TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES NEURODEGENERATIVAS
Campo de la Invención La presente invención se refiere a un compuesto que contiene un tripéptido y sus derivados, y el uso de ese compuesto en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. Antecedentes de la Invención La enfermedad de Alzheimer es una enfermedad cerebral degenerativa que se caracteriza por la pérdida progresiva de la memoria subsecuentemente la mayoría de otras funciones cognoscitivas en una perdida irreversible durante un periodo de años. Representa un problema de salud importante particularmente e la población de edad avanzada y actualmente afecta a aproximadamente 8000,000 personas solo en el Reino Unido. Hasta recientemente, los métodos terapéuticos para tratar la enfermedad de Alzheimer se han dirigido a la estabilización de la concentración de la acetilcolina. El uso de inhibidores de esterasa de acetilcolina resulta en una mejora temporal que no es adecuado para detener o invertir la degeneración, la eficacia de esos fármacos ha sido criticado por NICE (el Instituto Nacional de Excelencia Clínica del Reino Unido) y existe una necesidad urgente de métodos más efectivos, en base al mayor entendimiento de los mecanismos bioquímicos que son la base de la muerte de las células neuronales que caracteriza a la enfermedad. Dos efectos que se ha observado tienen lugar en el cerebro de
una persona que sufre de la enfermedad de Alzheimer, es la acumulación fuera de las células nerviosas del cerebro, de ovillos de masas de proteína (placas), y la acumulación dentro de las células cerebrales de una proteína diferente (ovillos neureofibrilares). Las proteínas extracelulares se sabe que se agregan a los polipéptidos que tienen secuencias aminoácidos correspondientes a las porciones de amiloides beta de la proteína precursora de amiloides APP. Los ovillos de masas de esas proteínas se conocen como placas amiloides. Sin embargo no se sabe si uno o ambos de entre las placas amiliodes y la acumulación intraceluar de proteínas neurofibrilares son las causas o los síntomas de la enfermedad de Alzheimer y las enfermedades neurodegenerativas del tipo de Alzheimer. La familia APP consiste de 8 isoformas hechas de 770, 752, 751, 733, 714, 696, 695 y 677 residuos aminoácidos generados por el empalme alternativo (ver Selkoe, Annu Rev. Neurosci. 17, 489-517, 1994). La isoforma presente en las neuronas se sabe que consiste de 695 residuos aminoácidos en una secuencia conocida (ver Selkoe, Annu Rev Neurosci 17, 489-517, 1994). La isoforma presente en las neuronas se sabe que consiste de 695 residuos aminoácidos en una secuencia conocida [(ver Kang et al, Nature 325, 733-736 (1987), y Carrodeguas et al, Neuroscience 134, 1285-1300 (2005), cuyo contenido se incorpora como referencia]. Las secuencias APP-751 de pollo y humanas se comparan en la figura 1 de Carrodeguas.
La APP es una proteína transmembrana multifuncional y se sabe que tiene funciones importantes en el tejido cerebral normal incluyendo el crecimiento neurítico. La reducción en la regulación de la síntesis APP o el bloqueo de su dominio terminal N extracelular con anticuerpo previene la formación de memoria a largo plazo en un sistema de modelo para el estudio de los procesos moleculares involucrados en la formación de la memoria, la tarea de evasión pasiva de una prueba en el pollo joven (ver Mileusnic et al.2000). La forma de pollo de APP se sabe que consiste del mismo número de residuos aminoácidos y que se parecen cercanamente a la forma humana, siendo aproximadamente 95% homólogo. La secuencia aminoácida del aminoácido 360 a 460 de APP es idéntica en las formas humanas y de pollo de APP (ver Kang et al 1997, Carrodeguas et al 2005, and Barnes et al, J Neurosci, 18 (15) 5869-5880 (1998), cuyo contenido se incorpora como referencia). La solicitud de patente internacional cuyo contenido se incorpora como referencia, reporta que la amnesia inducida en los pollos al bloquear la síntesis o función de APP o al inyectar el amiloide-beta, puede prevenirse por medio de inyección de un pequeño péptido homólogo a la parte del dominio promotor del crecimiento de APP (residuos aminoácidos 375 a 392). Se reporta que un péptido particularmente preferido es Arg-Glu-Arg (de aquí en adelante RER), homologo a los residuos 328 a 330 de la secuencia APP humana dada en WO02/083729. La presente invención se basa en la identificación de otro
péptido preferido. Breve Descripción de la Invención Los aminoácidos pueden existir en la forma L natural (designada en el código de los aminoácidos de una sola letra al usar mayúsculas) o su forma isomérica óptica D (designada por el uso de minúsculas). Los presentes inventores han determinado que los péptidos de la secuencia rER (esto es, D-Arg-L-Glu-L-Arg), y sus derivados, son particularmente activos biológicamente. Además, los péptidos de la secuencia ReR (L-Arg-D-Glu-L-Arg) también parecen ser biológicamente activos, aunque a un menor grado que el péptido rER. De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se provee un compuesto que contiene un péptido que tiene la secuencia rER, o un péptido que tiene la secuencia ReR. Un péptido particularmente preferido tiene la secuencia rER. El péptido puede comprender uno o más grupos de protección, preferentemente un grupo de protección terminal BN. En una modalidad preferida el grupo de protección es un grupo acilo., preferentemente el grupo acetilo (Ac-rER). Otros grupos de protección de acilo pueden tener la n R C li fórmula ~ > en donde R representa un grupo alquilo de cadena recta o ramificada, por ejemplo un grupo metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, isobutilo, s-butilo, t-butilo, pentilo o hexilo, un grupo cicloalquilo substituido o insubstituido, por ejemplo un grupo metilciclohexilo o ciclohexilo, un grupo aralquilo de cadena recta o
