２３日出願の同第１０／２５２，１２０号明細書、および２００５年３月２９日出願の同第１１／０９１，３３６号明細書にも関する。

２．発明の分野
本発明は、外傷性脳損傷、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、潰瘍性結腸炎、関節炎、多発性硬化症、アテローム性動脈硬化症、および敗血症の治療のための化合物および方法を提供する。本発明は、全身照射および局所放射線療法を含む放射線の影響から対象を保護する方法にも関し、かつ電離放射線への偶発的または意図的な曝露の場合の移植、癌療法、および救急医療の分野に関する。

３．背景
アポＥ（アポリポタンパク−Ｅ）が急性および慢性神経学的疾患における臨床転帰の緩和に重要な役割を果たすことについて多数の収束的な一連の証拠がある。これらの所見は、患者のアポＥ遺伝子型に基づくが、アポＥが神経保護効果をもたらす脳卒中および外傷性脳損傷（ＴＢＩ）のマウスモデルと一致する（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）ら、１９９７年、シェング（Ｓｈｅｎｇ）ら、１９９８年、１９９９年、リンチ（Ｌｙｎｃｈ ）ら、以下を参照）。

アポＥは多重生物学的特性を有する２９９個のアミノ酸タンパク質である。コレステロールおよびトリグリセリドの輸送および代謝におけるその役割について最初に確認され、アポＥは低比重リポタンパク（ＬＤＬ）受容体、ＬＤＬ受容体関連タンパク質（ＬＲＰ）、および超低比重リポタンパク（ＶＬＤＬ）受容体としての機能を果たす（ワイスグレーバー（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ）１９９４年）。コレステロール代謝におけるその役割に加えて、最近の説得力のある臨床データは、アポＥが急性および慢性ヒト疾患の神経生物学において重要な役割を果たすことを示す。残基１１２および１５８で入れ替わるアミノ酸が１つ異なるアポＥ−２、アポＥ−３、およびアポＥ−４で示される３つの共通のヒトイソフォームがある（ワイスグレーバー（Ｗｅｉｓｇｒａｂｅｒ）１９９４年）。アポＥ４対立遺伝子の存在は後期発症家族性および散発性アルツハイマー病（ＡＤ）を発現しやすくする性質の増大と関係がある。最近の臨床証拠によっても、アポＥ４対立遺伝子の存在が急性脳損傷後の不良な転帰と強く関係づけられている（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）ら、１９９８ａ、１９９８ｂ、クローフォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ）ら、２００２年を参照）。

アポＥが後期発症および家族性ＡＤの発現に影響を及ぼすことが確認されている。この影響は強固かつ用量依存性であり、アポＥ４／４遺伝子型を有する同型接合個体がＡＤを発現するおよそ２０倍の増大リスクを有し、かつアポＥ３／４遺伝子型を有する異型接合個体は最も一般的なアポＥ３／３遺伝子型の同型接合である患者に対して４倍の増大リスクを有するようになる（ストリットマッター（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ）ら、１９９３年、コーダー（Ｃｏｒｄｅｒ）ら、１９９３年、ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）らによる論評、１９９８ａ）。この所見は哺乳類中枢神経系（ＣＮＳ）におけるアポＥの機能における関心の再燃をもたらした。ＡＤとのその関係のため、多数の研究室は、ＡＤの病因に特異的な役割を果たすと考えられているアポＥとタンパク質との間の相互作用を検査した。したがって、一部の研究室は、アポＥとＡベータまたはアポＥとタウとの間のイソフォーム特異的相互作用を説明した（ストリットマッター（Ｓｔｒｉｔｔｍａｔｔｅｒ）ら、１９９４年、ガロ（Ｇａｌｌｏ）ら、１９９４年、フレミング（Ｆｌｅｍｉｎｇ）ら、１９９６年、ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）らによる論評、１９９８ａ）。しかし、ＣＮＳにおけるアポＥの役割は不明確なままであり、これらの相互作用のうちどれがヒト神経変性疾患において重要であるか不明である。

外傷性脳損傷（ＴＢＩ）は、米国における小児、若年成人、および高齢者のうちで損傷関連死亡および障害の主要な原因である。疫学的データは、入院治療費のみで毎年１０億ドルを越えることを推計する、ＴＢＩの社会への深刻な社会経済的影響を明らかにした。ＴＢＩの推定発生率は年齢５〜１４歳で倍になり、成人期初期の間に男女で十万人当たりおよそ２５０人でピークとなる。中等度〜重度のＴＢＩの大部分の生存者の生活は、さまざまな程度の依存状態とともに慢性の生涯にわたる神経学的生涯を伴うため、患者の費用、家族の負担、および社会への経済的負担は、生存年数が多い者にとってより大きくなるとみられる。したがって、ＴＢＩに対する治療に改善の必要がある。

２００２年９月２３日に出願された米国特許出願第１０／２５２，１２０号明細書は、脳虚血または脳炎症の神経学的影響を治療し、または改善するＣＯＧ１３３を含むアポＥ類似体を使用する方法を開示している。ＣＯＧ１３３は、総アポＥタンパク質の残基１３３−１４９から成る小さな切断ペプチドである。ＣＯＧ１３３は動物試験で有用であることが判明したが、投与すべき範囲の限定された治療の窓を有する。したがって、依然としてＴＢＩに対する治療の改善の必要がある。

ＴＢＩに加えて、化学療法および放射線療法と関係がある毒性が、短長期の患者の生活の質に悪影響を及ぼし、治療の用量および持続期間を制限し、生命にかかわりうるとともに、医療費および非医療費に寄与しうる。癌治療の悪影響は、特定の化学療法および放射線療法毒性を改善し、または軽減することが意図された特定の薬剤の開発をもたらした。理想的な化学療法および放射線療法保護剤は、癌治療の抗腫瘍効果に悪影響を及ぼすことなく、生命にかかわらない副作用（脱毛）から、潜在的に致死的なイベント（重篤な心筋症、重篤な血小板減少症）への不可逆性の病的状態（治癒喪失、神経毒性）までのすべての毒性を防ぎ、かつ投与が容易であり、それ自体で比較的非毒性であろう。しかし、これまで開発された大部分の薬剤は毒性保護のはるかに狭いスペクトルを有する（ヘンスレイ（Ｈｅｎｓｌｅｙ）ら、１９９９年）。

口内乾燥および粘膜炎は放射線療法と関係がある主要な毒性である。これらの合併症のリスクは放射線を受ける領域、放射線療法の線量およびスケジュール、放射線療法が化学療法と併用されているかどうか、および部分的にのみ理解されている多くの宿主疾患関連因子と関連している（モスマン（Ｍｏｓｓｍａｎ）、１９９４年）。これらの毒性はまれに死亡と関係があるが、死亡率は急性および長期にわたる影響を有する患者にきわめて重要でありうる。口内乾燥が頭部および頸部への標準分割放射線療法と関係がある最も一般的な毒性である。放射線からの急性口内乾燥は炎症反応によるものであるが、放射後１年に発生する口内乾燥を含む遅発口内乾燥は、唾液腺の線維症を示し、かかるものとして、通常、持続性である。口内乾燥は結果として口渇の症状をもたらし、これは患者の摂食および発話能力に影響を及ぼす。また、口内乾燥を有する患者は虫歯、経口感染、および骨壊死にかかる可能性が高い。

放射線療法は脳癌患者のための一次治療である。放射線が脳に送達されることによる死亡率（薬物療法、攻撃、または核事故）と無関係に、脳は一般的に脳細胞死の徴候である緩徐に重篤な臨床症状に反応する（ファイケ（Ｆｉｋｅ）ら、１９８８年）。これらの問題は深刻であり、数か月の間に致死的になりうるが、あまり深刻ではない急性の症状は放射線療法後数日〜数週間で弱体化もしている（マンデル（Ｍａｎｄｅｌｌ）ら、１９９０年）。

脳細胞の死および／または機能障害の理由は正確には知られていないが、放射線の適用後のさまざまな反応から生じると考えられている。電離放射線は放射線エネルギーに依存して一連の分子イベントにより生体組織に損傷をもたらす。急性放射線損傷は、水に対する放射線の作用によって発生される水性フリーラジカルによる。水性放射線分解に起因する主要なフリーラジカルは、ＯＨ・、Ｈ・、ＨＯ_２、Ｈ_３Ｏ^＋、等である。（ショレス（Ｓｃｈｏｌｅｓ）、１９８３年、プラドハン（Ｐｒａｄｈａｎ）ら、１９７３年、ドラガリック（Ｄｒａｇａｒｉｃ）とドラガリック（Ｄｒａｇａｒｉｃ）、１９７１年）。これらのフリーラジカルは、ＤＮＡ、ＲＮＡ、タンパク質、および膜など細胞高分子と反応し、最終的に死をもたらしうる細胞機能障害を引き起こす。細胞への放射線損傷は、細胞環境における酸素、スルフヒドリル化合物、および他の分子の存在などいくつかの因子に依存して強化または軽減される（プラドハン（Ｐｒａｄｈａｎ）ら、１９７３年、バック（Ｂａｃｑ）、１９６５年）。酸素の存在下、水和電子およびＨ原子は分子酵素と反応し、他の水性フリーラジカルは別として、ＨＯ_２、Ｏ_２ ⁻などのラジカルを産生する（バラボイ（Ｂａｒａｂｏｉ）ら、１９９４年、ビアコフ（Ｂｉａｋｏｖ）とステパノフ（Ｓｔｅｐａｎｏｖ）、１９９７年）。

ラジカル種を発生させる放射線の直接の影響を超えて、いくつかの報告により放射線治療後の脳におけるサイトカインの放出が記録されている（例えば、ジリンスキー（Ｇｉｒｉｎｓｋｙ）ら、１９９４年、ホング（Ｈｏｎｇ）ら、１９９５年、チャン（Ｃｈｉａｎｇ）、１９９７年）。具体的には、ホング（Ｈｏｎｇ）ら（１９９５年）は、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）、インターロイキン１アルファ、およびベータ（ＩＬ１ａおよびＩＬ１ｂ）のｍＲＮＡが、１０％未満の死亡に移される線量である１回の２５グレイ（Ｇｙ）線量の脳照射を受けたマウスの脳において大幅に増大したことを報告している。それほどではないにせよ、インターロイキン６（ＩＬ６）も放射線量の増加とともに用量依存的に誘発される。全身照射は同様のパターンのサイトカイン誘発を発生させたが、誘発のレベルは脳特異的照射で見られたものよりはるかに低かった。これら照射後のサイトカインレベルで確認された変化は、脳が疾患および／または病原体の侵入に反応して高まる星状細胞増加症およびミクログリア細胞症と一致している。われわれの最近の刊行物（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００３年）において報告されているように、リポ多糖（ＬＰＳ）による末梢治療は、放射線治療でこれらの著者らによって確認されたものと同様の星状細胞増加症、ミクログリア細胞症、およびサイトカイン放出を含む脳炎症性反応も誘発しうる。

３つの薬剤が現在、化学療法および／または放射線療法保護のために米国食品医薬品局（ＦＤＡ）によって承認されている。すなわち、デクスラゾキサン、メスナ、およびアミフォスチンである。しかしこれらの承認薬剤の各々は、それらの有効性を制限する重要な問題を有する。デクスラゾキサンおよびメスナは各々比較的限定されたスペクトルの心臓および尿路の毒性保護をそれぞれ有するが、アミフォスチンはより広い潜在的な細胞保護スペクトルを有する。朗報は、これらの薬剤は（おそらくメスナを除き）全身的に作用し、明らかに特定の細胞型をターゲットとせず、おそらく大部分の細胞型を保護する働きをすることである。骨髄抑制または急性嘔吐／嘔吐とは異なり、これらの薬剤と関係がある毒性の測定はより困難であり、または転帰の主観性（神経毒性）、潜在的発症（心筋症）、または不明の臨床的関連（血清クレアチニン、顕微鏡的血尿における無症候性増加、または心臓駆出分における無症候性減少）のため臨床試験において再現性を評価するには大きな労働力を要する（ヘンスレイ（Ｈｅｎｓｌｅｙ）ら、１９９９年）。

アミフォスチンは、以前はＷＲ−２７２１として知られ、その活性代謝産物はアミノチオールであるが、酸素由来フリーラジカルを捕捉することによって損傷から細胞を保護しうる。この薬物は、米国陸軍の後援の下に機密の核戦争プロジェクトから生じ、最終的にその優れた放射線保護特性および安全性プロフィールのためスクリーニングされた４，４００超のグループの化学薬品から選択された（シュクター（Ｓｃｈｕｃｔｅｒ）とグリック（Ｇｌｉｃｋ）、１９９３年）。その後、アミフォスチンは、アルキル化剤およびプラチナ剤など、ＤＮＡの構造および機能を変化させる放射線療法および化学療法剤の毒性の軽減におけるその潜在的な役割について評価された。保護効果が特定の臓器に対して方向づけられたデクスラゾキサンおよびメスナとは異なり、アミフォスチンは広域スペクトルの細胞保護剤として評価されている。プロフィールが、放射線療法の細胞障害性効果から、中枢神経系（ＣＮＳ）および新生物組織を除くほぼすべての正常組織を選択的に保護するアミフォスチンの能力を証明した前臨床試験から出現した（シュクター（Ｓｃｈｕｃｔｅｒ）とグリック（Ｇｌｉｃｋ）、１９９３年、コールマン（Ｃｏｌｅｍａｎ）ら、１９８８年）。したがって、依然として、特に脳およびＣＮＳにおいて放射線および放射線療法の効果を軽減する有効な治療の大きな必要がある。

炎症性腸疾患（ＩＢＤ）は、クローン病または潰瘍性結腸炎としても知られるが、腸の炎症、腹痛、けいれん、および下痢を有するおよそ１００万人のアメリカ人に影響を及ぼす。これらの症状は重篤度の点で異なるが、それらがかれらの生活の質を大きく変化させる程度まで患者をしばしば弱体化する。疾患の重篤度に依存して治療様式の組合せを必要とするほぼすべての患者により利用可能な多様な治療法がある。しかし、これらの治療は、インフリキシマブ（抗ＴＮＦモノクローナル抗体）による場合のようにしばしば高価であり、一般的に、感染または悪性腫瘍、糖尿病、膵炎、および重篤な骨喪失のリスクを含むコルチコステロイドおよび免疫抑制剤で見られるような重大な望ましくない副作用を示す。これらの問題に加えて、ＩＢＤ患者が直面する甚大な死亡率は新しく有効な治療法を開発する継続的な努力の明らかな推進要因である。アポＥは、先天性免疫における有利な効果を有するように思われるが、アポＥ欠乏マウスにおける全身感染および敗血症や炎症の悪化に対する先天性免疫の喪失によって証明されるように腸炎におけるアポＥの役割は完全に未調査のままである。

４． 概要
本発明は、アポＥの残基１３３−１４９から成る切断ペプチドであるＣＯＧ１３３の類似体および誘導体を提供する。この切断アポＥペプチドは、ＣＯＧ１３３（ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号１））と呼ばれ、脳虚血または脳炎症の治療または軽減に有用であるとわかった。参照によりその全体が本明細書で援用される、２００２年９月２３日出願の米国特許出願第１０／２５２，１２０号明細書。しかし、動物モデルでは、ＣＯＧ１３３は、ＴＢＩ直後に投与されると最も効果的である。本発明の化合物は、外傷性脳損傷の神経学的影響の治療および予防に対する広い治療の窓を提供する。治療の窓は、本発明の化合物がＴＢＩ後に有効に投与されうる時間を指す。治療の窓を増大させることによって、本発明の化合物はＴＢＩ後のより大きな時間間隔で投与され、ＴＢＩの神経学的影響を有効に治療または予防し、ＴＢＩ後の脳炎症もしくは虚血を減少させ、または認知機能を改善することができる。また、本発明の化合物は、外傷性脳損傷の神経学的影響の治療および予防の有効性の増強、大きな治療指数、および長い治療の窓を提供する。

本発明は、上記の化合物の使用方法も提供する。例えば、本発明の化合物は、外傷性脳損傷、アルツハイマー、脳虚血、脳浮腫、またはグリアもしくはミクログリア活性の軽減を含む中枢神経系（ＣＮＳ）疾患および障害の治療のために使用されうる。本発明は、ＣＮＳ外傷、炎症、または脳虚血と関係がある症状の改善のための方法も提供する。１つの実施形態において、本発明は、神経細胞死を軽減し、またはマクロファージ活性化を抑制する方法を提供する。

ＣＮＳ疾患および傷害の治療において、血液脳関門（ＢＢＢ）は、ペプチドなど極性分子の脳への輸送を大幅に制限する。ｉｎ ｖｉｖｏでの予備データは、ＣＯＧ１３３および他のアポＥペプチド類似体の有効性がタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）へのコンジュゲート
によって大幅に改善されうることを示す。ＰＴＤは、その他の点では細胞膜を横断することなく、または最小限にのみ横断する輸送物の細胞内送達を促進する短い塩基ペプチドである。しかし、輸送物を細胞内に輸送するＰＴＤの能力は、ＢＢＢによる輸送が可能であることを保証することはないが、これはさらに複雑な過程であり、ｉｎ ｖｉｖｏでＢＢＢ上の輸送物の輸送について試験されたＰＴＤの数は比較的少ない。したがって、ＢＢＢ輸送の適切なＰＴＤは、実験的に決定され、かつ／または既知のＰＴＤの改良によって生成されることが必要である。本発明は、ＣＯＧ１３３およびそれに誘導体および類似体を含むアポＥ類似体および誘導体のＰＴＤコンジュゲートを含む化合物を提供する。

本発明は、関節、肺、および心臓など末梢組織における中枢神経系（ＣＮＳ）傷害および疾患などを治療し、予防し、または改善する本明細書に記載された化合物を使用する方法も提供する。１つの実施形態において、本発明は、神経細胞死を軽減し、またはマクロファージ活性化を抑制するための方法も提供する。別の実施形態において、本発明はアテローム性動脈硬化症を治療し、またはアテローム斑を軽減するための方法を提供する。さらに別の実施形態において、本発明は、細菌性敗血症の症状の治療、予防、または改善のための方法を提供する。

本発明の１つの態様は、少なくとも１つの上記のアポＥ類似体を投与することによって、ｉｎ ｖｉｔｒｏまたは哺乳類対象のいずれかでグリアまたはミクログリア活性化を抑制するための方法を提供する。１つの実施形態において、この方法は、化合物がグリアまたはミクログリア活性化を軽減する量で投与されうることを提供する。

本発明の１つの態様は、上記の少なくとも１つの化合物を投与することによって、ＣＮＳ外傷、ＣＮＳ炎症、脳虚血、または脳浮腫と関係がある症状を治療し、または改善する方法を提供する。少なくとも１つの化合物は、化合物の非存在下に起こるものと比べＣＮＳ外傷、ＣＮＳ炎症、脳虚血、または脳浮腫を軽減する量で投与されうる。特定の実施形態において、本発明の方法は、外傷性脳損傷後のＣＮＳ外傷、ＣＮＳ炎症、脳虚血、または脳浮腫を軽減する。特定の実施形態において、この方法は外傷性脳損傷からの回復を加速する。特定の実施形態において、この方法は、外傷性脳損傷後の機能的回復または認知機能を改善する。

１つの実施形態において、本発明は、哺乳類対象におけるグルタミン酸興奮毒性またはＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）曝露と関係がある神経細胞死を、前記対象に少なくとも１つの本発明の化合物を投与することによって軽減する方法を提供する。少なくとも１つの化合物は、化合物の非存在下に起こる軽減と比べグルタミン酸毒性と関係がある神経細胞死を軽減する量で投与されうる。

別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された少なくとも１つの化合物を投与することによって、哺乳類対象におけるマクロファージ活性化を抑制する方法を提供する。少なくとも１つの化合物は、化合物の非存在下に起こる活性化と比べマクロファージ活性化を抑制する量で投与されうる。

１つの実施形態において、本発明は、関節炎またはリウマチ疾患の症状を治療し、または改善する方法を提供する。特定の実施形態において、この方法は、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎などの症状の治療または改善を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、多発性硬化症（ＭＳ）の症状を治療し、または改善する方法を提供する。特定の実施形態において、この方法は、本明細書に記載された少なくとも１つの化合物を投与するステップを含む、再発性／寛解型ＭＳ、二次進行性ＭＳ、進行性再発性ＭＳ、または一次進行性ＭＳの症状の治療または改善を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術中またはそれと同時に化合物を投与する方法を提供する。

別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された少なくとも１つの化合物を投与するステップを含む、アテローム性動脈硬化症を治療し、またはアテローム斑の形成を軽減する方法を提供する。少なくとも１つの化合物は、化合物の非存在下に起こるものと比べアテローム斑の形成を軽減する量で投与されうる。特定の実施形態において、この方法は、本明細書に記載された少なくとも１つの化合物を投与することによってアテローム斑発現の予防を提供する。

さらに別の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された少なくとも１つの投与によって細菌性敗血症の症状の治療、予防、または改善のための方法を提供する。少なくとも１つの化合物は、化合物の非存在下に起こるものと比べ敗血症関連炎症を軽減する量で投与されうる。

特定の実施形態において、本発明は、本明細書に記載された少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物を提供する。特定の実施形態において、本発明は、ＣＮＳまたは神経学的損傷、リウマチ疾患、多発性硬化症、ＣＡＢＧ手術、アテローム性動脈硬化症、または細菌性敗血症の治療、予防、または改善の別の薬物とともに、本明細書に記載された少なくとも１つの化合物を含む医薬組成物を提供する。本発明の医薬組成物は、例えば、静脈内、筋内、皮下、または経皮投与を含む、それを必要とする対象に投与を促進するような方法で提供されうる。参照により本明細書で援用される、Ｒｅｍｉｇｎｔｏｎｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１９版、レミントン（Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ）とジェナロ（Ｇｅｎｎａｒｏ）編、マック・パブリッシング社（Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．）、Ｅａｓｔｏｎ、ペンシルベジア（ＰＡ）を参照。本発明の方法はさらに、本明細書に記載された疾患を治療し、予防し、または改善するさまざまな投与スケジュール、投与時間、投与間隔および期間を提供する。本発明で開示されたアッセイを使用して特定された開示された化合物および変異形の機能的変異形も含まれるが、ここでかかる化合物は本明細書で開示された機能的効果を介在する。それと一致して、本発明は、本明細書で論じたさまざまな疾患および障害を治療するための薬剤を製造する方法における開示された化合物およびそれの機能的変異形の使用も含む。

本発明はさらに、それを必要とする対象にアポＥタンパク質または１つもしくはそれ以上のアポＥ類似ペプチドを投与するステップを含む放射線および放射線療法の１つもしくはそれ以上の影響に対して保護するための新規治療を提供する。この方法は、例えば、血液または骨髄移植法の一環として、全身照射（ＴＢＩ）を受ける対象の治療のために使用されうる。この方法は、例えば、癌の治療のために、または環境放射線に曝露された個体の保護または治療のために、放射線を受ける対象を治療するためにも使用されうる。

本発明はさらに、化合物の非存在下に起こるものと比べＩＢＤ、クローン病、または潰瘍性結腸炎の症状を軽減する量でアポＥタンパク質または１つもしくはそれ以上のアポＥ類似ペプチドをそれを必要とする対象に投与するステップを含む炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、または潰瘍性結腸炎の新規治療を治療する。

６．発明の詳細な説明
本発明は、脳浮腫、脳虚血およびアルツハイマーのほか、リウマチ疾患、多発性硬化症、ＣＡＢＧ手術、アテローム性動脈硬化症、敗血症、結腸炎、および放射線保護を含む中枢神経系（ＣＮＳ）疾患の治療のための化合物、組成物、および方法を提供する。本明細書に記載された化合物、組成物、および方法は、ＣＮＳ疾患と関係がある症状を改善し、認知機能を改善する。

化合物
理論に拘束されることなく、損傷脳におけるアポＥ作用に対する少なくとも２つの明確な機序、すなわち、グリア調節および神経保護を裏づける証拠がある。脳は急性および慢性損傷に対する反応の限定されたレパートリーを有する。反応酵素種（ＲＯＳ）、グルタミン酸、プロテアーゼ、および炎症性サイトカインのその後の放出によるグリア活性化は、アルツハイマー病（ＡＤ）および急性脳損傷において確認されるものなど両方の神経変性過程におけるニューロン損傷に関与していると考えられている。出願人最近、アポＥが、混合グリア培養およびリポ多糖（ＬＰＳ）による刺激後の精製ミクログリア培養におけるグリア活性化、酸化窒素（ＮＯ）の放出、および炎症性サイトカインの放出をダウンレギュレートすることを明らかにした（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）ら、１９９７年を参照）。これらのｉｎ ｖｉｔｒｏ所見は、マウスアポＥタンパク質を発現する対応対照と比べると、ＬＰＳを注射したアポＥ欠乏マウスまたは閉鎖性頭部損傷にさらされた脳において大幅にアップレギュレートされた炎症性遺伝子の発現として生物学的に重要であると思われる（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００１年）。アポＥとグリア活性化および炎症性サイトカイン放出との関係は、アポＥがミクログリアとして周知の脳特異的マクロファージと密接に関連するマクロファージにおけるシグナル反応を誘発することを示す最近の報告に照らして特に興味深い（ミスラ（Ｍｉｓｒａ）、２００１年）。アポＥ／グリア活性化関係の別の証拠が、多発性硬化症のける障害の進行が患者が発現する特定のアポＥイソフォームに依存すると思われる臨床所見によって提供される（チャップマン（Ｃｈａｐｍａｎ）ら、１９９９年）。

アポＥが神経学的疾患において役割を果たす別の機序は、直接の神経保護効果を与えることによるものである。増大する多数の証拠が、神経突起伸長の促進（ナタン（Ｎａｔｈａｎ）ら、１９９４年、ベロスタ（Ｂｅｌｌｏｓｔａ）ら、１９９５年、ホルツマン（Ｈｏｌｔｚｍａｎ）ら、１９９５年）、酸化的ストレスに対する保護（ハイエク（Ｈａｙｅｋ）ら、１９９４年、ミヤタ（Ｍｉｙａｔａ）とスミス（Ｓｍｉｔｈ）、１９９６年、マシューズ（Ｍａｔｔｈｅｗｓ）とビール（Ｂｅａｌ）、１９９６年）、およびニューロン生存を促進させる成長因子との相互作用（グットマン（Ｇｕｔｍａｎ）ら、１９９７年）におけるアポＥのイソフォーム特異的役割に関与している。出願人は最近、限局性および広範囲の虚血のマウスモデルで見られるアポＥの保護効果と一致するグルタミン酸誘発興奮毒性および酸化的ストレスのバイオアッセイにおける一次ニューロン培養に対する神経保護効果をアポＥが与えることを明らかにした（シャング（Ｓｈｅｎｇ）ら、１９９８ａおよび１９９９ｂ）。ミスラ（Ｍｉｓｒａ）ら、２００１年は、他の人と共に最近、アポＥが神経におけるカルシウム依存シグナル伝達系を開始することを明らかにした。したがって、１つの可能性は、これらの神経保護効果が神経におけるシグナル伝達系を誘発するアポＥの能力に関連していることである（ミュラー（Ｍｕｌｌｅｒ）ら、１９９８年、ミスラ（Ｍｉｓｒａ）ら、２００１年）。

アポＥ１３０−１５０ペプチドの多数の類似体が以前に作成され、それらの活性が炎症性サイトカインおよびフリーラジカルの放出の抑制のための細胞ベースのアッセイおよび受容体結合アッセイにおいて試験された。その各々の内容が参照によりその全体が本明細書で援用される、リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００３年、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８（４）、４８５２９−３３頁、および米国特許出願第１０／２５２，１２０号明細書（２００２年９月２３日出願）、同第０９／９５７，９０９号明細書（２００１年９月２１日出願）、および米国仮特許出願第６０，０７７，５５１号明細書（１９９８年３月１１日出願）の利点を請求する、現在放棄された同第０９／２６０，４３０号明細書（１９９９年３月１日出願）。

本発明は、脳虚血または脳炎症の治療または軽減に有用であるとわかったＣＯＧ１３３（ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号１））と呼ばれる、アポＥの残基１３３−１４９から成る切断ペプチドであるＣＯＧ１３３の類似体および誘導体を提供する。参照により本明細書でその全体が援用される、２００２年９月２３日に出願された米国特許出願第１０／２５２，１２０号明細書。しかし、動物モデルでは、ＣＯＧ１３３はＴＢＩ直後の３０分以内に投与されると最も効果的である。本発明は、外傷性脳損傷の神経学的影響の治療および予防の広い治療の窓および広い治療指数を提供するアミノ酸置換誘導体、ペプチド類似物、および融合タンパク質コンジュゲートを含むＣＯＧ１３３類似体および誘導体を提供する。

治療の窓は、本発明の化合物がＴＢＩ後に有効に投与されうる時間を指す。治療の窓を増大させることによって、本発明の化合物はＴＢＩ後のより大きな時間間隔で投与され、ＴＢＩの神経学的影響を有効に治療または予防し、ＴＢＩ後の脳炎症もしくは虚血を減少させ、または認知機能を改善することができる。本発明の化合物、その類似体および誘導体は、ＣＯＧ１３３よりも広い治療指数も提供する。治療指数は、損傷後の性能が生理食塩水対照よりも大幅に優れている最小の有効量によって割れる動物が死亡しない最大耐量を指す。本発明の化合物は、ＣＮＳ貫通の増大を提供するか、外傷性脳損傷の神経学的影響の治療および予防の治療の窓を増大させる。ＣＮＳ貫通は、ペプチドを含む化合物の血液脳関門を横断し、中枢神経系（ＣＮＳ）に侵入する能力を指す。

理論に拘束されることなく、ＰＴＤが、アポＥ類似体ペプチドを含む化合物のＣＮＳ貫通を増強しうると仮定されている。ＣＮＳ貫通を増大させることによって、本明細書に記載されたＰＴＤ−アポＥ−類似体コンジュゲート化合物はアポＥ類似体の有効性を増大させ、治療の窓、すなわち、脳損傷とＣＯＧ１３３を含むアポＥ類似体の有効な投与との間の時間の長さを拡大させることができる。予備データは、ＣＯＧ１３３がＴＢＩ後３０分までに投与されると神経保護的であったが、ＰＴＤ−ＣＯＧ１３３コンジュゲートがＴＢＩ後１５０分までに投与されると同等に効果的であったことを示す。これは、この新規治療化合物によって助けられうる患者の数を劇的に拡大しうる治療の窓の実質的な増大を示す。さらに、ＣＯＧ１３３を含むアポＥ類似体のＢＢＢ貫通性を増強することにより、これらの化合物が、ＢＢＢが障害を起こしているかどうかに関係なく、無数の炎症性の神経変性疾患の治療、予防、または改善に有用にされうる。

本発明のＰＴＤコンジュゲートは、脳を特異的にターゲットするため投与されることが必要な薬物（ＣＯＧ１３３）の量を低下させる追加の利点も提供する。これは、所望の保護効果を見るために投与されることが必要な化合物の最小有効量によって割れる、死亡が見られない化合物の最大耐量であるコンジュゲート化合物の優れた治療指数を提供する。指数が大きいほど、副作用プロフィールが所望の保護効果を見るために必要な濃度で減少するという点で化合物は安全となる。異なるＰＴＤが治療される障害に依存して他の特定の組織および／または臓器を優先的にターゲットされうる。

１つの実施形態において、本発明は、下記の方法のための化合物を提供する。１つの態様において、本発明は、アポＥ類似体である化合物を提供する。１つの態様において、本発明は、α−らせんペプチドである化合物を提供する。好ましい実施形態において、化合物は、配列ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号１）のペプチドである、ＣＯＧ１３３の類似体および誘導体である。より好ましい実施形態において、本発明は、

からなる群から選択される配列を含有するペプチド化合物を提供するが、ここで（ＮＭｅ）−ＬはＮ−メチル化ロイシンであり、Ａｉｂはアミノイソ−ブチル酸であり、（ｏｒｎ）はオルニチンであり、（ｎａｒｇ）はニトロアルギニンであり、（ＮＬｅ）はニューロロイシン（ｎｅｕｒｌｅｕｃｉｎｅ）であり、（ｈａｒｇ）はホモアルギニンであり、（ｄｍａｒｇ）はジメチルアルギニンであり、（ａｃｌｙｓ）はアセチルリシンであり、（ａｚｌｙｓ）はアザリシンであり、Ａｃはアセチル化アミノ末端である。アミノ酸残基の１字略語は当業者に公知である。

本発明は、アポＥ類似体にコンジュゲートしたタンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）を提供する。ＰＴＤはサイズが不均一であり、配列相同性を欠くが、大部分は正電荷を共有し、両親媒性である。本発明のＰＴＤは、ＣＮＳ貫通を促進し、または細胞内輸送を促進するものである。特定の実施形態において、ＰＴＤは、プロテグリン１、バクテネシン７、ブフォリン、およびマギニンなど抗菌ペプチド、アルギニンが豊富なＲＮＡおよびＤＮＡ結合ペプチドの宿主（例えば、ＨＩＶ−１転写活性化タンパク質（ＴＡＴ）およびショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）ホメオドメイン転写因子アンテナぺディア（ａ．ｋ．ａ．ぺネトラチン）、トランスポルタンなどキメラＰＴＤ、ファージディスプレイライブラリー由来のリシンおよびアルギニンが豊富なペプチド、ポリアルギニン、およびごく最近では、β−ホモリシンオリゴマーである（参照によりその全体が本明細書で援用される、フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ら、２００１年、リンジー（Ｌｉｎｄｓａｙ）、２００２年、タン（Ｔｕｎｇ）ら、２００３年、レイファート（Ｌｅｉｆｅｒｔ）ら、２００３年、ボゴイエビッチ（Ｂｏｇｏｙｅｖｉｔｃｈ）ら、２００２年、ガルシア−エシェベリア（Ｇａｒｃｉａ−Ｅｃｈｅｖｅｒｒｉａ）、２００３年を参照）。特定の実施形態において、ＰＴＤは、本明細書に記載されたＰＴＤの多くの追加のレベルソ−、レトロ−インベルソ、およびエナンチオ形態である。

好ましい実施形態において、本発明は、

よりなる群から選択されるＰＴＤコンジュゲートを提供する。

特定の実施形態において、ＰＴＤコンジュゲートは、ＳｙｎＢ５と呼ばれるＲＧＧＲＬＡＹＬＲＲＲＷＡＶＬＧＲ（配列番号５５）、またはＳｙｎＢ３と呼ばれるＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ（配列番号５４）である。本発明のＰＴＤ−アポＥ−コンジュゲート化合物としては、例えば、ＳｙｎＢ５−ＣＯＧ１３３、ＳｙｎＢ３−ＣＯＧ１３３、またはＳｙｎＢ５、および本明細書に記載されたＣＯＧ１３３類似体のいずれかのＳｙｎＢ３コンジュゲートが挙げられる。したがって、ＰＴＤ輸送は当初、受容体およびエネルギー非依存、非エンドサイトーシスとして特徴づけられ、細胞特性を欠いていた。しかし、これらのデータは固定細胞での蛍光顕微鏡またはフローサイトメトリーによって細胞取込みの分析により収集された。一部のグループは最近、このようにして収集されたデータが細胞固定のアーチファクト対象となったことを明らかにした（参照によりその全体が本明細書で援用される、フタキ（Ｆｕｔａｋｉ）、２００２年、ビベス（Ｖｉｖｅｓ）ら、２００３年、スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）、２００１年、リチャード（Ｒｉｃｈａｒｄ）ら、２００３年、ルンドベルク（Ｌｕｎｄｂｅｒｇ）ら、２００２年、トレン（Ｔｈｏｒｅｎ）ら、２００３年）。これらＰＴＤの多く、例えば、ペネトラチンＴＡＴ、ポリ−アルギニンがエンドサイトーシスによって吸収されることが明らかになっている（参照によりその全体が本明細書で援用される、ドリン（Ｄｒｉｎ）ら、２００３年、トレン（Ｔｈｏｒｅｎ）ら、２００３年）。ＰＴＤの構造活性関係の分析のために同じ方法も使用された。これらの試験、および、やはり固定細胞由来であった細胞特異性の試験の結果の検証は、したがって、疑問を呼んだ。例えば、生体細胞におけるぺネトラチンの取込みは最近、エンドサイトーシスであることが明らかにされた。さらに、トランスサイトーシスに重要として以前に同定された２つのトリプトファン残基の置換は、ぺネトラチンの取込みを変更することはなかった（参照によりその全体が本明細書で援用される、トレン（Ｔｈｏｒｅｎ）ら、２００３年）。輸送の機序に関する疑問とは別に、ペプチド、タンパク質、ペプチド核酸、オリゴヌクレオチド、リポソーム、および磁性ナノ粒子を含むＰＴＤによって運ばれる輸送物の生物学的効果の無数の報告があり、その転移の能力を実証している（参照によりその全体が本明細書で援用される、シュワルツェ（Ｓｃｈｗａｒｚｅ）ら、２０００年、ボゴイエビッチ（Ｂｏｇｏｙｅｖｉｔｃｈ）ら、２００２年、タン（Ｔｕｎｇ）ら、２００３年、ビベス（Ｖｉｖｅｓ）ら、２００３年）。ＰＴＤに関するわれわれの知見は再検討の必要があり、輸送機序がＰＴＤ間で異なる可能性があり、おそらくその一次構造も異なることが明らかになっている。

比較試験は、ＰＴＤが交換可能ではなく、それらは取込み速度、転移に必要な濃度、毒性、および細胞コンテキストが異なることを示した（参照によりその全体が本明細書で援用される、トレン（Ｔｈｏｒｅｎ）ら、２００３年、スズキ（Ｓｕｚｕｋｉ）ら、２００２年、マイ（Ｍａｉ）ら、２００２年）。生きた細胞を使用する試験では、ＰＴＤが、細胞コンテキストによって異なる多数の輸送様式を有しうることが報告された（参照によりその全体が本明細書で援用される、ドリン（Ｄｒｉｎ）ら、２００３年、フタキ（Ｆｕｔａｋｉ）、２００２年、レイファート（Ｌｅｉｆｅｒｔ）ら、２００３年）。最近のデータは、ＰＴＤが細胞特異性を示し、その原因がＰＴＤと特定の細胞表面グリコサミノグリカンとの優先的な相互作用でありうることを示している（参照によりその全体が本明細書で援用される、マイ（Ｍａｉ）ら、２００２年、コンソール（Ｃｏｎｓｏｌｅ）ら、２００３年、コペルフース（Ｋｏｐｐｅｌｈｕｓ）ら、２００２年）。この効果の証拠は、硫酸デキストランがペネトラチン複合体ではなかくＴＡＴの取込みを阻害し、かつヘパリンが異なる程度にＴＡＴおよびぺネトラチン複合体の内部化を阻害したことを示す試験に由来する（参照によりその全体が本明細書で援用される、コンソール（Ｃｏｎｓｏｌｅ）ら、２００３年）。これらのデータは、組織の選択的ターゲティングが特定の細胞表面発現グリコサミノグリカンをターゲットするＰＴＤを最適化することによって可能でありうることを示す。明らかに、全体にわたって輸送物の送達に最適であるＰＴＤは存在しない。ＰＴＤ、輸送物、および標的器官はすべて考慮されなければならない。

１つの態様において、化合物はアポＥタンパク質の類似体またはペプチド類似物である。さらに別の好ましい実施形態において、ペプチドは、ＡｃＡＳＨＬＲＫＬＡｉｂＫＲＬＬ（配列番号６）（ＣＯＧ４３２）である。別の好ましい実施形態において、ペプチドは、Ａｃ−ＡＳ−Ａｉｂ−ＬＲＫＬ−Ａｉｂ−ＫＲＬＬ−ＮＨ_２（配列番号７）（ＣＯＧ１４１０）である。ＣＯＧ１４１０は特に、ＣＯＧ１３３と比べ治療の窓における４倍の増幅率、治療指数における７．４倍の増幅率を示す。特定の実施形態において、本発明は、以下に詳述されるように、活性ペプチドの機能性を模倣するペプチド類似物およびそれを製造する方法を提供する。

化合物調製
本発明のペプチドは、当業界で周知の標準方法によって製造されうる。これらのペプチドと関係がある機能的活性を増強する本明細書に開示されたペプチドの変更は、当業者によって容易に達成されうる。例えば、本発明の方法で使用されるペプチドは、化学的に変更され、溶解度、血清安定性等などのパラメータを増強すると同時に、機能的活性を保持するために他の分子にコンジュゲートしうる。具体的には、本発明のペプチドはＮ末端でアセチル化され、かつ／またはＣ末端でアミド化され、またはアルブミン、免疫グロブリン、およびそれの断片、トランスフェリン、リポタンパク、リポソーム、α−２−マクログロブリン、およびα−１−糖タンパク質、ＰＥＧ、およびデキストランを含むが、これらに限定されない血清安定性を増強する分子にコンジュゲート、複合、または融合されうる。かかる分子は米国特許第６，７６２，１６９号明細書に記載されており、これは参照によりその全体が本明細書で援用される。

コンジュゲートを特定の細胞または組織にターゲットする小分子も使用されうる。ビオチン−アビジン複合体の存在が、内皮細胞上のかかる修飾ペプチドの取込みを増大させることが知られている。ペプチドの糖質部分への、例えば、β−グリコシドへのぺプチド上のセリン残基によるβ−Ｏ結合グリコシドを形成する連結は、グルコース輸送担体によりグリコシド誘導体の輸送を増強する（ポルト（Ｐｏｌｔ），Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９１：７１４４−７１１８ 頁（１９９４年）、オー（Ｏｈ）ら、Ｄｒｕｇ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，Ｉｎ Ｍｅｍｂｒａｎｅ Ｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｓ ａｓ Ｄｒｕｇ Ｔａｒｇｅｔｓ、アミドン（Ａｍｉｄｏｎ），Ｇ．Ｌ．およびサデー（Ｓａｄｅｅ），Ｗ．編、５９−８８頁、プレナム・プレス（Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ）、ニューヨーク、１９９９年）。

ペプチドは、検出および追跡のための放射活性標識および蛍光標識などさまざまな標識部分を付着させたとみられる。蛍光標識としては、フルオレセイン、エオシン、アレクサフルオル、オレゴングリーン、ローダミングリーン、テトラメチルローダミン、ローダミンレッド、テキサスレッド、クマリンおよびＮＢＤ蛍光プローブ、ＱＳＹ７、ｄａｂｃｙｌ ａｎｄ ｄａｂｓｙｌ発色団、ＢＯＤＩＰＹ、Ｃｙ．ｓｕｐ．５等が挙げられるが、これらに限定されない。

別の態様において、他の天然起源または合成ペプチドおよびタンパク質を使用し、対象ペプチドに対する抗体を発生させるための担体免疫原を提供しうるが、ここで抗体は免疫調節ペプチドを検出し、または同等の構造を有する他のペプチドを同定するための試薬としての機能を果たす。抗体を発生させるための適切な担体としては、とりわけ、ヘモシアニン（例えば、キーホールリンペットヘモシアニン−−ＫＬＨ）、アルブミン（例えば、ウシ血清アルブミン、オボアルブミン、ヒト血清アルブミン等）、免疫グロブリン、チログロブリン（例えば、ウシチログロブリン）、毒素（例えば、ジフテリアトキソイド、破傷風トキソイド）、およびポリリシン、またはポリアラニン−リシンなどのポリペプチドが挙げられる。タンパク質は好ましい担体ではあるが、他の担体、好ましくは、糖質、多糖、リポ多糖、核酸、および十分なサイズと免疫原性のものなどを含む高分子量化合物が使用されうる。また、結果として得られる抗体を使用し、標的部位への結合のための対象ペプチドと競合しうる抗イディオタイプ抗体を調製しうる。これらの抗イディオタイプ抗体は、対象ペプチドが結合するタンパク質を同定するために有用である。

本発明の治療ペプチドの別の変化は、１〜１５個のアミノ酸または類似体の治療ペプチドのＮ末端またはＣ末端アミノ酸への連結である。本発明のペプチドの類似体は、１〜１５個の追加のアミノ酸の活性ペプチドのＮ末端、Ｃ末端、もしくはＮ末端およびＣ末端への付加によっても調製されうるが、ここでかかるアミノ酸の付加は、本発明のペプチドによって結合される部位での受容体に結合するペプチドの能力に悪影響を及ぼすことはない。

本発明のペプチドはさらに本明細書に記載されたペプチドの保存的変異形を含む。本明細書で使用される保存的変異形は、ペプチドの生物学的機能に悪影響を及ぼすことがないアミノ酸配列の変化を指す。置換、挿入、または欠失が、変化した配列がペプチドと関係がある生物学的機能を阻止または崩壊させる場合にペプチドに悪影響を及ぼすと言われている。例えば、ペプチドの全体的な電荷、構造、または疎水性／親水性は、生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく変化しうる。したがって、アミノ酸配列は、例えば、ペプチドの生物学的活性に悪影響を及ぼすことなく、ペプチドをより疎水性または親水性にするように変化されうる。

通常、ペプチドの保存的置換変異形、類似体、および誘導体は、開示された配列、配列番号１−５６と少なくとも約５５％、少なくとも約６５％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９５％、もしくは少なくとも約９６％〜９９％同一のアミノ酸配列を有する。かかる配列に関して同一性または相同性は、本明細書では、配列を整列させ、ギャップを導入し、必要に応じて、最大パーセントの相同性を達成した後の既知のペプチドと同一である候補の配列におけるアミノ酸残基の比率として定義され、配列同一性の一部として保存的置換を考慮しない。Ｎ末端、Ｃ末端、または内部伸長、欠失、またはペプチド配列への挿入は、相同性に影響を及ぼすと考えるべきではない。

したがって、本発明のペプチドは、配列番号１−５６で開示されたアミノ酸配列を有する分子、治療ペプチドの少なくとも約３、４、５、６、１０、１５個、もしくはそれ以上のアミノ酸残基の保存的配列を有するそれの断片、アミノ酸残基が、ＮまたはＣ末端で開示された配列に、またはその内部に挿入されているかかるペプチドのアミノ酸配列変異形、および開示された配列のアミノ酸配列変異形、または、別の残基によって置換されている上記のその断片を含む。本発明のペプチド配列を含むペプチド化合物は、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０個、もしくはそれ以上のアミノ酸でありうる。さらに考えられる変異形としては、例えば、相同的組換え、部位特異的、またはＰＣＲ突然変異による所定の変異を含有するもの、および、ウサギ、ラット、ブタ、ウシ、ヒツジ、ウマ、およびヒト以外の霊長類種を含む他の動物種の対応するペプチド、およびペプチドが、天然起源のアミン酸以外の部分（例えば、酵素または放射性同位体など検出可能な部分）による置換、化学的、酵素的、または他の適切な手段によって共有結合的に修飾されている誘導体が挙げられる。

本発明の治療ペプチドは、自由形態または塩の形態でありうるが、ここで塩は医薬として許容可能である。これらにはナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、亜鉛、銅、マンガンなどの無機塩が含まれる。ペプチドのさまざまな有機塩は、酢酸、プロピオン酸、ピルビン酸、マレイン酸、コハク酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、桂皮酸、サリチル酸等を含むが、これらに限定されないものによっても製造されうる。

方法
以前に、ＣＯＧ１３３ペプチドが、Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸曝露と関係がある神経細胞死およびカルシウム流入を大幅に抑制することが証明された。参照によりその全体が本明細書で援用される、米国特許出願第１０／２５２，１２０号明細書。したがって、本発明のペプチドは、ＮＭＤＡ興奮毒性と関係がある疾患を治療するための改善された治療組成物の基礎を提供する。例えば、ＮＭＤＡ興奮毒性は、ＨＩＶ認知症および脳障害と関係がある（ペレス（Ｐｅｒｅｚ）ら、２００１年、ホーヒー（Ｈａｕｇｈｅｙ）ら、２００１年、ドーブル（Ｄｏｂｌｅ）、１９９９年）。

ＮＭＤＡ興奮毒性は、神経ラシリズム、筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）（ドーブル（Ｄｏｂｌｅ）１９９９年、ヌイムファック（Ｎｇｕｉｍｆａｃｋ）２００２年）、統合失調症、ハンチントン舞踏病、パーキンソン（ヌイムファック（Ｎｇｕｉｍｆａｃｋ、）２００２年、ミチリニュー（Ｍｙｔｉｌｉｎｅｏｕ）ら、１９９７年、クロップマン（Ｋｌｏｐｍａｎ）とセダイク（Ｓｅｄｙｋｈ）、２００２年、レー（Ｌｅ）とリプトン（Ｌｉｐｔｏｎ）２００１年）、双極性障害（ファルバー（Ｆａｒｂｅｒ）ら、２００２年）、ヒトにおける多発性硬化症、および動物における実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）（ポール（Ｐａｕｌ）とボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）、２００２年）、うつ、脳卒中（レー（Ｌｅ）とリプトン（Ｌｉｐｔｏｎ）、２００１年）、てんかん、および遺伝性神経代謝疾患ｄ−２−ヒドロキオキシグルタル酸尿（コルカー（Ｋｏｌｋｅｒ）ら、２００２年）とも、アルツハイマー病（バイ（Ｂｉ）ら、２００２年、バイ（Ｂｉ）とスゼ（Ｓｚｅ）２００２年）および外傷性脳損傷（ラオ（Ｒａｏ）ら、２００１年、レグナー（Ｒｅｇｎｅｒ）ら、２００１年、スー（Ｘｕ）とルオ（Ｌｕｏ）、２００１年）に加えて関係がある。ＮＭＤＡ拮抗薬は臨床麻酔（ファルバー（Ｆａｒｂｅｒ）ら、２００２年）においても使用され、慢性疼痛（マックケナ（ＭｃＫｅｎｎａ）とメルザック（Ｍｅｌｚａｃｋ）、２００１年、レー（Ｌｅ）とリプトン（Ｌｉｐｔｏｎ）、２００１年）、薬物耐性（カディ（Ｃａｄｙ）、２００１年）、および動物モデルにおけるアルコール依存（コトリンスカ（Ｋｏｔｌｉｎｓｋａ）、２００１年）を阻害することが証明されている。

したがって、本発明は、上記の疾患または障害のいずれかの治療のための方法および医薬製剤、およびさまざまな疾患を治療するために有用な他の既知の化合物を含有する複合治療組成物における開示されたペプチドおよびペプチド類似物の使用を含む。例えば、本発明のペプチドおよび他の化合物は、ウイルス複製を阻害し、ＨＩＶ認知症を予防または治療することに適合した併用療法において、ＨＩＶ逆転写酵素およびプロテアーゼ阻害剤を含む既知のＨＩＶ薬物と組合され、または単独もしくは補助製剤における他のＮＭＤＡ拮抗薬とともに投与されうる。ある著者は最近、ＣＮＳの抗レトロウイルス療法がＡＩＤＳ認知症候群を示す患者における機能および予後の改善に重要である場合でも、毒性の重要な部分は抗レトロウイルス療法中でも継続する間接的機序によって介在されると思われるため、長期的には、追加の神経保護を提供し、神経毒性の二次機序を阻止することも必要でありうると論評した（クリフォード（Ｃｌｉｆｆｏｒｄ）、２００２年）。

１つの実施形態において、ペプチドは、スタチンとも呼ばれる、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害剤を含む抗硬化症と組合せられうる。本発明の方法における使用に適切なスタチンとしては、例えば、ロバスタチン（ＭＥＶＡＣＯＲ（登録商標）、メルク（Ｍｅｒｃｋ））、シンバスタチン（ＺＯＣＯＲ（登録商標）、メルク（Ｍｅｒｃｋ））、プラバスタチン（ＰＲＡＶＡＣＨＯＬ（登録商標）、ブリストル・マイヤーズ・スキブ（ＢｒｉｓｔｏｌＭｙｅｒｓＳｑｕｉｂｂ））、ロスバスチン（ＣＲＥＳＴＯＲ（登録商標）、アストラゼネカ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ））、フルバスタチン（ＬＥＳＣＯＬ（登録商標）、ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、およびアトルバスタチン（ＬＩＰＩＴＯＲ（登録商標）、ワーナー・ランバート（Ｗａｒｎｅｒ−Ｌａｍｂｅｒｔ））が挙げられる。

リルゾール（ＲＩＬＵＴＥＫ（登録商標）、ローン・ポーレンク（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ）は、筋萎縮性側索硬化症における神経保護治療のために使用され、現在、ハンチントン病およびパーキンソン病の治療にたいする臨床試験において試験されているグルタミン酸拮抗薬特性を有する薬物である（シーファー（Ｓｃｈｉｅｆｅｒ）ら、２００２年、ドーブル（Ｄｏｂｌｅ）、１９９９年）。シーファー（Ｓｃｈｉｅｆｅｒ）らは最近、リルゾールがハンチントン病のトランスジェニックマウスモデルにおける生存時間を延長させ、核内封入体形成を変化させることを明らかにした。したがって、ＮＭＤＡが本発明のペプチドおよび化合物の拮抗的役割であると考えると、これらのペプチドおよび化合物は、単独またはリルゾールなど他のグルタミン酸拮抗薬と組合せて、ＡＬＳ、ハンチントン、およびパーキンソンの治療用の医薬製剤において使用されうる。

Ｌ−デプレニルは、パーキンソン病の障害の出現および徴候と症状の進行を遅らせるモノアミンオキシダーゼ（ＭＡＯ）−Ｂの阻害剤であり、グルタミン酸受容体の活性化から下流に生じるイベントからの保護効果を発揮すると予想される（ミチリニュー（Ｍｙｔｉｌｉｎｅｏｕ）ら、１９９７年）。ＭＡＯ−Ｂ阻害剤、レボドパなどドーパミン受容体拮抗薬、およびＮＭＤＡ受容体拮抗薬はすべて抗パーキンソン効果を有することが証明されており、多剤併用が薬物の抗パーキンソン効果を相乗的に増強することが証明されている（クロップマン（Ｋｌｏｐｍａｎ）とセダイク（Ｓｅｄｙｋｈ）、２００２年）。したがって、ＮＭＤＡが本発明のペプチドおよび化合物の拮抗的役割であると考えると、これらのペプチドおよび化合物は、単独または他のＮＭＤＡ受容体拮抗薬、Ｌ−デプレニルなどＭＡＯ−Ｂ阻害剤、およびレボドパなどドーパミン受容体拮抗薬と組合せて、パーキンソンの治療用の医薬製剤において使用されうる。

グルタミン酸興奮毒性の結果としてのフリーラジカルの産生は、統合失調症の病因に関与している（ヌイムファック（Ｎｇｕｉｍｆａｃｋ）２００２年）。したがって、研究者は、ＡＬＳ、パーキンソン病、およびハンチントン病など他の神経学的疾患において使用される抗酸化薬物による統合失調症の治療の検討を開始した。本発明のＮＭＤＡ受容体拮抗ペプチドおよび化合物がグルタミン酸興奮毒性の結果としてのフリーラジカルの産生を阻害するために使用されうると考えると、これらのペプチドおよび化合物は、単独または他の抗酸化薬物と組合せて、統合失調症の治療用の医薬製剤において使用されうる。

ＮＭＤＡ受容体の機能低下を阻害する抗けいれん薬、抗てんかん薬は、双極性障害における臨床用途であることがわかった（ファルバー（Ｆａｒｂｅｒ）ら、２００２年）。かかる薬剤としては、フェニトイン（ＤＩＬＡＮＴＩＮ（登録商標）、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ））、カルバマゼピン（ＴＥＧＲＥＴＯＬ（登録商標）、ノバルティス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ））、バルプロ酸（ＤＥＰＡＫＯＴＥ（登録商標）、アボット（Ａｂｂｏｔｔ））、ラモトリギン（ＬＡＭＩＣＴＡＬ（登録商標）、グラクソスミスクリン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ））、リルゾール（ＲＩＬＵＴＥＫ（登録商標）、ローン・ポーレンク（Ｒｈｏｎｅ−Ｐｏｕｌｅｎｃ））、テトロドトキシン、フェルバメート（ＦＥＬＢＡＴＯＬ（登録商標）、ウォレス（Ｗａｌｌａｃｅ））、ガバペンチン（ＮＥＵＲＯＮＴＩＮ（登録商標）、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ））およびエトスキシミド（ＺＡＲＯＮＴＩＮ（登録商標）、ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ））が挙げられる。本発明の化合物のペプチドもＮＭＤＡ受容体関連神経毒性を阻害すると考えると、本発明のペプチドおよび化合物は、単独または他のＮＭＤＡ受容体拮抗薬またはＮＭＤＡ受容体低下機能の阻害剤と組合せて、双極性障害またはてんかんを治療する医薬および方法において使用されうる。

多発性硬化症（ＭＳ）は、免疫療法に対する反応および動物モデルの実験的自己免疫脳炎（ＥＡＥ）の存在の所見によって判定される免疫介在性疾患である。例えば、ミックス（Ｍｉｘ）ら、２００４年、Ｊ．Ｎｅｕｒｏｉｍｍｕｎｏｌ．１５１（１−２）：１５８−７０頁、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）ら、２００４年、Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．５５（５）：６５４−９、およびニー（Ｎｉ）ら、２００４年、Ｍｕｌｔ．Ｓｃｌｅｒ．１０（２）：１５８−６４頁を参照。インターフェロン（ＩＦＮ）ベータ１ｂ、ＩＦＮベータ−１ａ、および酢酸ガラティラメル（ＣＯＰＡＸＯＮＥ（登録商標）、テヴァ（Ｔｅｖａ））は、再発または寛解型のＭＳのために使用されている現在の治療薬であり、ＭＳの免疫学的病因に対処する作用の機序を有する（ジブ・ヤルブット（Ｄｈｉｂ−Ｊａｌｂｕｔ）、２００２年）。例えば、インターフェロンは細胞表面特異的受容体に結合し、抗ウイルス、抗増殖性、および免疫調節遺伝子産物の分泌で終わる、続いて起こるシグナル経路を開始する。合成分子である酢酸ガラティラメルは、ミエリン塩基性タンパク質反応Ｔ細胞の活性化を阻害し、抗炎症効果によって特徴づけられるＴ細胞レパートリーを誘発する。ＩＶ免疫グロブリン（ＧＡＭＡＧＡＲＤ（登録商標）、バクスター（Ｂａｘｔｅｒ））、メトトレキサート（ＲＨＥＵＭＡＴＲＥＸ（登録商標）、アメリカン・シアナミド（ＡｍｅｒｉｃａｎＣｙａｎａｍｉｄ））、およびアザチオプリン（ＩＭＵＲＡＮ（登録商標）、グラクソスミスクリン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ））を含むいくつかの現在市販の治療薬は、承認治療薬と組合せて再発−寛解型の多発性硬化症のための治療薬として評価されている（カラブレシ（Ｃａｌａｂｒｅｓｉ）、２００２年）。ＮＭＤＡ受容体拮抗薬メマンチン（ＮＡＭＥＮＤＡ（登録商標、メルツ（Ｍｅｒｚ））が血液脳関門の破壊を予防し、これを修復し、かつｉｎ ｖｉｖｏでＥＡＥの病因と関係がある症状を軽減することが証明されていることを考えると（ポール（Ｐａｕｌ）とボルトン（Ｂｏｌｔｏｎ）、２００２年）、本発明のペプチドおよび化合物は、単独または他のＮＭＤＡ受容体拮抗薬と組合せて、もしくはインターフェロンまたは酢酸ガラティラメルに加えてヒトにおけるＭＳの治療のために使用されうる。

持続性のヒト疼痛の動物モデルを使用することにより、マックケナ（ＭｃＫｅｎｎａ）およびメルザック（Ｍｅｌｚａｃｋ）は最近、疼痛挙動がＮＭＤＡ受容体拮抗薬ＡＰ５による治療によって大幅に軽減されたことを示した（マックケナ（ＭｃＫｅｎｎａ）およびメルザック（Ｍｅｌｚａｃｋ）、２００１年）。同様に、フォン・ベルゲン（Ｖｏｎ Ｂｅｒｇｅｎ）らは最近、競合的非−Ｎ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸興奮性アミノ酸受容体拮抗薬であるＬＹ２９３５５８の髄腔内投与が、１８０分の間中ラットの感覚および運動反応を阻害し、翌日に完全な回復が確認されたことを明らかにした。ＬＹ２９３５５８の効果は、ブピバカインの効果よりも顕著かつ持続的であり、著者らはグルタミン酸受容体を阻害するＬＹ２９３５５８のような薬物がヒトにおける脊髄麻酔のための局所麻酔薬の代替になりうると結論づけるに至った（フォン・ベルゲン（Ｖｏｎ Ｂｅｒｇｅｎ）ら、２００２年）。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、単独または他のＮＭＤＡ受容体拮抗薬と組合せて、もしくは局所麻酔薬として他の麻酔化合物に加えてヒトおよび動物において使用されうる。

ＮＭＤＡ受容体は、薬物使用の病理生理学において主要な役割を果たすとも考えられている（コトリンスカ（Ｋｏｔｌｉｎｓｋａ）、２００１年、ソイカ（Ｓｏｙｋａ）ら、２０００年）。例えば、コトリンスカ（Ｋｏｔｌｉｎｓｋａ）は、エタノール投与前に投与されるＮＭＤＡ受容体拮抗薬メマンチンがラットにおけるエタノール依存の発現を予防することを示した。ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）らは、モルヒネ禁断症候群の強さがＮＭＤＡ受容体拮抗薬ＬＹ２３５９５９で前処置したラット子において軽減したことを明らかにした。頭部の動き、足の移動、回転、歩行など禁断行動は減少し、ＬＹ２３５９５９で前処置した子において発声は完全に除去された（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）ら、２００２年）。最近の調査によると、依存症の基本機序のターゲットをめざした方法は、依存症が中枢神経系における適応変化によって引き起こされ、再発の主な原因である渇望がドーパミン作動機序に依存し、かつ高い全身興奮性を要求するという仮定に依拠する。したがって、薬理学的方法は、電位依存性チャンネル（例えば、ニモジピン）およびＮＭＤＡ受容体（例えば、メマンチン）により神経へのカルシウムエントリーを阻害することによってニューロン適合性を軽減する薬物、および抑制ＧＡＢＡ作動系を刺激する薬物（ガンマ−ビニル−ＧＡＢＡ、バクロフェン）を必要とした。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、単独またはメマンチンなど他のＮＭＤＡ受容体拮抗薬と組合せて、もしくはニモジピン、ガンマ−ビニル−ＧＡＢＡ、バクロフェンなど他のニューロン適合性化合物に加えてヒトにおけるアルコールおよび薬物依存症の予防および治療のための組成物および方法において使用されうる。

ラオ（Ｒａｏ）らは、ラットにおける外傷性脳損傷後のメマンチンによる神経保護を報告した（ラオ（Ｒａｏ）ら、２００１年）。他の著者らは最近、ＮＭＤＡ受容体の過剰な活性化が二次脳障害を誘発する最も重要な因子の１つであり、かつＡＰ５などＮＭＤＡ受容体拮抗薬が脳損傷後の浮腫から脳を保護しうることを論評した。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、単独またはＮＭＤＡ受容体拮抗薬と組合せてヒトおよび動物における脳損傷および関連性の二次脳障害の治療用の組成物および方法において使用されうる。

スタチンは、頭部外傷を有する患者の治療および頭部外傷やアルツハイマー病と関係がある炎症の軽減において有効であることが証明されている。例えば、マックガート（ＭｃＧｉｒｔ）ら、２００２年、Ｓｔｒｏｋｅ，２００２年１２月によって報告されているように、シンバスチン治療がくも膜下出血（ＳＡＨ）のマウスモデルにおける血管けいれんを軽減し、かつ機能的転帰を改善することが証明された。別の試験では、アトルバスチンによる前処置が同様の保護効果を有し、ＳＡＨおよび閉鎖性頭部損傷における転帰の改善において有効な薬剤クラスとしてのスタチンの役割を示している。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、シンバスチンおよび／またはアトルバスチンを含む、１つもしくはそれ以上のスタチン薬剤と組合せて、ヒトおよび動物における脳損傷および関連二次脳障害の治療のための組成物および方法において使用されうる。

関節炎の新しい治療薬としては、腫瘍壊死因子と結合するペプチドおよびタンパク質が挙げられる。エタネルセプト（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）、アムゲン（Ａｍｇｅｎ））は、ヒトＩｇＧ１のＦｃ部分と連結したヒト７５ｋｄ腫瘍壊死因子受容体の細胞外リガンド結合部分から成る二量体融合タンパク質である。アダリムマブ（ＨＵＭＩＲＡ（登録商標）、アボット（Ａｂｂｏｔｔ））は組換えヒトＩｇＧ１モノクローナル抗体である。腫瘍壊死因子結合タンパク質は、関節リウマチおよび他のリウマチ疾患の進行を遅らせ、かつその症状を緩和することにおいて優れた結果を示した。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、単独、または、例えば、関節リウマチ、強直性脊椎炎、多関節経過若年性関節リウマチ、および乾癬性関節炎を含むリウマチ疾患の治療用の他の薬物と組合せて使用されうる。

本方法および化合物は、急性ＣＮＳ損傷と関係がある神経学的徴候および症状の予防、治療、および改善に有用である。本明細書で使用される急性ＣＮＳ損傷としては、脳卒中（血栓症、塞栓症、または血管収縮によって引き起こされる）、閉鎖性頭部損傷、全脳虚血（例えば、心筋梗塞、心不整脈、出血性ショック、および冠状動脈バイパス移植後脳損傷を含むいずれかの原因の全身性低血圧による虚血）、局所虚血、および頭蓋内出血が挙げられるが、これらに限定されない。中枢神経系への虚血損傷は、全虚血または局所虚血状態のいずれかによりもたらされうる。全虚血は、全脳への血流が、心停止中などある期間にわたって停止する場合に生じる。局所虚血は、脳の一部が、血栓塞栓閉塞、外傷性損傷、浮腫、および脳腫瘍の間に脳血管の正常血流を奪われている場合に生じる。脳虚血によるＣＮＳ損傷の多くは、虚血状態後の数時間もしくはさらに数日の間に生じ、損傷組織による細胞毒性産物の放出に続発する。

特定の実施形態において、本発明の方法は、冠状動脈バイパス移植（ＣＡＢＧ）手術の前、最中、または同時の化合物の使用を提供する。デューク（Ｄｕｋｅ）大学で実行され、２００１年２月のＮｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅで発表された試験によれば、冠状動脈バイパス手術後の患者の実質的部分は、その精神能力において「ポンプヘッド」現象と呼ばれる測定可能な障害を経験する。この試験によれば、試験された患者の４２％は手術後に試験スコアの少なくとも２０％の低下を示した。さらに、認知能力の減少は５年間持続した。

本方法および化合物は、アルツハイマー病（ＡＤ）およびＨＩＶ関連脳症を含むが、これらに限定されない慢性神経学的疾患と関係がある神経学的徴候および症状の予防、治療、または改善にも有用である。アポＥペプチドがグリア活性化を抑制するために使用されうる本発明者による所見は、ミクログリア活性化を伴う神経学的疾患の治療における本発明のペプチドおよび化合物の役割を提供する。例えば、ミクログリアはＡＤにおける活性化のマーカーを発現し、ＡＤにおける重大な炎症性イベントがミクログリアに影響を及ぼすことを示している。かかる活性化ミクログリアはアミロイド斑の近くに群がる（グリフィン（Ｇｒｉｆｆｉｎ）ら、１９９５年）。ミクログリアはてんかんにおいても活性化される（シェング（Ｓｈｅｎｇ）ら、１９９４年）。

最近、アミロイドベータペプチドの取込みおよび病原性効果がＮＭＤＡ受容体拮抗薬によって阻害されることが証明されている（バイ（Ｂｉ）ら、２００２年）。他の試験は、抗炎症性薬物がＡＤの発症および進行を遅らせうることを示す（ブライトナー（Ｂｒｅｉｔｎｅｒ）ら、１９９５年、ロジャース（Ｒｏｇｅｒｓ）ら、１９９３年）。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、単独もしくは他のＮＭＤＡ受容体拮抗薬または他の既知の医薬および特にＡＤの治療に使用される抗炎症薬と組合せてヒトにおけるＡＤの治療用の組成物および方法において使用されうる。

本方法および化合物は、多発性硬化症、脈管炎、急性播種性脳脊髄炎、およびギランバレー症候群を含むが、これらに限定されないＣＮＳを含む神経系に影響を及ぼす炎症性状態と関係がある神経学的徴候および症状の予防、治療、または改善にも有用である。これに関しては、本発明のアポＥペプチドおよび他の化合物を単独もしくは他の既知の抗炎症薬またはサイトカインと組合せて使用し、ＣＮＳ炎症性状態の治療用の医薬組成物を形成することができる。

本方法および化合物は、急性または慢性ＣＮＳ疾患の一部として生じるＣＮＳにおけるグリアの活性化の予防、抑制、または軽減に有用である。本方法および化合物の効果は、細胞または組織レベル（例えば、組織学的または形態計測学的に）で、または対象の神経学的状態を評価することによって評価されうる。グリア活性化の抑制または軽減は、当業者に明らかであろうさまざまな方法によって評価されうるが、かかる方法の１つは活性化グリアによって産生されることが知られている化合物の産生または存在を測定し、かつかかる測定値を対照条件下の同じ化合物のレベルと比較することである。あるいは、ミクログリア活性化の抑制、軽減、または予防における本方法および化合物の効果は、治療対象および対照対象におけるＣＮＳ疾患の徴候および／または症状を比較することによって評価されうるが、ここでかかる徴候および／または症状はミクログリアの活性化と関係があり、またはこれに続発する。

アポＥ受容体結合ペプチドは、敗血症のｉｎ ｖｉｖｏ動物モデルにおける末梢においてサイトカインのＬＰＳ誘発産生に対して保護することも証明されている。参照によりその全体が本明細書で援用される、米国特許出願第１０／２５２，１２０号明細書。したがって、本発明のペプチドおよび化合物は、単独または他の既知の抗炎症性サイトカインおよび抗体と組合せて敗血症の治療用の組成物および方法において使用されうる。

本明細書で使用される「治療する」および「改善する」という語は、処置される対象を苦しめるＣＮＳまたは敗血症状態の基礎を成す疾患過程の逆転または停止を示すことを必ずしも意味していない。かかる語は、処置される状態と関係がある有害な徴候および／または症状が緩和もしくは軽減され、または進行速度が、治療の非存在下に生じるものと比べ軽減されることを示す。疾患徴候または症状における変化は、対象のレベルで（例えば、対象の機能または条件が評価される）、または組織もしくは細胞レベルで（例えば、グリアまたはマクロファージ活性化のマーカーの産生が緩和または軽減される）評価されうる。本発明の方法が慢性ＣＮＳ状態（アルツハイマー病など）を治療するために使用される場合、方法は認知症など症状の発症を減速または遅延させることができるが、基礎を成す疾患過程に必ずしも影響を及ぼさず、または逆転することはない。

炎症性過程がアテローム硬化性過程の状況を介在することが知られている。例えば、ハンソン（Ｈａｎｓｓｏｎ）（１９９４年）、ベルリーナー（Ｂｅｒｌｉｎｅｒ）ら（１９９５年）、ワタナベ（Ｗａｔａｎａｂｅ）ら（１９９７年）を参照。アポＥは血管壁で局所にマクロファージによって分泌されることが知られている（ただし、個体においてマクロファージによって分泌される量は、肝によって産生されるアポＥの量と比べ些細である）。アテローム性動脈硬化症の標準的なモデルにおいて、アポＥはコレステロールを血流から除去し、かつそれをマクロファージまたは肝に送達する働きをする。しかし、血管壁でのマクロファージによって分泌されるアポＥは、いかなる脂質代謝効果とも無関係に、アテローム斑形成を減少させることが明らかになった。例えば、アポＥ欠乏マウスは高コレステロール血症およびアテローム性疾患のモデルとして認められている。アポＥ分泌マクロファージをかかるマウスに提供することにより、アテローム斑形成が劇的に減少する。リントン（Ｌｉｎｔｏｎ）ら（１９９５年）。逆に言えば、野生型マウスのマクロファージをアポＥ欠乏マクロファージと置換することにより、マウスが継続して肝によってアポＥを産生する場合でも、アテローム性変化は加速する。ファジオ（Ｆａｚｉｏ）ら（１９９７年）。

アテローム性動脈硬化症においては、アポＥが、受容体介在イベントによって、血管壁も近くでマクロファージ活性化をダウンレギュレートすると仮定されている。マクロファージ活性化のかかるダウンレギュレーションは、アテローム斑形成と関係がある一連のイベントを中断し、またはこれに干渉し、それによって、アテローム性病変の形成を軽減または遅くさせる。アテローム性動脈硬化症と関係があることが知られている一連のイベントとしては、平滑筋細胞および内皮細胞増殖、および泡沫細胞形成が挙げられる。アポＥがこれらの過程の各々をダウンレギュレートする証拠がある。したがって、アポＥは、脂質に対するその効果とは無関係に、ｉｎ ｖｉｖｏでアテローム性動脈硬化症の存在および増殖に影響を及ぼす。アテローム性動脈硬化症の進行は、アテローム斑の量またはサイズ、またはアテローム性病変によって阻害される血管の割合、またはかかる斑の成長速度を測定することによって評価されうる。

アポＥがマクロファージにおけるカルシウム介在シグナルを変換し（Ｃａ２＋／イノシトールリン酸シグナル変換）、アポＥがマクロファージ活性化をダウンレギュレートすることによってマクロファージ機能を変更し、したがって、その後の炎症を変更することを示すことが証明されている。したがって、ミクログリアおよびＣＮＳ医薬本明細書に記載されたペプチド、化合物、方法、および医薬製剤は、アテローム性動脈硬化症を抑制、予防し、遅らせるマクロファージの活性化を抑制する方法において有用である。

アテロームせ動脈硬化症は、動脈内膜の肥厚およびアテローム斑における脂質の蓄積を指す。アテローム性動脈硬化症を治療または予防する本発明の化合物の投与は、本明細書で論じたいずれかの手段、および当業界で周知である他の適切な方法によって行われうる。アテローム硬化性変化を予防し、遅らせ、または治療する本化合物を使用すると、それらが血液脳関門を通過するように形成される必要がないことが明らかである。本方法によって治療されうる状態としては、冠状動脈、頸動脈など中枢神経系を供給する動脈、末梢循環または内蔵循環の動脈のアテローム性動脈硬化症、および腎動脈疾患が挙げられる。非経口投与などの投与は、部位特異的または全身血流内でありうる。

本方法および化合物は、放射線の悪影響からの対象の保護においても有用である。照射後の脳損傷増大の所見は、抗炎症治療法が照射後の損傷から正常な脳組織を保護しうることを本発明者に示唆した。アポＥ欠乏動物はＬＰＳ注射後の全身炎症性反応の増大および高い死亡率を有し、かつ外因性アポＥの投与が炎症カスケードをダウンレギュレート／抑制することによって死亡を改善することが報告されている（ファン・オーステン（Ｖａｎ Ｏｏｓｔｅｎ）ら、１９９１年）。したがって、本発明は、放射線の悪影響から対象を保護するアポＥおよび具体的にはアポＥ類似ペプチドの投与を包含する。

具体的には、本発明は、放射線の少なくとも１つの影響に対してそれを必要とする対象を保護するための方法を包含するが、これは前記対象に保護量のアポＥもしくは少なくとも１つのアポＥ類似ペプチドを投与するステップを含む。好ましいアポＥ類似ペプチドとしては、ＣＯＧ１３３、配列ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号１）のペプチド、および本明細書に記載されたＣＯＧ１３３の誘導体が挙げられる。

本発明の方法によって対処されうる放射線曝露の種類としては、例えば、前記対象が移植法もしくはより具体的には血液または骨髄移植を受けた全身照射（ＴＢＩ）、例えば、癌の治療中の臓器の１つもしくはそれ以上の特定の臓器の放射線療法、および環境放射線曝露、すなわち、例えば、核施設もしくは核廃棄物貯蔵地、戦争、テロ行為、または放射線への曝露を伴う実験もしくは他の作業など偶発的もしくは意図的な曝露が挙げられる。本発明の方法は、放射線曝露の前、最中、または同時に実行されうる。

放射腺曝露が癌の放射線療法である場合、かかる癌としては、脳腫瘍、頭頸部癌、肺癌、乳癌、前立腺癌、皮膚癌、直腸癌、頸子宮癌、リンパ腫、および肉腫を含むが、これらに限定されない放射線療法の影響を受けやすい癌が挙げられる。放射線療法は、外部ビーム照射または近接照射療法によって与えられうる。本発明の方法は、放射線療法の前、最中、または同時に実行されうる。

例えば、一般に、本発明の方法は、放射線曝露後数分から数時間以内、または放射線曝露後約１日、約２日、約３日、約４日、約５日、約６日、約７日、約１０日、もしくは約２〜３週間〜１か月以内に実行されうる。一般に、アポＥおよびペプチドは、最良の結果のために放射線曝露後できるだけ速やかに投与されるべきである。放射線に曝露される予定の−−もしくは曝露の危険にある−−対象における放射線曝露の影響を予防または軽減するために方法が実行される場合、本発明の化合物は、曝露前の約１０日、約７日、約６日、約５日、約４日、約３日、約２日、もしくは約１日の時点で、または曝露の直前（例えば、曝露前の数時間から数分以内）に投与されうる。次いで、投与は上記の通り暴露後に継続されうる。

上記の通り、本発明の方法は、放射線の少なくとも１つの影響に対してそれを必要とする対象を保護する。放射線曝露の症状または影響が発現した後に与えられると、本発明の方法は放射線の少なくとも１つの影響を治療または減少させるために使用されうる。本明細書で使用される「保護する」「治療する」および「減少させる」という語は、放射線曝露に付随する、またはこれによって引き起こされる疾患過程の逆転または停止を示すことは必ずしも意味されない。かかる語は、放射線曝露と関係がある有害な徴候および／または症状が緩和もしくは軽減され、または進行速度が、治療の非存在下に生じるものと比べ軽減されることを示す。疾患徴候または症状における変化は、対象のレベルで（例えば、対象の機能または条件が評価される）、または組織もしくは細胞レベルで（例えば、グリアまたはマクロファージ活性化のマーカーの産生が緩和または軽減される）評価されうる。本発明の方法が放射線曝露を治療するために使用される場合、本発明の方法は、放射線毒性の症状の発症を遅らせ、または遅延させうるが、基礎を成す疾患過程に必ずしも影響を及ぼさず、または逆転しない。

本発明による放射線曝露もしくはＴＢＩまたは放射線療法の影響としては、少なくとも１つのサイトカインの放射線誘発産生が挙げられるが、これに限定されない。かかるサイトカインとしては、とりわけ、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦα）、形質転換成長因子ベータ（ＴＧＦ−β）、インターロイキン−１アルファ（ＩＬ１α）、インターロイキン−１ベータ（ＩＬ１β）、インターロイキン−６（ＩＬ６）、およびインターロイキン−１２（ＩＬ１２）からなる群から選択されるサイトカインが挙げられる。白血球活性化の酵素マーカーの変化（例えば、ミエロペルオキシダーゼ、ＣＯＸ−２発現、ｉＮＯＳ発現等）および細胞アポトーシス（例えば、ＤＮＡ断片化、カスパーゼ活性化等）も含まれる。放射線誘性の影響としては、行動の影響、急性および遅発口内乾燥を含む口内乾燥、放射線誘発神経毒性、遅延性放射線誘発脳壊死、とりわけ、皮膚萎縮、放射線膀胱炎（膀胱の炎症）、直腸炎（直腸および肛門の炎症）、および喉頭への損傷からなる群から選択される傷害を含む放射線誘発軟組織または血管傷害、白血球減少症、紫斑、出血、脱毛、下痢、発熱、電解質平衡異常、けいれん、運動失調、振戦、および昏睡も挙げられるが、これらに限定されない。集合的に放射線皮膚症候群と呼ばれる放射線誘発皮膚損傷としては、腫脹、落屑、潰瘍、およびフィステル形成を含む遅発性皮膚線維症を伴う急性皮膚反応を挙げることができる。

本発明はさらに、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病または潰瘍性結腸炎を治療する方法を提供するが、これは、それを必要とする対象にアポＥタンパク質または１つもしくはそれ以上のアポＥ類似ペプチドを、そのタンパク質の非存在下に生じるものと比べＩＢＤ、クローン病、または潰瘍性結腸炎の症状を軽減する量で投与するステップを含む。本発明の方法の実施において、治療ペプチドおよび／またはそれの誘導体は、単独または他の活性成分と組合せて使用されうる。必要に応じて、炎症性腸疾患を治療するために一般的に使用される１つもしくはそれ以上の薬剤は、本発明の方法および組成物における治療ペプチドの代わりとして、またはこれに加えて使用されうる。かかる薬剤としては、生物製剤（例えば、インフリキサマブ、アデリムマブ、およびＣＤＰ−８７０）、小分子免疫調節剤（例えば、ＶＸ７０２、ＳＣＩＯ４６９、ドラマピモド、ＲＯ３０２０１１９５、ＳＣＩＯ３２３、ＤＰＣ３３３、プラナルカサン、マイコフェノレート、およびメリメポジブ）、非ステロイドイムノフィリン非依存免疫抑制剤（例えば、シクロスポリン、タクロリムス、ピメクロリムス、およびＩＳＡｔｘ２４７）、５−アミノサリチル酸（例えば、メサラミン、スルファサラジン、バルサラジド２ナトリウム、およびオルサラジンナトリウム）、ＤＭＡＲＤ（例えば、メトトレキサートおよびアザチオプリン）およびアロセトロンが挙げられる。したがって、１つの実施形態において、本発明は、配列番号１−５６の配列を含むペプチド化合物および前記薬剤のいずれかの組合せ、およびそれによる炎症性腸疾患を治療する方法を特徴づける。

本発明の方法から恩恵を受ける適切な対象としては、ヒト、ヒト以外の霊長類、および霊長類以外の哺乳類を含む雌雄の哺乳類対象が挙げられる。対象としては、獣医（コンパニオン動物）対象のほか、家畜類および外来種が挙げられる。

組成物
本発明の化合物および治療は自由形態または塩の形態でありうるが、ここで塩は医薬として許容可能である。

本明細書で使用される「対象の脳に投与する」という語は、化合物を中枢神経系組織、かつ具体的には、治療される対象の脳に提供する、当業界で周知である投与の経路の使用を指す。

好ましくは、本発明の化合物は、医薬として許容可能な担体と組合せて使用される。したがって、本発明は、対象への投与に適切な医薬組成物をも提供する。かかる組成物は、医薬として許容可能な担体と組合せて本発明の化合物の有効量を含む。担体は、組成物が非経口投与に適合されるように液体であり、または固体、すなわち、経口投与のために形成された錠剤または丸剤でありうる。さらに、担体は、組成物が吸入用に適合されるように噴霧可能な液体または固体の形でありうる。非経口投与される場合、組成物は発熱物質を含まず、許容可能な非経口担体中にあるべきである。あるいは、活性化合物は、既知の方法を使用してリポソームにカプセル化して形成されうる。また、ＣＮＳ状態を治療するペプチドの鼻内投与は当業界で周知である（例えば、ＡＤを治療するペプチドＴの鼻内投与に関する、パート（Ｐｅｒｔ）への参照により本明細書で援用される米国特許第５，５６７，６８２号明細書を参照）。鼻内投与のための本発明の化合物の調製は、当業界で周知の方法を使用して実行されうる。

免疫調節ペプチドは単独、または、例えば、スーパオキシドジスムターゼなど酸素ラジカル捕捉剤、またはコルチコステロイド、ヒドロコルチゾン、プレドニゾンなどの抗炎症剤、ロペルアミドなどの下痢止め剤、ペニシリン、セファロスポリン、バシトラシンなどの抗菌剤、キナクリン、クロロキンなどの抗寄生虫剤、ニスタチン、ゲンタマイシンなどの抗真菌剤、アシクロビル、ガンシクロビル、リバビリン、インターフェロンなどの抗ウイルス剤、サリチル酸、アセトアミノフェン、イブプロフェン、フルビプロフェン、モルヒネなどの鎮痛剤、リドカイン、ブピバカイン、ベンゾカインなどの局所麻酔剤、結腸刺激因子、顆粒球マクロファージ結腸刺激因子などの成長因子、ジフェンヒドラミン、クロルフェンクラミンなどの抗ヒスタミン剤、抗嘔気剤、ロイコボリンなどの栄養添加剤、および他の同様の物質と組合せて使用されうる。放射線曝露を受けた対象の治療用の栄養剤は、参照によりその全体が本明細書で援用される、米国特許出願公開第２００３０１０５０２７号明細書に記載されている。

本発明は、抗炎症性サイトカイン、成長因子、または白血球遊走阻止化合物と組合せても使用されうる。有用なサイトカインとしては、炎症性サイトカインの産生を抑制し、免疫系の修復に関与していることが知られているＩＬ−４、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、およびＩＬ−１３、特にＩＬ−４およびＩＬ−１０が挙げられるが、これらに限定されない。成長因子としては、とりわけＧＭ−ＣＳＦが挙げられる。これらのサイトカインおよび成長因子は、精製タンパク質−−天然または組換え起源から得られる−−として投与され、または、これらのペプチドを発現する核酸の形で、特に融合タンパク質として投与されうる。

本発明の化合物の医薬調製物としては、医薬として許容可能な希釈剤または賦形剤が挙げられる。

本発明の化合物の有効量は、化合物の非存在下に生じるものと比べミクログリア活性化を減少させる量であり、言い換えれば、化合物の非存在下に生じるものと比べミクログリアによる神経毒性および神経調節化合物の産生を減少させる量である。神経調節は、神経機能における非致死的変化を指す。有効量（および投与様式）は個体レベルで決定され、使用される特定の治療分子、および対象（サイズ、年齢、全体的な健康）、処置される状態（ＡＤ、急性頭部損傷、脳炎症等）、処置される症状の重篤度、求められる結果、使用される特定の担体または製剤処方、投与経路、および当業者に明らかである他の因子の検討に基づく。有効量は、当業界で周知である方法を使用して当業者によって決定されうる。本明細書に記載された化合物の治療有効量は、当業界で周知である、ｉｎ ｖｉｔｒｏ試験、動物モデル、または他の用量反応試験を使用して決定されうる。

本発明の化合物は、急性（すなわち、脳炎症または虚血をもたらすイベントの発症中またはその直後）に投与され、または予防的（例えば、計画された手術前、または神経学的徴候もしくは症状の出現前）に投与され、またはその他の場合に生じる症状の進行を軽減または改善する変性疾患の経過中に投与されうる。投与のタイミングおよび間隔は対象の症状によって異なり、当業者によって決定されるように、数時間、数日、数週、もしくはそれ以上に時間経過にわたって、数時間から数日の間隔で投与されうる。

一般的な毎日の処方は、約．０１μｇ／ｋｇ体重／日から、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日から、約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日から、約１００ｍｇ／ｋｇ体重／日から、約１，０００ｍｇ／ｋｇ体重／日でありうる。好ましい投与量は、化合物によって、約．０１μｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日であり、より好ましくは、約１ｍｇ／ｋｇ体重／日〜約１０ｍｇ／ｋｇ体重／日である。

血液脳関門は、血流からＣＮＳのさまざまな部位への薬物の受動拡散への関門を示す。しかし、特定の薬剤の活性輸送が血液脳関門上のいずれかの方向で生じることが知られている。血流から脳への限定されたアクセスを有しうる薬物は脳脊髄液へ直接注射されうる。脳虚血および炎症は血液脳関門を変更し、結果として血流における薬物へのアクセスの増大をもたらすことが知られている。

化合物の脳への直接の投与が当業界で周知である。髄腔内注射により薬剤が脳室および脊髄駅へ投与される。外科的に移植可能な注入ポンプが薬物の脊髄液への直接の持続的投与を提供するために利用可能である。医薬化合物の脳脊髄液への注射（「脊髄注射」）による腰椎穿刺が当業界で周知であり、本化合物の投与のために適している。本明細書にｋ際されたＰＴＤドメインのほか当業界で周知の他のペプチドおよび非ペプチド部分の使用も血液脳関門上の輸送を促進するために使用されうる。

親水性化合物の脂溶性薬物への変換を含む血液脳関門を回避するための薬理学に基づく方法も当業界で周知である。活性剤は脂質小胞またはリポソームにカプセル化されうる。

血液脳関門を一時的に開放し、親水性薬物の脳への通過を可能にする動脈内注入も当業界で周知である。コザリッチ（Ｋｏｚａｒｉｃｈ）への米国特許第５，６８６，４１６号明細書は、血液脳関門の浸透性の増大をもたらし、化合物の脳への送達増大をもたらす脳の間質液コンパートメントへ送達される化合物との受容体介在浸透性（ＲＭＰ）ペプチドの同時投与を開示している。

活性剤を血液脳関門上へ輸送する１つの方法が、血液脳関門を浸透し、活性剤を血液脳関門上輸送するその能力のために選択されるペプチドまたは非タンパク性部分である第２の分子（「担体」）への活性剤の結合またはコンジュゲートである。適切な担体の実施例としては、ピリジニウム、脂肪酸、イノシトール、コレステロール、およびグルコース誘導体またアドビタミンＣが挙げられる。担体は、脳内皮細胞における特定の輸送系を通じて脳へ入る化合物でありうる。血液脳関門を通じる受容体介在トランスサイトーシスによって神経医薬薬剤を脳へ送達するために適合したキメラペプチドが、パルドリッジ（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）らへの米国特許第４，９０２，５０５号明細書に開示されている。これらのキメラペプチドは、トランスサイトーシスによって血液脳関門を横断することができる輸送可能なペプチドとコンジュゲートされた医薬剤を含む。パルドリッジ（Ｐａｒｄｒｉｄｇｅ）らによって開示された特定の輸送可能なペプチドとしては、ヒストン、インスリン、トランスフェリンなどが挙げられる。血液脳関門を横断する担体分子との化合物のコンジュゲートもポドゥスロ（Ｐｏｄｕｓｌｏ）への米国特許第５，６０４，１９８号明細書に開示されている。開示された特定の担体分子としては、ヘモグロビン、リゾチーム、シトクロムｃ、セルロプラスミン、カルモジュリン、ユビキチン、およびサブスタンスＰが挙げられる。ボーダー（Ｂｏｄｏｒ）への米国特許第５，０１７，５６６号明細書を参照。

本発明のペプチドを投与する別の方法が、ペプチドをコード化する核酸配列を有するベクターを対象に投与することによって行われるが、ここでベクターはペプチドが発現され、分泌されるように脳細胞に入ることが可能であり、したがって、ミクログリア細胞に利用可能である。適切なベクターは、ＤＮＡウイルス、ＲＮＡウイルス、およびレトロウイルスを含むウイルスベクターである。ベクター送達系を利用し、遺伝子療法を行うための方法が当業界で周知である。ヘルペスベクターが、本発明の化合物の投与において使用されうるベクターの特定の種類である。

以下の実施例は本発明を説明するために記載されており、それの限定としては考えられていない。

７．実施例
実施例１．改善されたペプチド類似体のデザインおよび特性
レトロインベルソペプチド
Ｄ−アミノ酸によるＬ−アミノ酸の置換を含むペプチド類似体をアポＥ１３０−１５０活性の特性の性質を調査するために製造した。出願人はすべてのＬ−アミノ酸をすべてのＤ−アミノ酸ペプチドと比較し、アポＥ１３０−１５０のレトロ−インベルソ類似体が活性であったかどうか試験した。レトロ−インベルソ類似体は、Ｄ−アミノ酸のみ（全−ＤアポＥ１５０−１３０）で製造された逆配列（すなわち、アポＥ１５０−１３０）であった。ペスカロロ（Ｐｅｓｃａｒｏｌｏ）ら（２００１年）によって報告された実験とは逆に、出願人は、レトロ−インベルソペプチドが０．０１ｕＭを超える濃度で信じられないほど毒性であることを見出した。したがって、酸化窒素のＢＶ−２ミクログリア細胞産生において確認された劇的な軽減は、アッセイにおける細胞がこのレトロ−インベルソペプチドの適用で殺傷されていたためアーチファクトであった。また、アポＥ１３０−１５０の全−Ｄアミノ酸類似体は、リポ多糖（ＬＰＳ）処置ＢＶ２ミクログリア細胞からの酸化窒素（ＮＯ）放出の抑制において活性なしであった。本化合物の利用の可能性は、マクロファージ、および癌治療における骨髄移植の前駆体としての免疫抑制療法の可能性としてレトロインベルソアポＥ１３３−１４９によって殺傷される他の細胞を全滅させたいと思う場合であろう。ＬＰＳ処置ＢＶ２細胞からのＮＯおよびＴＮＦα放出を抑制する全−Ｌアミノ酸アポＥ１３０−１５０ペプチドの活性、およびアポＥ１３０−１５０の全Ｄ−アミノ酸類似体の活性の欠如は、適切な細胞受容体への全−Ｌアミノ酸ペプチドの立体特異的結合と一致している。このデータに基づき、レトロ−インベルソ法の別の追求が、免疫抑制パラダイムへの今後の試験において拡大される必要がある。

部位特異的置換
次いで、出願人は体系的にアポＥ１３３−１４９（ＣＯＧ１３３）における各々アミン素をアラニンと置換し、次いで各々アポＥペプチド類似体の活性を測定した。これらの置換に使用される略語は当業者に周知であり、例えば、アポＥ１３３−１４９ペプチドの１４９位でのロイシン（Ｌ）を意味するＬ１４９Ａ（１３３−ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ−１４９）（配列番号１）はアラニン（Ａ）と置換されており、Ｌ１４９Ａ類似体（１３３−ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＡ−１４９）（配列番号６５）を示す。

表１に示されているように、アラニンスキャニング置換は、アラニンが１３９、１４３、１４４、１４６、１４７、および１４９位に存在した場合に炎症性活性の結合および／または抑制に関して効力の減少を示した。Ｌ１４４Ａにおいて見られる減少と同様、Ｌ１４４Ｍ置換は、炎症性活性のアポＥ１３３−１４９受容体結合および抑制と比べると効力の減少を示した。これは、ロイシンが短い分岐炭素側鎖を有する疎水性残基であり、メチニンも疎水性であるが、イオウ原子を有するわずかに長い側鎖を有するため興味深い所見である。これは活性の減少が長い側鎖またはイオウ原子対炭素原子もしくは両方の増大サイズのいずれかのため側鎖サイズの増大によるため側鎖サイズが重要であることを可能にする。

活性の減少は、塩基性アルギニンが酸性グルタミン酸残基と置換されたＲ１４２Ｅ置換においても確認され、電荷がこの位置で重要であることを示した。活性の減少がＬ１４８Ｎ置換でも確認されたが、そこでは疎水性ロイシンはその側鎖が同様の炭素骨格構造を示すが、酸素およびアミノ基を同様の炭素骨格の末端に配置するＬ１４８Ｎ置換においても確認され、サイズおよび／または反応がこの位置で重要な役割を果たすことを示した。試験された置換の残りは、アポＥ１３０−１５０親ペプチドまたはＣＯＧ１３３（アポＥ１３３−１４９ペプチド）と比べ活性における重要な変化を示さなかった。

全２９９アミノ酸アポＥタンパク質（ホロ−アポＥ）の提案された結晶構造に基づき、１３０−１５０からの部位が、アポＥタンパク質リガンドの受容体への結合のために必要な部位を含有するアルファらせんを形成する。出願人は、アポＥ１３０−１５０ペプチドが円二色スペクトルによって測定される溶液中のアルファらせん構造を示すことも発表した（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）、２００１年）。一般的なアルファらせんは３６０度の１つの完全ターンあたり３．６アミノ酸残基または１０の完全ターンあたり３６残基を含有する。この情報をペプチドのＨｅｌｉｃａｌ ｗｈｅｅｌ表示と共に使用することにより、われわれのアッセイにおけるペプチドの活性と関係があるこのらせん構造の１つの側／表面があると思われる（図１、Ｈｅｌｉｃａｌ ｗｈｅｅｌ）。この情報は、アポＥ１３０−１５０の活性に重要である残基に対する初期マップを提供するように重要である。

表１の結果に達するために、各々のペプチド類似体で多数の試験が実行された。炎症プロファイリングの抑制のために、各々ペプチド類似体をＮＯおよび／またはＴＮＦαのＬＰＳ誘発ＢＶ２ミクログリア細胞放出において０．１、０．５、１、３、５、１０、および２５μＭの最終濃度で試験された。特定の残基位置での活性の減少が上付き文字−記号で示されており、その濃度がＣＯＧ１３３の３．５μＭ ＥＣ５０よりも高かったＥＣ５０を指す（ＮＯまたはＴＮＦα放出の５０％軽減が少なくとも２つの異なる検定日で確認された濃度と規定）。受容体結合が修正された公開方法（ミスラ（Ｍｉｓｒａ）ら、２００１年）により得られ、実質的に同一の結果が公開方法で得られた。修正はアポＥペプチドでのビオチン標識（ビオチン−ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ−アミド）であったが、これは^１２５Ｉ−ストレプトアビジン（ＩＳＡ、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ）による検出を可能にする。また、出願人は、４℃下に６ウェルディッシュ（ヌンク（Ｎｕｎｃ））でウェルあたり２５０，０００個の細胞への結合を使用したが、これはより一貫した多数の計数の特定のペプチドの結合を提供する助けとなった。本方法の実施例として、出願人は、非標識アポＥ１３３−１４９が４μＭでビオチン化アポＥ１３３−１４９の結合の５０％を阻害した（ＩＣ５０＝４μＭ）ことを測定したが、これは炎症活性の抑制のためのアポＥ１３３−１４９の３．５μＭ ＥＣ５０と十分に合致する数である。一般に、異なるペプチド類似体へのＥＣ５０およびＩＣ５０の値は、結合アッセイと生物学的活性アッセイとの間で一致した。

切断型誘導体
最大の活性を保存しながらアポＥ１３０−１５０のサイズを最小限に抑える努力において、ペプチドは漸次、アミノ末端およびカルボキシ末端から切断された。カルボキシ末端から開始することにより、アポＥ１３０−１４９はアポＥ１３０−１５０親ペプチドの活性を維持した。対照的に、アポＥ１３０−１４８およびアポＥ１３０−１４７は２５μＭで活性を示さなかった。アミノ末端から開始することにより、アポＥ１３３−１４９はアポＥ１３０−１５０親ペプチドの活性を維持した。アポＥ１３９−１４９は２５μＭでも活性を示さなかった。残りの介在ペプチドのうち、アポＥ１３４−１４９が最も活性であったが、アポＥ１３０−１５０よりも効力が２．５倍低かった。アポＥ１３５−１４９およびアポＥ１３６−１４９はアポＥ１３０−１５０よりも効力が５倍および８倍低かったが、アポＥ１３７−１４９およびアポＥ１３８−１４９は２５μＭでも活性を示さなかった。これらの活性測定値から、アポＥ１３３−１４９（ＣＯＧ１３３）は、アポＥ１３０−１５０親ペプチドの完全な活性を維持する最も短いアポＥペプチドであった。出願人は、新しいペプチド類似体の基礎をアポＥ１３３−１４９（ＣＯＧ１３３）に置き、アポＥペプチドの薬理学的活性に重要である残基の構造活性関係をさらに精緻化した。

構造−活性関係の特性
ペプチド類似物の分野は、選択ペプチド化合物を薬物状の医薬特性を有する小分子への変換を含む（オルソン（Ｏｌｓｏｎ）ら、１９９３年、１９９５年、スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９９７年、１９９８年、２０００年、ヒルシュマン（Ｈｉｒｓｃｈｍａｎｎ）ら、１９９６年、リュー（Ｌｉｕ）ら、２０００年）。ペプチド類似物は、ペプチド類似体（骨格に非天然アミノ酸を有する）、ペプチド代理物（ペプチドアミド結合をオレフィンまたは他の等量式で置換する）、およびペプチドが非ペプチドテンプレートを使用してデザインされた小分子によって合理的な方法で置換されている小分子類似物からさまざまな方法を包含する。新しい特性が類似物へ組込まれているが、これらはその有用性を多くの潜在的な受容体標的に拡大し、新規構成単位、構造的テンプレート、および天然過程または遺伝子工学によってが可能ではないアセンブリの経路を作成することによって多様性を大いに増大させる。これらの類似物は、有力な生物学的活性を増強されたバイオアベイラビリティと結合させ、新規の特許性のある新しい医薬品を構成する他とは異なる独自仕様の骨格を組込む。例えば、図２−５を参照。酵素阻害に適切なテンプレートは、ピロリノン化学的分類（プロビド・ファーマシューティカルズ（Ｐｒｏｖｉｄ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ）、Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ、ニュージャージー州（ＮＪ））に基づきデザインされている。他の系はペプチドの非ペプチド類似物の優先テンプレートとしての糖質に基づき、これはタンパク質−タンパク質相互作用およびＧ−タンパク質結合受容体の阻害剤に至った領域である。ＨＩＶ−プロテアーゼ阻害剤およびインテグリン受容体のＲＧＤベースの阻害薬など非ペプチド類似物は臨床的および商業的に成功した技術例である。例としては、サキナビル（ＩＮＶＩＲＡＳＥ（登録商標）、ロシュ（Ｒｏｃｈｅ））、インディナビル（ＣＲＩＸＩＶＡＮ（登録商標）、メルク（Ｍｅｒｃｋ））、リトナビル（ＮＯＲＶＩＲ（登録商標）、アボット（Ａｂｂｏｔｔ））、ネルフィナビル（ＶＩＲＡＣＥＰＴ（登録商標）、アグロン（Ａｇｏｕｒｏｎ）／ファイザー（Ｐｆｉｚｅｒ））、アンプレナビル（ＡＧＥＮＥＲＡＳＥ（登録商標）、ベルテックス（Ｖｅｒｔｅｘ）／グラクソ（Ｇｌａｘｏ））であり、これらはＨＩＶ／ＡＩＤＳを治療可能な慢性疾患へ変換するために医学的に信頼できる商業的に成功した薬物である（グループとして１０億ドルを超える販売）。

一例として、プロビド（Ｐｒｏｖｉｄ）の非ペプチド類似化学における努力は、ＭＨＣクラスＩＩ、具体的には、疾患と関係があるＨＬＡ−ＤＲ２分子による抗原提示の阻害に基づく自己免疫疾患における臨床開発のための主要な化合物の同定をもたらした。ホフマン・ラロシュ（Ｈｏｆｆｍａｎｎ−ＬａＲｏｃｈｅ）の関係者であったプロビド（Ｐｒｏｖｉｄ）上級社員によって実行されたＨＬＡ−ＤＲ１およびＨＬＡ−ＤＲ４に関する関連試験もこれらの研究者によって発表されている（ボリン（Ｂｏｌｉｎ）ら、２０００年）。

ペプチドを非ペプチドに変換する方法の一例が、活性化内皮細胞での血管細胞接着分子（ＶＣＡＭ−１）と循環リンパ球で見られるインテグリン最晩期抗原−４（ＶＬＡ−４）受容体との相互作用を阻止する阻害剤のデザインにおいて示されている。この例において、開始点は、以下に示された同様の方法を使用し、分子モデル化されて有力な非ペプチド分子に変換されたペプチド拮抗薬であった（フォトイ（Ｆｏｔｏｕｈｉ）ら、２０００年、チェン（Ｃｈｅｎ）ら、２００２年）。この方法は、環状ペプチドの小分子への変換によって例示されるが、方法は有機化合物およびペプチドに適用される。

らせん類似物は非ペプチド類似物技術の適用の特定の領域である（オルソン（Ｏｌｓｏｎ）ら、１９９３年）。らせんペプチドが受容体相互作用に関与している場合、ペプチドの骨格アミド基はすべて分子内水素結合され、らせんの構造的骨格を形成する（エルンスト（Ｅｒｎｓｔ）ら、２００２年、オルネー（Ｏｒｎｅｒ）ら、２００１年）。この場合、側鎖官能基は支配的活性基であり、らせんは置換可能なテンプレートとして見ることができる。ＣＯＧ１３３に関する出願人の予備試験により、らせん構造の受容体の認識が生物学的活性のために重要であり、受容体結合におけるらせん双極性構造も、例えば、炎症反応を抑制するためなど生物学的活性に重要であるという主張が裏づけられる。

アポＥ類似体の役割構造活性関係を解明するために、出願人はＣＯＧ１３３の新しい類似体の合成に以下の通り着手した。すなわち、（ａ）アルファらせん特徴を実証するためにらせん破壊剤またはアルファらせん安定剤を組込む類似体、（ｂ）重要部位の相対サイズおよび組成物を決定する活性に重要である残基に隣接した部位で新しいアミノ酸を組込む類似体、および（ｃ）アミノ酸骨格が有機テンプレート置換されている類似体。

ＣＯＧ１３３ １７ｍｅｒのペプチドは、単一アミノ酸置換および切断試験を利用して調査されている原型の活性配列を表し、それによる構造活性データは表１（上記）に示されている。データの分析では、生物学的活性に影響を及ぼす重要な残基Ｓ１３９、Ｒ１４２、Ｋ１４３、Ｌ１４４、Ｋ１４６、Ｒ１４７、およびＬ１４９が同定された。アポＥタンパク質において、この部分は、４つのらせん束におけるらせん、およびらせんの一面での残基クラスター、または縁の１つの一部であり、ＣＯＧ１３３がらせんペプチドとしてその確認された生物学的効果を発揮する場合は同様のエピトープを示すことになる（図１）。２０個の残基アポＥ（１３０−１４９）ペプチド、および２つの切断１７−ｍｅｒペプチド［（１３０−１４６）および（１３３−１４９）］は、円偏向二色性分光計によって検査されており、すべてが質的にらせんおよびランダムコイル構造の混合物と一致する（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）ら、２００１年）。

アポＥ１３３−１４９ペプチドが生物学的に活性であるようにらせん構造を取る必要があるという仮説を試験するために、出願人は、Ｄ−プロリンなどらせん構造への折畳みを阻害することが公知であるアミノ酸残基を組込んだ類似体を試験した（バララム（Ｂａｌａｒａｍ）ら、１９９４年、ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）ら、２００３年）。出願人は、Ｌ１４１およびＲ１４５の位置でらせん破壊アミノ酸残基、Ｄ−プロリン（ｐ）を含有するＣＯＧ１３３の２つの類似体を合成した。ＣＯＧ１３３のＬ１４１ｐ類似体もＲ１４５ｐ類似体も炎症性サイトカイン（ＴＮＦα）放出の抑制についてのアッセイにおいて、またはフリーラジカル放出（酸化窒素）の抑制についてのアッセイにおいて２５μＭで活性を示さなかった。したがって、これは、ＣＯＧ１３３およびＣＯＧ１３３の活性類似体が炎症アッセイの抑制におけるなど生物学的活性を示す場合にらせん構造を取る可能性があるという出願人の仮説を裏づける。

初期ペプチド類似体デザインおよび合成により生物学的活性に必要とされる構造的要件および活性基要素（側鎖官能基）が調査される。天然および非天然アミノ酸構成要素はＣＯＧ１３３配列へ組込まれ（標準ＦＭＯＣ固相合成プロトコールを使用）、両方は単一および多重の置換としてこのペプチドのための活性基モデルを構築する。これは官能基が生物学的活性およびその空間的な提示／関係の性質に必要であることの大きな理解につながる。正電荷を持つ側鎖の重要性、およびその相対位置および構造移動度を調査する。表３は、構造的特性を増強または不安定化する潜在的な隣接基相互作用に基づき選択された組合せで合成されうる変更の範囲を示す（カール（Ｋａｒｌｅ）、２００１年、ビジャヤラクシュミ（Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ）ら、２０００年、カール（Ｋａｒｌｅ）ら、１９９０年）。

アポＥ−３およびアポＥホロタンパク質は炎症反応を軽減する。したがって、ＣＯＧ１３３がらせん構造を形成し、その生物学的活性を働かせて炎症性メディエータの放出を軽減するという仮説は妥当である（図１およびリンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００３年）。一般に、ＣＯＧ１３３（１７ｍｅｒ）など小さなペプチドは、溶液中で自由の場合にほとんどらせん内容を有さないことが予想されるが（一部の小さならせん内容を有する大多数のランダムコイル構造と一致したＣＤスペクトル）、しかし、それらは受容体の存在下にかかる構造単位へ折畳まれるように誘導されうる。特にらせん破壊剤による新しい予備データ（表２、上記）に照らして、かかるペプチドのらせん形態の安定化は有利に働き、かつ前組織化によって受容体結合との親和性を増強することが予想される。らせん形成と関係がある分子内水素結合も極性アミド骨格の曝露を軽減し、結果としてタンパク質分解消化に対する改善された膜透過および安定性をもたらす。

これらの考えに基づき、出願人は、らせん安定化およびらせん不安定化アミノ酸を最初に組込むことによってＣＯＧ１３３のらせん構造を試験することを提案する（表４を参照）。Ｄ−プロリンなどの残基（バララム（Ｂａｌａｒａｍ）ら、１９９４年、ミッチェル（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ）ら、２００３年）は、有効ならせん不安定剤であることが証明されている。対照的に、Ａｉｄ（ジメチルグリシン様）などのアルファ二置換グリシンは、７個の残基ほどの短いペプチド配列においてらせん傾向を大きく増強することが証明されている（カール（Ｋａｒｌｅ）、２００１年、ビジャヤラクシュミ（Ｖｉｊａｙａｌａｋｓｈｍｉ）ら、カール（Ｋａｒｌｅ）ら、１９９０年）。らせんを増強させる他の方法としては、アミノおよびカルボキシ末端キャッピング（ドイグ（Ｄｏｉｇ）ら、２００２年、１９９４年、１９９３年）、およびペプチドの構造を制限する分子内側鎖と側鎖の共有結合の形成が挙げられる。この状況において有用であることが証明されているかかる共有結合はジスルフィド、オレフィンメタセシス化学由来のラクタム架橋および炭素‐炭素結合である（グルッブス（Ｇｒｕｂｂｓ）ら、２００１年、ベルディン（Ｖｅｒｄｉｎｅ）ら、２０００年）。

生物学的活性のために必要な分子の機能性の正確な空間的アレイを保持する最小の長さの配列が得られると、不要なペプチド特性（アミドＮＨ／連結）は除去され、必要な機能性は、医薬品に望まれる優れた特性（安定性等など）の多くを本質的に有する非ペプチド骨格またはテンプレートで提示されうる。

構造活性関係データを使用して新しい世代の類似体の合成を誘導し、適切な類似物を選択するとともに、適切な骨格／テンプレートを選択して活性に必要でないペプチド部分を置換することができる。これらの構成要素の特性は、グラクソスミスクライン（ＧｌａｘｏＳｍｉｔｈＫｌｉｎｅ）におけるグループによって最近報告されたバイオアベイラビリティに重要であると判定された分子の特徴と一致するように選択される（ベーバー（Ｖｅｂｅｒ）ら、２００２年）。

らせん類似物の場合、非ペプチド骨格は有効にアルファらせんの２−４の回転を模倣することが報告されている（約７〜１４個のアミノ酸残基）。このクラスにおける類似物はテルフェニルなど低分子量有機化合物であるが、これらはらせん認識を含むタンパク質‐タンパク質相互作用と競合することが証明されている（ハミルトン（Ｈａｍｉｌｔｏｎ）ら、２００３年、２００２年、２００１年）。

ＳＡＲ試験および／または活性基モデルから同定された特定の側鎖官能基はテンプレート／骨格（例えば、図２で示されているテルフェニルフレームワーク）で提示され、所望のペプチドによって提供される官能基を模倣する（図３はらせん類似物としての三環性骨格を示す）。モデル化試験により、必要な官能基を提示する骨格として働く追加の分子フレームワークが同定され、柔軟性のある合成経路が２つのクラスの三環性骨格、カルバゾールおよびフェノチアジンのために開発された。テルフェニル、カルバゾール、およびフェノチアジンの一連の官能化類似体の合成は、必要な官能基（上記の活性基モデル化によって判定）を骨格のＸ、Ｙ、およびＺの位置に組込むことによって実行されうる。次いで、化合物が細胞ベースおよび動物ベースにおける生物学的活性について評価されうる。例えば、各々の類似体の活性は、炎症の軽減の細胞ベースのアッセイにおいて、受容体結合アッセイにおいて、かつＴＢＩマウスモデルにおける性能の長期的な行動測定において試験されうる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏ炎症抑制アッセイ
炎症抑制アッセイのために、炎症の抑制の公開された細胞ベースのモデルを、ＣＯＧ１３３またはＣＯＧ１３３の類似体の非存在または存在下にリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激されたＢＶ−２マウスミクログリア細胞を用いて使用されうる（ラスクウィッツ（Ｌａｓｋｗｉｔｚ）ら、２００１年）。一般的に、ＢＶ−２細胞は完全培地における９６ウェルプレートにプレーティングされ、次いで培地は翌日、血清を含まない培地または軽減された血清（１％）培地と交換される。細胞は、ＬＰＳの添加によって、または陽性対照としてＬＰＳ＋さまざまな濃度のＣＯＧ１３３の添加によって刺激される。ＬＰＳ＋さまざまな濃度のＣＯＧ１３３の類似体もウェルを分離するために添加される。さまざまな濃度のＣＯＧ１３３の類似体もウェルを分離し、ペプチドのみ（ＬＰＳの非存在下）の活性を制御するために添加される。ペプチドの各々濃度（標準初期濃度は０．１、０．５、１、３、１０、および２５μＭ）は、少なくとも６ウェルの細胞に添加され（例えば、６ウェルは０．１μＭペプチドになり、６ウェルは０．５μＭペプチド等になる）、データは６ウェルすべてから平均化される。２４時間のインキュベーション後、馴化培地中のＴＮＦαおよび亜硫酸塩レベルをラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）ら（２００１年）に記載されたＥＬＩＳＡおよびグリース（Ｇｒｉｅｓｓ）アッセイで測定される。細胞生死はさらにＭＴＴアッセイで測定される（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）ら２００１年）。各々の試験ペプチドのＥＣ５０は、ｔ検定および／またはＡＮＯＶＡによって生物学的活性についてＣＯＧ１３３のＥＣ５０と比較され、ここでｐ＜０．０５が有意とみなされる。

受容体結合アッセイ
受容体結合は公開方法の修正として試験されうる（ミスラ（Ｍｉｓｒａ）ら、２００１年）。出願人の修正は、^１２５Ｉ−ストレプトアビジン（ＩＳＡ、アマシャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ））で検出されうるビオチン−ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ−アミドを合成することによってアポＥペプチドでビオチン標識を使用することである。また、出願人は、より一貫した多数の計数の特定のペプチドの結合を提供する助けとなる、４℃下に６ウェルディッシュ（ヌンク（Ｎｕｎｃ））でウェルあたり２５０，０００個の細胞への結合を使用する。^１２５Ｉ−ストレプトアビジンは、ストレプトアビジン‐セイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲート、またはＣＤＰＳｔａｒ（ロシュ・アプライド・サイエンス（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を検出試薬として使用してストレプトアビジン‐アルカリホスファターゼコンジュゲートと置換されうる。

毒性試験
次いで、候補の化合物が、損傷後３０分で静脈内投与による外傷性脳損傷のわれわれの閉鎖性頭部損傷モデルにおいてスクリーニングされる。新規化合物が最初にその最大耐量（０．５×ＭＴＤ）の半分で試験される。最大耐量（ＭＴＤ）は、マウスの死亡をもたらさない尾静脈注射で投与されるペプチドの用量である。死亡は、呼吸の完全欠如、および１０分もしくはそれ以上の間のテイルピンチおよび／またはトーピンチなど外部刺激に対する完全無反応として規定される。動物には１ｍｇ／ｋｇのペプチド類似体または非ペプチド類似体の初期用量が投与され、継続的に１５分間観察され、次いで１５分間隔で２時間、次いで１時間間隔で４時間以上観察される。動物は注射後２４時間の時点でも観察される。

最大耐量は、動物がこれらの観察時間のいずれの時点でも死亡しない最大用量である。この方法の例として、ＭＴＤは最初に１ｍｇ／ｋｇでマウス３匹の群に投与することによって実験的に決定される。この用量が耐性である場合は、別のマウス３匹の群に３ｍｇ／ｋｇで投与される。この用量が耐性である場合は、別のマウス３匹の群に９ｍｇ／ｋｇ等で投与される。例えば、９ｍｇ／ｋｇが１匹もしくはそれ以上の動物が死亡したため耐性ではない場合は、３ｍｇ／ｋｇ〜９ｍｇ／ｋｇの用量がＭＴＤが確認されるまで調査される。ＭＴＤが実験的に決定されると、別のマウス７匹の群でＭＴＤで試験される合計１０匹のマウスについて確認され、これがＭＴＤであることを確認するためにそのすべてが死亡する必要はない。ややはっきししないが、これは全動物における新しい化合物の毒性をプロファイルする迅速かつ強固な方法であることが判明した。

ｉｎ ｖｉｖｏ外傷性脳損傷モデル
ＴＢＩの実験モデルは、ＴＢＩと関係がある複雑な生理的、行動的、および組織学的変化を評価し、理解する過程において重要な役割を果たす。この相互作用ネットワークをさらに解明するために、ＴＢＩの既存の前臨床モデルがヒトＴＢＩの臨床続発症を厳密に模倣するようにデザインされている。ＴＢＩを生成する最も広く使用されている実験法の１つでは、堅いインパクタを使用し、機械的エネルギーを発生させ、衝撃の送達中に通常、拘束され続ける動物の無傷頭蓋に衝撃を与える。現在、この種類の損傷をもたらす最も一般的な方法では、鋼のチップインパクタを頭蓋内へ推進し、下記の通り、外傷性脳損傷と呼ばれる機械的エネルギー源として加圧空気が使用される。マウスを含むいくつかの種における使用に適合させ（スミス（Ｓｍｉｔｈ）ら、１９９５年）、空気圧作動デバイスによる変形パラメータ（衝撃の時間、粘度、および深度）を制御する能力、およびリバウンド損傷のリスクの欠如（ライトホール（Ｌｉｇｈｔｈａｌｌ）１９８８年）により、外傷性脳損傷（ＴＢＩ）モデルが自由落下誘導錘の重力によって推進されるデバイスよりも優れている（フィーニィ（Ｆｅｅｎｅｙ）ら、１９８１年、デイル（Ｄａｉｌ）ら、１９８１年）。

いくつかの異なる前臨床パラダイムが閉鎖性頭部損傷をモデル化するために開発されている。伝統的に、これら頭部損傷モデルの多くは、開頭術が行われ、液体打撃または制御皮質衝撃など再現可能な損傷を脳実質に直接与えた齧歯類で実行された（リンダー（Ｒｉｎｄｅｒ）、１９６９年）。この種類のモデルは組織損傷の再現可能かつ明確な領域を作成する利点を有する。しかし、このモデルによって生成される損傷は、（交通事故中に生じるなど）迅速な加速‐減速力によってもたらされるヒト閉鎖性頭部損傷が、しばしばねじれ力（びまん性軸索損傷）、皮質打撲、および出血性硬膜下硬膜外血腫の要素によるはるかに多くの異種損傷をもたらすほど臨床的に重要ではないかもしれない。これらの制限に対処するために、閉鎖性頭蓋に対してより生理的衝撃を与える落錘モデルが開発された。これにより短期に神経学的欠損を、長期に認知的欠損をもたらすより臨床的に重要な損傷が生じた（ゾウハー（Ｚｏｈａｒ）、２００３年）。しかし、これらの初期モデルの１つの欠点は、不完全な生理学的モニタリングおよび錘落下によって生じる機械的損傷の変動によってもたらされる実験制御および再現性の欠如であった。これらの制限に対処し、かつ現在利用可能なトランスジェニックマウス技術を活用するために、このモデルは、重要な生理学的パラメータ（中核および頭蓋骨膜温度、平均動脈圧、血糖、血液ガス等）がモニタリングされる人工呼吸器装着マウスの無傷頭蓋に対して較正空気衝撃を使用することによってマウスに適合させた（図５）。

閉鎖性頭部損傷パラダイムの仕組み
Ｃ５７Ｂｌ／６Ｊオスマウス（ザ・ジャクソン・ラボラトリー（Ｔｈｅ Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、メイン州（ＭＥ））、年齢１２−１６週および体重２４−３２ｇをすべての実験に使用した。麻酔を最初に３０％Ｏ_２／平衡Ｎ_２中イソフランで誘発する。気管に挿管し、３０％Ｏ_２／平衡Ｎ_２中１．６％イソフランで肺を機械的に換気する。温度を直腸プローブでモニタリングし、加熱ランプで３６．５℃下に維持する。右内頸静脈にシリコーンカテーテルを挿入する。この損傷モデルはラットの閉鎖性頭蓋外傷の既述モデル（マルマロウ（Ｍａｒｍａｒｏｕ）ら、１９９４年）から、既述通り（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００２年）に適合させた。次いで、挿管動物を成形アクリル鋳造物上に腹臥位に配置する（図６Ａ）。動物をアクリルモールド上に配置することにより動物が安定し、衝撃法の間の移動を阻止し、より均質の損傷を作成する助けとなる。頭皮を切開し、頭蓋を露出させる。凹面の３ｍｍ金属円盤を接着剤で（頭蓋に対して並列に凹表面とともに）頭蓋表面に固定する。モデルの開発中、この円盤の配置が頭蓋骨折の発生を軽減する助けとなり、よりびまん性の脳損傷が生じることがわかった。円盤はブレグマに対して尾側正中線に直接配置した（図６Ｂ）。さらに、この正中腺損傷は、びまん性軸索損傷のより臨床的に重要なモデルであることが判定された。この損傷は結果として、フルオロジェード（ヒストケム社（ＨｉｓｔｏＣｈｅｍ，Ｉｎｃ．）染色によって測定される、同等の機能的欠損による片側損傷と比べ比較的軽度の両側海馬損傷が生じる。マウスは定位フレームに配置される。定位フレームは動物を安定化し、衝撃時の鉛直変位（３ｍｍ）を正確に較正する助けとなるが、イヤーバーははるかに高い頭蓋骨折率（または頭部が衝撃中にイヤーバーの軸の周りを回転する場合には脳幹損傷）により使用すべきではない。ピストンは、アクリルモールドにおける頭蓋を衝撃して最大およそ３ｍｍ移動させるために６．８±０．２ｍ／ｓで放出させる（図６Ｃ）。吸引イソフルランは衝撃直後に０．７％に減少される。頭皮をリドカインで浸潤し、縫合で閉鎖した。眼軟膏を保護用に眼に塗った。頭蓋骨折の発生率は、金属円盤が衝撃の拡散を助けるため低く（およそ１０％）、イヤーバー固定を行わないことにより全頭部の転位が可能である。陥没頭蓋骨骨折が確認された場合は（発生率およそ１０％）、マウスを除外した。動物を自然換気に戻させ、次いで抜管した。代理の生理学的対照群の使用は長期の転帰を含む実験に必要である。動脈カテーテルの配置は生理学的パラメータを測定するために必要であり、他の配置は大腿神経叢を損傷し、運動障害をもたらしうる。他の配置は運動技能（モリスの水迷路における泳ぎを含む）を含む行動試験を解釈不能にする。これらのマウスにおいて、ベースライン、損傷直後、および損傷後１５分での動脈血圧、血液ガス、および血糖を回復期間中にモニタリングする。

組織学的転帰
この正中線閉鎖性頭部損傷は結果として、フルオロジェード染色によって視覚化された海馬のＣＡ３部位における再現可能な病変をもたらす。しかし、片側液体打撃モデルとは異なり、このパラダイムは結果としてよりびまん性の損傷をもたらし、行動の欠陥に対して比例して海馬ニューロン損傷が少ない。出願人は、この正中線損傷が結果として放射線学的脳浮腫および炎症性サイトカインのアップレギュレーションをもたらすことも明らかにした。これは、これがびまん性軸索損傷の臨床的に重要なモデルであるという主張を裏づける。

行動転帰
このパラダイムは軽度‐中等度閉鎖性頭部損傷としてデザインされた。マウスは最初に、下記の通り損傷後１−５日目の回転棒および神経学的重篤度スコアによって評価された運動および小脳障害を有する。頭部損傷の生存者において一般的なより適切な長期の神経学的障害をモデル化するために、損傷後２１‐２５日目にモリスの水迷路に記憶が評価される。具体的には、これにより９０秒間隔以内で直径１０５ｃｍのプールにおける直径７．５ｃｍの隠されたプラットフォームを見つけ出す能力が試験される。

回転棒試験
外傷性脳損傷（ＴＢＩ）、ペプチドの静脈内投与、および行動性能は上記および発表（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００２年、リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、提出済み）通りに実行される。手短に言えば、回転棒でのベースライン性能をマウスが挿管される前に確認し、頭皮上の皮膚を反映し、空気インパクタからの制御された皮質衝撃を正中線に与える。皮膚は外科クリップで閉鎖され、動物は麻酔から覚めるまでつねに、さらにその後の４時間にわたって１時間ごとにモニタリングされる。衝撃後３０分の時点で、生理食塩水賦形剤または試験品（ＣＯＧ１３３、ＣＯＧ１３３の類似体、またはＣＯＧ１３３の非ペプチド類似体）が尾静脈注射によって投与される。回転棒での性能は衝撃後２４時間、次いで５日間毎日試験され、データは記載通り示されている。マウス１２匹の群を０．５×ＭＴＤでの各々の化合物のために使用される。陰性対照群には生理食塩水賦形剤のみが投与され、陽性対照群には尾静脈注射によって１００ｕｌ量の生理食塩水中４ｍｇ／ｋｇのＣＯＧ１３３が投与される。新規ペプチドおよび非ペプチド類似体も尾静脈注射によって投与される。

ペプチドの活性の対照としてのみ、偽動物を調製し、皮質衝撃を与えないことを除き、上記の通り試験品を投与することができる。回転棒での行動性能を上記の通り測定し、尾静脈注射によって４ｍｇ／ｋｇでＣＯＧ１３３が投与された偽動物の性能と比較する（合計１２群×動物１２匹＝動物１４４匹）。プリズムおよび／またはインスタットコンピュータプログラムを使用し、反復測定ＡＮＯＶＡによってＣＯＧ１３３と新規化合物との間の有意性の測定を支援する。

毎日の回転棒（ＲＲ）試験を行って頭部損傷後の短期の運動および小脳障害を評価した（ハム（Ｈａｍｍ）ら、１９９４年）。マウスをその尾で支え、静かな揺れる動きを使用して壁に面すると同時に一定の速度モードで走行するＲＲ上に配置する。全マウスが適所に配置されると、ＲＲは加速モードに切替わり、棒から落ちる、または２回回転する（７２０度）までのいずれかのレイテンシータイムを記録した。その３つの試験の平均レイテンシータイムは毎日記録した。

損傷後ｉｎ ｖｉｖｏモデル
われわれのマウスＴＢＩモデルにおいて外傷性脳損傷後６０、９０、および１８０分の時点で類似体をさらに試験することができる。このより厳密な遅延試験において、新規化合物の有効性を、上記の通り再現可能な外傷性脳損傷（ＴＢＩ）を与える標準閉鎖性頭部損傷後６０分の時点で尾静脈注射によって投与されるＣＯＧ１３３と比較されうる。化合物が、反復測定ＡＮＯＶＡで分析される回転棒性能によって判定される通りＴＢＩ遅延後６０分の時点でＣＯＧ１３３より大幅に優れていることが判明する場合は、これはＴＢＩ遅延後９０分で試験される。化合物が、反復測定ＡＮＯＶＡで分析される回転棒性能によって判定される通りＴＢＩ遅延後９０分の時点でＣＯＧ１３３より大幅に優れていることが判明する場合は、これはＴＢＩ遅延後１８０分で試験される。

運動障害の行動試験および長期の記憶試験
認知および学習異常は臨床集団におけるＴＢＩの一般的な長期の続発症である。われわれのモデルの感度および臨床上の重要性を最大限にするために、神経学的機能における学習、保持、および行動障害が評価されうる。このために、モリス水迷路タスクにおける性能の変化が試験されうる（モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）、１９８４年）。このタスクでは自然に泳いでいる齧歯類の平均を取り、視空間合図を作業および基準記憶へ組込む動物の能力を測定する。このタスクでの性能はヒト臨床集団において見られる神経精神障害の相関でありうる。理論上、マウスは水泳によるタスクから任意に、またはプールの全体を通じて非系統的な通路で逃げることもできるが、しかし、作業記憶が無傷である場合は、マウスは試験チャンバーの固定物から遠位の合図を使用し、プラットフォームの相対位置を学習する。したがって、プラットフォームを見出すタイムレイテンシーは実行の関数として減少し、学習能力の指数として使用されうる。

タンパク質分解開裂アッセイ
一部のペプチドは、トリプシン様プロテアーゼによって開裂されうる。ペプチドの開裂は、液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレイイオン化質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法においてトリプシンおよび脳ホモジネートを使用して測定されうる。手短に言えば、ビードアガロース（パース（Ｐｉｅｒｃｅ））に結合したトリプシンを０．１Ｍ炭酸アンモニウム、ｐＨ８．０で２回洗浄し、その後にカルシウム、マグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ８．０（ＰＢＳ−８）で２回洗浄する。２０ｕｇ／ｍｌのペプチド基質を含有するＰＢＳ−８中に樹脂を再懸濁し、０、０．１、１、５、および２０時間３７℃下に消化させる。３通りの試料を各々時点で評価する。試料を一時的に遠心分離し、樹脂を含まない上清をＡＴＩ（アセトニトリル、ＴＦＡ、内部標準）で抽出し、処理して以下の条件でＬＣ／ＭＳ定量にかける。

ＬＣ条件：
カラム：アジレント・ゾルバックス（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｚｏｒｂａｘ）３００ ＳＢＣ_１８ ２．１×７５ｍｍ×５ｕｍ粒子３００Ａ細孔サイズ
勾配：４．５分で５％Ｂ〜６５％Ｂ
Ａ＝５％アセトニトリル／９５％水（０．０２５％ＴＦＡ）
Ｂ＝９５％アセトニトリル／５％水（０．０２５％ＴＦＡ）
流量：０．５ ｍＬ／分
注入量：１０ｕＬ
分析時間：３．５分の平衡時間で４．５分
ＭＳ条件：
操作モード：アジレント（Ａｇｉｌｅｎｔ）１１００ＭＳＤシステムで陽イオンエレクトロスプレイ
走査範囲：ＳＩＭ、ｍ／ｚ７２４．１でＣＯＧ１３３およびｍ／ｚ６９５．７でＩＳ−１１について［Ｍ＋３Ｈ］^＋３を検出
ドゥエル時間：４９ｍｓ／イオン
キャピラリー出口電圧：２００Ｖ
乾燥ガス：３５０Ｃ下に９．５Ｌ／分
噴霧圧：５０ｐｓｉ
同様に、全マウス脳ホモジネートをペプチドを分解させる細胞内および細胞外プロテアーゼの供給源として使用されうる。この場合、新鮮マウス脳は１００ｍｇ湿重量／ｍｌＰＢＳ（ｐＨ７．４）で均質化されうる。ＰＢＳ（ｐＨ７．４）中４０ｕｇ／ｍｌでのペプチド基質を同等量の脳ホモジネートと混合し、ＡＴＩによる抽出、上記のＬＣ／ＭＳによるわれわれの内部標準ペプチドに対する分解産物の定量のための処理、および提出前に３７Ｃ下に０、０．１、１、１、５、および２０時間インキュベートする。３通りの試料を各々の時点で評価する。各々実験において、無傷、非分解ペプチドのモル、および主要な代謝産物（無傷、非分解ペプチドのモル量の少なくとも２０％である断片）を各時点で測定する。均質化脳も使用し、ペプチドの脳への取込みをＬＣ／ＭＳ法を使用して測定することができる。

ペプチドの血漿半減期も各々ペプチド誘導体をマウス血液血漿に曝露し、標準対照と比べ経時的に回復を測定することによってＬＣ／ＭＳ法をお使用する測定することができる。

実施例２．ＣＯＧ４３２の特性
図４は、４ｍｇ／ｋｇまたは１ｍｇ／ｋｇのＣＯＧ４３２、（ＣＯＧ４３２：Ａｃ−ＡＳＨＬＲＫＬＡｉｂＫＲＬＬ（配列番号６））または対照（生理食塩水）によるＴＢＩ後の回転棒試験の結果を示す。縦軸は、回転棒性能を示す（１００％はＴＢＩ前の回転棒性能）。ＣＯＧ４３２、４ｍｇ／ｋｇ、または生理食塩水による処置を外傷性脳損傷後２時間の時点で開始し、動物をＴＢＩ後１日目に開始して次の５日間毎日試験した。ＴＢＩ後５日までに、４ｍｇ／ｋｇのＣＯＧ４３２ペプチドで処置した動物は回転棒試験によって測定されるように約８０％の機能まで回復していた。生理食塩水賦形剤のみで処置した対照マウスが回復した機能は５０％未満であった。

実施例３．ＣＯＧ１４１０の特性
われわれは、Ｌ１４０およびＲ１４５の位置で２つのアミノイソブチル酸（Ａｉｂ）置換を含有する類似体であるＣＯＧ１４１０を合成した。Ａｉｂは、ペプチドに存在するアミノ酸の種類に関係なくらせん構造を形成することが証明されている非天然アミノ酸である（マーシャル（Ｍａｒｓｈａｌｌ）ら、１９９０年）。また、Ａｉｂは、他のアミノ酸に対して結合時に配座エントロピー喪失の軽減を示すため結合親和性を改善する（ラトナパルキー（Ｒａｔｎａｐａｒｋｈｉ）ら、２０００年）。

細胞ベースのアッセイ
図７に示されているように、ＣＯＧ１４１０は、酸化窒素（９Ａ）およびＴＮＦａ（９Ｂ）放出の抑制のわれわれの細胞ベースのアッセイにおいてＣＯＧ１３３よりも大幅に強力であった。また、ｉｎ ｖｉｖｏでの予備スクリーニングは、ＣＯＧ１４１０がＴＢＩ後１２０分で投与すると神経保護性であることを示したが、これはこの時点で神経保護活性を欠いているＣＯＧ１３３とは異なる（図８）。

用量反応試験
予備用量反応試験は、ＣＯＧ１４１０の最小有効量（ＭＥＤ、賦形剤処置対照と比べ性能における統計的に有意な改善を示す最低用量）は、ＣＯＧ１３３のものとほぼ同じであり、それぞれ、０．３ｍｇ／ｋｇ対０．４ｍｇ／ｋｇであった。しかし、ＣＯＧ１４１０の最大耐量（ＭＴＤ、２４時間でマウスの死亡をもたらさない最高用量）は、ＣＯＧ１３３の１．４ｍｇ／ｋｇのＭＴＤに対して８ｍｇ／ｋｇであった。ＣＯＧ１４１０の治療指数（ＴＩ、ＭＴＤのＭＥＤに対する比）は２６であり、ＣＯＧ１３３の３．５のＴＩりも大幅に良好である。ＴＩが高いほど、薬物は安全であるとみなされる。ＣＯＧ１４１０のこの高いＴＩは、有利かつ所望の保護硬化をもたらすよりも毒性反応を引き起こすためにはるかに高い用量を取ることを示す。

薬理動態パラメータの分析
考慮する多くの薬物動態パラメータのうち、血漿半減期およびタンパク質分解に対する耐性が、液体クロマトグラフィー−エレクトロスプレイイオン化質量分析（ＬＣ／ＭＳ）法で正確に測定されうるペプチドの２つの特性である。ＬＣＭＳ−ＬＬＣを用いて、われわれは、ペプチド量および血液血漿およびマウス脳抽出物におけるペプチド断片を測定するＬＣ／ＭＳ法を開発した。

手短に言えば、０、０．００５、０．０２５、０．１、１．０、５、１０、または２５ｕｇ／ｍｌのＣＯＧ１３３をマウス血液血漿に添加することによって較正曲線を構成した。これら同じ濃度のＣＯＧ１３３をＰＢＳ（リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７．４）にも添加した。ＣＯＧ１３３を含有する血漿またはＰＢＳを１体積のＰＢＳおよび１体積のＡＴＩ（ＡＴＩ＝アセトニトリル中０．６％トリフルオロ酢酸および３ｕｇ／ｍｌの内部標準ペプチド［ＬＡＶＬＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ］（配列番号５８））を添加し、ボルテックスし、１５，０００ｘｇで１０分間遠心分離し、上部有機層を抽出試料として採集することによって抽出した。抽出試料を上記（実施例１）の条件下にＬＣ／ＭＳ定量にかけ、信号増大が試料中のＣＯＧ１３３の増大量に直線的に比例したことを示す直線濃度／信号曲線を示した（データを示さず、Ｒ^２＝０．９９８４）。

われわれの内部標準ペプチド（ＬＡＶＬＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ）と比べ、われわれは一貫して、各々の血漿試料におけるＣＯＧ１３３の８０％以上を回復させ、以下の表に示されている分析結果を示した。

われわれの半減期実験のために、ＣＯＧ１３３（０．４ｍｇ／ｋｇ）をオスＣ５７Ｂ１／６マウスの尾静脈へ注射し、指示時点で心穿刺によって１ｍｌの血液を採取し、上記の通り血液血漿を処理した。血漿濃度時間グラフはＣＯＧ１３３にマウス血液血漿における８分半減期を示す（図９）。内部標準とともにこの同じ方法を使用して、われわれは、マウス血液血漿における無傷、非分解ＣＯＧ１４１０の２分半減期を計算する（データは示さず）。

われわれは、同様のＬＣ／ＭＳ法を使用し、脳における無傷、非分解ＣＯＧ１４１０の量を測定した。手短に言えば、われわれは、０時点で尾静脈注射によって４ｍｇ／ｋｇのＣＯＧ１４１０を投与し、心穿刺によって等張性生理食塩水の注射後５分の時点マウスを灌流し、血液を脳血管系から除去し、かつ注射後１０分の時点で灌流脳を除去した。脳材料の０．１ｇ湿重量あたりプロテアーゼ阻害剤カクテル（ロシュ・ディアグノスティックス（Ｒｏｃｈｅ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）、１０ｍｇ／ｍｌ）を含有する１ｍｌのＰＢＳ中に脳を均質化した。ホモジネートを同等量のＡＴＩと混合し、ボルテックスし、遠心分離し、試料を上記の通りＬＣ／ＭＳにかけた。この方法を使用して、われわれは、「３ｄ ＣＯＧ１４１０」および「２ｄ ＣＯＧ１４１０」脳において４．９０分でピークを見出し、ＣＯＧ１４１０の［Ｍ＋２Ｈ］＋２イオンで７０５の正確なｍ／ｚ比を有する。この予備試験は、ＣＯＧ１４１０の測定可能量が５分のエントリー期内に脳に入り、この実験の次の５分の灌流期中に脳内に残留することを示す。これは、ＴＢＩ後の性能の行動試験における有意なＣＯＧ１４１０介在改善を示すわれわれの薬理学的データと一致する（データを示さず）。

われわれは、分解過程によって生じうるＣＯＧ１４１０の断片を同定する同様のＬＣ／ＭＳ法を使用した。手短に言えば、ＣＯＧ１４１０を投与したマウスからの血漿を使用することにより、一部の小さめのペプチド断片が、未処置マウスからの血漿には見られないこのＬＣ／ＭＳ法で同定された（データは示さず）。質量分析計でのＭＳ／ＭＳを使用し、これらの断片の部分的配列を得ることにより、少なくとも１つの主要な代謝産物が、トリプシン様プロテアーゼまたはカルボキシペプチダーゼ活性によって無傷ＣＯＧ１４１０の消化に由来しうる断片であるアセチル−ＡＳ−Ａｉｂ−ＬＲＫＬ−Ａｉｂ−ＫＲ（配列番号５９）である可能性が高いと思われる。この断片の存在は、ＣＯＧ１４１０の短い半減期の１つの説明が、トリプシン様プロテアーゼまたはカルボキシペプチダーゼ活性の影響を受けやすいことにあることを示す。

結論
ＣＯＧ１４１０によるこれらのデータは、増大した安定性、増強された効力およびＢＢＢ透過性、減少した毒性、増大した治療指数、およびＴＢＩの治療に対する拡大した治療の窓を有する化合物を発現する実現可能性を示す。分解に対する増大した耐性など、さらに優れた医薬特性を有する追加の類似体が、上記のガイドラインを使用して制限された数の誘導体の合成によって達成可能である。

実施例４．ＣＯＧ１４１０のさらなる最適化
ＣＯＧ１４１０は、多くの基準によってＣＯＧ１３３に対して大幅な改善である。われわれの予備データは、アルファらせん構造がきわめて重要であり、このらせん構造の強化がＣＯＧ１４１０をもたらすことを示した。らせん構造を促進するＡｉｂのようなアミノ酸を含めるわれわれの初期の方法は、潜在的にアラニンスキャニング作業から可能である２つの新しい位置に拡大される（実施例１を参照）。ＣＯＧ１４１０のらせん性質へのさらなる強化は、ペプチドの生物活性を直接与えるとは思われないらせんの表面でアミノ酸の側鎖の誘導体化によって達成されうる。これらの誘導体の全体的な性質は、その柔軟性を抑制し、らせん構造に残る傾向を増大させる選択アミノ酸間のオレフィン架橋を含めるべきである。

われわれの予備データは、ＣＯＧ１４１０のタンパク質分解がその安定性の欠如に関与しうることも示した。また、われわれのアラニンスキャニングデータは、カルボキシ末端ロイシンが活性には重要であることを示したが、これはこの残基のタンパク質除去が結果として生物活性の欠如をもたらすことを示している。タンパク質分解断片のより正確な定義に引き続いて選択アミノ酸の置換および／または選択アミノ酸の誘導体化が、タンパク質分解に対する耐性を増大させると同時に生物活性を維持する。

したがって、ＣＯＧ１４１０はさらに誘導体化され、以下の３つの方法でらせん構造を増大させうる。すなわち、１）選択位置でのＡｉｂ残基の組込みによってらせん構造を強化し、２）アミノ末端キャッピングによってらせん構造を強化し（ドイグ（Ｄｏｉｇ）ら、２００２年、１９９４年、１９９３年）、および３）ペプチドの構造を制限する分子内側鎖の側鎖との共有結合を形成することによってらせん構造を強化する。この状況で有用であることが証明された共有結合はオレフィンメタセシス化学由来であり、架橋を含有するアルケンでｉ〜ｉ＋４またはｉ〜ｉ＋７の位置を補う（グラブス（Ｇｒｕｂｂｓ）ら、２００１年、シャフマイスター（Ｓｃｈａｆｍｅｉｓｔｅｒ）ら、２０００年）。

側鎖架橋
閉環メタセシス（ＲＣＭ）法を使用することにより、オレフィン側鎖が組込まれ、配列：ＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬにおける選択残基で側鎖と側鎖を共有結合しうる。ＣＯＧ１４１０は、らせんの一面上の荷電残基のすべておよびらせんの対向面上の疎水性残基のすべてを有する両親媒性アルファらせんを形成するように思われる。大部分の荷電残基のアラニン置換は大幅に抗炎症活性を軽減したため（表１）、荷電残基は側鎖結合法の候補ではない（Ａｉｂ置換が生物活性を増強したＲ１４５を除く）。これは疎水性残基の大部分を側鎖結合法による変更に利用可能なままにする。したがって、以下の架橋結合分子が合成されうるが、ここでＸおよびＺで示されたアミノ酸は、架橋結合オレフィン架橋に結合される側鎖を含有するアミノ酸でありうる。すなわち、ＡＳＨＸＲＫＬＺＫＲＬＬ（配列番号６０）、ＸＳＨＬＲＫＬＺＫＲＬＬ（配列番号６１）、ＡＳＸＬＲＫＬＲＫＺＬＬ（配列番号６２）、およびＡＳＨＸＲＫＬＲＫＲＺＬ（配列番号６３）。

手短に言えば、ＸおよびＺは、従来の固相合成中にペプチド鎖へ組込まれたアルファ‐メチル、アルファ‐アルケニル ジ置換アミノ酸（ｉ：ｉ＋４架橋に対して両方のブテニル、ｉ：ｉ＋７に対して１つのブテニルと１つのペンテニル）である。固相支持およびキャップ状態でありながら、ペプチドは、１，２ジクロロエタン中でグラブス触媒（ビス（トリシクロヘキシルホフィン）二塩化ベンジリジンルテニウム（ＩＶ））と反応する。触媒は樹脂を洗浄することによって除去され、転換ペプチドはトリフルオロ酢酸で樹脂から開裂され、Ｃ１８逆相ＨＰＬＣカラムで精製され、エレクトロスプレイ質量分析計によって確認される。らせん構造を強化する可能性に加えて、架橋の存在は、ペプチドのプロテアーゼへの結合を物理的に遮断するオレフィン側鎖によってタンパク質分解に対する耐性をも増大させうる（ベルディン（Ｖｅｒｄｉｎｅ）ら、２０００年）。

プロテアーゼ感受性部位での耐性の強化
ＬＣ／ＭＳによるわれわれの予備データにより、ＣＯＧ１４１０の潜在的に重要な代謝産物としてアセチル−ＡＳ−Ａｉｂ−ＬＲＫＬ−Ａｉｂ−ＫＲが同定された。この断片は、トリプシン様プロテアーゼによる細胞内タンパク質分解開裂および／またはカルボキシペプチダーゼによる細胞外タンパク質分解開裂によって生成されうる。エンドプロテアーゼの可能性に対処するために、オルニチン、ニトロアルギニン、ホモアルギニン、またはジメチル‐アルギニンをアルギニンに対して１４７の位置で自動ペプチド合成器で標準Ｆｍｏｃ化学によって置換するＣＯＧ１４１０の誘導体が合成されうる。エクソプロテアーゼの可能性に対処するために、バリン、メチオニン、またはイソロイシンをロイシンに対して１４９の位置で置換するＣＯＧ１４１０の誘導体が合成されうる。

実施例５．実験自己免疫脳脊髄炎のマウスモデルにおけるアポＥ類似物の保護効果
多発性硬化症（ＭＳ）の信頼できる動物モデルの１つとして、実験自己免疫脳脊髄炎（ＥＡＥ）は中枢神経系（ＣＮＳ）において重篤な脱髄を引き起こす炎症性疾患である（ペンダー（Ｐｅｎｄｅｒ）とウォルフェ（Ｗｏｌｆｅ）２００２年）。ＥＡＥおよびＭＳは、ミクログリア活性化、および主にＴリンパ球およびマクロファージから成る炎症性細胞のＣＮＳへの顕著な浸潤を含む共通の組織学的特徴を共有する（へーバー・カッツ（Ｈｅｂｅｒ‐Ｋａｔｚ）１９９３年）（へマー（Ｈｅｍｍｅｒ）、アルケロス（Ａｒｃｈｅｌｏｓ）ら、２００２年）。これらの活性化エフェクタ細胞は、ＴＮＦα、ＩＬ−１β、ＩＦＮγ、およびリンホトキシンなど一連の前炎症性サイトカインを放出する。次いで、これらの因子はさらに浸潤細胞の蓄積を促進するが、これらは炎症、および組織損傷と関係がある（エング（Ｅｎｇ）、ジルニカー（Ｇｈｉｒｎｉｋａｒ）、１９９６年）（ベンベニスト（Ｂｅｎｖｅｎｉｓｔｅ）１９９７年）（ウィーマン（Ｗｉｅｍａｎｎ）、ファン（Ｖａｎ）ら、１９９８年）。

多発性硬化症遺伝子の染色体局在のスクリーニングにより、ＭＳ遺伝子は、アポリポタンパクＥ（アポＥ）遺伝子が位置している１９ｑ１３．３部位に位置したマーカーに結合される（ルコット（Ｌｕｃｏｔｔｅ）２００２年）。この所見は、患者がアポＥ ４を有する患者が重篤なＭＳで影響される可能性がより高いという報告（チヤプマン（Ｃｈａｐｍａｎ）、ビノクロフ（Ｖｉｎｏｋｕｒｏｖ）ら、２００１年）（ファゼカス（Ｆａｚｅｋａｓ）、シュトラッサー・フックス（Ｓｔｒａｓｓｅｒ‐Ｆｕｃｈｓ）ら、２００１年）（シュミット（Ｓｃｈｍｉｄｔ）、バルセロス（Ｂａｒｃｅｌｌｏｓ）ら、２００２年）（メーターマン（Ｍａｔｅｒｍａｎ）、チャン（Ｚｈａｎｇ）ら、２００２年）とともに、アポＥが多発性硬化症の発現に関与しうることを示す（ウェザーバイ（Ｗｅａｔｈｅｒｂｙ）、マン（Ｍａｎｎ）ら、２０００年）（ウェザーバイ（Ｗｅａｔｈｅｒｂｙ）、マン（Ｍａｎｎ）ら、２０００年）。

材料と方法
マウス
メスＣ５７ＢＬ／６Ｊマウス（１２週齢）をジャクソン・ラボラトリーズ（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から購入し、デューク（Ｄｕｋｅ）大学実験動物施設に収容した。動物ケアおよび実験法はデューク大学動物ケアおよび使用委員会によって承認された規則に一致した。

試薬
ミエリンオリゴデンドロサイト糖タンパク質（ＭＯＧ）ペプチドは、マウスＭＯＧタンパク質の残基３５‐５５（ＭＯＧ３５‐５５、ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶＶＨＬＹＲＮＧＫ（配列番号６４））由来であり、アポＥ類似ペプチド（ＣＯＧ１３３）は、アセチル−ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ−アミドの配列を有するヒトアポリポタンパク‐Ｅの残基１３３〜１４９由来である。アポＥ逆ペプチド（ＣＯＧ−１４９で示される）は、ここではＣＯＧ１３３のスクランブル対照として処置される。アンテナペディア結合ペプチド（ＣＯＧ１３４、ａｋａＣＯＧ４５０２として示される）は、アンテナぺディアプレフィックスペプチドをＣＯＧ１３３と結合する。ペプチドはすべて、ＲＰ‐ＨＰＬＣによりメリフィールド固相化学および精製によりＦＭＯＣ試薬を使用してＵＮＣでのペプチド合成施設によって合成された。以下の試薬をシグマ（Ｓｉｇｍａ）から購入した。すなわち、百日咳毒素、ＬＰＳ、およびＩＦＮ‐γ。ＴＮＦαおよびＩＬ‐６の定量ＥＬＩＳＡキットをバイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）から得た。

ＭＯＧペプチドのＥＡＥの誘発
ＥＡＥをファインスタイン（Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ）らの方法に従ってマウスにおいて誘発した（ファインスタイン（Ｆｅｉｎｓｔｅｉｎ）、ガレア（Ｇａｌｅａ）ら、２００２年）１）２回のｓ．ｃ．注射、５ｍｇ／ｍｌのヒト型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）Ｈ３７ＲＡ（ジフコ（Ｄｉｆｃｏ）、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ミズーリ州（ＭＯ））を含有する同等量のＣＦＡ中に乳化したＰＢＳ ０．１ｍｌ中ＭＯＧ３５‐５５ペプチド３００μｇを後足の各々の側面に０日目に投与した。２）百日咳毒素（ＰＢＳ ０．１ｍｌ中マウス１匹につき２００ｎｇ）を最初のＭＯＧ注射の直後および４８時間後にｉ．ｐ．投与した。３）同一の乳剤、投与経路、および位置による追加免疫を７日目に投与した。

アポＥによる処置
最初のＭＯＧ注射（０日）後、マウスを無作為に１群マウス１５匹の３群に分け、対照群、アポＥ１３３‐１４９（ＣＯＧ１３３）処置群、およびアポＥ逆ペプチド処置群とした。生理食塩水中ＣＯＧ１３３、生理食塩水中逆ペプチド、または生理食塩水を６、７、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、および２２日に１００μｌ量中１ｍｇ／ｋｇの用量で静脈内注射し、各々の処置群に合計１０用量を投与した。

ＥＡＥの臨床評価
脳炎誘発性チャレンジの後、マウスを毎日モニタリングし、神経学的障害を以下の通り臨床スコア（Ｃ．Ｓ．）によって評価した。すなわち、０、ＥＡＥの臨床徴候なし、１、だらりとした尾、２、たるんだ尾と異常な歩き方（後肢の運動失調および／または麻痺）、３、重度の後肢麻痺（ｈｉｎｄ ｂｏｄｙによる）、４、完全麻痺、５、瀕死または死亡。

腹膜マクロファージ調製、培養、および処置
このために、３０ｄｐｉ（免疫後の日数）で臨床スコアが０のマウス３匹および臨床スコアが４のマウス３匹を腹膜マクロファージ培養の調製用に使用した。ＰＢＳを含有するヘパリン（１０Ｕ／ｍｌ）３ｍｌによる腹膜洗浄後にマクロファージを回収し、次いで９６ウェルマイクロプレートに１×１０^５細胞／ウェルの密度で１０％ウシ胎仔血清、２ｍＭ Ｌ‐グルタミン血清、１％ＨＥＰＥＳ、および１００Ｕ／ｍｌペニシリン、および１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンを含有するダルベッコＭＥＭ中、５％ＣＯ_２による加湿インキュベータ中３７℃下に接種した。２４時間後、血清含有培地を除去し、血清を含まない培地で細胞を１回洗浄した。免疫促進剤に対するマクロファージの分化反応を検査するために、臨床スコア０または４のマウスから得られたマクロファージを連続濃度のＩＦＮ‐γ／ＬＰＳまたはＭＯＧ３５‐５５ペプチドに曝露した。ＩＦＮ‐γ／ＬＰＳまたはＭＯＧ誘発サイトカイン産生に対するＣＯＧ１３３またはＣＯＧ１３４の効果を調査するために、これらペプチドの指定濃度をＩＦＮ‐γ／ＬＰＳまたはＭＯＧ治療前３０分に適用した。培地を４５時間または７２時間の時点で回収し、以下の詳述通り、ＴＮＦ−γおよびＩＬ−６または酸化窒素（ＮＯ）についてＥＬＩＳＡによって分析した。

亜硫酸塩および総タンパク質の測定
酸化窒素放出の安定した最終産物として、５０μｌ培地試料をシーバース（Ｓｉｅｖｅｒｓ）２８０ＮＯＡ分析器（ボルダー（Ｂｏｕｌｄｅｒ）、コロラド州（ＣＯ）、米国（ＵＳＡ））ヘ注入することによって馴化培地中の亜硫酸塩レベルを測定した。総タンパク質（μｇ／ウェル）を標準としてＢＳＡによるメーカーの指示に従いＢＣＡ法（パース（Ｐｉｅｒｃｅ）、Ｒｏｃｋｆｏｒｄ、イリノイ州（ＩＬ）、米国（ＵＳＡ））を使用して測定した。ＢＣＡ値をＯＤ５６２でモレキュラー・デバイセス・サーモマックス・マイクロプレート・リーダー（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｔｈｅｒｍｏｍａｘ Ｍｉｃｒｏｐｌａｔｅ Ｒｅａｄｅｒ（メンロ・パーク（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ）、カリフォルニア州（ＣＡ）、米国（ＵＳＡ））を使用して測定した。酸化窒素レベルはμＭ ＮＯ_２−／ｍｇタンパク質で表される。

ＥＬＩＳＡによるＴＮＦ−γおよびＩＬ−６の測定
サイトカインアッセイのために、ＴＮＦ−γ／ＬＰＳまたはＭＯＧ処置後４５時間に回収し、選択ペアのモノクローナル抗体を使用する定量ＥＬＩＳＡを（メーカーのバイオソース（Ｂｉｏｓｏｕｒｃｅ）による推奨通り）実行し、サイトカイン、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６を定量した。ＴＮＦ−αＥＬＩＳＡのために、９６ウェルＥＬＩＳＡプレートを捕捉抗体としてのＴＮＦ−αに対するウサギ抗マウスポリクローナルで１８時間、２−８℃でプレコートし、次いで２時間、室温で阻止した。ウェルを試料またはマウスＴＮＦ−α標準でインキュベートした。室温下に２時間のインキュベーション後、ウェルを洗浄し、その後にハムスター抗マウスＴＮＦ−αビオチン化二次抗体およびセイヨウワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを添加した。次いで、テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液を添加し、ペルオキシダーゼ触媒変色を２Ｎ Ｈ_２ＳＯ_４による酸性化によって停止した。プレートを波長４５０ｎｍでスキャンニングし、吸光度を測定した。結果は平均濃度（ｐｇ／ｍｌ）±ＳＥＭで表されている。

ＩＬ−６ＥＬＩＳＡのために、捕捉抗体としてＩＬ−６に対するラット抗マウスモノクローナルを、検出抗体としてＩＬ−６に対するビオチン化ラットマウス喪のクローナルを使用した。残りの方法はＴＮＦ−α ＥＬＩＳＡのものと同一である。

ルーチン組織学
マウスを麻酔し、出血させ、ＰＢＳ ２５ｍｌおよび緩衝ＰＢＳ中４％パラホルムアルデヒド２５ｍｌで灌流した。脳および脊髄を臨床スコアが０のマウス３匹および臨床スコアが４の別のマウス３匹から免疫後３０日に切除した。組織をさらに２４時間４％パラホルムアルデヒド中に後固定し、次いで０．１％アジ化ナトリウムとともに１×ＰＢＳ中に保存した。固定組織をパラフィン中に埋設し、５μＭ厚切片を脳、脳幹、および脊髄の３つの異なるレベル（頸部、胸部、および腰部）から切断した。切片を炎症の証拠のためにヘマトキシリン／エオシン、および（脱髄ために）ルクソールファーストブルーで染色した。炎症の重篤度を以下の基準を使用して評価した。すなわち、０、炎症なし、１、血管周囲および髄膜でのみの細胞浸潤、２、実質でのみの軽度浸潤（１−１０／切片）、３実質での中等度浸潤（１１‐１００／切片）、４、実質での顕著な細胞浸潤（＞１００切片）。

統計的分析
回転棒データ、サイトカイン、および亜硫酸塩濃度をＡＮＯＶＡの後、ダネットの比較によって分析した。疾患スコアをマン・ホイットニー検定によって分析した。

結果
ＣＯＧ１３３は活性ＥＡＥの発現を軽減する
ＣＯＧ１３３の推定の保護効果を検査するために、１ｍｇ／ｋｇＣＯＧ１３３、もしくは逆ペプチド、または生理食塩水の１０用量の静脈内投与を尾静脈注射によって行い、６日目に開始して２２日目に終了した。臨床徴候を毎日、回転棒での行動を１日おきに検査した。ＣＯＧ１３３処置群の平均最大臨床スコアは、生理食塩水またはスクランブルペプチド処置群のものより大幅に低かった（Ｐ＜０．０５）（図１０）。この結果は、ＣＯＧ１３３で処置した動物が疾患の重篤な臨床徴候をあまり示さないように思われるというわれわれの一般的な所見に対応する。

エンドポイントとして５の臨床スコアを生む死亡を使用して、マウス４匹が１５匹の生理食塩水処置群における疾患で死亡したが、１５匹のＣＯＧ１３３処置群における動物は死亡せず、かつこの処置群の最も高い臨床スコアは３であった（表６を参照）。ＣＯＧ１３３処置群の疾患発症までの平均時間は対照群と比較してわずかに遅延しているようにみえるが、統計的に有意差はなかった。さらに、ＣＯＧ１３３処置は、ＣＯＧ１３３群の平均臨床スコアが３０日目に対照群よりもはるかに低かったことを示すデータによって疾患からの回復を強固に促進した。

各々のマウスの回転棒での性能を２日おきの計画で試験した。値を０日のものに対する割合で示した。回転棒データは疾患の発現期において有意性を示さなかったが、ＣＯＧ１３３処置群の値は回復期（ファージ）における対照群のものよりもはるかに高かった（Ｐ＜０．０５）（データは示さず）。

ＭＯＧまたはＬＰＳ／ＩＦＮ−γ−処置は臨床スコア依存的にＮＯ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−６のマクロファージ産生を誘発する
ＥＡＥの病因におけるＴＮＦ−αおよびＩＬ−６およびフリーラジカル、酸化窒素、またはＮＯなどサイトカインの役割を検査するために、マクロファージを臨床重篤度が異なる（Ｃ．Ｓ．０および４）マウスから採集し、次いでさまざまな免疫促進剤、すなわち、ＬＰＳおよびＩＦＮ−γまたはＭＯＧペプチドでチャレンジした。ＭＯＧペプチドはＬＰＳ＋ＩＦＮ−γと比べ比較的低刺激性の免疫促進剤であるが、ＮＯの強固な産生が依然として濃度依存的にＥＡＥマウスからのマクロファージにおいて確認された（図１１Ａ）。Ｃ．Ｓ．が４のマウスの重度障害マウスからの高濃度のＭＯＧ（２０μｇ／ｍｌ、７．７５μＭに相当）処置マクロファージは、Ｃ．Ｓ．が０の非障害マウスからのＭＯＧ処置マクロファージからのものよりはるかに高い酸化窒素の放出を誘発し、ＮＯの産生が有害な疾患の発現の大きな原因になりうることを示している。

ＭＯＧ処置は、ＮＯ放出パターンと異なるパターンを示すＴＮＦα分泌を誘発した。Ｃ．Ｓ．０でのＴＮＦ−αのベースラインはＣ．Ｓ．４のものよりもはるかに高く（図１１Ｂ）、疾患の開始におけるＴＮＦ−αの役割を示している。また、ＭＯＧ誘発ＩＬ−６分泌は本試験において検出不可能であった。

Ｃ．Ｓ．４マウスからのマクロファージにおいて、ＬＰＳ＋ＩＦＮ−γは、Ｃ．Ｓ．０マウスからのＬＰＳ＋ＩＦＮ−γ刺激マクロファージにおけるよりもＮＯ、ＴＮＦ−γおよびＩＬ−６の高い産生を有意に刺激した（図１１Ｃ、Ｄ、Ｅ）。

ＣＯＧ１３３ はＮＯおよびＴＮＦαのＭＯＧ誘発産生を阻害する。

ＥＡＥの発現に対するＣＯＧ１３３の有利な効果の機序を調査するために、Ｃ．Ｓ．４マウスからのマクロファージの培地におけるＮＯおよびＴＮＦαのレベルをＭＯＧ（２０μｇ／ｍｌ、７．７５μＭ）への曝露後７２時間に測定した。ＣＯＧ１３３は濃度依存的にＮＯおよびＴＮＦαの産生を阻害した（それぞれ、図１２ＡおよびＢ）が、逆ペプチドはかかる阻害効果を示さなかった。

ＣＯＧ１３３ はＮＯ、ＴＮＦα、およびＩＬ−６のＬＰＳ／ＩＦＮ−γ−誘発産生を阻害する。

ＮＯ、ＴＮＦα、およびＩＬ−６の強固な産生がマクロファージのＬＰＳおよびＩＦＮγ処置によって誘発された（図１３）。高濃度（５μＭ）ではなく、低濃度（１μＭ）では、ＣＯＧ１３３は、ＮＯ（Ａ）、ＴＮＦα（Ｂ）、およびＩＬ−６（Ｃ）の産生を有意に阻害した（Ｐ＜０．０５）。逆ペプチドは再びこの産生を阻害しなかった。

ＣＯＧ１３３（アンテナペディア−ＣＯＧ１３３キメラ、ａｋａＣＯＧ４５０２）はＭＯＧまたはＬＰＳ／ＩＦＮ−γ処置によって誘発されるサイトカインの産生を強く抑制した。

ＣＯＧ１３３と比べ、アンテナぺディアに引き続きアポＥ１３３−１４９キメラペプチドで構成されたキメラペプチド（ａｋａＣＯＧ１３４またはＣＯＧ４５０２）は、ＭＯＧまたはＬＰＳ／ＩＦＮ−γ処置のいずれかによって誘発されるサイトカイン産生の阻害において有意により強い（図１４）。５μＭでのＣＯＧ１３４（ＣＯＧ４５０２）は、ＮＯ、ＴＮＦα、およびＩＬ−６の産生を完全に阻害し、すべてのサイトカインのレベルが基礎レベルに戻ったことを示した。ＣＯＧ１３４もサイトカインおよびフリーラジカル放出を阻害する用量依存能を示す。ＣＯＧ１３４の対照として、ＣＯＧ１３３のプレフィックスとしての機能を果たすアンテナぺディアの部分が合成され、この系においても試験された。このアンテナぺディアプレフィックスペプチドはわれわれの系において活性を示さなかった。

ＣＯＧ１３３は細胞およびｉｎ ｖｉｖｏ系におけるサイトカイン放出を阻害する
われわれは以前、ＣＯＧ１３３が、ミクログリア（脳のマクロファージ）活性化（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）ら、２００１年）を抑制し、培養細胞における細胞内シグナル伝達系を開始する（ミスラ（Ｍｉｓｒａ）ら、２００１年）その能力における無傷アポＥタンパク質の生物活性を保持することを示した。アポＥがその免疫調節効果を誘発する機序を調査するために、われわれは、Ｃ５７ＢＬ６マウスにおけるｉｎ ｖｉｖｏでの全身炎症性反応を抑制するＣＯＧ１３３の能力を検査した。ＬＰＳに対する炎症性反応は、末梢循環および脳における２つの明確なプロ炎症性サイトカイン、腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）およびインターロイキン−６（ＩＬ−６）の一時的分泌および発現プロフィールを測定することによってモニタリングされた。マウスに対し、尾静脈を通じてＬＰＳ注射し、血清試料を指示時点で得るとともに、ＴＮＦａおよびＩＬ−６のレベルをＥＬＩＳＡで測定した。ＬＰＳと同時投与すると、ＣＯＧ１３３は１時間で血清ＴＮＦａレベルを有意に軽減し、かつ血清ＩＬ−６レベルを１および３時間で軽減した（図１５）。各群において注射後２４時間の時点で測定可能なＴＮＦａまたはＩＬ−６タンパク質はなかった。これらの結果は、ＣＯＧ１３３が全動物モデルにおけるＬＰＳ誘発炎症を抑制することができ、ＴＮＦａおよびＩＬ６放出の抑制において特に有効であるように思われることを示す（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００３年）。

末梢におけるサイトカイン放出の抑制に加えて、われわれは、ＬＰＳの尾静脈投与後に誘発されるＣＮＳ炎症性反応を抑制するＣＯＧ１３３の能力も検査した。脳試料の血液および他の細胞による汚染を防ぐため、これらの試験におけるマウスを生理食得水で灌流し、血液を微小血管系から洗い流し、したがって、脳コンパートメント内のサイトカインのみが存在する。ＣＯＧ１３３処置動物は、賦形剤を投与した動物と比べＬＰＳの注射後１および３時間で有意に減少した脳内のＴＮＦａレベルを示した（ｐ＜０．０５、図１６Ａ）。同様に、ＣＯＧ１３３処置動物は、賦形剤を投与した動物と比べ、ＬＰＳの注射後３時間で有意に減少した脳内のＩＬ６レベルを示した（ｐ＜０．０５、図１６Ｂ）。各群において注射後２４時間で測定可能なＴＮＦａまたはＩＬ−６はなかった。これらの結果は明らかに、ＣＯＧ１３３のＩＶ投与が脳実質におけるＬＰＳ誘発炎症を有意に抑制したことを示す（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００３年）。脳内のレベルの軽減は末梢で合成されたサイトカインの結果ではなく、マウスは犠死前に灌流されたため血液脳関門を横断しえない。また、リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら（２００３年）は、これらのサイトカインに対する脳のｍＲＮＡレベルがＬＰＳ＋ＣＯＧ１３３処置動物においてＬＰＳのみで処置した動物と比べ減少することを報告した。これらの結果により、無傷全動物において、尾静脈を通じたＣＯＧ１３３投与が、血液脳関門（ＢＢＢ）によって血液から分離されたコンパートメントである脳の実質における炎症を制御しうることが明らかにされる。

考察
本試験において、われわれは、アポＥ類似ペプチドであるＣＯＧ１３３が、ヒトにおける多発性硬化症の特徴の大部分を模倣する実験的に誘発されたアレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）の行動転帰を改善する顕著な能力を示すことを明らかにする。ＭＳは、広範囲な炎症、限局性脱髄、およびさまざまな程度の軸索喪失によって特徴づけられる中枢神経系の慢性炎症性疾患である（コルネック（Ｋｏｒｎｅｋ）、ストルヒ（Ｓｔｏｒｃｈ）ら、２０００年）。マクロファージおよびＴリンパ球の大規模な浸潤が、全能にわたって、特に脊髄における炎症の顕著な徴候として確認されうる（レイン（Ｒａｉｎｅ）１９９４年）。浸潤および活性化マクロファージおよびＴリンパ球によるプロ炎症性サイトカインの放出は、ＥＡＥにおけるＣＮＳ病因の重要なメディエーターである。実際に、大量のＴＮＦ−α、ＩＦＮ−α、およびＩＬ−１βが脱髄斑に存在する（ブロスナン（Ｂｒｏｓｎａｎ）、カネラ（Ｃａｎｎｅｌｌａ）ら、１９９５年）。また、浸潤免疫反応性細胞は毒性サイトカインを放出することによって直接、または間接に星状膠細胞およびミクログリアを活性化するが、これらはＣＮＳにおけるマクロファージと考えられ、したがって、炎症性反応の二次カスケードをもたらす（プリネアス（Ｐｒｉｎｅａｓ）、クォン（Ｋｗｏｎ）ら、２００１年）。次いで、脊髄における炎症は増悪中に顕著となり、運動の顕著な障害をもたらし、場合により、マウス対象の死亡をもたらす。したがって、抗炎症性介入は、疾患の有害な過程を防ぐ有望な方法として相当な関心を引出した（リークマン（Ｒｉｅｃｋｍａｎｎ）とマウラー（Ｍａｕｒｅｒ）２００２年）。

本発明において見られるアポＥ類似ペプチドの有利な効果としては、ＥＡＥの症状の発症の遅延、疾患の重篤度の軽減、および回復の促進が挙げられる。ＭＯＧペプチドによる免疫またはＬＰＳ／ＩＦＮガンマによる治療の標準プロトコールを使用することにより、疾患の強固な弱体化が確認された。この免疫プロトコールおよびその後の生理食塩水賦形剤の尾静脈注射または逆ペプチド（すなわち、アポＥ１４９−１３３）により処置された動物は、ＣＯＧ１３３を注射した動物よりも臨床疾患の顕著により悪い徴候を示す。したがって、本試験は、ＭＳの治療介入におけるＣＯＧ１３３の利用可能性を示し、かつ広い治療の窓および高い治療指数を示すＣＯＧ４３２およびＣＯＧ１４１０など改善されたペプチド誘導体も治療介入に有用であることを示す。興味深いことに、われわれの研究室の以前の研究では、ＣＯＧ１３３が抗炎症効果を誘発することが示された（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）、タン（Ｔａｎｇ）ら、２００３年）。ＣＯＧ１３３は、一次グリア培養およびＢＶ２細胞、すなわちマウスミクログリア細胞系においてＮＯおよびＴＮＦ−αのＬＰＳ誘発産生を大幅に阻害した（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）、テクジ（Ｔｈｅｋｄｉ）ら、２００１年）。ところで、本試験は、ＣＯＧ１３３がＥＡＥの症状を大幅に改善し、アポＥペプチドがｉｎ ｖｉｖｏで抗炎症効果を誘発するという考えを裏づける新規証拠を提供する。

実施例６．マウスにおける関節リウマチのコラーゲン誘発モデルにおけるアポＥ類似ペプチドの抗炎症活性
自己免疫モデル、ＥＡＥ、およびＥＡＮにおけるアポＥ欠乏の分離ｉｎ ｖｉｖｏ試験は、１）炎症性反応の規模、および２）慢性、Ｔｈ１介在、自己免疫反応において持続される組織破壊の量を阻害することによって、アポＥが大きな疾患重篤度および死亡からマウスを保護することを示した。したがって、アポＥ類似ペプチドは、関節リウマチのコラーゲン誘発モデルにおける有効性について試験されうる。

ムーア（Ｍｏｏｒｅ）（２００３年）によって書かれたプロトコールに従い、ＤＢＡ／１マウスにおけるコラーゲン誘発関節炎を誘発する。このプロトコールは、ＩＩ型コラーゲンを使用してマウスにおいてＣＩＡを発生させるためのコンドレックス社（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ Ｉｎｃ）推奨方法に類似している。８０−９０％の疾患発生率がこの方法を使用してルーチンに達成される。われわれは、疾患が出現する最初の日にマウスの処置を開始し、さらに１４日間処置し、感作後およそ４０日でマウスを屠殺する。

マウスは以下のプロトコールによってＩＩ型コラーゲンに感作される。０．０１Ｍ酢酸の溶液をニワトリＩＩ型コラーゲンに添加し、４ｍｇ／ｍｌの濃度を作る（コンドレックス社（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ Ｉｎｃ）、Ｒｅｄｍｏｎｄ、ワシントン州（ＷＡ）。コラーゲンを一夜溶解し、上清を４℃下にローラーミキサーで混合する。溶解コラーゲンを同等量のよく冷えたフロイント完全アジュバントを添加することによって乳化する。フロイント完全アジュバントは、最終濃度４ｍｇ／ｍｌで加熱死ヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）（菌株Ｈ３７Ｒａ）と混合されたフロイント完全アジュバントから成る（ジフコ・ラボラトリーズ（Ｄｉｆｃｏ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）、Ｄｅｔｒｏｉｔ、ミシガン州（ＭＩ）。各々マウスに対し、尾の基部で皮内注射１００ｕｌを投与する。０．０１酢酸中１ｍｇ／ｍｌウシＩＩ型コラーゲンを含有する１００ｕｌブースタ注射を感作後２１日にｉ．ｐ．投与する。このプロトコールを使用することにより、症状がルーチンに感作後約２５日から発現する。しかし、マウスは、関節の症状が出現する最初の日まで１４日処置を開始しない。われわれが動物が犠死されることを予期する感作後の平均時間は４０日である。偽関節炎群には他の群が感作され、ブーストされる場合に抗原の注射を投与しない。１０−１２週齢の合計２７０匹のオスＤＢＡ／マウス（ジャクソン・ラボラトリー（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｕｒ、メイン州（Ｍａｉｎｅ））を３つの別個の実験および２つの予備実験で使用し、疾患モデルを有効にする。

マウスを無作為に処置群に割り当てる。各々群はマウス１５匹を含む。賦形剤のみ（ＰＢＳ）から成る陰性対照、逆ペプチド対照（２．７ｍｇ／ｋｇ）、デキサメタゾン（１．０ｍｇ／ｋｇ）から成る陽性対照、および滅菌生理食塩水中に希釈したＣＯＧ１３３または他のアポＥペプチドの３用量、すなわち、０．３、０．９、および２．７ｍｇ／ｋｇを試験する。投与量は、予備結果の部に示されているｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ実験で得られたデータに基づく。アポＥペプチド、賦形剤、またはデキサメタゾンを以下のスケジュールに従って各々日に腹腔内注射によって投与する。すなわち、０日、感作日、２１日、ブースター、約２１−２５日、活性疾患の１４日間の処置、約４０日、疾患の１４日後に犠死。マウスを実験の全体を通じて疾患重篤度および足の腫脹についてマウスが犠死されるまで毎日分析する。疾患の１４日目、ＣＯ_２による窒息によって犠死させ、体重を量り、炎症および疾患重篤度について評価した。各々の膝蓋骨を切開し、乾燥させ、秤量する。

健康なマウスにおける炎症および骨喪失に対するＣＯＧ１３３療法の効果も評価する。偽マウスの群については感作せず、他のマウスに対しコラーゲン誘発関節炎を与える時点でブーストしない。これらのマウスには高用量のＣＯＧ１３３療法（２．７ｍｇ／ｋｇ）またはＣＯＧ１４１０（０．６ｍｇ／ｋｇ）を１４日間与える。試験の開始前、われわれは、組織学的および生物化学的手段によって未処置マウスの群におけるＣＩＡモデルを有効にする。ＤＢＡ／１オスマウス１０匹を感作し、上記の通りブーストするが、処置せず、炎症のパラメータを足の容積によってモニタリングし、疾患の１４日後、マウスを犠死させ、体重を量り、血液を採取して抗ＩＩ型コラーゲンＩｇＧについて試験する。マウス５匹については骨関節を組織学的分析用に除去し、ＣＩＡの存在および均一性を確認し、他のマウス５匹については各々の膝蓋骨を除去し、乾燥させて秤量し、測定可能かつ再現可能な骨喪失を確認する。別の５匹の健康な年齢を適合させた対照を犠死させ、組織学および膝蓋骨の骨量のベースライン値を得る。この実験は２回繰り返され、われわれの疾患重篤度が一貫しており、再現可能であることを確認する。犠死の時点で、末梢血を採集し、血漿を分離し、次いで存在する抗コラーゲン抗体の量についてＥＬＩＳＡで測定する。市販のアッセイキット、アルスロゲン（ａｒｔｈｒｏｇｅｎ）−ＣＩＡ（登録商標）マウスＩｇＧ抗ＩＩ型コラーゲンＥＬＩＳＡキットを使用し、ＩＩ型コラーゲン感作およびブーストの均一性を確認する（コンドレックス（Ｃｈｏｎｄｒｅｘ）。

組織学を用いたＣＩＡの検証：足首および手首の関節を切除し、１０％緩衝ホルマリン中に固定し、次いで３日間、１０％ギ酸の溶液中で脱灰化する（カワブタ（Ｋａｗａｂｕｔａ）ら、２００３年）。組織は、デューク（Ｄｕｋｅ）大学医療センター病理学科または受け入れ可能な民間専門業者に送られ、パラフィンに埋設し、６ｕｍ切片に切断し、ガラススライドに載せられる。スライドは３つの異なる手段によって染色され、以下の疾患マーカーが評価されるのを可能にする。すなわち、骨関節に存在するコラーゲンの量の変化（マッソントリクローム）、軟骨の軽減（サフラニンＯ）、およびパンヌス組織の形成、関節腔の狭窄、および炎症性細胞浸潤（ヘマトキシリンおよびエオシン）。組織切片を半定量手段を使用して評価する（ファン・メウルス（ｖａｎ Ｍｅｕｒｓ ）ら、１９９９年、ベーラー（Ｂｅｅｈｌｅｒ）ら、２００３年、カワバタ（Ｋａｗａｂａｔａ）ら、２００４年）。

足の容積による炎症性反応の定量：疾患重篤度／臨床スコアをムーア（Ｍｏｏｒｅ）（２００３年）によって概説されている通り評価する。障害の徴候を示す各々の数字は１で記録され、後肢または前肢の炎症は１／肢と記録され、足蹠部、足首、または手首における腫脹、各々は１のスコアを臨床スコアに加える。炎症を起こした肢／マウスの総数にも留意する。ディジタルプレチスモメーター（足容積測定装置、ステルチング社（Ｓｔｏｅｌｔｉｎｇ Ｃｏ．）、Ｗｏｏｄ Ｄａｌｅ、イリノイ州（ＩＬ））を使用し、経時的に足の腫脹の変化を測定し、平均＋／−標準誤差（ＳＥＭ）／実験群として表される。足の体積変化の測定における一貫性を確実にするために、マウスには実験開始２週間前に感作前のひじおよびひざ関節に線で入れ墨をし、各々のマウスの足の一貫した量が測定されるようにする。総足腫脹は試験中の各々の動物の曲線下面積を測定することによって判定する。各々の実験群からのデータは総足腫脹±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表される。

骨喪失の定量：マウスが犠死される時点で、各々の膝蓋骨をばらばらにする。各々の膝蓋骨を一夜７０℃下に乾燥させ、再び秤量する。膝蓋骨の重量は同様の年齢および重量の健康なマウスと比べた比率として表されている。同様に、膝蓋骨の乾燥重量は実験群の平均±標準誤差として表される。

統計：実験群間の差は分散分析（ＡＮＯＶＡ）によって判定されるが、群のペア間の差はマン・ホイットニーＵ検定によって判定される。ｐ値≦０．０５を有意とみなす。

われわれは、上記の用量および処置時間でのＣＯＧ１３３、ＣＯＧ１４１０、および他のアポＥ類似ペプチドが正常マウスにおいて十分に耐性であると期待する。ＥＡＥを有するマウスにおけるＣＯＧ１３３を使用する予備データは、ペプチドが十分に耐性であることを示した。さらに、この処置が、ＣＩＡの重篤度における用量依存阻害、および疾患の１４日後の炎症および骨喪失の尺度を導くことが期待される。われわれは、ＣＯＧ１３３が炎症性過程または骨喪失にのみ作用することを期待しないが、両方の疾患過程を同等に軽減することは期待する。

実施例７：刺激ウサギ線維芽細胞におけるアポＥ類似ペプチドの抗炎症性活性
パンヌス組織は、関節リウマチを有する患者およびＣＩＡを有するマウスの骨関節内で過剰増殖を受けた滑膜細胞から成る。この組織は、そのサイトカイン、ＭＭＰ、および酸化窒素の産生のため軟骨および骨の破壊の主要な原因である（ピリンジャー（Ｐｉｌｌｉｎｇｅｒ）ら、２０００年）。疾患過程に生理学的に関連する細胞を使用してＲＡに対する候補の療法の試験は、その処置がｉｎ ｖｉｖｏで有する潜在的な利点の判定の助けとなる。

ＨＩＧ−８２細胞（アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、Ｍａｎａｓｓａｓ、バージニア州（ＶＡ））を１０重量％ウシ胎仔血清、５０μｇ／ｍｌペニシリン−ストレプトマイシン、および１ｍＭ Ｌ−グルタミン（インビトロジェン（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ））を補充したハムＦ−１２培地で培養する。細胞を１５０ｍｍ通気口付きフラスコ（ヌンク（Ｎｕｎｃ））中で成長させ、５％ＣＯ_２とともに３７℃、加湿環境下に維持した。ＨＩＧ−８２細胞を最初にＣａ^＋２／Ｍｇ^＋２を含まないＤ−ＰＢＳ１０ｍｌで２回洗浄し、引き続きヴェルセン（インビトロジェン（Ｉｎ Ｖｉｔｒｏｇｅｎ））の１／５０００希釈ストック５ｍｌを添加することによって、フラスコの底から分離する。ヴェルセン処置細胞を遠心分離（２００ｘｇ、７分）によって洗浄し、培地中に静かに再懸濁する。

ＨＩＧ−８２細胞培養からの上清におけるＭＭＰおよびＮＯを測定するための実験プロトコールは、パナガコス（Ｐａｎａｇａｋｏｓ）ら（２０００年）およびコロミキン（Ｋｏｌｏｍｙｉｋｉｎ）ら（２００２年）によって発表された方法に基づく。手短に言えば、２ｍｌの培地中２．０×１０^５細胞を１２ウェルプレート（ヌンク（Ｎｕｎｃ））の各々ウェルに添加し、密集成長させる。細胞が密集すると、培地をウェルから吸引し、血清を含まない培地１ｍｌを添加する。２４時間後、滑膜線維芽細胞を増加濃度のＣＯＧ１３３の存在または非存在下に炎症性メディエーターで処置する。さらに２４時間後、上清を回収し、酸化窒素、ＴＮＦ−アルファ、およびＭＭＰ−１、３−９、および１３について検査する。

ＣＯＧ１３３またはＣＯＧ１４１０が滑膜線維芽細胞からのＴＮＦ−アルファ産生を阻害するかを試験するために、ＨＩＧ−８２細胞をＣＯＧ１３３またはＣＯＧ１４１０（０．１、０．５、１、３、１０、および２５ｕＭ）の存在または非存在下、ＬＰＳ（０．００１、０．０１、および０．１ｕｇ／ｍｌ）で活性化する。上清を採集し、市販のウサギＴＮＦ−アルファＥＬＩＳＡキット（ＢＤバイオサイエンス社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））で分析する。ＭＭＰおよびＮＯ実験でのように、経時的試験を行い、ＣＯＧ１３３またはＣＯＧ１４１０試験前のＴＮＦ−アルファ産生のピーク時間を判定する。

賦形剤、逆ペプチド、ＣＯＧ１４１０、またはＣＯＧ１３３（または他のアポＥ類似ペプチド）処置滑膜線維芽細胞を、ＴＮＦ−アルファ、ＭＭＰ、およびＮＯ産生について、各々アッセイに最適である濃度およびインキュベーション時間で各々プロ炎症性メディエーターの多重用量での刺激後に試験することがわれわれの目的である。予備試験では、ＬＰＳ（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）０５５：Ｂ５、シグマ（Ｓｉｇｍａ））、ＩＬ−１ベータ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））またはＴＮＦ−アルファ（Ｒ＆Ｄシステムズ（Ｓｙｓｔｅｍｓ））のほか、ＩＬ−１ベータおよびＴＮＦ−アルファによる培養の同時処置によるＨＩＧ−８２細胞を活性化するための最適な濃度およびインキュベーション時間を確立する。

ピリンジャー（Ｐｉｌｌｉｎｇｅｒ）ら（２０００年）は、２０ｎｇ／ｍｌで組換えヒトＩＬ−１ベータまたはＴＮＦ−アルファを使用し、ＭＭＰ（ＭＭＰ−１および１３）およびＮＯのアッセイにおけるＨＩＧ−８２細胞を活性化した。ＨＩＧ−８２によるＭＭＰ産生の最適な時間は１４−４８時間の範囲であることが報告されている。ピークＭＭＰ産生を刺激するために使用されたヒトＩＬ−１Ｂの濃度も変動する（０．００１−２０ｎｇ／ｍｌ）（パナガコス（Ｐａｎａｇａｋｏｓ）ら、２０００年、コロミトキン（Ｋｏｌｏｍｙｔｋｉｎ）ら、２００２年、ピリンジャー（Ｐｉｌｌｉｎｇｅｒ）ら、２００４年）。ＴＮＦ−アルファ、ＮＯ、およびＭＭＰ１、３、９、および１３の産生の最適な条件は、最小３つの独立実験を表３に示されている通り４の複製において実行される。次善、最適な、および高用量の各々のメディエーターを試験する。統計的有意性をＡＮＯＶＡに引き続きダネットｔ検定を使用して判定する。

マトリックスメタロプロテアーゼ（ＭＭＰ）活性のアッセイ：われわれは、Ｃｏｇｎｏｓｃｉで開発された方法、すなわち、多重酵素／多重試薬アッセイ系（ＭＥＭＲＡＳ、ラスムッセン（Ｒａｓｍｕｓｓｅｎ）ら、２００４年）を使用してＭＭＰ１、３、９、および１３を測定することを提案する。ＭＥＭＲＡＳは単一試料での多重ＭＭＰの活性の測定を可能にする。

データは各々の実験群で検出された各々のＭＭＰの平均濃度±Ｓ．Ｅ．Ｍ．として表される。

ＮＯのアッセイ：細胞培養実験からの上清をグライス（Ｇｒｅｉｓｓ）試薬系（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ウィスコンシン州（ＷＩ））を使用して分析し、酸化窒素、亜硫酸塩（ＮＯ_２−）の安定、非揮発性の分解産物を測定する。データは陽性対照（細胞＋ＬＰＳまたはサイトカイン）の平均比率±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表される。

ウサギＴＮＦ−アルファのアッセイ：ウサギＴＮＦ−アルファ、およびウサギＴＮＦ−アルファ（標準）の捕捉および検出の抗体ペアは市販であり（ＢＤバイオサイエンス社（Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ））、メーカーの指示に従って使用され、ＨＩＧ−８２細胞が産生するＴＮＦ−アルファの量を定量する。データは陽性対照（細胞＋ＬＰＳまたはサイトカイン）の平均比率±Ｓ．Ｅ．Ｍ．で表される。

われわれが観察するＭＭＰ、ＮＯ、またはＴＮＦ−アルファの量の軽減が細胞死によるものではないことを確実にするために、提案されたすべての実験条件下、ＭＴＴアッセイ（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）、Ｍａｄｉｓｏｎ，ウィスコンシン州（ＷＩ））を使用してＨＩＧ−８２細胞で実行する。

実施例８ペネトラチン−ＣＯＧ１３３コンジュゲート
アポＥ類似物はＴＢＩのマウスモデルにおいて神経保護性である
ＴＢＩ後３０分に、マウスを４０６μｇ／ｋｇＣＯＧ１３３または生理食塩水賦形剤で処置した。損傷後２４時間、生理食塩水注射動物は回転棒試験によって測定される通り運動神経および平衡の顕著な障害を示した（図１５Ａ）。この運動障害は体重喪失と関係があった（データは示さず）。ＣＯＧ１３３処置マウスは、それらの生理食塩水処置対照よりも毎日、有意に優れて機能した、ｐ＜０．０１（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００１年）。この回復の機能は、生理食塩水処置マウスと比べＣＯＧ１３３処置マウスの海馬におけるニューロン死の減少と相関した、ｐ＜０．０５、データは示さず。これらの結果は、ＣＯＧ１３３の静脈内投与が回転棒での性能を改善し、頭部外傷と関係があるニューロン死を予防したことを強く示す。

回転棒による神経学的機能の急性回復の肉眼的試験に加えて、出願人はモリスの水迷路タスク（モリス（Ｍｏｒｒｉｓ）、１９８４年）における性能の変化を試験することによってＴＢＩ後２０日での慢性回復も測定した。このタスクでは視空間合図を作業および基準記憶へ組込む動物の能力を測定する。このタスクでの性能は、ヒト臨床集団において見られる神経精神障害の相関である（スケルトン（Ｓｋｅｌｔｏｎ）ら、２０００年）。図１５Ｂに示されているように、ＣＯＧ１３３で静脈内処置した頭部損傷マウスは、対照として静脈内生理食塩水賦形剤を投与した損傷動物よりも２３および２４日に有意に優れて機能した、ｐ＜０．０１（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００１年）。この一連の実験により、静脈内投与されるＣＯＧ１３３がマウスにおいてＴＢＩ後３０分に投与すると神経保護性であること原理の証明が明らかにされた。この保護は、神経運動、神経認知、および神経病理的エンドポイントにまで及んだ。

ＢＶ−２細胞におけるペネトラチン−ＣＯＧ１３３活性
先の研究では出願人は、ＣＯＧ１３３がＢＶ２マウスミクログリア細胞におけるＬＰＳ刺激亜硫酸塩分泌の用量依存抑制を示したことを明らかにした。図１６に示されているように、５０％抑制がおよそ３μＭ ＣＯＧ１３３の用量で達成された。出願人の予備研究のために、２つの最も一般的なＰＴＤ、ＴＡＴおよびペネトランを使用した。図１７に示されているように、ＴＡＴ−ＣＯＧ１３３コンジュゲートは、２５−１０００ｎＭの範囲では効果的ではなかった。１０００ｎＭよりも高い容量は結果として細胞の９０％以上の死をもたらした（データは示さず）。図１８は、ぺネトラチン−ＣＯＧ１３３コンジュゲートが有意により強力であったことを示す。ぺネトラチン−ＣＯＧ１３３（ＣＯＧ４５０２）による５０パーセント抑制がおよそ３０ｎＭで生じたが、ＣＯＧ１３３のみでは本実験で使用された用量範囲内では５０％抑制は達成されなかった。５０％の抑制が３μＭで達成された図１６におけるデータと図１８におけるデータの比較は、ＣＯＧ１３３の有効性がぺネトラチンにコンジュゲートすると（ＣＯＧ４５０２）約１００倍に増大したことを示す。これらの予備データは、ＴＡＴ−ＣＯＧ１３３は細胞傷害性であったが、ぺネトラチン−ＣＯＧ１３３（ＣＯＧ４５０２）はＢＶ２ミトコンドリアにおけるＣＯＧ１３３の有効性を有意に増大したことを示す。

ＰＴＤコンジュゲートＣＯＧ１３３の有効性をさらに判定するために、ＢＶ２細胞をさまざまな濃度のＰＴＤ−ＣＯＧ１３３（ＰＴＤおよびＣＯＧ１３３配列について表７を参照）で処置し、ＮＯ産生を定量し、細胞生存に基づき標準化した。図１９に示されているように、試験されたＰＴＤのすべてとのＣＯＧ１３３のコンジュゲートは、ＣＯＧ１３３の有効性をさまざまな程度に増強した。ＩＣ５０、すなわち、未処置対照に対してＮＯ産生の５０％抑制をもたらしたＰＴＤ−ＣＯＧ１３３コンジュゲートの濃度を各々化合物について測定した。図１９に示され、表７に詳述されているように、ＣＯＧ１３３は試験された最も高い濃度、すなわち、２５μＭで未処置対照の５０％に辛うじてＮＯ産生を軽減することができたが、ａｎｔｐＣＯＧ１３３は０．７μＭの用量でこれを軽減し、２５μＭでは１００％抑制を達成した。興味深いことに、切断ａｎｔｐＰＴＤ、すなわち、他のｉｎ ｖｉｔｒｏ試験（フィッシャー（Ｆｉｓｈｅｒ）ら、２０００年）において完全長ａｎｔｐと同様に効果的と報告されたａｎｔｐ（５２−５８）は、１１μＭのＩＣ５０で有意に減少した有効性を示した。ＳｙｎＢ３、ＳｙｎＢ５、および８Ｒはほぼ同じ程度にＣＯＧ１３３の活性を増強し、ＩＣ５０は、それぞれ、５．９μｍ、３．２μＭ、および４μＭであった。ａｎｔｐＣＯＧ１３３は最も効果的なコンジュゲートであり、結果としてＣＯＧ１３３に対して効力の４０倍の増大をもたらした。

同様の転帰がｉｎ ｖｉｖｏで生じるかを判定するために、出願人は、ＴＡＴ−ＣＯＧ１３３およびぺネトラチン−ＣＯＧ１３３（ＣＯＧ４５０２）コンジュゲートをＴＢＩ後のさまざまな時点でマウスに投与した。

ｉｎ ｖｉｖｏでのペネトラチン−ＣＯＧ１３３（ＣＯＧ４５０２）活性
マウスにはＣＯＧ１３３、ＴＡＴ−ＣＯＧ１３３、またはペネトラチン−ＣＯＧ１３３（ＣＯＧ４５０２）をＴＢＩ後のさまざまな時点で投与し、回転棒タスクでの性能によって効果を分析した。図２０に示された結果は、ＣＯＧ１３３のペネトラチンとのコンジュゲートがＣＯＧ１３３の治療の窓を増大せさうるが、ＴＡＴ−ＣＯＧ１３３による処置は効果的ではなく、生理食塩水と同様であったことを示す（データは示さず）。これらのデータは、ＢＶ２細胞におけるＣＯＧコンジュゲートの活性をスクリーニングし、それによってＣＯＧ活性の一次スクリーンとしてのＢＶ２細胞の有効性を確立することにより得られた結果と一致する。

出願人は、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏで、ＣＯＧ１３３がその抗炎症性および神経保護特性を示すことを明らかにした。輸送の機序が１つもしくはそれ以上の既知のアポＥ受容体による可能性が高いが、ペネトラチンなどのＰＴＤが輸送物を細胞膜上、かつ、場合によって、ＢＢＢ上を輸送する能力を有することが明らかである。ＢＶ２細胞およびｉｎ ｖｉｖｏの予備データは、出願人が、ＣＯＧ１３３のさまざまなＰＴＤとのコンジュゲートはＣＯＧ１３３の有効性および治療の窓を増大させうるという仮説を試験するように提案する固体塩基を形成する。現在、ＴＢＩを治療するために利用可能な確実な神経保護剤はない。これはプラットフォーム送達賦形剤として新規ＰＴＤの開発のための戦略における最初のステップである。新規ＰＴＤ類似体によって与えられるＢＢＢを通じた送達の増強により、ＣＯＧ１３３で処置されうる神経疾患の範囲がＴＢＩにおいて見られる明らかなＢＢＢ侵害を欠くものを含むために拡大される。また、ＣＯＧ１３３の細胞通過能がその活性を全身的に増強し、潜在的にＣＯＧ１３３が抗炎症性治療薬として広い適用を享受することを可能にする。

実施例９：ＢＶ２（マウスミクログリア）細胞におけるＣＯＧ１３３の細胞内送達および機能を促進するＰＴＤの同定
実験デザイン：独立変数がＰＴＤであり、依存変数が培養培地に存在する酸化窒素のレベルとなる無作為化デザインが使用される。

ＰＴＤ−ＣＯＧ１３３コンジュゲートの合成：ペプチドは、ニュー・イングランド・ペプチド社（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｐｅｐｔｉｄｅｓ）または他の適切な専門業者によって９５％の純度に合成され、滅菌等張性ＰＢＳ中で再構成される。各々のＰＴＤはＣＯＧ１３３のＮ末端に付加されるが、その配列はＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号１）である。ここで留意すべきは、ＣＯＧ１３３が５つのアルギニンを有することである。ＰＴＤのトランスサイトーシスに重要であることが報告されているアルギニンの存在は、ＣＯＧ１３３がそれ自体でＰＴＤの特性を有し、かつ／またはＰＴＤ輸送を促進しうることを示している。

細胞培養：十分に特徴づけられたマウスミクログリア細胞系である（ボチーニ（Ｂｏｃｈｉｎｉ）、１９９２年）ＢＶ−２が、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１０％ウシ胎仔血清、１％非必須アミノ酸、および１％ピルビン酸ナトリウムで補充した高いグルコース含有ＤＭＥＭ中で培養する。細胞を密集成長させ、トリプシン化し、遠沈し、１％Ｎ２補給剤、１％ペニシリン／ストレプトマイシン、１％非必須アミノ酸、および１％ピルビン酸ナトリウムを含有する血清を含まないＯｐｔｉＭＥＭ中に再懸濁し、２０，０００細胞／ウェルの濃度でプレーティングし、非接着性細胞および血清を除去する。

ＰＴＤ−ＣＯＧ１３３による細胞および処置のＬＰＳ刺激：ＢＶ２細胞をＯｐｔｉＭＥＭで洗浄し、血清の除去を確実にし、２００μｌの新鮮ＯｐｔｉＭＥＭで保護し、次いでさまざまな濃度のＰＴＤ−ＣＯＧ１３３（もしくは適切に希釈された炭酸アンモニウム賦形剤対照溶液）および大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）（カタログ番号Ｌ８２７４、シグマ（Ｓｉｇｍａ）からの１００ｎｇ／ｍｌ ＬＰＳで処置する。上清をＬＰＳ刺激後２４および／または４８時間に採集し、亜硫酸塩について測定する。

酸化窒素（ＮＯ）の定量：培地中の亜硫酸塩（ＮＯ産生の安定最終産物）の蓄積をコロメトリック（ｃｏｌｏｍｅｔｒｉｃ）グリース（Ｇｒｉｅｓｓ）試薬系（プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）によって測定し、吸光度を５４０ｎｍで測定する。

細胞生存アッセイ：細胞生存を非放射線活性細胞生存アッセイ（細胞タイター９６ＡＱ、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）） を使用して測定する。アッセイではＭＴＳ（（３−（４，５−ジメチルチアゾール−２−）−５−（３−カルボキシメトキシフェニル）−２−（４−スルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウムの生細胞によるホルマザンへの生体内還元性を測定する。コロメトリックアッセイの吸光度をλ４９０ｎｍで測定する。生存を評価し、これを使用して亜硫酸塩データを標準化する。

データ収集および統計的分析：実験を最小３つの異なる培養群に対する実験条件ごとに分析された最小６ウェルで行う。値は平均±標準誤差で表されうる。有意性は対応のないスチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを使用して判定する。

実施例１０：マウスにおける外傷性脳損傷の確立された回復モデルを使用してＣＯＧ１３３の有効性を強化し、かつ／またはその治療の窓を拡大する候補のＰＴＤ−ＣＯＧ１３３コンジュゲートの能力を測定する。

実験デザイン：２つの独立変数、ａ）損傷と処置との間の経過時間（すなわち、３０、６０、９０、および１８０分）、およびｂ）ＢＶ−２細胞における上位３つのＰＴＤ−ＣＯＧ１３３コンジュゲートベースの性能とともに無作為化デザインを使用する。依存変数は回転棒スコアおよび重量とする。

制御された空気衝撃デバイスによる頭部損傷モデル：麻酔誘発ボックス中で９０秒間、５０％のＦｉＯ２で酸素中４．３％イソフルランでマウスを麻酔する。気管に挿管し、肺を機械的に通気し、５０％Ｏ_２および５０％Ｎ_２中１．４％イソフランで麻酔する。体温を表面加熱／冷却を使用して３７℃下に維持する。各々のマウスを定位デバイスに配置する。頭蓋の上部を曝露し、解剖学的目印を特定する。制御された速度（６．０±０．２ｍ／秒）および鉛直変位（３．０ｍｍ）で２．０ｍｍ鋼チップインパウンダーを使用して、動物を空気インパクタ（エアー・パワー（Ａｉｒ−Ｐｏｗｅｒ）、ハイ・ポイント（Ｈｉｇｈ Ｐｏｉｎｔ）、ノースカロライナ州（ＮＣ）による制御された頭蓋衝撃にかける。動物を抜管前に自発換気に回復させる。回復後、マウスには自由に飼料と水を与える（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００１年ａ、ｂ）。

薬物投与：ＴＢＩ後３０、６０、９０、または１８０分の時点で、マウスには１００ｕｌの滅菌リン酸緩衝生理食塩水賦形剤、１ｍｇ／ｋｇの用量でＣＯＧ１３３、または１ｍｇ／ｋｇの用量でさまざまなＰＴＤ−ＣＯＧ１３３コンジュゲートにより静脈内注射する。以前の実験に基づき、実験処置群あたり動物２０匹を使用し、有意な統計的比較が行えうるように十分なデータを得る。

回転棒試験：回転棒試験を実験的に適用されるＴＢＩの約２時間前に与える。手短に言えば、各々マウスを尾によって持ち上げ、ゆっくりかつ一定の速度で回転する回転棒に静かに配置する。５〜１０秒後、回転棒を加速モードに切替え、タイマーをスタートさせる。マウスが回転棒から落下し、またはマウスが棒にしがみつき、２度回転した場合（７２０度の回転）にタイマーを止める。５分の休息期間後、同じマウスを回転棒に再び配置することによって第２の試験を実行し、「レイテンシー」すなわち回転棒で費やした時間を再び測定する。さらに５分の休息期間後、第３の試験を実行し、レイテンシータイムを各々のマウスについて測定する。ＴＢＩ後の翌日（および衝撃後２０〜２４時間）および翌５日間の毎日、各々のマウスを下記の通り回転棒試験で３回の試験によって試験し、各々のマウスをその独自の対照とすることを可能にする。データ分析のために、マウスの群の各々マウスの３つのレイテンシータイムを共に平均化し、標準偏差を計算する。この試験パラダイムは、外傷後機能障害の存在、およびその後の回復を検出する感度を有することを明らかにしたＴＢＩに関するわれわれの以前の調査に基づいて選択された（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００１年ａ、ｂ）。すべての試験は群の割当が知らされていない研究者によって行われる。

データ収集および統計的分析：値は平均±標準誤差として表されうる。有意性は、対応のないスチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを使用して判定される。

ＳｙｎＢ３−ＣＯＧ１３３の結果
図２３に示されたデータは、ＳｙｎＢ３−ＣＯＧ１３３コンジュゲートが、外傷性脳損傷後２時間に１回尾静脈注射によって投与するとマウスにおける頭部外傷からの転帰を有意に改善する（回転棒レイテンシーによって測定）ことを示す。

実施例１１．ＣＯＧ１３３の抗炎症性特性
アポＥホロ−タンパク質由来のペプチドによりホロ−アポＥ−タンパク質と同じ抗炎症活性が得られるか試験するために、われわれは最初、ＣＯＧ１３３（ａｋａ．アポＥ１３３−１４９）またはアポＥ１３０−１４９の添加が結果としてリポ多糖（ＬＰＳ）で刺激したＢＶ２ミクログリア細胞系からのＴＮＦα放出の用量依存阻害をもたらすことを示した（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）ら、２００１年）。対照的に、スクランブルペプチドで処置した細胞は、ＴＮＦα放出を阻害しなかった。同様に、ＣＯＧ１３３およびアポＥ１３０−１４９はＬＰＳ処置ＢＶ２細胞からの酸化窒素放出を有意に軽減したが、スクランブルペプチド処置は酸化窒素放出を阻害しなかった。これらのデータは、マクロファージ細胞のＬＰＳ誘発死激後のサイトカイン（ＴＮＦα）およびフリーラジカル（ＮＯ）の放出がＣＯＧ１３３の存在下に有意に軽減され、ＣＯＧ１３３が抗炎症剤として機能しうることを示しているのを明らかにした。参照によりその全体が本明細書で援用される、米国特許第１０／２５２，１２０号明細書を参照。

われわれは次に、ＣＯＧ１３３（アポＥ−１３３−１４９）が、細胞ベースのモデル（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）ら、２００１年）と同じやり方で丸ごとの動物（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００３年）における炎症性反応を抑制するか調査した。ＬＰＳと同時投与すると、ＣＯＧ１３３アポＥ−類似ペプチドは血清ＴＮＦαおよび血清ＩＬ−６レベルを有意に軽減した。末梢におけるサイトカイン放出の抑制に加えて、われわれは、野生型マウスの脳におけるサイトカインｍＲＮＡレベルに対するＬＰＳ＋ＣＯＧ１３３の尾静脈注射の効果を調査した（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００３年）。ＬＰＳ＋生理食塩水と比べ、ＴＮＦαおよびＩＬ６ ｍＲＮＡレベルはＬＰＳ＋ＣＯＧ１３３の注射後３時間で動物において有意に減少し、アポＥ類似ペプチドであるＣＯＧ１３３の投与が丸ごとの動物モデルにおけるＬＰＳ誘発炎症を有意に抑制しうることを示した。

実施例１２．内因性アポＥタンパク質の放射線保護の役割
アポＥの抗炎症効果がＴＢＩおよび放射線療法を受ける対象の保護に有用であることを確認するために、われわれは、マウスアポＥタンパク質を発現する野生型Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおけるＴＢＩの７Ｇｙおよび８Ｇｙの効果をアポＥノックアウトマウス（ジャクソン・ラボ社（Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｓ）、Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、メイン州（ＭＥ））におけるＴＢＩの７Ｇｙおよび８Ｇｙの効果と比較した。マウス１０匹の群を０の時点で照射し、その生存を翌３６日にわたって追跡した。図２２に示されているように、７Ｇｙへ曝露された野生型マウスのうち１匹も３０日の時間的経過中に死亡しなかったが、アポＥノックアウトマウス１０匹のうち２匹が照射後１３日で死亡し（２０％死亡／８０％生存）、３０日の時間的経過中にさらなる死亡はなかった。野生型マウス１０匹の群を８ＧｙのＴＢＩへ曝露した場合、４匹が照射後２１日目に死亡し、さらに２匹が２３日目に死亡したが、３６日までにそれ以上の死亡はなかった。アポＥノックアウトマウス１０匹の群を８ＧｙのＴＢＩへ曝露した場合、６匹が照射後１０日で死亡し、さらに２匹が１１日目に死亡し、最後の２匹は１２日目に死亡した。

この８Ｇｙ ＴＢＩデータを要約するいくつかの方法がある。すなわち、最大１００％のアポＥノックアウトマウスが照射後１２日までに死亡するのに対し、照射後２３日までに最大６０％の野生型マウスが死亡する。あるいは、６０％のアポＥノックアウトマウスが照射後１０日までに死亡するのに対して、６０％の野生型マウスが照射後２３日までに死亡する。データのいずれかの表示からも、アポＥノックアウトマウスにおけるアポＥタンパク質の不在は早期での死亡と関係があり、大きな割合のアポＥノックアウト動物が、その野生型のアポＥ含有対照と比べ所定用量のＴＢＩで死亡することが明らかである。この所見は、アポＥタンパク質が、ＴＢＩ後の丸ごとの動物の生存を増強する保護効果を与え、アポＥの欠損が高荷電、高エネルギー（ＨＺＥ）粒子曝露の行動毒性を悪化させうることを示す以前の実験（ヒグチ（Ｈｉｇｕｃｈｉ）ら、２００２年）と一致することを本発明者に示した。

全身照射は、全身炎症における顕著な増大と関係がある。われわれおよび他の人々は、ＴＢＩへ曝露されたマウスの血液中のサイトカインのレベルの顕著な増大を見出した（ブダゴフ（Ｂｕｄａｇｏｖ）２００４年および未発表）。ブダゴフ（Ｂｕｄａｇｏｖ）およびウリアノバ（Ｕｌ’ｉａｎｏｖａ）（２００４年）は、同じ損傷へ曝露され、抗ＩＬ６モノクローナル抗体を受けなかったマウスの１００％の死亡率と比べ、７．５ＧｙのＴＢＩ＋１０％の体表面全層熱傷を受けたマウスへの抗ＩＬ６モノクローナル抗体のマウスへの投与が結果として損傷後３０日での６０％レベルへの大幅に改善された生存をもたらしたことを見出した。ファン・デル・メーレン（Ｖａｎ ｄｅｒ Ｍｅｅｒｅｎ）ら（２００２年）の優れた報告が、８ＧｙのＴＢＩを受けた後、２時間遅延され、次いでｒＩＬ１１を５日間毎日投与されたマウスが死亡から大幅に保護されたことを示した。具体的には、ＴＢＩ後３０日に、ｒＩＬ１１処置群が７４％の生存率を享受したが、プラセボ処置対照は１１％生存率しか達成しなかった（ｐ＜０．００１）。これらの試験は、体の免疫反応の調節が全身照射へ曝露された個体の生存において有意に好ましい役割を果たしうるという考えを強く裏づける。

アポＥが炎症において果たす役割に基づき、われわれは、ホロ−アポＥの組織保護活性を有する小ペプチドであるＣＯＧ１３３を作成した（図２２）（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）ら、２００１年、リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００３年、リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００５年）。野生型マウスにおけるリポ多糖（ＬＰＳ）誘発炎症を使用することにより、ＣＯＧ１３３による処置が、ＬＰＳおよび生理食塩水賦形剤で処置したその野生型対照と比べると、血液および脳における腫瘍壊死因子アルファ（ＴＮＦａ）およびインターロイキン−６（ＩＬ６）放出を顕著に軽減した。炎症が実験的に適用された外傷性脳損傷後に誘発される別の野生型のマウスモデルにおいて、われわれは、ＣＯＧ１３３が、外傷性脳損傷後３０分に投与されると、大幅に死亡を阻止し、行動機能を修復することにおいて効果的であったことを報告した（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００５年）。より最近の試験において、われわれは、腹腔内経路によるＣＯＧ１３３投与がマウスにおけるＬＰＳ注射後の炎症の軽減においても効果的であることを見出した（データは示さず）。われわれの結果は、ＣＯＧ１３３が天然起源のアポＥタンパク質の内因性レベルの存在下に炎症を効果的に軽減し、ＣＯＧ１３３が炎症性刺激後に投与されている場合でもそのように軽減しうることを示す。

実施例１３．ＣＯＧ１３３の存在および非存在下にＴＢＩを受けるマウスの生存
ＴＢＩが炎症を刺激し、アポＥ類似物であるＣＯＧ１３３が丸ごとの動物における炎症を調節しうるという情報を組合わせることにより、われわれは、全身照射へ曝露された野生型マウスにおける生存を改善するＣＯＧ１３３の能力を試験した。

われわれが実行した独立研究から、ＣＯＧ１３３の最大耐量は１４ｍｇ／ｋｇである（データは示さず）。この最大耐量は、ＣＯＧ１３３の尾静脈注射の２４時間以内に動物が死亡しない用量である。われわれは、ＬＰＳ介在ＴＮＦａおよびＩＬ６レベルがＣＯＧ１３３の同時投与によって大幅に軽減されることも報告した（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００３年）。したがって、われわれは、０〜１２グレイの全身照射（ＴＢＩ）を受けたマウスにゼロ〜最大耐量の半分（０〜０．５×ＭＴＤ）であるＣＯＧ１３３の量（用量）を投与する。このようにして、ＴＢＩのみの効果、ＣＯＧ１３３のみの効果、およびＴＢＩ＋ＣＯＧ１３３の効果を比較することができる。

最初に試験される放射線量の範囲（０〜１２Ｇｙ）は、中間および低用量の照射をカバーする（ホール（Ｈａｌｌ）、２０００年）。放射線の中間線量（５〜１２Ｇｙ）では、死亡は数日中に起こることが予想され、下痢および胃腸粘膜の破壊（胃腸症候群と呼ばれる）と関係がある。低い放射線量（およそ２．５〜５Ｇｙ）では、死亡は曝露の数週間後に起こり、血液形成臓器に対する影響によって引き起こされる（骨髄死または造血症候群と呼ばれる）。したがって、高い線量群では早期の胃腸症候群および低線量群では遅延造血症候群が予想される。

図２３に示されているように、アポＥタンパク質を発現する野生型マウスは、１０ＧｙのＴＢＩへ曝露されるとＬＤ_{１００／１２}を受ける（すなわち、１０ＧｙのＴＢＩへ曝露されるマウスの１００％が照射後１２日で死亡する）。対照的に、ＴＢＩ（１０Ｇｙ）後１分でＣＯＧ１３３の１回の腹腔内注射（生理食塩水中４ｍｇ／ｋｇ）を投与されるマウスは、より優れた生存を示し、その生理食塩水処置対照よりも優れているＬＤ_{１００／１３}を示す。われわれが１０ＧｙのＴＢＩをマウスに投与した後、１時間の遅延の後、さらにＣＯＧ１３３の初期投与（４ｍｇ／ｋｇ）の後、ＴＢＩ後１日、２日、および３日目に追加のＣＯＧ１３３を投与した場合は、生存はさらに増強され、その生理食塩水処置対照よりも有意に優れているＬＤ_{１００／１６}を示した（ｐ＜０．０１）。これらのパイロット実験、およびＴＢＩにおける免疫修飾因子の文献の報告は（上記参照）、ＴＢＩ後３０日で生存を大幅に増大させる放射線生物学的標準に合致するＣＯＧ１３３の能力をさらに試験することにわれわれをかきたてる。

これらのデータは、Ｃ５７Ｂｌ６マウスのＴＢＩへの曝露後にＣＯＧ１３３の投与が結果として、放射線を受け、かつＣＯＧ１３３を欠く生理食塩水賦形剤を受けたマウスと比べ寿命の拡大をもたらしたことを示す。これらの動物のいずれもが３０日まで生存しなかったが、われわれは、照射後１２日で生理食塩水処置マウスにおける１００％の死亡率を示した（ＬＤ_{１００／１２}）１０Ｇｙの高い線量を使用した。１０Ｇｙの後ＣＯＧ１３３による処置を受けた全動物も死亡したが、それらは１４日および１６日までに死亡し、その生存時間は明らかにＣＯＧ１３３が投与されたパラダイムに関係があった。４用量のＣＯＧ１３３が投与された動物は、ＡＮＯＶＡによって分析されると、照射後に生理食塩水賦形剤処置対照群よりも有意に長い時間生存した（ｐ＜０．０５）。別のやり方で示すと、１０Ｇｙへ曝露された各々群のＬＤ５０は生理食塩水対照、ＬＤ５０／１００、照射後１分でＣＯＧ１３３、ＬＤ５０／１２、および照射後１時間＋照射後１、２、および３日でＣＯＧ１３３（１ｍｇ／Ｋｇで合計４用量のＣＯＧ１３３）、ＬＤ５０／１４であった。われわれはこのデータを用量軽減因数またはＤＲＦとして示したと思ったが、１回の放射線量で得られたこの制限されたデータセットで行うことは不可能である。放射線量の変化が、次いでＤＲＦ計算を可能にするＣＯＧ１３３の存在および非存在下にＬＤ５０／３０を実験的に測定する実験で与えられる必要がある。所定レベルの致死率では、用量軽減因数は、ＣＯＧ１３３の非存在下に放射線量によって割られるＣＯＧ１３３の存在下の放射線量に等しい。この計算方法を使用することにより、ホール（Ｈａｌｌ）（２０００年）は、アミホステンが照射イベント直前に投与されるとマウスにおける照射後３０日でアミホステンについて２．７の用量軽減因数を報告している。最大用量軽減因数は２．５〜３であると計算されるが（ホール（Ｈａｌｌ）、２０００年）、われわれは、ＴＢＩイベント後に投与され、マウスにおける生存期間を延長させるＣＯＧ１３３の能力に集中している。したがって、われわれの目的は、ＣＯＧ１３３が組織を保護することができ、それによってＴＢＩを受け、その後にＴＢＩ後ＣＯＧ１３３を投与される動物の生存期間を延長させることを示すことである。

われわれはこれらの実験を、マウスアポＥタンパク質を発現する野生型、Ｃ５７Ｂ１／６マウスにおいても実行する。われわれは、これらの野生型、アポＥ含有マウスへのＣＯＧ１３３の添加がその生存を改善するかを試験している。われわれは、これは、ＣＯＧ１３３などの放射線保護療法がすでにアポＥタンパク質を有するヒトに潜在的に投与されるため重要であると思う。われわれは、ＣＯＧ１３３によるアポＥノックアウトマウスにおける実験を行うことを考慮したが、これは低いバーであり、すでにその独自の内因性アポＥタンパク質を発現したヒトに与えられるう療法の長期の基準に合致しないと思われた。

ペプチド合成： ペプチドはマルチプル・ペプチド・システムズ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）によって質量分析で確認されるように９５％の純度に合成され、トリフルオル酢酸塩から再構成される。ＣＯＧ１３３は配列：ＬＲＶＲＬＡＳＨＬＲＫＬＲＫＲＬＬ（配列番号１）を有し、逆−ＣＯＧ１３３は配列：ＬＬＲＫＲＬＫＲＬＨＳＡＬＲＶＲＬ（配列番号５７）を有する。

処置条件：一般に、各々の治療群は、週齢１２〜１６のオス、Ｃ５７ＢＬ／６マウス１２匹から成る。われわれは、０×ＭＴＤ（すなわち、生理食塩水賦形剤）、０．１×ＭＴＤ、０．２×ＭＴＤ、および０．５×ＭＴＤ（０、２．６、５．２、および１３ｍｇ／Ｋｇ、本実験では合計５０ｍｇ）に対応するＣＯＧ１３３の用量を投与する（表８）。ＣＯＧ１３３の初期腹腔内投与は全身照射後１時間（すなわちＴＢＩ後１時間）であり、その後、合計３０日間または動物が死亡するまで毎日注射する。ＴＢＩによる文献およびわれわれ独自の予備データからの値に基づき、われわれは、上記のＣＯＧ１３３の各々の異なる用量とともに、０、４、５、６、７、８、９、および１０Ｇｙの全身電離照射を使用する。したがって、４つの量のＣＯＧ１３３×８つの異なる量の放射線量により３２の異なる条件が得られる。３２の異なる条件×条件あたりマウス１２匹で合計マウス３８４匹となる。全身照射（ＴＢＩ）を受けるために、マウスは較正照射器へ配置され、上記の予備の結果の部で行われた通り電離放射線の所望量を生成する長さの時間にわたって曝露される。生理食塩水のみおよび全化合物は、ＴＢＩ後６０分、次いで３０日間毎日、腹腔内注射によって滅菌生理食塩水賦形剤で投与される（ＣＯＧ１３３のＱＤ投与）。

動物評価：動物の生存はさまざまなやり方で測定される。死亡は、呼吸の完全欠如、および１０分もしくはそれ以上の間のテイルピンチおよび／またはトーピンチなど外部刺激に対する完全無反応として規定される。生存は、ＴＢＩ曝露後３０日の各々について毎日、各々の動物において評価される。動物はＴＢＩ前の３日間毎日およびＴＢＩ後３０日間毎日、電子スケールで体重を量る。

臨床徴候は動物のＣＮＳ活性に関連した所見であり（運動活性、運動失調、立ち直り反射、およびけいれん）、毒性または病的状態の早期指標である。これらの所見を使用し、ＴＢＩ後に機能する動物の能力およびこの性能がＣＯＧ１３３で改善されているかを評価することができる。われわれは、修正神経重篤度評価システムを使用し、サマリー神経重篤度スコア（ＮＳＳ）を、われわれの協力者であるラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）博士によって記載された通り示す（シェング（Ｓｈｅｎｇ）ら、１９９９年）。各々の動物をＴＢＩ前の３日間毎日およびＴＢＩ後３０日間毎日評価する。群の割当が知らされていない訓練を受けた監視者がこれらの評価を行う。０点のスコアが正常な神経学的検査を意味し、１０点のスコアは最も重篤な神経障害を意味する。値は「サマリーＮＳＳスコア」として以下の通り要約される。すなわち、１＝正常（０点）、２＝中等度障害（１−６点）、３＝重篤な障害（７−１０点）、４＝死亡。各評価間、動物をそのケージに戻し、飼料と水を自由に与える。神経−重篤度スコアをマン・ホイットニーＵ統計値を用いて比較する。

過度の苦痛の徴候を示していると思われる動物、それらはヒト用途および動物のケアのＩＡＣＵＣのガイドラインにより直ちに安楽死させられる。非致死的罹患率の測定は実施例４において対処される。死亡データは、ログランク検定および／またはフィッシャーの正確検定（両側）を使用して処置および未処置動物の生存曲線を比較することによって分析される。生存データの統計的分析は、全群間でプリズム（Ｐｒｉｓｍ）コンピュータプログラムにより比較される。有意性は対応のないスチューデントｔ検定またはＡＮＯＶＡを使用して判定され、ｐ＜０．０５の場合に統計的有意性と仮定する。

線量軽減因数：ホール（Ｈａｌｌ）（２０００年）は、同じレベルの効果（ＬＤ_{５０／３０}）に対する薬剤（ＣＯＧ１３３など）の非存在下の放射線量に対する薬剤（ＣＯＧ１３３など）の存在下の放射線量の比としてＤＲＦを規定している。したがって、ＤＲＦ＝５０％レベルの致死率（＝５０％生存）をもたらすＣＯＧ１３３の非存在下の放射線量によって割られるＣＯＧ１３３の存在下の放射線量である。上記の試験から収集されたデータを使用することにより、われわれは、ＴＢＩ後３０日で５０％生存を示す全身照射の線量が補間されうる生存対曝露曲線をプロットする（ヘンシュケ（Ｈｅｎｓｃｈｋｅ）とモルトン（Ｍｏｒｔｏｎ）１９５７年）。生理食塩水対照動物からのＬＤ_{５０／３０}のほか、ＣＯＧ１３３の０．１×ＭＴＤ、ＣＯＧ１３３の０．２×ＭＴＤ、およびＣＯＧ１３３の０．５×ＭＴＤのＬＤ_{５０／３０}を使用することにより、われわれは、ＣＯＧ１３３の各々量のＤＲＦを計算する。ＤＲＦが１よりも大きい場合は、この結果はＴＢＩ後のＣＯＧ１３３による動物の処置がＴＢＩへの曝露の動物の生存に対する保護効果を有することを示す。ＤＲＦが１である場合は、ＣＯＧ１３３処置によって保護が得られない。ＤＲＦが１未満である場合は、ＣＯＧ１３３はＴＢＩに対して動物を感作する薬剤として作用しているとみられる。図３におけるわれわれの予備試験に基づき、われわれは、ＣＯＧ１３３が、ＴＢＩへ曝露されたマウスの生存を有意に増大させ、１より大きいＤＲＦを生む放射線保護剤として作用することを予測する。

マウスは、ＴＢＩに対して一貫して反応するため、この概念の検証実験には最適な動物であり、照射器械へ都合よく適応させるのに十分に小さく、その小さなサイズによりこの試験パラダイムにおけるＣＯＧ１３３の使用が節約される。その後のタスクにおけるＣＯＧ１３３の効果を正確に判定するために、われわれは、各々の処置条件に対する完全な放射線量対生存率曲線を生成する必要がある。マウスに関しては、４Ｇｙ未満のＴＢＩ曝露が一般的に生存に対する測定可能な効果を示さず、したがって、われわれは、この提案においてその低線量実験で重要な動物資源を消費することは選択しなかった。しかし、線量照射試験からの異なる転帰が今後の提案の対象となりうる。他方、１０Ｇｙを超えるＴＢＩ曝露は一般的に１０％未満の生存（９０％を超える死亡）をもたらす。１０Ｇｙを超えるものに対する動物の反応は軍事的および民間的理由で重要ではあるが、われわれは、動物の死亡とも顕著に関係がある曝露の範囲に集中することを選択した。われわれの治療介入がＴＢＩのこれら低〜中程度の線量で生存を有意に改善しうる場合は、今後の提案は、１０Ｇｙを超えるＴＢＩなど高い線量のＴＢＩ後の生存の保護に対する可能性に集中することになる。

実験のスケジュール：動物４８匹の１群を計画の１年間にわたってほぼ６週間ごとに試験する。したがって、以下のスケジュールが提案される。

実施例１４．ＣＯＧ１３３処置の有無によるＴＢＩ動物のワイヤハング／回転棒での行動性能
全体としては、マウスをワイヤハング試験で試験し、マウスがその肢の強さを有することを示す。マウスが強さを有する場合は、次いで、運動強度および調整の行動性能の統合試験である回転棒で試験される。ストレスをかける前にこれらの試験にパスしない動物は、われわれのその後の研究で使用されない。ＴＢＩ＋ＣＯＧ１３３を受けた動物がＴＢＩのみを受けたものより有意に優れて機能する場合は、これはＣＯＧ１３３が死亡を改善するだけではなく、病的状態も改善することを示す。

ワイヤハング試験：把握（ｐｒｅｈｅｎｓｉｌｅ）反射および一般運動強度を評価するために、ワイヤハング試験を使用する。本試験のわれわれのバージョンでは、マウスを尾で持ち上げ、標準靴箱ケージ（これは、２０ｃｍ×３０ｃｍの靴箱の全上部をカバーする約１ｃｍ間隔で配置された直径およそ２ｍｍの平行のステンレス鋼ワイヤから成る）のワイヤふた上に配置する。マウスは一般的にふた上のワイヤをつかみ、マウスを保持するふた全体はベンチの上部に位置する気泡ゴムパッドの上部より上の約２０〜３０ｃｍで反転される。マウスは３０秒間ふたをつかんだままにされる。マウスがふたをつかみそこねて３０秒前に落下した場合は、反転から落下までの時間がレイテンシータイムとして記録される。マウスが落下しない場合は、３０秒のレイテンシータイムが与えられる。３つの試験がＴＢＩ前の３日間毎日、各々のマウスについて実行される。各々試験は、休息期間として少なくとも５分で分離される。平均レイテンシータイムおよび標準偏差を各々の日の各々群について計算する。ワイヤハングはＴＢＩ後の毎日に同じやり方でも実行される。動物が、ＴＢＩ前の３日の各々における各々の試験で全３０秒間、ワイヤハングを成功裏に実行し、ワイヤふたで保持することができない場合は、ＴＢＩおよびその後の試験から除外される。われわれの実験ではすべての健康な野生型、Ｃ５７Ｂ１／６マウスは容易にこの試験をパスしている。

回転棒試験： 毎日の回転棒（ＲＲ）試験を使用し、全身照射後の短期の運動および小脳障害を評価する（ハム（Ｈａｍｍ）ら、１９９４年）。回転棒試験は、ＴＢＩ前の３日間毎日およびＴＢＩ後の３０日間毎日与えられる。手短に言えば、各々のマウスを尾によって持ち上げ、ゆっくりかつ一定の速度で回転する回転棒に静かに配置する。５〜１０秒後、回転棒を加速モードに切替え、タイマーをスタートさせる。マウスが回転棒から落下し、またはマウスが棒にしがみつき、２度回転した場合（７２０度の回転）にタイマーを止める。５分の休息期間後、同じマウスを回転棒に再び配置することによって第２の試験を実行し、「レイテンシー」すなわち回転棒で費やした時間を再び測定する。さらに５分の休息期間後、第３の試験を実行し、レイテンシータイムを各々のマウスについて測定する。

毎日、各々のマウスを上記の通り回転棒試験で３回の試験によって試験し、それによって各々のマウスをその独自の対照とすることを可能にする。データ分析のために、マウスの群の各々マウスの３つのレイテンシータイムを共に平均化し、標準偏差を計算する。この試験パラダイムは、回転棒が外傷後機能障害の存在、およびその後の回復を検出する感度を有することを明らかにした行動実行に関するわれわれの以前の調査に基づいて選択された。群の割当が知らされていない研究者がすべての試験を行う。われわれは、プリズム（Ｐｒｉｓｍ）統計的分析プログラムとともに反復測定ＡＮＯＶＡを使用し、実験化合物を投与したマウス、および生理食塩水対照を投与したマウスの群間の差の有意性を計算するが、ここでｐ＜０．０５を有意とみなす。動物が、一般的に、ＴＢＩの３日の各々における各々の試験でこの齢の健康なマウスでは約２００秒であるレイテンシータイムである回転棒で成功裏に実行できない場合は、ＴＢＩおよびその後の試験からこれを除外する。

統計的分析：行動転帰の統計的分析は、対照群に対する多重比較の補正するためのダンネットのポストホック法による分散の反復測定分析で実行される。有意性は、ｐ＜０．０５の場合に仮定される。すべての値が平均±標準偏差として表される。

実施例１５：抗炎症性特性を有するアポＥ類似ペプチド
アポＥタンパク質の抗炎症性特性に基づき、われわれは、２９９アミノ酸、アポＥホロタンパク質の受容体結合部位に位置したアミノ酸残基（１３３−１４９）由来のペプチドであるＣＯＧ１３３を開発した（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）ＤＴら、２００１年）。われわれは、培養マクロファージ（ラスコウィッツ（Ｌａｓｋｏｗｉｔｚ）ＤＴら、２００１年）およびＣ５７Ｂ１／６マウス（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）Ｊ．Ｒ．ら、２００３年）を使用することにより、ＣＯＧ１３３がアポＥタンパク質の抗炎症性特性を保持することを明らかにした。炎症をＬＰＳ注射±ＣＯＧ１３３によってナイーブマウスにおいて誘発し、注射後０、１、３、および２４時間の時点で血清を回収した（図２４ＡおよびＢ）。サイトカインＥＬＩＳＡキット（パース（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用することによって、ＣＯＧ１３３処置動物は、生理食塩水対照と比べ、有意に低い血清ＴＮＦ−αおよび有意に低い血清ＩＬ−６を有した（リンチ（Ｌｙｎｃｈ）Ｊ．Ｒ．ら、２００３年）。われわれもリンチ（Ｌｙｎｃｈ）らにおいて、ＴＮＦ−αおよびＩＬ−６の脳レベルが、定量的ＲＴ−ＰＣＲによってタンパク質レベルまたはｍＲＮＡレベルのいずれかの測定によって、生理食塩水対照と比べＣＯＧ１３３処置動物において有意に低いことを報告した。新鮮ヒト血液±ＣＯＧ１３３のＬＰＳ刺激も、ＣＯＧ１３３が生理食塩水処置対照と比べ、酸化窒素およびＴＮＦ−αレベルを有意に軽減したことを示した。これらのデータは、ＣＯＧ１３３がｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｉｎ ｖｉｖｏ、およびエクスビボで炎症を軽減することを示し、これは、ＣＯＧ１３３がヒト疾患における炎症を効果的に軽減しうるというわれわれの考えを裏づける。

実施例１６．ＣＯＧ１３３はＥＡＥを有するマウスにおける疾患重篤度を軽減する
マウスにおけるＭＯＧ誘発実験アレルギー性脳脊髄炎（ＥＡＥ）は、ＭＳおよびＥＡＥの臨床的および組織病理学的特徴が多くの基本的な点で同様とみなされるため多発性硬化症（ＭＳ）と関係がある炎症の最もしばしば使用されるマウスモデルである。これらには、ＣＮＳの全体を通じて多発性病変の臨床症状、発生率、脱髄性斑、血管周囲炎症、およびＴＮＦ−α、ＩＬ−６、およびＮＯのような炎症原を放出する侵入炎症性細胞を関与が含まれる（ランゾホフ（Ｒａｎｓｏｈｏｆｆ）Ｒ．Ｍ．、１９９９年）。したがって、このモデルは、ＣＯＧ１３３がその抗炎症性特性によりＭＳの障害を改善しうるというわれわれ仮説を試験するために選択された。

手短に言えば、Ｃ５７ＢＬ／６メスマウスを最初にＭＯＧペプチド（ｐＭＯＧ_{３５−５５}、ＭＥＶＧＷＹＲＳＰＦＳＲＶ ＶＨＬＹＲＮＧＫ）で免疫化し、免疫化後６〜２４日に開始することにより、１ｍｇ／ｋｇのＣＯＧ１３３もしくは逆ＣＯＧ１３３、または同量の生理食塩水を尾静脈ボーラス注射によって一日おきに投与した。全体で、１０用量のペプチドを投与した。われわれは、ＣＯＧ１３３処置動物における平均最大臨床スコアが生理食塩水対照動物におけるよりも有意に低いことを示すことによって、ＣＯＧ１３３がＥＡＥの重篤度を有意に改善することを見出した（図１０）。ＣＯＧ１３３は、生理食塩水群の１５匹中４匹および逆ペプチド群の１５匹中５匹から、ＣＯＧ１３３処置群の１５匹中０匹へ死亡を有意に軽減した（ｐ＜０．０５）。疾患進行のパターンは、マウスがＣＯＧ１３３処置群において免疫化後２３日から回復し始めたが、対照動物は依然として高いレベルの重篤度のままであった（図２）。逆ＣＯＧ１３３はＢＶ２細胞におけるｉｎ ｖｉｔｒｏで生物活性を欠き、ＥＡＥの行動症状を改善しなかった（図１０）。逆ペプチド群と生理食塩水群との間に統計的に有意差はなかった（ｐ＞０．０５）が、いずれかの対照群と比べＣＯＧ１３３群における統計的に有意な改善が認められる（ｐ＜０．０５）。示されてはいないが、きわめて同様の結果が、ＣＯＧ１３３処置動物による投与の腹腔内経路（ｉ．ｖ．の代わりにｉ．ｐ．）を使用して得られ、生理食塩水対照と比べ有意な改善を示した（ｐ＜０．０５）。これらの結果は、ＣＯＧ１３３がＥＡＥと関係がある炎症を有意に軽減し、疾患からの回復を促進しうることを示す。

侵入炎症性細胞を含む病理学的変化を示すために、動物を３０日目に犠死させ、全脊髄をばらばらにし、ＣＯＧ１３３処置動物および生理食塩水処置対照の脊髄の頸部、胸部、および腰部から５μｍ厚の切片を作成した。これらの切片をルクソールファーストブルーで染色し（ミエリンについて、青色に染色）、次いでエオシンで対比染色した（末梢浸潤物を赤紫色に示す）。図２５−Ａ、Ｂ、およびＣに示されているように、大規模な脱髄（青色染色の喪失）および増強された浸潤物（赤紫色粒子で示される）が対照動物の脊髄全体を通じて白質において確認されうる。行動変化と一致して、ＣＯＧ１３３はＭＯＧ処置動物における脱髄を軽減し、かつ炎症性浸潤物を軽減した（図２５−Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）。

実施例１６ＣＯＧ１３３の類似体も抗炎症性活性を有する
ＣＯＧ１３３をテンプレートとして使用することにより、われわれは、増強された所望の医薬特性を有する新しい類似体を生成し続けている。図２６に示されているように、ＣＯＧ１４１０は、非天然アミノ酸を含有し、ＣＯＧ１３３親化合物よりも優れたＬＰＳ−刺激、ＢＶ２ミクログリア細胞におけるＮＯ放出を抑制することができる類似体である。同様に、ＣＯＧ４５０２は、エキストラアミノ酸のプレフィックスに引き続きＣＯＧ１３３配列を含有し、ＣＯＧ１３３親よりもはるかに優れてこの系でＮＯ放出を抑制することができる別の類似体である。より生理的な系におけるＣＯＧ４５０２の有用性をさらに検証するために、われわれは、マウス腹膜マクロファージを単離し、それらをＣＯＧ４５０２の存在または非存在下にＬＰＳで刺激した。図２７に示されているように、ＣＯＧ４５０２はＴＮＦａの用量依存阻害およびＩＬ６放出の用量依存阻害をもたらす。これらの結果は、ＣＯＧ化合物が、細胞系、腹膜マクロファージ、および丸ごとの動物において有力な抗炎症性分子であることを強く示す（上記で詳述）。

実施例１７結腸炎のマウスモデル：アルギナーゼおよびＯＤＣの保護的役割およびｉＮＯＳの有害な効果
炎症はクローン病および潰瘍性結腸炎の進行および症状の基礎にあり、場合によって、これは狭窄形成、瘻、閉塞、およびせん孔の合併症に進行しうる。ＩＢＤにおけるこの炎症性反応の一部が、一般に疾患活性の悪化と結合しているＮＯ放出の刺激である。ＮＯは基質としてアルギニンからのＮＯ合成（ＮＯＳ）によって生成され、この酵素の誘導性形態（ｉＮＯＳ）はＩＢＤに関与する主要な担い手である。しかし、アルギニンは、ポリアミンを生成する別の経路によっても使用される。これは、制限アルギニン基質の２つの経路間での競合を誘発する。

ウィルソン・ラボ（Ｗｉｌｓｏｎ Ｌａｂ）は、粘膜免疫学におけるｉＮＯＳおよびアルギナーゼ／ＯＤＣ経路の競合活性に集中してきた（クロス（Ｃｒｏｓｓ）ＲＫら、２００３年、ゴベルト（Ｇｏｂｅｒｔ）ＡＰら、２００４年、チヤツルヴェディ（Ｃｈａｔｕｒｖｅｄｉ）Ｒ．ら．２００４年、スー（Ｘｕ）Ｈ．ら、２００４年、ブシール（Ｂｕｓｓｉｅｒｅ）ＦＩら、２００５年、ゴベルト（Ｇｏｂｅｒｔ）ＡＰら、２００１年、２００２年、チェン（Ｃｈｅｎｇ）Ｙ．ら、２００５年）。結腸炎のマウスモデルは、別のアルギナーゼ−オルニチンデカルボキシレート（ＯＤＣ）経路が、結腸炎の改善における重要な役割を果たす、結腸におけるポリアミンの形成をもたらすことを発見するために使用されている（ゴベルト（Ｇｏｂｅｒｔ）ら、２００４年）。追加のアルギニンが投与された（別の経路に入るアルギニンの量を増大させる）ｉＮＯＳ欠乏マウス（高レベルのＮＯを作る酵素を欠く）または野生型マウスのいずれかが、シトロバクターローデンティウム、またはデキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）によって誘発される結腸炎の改善を示すことが証明されている。さらに、アルギニンを有するｉＮＯＳ欠乏マウスが結果として疾患の劇的な改善およびプロ炎症性サイトカイン産生の逆転をもたらした。対照的に、アルギナーゼまたはＯＤＣの阻害剤によるマウスの処置は結腸炎の劇的な悪化をもたらす。これらのデータは、ＮＯへのアルギニン代謝が問題を悪化させる疾患の部位でアルギニンの競合が認められるが、ポリアミンへのアルギニン代謝は疾患を改善することを示す。この指摘に基づき、ＮＯ産生の軽減および／またはポリアミン合成の増大をめざした治療法は、炎症性腸疾患に対する効果的な治療であるべきである。

Ｃ．ローデンティウム結腸炎： ２つの既存のマウスモデルのうち（ゴベルト（Ｇｏｂｅｒｔ）ＡＰら、２００４年、チェン（Ｃｈｅｎｇ）Ｙ．ら、２００３年）、ヒトＩＢＤと同様の組織学的変化を有するＴｈ１−支配的粘膜炎症をもたらすため、Ｃ．ローデンティウムモデルが選択された（ヒギンス（Ｈｉｇｇｉｎｓ）ＬＭら、１９９９年）。このモデルにおいて、マウスを、ヒトにおける下痢の原因である病原性大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）の齧歯類同等物であるグラム陰性病原性細菌である、Ｃ．ローデンティウム（ゴベルト（Ｇｏｅｂｅｒｔ）ＡＰら、２００４年）と強制経口投与によって感染させる。

アルギナーゼＩおよびｉＮＯＳの誘発。われわれが、結腸炎組織におけるアルギナーゼおよびｉＮＯＳ酵素の発現を試験したところ、われわれはアルギナーゼＩｍＲＮＡおよびタンパク質発現が大幅に増大したが、アルギナーゼＩＩは誘発されなかったことを見出した（図２８ＡおよびＢ）。これらのデータはリアルタイムＰＣＲによって確認されたが、ここでわれわれは、アルギナーゼＩの９．７±２．５倍の増加が見出されたが、アルギナーゼＩＩの増大は見出されなかった。ｉＮＯＳ ｍＲＮＡもＲＴ−ＰＣＲによって一貫して増大し（図２８Ａ）、これもリアルタイムＰＣＲによって確認された。免疫組織化学によって、われわれは、図２９Ｂ−Ｃ、および２９Ｈに示されている通り、感染マウスの結腸組織においてアルギナーゼＩに対する局所的に強い染色を見出した。染色は上皮細胞に存在した（図２９ＢおよびＣ）が、重篤な結腸炎における粘膜の全体を通じても見出され（図２９Ｈ）、浸潤炎症性細胞の染色を示した。同じ組織からの連続切片において、ｉＮＯＳは上皮、および固有層および粘膜下炎症性細胞に局在した（図２９Ｅ−Ｆ、および２９Ｉ）。染色は、アルギナーゼＩに対するＡｂを有する非感染組織（図２９Ａ）もしくはｉＮＯＳ（図２９Ｄ）またはイソタイプＩｇ対照でインキュベートされた感染組織（図２９Ｇ）において欠如していた。ｉＮＯＳ染色がｉＮＯＳ^−／−マウスからの組織において完全に欠如していた（データを示さず）。

われわれは、アルギナーゼ活性が感染マウス対対照マウスで２．４倍に増大したことを確認することができた（図３０Ａ）。ＮＯ濃度における有意な増大が、対照マウスと比べ感染マウスの血清において確認された（図３０Ｂ）。Ｌ−Ａｒｇ濃度の同時の顕著な減少が感染マウスの血清において確認された（図３０Ｃ）。これらのデータは、Ｃ．ローデンティウムモデルにおけるように、顕著な腸炎症の条件下に、全身アルギンのほぼ完全な枯渇が認められた。

ｉＮＯＳおよびアルギナーゼの対照的な役割：Ｌ−Ａｒｇ追加およびｉＮＯＳ欠失による臨床パラメータの改善
アルギナーゼＩおよびｉＮＯＳが両方とも結腸炎組織において多量に発現され、Ｌ−Ａｒｇは完全に代謝されたため、われわれは、飲料水中１％Ｌ−Ａｒｇの投与の効果を調査した。野生型（ＷＴ）マウスにおいて、Ｃ．ローデンティウム結腸炎は、感染後９日も開始した高レベルの死亡を誘発した（図３１Ａ）。Ｌ−Ａｒｇで処置したＷＴ動物において、死亡は、感染後１２および１４日にそれぞれ、水のみが与えられたマウスと比べ４２％および６２％阻害された（図３１Ａ）。Ｃｏｘ回帰分析によって、Ｌ−Ａｒｇで処置したＷＴマウスは、水のみが与えられたマウスと比べ死亡の３１％の危険のみを示した（ｐ＜０．０００９）。ｉＮＯＳ^−／−マウスにおいて、Ｌ−Ａｒｇの有無に関係なく、死亡は確認されなかった（図３１Ａ）。ＷＴマウスにおいて、Ｌ−Ａｒｇ処置は体重喪失を軽減し、Ｌ−Ａｒｇが与えられたｉＮＯＳ欠乏マウスはさらに改善を示し、実際に感染の存在下に体重を増加した（図３１Ｂ）。ここで留意すべきは、依然として生きている動物の体重のみが含まれたため、ＷＴマウスの体重喪失が過小評価であることである。結腸重量は、Ｃ．ローデンティウム感染ＷＴマウスでは２倍より多く大幅に増大し（図３１Ｃ）、ＷＴ−Ｌ−ＡｒｇおよびｉＮＯＳ^−／−マウスでは、それぞれ、２８％、および３８％減少した。ｉＮＯＳ欠失およびＬ−Ａｒｇ投与の追加の効果が認められ、結腸重量が６８％減少した。ｉＮＯＳ欠失でもＬ−Ａｒｇ処置でも非感染対照マウスにおける結腸重量に対する影響はなかった。重要なことに、これらの変化は結腸組織学における変化によって密接に対比された（図３２）。

結腸炎組織におけるプロ炎症性サイトカインの誘発はＬ−Ａｒｇ処置またはｉＮＯＳ欠乏によって弱化される。

Ｃ．ローデンティウム結腸炎はＴＨ１サイトカインＩＦＮ−γ、および関連プロ炎症性サイトカインＴＮＦ−α、およびＩＬ−１の活性化と強く関係があるため（３０、４６）、われわれは、われわれがこれらの免疫学的パラメータで確認した臨床と組織学的効果との関係の判定を求めた。リアルタイムＰＣＲ分析では、正常な組織と比べＣ．ローデンティウム結腸炎組織においてＩＦＮ−γ（図３３Ａ）、ＴＮＦ−α（図３３Ｂ）、およびＩＬ−１（図３３Ｃ）における有意な増大、およびｉＮＯＳ欠失またはＬ−Ａｒｇ処置のいずれかによるこれらの増大の有意な弱化が明らかにされた。

ＯＤＣ活性がＣ．ローデンティウム感染マウスの結腸において誘発される。

アルギナーゼの産物であるオルニチンは、ＯＤＣによって代謝され、ポリアミン（ｐｏｌｙａｍａｉｎｅｓ）を形成するため、われわれは、Ｃ．ローデンティウム感染ＷＴマウスの結腸におけるＯＤＣ発現を調査した。リアルタイムＰＣＲによって、われわれは、対照マウス（ｎ＝４、示さず）と比べ感染マウス（ｎ＝１３）におけるｍＲＮＡレベルの２．５±０．５倍の増大が見出された。しかし、ＯＤＣ活性の４０倍の増大は、感染ＷＴマウスまたはＬ−Ａｒｇで処置した感染ＷＴマウスのいずれかの結腸において測定された（図３４Ａ）。この増大は、Ｃ．ローデンティウムそのものからのＯＤＣ活性による可能性は低かったが、それはわれわれが、細菌性ＯＤＣ活性を測定し、組織中に全ＯＤＣ活性の１％以下を示すことを判明したためである。Ｃ．ローデンティウム感染ＷＴマウスにおける結腸ポリアミンの１．８±０．１倍の増大、Ｌ−Ａｒｇ処置により有意な、さらなる２．７±０．２倍の増大が認められ（図３４Ｂ）、アルギナーゼ活性がポリアミン合成の重要な決定因子であったことを示した。ポリアミンにおける適度の増大対ＯＤＣ活性における大幅な増大は、ポリアミンは迅速にアセチル化され、細胞からの流出および分泌をもたらすという事実を反映している可能性が最も高い（３１）。

アルギナーゼまたはＯＤＣ阻害によるＣ．ローデンティウム結腸炎の悪化
アルギナーゼおよびポリアミン形成の有利な効果をさらに明らかにするために、マウスに対し、アルギナーゼおよびＯＤＣの阻害剤である、Ｓ−（２−ボロノエチル）−Ｌ−システイン（ＢＥＣ）または−ジフロロメチルオリニチン（ＤＦＭＯ）をそれぞれ、飲料水中で与えた。非感染対照マウスにおいて、ＢＢＣまたはＤＦＭＯは効果を示さなかった（表Ｉ）。しかし、ＢＥＣまたはＤＦＭＯで処置したＣ．ローデンティウム感染マウスにおける有意な生存の喪失が認められた（表９）。実際に、実験は、感染後１０日に、この時点での死亡および重篤な疾患のため早期に終了されなければならなかった。Ｃ．ローデンティウム−ＢＥＣおよびＣ．ローデンティウム−ＤＦＭＯ群の結腸は、Ｃ．ローデンティウム−水群のものよりも重量および組織学的損傷の大幅な増大を示した（表９）。

水でのみ処置した感染ＷＴマウスと比較した場合、ＢＥＣおよびＤＦＭＯ処置マウスの結腸は顕著な貫壁性炎症およびムチン欠失を示した（ゴベルト（Ｇｏｂｅｒｔ）ＡＰら、２００４年）。ＢＥＣ処置マウスは実質的な粘膜下膿瘍形成を有し、ＤＦＭＯ処置マウスは粘膜および粘膜下出血を示したが、これらはいずれも重篤な急性炎症を示した。ＢＥＣがｉＮＯＳ^−／−Ｃ．ローデンティウム感染マウスに投与されると、結腸は増大し、ｉＮＯＳ^−／−のみと比べ、ＢＥＣは結腸組織学的損傷スコア（ｉＮＯＳ^−／−：２．４２±０．４６、ｎ＝１２、対ｉＮＯＳ^−／−＋ＢＥＣ：６．４４±０．９８、ｎ＝８、ｐ＜０．０１）および結腸重量（ｉＮＯＳ^−／−：総体重の０．３６±０．０１％対ｉＮＯＳ^−／−＋ＢＥＣ：０．９２±０．２０％、ｐ＜０．０５）の有意な悪化をもたらした。これらのデータはさらに、ｉＮＯＳ^−／−マウスを保護するＮＯ産生の予防のみではなく、むしろＬ−Ａｒｇのアルギナーゼ経路への短絡である証拠を提供する。

実施例１８．デキストラン硫酸ナトリウム（ＤＳＳ）結腸炎モデル
このモデルは、結腸炎のマウスモデルとして一般的に受け入られており、単にＤＳＳを飲料水に添加するだけのため、使用するのにきわめて実用的であるため選択された（モチュー（Ｍｏｔｅａｕ）Ｏら、２０００年、ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ＫＬら、２００１年、アンドレス（Ａｎｄｒｅｓ）ＰＧら、２０００年、マーラー（Ｍａｈｌｅｒ）Ｍ．ら、１９９８年、テッサー（Ｔｅｓｓｅｒ）ＴＧら、１９９８年）。初期実験では、われわれは、２．５％〜５％の文献（モチュー（Ｍｏｔｅａｕ）Ｏら、２０００年、ウィリアムズ（Ｗｉｌｌｉａｍｓ）ＫＬら、２００１年、アンドレス（Ａｎｄｒｅｓ）ＰＧら、２０００年、マーラー（Ｍａｈｌｅｒ）Ｍ．ら、１９９８年、テッサー（Ｔｅｓｓｅｒ）ＴＧら、１９９８年）からの報告された範囲でさまざまな用量を試験し、われわれが４％ＤＳＳで最も信頼できる反応を得たことがわかった。また、われわれは、十分に生存しているマウスが提供されれば、ＤＳＳを水中に６日間含め、次いでそれを除去すること、ＤＳＳが長い連続した日数の間、水中に放置された場合、死亡率は高くなりすぎるため、生存したものを容易に分析しうる方法を生存するマウスを十分に得られなかったことがわかった。

アルギナーゼＩ、ｉＮＯＳ、およびｉＮＯＳ結腸炎の誘発
確立され次第、われわれは、本モデルにおける１０日の時点でマウスにおけるアルギナーゼおよびｉＮＯＳ発現を評価した。図３５Ａに示されているように、Ｃ．ローデンティウムモデルにおけるように、アルギナーゼＩのアップレギュレーションが認められたが、アルギナーゼＩＩ ｍＲＮＡ発現については認められず、ｉＮＯＳレベルの増大が認められた。われわれは、ウェスタンブロット法（図３５Ｂ）および免疫組織化学（図３６）によってタンパク質レベルでのアルギナーゼＩ発現を確認した。

これらのデータと一致して、われわれは、リアルタイムＰＣＲによってアルギナーゼＩ ｍＲＮＡ、および結腸炎組織におけるアルギナーゼ酵素活性の平行の増大を検出した（データは示さず）。同様に、ＯＤＣ ｍＲＮＡおよび酵素活性における増大が認められた（データは示さず）。

アルギニン追加またはｉＮＯＳ欠失によるＤＳＳ結腸炎における改善
われわれのＣ．ローデンティウムモデルにおける上記の結果と一致して、さらにｉＮＯＳ欠失またはＬ−Ａｒｇ投与のいずれかによるＤＳＳモデルにおける結腸炎の臨床パラメータの軽減が認められ、Ｌ−ＡｒｇがｉＮＯＳ^−／−マウスに投与されると、さらに生存、体重、および結腸重量の改善が認められた（図３７）。これらのデータは、結腸組織病理の改善によって対比された（図３８）。

プロ炎症性サイトカインＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−α、およびＩＬ−１のレベルもＤＳＳ結腸炎組織において誘発され（図３９）、Ｃ．ローデンティウムモデルにおけるわれわれの所見と同様、レベルは結腸炎の軽減とともにマウスにおいて減少し、それらが疾患重篤度の有用なマーカーであることを示した。留意すべきは、ｉＮＯＳ^−／−マウスにおけるレベルはＬ−Ａｒｇ処置マウスにおけるほど軽減されなかったことであるが、これは図３７および３８における１０日の体重、結腸重量、および組織学の所見に対応する。総合すれば、これらの所見は、ＤＳＳモデルにおいて、アルギナーゼ経路により作用するアルギニン追加が有利であることを示す。

ポリアミンレベルはＬ−ＡｒｇおよびｉＮＯＳ欠失によって増大する
興味深いことに、ポリアミンレベルを評価したところ、臨床改善した群における一貫した増大が認められた（図４０）。Ｃ．ローデンティウムモデルにおけるように、Ｌ−Ａｒｇの添加はポリアミンレベルを増強した。しかし、Ｃ．ローデンティウムと対照的に、Ｌ−Ａｒｇを含まないＷＴマウスにおけるポリアミの増大は認められず、われわれは、これは、われわれがこれらの組織において確認した酵素スペルミンオキシダーゼおよびスペルミジン／スペルミンＮ^１−アセチルトランスフェラーゼ（ＳＳＡＴ）を代謝するポリアミンの誘発によるものであると推測する（データは示さず）。

結腸炎におけるアルギナーゼ−ＯＤＣ経路の重要性を裏づける追加のデータ
ＤＳＳモデルにおけるアルキナーゼの保護的役割と一致して、アルギナーゼ阻害剤ＢＥＣが投与されると、われわれは、ＷＴおよびｉＮＯＳ^−／−マウスにおける結腸炎の臨床および組織学的パラメータの悪化が確認された（データは示さず）。最後に、潰瘍性結腸炎およびクローン病からのヒトＩＢＤ組織において、われわれは、アルギナーゼＩおよびＯＤＣ ｍＲＮＡレベルの増大を確認した（図４）。マウスとは異なり、アルギナーゼＩＩにおける増大も認められ、ミトコンドリア酵素もこれらの組織において誘発される。

実施例１９アポＥ類似ペプチドはＣ．ローデンティウム刺激マクロファージにおけるｉＮＯＳを阻害する
試験を開始し、ＩＢＤのモデルに対するアポＥ類似ＣＯＧペプチドの考えうる関連性を検証するために、われわれは、それらをＣ．ローデンティウムで活性化したマウスＲＡＷ２６４．７マクロファージにおいて試験した。われわれは、細菌溶解物を使用し、固有層マクロファージが曝露される可能性ある細菌産物により密接に模倣する。実際に、われわれは、規則的に感染マウスにおける上皮下粘膜において細菌凝集体を確認した（図３２、高倍率像を参照）。

意外にも、われわれは、試験した両方のペプチド、すなわちＣＯＧ１４１０、およびＣＯＧ１３３のアンテナぺディア結合形態のＣＯＧ４５０２により、亜硫酸塩（ＮＯ_２ ^ー）レベルによって測定される通り、マクロファージ上清中にＮＯ産生の阻害が認められた（図４２）。ＣＯＧ１４１０については、細胞毒性が５μＭ以上の濃度で確認され、そこで２μＭでのデータのみが示されており、ＣＯＧ４５０２については、毒性がＸＴＴ細胞生存アッセイによって１０μＭで確認され、そこで毒性が生じない０．１−５μＭ範囲でのデータが示されている。また、ｍＲＮＡレベルをＣＯＧ４５０２処置で評価した場合、ｉＮＯＳ ｍＲＮＡ発現の有意な濃度依存阻害が認められた。

７． 引用文献
ここで引用された全ての文献および特許（以下のものを含むがこれらの限定されない）は、参照によりその全体が本明細書で援用される。

Alberts, et al., 1995, ApoE genotype and survival from intracerebral haemorrhage, Lancet 346: 575.
Alberts, et al., 1996, Stroke 27:183 (abstract).
Amador, et al., 1963,Serum lactate dehydrogenase activity: an analytical assessment of current assays, Clin. Chem. 9: 391-4.
Aono M., Lee Y., Grant, E.R., Zivin, R.A., Pearlstein, R.D., Warner, D.S., Bennett, E.R., and Laskowitz, D.T. (2002). Apolipoprotein E protects against NMDA excitotoxicity. Neurobiol. Dis. 11: 214-20.
Aono, M., Bennett, E.R., Kim, K.S., Lynch, J.R., Myers, J., Pearlstein, R.D., Warner, D.S., and Laskowitz, D.T. (2003). Protective effect of apolipoprotein E-mimetic peptides on N-methyl-D-aspartate excitotoxicity in primary rat neuronal-glial cell cultures. Neuroscience, 116: 437-45.
Asoh, S., Ohsawa, I., Mori, T., Katsura, K., Hiraide, T., Katayama, Y., Kimura, M., Ozaki, D., Yamagata, K., and Ohta, S (2002) Protection against ischemic brain injury by protein therapeutics. PNAS 99: 17107-17112.
Avila, et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:5900.
Bacq, Z. M. 1965. Chemical protection against ionizing radiation, Charles C Thomas, Springfield, IL.
Balaram and Gurunath., 1994, Incorporation of a potentially helix breaking D-Phe-Pro sequence into the center of a right handed 16 residue peptide helix, Biochem. Biophys. Res. Commun., 202(1), 241.
Baraboi, V. A., Beloshiskii, P. V., Krasiuk, A. N. and Korkach, V. I. 1994. Oxygen dependent processes in the irradiated organisms. Fiziol. Zh. 40: 116−128.
Bart, et al., 1998, Regional cerebral blood flow in apolipoprotein E deficient mice and wildtype mice during focal cerebral ischemia, NeuroReport. 9: 2615-2620.
Bellosta, et al., 1995, Stable expression and secretion of apolipoproteins E3 and E4 in mouse neuroblastoma cells produces differential effects on neurite outgrowth, J. Biol. Chem. 270: 27063-27071.
Ben-Nathan D, Padgett DA, Loria RM. 1999. Androstenediol and dehydroepiandrosterone protect mice against lethal bacterial infections and lipopolysaccharide toxicity. J Med Microbiol. 1999 May;48(5):425-31.
Benveniste EN, 1997, Role of macrophages/microglia in multiple sclerosis and experimental allergic encephalomyelitis, J Mol Med. 75(3):165-73.
Bolin, et al., 2000, Peptide and peptide mimetic inhibitors of antigen presentation by HLA- DR class II MHC molecules. Design, structure-activity relationships, and X-ray crystal structures, J. Med. Chem. 43, 2135-48.
Bacskai, et al., 2000, The endocytic receptor protein LRP also mediates neuronal calcium signaling via N-methyl-D-aspartate receptors. Proc. Natl. Acad. Sci. 97:11551-11556.
Barger and Harmon, 1997, Nature 388:878.
Bart, et al., 1998, Regional cerebral blood flow in apolipoprotein E deficient vs wildtype mice undergoing middle cerebral artery occlusion. Neuroreport 11:2615-2620.
Bell, et al., 1994, Upregulation of the macrophage scavenger receptor in response to different forms of injury in the CNS, J. Neurocytol. 23(10):605-13.
Berliner, et al., 1995, Circulation 91:2488.
Bi, et al., 2002, Uptake and pathogenic effects of amyloid beta peptide 1-42 are enhanced by integrin antagonists and blocked by NMDA receptor antagonists, Neuroscience 112(4):827-40.
Bi, et al., 2002, N-methyl-D-aspartate receptor subunit NR2A and NR2B messenger RNA levels are altered in the hippocampus and entorhinal cortex in Alzheimer's disease, J. Neurol. Sci. 200(1-2):11-8.
Biakov, V. M. and Stepanov, S.V. 1997. Mechanism of primary radiobiologic action. Radiat. Biol. Radioecol. 37: 469−474.
Bocchini, V. R., Mazzolla, R., Barluzzi, E., Blasi, P., Sick, and H. Kettenmann (1992) An immortalized cell line expresses properties of activated microglial cells. J. Neurosci. Res. 31: 616−621.
Bogoyevitch, M. A., Kendrick, T.S., Ng, D.C.H. and Barr, R.K. (2002) Taking the cell by stealth or storm? Protein transduction domains (PTDs) as versatile vectors for delivery. DNA and Cell Biology 21: 879-894
Bolton, S.J., Jones, D.N.C., Darker, J.G., Eggleston, D.S., Hunter, J.,and Walsh, F.S. (2000) Cellular uptake and spread of the cell-permeable peptide penetratin in adult rat brain. European Journal of Neuroscience 12: 2847-2855.
Brain Injury Association of America (2002) Brain Injury Fact Sheet. http://www.biausa.org/word.files.to.pdf/good.pdfs/2002FactSheetBrainInjury.pdf
Breitner, et al.,1995, Neurobiol. Aging 16:523.
Broderick, et al., 2001, Apolipoprotein E phenotype and the efficacy of intravenous tissue plasminogen activator in acute ischemic stroke, Ann. Neurol. 49:736-744.
Centers for Disease Control and Prevention. Traumatic brain injury in the United States. Unpublished data from the National Center for Injury Prevention and Control, May 1998.
Cao, G., W. Pei, H., Ge, Q., Liang, Y., Luo, F. R., Sharp, A., Lu, R., Ran, S. H., Graham, and Chen, J. (2002) In vivo delivery of a Bcl-xL fusion protein containing the TAT protein transduction domain protects against Ischemic Brain Injury and Neuronal Apoptosis. Society of Neuroscience 22: 5423-5431.
Cady, 2001, Understanding opioid tolerance in cancer pain, Oncol. Nurs. Forum 28(10):1561-8.
Calabresi, 2002, Considerations in the treatment of relapsing-remitting multiple sclerosis, Neurology 58(8 Suppl 4):S10-22.
Centers for Disease Control and Prevention. Report to Congress on Mild Traumatic Brain Injury in the United States: Steps to Prevent a Serious Public Health Problem, September 2003.
Chapman, et al., 1999, Preliminary observations on APOE epsilon 4 allele and progression of disability in multiple sclerosis, Arch. Neurol. 56:1484-1487.
Chapman J, Vinokurov S, Achiron A, Karussis DM, Mitosek-Szewczyk K, Birnbaum M, Michaelson DM, Korczyn AD, 2001, APOE genotype is a major predictor of long-term progression of disability in MS, Neurology. 56(3):312-6.
Chen, et al., 1997, Motor and cognitive deficits in apolipoprotein-E deficient mice after closed head injury, Neuroscience 80: 1255-1262.
Chen, et al., 2002, N-acyl-L-phenylalanine derivatives as potent VLA-4 antagonists that mimic a cyclic peptide conformation, Bioorg. Med. Chem. Lett. 12, 137-40.
Chesnut, et al., Rehabilitation for traumatic brain injury. Evidence report no. 2 (Contract 290-97-0018 to Oregon Health Sciences University). Rockville, MD: Agency for Health Care Policy and Research. February 1999.
Chensue et al.,1991, Am. J. Pathol. 138:395-402.
Chiang CS, Hong JH, Stalder A, Sun JR, Withers HR, McBride WH. 1997. Delayed molecular responses to brain irradiation. Int J Radiat Biol. 1997 Jul;72(1):45-53.
Coleman N, Bump E, Kramer R: Chemical modifiers of cancer treatment. 1988. J Clin Oncol 6:709-733.
Clifford, 2002, AIDS dementia, Med. Clin. North Am. 86(3):537-50, vi.
Cohen, et al., 1992, Interaction of lactoferrin and lipopolysaccharide (LPS): effects on the antioxidant property of lactoferrin and the ability of LPS to prime human neutrophils for enhanced superoxide formation, J. Infect. Dis. 166:1375-1378.
Connolly, et al., 1996, Stroke 27:174 (abstract).
Clodi, and Younes, 1997, Reed-Sternberg cells and the TNF family of receptors/ligands, Leuk. Lymphoma 27: 195-205.
Colton, C.A., Brown, C.M., Cook, D., Needham, L.K., Xu, Q., Czapiga, M., Saunders, A.M., Schmechel, D.E., Rasheed, K., and Vitek, M.P. (2002). APOE and the regulation of microglial nitric oxide production: a link between genetic risk and oxidative stress. Neurobiology of Aging 23:777-85.
Console, S., Marty, C., Garcia-Echeverria, C., Schwendener, R. and Ballmer-Hofer, R. (2003) Antennapedia and HIV TAT ‘protein transduction domains’ promote endocytosis of high Mr cargo upon binding to cell surface glycosaminoglycans. J Biol Chem, in press.
Corder, et al., 1993, Gene doses of apolipoprotein E type 4 allele and the risk of Alzheimer's disease in late onset families, Science 261: 921-923.
Crawford FC, Vanderploeg RD, Freeman MJ, Singh S, Waisman M, Michaels L, Abdullah L, Warden D, Lipsky R, Salazar A, Mullan MJ, 2002, APOE genotype influences acquisition and recall following traumatic brain injury. Neurology 58(7):1115-8.
Crawley, 2000, What’s wrong with my mouse: Behavioral phenotyping of transgneic and knockout mice. (John Wiley and Sons, New York).
Dail, et al., 1981, Responses to cortical injury: II. Widespread depression of the activity of an enzyme in cortex remote from a focal injury, Brain Res. 211:79−89.
Denicourt, C., and Dowdy, S.F. (2003). Protein transduction technology offers novel therapeutic approach for brain ischemia. Trends in Pharmacological Sciences 24: 216-218.
Dietz, G.P.H, Kilic, E., and Bahr, M. (2002) Inhibition of neuronal apoptosis in vitro and in vivo Using TAT-mediated protein transduction. Molecular and Cellular Neuroscience 21: 29-37.
de Bont N, Netea MG, Demacker PN, Verschueren I, Kullberg BJ, van Dijk KW, van der Meer JW, Stalenhoef AF. 1999. Apolipoprotein E knock-out mice are highly susceptible to endotoxemia and Klebsiella pneumoniae infection. J Lipid Res. 1999 Apr;40(4):680-5.
DiScala, et al., 1997, Children hospitalized for traumatic brain injury: transition to postacute care, J. Head Trauma Rehabil. 12(2):1-10.
Doig, 2002, Recent Advances in helix-coil theory, Biophys. Chem., 101-102, 281.
Doig, et al., 1994, Determination of free energies of N-capping in alpha helices by modification of the Lifson-Roig helix-coil theory to include N- and C- capping, Biochemistry 33(11), 3396.
Doig and Baldwin, 1993, N- and C- capping preferences for all 20 amino acids in alpha-helical peptides, Protein Sci., 4(7), 1325.
Dhib-Jalbut, 2002, Mechanisms of action of interferons and glatiramer acetate in multiple sclerosis, Neurology 58(8 Suppl 4):S3-9.
Doble, 1999, The role of excitotoxicity in neurodegenerative disease: implications for therapy, Pharmacol. Ther. 81(3):163-221.
Drin, G..S., Cottin, E. Blanc, A.R., Rees, and Temsamani.J. (2003) Studies on the internalization mechanism of cationic cell-penetrating peptides. The Journal of Biological Chemistry. In press.
Dragaric, I. G. and Dragaric, Z. D.1971. The radiation chemistry of water. pp. 256, Academic Press, New York.
Dunlop, et al., 1997, HIV dementia and apolipoprotein E, Acta Neurol. Scand. 95(5):315-8.
Dyer, et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:15009.
Ernst, et al., 2002, Design of a protein surface antagonist based on alpha-helix mimicry: inhibition of gp41 assembly and viral fusion, Angew Chem. Int. Ed. Engl. 41, 278-81.
Edgington and Curtiss, 1981, Cancer Res. 41:3786.
Eng LF, Ghirnikar RS, Lee YL, 1996, Inflammation in EAE: role of chemokine/cytokine expression by resident and infiltrating cells, Neurochem Res. 21(4):511-25.
Fazekas F, Strasser-Fuchs S, Kollegger H, Berger T, Kristoferitsch W, Schmidt H, Enzinger C, Schiefermeier M, Schwarz C, Kornek B, Reindl M, Huber K, Grass R, Wimmer G, Vass K, Pfeiffer KH, Hartung HP, Schmidt R, 2001, Apolipoprotein E epsilon 4 is associated with rapid progression of multiple sclerosis, Neurology, 57(5):853-7.
Feinstein DL, Galea E, Gavrilyuk V, Brosnan CF, Whitacre CC, Dumitrescu-Ozimek L, Landreth GE, Pershadsingh HA, Weinberg G, Heneka MT, 2002, Peroxisome proliferator-activated receptor-gamma agonists prevent experimental autoimmune encephalomyelitis, Ann Neurol. 51(6):694-702.
Feeney, et al., 1981, Responses to cortical injury: I. Methodology and local effects of contusions in the rat, Brain Res. 211:67−77.
Fisher, P. M., E. Krausz., D. P. Lane. 2001. Cellular delivery of impermeable effector molecules in the form of conjugates with peptides capable of mediating membrane translocation. Bioconjugate Chemistry 12: 825-841.
Fike JR, Cann CE, Turowski K, Higgins RJ, Chan AS, Phillips TL, Davis RL. 1988. Radiation dose response of normal brain. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1988 Jan;14(1):63-70.
Flegel WA, Baumstark MW, Weinstock C, Berg A, Northoff H. 1993. Prevention of endotoxin-induced monokine release by human low- and high-density lipoproteins and by apolipoprotein A-I. Infect Immun. 1993 Dec;61(12):5140-6.
Fleming, et al., 1996, Differential binding of apolipoprotein E isoforms to tau and other cytoskeletal proteins, Exp. Neurol. 138: 252-260.
Friedman, et al., 1999, Apolipoprotein E-epsilon 4 genotype predicts a poor outcome in survivors of traumatic brain injury, Neurology 52: 244-248.
Fotouhi, et al., 2000, The design and synthesis of potent cyclic peptide VCAM-VLA-4 antagonists incorporating an achiral Asp-Pro mimetic, Bioorg. Med. Chem. Lett. 10, 1171-3.
Futaki, S. (2002) Arginine-rich peptides: potential for intracellular delivery of macromolecules and the mystery of the translocation mechanisms. International Journal of Pharmaceutics 245: 1-7.
Farber, et al., 2002, Antiepileptic drugs and agents that inhibit voltage-gated sodium channels prevent NMDA antagonist neurotoxicity, Mol. Psychiatry 7(7):726-33.
Fazio, et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. 94:4647.
Flaherty, et al., 1999, Regulation of tau phosphorylation in microtubule fractions by apolipoprotein E, J. Neurosci. Res. 56(3):271-4.
Garcia-Echeverria, C., Jiang, L., Ramsey, T.M., Sharma, S.K., and Chen, Y.−N. P. (2001) A new Antennapedia-derived vector for intracellular delivery of exogenous compounds. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 11: 1363-1366.
Garcia-Echeverria, C., and Ruetz, S. (2003) β-Homolysine oligomers: a new class of Trojan carriers. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 13: 247-251.
Gaffin SL, Wells M, Jordan JP. 1985. Anti-lipopolysaccharide toxin therapy for whole body X-irradiation overdose. Br J Radiol. 1985 Sep;58(693):881-4.
Girinsky TA, M Pallardy, E Comoy, T Benassi, R Roger, G Ganem, JM Cosset, G Socie, and H Magdelenat. 1994. Peripheral blood corticotropin-releasing factor, adrenocorticotropic hormone and cytokine (interleukin beta, interleukin 6, tumor necrosis factor alpha) levels after high- and low-dose total-body irradiation in humans. Radiat Res. 139:360-363.
Gallo, et al., 1994, Potential role of apolipoprotein-E in fibrillogenesis. Am. J. Pathol. 145: 526-530.
Gotschall, et al., 1995, Comparison of three measures of injury severity in children with traumatic brain injury, J. Neurotrauma 12,611−619.
Grubbs, et al., 2001, Ring-closing metathesis of olefinic peptides: Design, Synthesis, and Structural characterization of macrocyclic helical peptides, J. Org. Chem., 66, 5291.
Gutman, et al., 1997, Apolipoprotein E binds to and potentiates the biological activity of ciliary neurotrophic factor. J. Neurosci. 17: 6114-6121.
Gehrmenn, et al., 1995, Microglia: intrinsic immuneffector cell of the brain, Brain Res. Brain Res. Rev. 20(3):269-87.
Giulian, et al., 1996, J. Neuroscience, 16:3139.
Griffin, et al., 1995, J. Neuropath. Exp. Neurol. 54:276.
Grubbs R.H., Blackwell H.E., Sadowsky J.D., Howard R.J., Sampson J.N., Chao J.A., Steinmetz W.E., and O'Leary D.J., 2001, " Ring-closing metathesis of olefinic peptides: Design, Synthesis, and Structural characterization of macrocyclic helical peptides", J.Org.Chem., 66, 5291.
Hall, EJ. 2000. Radiobiology for the Radiologist. Lippincott Williams and Wilkins, 5th edition, p. 138.
Hamm, et al., 1994, The Rotarod Test: An Evaluation Of Its Effectiveness In Assessing Motor Deficits Following Traumatic Brain Injury, J. Neurotrauma 11, 187-196.
Hamilton, et al., 2003, Design and application of an alpha helix mimetic scaffold based on an Oligoamide-foldamer strategy: Antagonism of the Bak BH3/Bcl-xL complex, Angew. Chem. Int. Ed., 42(5),535.
Hamilton, et al., 2002, Design of a protein surface antagonist based on alpha-helix mimicry: Inhibition of gp41 assembly and viral fusion, Angew. Chem. Int. Ed., 41(2), 278.
Hamilton, et al., 2001, Towards proteomimetics: terphenyl derivatives as structural and functional mimics of extended regions of an alpha helix, J. Amer. Chem. Soc., 123, 5382.
Hayek, et al., 1994, Increased plasma and lipoprotein lipid peroxidation in apo E-deficient mice, Biochem. Biophys. Res. Commun. 201: 1567-1574.
Heber-Katz E, 1993, The ups and downs of EAE, Int Rev Immunol. 9(4):277-85. Hemmer B, Archelos JJ, Hartung HP, 2002, New concepts in the immunopathogenesis of multiple sclerosis, Nat Rev Neurosci. 3(4):291-301.
Hill GR, Crawford JM, Cooke KR, Brinson YS, Pan L, Ferrara JL. 1997. Total body irradiation and acute graft-versus-host disease: the role of gastrointestinal damage and inflammatory cytokines. Blood. 1997 Oct 15;90(8):3204-13.
Hill RP, H-P Rodemann, JH Hendry, SA Roberts, and M. S. Anscher. 2001. Normal tissue radiobiology: From the laboratory to the clinic. Int. J. Radiation Oncology Biol. Phys., 49:353−365.
Hong JH, Chiang CS, Campbell IL, Sun JR, Withers HR, McBride WH. 1995. Induction of acute phase gene expression by brain irradiation. Int J Radiat Oncol Biol Phys. 1995 Oct 15;33(3):619-26.
Hirschmann, et al.,1996, Synthesis of Potent Cyclic Hexapeptide NK-1 Antagonists. Use of a Minilibrary in Transforming a Peptidal Somatostatin Receptor Ligand into an NK-1 Receptor Ligand via a Polyvalent Peptidomimetic, J. Med. Chem., 39, 2441-2448.
Holtzman, et al., 1995, Low density lipoprotein receptor-related protein mediates apolipoprotein E-dependent neurite outgrowth in a central nervous system-derived neuronal cell line, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 92: 9480-9484.
Horsburgh, et al., 1999, Increased neuronal damage in apolipoprotein E-deficient mice following global ischaemia, Neuroreport 10: 837-841.
Horsburgh, et al., 2000, Intraventricular infusion of apolipoprotein E ameliorates acute neuronal damage after global cerebral ischemia in mice, J. Cerebral Blood Flow Metab. 20:458-462.
Horsburgh, et al., 1999, Increased neuronal damage in apolipoprotein E-deficient mice following global ischaemia, Neuroreport 10: 837-841.
Hansson,1994, Basic Res. Cardiol., 89(1):41.
Harris, et al., 1998, Hepatol. 27:1341-48.
Harris, et al., 1993, J. Clin. Invest. 91:1028-34.
Harris HW, Grunfeld C, Feingold KR, Rapp JH. 1990. Human very low density lipoproteins and chylomicrons can protect against endotoxin-induced death in mice. J Clin Invest. 1990 Sep;86(3):696-702.
Haughey, et al., 2001, HIV-1 Tat through phosphorylation of NMDA receptors potentiates glutamate excitotoxicity, J. Neurochem. 78(3):457-67.
Henderson, et al., 1996, Microbiol. Rev. 60:316-34.
Holtzman et al., Low density lipoprotein receptor-related protein mediates apolipoprotein E-dependent neurite outgrowth in a central nervous system-derived neuronal cell line. Proc. Natl. Acad. Sci. 92:9480-9484 (1995).
Hensley, ML., LM Schuchter, C Lindley, NL Meropol, GI Cohen, G Broder, WJ Gradishar, DM Green, RJ Langdon, RB Mitchell, R Negrin, TP Szatrowski, JT Thigpen, D Von Hoff, TH Wasserman, EP Winer, DG Pfister for the American Society of Clinical Oncology. 1999. American Society of Clinical Oncology Clinical Practice Guidelines for the Use of Chemotherapy and Radiotherapy Protectants., J Clin. Oncol. 17: 3333-3355.
Higuchi, Y, GA Nelson, M Vazquez, DT Laskowitz, JM Slater, and RD Pearlstein. 2002. Apolipoprotein E expression and behavioral toxicity of high charge, high energy (HZE) particle radiation. J. Radiat. Res. 43:S219-S224/
Huang, et al., 2001, Apolipoprotein E fragments present in Alzheimer’s Disease brains induce neurofibrillary tangle-like intracellular inclusions in neurons, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11183-11186.
Huettinger, et al., 1988, Characteristics of chylomicron remnant uptake into rat liver, Clin. Biochem. 21(2):87-92.
Innerarity, et al., 1979, J. Biol. Chem. 254:4186-4190.
Innerarity, et al., 1983, The receptor-binding domain of human apolipoprotein E: binding of apolipoprotein E fragments, J. Biol. Chem. 258:12341-47.
Jordan, et al., 1997, Apolipoprotein E epsilon-4 associated with chronic traumatic brain injury in boxing, J.Am. Med. Assoc. 278: 136-140.
Jones, et al., 2002, Attenuation of acute morphine withdrawal in the neonatal rat by the competitive NMDA receptor antagonist LY2359592002, Neuropsychopharmacology 26(3):301-10.
Jordan et al., 1998, Isoform-specific effect of apolipoprotein E on cell survival and beta-amyloid-induced toxicity in rat hippocampal pyramidal neuronal cultures, J. Neurosci. 18:195-204.
Joseph, JA, S Erat, and BM Rabin. 1998. CNS effects of heavy particle irradiation in space: behavioral implications. Adv. Space Res. 22: 209-216.
Karle, 2001, Controls exerted by the Aib residue: Helix formation and Helix reversal, Biopolymers, 60(5),351.
Karle and Balaram, 1990, Structural characteristics of alpha helical peptide molecules containing Aib residues, Biochemistry, 29(29), 6747.
Kilic, U., Kilic, E., Dietz, G.P.H., and Bahr, M. (2003) Intravenous TAT-GDNF is protective after focal cerebral ischemia in mice. Stroke 34: 1304-1310.
Knouff, et al., 1999, ApoE structure determines VLDL clearance and atherosclerosis risk in mice, J. Clin. Invest. 103: 1579-86.
Kraus, et al., 1990, Brain injuries among infants, children, adolescents and young adults, AJDC 144, 684−691.
Kim, et al., 1996, Human apolipoprotein E receptor 2, J. Biol Chem. 271, 8373-8380.
Klopman and Sedykh, 2002, An MCASE approach to the search of a cure for Parkinson's Disease, BMC Pharmacol. 2(1):8.
Kolker, et al., 2002, NMDA receptor activation and respiratory chain complex V inhibition contribute to neurodegeneration in d-2-hydroxyglutaric aciduria, Eur. J. Neurosci. 16(1):21-8.
Koppelhus, U., Awasthi, S.K., Zachar, V., Holst H.U., Ebbsen, P., Nielson, P.E. (2002) Cell-dependent differential cellular uptake of PNA, peptides, and PNA-peptide conjugates. Antisense Nucleic Acid Drug Dev 12: 51-63.
Kotlinska, 2001, NMDA antagonists inhibit the development of ethanol dependence in rats, Pol. J. Pharmacol. 53(1):47-50.
Krieger and Herz, 1994, Structures and functions of multiligand lipoprotein receptors: macrophage scavenger receptors and LDL receptor-related protein (LRP), Ann. Rev.Biochem. 63:601-37.
Kudo, et al., 2001, Absence of direct antioxidant effects from volatile anesthetics in mixed neuronal-glial culture, Anesthesiology 94:303-312.
Laskowitz, et al., 2000, Altered immune responses in apolipoprotein E deficient mice. J. Lipid Res. 41: 613-620.
Laskowitz, et al., 1998b, Apolipoprotein E and the CNS response to injury, J. Cerebral Blood Flow Metab. 18:465-471.
Laskowitz and Roses, 1998a, Apolipoprotein E: an expanding role in the neurobiology of disease, Alzheimer’s Reports 1: 5-12.
Laskowitz, et al., 2001, Downregulation of microglia activation by apolipoprotein-E and apoE-mimetic peptides, Expt. Neurol. 167: 74-85.
Laskowitz, et al., 1997a, Apolipoprotein E deficient mice have increased susceptibility to focal cerebral ischemia, J. Cereb. Blood Flow Metab. 17: 753-758.
Laskowitz, et al., 1997c, Endogenous apolipoprotein E suppresses LPS-stimulated microglial nitric-oxide production, Neuroreport 9: 615-618.
Laskowitz, et al., 1997b, Apolipoprotein E suppresses glial cell secretion of TNFα. J.Neuroimmunology 76: 70-74.
Liefert, J.A., and Whitton, J.L. (2003) “Translocatory proteins” and “protein transduction domains”: a critical analysis of their biological effects and the underlying mechanisms. Molecular Therapy 8: 13-19.
Lindsay, M.A. (2002). Peptide-mediated cell delivery: application in protein target validation. Current Opinions in Pharmacology 2: 587-594.
Lo, E.H., Singhal, A.B., Torchlin, V.P., and Abbott, N.J. (2001) Drug delivery to damaged brain. Brain Research Reviews 38: 140-148.
Lomnitski, L., Chapman, S., Hochman, A., Kohen, R., Shohami, E., Chen, Y., Trembovler, V., and Michaelson, D.M. (1999). Antioxidant mechanisms in apolipoprotein E deficient mice prior to and following closed head injury. Biochim Biophys Acta, 1453: 359-68.
Lendon et al., No effect of apolipoprotein E on neuronal cell death due to excitotoxic and apoptotic agents in vitro and neonatal hypoxic ischaemia in vivo, Euro. J. Neurosci. 12:2235-2242 (2000).
Lighthall, 1988, Controlled cortical impact: a new experimental brain injury model. J. Neurotrauma 5:1−15.
Linton et al., Phenotypes of apolipoprotein B and apolipoprotein E after liver transplantation, J. Clin. Invest. 270-81 (1991).
Linton et al., Science, 267:1034 (1995).
Linton, et al., 1997, Phenotypes of apolipoprotein B and apolipoprotein E after liver transplantation. J. Clin. Invest., 270-281.
Liu, et al., 2000, Synthesis of a Substance P Antagonist with a Somatostatin Scaffold: Factors Affecting Agonism/Antagonism at GPCRs and the Role of Pseudosymmetry, J. Med. Chem., 43, 3827-3831.
Lucotte GL; French MS Consortium, 2002, Confirmation of a gene for multiple sclerosis (MS) to chromosome region 19q13.3, Genet Couns. 13(2):133-8.
Lynch, et al., 2001a, Apolipoprotein E mimetic peptide is neuroprotective in a murine head injury model, Soc. Neuroscience Abstracts.
Lynch, et al., 2001b, Apolipoprotein E modulates glial activation and the endogenous central nervous system inflammatory response, J. Neuroimmunology 114: 107-113.
Lynch, et al., 2002, Apolipoprotein E affects the Central Nervous System Resonse to Injury and the Development of Cerebral Edema, Ann. Neurol. 51: 113-7.
Lynch, Tang, et al., 2003, ApoE genotype and an apoE-mimetic peptide modify the systemic and CNS inflammatory response, J. Biol. Chem, epub ahead of print.
Lalazar, et al., 1998, Site-specific mutagenesis of human apolipoprotein E. Receptor binding activity of variants with single amino acid substitutions, J. Biol. Chem. 263:3542-3545.
Le and Lipton, 2001, Potential and current use of N-methyl-D-aspartate (NMDA) receptor antagonists in diseases of aging, Drugs Aging 18(10):717-24.
Lendon, et al., 2000, No effect of apolipoprotein E on neuronal cell death due to excitotoxic and apoptotic agents in vitro and neonatal hypoxic ischaemia in vivo, Euro. J. Neurosci. 12:2235-2242.
Linton, et al., 1995, Science, 267:1034.
Lynn, W. A., and J. Cohen. 1995. Adjunctive therapy for septic shock: a review of experimental approaches. Clin. Infect. Dis. 20: 143−158.
Lovestone, et al., 2001, Apolipoprotein E gene and Alzheimer's disease: is tau the link? Biochem. Soc. Symp. (67):111-20.
Lundberg, M and Johansson (2002). Positively charged DNA-binding proteins cause apparent cell membrane translocation. Biochem, Viophys Res Comm291; 367-371.
Mai, J.C., Shen, H., Watkins, S.C., Cheng, T., and Robbins, P.D. (2002). Efficiency of protein transduction is cell type-dependent and is enhanced by dextran sulfate. The Journal of Biological Chemistry 277: 30208-30218.
Mandell LR, Steinherz P, Fuks Z. 1990. Delayed central nervous system (CNS) radiation in childhood CNS acute lymphoblastic leukemia. Results of a pilot trial. Cancer. 1990 Aug 1;66(3):447-50.
Masterman T, Zhang Z, Hellgren D, Salter H, Anvret M, Lilius L, Lannfelt L, Hillert J, 2002, APOE genotypes and disease severity in multiple sclerosis, Mult Scler. 8(2):98-103.
Matthews and Beal, 1996, Increased 3-nitrotyrosine in brains of Apo E-deficient mice, Brain Res. 718: 181-184.
McArron, et al., 1998, The apolipoprotein E epsilon4 allele and outcome in cerebrovascular disease,. Stroke 29, 1882-1887.
Misra, et al., 2001, Apolipoprotein E and mimetic peptide initiate a calcium-dependent signaling response in macrophages, J.Leukocyte Biol. 70: 677-683.
Mitchell and Smith, 2003, D-amino acid residues in peptide and proteins, Proteins 50(4), 563.
Miyata and Smith, 1996, Apolipoprotein E allele-specific antioxidant activity and effects on cytotoxicity by oxidative insults and beta-amyloid peptides, Nat. Genet. 14: 55-61.
Morris, 1984, Developments of a water maze procedure for studying spatial learning in the rat, J. Neurosci. Methods 11: 47-60.
Mossman KL. Frequent short-term oral complications of head and neck radiotherapy. 1994. Ear Nose Throat J. 73:316-320.
Muller, et al., 1998, Apolipoprotein E isoforms increase intracellular Ca2+ differentially through a omega-agatoxin IVa-sensitive Ca2+-channel, Brain Pathology 8: 641-653.
Matsubara, et al., 2002, Monoclonal antibodies against inflammatory mediators for the treatment of patients with sepsis, Nippon Rinsho 60(3):578-84.
Mayeux, et al.,1995, Neurology 45:555.
McArron et al., The apolipoprotein E epsilon4 allele and outcome in cerebrovascular disease. Stroke 29:1882-1887 (1998).
McGeer, et al., 1993, Glia 7:88.
McKenna and Melzack, 2001, Blocking NMDA receptors in the hippocampal dentate gyrus with AP5 produces analgesia in the formalin pain test, Exp. Neurol. 172(1):92-9.
Meldrum, et al., 1990, Excitatory amino acid neurotoxicity and neurodegenerative disease, Trends Pharmacol. Sci. 11:379-387.
Misra, et al.1994, The relationship between low density lipoprotein-related protein/alpha 2-macroglobulin (alpha 2M) receptors and the newly described alpha 2M signaling receptor, J. Biol. Chem. 269(28):18303-6.
Miyazawa, et al., 1991, Lactoferrin-lipopolysaccharide interactions. Effect of lactoferrin binding to monocyte/macrophage-differentiated HL-60 cells, J. Immunol. 146:723-729.
Moulder, et al. 1999, Analysis of a novel mechanism of neuronal toxicity produced by an apolipoprotein E-derived peptide. J. Neurochem. 72:1069-1080.
Myers, et al., 1997, Helix propensities are identical in proteins and peptides. Biochemistry 36:10923-10929.
Mytilineou, et al., 1997, L-deprenyl protects mesencephalic dopamine neurons from glutamate receptor-mediated toxicity in vitro, J. Neurochem. 68(1):33-9.
Nair CK, DK Parida, and TJ Nomura. 2001. Radioprotectors in radiotherapy. Radiat Res (Tokyo). 42(1):21-37.
Netea MG, de Bont N, Demacker PN, Kullberg BJ, Jacobs LE, Verver-Jansen TJ, Stalenhoef AF, Van der Meer JW. 1998. Lipoprotein(a) inhibits lipopolysaccharide-induced tumor necrosis factor alpha production by human mononuclear cells. Infect Immun. 1998 May;66(5):2365-7.
NIAID Whte Paper, NIAID Expert Panel Review on Radiobiological Research, 26 Feb 2003.
Nathan, et al., 1994, Differential effects of apolipoproteins E3 and E4 on neuronal growth in vitro, Science 264: 850-852.
NIH Consensus Statement: Rehabilitation of Persons with Traumatic Brain Injury, 1998.
NIH (1999) Report of the Consensus Development Conference on the REHABILITATION OF PERSONS WITH TRAUMATIC BRAIN INJURY http://www.nichd.nih.gov/publications/pubs/traumatic/NIH_Consensus_Statement.htm
Newman, et al., 1995, Ann.. Thorac. Surg. 59:1326.
Nguimfack, 2002, Do the glutamate excitotoxicity theory and potential free radicals implication in schizophrenia aetiopathogenesis provide a new enlightenment to links between: genome, environment and biology in the determinism of that disorder? Encephale 28(2):147-53.
Nicoll, et al., 1995, Nat. Med. 1:135.
Novak, et al., 1996, A new low density lipoprotein receptor homologue with 8 binding ligand repeats in brain of chicken and mouse. J. Biol. Chem. 271:11732-11736.
Olson, et al., 1993, Perspective: Concepts and Progress in the Development of Peptide Mimetics, J. Med. Chem. 36, 3039-3049.
Olson, et al., 1995, Peptide Mimetics of Thyrotropin Releasing Hormone Based on a Cyclohexane Framework: Design, Synthesis, and Cognition-Enhancing Properties, J. Med. Chem, 38, 2866-2879.
Orner, et al., 2001, Toward proteomimetics: terphenyl derivatives as structural and functional mimics of extended regions of an alpha-helix, J. Am. Chem. Soc. 123, 5382-3.
Paul and Bolton, 2002, Modulation of blood-brain barrier dysfunction and neurological deficits during acute experimental allergic encephalomyelitis by the N-methyl-D-aspartate receptor antagonist memantine, J. Pharmacol. Exp. Ther. 302(1):50-7.
Pearlstein, et al., 1998, Neuroprotective effects of NMDA receptor glycine recognition site antagonism: dependence on glycine concentration. J. Neurochem. 70:2012-2019.
Pender MP, Wolfe NP, 2002, Prevention of autoimmune attack and disease progression in multiple sclerosis: current therapies and future prospects, Intern Med J. 32(11):554-63.
Perez, et al., 2001, Evaluation of HIV-1 Tat induced neurotoxicity in rat cortical cell culture, J. Neurovirol. 7(1):1-10.
Pescarolo, et al., 2001, A retro-inverso peptide homologous to helix 1 of c-Myc is a potent and specific inhibitor of proliferation in different cellular systems, FASEB J. 15: 31-3.
Parker TS, Levine DM, Chang JC, Laxer J, Coffin CC, Rubin AL. 1995. Reconstituted high-density lipoprotein neutralizes gram-negative bacterial lipopolysaccharides in human whole blood. Infect Immun. 1995 Jan;63(1):253-8.
Poirier, J. 1994. Apolipoprotein E in animal models of CNS injury and Alzheimer’s disease. Trends Neurosci. 17:525-530.
Pradhan, D. S., Nair, C. K. K. and Sreenivasan, A. 1973. Radiation injury repair and sensitization of microorganisms. Proc. Ind. Natl. Sci. Acad. 39B: 516−530.
Redlich CA, Gao X, Rockwell S, Kelley M, Elias JA. 1996. IL-11 enhances survival and decreases TNF production after radiation-induced thoracic injury. J Immunol. 1996 Aug 15;157(4):1705-10.
Rao, et al., 2001, Neuroprotection by memantine, a non-competitive NMDA receptor antagonist after traumatic brain injury in rats, Brain Res. 911(1):96-100.
Regner, et al., 2001, Neurochemical characterization of traumatic brain injury in humans, J. Neurotrauma 18(8):783-92.
Rensen, et al., 1997, Human recombinant apolipoprotein E redirects lipopolysaccharide from Kupffer cells to liver parenchymal cells in rats in vivo, J. Clin. Invest. 99(10):2438-45.
Richard, J.P.,Melikov, K., Vives, E., Ramos, C., Verbeure, B., Gait, M.J., Chernomordik, L.V.and Lebleu, B (2003). Cell-penetrating peptides. A reevaluation of the mechanism of cellular uptake. The Journal of Biological Chemistry 278: 585-590.
Rousselle, C., Clair, P., Lefauconnier, J., Kaczorek, M., Scherrmann, J., and Temsamani, J (2000) New advances in the transport of doxorubicin through the blood-brain barrier by a peptide vector-mediated strategy. Molecular Pharmacology 57: 679-686.
Rousselle, C., Smirnova, M., Clair, P., Lefauconnier, J., Chavanieu, A., Calas, B., Scherrmann, J., and Temsamani, J. (2001) Enhanced delivery of doxorubicin into the brain via a peptide-vector-mediated strategy: saturation kinetics and specificity. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 296: 124-131.
Rousselle, C., Clair, P., Smirnova, M., Kolesnikov, Y., Pasternak, G.W., Gac-Breton, S., Rees, A.R., Scherrmann, J., and Temsamani, J. (2003) Improved brain uptake and pharmacological activity of dalargin using a peptide-vector-mediated-strategy. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics 36: 371-376.
Rogers, et al.,1993, Neurology 43:1609.
Rothwell and Relton, 1993, Cerebrovasc. Brain Metab. Rev. 5:178.
Roselaar SE, Daugherty A. 1998. Apolipoprotein E-deficient mice have impaired innate immune responses to Listeria monocytogenes in vivo. J Lipid Res. 1998 Sep;39(9):1740-3.
Roses, AD and AM Saunders. 1998. ApoE, Alzheimer’s disease, and recovery from brain stress. Ann. N.Y. Acad. Sci. 826: 200-212.
Schmidt S, Barcellos LF, DeSombre K, Rimmler JB, Lincoln RR, Bucher P, Saunders AM, Lai E, Martin ER, Vance JM, Oksenberg JR, Hauser SL, Pericak-Vance MA, Haines JL; Multiple Sclerosis Genetics Group, 2002, Association of polymorphisms in the apolipoprotein E region with susceptibility to and progression of multiple sclerosis, Am J Hum Genet. 70(3):708-17.
Sheng, et al., 1999a, Characterization of a recovery global ischemia model in the mouse, J. Neurosci. Methods 88: 103-109.
Sheng, et al., 1999a, Characterization of a recovery global ischemia model in the mouse, J. Neurosci. Methods 88: 103-109.
Sheng, et al., 1998, Apolipoprotein E isoform-specific differences in outcome from focal ischemia in transgenic mice, J. Cereb. Blood Flow Metab. 18: 361-366.
Sheng, et al., 1999b, Apolipoprotein E deficiency worsens outcome from global cerebral ischemia in the mouse, Stroke 30: 1118-1124.
Scholes, G. 1983. Radiation effects on DNA: The Silvanus Thomson memorial lecture April 1982. Br. J. Radiol. 56: 221−231.
Schuchter LM, Glick J: The Current status of WR-2721 (Amifostine): A chemotherapy and radiation therapy protector. 1993. Biologic Ther Cancer 3:1-10.\
Skelton, R.W., Bukach, C.M., Laurance, H.E., Thomas, K.G., and Jacobs, J.W. (2000). Humans with traumatic brain injuries show place-learning deficits in computer-generated virtual space. J Clin Exp Neuropsychol, 22: 157-75.
Slooter, et al., 1997, Apolipoprotein E epsilon4 and the risk of dementia with stroke. A population-based investigation, J.Am. Med.Assoc. 277: 818-821.
Smith, et al., 1995, A model of parasagittal controlled cortical impact in the mouse: cognitive and histopathologic effects, J. Neurotrauma 12:169−78.
Smith, et al., 1997, An Orally Bioavailable Pyrrolinone Inhibitor of HIV-1 Protease: Computational Analysis and X-Ray Structure of the Enzyme Complex, J. Med. Chem. 40, 2440-2444.
Smith, et al., 1998, Design, Synthesis, and Evaluation of a Pyrrolinone-peptide Hybrid Ligand for the Class II MHC Protein HLA-DR1, J. Am. Chem. Soc. 120, 12704-12705.
Smith, et al., 2000, Design, Synthesis and Evaluation of a Pyrrolinone-Based Matrix Metalloprotease Inhibitor, Org. Lett., 2:3809-3812.
Strittmatter, et al., 1994, Isoform-specific interactions of apolipoprotein E with microtubule-associated protein tau: implications for Alzheimer disease, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 11183-11186.
Strittmatter, et al., 1993, Apolipoprotein E: high-avidity binding to beta-amyloid and increased frequency of type 4 allele in late-onset familial Alzheimer disease, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 90: 1977-1981.
Schiefer, et al., 2002, Riluzole prolongs survival time and alters nuclear inclusion formation in a transgenic mouse model of Huntington's disease, Mov. Disord. 17(4):748-57.
Schiefermeier, et al., 2000, Apolipoprotein E polymorphism. Survival and neurological outcome after cardiopulmonary resuscitation, Stroke 21: 2068-2071.
Schwarze, S.R., Ho, A., Vocero-Akbani, A., and Dowdy, S.F. (1999) In vivo transduction: delivery of a biologically active protein into the mouse. Science 285: 1569-1572.
Schwarze, S.R., and Dowdy, S.F. (2000) In vivo protein transduction: intracellular delivery of biologically active proteins, compounds, and DNA. Trends Pharmacol Sci 21: 45-48.
Seliger, et al., 1997, Neurology (Abstract) page A213.
Sheng, et al., 1994, J. Neurochem. 63:1872.
Sheng et al., 1999, Apolipoprotein E deficiency worsens outcome from global ischemia in the mouse, Stroke 30:1118-1123.
Sheng, H. D.T. Laskowitz, E. Bennett, D.E. Schmechel, R.D. Bart, A.M. Saunders, R.D. Pearlstein, A.D. Roses and D.S. Warner. 1998. Apolipoprotein E isoform-specific differences in outcome from focal ischemia in transgenic mice. J. Cereb. Blood Flow Metab. 18: 361-366.
Sheng H, DT Laskowitz, RD Pearlstein, and DS Warner. 1999a. Characterization of a recovery global ischemia model in the mouse. J Neurosci Methods 88: 103-109.
Sheng, H. D.T. Laskowitz, G.B. Mackensen, M. Kudo, R.D. Pearlstein, and D.S. Warner. 1999b. Apolipoprotein E deficiency worsens outcome from global cerebral ischemia in the mouse. Stroke 30: 1118-1124.
Shukitt-Hale, B, G Casadesus, JJ McEwen, BM Rabin, and JA Joseph. 2000. Spatial learning and memory deficits induced by exposure to iron-56-particle radiation. Radiat. Res. 154: 28-33.
Sorbi, et al., 1996, Neurology 46:A307 (abstract).
Sorbi, et al., 1995, ApoE as a prognostic factor for post-traumatic coma. Nat. Med. 1:852.
Soyka, et al., 2000, NMDA receptor challenge with dextromethorphan - subjective response, neuroendocrinological findings and possible clinical implications, J. Neural. Transm. 107(6):701-14.
Stoll and Mueller, 1986, Neurosci. Lett. 72:233.
Stoll, et al., 1989, Glia 2:170.
Strittmatter, et al., 1993, Apolipoprotein-e-epsilon-4 allele distributions in late-onset alzheimers disease and in other amyloid-forming diseases, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:1977-81.
Suzuki. T., Futaki, S., Niwa, M., Tanaka, S., Uedo, K., and Sugiura, Y. (2002). Possible existence of common internalization mechanisms among Arginine-rich peptides. The Journal of Biological Chemistry 277: 2437-2443.
Takahashi, S, X-Z Sun, Y Kubota, N Takai, and K Nojima. 2002. Histological and elemental changes in rat brain after local irradiation with carbon ion beams. J. Radiat. Res. 43: 143-152.
Takeshima, K., Chikushi, A., Lee, K., Yonehara, S., and Matsuzaki, K. (2003) Translocation of Analogues of the antimicrobial peptides magainin and buforin across human cell membranes. The Journal of Biological Chemistry 278: 1310-1315.
Tardiff, et al., 1997, Preliminary report of a genetic basis for cognitive decline after cardiac operations. The Neurologic Outcome Research Group of the Duke Heart Center, Ann. Thorac. Surg. 64: 715-20.
Teasdale, et al., 1999, Challenges in translating the efficacy of neuroprotective agents in experimental models into knowledge of clinical benefits in head injured patients. Acta Neurochir (Wien) 73:Suppl:111−6.
Teasdale, et al., 1997, Association of apolipoprotein E polymorphism with outcome after head injury, Lancet 350: 1069-1071.
Tesseur, et al., 2000, Expression of human apolipoprotein E4 in neurons causes hyperphosphorylation of protein tau in the brains of transgenic mice, Am. J. Pathol. 156(3):951-64.
Thoren, P.E.G., Persson, D., Isakson, P., Goksor, M., Onfelt, A., and Norden, B (2003) Uptake of analogs of penetratin, Tat(48-60) and oligoarginine in live cells. Biochemical and Biophysical Research Communications 307: 100-107.
Tolar, et al., 1999, Truncated apolipoprotein E (ApoE) causes increased intracellular calcium and may mediate apoE neurotoxicity. J. Neurosci. 19:7100-7110.
Tolar, et al., 1997, Neurotoxicity of the 22 kDa thrombin-cleavage fragment of apolipoprotein E and related synthetic peptides is receptor-mediated. J. Neurosci. 17:5678-5686.
Tung, C., and Weissleder, R. (2002) Arginine containing peptides as delivery vectors. Advanced Drug Delivery Reviews 55: 281-294.
Van Lenten BJ, Fogelman AM, Haberland ME, Edwards PA. 1986. The role of lipoproteins and receptor-mediated endocytosis in the transport of bacterial lipopolysaccharide. Proc Natl Acad Sci U S A. 1986 Apr;83(8):2704-8.
Van Oosten M, Rensen PC, Van Amersfoort ES, Van Eck M, Van Dam AM, Breve JJ, Vogel T, Panet A, Van Berkel TJ, Kuiper J. 2001. Apolipoprotein E protects against bacterial lipopolysaccharide-induced lethality. A new therapeutic approach to treat gram-negative sepsis. J Biol Chem. 2001 Mar 23;276(12):8820-4.
Veber, et al., 2002, Molecular properties that influence the oral bioavailability of drug candidates, J.Med.Chem. 45, 2615.
Verdine, et al., 2000, An all hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides, J. Amer. Chem. Soc., 122, 5891.
Vijayalakshmi, et al., 2000, Comparison of Helix stabilizing effects of α,α- Dialkyl Glycines with Linear and Cycloalkyl Side Chains, Biopolymers, 53(1), 84.
Vives, E., Richard, J.-P., Rispal, C., and Lebleu, B. (2003) TAT peptide internalization: seeking the mechanism of entry. Current Protein and Peptide Science 4: 125-132.
Van Oosten, et al., 2001, Apolipoprotein E protects against bacterial lipopolysaccharide-induced lethality, J. Biol. Chem. 276(12):8820-24.
Veinbergs, et al., 2001, Role of apolipoprotein E receptors in regulating the differential in vivo neurotrophic effects of apolipoprotein E, Exp. Neurol. 170(1):15-2.
Von Bergen, et al., 2002, Effect of intrathecal non-NMDA EAA receptor antagonist LY293558 in rats: a new class of drugs for spinal anesthesia, Anesthesiology 97(1):177-82.
Wellons, et al., 2000, A comparison of strain-related susceptiblitiy in two murine recovery models of global cerebral ischemia, Brain Res. 868: 14-21.
Waage, et al., 1987, J. Exp. Med. 169:333-38.
Wang, et al., 1998, Apolipoprotein E (ApoE) peptide regulates tau phosphorylation via two different signaling pathways. J. Neurosci. Res. 51:658-665.
Wang, et al., 1997, Rapid elevation of neuronal cytoplasmic calcium by apolipoprotein E peptide. J. Cell. Physiol. 173:73-83.
Watanabe, et al., 1997, Int. J. Cardiol. 54:551.
Weisbarger et al., 1983, The receptor-binding domain of human apolipoprotein E: monoclonal antibody inhibition of binding, J. Biol. Chem. 258:12348-54.
Weisgraber, et al., 1982,Abnormal lipoprotein receptor-binding activity of the human E apoprotein due to cysteine-arginine interchange at a single site. J. Biol. Chem. 257:2518-2521.
Weisgraber, 1994, Apolipoprotein E: Structure-function relationships. Adv. Protein Chem. 45:249-302.
Wells MT, Gaffin SL, Jordaan JP. 1987. Radiation induced gram negative bacteremia and endotoxemia in rabbits: modification by anti-lipopolysaccharide hyperimmune equine plasma. Life Sci. 1987 Jun 29;40(26):2543-50.
Wells MT, Gaffin SL, Wessels BC, Brock-Utne JG, Jordaan JP, van den Ende J. 1990. Anti-LPS antibodies reduce endotoxemia in whole body 60Co irradiated primates: a preliminary report. Aviat Space Environ Med. 1990 Sep;61(9):802-6.
Wender, P. A., Mitchell, D. J., Pattabiraman, K., Pelkey, E. T., Steinman, L.,and Rothbard, J.B. (2000) The design, synthesis, and evaluation of molecules that enable or enhance cellular uptake: peptoid molecular transporters. Proc. Natl. Acad. Sci. 97: 13003-13008.
Wettereau, et al., 1988, Human apolipoprotein E3 is aqueaous solution. Evidence for two structural domains, J. Biol. Chem. 263:6240-48.
Wiemann B, Van GY, Danilenko DM, Yan Q, Matheson C, Munyakazi L, Ogenstad S, Starnes CO, 1998, Combined treatment of acute EAE in Lewis rats with TNF-binding protein and interleukin-1 receptor antagonist, Exp Neurol. 149(2):455-63.
Wisniewski, et al., 1992, Apolipoprotein E: a pathological chaperone in patients with cerebral and systemic amyloid. Neurosci. Let. 135:235-238.
Wright, L.R., Rothbard, J.B. and Wender, P.A. (2003) Guanidinium rich peptide transporters and drug delivery. Current Protein and Peptide Science 4: 105-124.
Xu and Luo, 2001, Relationship between changes of N-methyl-D-aspartate receptor activity and brain edema after brain injury in rats, Chin. J. Traumatol. 4(3):135-8.
Ye, D., Xu, D., Singer, A.U., and Juliano, R.L. (2002) Evaluation of strategies for the intracellular delivery of proteins. Pharmaceutical Research 19: 1302-1309.
Zanotti, et al., 2002, Cytokine modulation in sepsis and septic shock, Expert Opin. Investig. Drugs 11(8):1061-75.
本発明は上記の実施例を参照して詳細に記載されているが、本発明の精神を逸脱せずにさまざまな変更が行われうることが理解される。したがって、本発明は、以下の請求の範囲によってのみ限定される。本出願において言及されたすべての引用特許、特許出願、および刊行物は、参照によりその全体が本明細書で援用される。

５．図面の簡単な説明
ＣＯＧ１３３ペプチドのＨｅｌｉｃａｌ ｗｈｅｅｌ投影を示す図である。 例としての類似物を示す図である。 らせん類似物としての三環性骨格を示す図である。 外傷性脳損傷後のマウス回転棒性能を示すグラフである。 マウス閉鎖性頭部損傷モデルに使用される空気衝撃デバイスを示す図である。 空気衝撃前のマウス治療および処理を示す図である。 ＬＰＳ処置ＢＶ２ミクログリア細胞における酸化窒素（Ａ）およびＴＮＦａ（Ｂ）の放出の抑制を示すグラフである。ＣＯＧ１４１０は、ＣＯＧ１３３と比べ大幅に大きな効力を示す。 ＣＯＧ１４１０が生理食塩水と比べＴＢＩ後１２０分に投与されると神経保護性であることを示す回転棒結果のグラフであり、ｐ＜０．０５、ＣＯＧ１３３は生理食塩水とは異ならない、ｐ＞０．０５。 経時的にＣＯＧ１３３の血漿濃度を示すグラフである。 マウス実験自己免疫脳脊髄炎のマウスモデルにおけるＣＯＧ１３３対対照ペプチドの平均臨床スコアを示すグラフである。 ＭＯＧペプチドはＮＯ（Ａ）およびＴＮＦアルファ（Ｂ）のマクロファージ産生を誘発するが、ＬＰＳ／ＩＦＮガンマ治療はＮＯ（Ｃ）、ＴＮＦアルファ（Ｄ）、およびＩＬ−６（Ｅ）のマクロファージ産生を誘発することを示すグラフである。 ＣＯＧ１３３が濃度依存的にＮＯ（Ａ）およびＴＮＦアルファ（Ｂ）のＭＯＧ介在産生を阻害したことを示すグラフである。 ＣＯＧ１３３が濃度依存的にＮＯ（Ａ）、ＴＮＦアルファ（Ｂ）、およびＩＬ−６（Ｃ）のＬＰＳ／ＩＦＮガンマ誘発産生を阻害したことを示すグラフである。 （アンテナペディア−ＣＯＧ１３３キメラ）を含有するＣＯＧ１３４が、濃度依存的にＮＯ（Ａ）のＭＯＧ介在産生、およびＮＯ（Ｂ）、ＴＮＦアルファ（Ｃ）、およびＩＬ−６（Ｄ）のＬＰＳ／ＩＦＮガンマ誘発産生を阻害したが、プレフィックスペプチドのみ（Ｐ）は活性を示さなかったことを示すグラフである。 外傷性脳損傷後に処置したマウスでの回転棒およびモリスの水迷路の結果を示す図である。 ＣＯＧ１３３による亜硫酸塩放出抑制を示すグラフである。 ＴＡＴ−ＣＯＧ１３３による亜硫酸塩放出抑制を示すグラフである。 ぺネトラチン−ＣＯＧ１３３による亜硫酸塩放出抑制を示すグラフである。 ＰＴＤＣＯＧ１３３コンジュゲートがＬＰＳ介在酸化窒素産生を阻害することを示すグラフである。 ＴＢＩ後９０分のＣＯＧ１３３またはぺネトラチン−ＣＯＧ１３３で処置したマウスの回転棒レイテンシーのグラフを示す図である。 ＴＢＩ後２時間のｓｙｎＢ３−ＣＯＧ１３３で処置したマウスの回転棒レイテンシーのグラフを示す図である。 アポＥ含有動物対アポＥノックアウト動物の放射線誘発死に対する耐性を比較するグラフを示す図である。野生型動物１０匹の群を７ＧｙのＴＢＩに曝露し、１００％が照射後３０日目に生存した。アポＥノックアウト動物１０匹の群を７ＧｙのＴＢＩに曝露し、８０％が照射後３０日目に生存した。野生型動物１０匹の群を８ＧｙのＴＢＩに曝露し、４０％は照射後３６日目に生存した。アポＥノックアウト動物１０匹の群を８ＧｙのＴＢＩに曝露し、０％が照射後１３日目に生存した（Ｙ軸＝生存率、Ｘ軸＝全身照射後日数）。 アポリポタンパク−ｅのペプチド類似物のｃｏｇ１３３の存在または非存在に１０グレイの全身照射後のアポリポタンパク−ｅ含有野生型マウスの生存を示すグラフである。ＴＢＩ後１分でのｃｏｇ１３３の腹腔内投与（１００ｕｌ生理食塩水賦形剤中４ｍｇ／ｋｇ）は、生理食塩水賦形剤対照と比べ生存を改善した。ＴＢＩ後１時間、１日、２日、および３日でのｃｏｇ１３３の４回量のｉｐ投与（各々１００ｕｌ生理食塩水賦形剤中４ｍｇ／ｋｇの用量）は、対照と比べ大幅に生存を改善した、反復測定ａｎｏｖａによってｐ＜０．０１。 ＣＯＧ１３３処置がＬＰＳのみの対照と比べＬＰＳ注射後１時間でＴＮＦａの血漿レベルを大幅に軽減する（ｐ＜０．０５）ことを示すグラフである。０、３、および２４時間でのＴＮＦａレベルは背景対照と異ならなかった。リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００３年による。 ＣＯＧ１３３処置がＬＰＳのみの対照と比べＬＰＳ注射後１時間および３時間でＩＬ−６の血漿レベルを大幅に軽減するグラフを示す（ｐ＜０．０５）。０および２４時間でのＩＬ−６レベルは背景対照と異ならなかった。リンチ（Ｌｙｎｃｈ）ら、２００３年による。 ＣＯＧ１３３がＭＯＧ誘発ＥＡＥマウスの脊髄における脱髄を阻害することを示す図である。動物をｄｐｉ３０で犠死させ、全脊髄を除去し、５ｍｍ厚の切片を頸部（Ａ、Ｄ）、胸部（Ｂ、Ｅ）、および腰部（Ｃ、Ｆ）から作成した。ＣＯＧ１３３処置動物（Ｄ、Ｅ、Ｆ、Ｈ）および生理食塩水処置対照（Ａ、Ｂ、Ｃ、Ｇ）をルクソール・ファースト・ブルーで染色し（ミエリンでは青色に染色）、次いでエオシンで対比染色した（末梢浸潤を赤紫色で示す）。図ＧはＡの拡大挿入図であり、図ＨはＤの拡大挿入図である。 ＣＯＧ化合物が４０時間ＬＰＳで刺激したマウスＢＶ２ミクログリア細胞からの酸化窒素放出の用量依存阻害をもたらすことを示す図である。これらのデータから、ＣＯＧ１３３のおよそのＩＣ５０は２ｕＭであり、ＣＯＧ１４１０のＩＣ５０は２ｕＭであり、かつＣＯＧ４５０２のＩＣ５０は１０ｎＭである。各々のデータ点は３つの複製の平均である。エラーバーは示されているが、結果を示すために使用された記号よりも小さい。 ＣＯＧ４５０２が２４時間ガンマインターフェロンおよびＬＰＳによる培養で刺激したマウス腹膜マクロファージからのＴＮＦａまたはＩＬ６放出の用量依存阻害をもたらすことを示すグラフである。有意性は、ｐ＜０．０５レベルが１つの星印で示され、ｐ＜０．０１レベル対対照が２つの星印で示されている。 １４日間のＣ．ローデンティウム感染後の結腸アルギナーゼおよびｉＮＯＳ誘発を示すグラフである。Ａ、ＲＴ−ＰＣＲによるアルギナーゼＩ、アルギナーゼＩＩ、およびｉＮＯＳ ｍＲＮＡレベル。Ｂ、アルギナーゼＩおよびＩＩのウェスタンブロット法。ＡおよびＢにおいて、各々のレーンは異なるマウスの組織である。 アルギナーゼＩ（Ａ−Ｃ、Ｈ）およびｉＮＯＳ（Ｄ−Ｆ、Ｉ）の免疫組織化学的検出を示す図である。Ａ、非感染マウス（２００×）。Ｂ−Ｃ、アルギナーゼＩに対して染色したＣ．ローデンティウム感染マウス（Ｂ、２００×、Ｃ、４００×）、Ｄ−Ｆ ｉＮＯＳに対する同じ組織染色。Ｇ、ＢおよびＥの連続切片であり、ウサギＩｇＧが一次Ａｂを置換したが、染色を示さない。ＨおよびＩ、それぞれ、アルギナーゼＩ、およびｉＮＯＳに対して染色した異なる結腸炎マウス（２００×）。 対照（Ｃｔｒｌ）またはＣ．ローデンティウム感染（Ｃ．ｒｏｄ）マウスにおける結腸アルギナーゼ活性（Ａ）、血清ＮＯ濃度（Ｂ）、および血清Ｌ−Ａｒｇ濃度）（Ｃ）を示すグラフである。Ｃｔｒｌではｎ＝３、Ｃ．ローデンティウムではｎ＝６。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１。 Ｃ．ローデンティウムに感染したＷＴおよびｉＮＯＳ^−／−マウスにおける生存（Ａ）、体重（Ｂ）、および結腸重量（Ｃ）の変化を示すグラフである。マウスには感染後開始１日にＬ−Ａｒｇまたは水のみを与えた。ｎ＝Ｃ．ローデンティウムに感染したＷＴ（ν）では３１、Ｌ−Ａｒｇ処置ＷＴ感染マウス（□）では３２、感染ｉＮＯＳ^−／−マウス（σ）では２３、Ｌ−Ａｒｇを与えた感染ｉＮＯＳ^−／−マウス（○）では２０。Ａ−Ｃについて、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊＊ｐ＜０．００１対０日、§ｐ＜０．０５、§§ｐ ＜０．０１、§§§ｐ＜０．００１対ＷＴ−水、＃ｐ＜０．０５対Ｌ−ＡｒｇなしｉＮＯＳ^−／−。 Ｃ．ローデンティウム感染マウスのＨ＆Ｅ染色結腸における組織学的所見を示すグラフである。Ａ、非感染ＷＴ正常組織。Ｂ、重篤な結腸炎を有する感染ＷＴ。Ｃ、ｉＮＯＳ^−／−マウスにおける組織学的改善。Ｄ、Ｌ−Ａｒｇ処置ｉＮＯＳ^−／−マウスにおけるさらなる改善。Ｅ、Ｃ．ローデンティウム結腸炎における組織学スコア（０−１２スケール）。ｎ＝ＷＴでは１９、ＷＴ−Ｌ−Ａｒｇでは１７、ｉＮＯＳ^−／−では１２、およびｉＮＯＳ^−／−−Ｌ−Ａｒｇでは１１。^＊＊ｐ＜０．０１対ＷＴ、§ｐ＜０．０５対ｉＮＯＳ^−／−。すべてを同じ量のＣ．ローデンティウム（５×１０^８ＣＦＵ／マウス）で接種し、１２−１４日目に犠死させ、それ以前に死んだマウスを除外した。 Ｃ．ローデンティウム感染マウス対非感染ＷＴ対照におけるＩＦＮ−γ（Ａ）、ＴＮＦ−α（Ｂ）、およびＩＬ−１（Ｃ）に対するサイトカインｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ｍＲＮＡレベルをリアルタイムＰＣＲによって測定した。ｎ＝群あたり３−５。^＊＊ｐ＜０．０１対ＷＴ非感染対照、§ｐ＜０．０５、§§ｐ＜０．０１対ＷＴＣ．ローデンティウム。 Ｃ．ローデンティウム感染ＷＴマウスにおける結腸ＯＤＣ活性（Ａ）およびポリアミン濃度（Ｂ）を示すグラフである。対照ではｎ＝４、Ｃ．ローデンティウムではｎ＝７、Ｃ．ローデンティウム＋Ｌ−Ａｒｇではｎ＝５。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜ ０．０１対対照、§§ｐ＜０．０１対Ｃ．ローデンティウム。 マウスに対し６日間飲料水中４％ＤＳＳを与え、１０日目に組織を回収したことを示すグラフである。Ａ、ＲＴ−ＰＣＲによって評価されたアルギナーゼＩおよびＩＩ、およびｉＮＯＳのｍＲＮＡレベル。Ｂ、ウェスタンブロット法によって評価されたタンパク質レベル。 アルギナーゼＩタンパク質発現に対するＤＳＳ結腸炎の影響を示すグラフである。組織を犠死時にホルマリン中に固定し、アルギナーゼＩに対するポリクロナール抗体（１：４００希釈、リサーチ・ディアグノスティック社（Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．）を使用して免疫ペルオキシダーゼ法によって免疫組織化学を実行した。特に腺窩における上皮細胞、および潰瘍のある領域における炎症性細胞の染色に注意。 Ｌ−Ａｒｇ（１％）、またはｉＮＯＳノックアウトによるＤＳＳ結腸炎における改善を示すグラフである。Ａ、生存、Ｂ、体重、Ｃ、結腸重量。Ａにおいて、^＊ｐ＜ ０．０５対時間０、§ｐ＜０．０５対ＷＴ、ＢおよびＣにおいて、^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ ＜０．０１対ＷＴ、＃ｐ＜０．０５、＃＃ｐ＜０．０１対ｉＮＯＳ^−／−。ｎ＝１２−２１。 ＤＳＳ結腸炎を有するマウスからのＨ＆Ｅ染色スライドにおける組織学的所見を示すグラフである。Ａ、重篤な結腸炎を有するＷＴマウス、Ｂ、Ｌ−ＡｒｇによるＷＴマウスにおける改善、Ｃ、ｉＮＯＳ^−／−＋Ｌ−Ａｒｇによるさらなる改善。Ｄ、組織学スコア（０−４０スケール）。^＊ｐ＜０．０５、^＊＊ｐ＜０．０１対ＷＴ、ｎ＝１０。 ＤＳＳ結腸炎組織対ＷＴ対照におけるＩＦＮ−γ（Ａ）、ＴＮＦ−α（Ｂ）、およびＩＬ−１（Ｃ）に対する、リアルタイムＰＣＲによって測定されたサイトカインｍＲＮＡレベルを示すグラフである。ｎ＝群あたり３−６。^＊＊ｐ＜０．０１対ＷＴ対照、§ｐ＜０．０５、§§ｐ＜０．０１対ＷＴＤＳＳ、＃ｐ＜０．０５対ｉＮＯＳ^−／−。 ＤＳＳ結腸炎における結腸ポリアミンレベルを示すグラフである。^＊ｐ＜０．０１、^＊＊ｐ＜０．０１対対照マウス。 ＲＴ−ＰＣＲによるヒトＩＢＤ組織におけるアルギナーゼＩ、ＩＩ、およびＯＤＣの増大ｍＲＮＡレベルを示す図である。 マウスマクロファージにおけるＣＯＧペプチドによるＣ．ローデンティウム誘発ｉＮＯＳの阻害を示すグラフである。ＲＡＷ２６４．７細胞を１００の多様の感染でＣ．ローデンティウムのフレンチプレス溶解物で刺激した。Ａ、ＮＯ産生をＮＯ_２ ⁻レベルの測定によって測定した。^＊＊ｐ＜０．０１対対照、§§ｐ＜０．０１対Ｃ．ローデンティウムのみ。Ｂ、ｉＮＯＳに対するＲＴ−ＰＣＲ。

Claims (31)

1. ＡｐｏＥ断片であるＣＯＧ１３３（配列番号１）のαらせんペプチド誘導体であって、
   前記αらせんペプチド誘導体は、
   

   

   〔ここでＡｉｂはアミノイソ−ブチル酸であり、（ＮＬｅ）はニューロロイシン（ｎｅｕｒｌｅｕｃｉｎｅ）であり、Ａｃはアセチル化アミノ末端である。〕
   からなる群から選択される配列を有し、
   前記αらせんペプチド誘導体は、ＬＤＬ結合活性を有し、マウス外傷性脳損傷（ＴＢＩ）モデルにおいて、配列番号１で表されるアミノ酸配列を有するペプチドに比較してより大きな治療の窓（ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｗｉｎｄｏｗ）を示す効果を有する、
   αらせんペプチド誘導体。
2. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体であって、前記治療の窓の増加が、ＣＯＧ１３３に比較して４倍または５倍である、αらせんペプチド誘導体。
3. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体であって、前記ペプチド誘導体が、ＴＢＩ後６０分、ＴＢＩ後９０分、ＴＢＩ後１５０分、またはＴＢＩ後１８０分において、ＣＯＧ１３３以上の効果を示す、αらせんペプチド誘導体。
4. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体であって、前記ペプチド誘導体が、ＣＯＧ１３３に比較して、治療指数についても増加を示す、αらせんペプチド誘導体。
5. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体であって、Ａｃ−ＡＳ−Ａｉｂ−ＬＲＫＬ−Ａｉｂ−ＫＲＬＬ−ＮＨ２（配列番号７）を含む、αらせんペプチド誘導体。
6. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体を含む、医薬組成物。
7. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体を含む、グリア活性化、ミクログリア活性化、または神経細胞死を減少させる医薬。
8. 請求項７に記載の医薬であって、前記ミクログリア活性化が、ＣＮＳ炎症、外傷性脳損傷、脳虚血、または脳浮腫に関連するものである、医薬。
9. 請求項７に記載の医薬であって、前記神経細胞死が、グルタミン酸興奮毒性またはＮ−メチル−Ｄ−アスパラギン酸（ＮＭＤＡ）曝露に関連するものである、医薬。
10. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体を含む、アテローム性動脈硬化症の治療のための、またはアテローム斑の形成を減少させるための医薬。
11. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体を含む、細菌性敗血症の症状の治療、予防、または改善のための医薬。
12. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体を含む、多発性硬化症の症状の治療、予防、または改善のための医薬。
13. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体を含む、関節リウマチ、乾癬性関節炎、強直性脊椎炎、または多関節性若年性関節リウマチの治療、予防、または改善のための医薬。
14. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体を含む、炎症性腸疾患（ＩＢＤ）、クローン病、または潰瘍性結腸炎の症状の治療、予防、または改善のための医薬。
15. タンパク質導入ドメイン（ＰＴＤ）にコンジュゲートした請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体を含む組成物。
16. 請求項１５に記載の組成物であって、前記ＰＴＤが、アンテナペディア、ＴＡＴ、ＳｙｎＢ１、ＳｙｎＢ３、ＳｙｎＢ５及びポリアルギニンからなる群より選択される、組成物。
17. 請求項１６に記載の組成物であって、前記ＰＴＤが、アンテナペディア由来のペプチドである、組成物。
18. 請求項１６に記載の組成物であって、前記ＰＴＤが、前記ペプチド誘導体のアミノ末端にコンジュゲートしている、組成物。
19. 請求項１８に記載の組成物であって、前記アンテナペディア由来のＰＴＤが、ＲＱＩＫＩＷＦＱＮＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５１）またはＲＲＭＫＷＫＫ（配列番号５２）である、組成物。
20. 請求項１８に記載の組成物であって、前記ＴＡＴ由来のＰＴＤがＧＲＫＫＲＲＱＲＲＲＰＰＱ（配列番号５０）である、組成物。
21. 請求項１８に記載の組成物であって、前記ＳｙｎＢ１由来のＰＴＤがＲＧＧＲＬＳＹＳＲＲＲＦＳＴＳＴＧＲ（配列番号５３）である、組成物。
22. 請求項１８に記載の組成物であって、前記ＳｙｎＢ３由来のＰＴＤがＲＲＬＳＹＳＲＲＲＦ（配列番号５４）である、組成物。
23. 請求項１８に記載の組成物であって、前記ＳｙｎＢ５由来のＰＴＤがＲＧＧＲＬＡＹＬＲＲＲＷＡＶＬＧＲ（配列番号５５）である、組成物。
24. 請求項１８に記載の組成物であって、前記ポリアルギニン由来のＰＴＤがＲＲＲＲＲＲＲＲ（配列番号５６）である、組成物。
25. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体を含む、外傷性脳損傷の治療、予防、または改善のための医薬。
26. 請求項２５に記載の医薬であって、前記外傷性脳損傷が神経障害を引き起こすものである、医薬。
27. 請求項２５に記載の医薬であって、前記治療が、神経学的回復または認知機能改善を含む、医薬。
28. 請求項２５に記載の医薬であって、前記外傷性脳損傷がＣＮＳ炎症またはＣＮＳ浮腫である、医薬。
29. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体を含む、マクロファージ活性化を軽減する医薬。
30. 請求項２９に記載の医薬であって、前記マクロファージ活性化が、アテローム斑の形成に関連するものである、医薬。
31. 請求項１に記載のαらせんペプチド誘導体を含む、多発性硬化症又はギランバレー症候群の治療または予防のための医薬。

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