ramificada sustituido o insustituido, por ejemplo un grupo bencilo, o un grupo arilo sustituido o insustituido, por ejemplo un grupo fenilo o tolilo. Ejemplos de sustituyentes en los grupos sustituidos mencionados aquí son los grupos alquilo también antes mencionados. Otros grupos de protección adecuados pueden usarse (por ejemplo, Fmoc, Boc, Alloc). Ac-rER tiene la fórmula estructural
(Fórmula I)
En otras modalidades el grupo de protección puede ser un grupo de protección terminal C. Preferentemente el compuesto consiste esencialmente de un tripéptido que tiene la secuencia rER, opcionalmente con un grupo de protección. Alternativamente el compuesto puede consistir esencialmente de un tripéptido que tiene la secuencia ReR. Sin embargo, en ciertas modalidades el péptid puede incluir residuos aminoácidos adicionales. Los péptidos preferentemente comprenden no más de 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25 o 30 aminoácidos adicionales. En las modalidades preferidas, el péptido puede incluir residuos adyacentes a la secuencia RER encontrada en los residuos
aminoácidos 328-330 de APP humanos como se describe en WO02/083729. Los residuos adicionales particularmente preferidos se describen en WO02/083729. Por ejemplo, el péptido puede consistir o contener cualquiera de las secuencias rER, rERM, y rERMS; o cualquiera de las secuencias ReR, ReRM, y ReRMS. Alternativamente, o en adición, el péptido puede incluir aminoácidos no estándar adicionales, por ejemplo D-aminoácido, o aminoácidos no naturales en los mamíferos. El péptido puede comprender un tripéptido que tiene la secuencia rER (o la secuencia ReR), opcionalmente con un grupo protector, conjugado a otra secuencia péptida no relacionada con el APP humano; por ejemplo una secuencia de inmunoglobulina, una secuencia dirigida, o similares. El compuesto puede comprender un tripéptido que tiene la secuencia rER (o la secuencia ReR) conjugada a una molécula no peptídica; por ejemplo una etiqueta fluorescente, radioactiva u otra etiqueta. La invención también propone compuestos que comprenden un derivado del péptido rER, o un derivado del péptido reR. Los derivados pueden incluir sales; aminoácidos modificados, en particular aminoácidos modificados por medio de metilación, amidación, acetilación, o sustitución con otros grupos químicos. Preferentemente las modificaciones se seleccionan para alterar la vida media circulante del péptido sin afectar adversamente la actividad. Los derivados pede incluir péptido miméticos, por ejemplo en los cuales la estructura de péptido puede modificarse para incluir un grupo metilo dando por ejemplo al péptido Ac-rE-(Me)R. Otras
modificaciones pueden usarse para mejorar la estabilidad del péptido o derivados. Los péptidos o derivados de la presente invención pueden etiquetarse; por ejemplo por medio de de conjugación a una etiqueta detectable. Las etiquetas adecuadas incluye marcadores de oro o fluorescentes, los marcadores que tienen actividad enzimática y similares. La presente invención además proporciona un compuesto que comprende un péptido que tiene la secuencia rE , o la secuencia ReR, o un derivado del mismo, para usarse como medicamento. También se provee el uso de un compuesto que contenga un péptido que tenga la secuencia rER, o la secuencia ReR, o un derivado del mismo en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo. Preferentemente el trastorno es la enfermedad de Alzheimer. La invención además provee el uso de un compuesto que comprende un péptido que tiene la secuencia rER, o la secuencia ReR, o un derivado del mismo, en la preparación de un medicamento para mejorar la función cognoscitiva. Otros aspectos de la presente invención se refiere a método para el tratamiento de un trastorno neurodegenerativo, preferentemente la enfermedad de Alzheimer; o a métodos para mejorar la función cognoscitiva. Los métodos comprenden administrar a un individuo un compuesto que contiene un péptido que tiene la secuencia rER, o la secuencia ReR, o un derivado del mismo. Preferentemente el individuo es un humano. El péptido puede administrarse en cualquier forma conveniente, por ejemplo por medio
de inyección subcutánea, la administración intravenosa, oralmente, transdermalmente, nasalmente, rectalmente, parenteralmente, o por medio de administración pulmorar. Los niveles de dosificación adecuados dependerán entre otros factores de la naturaleza y severidad de la enfermedad que va a tratarse; edad, peso y sexo del individuo; la ruta de administración, y las potenciales interacciones con otros tratamientos al individuo que lo está tomando. Los niveles de dosificación preferidos pueden ser de 0.1 a 100 mg de sustancia activa por kg de peso corporal del sujeto; preferentemente de 0.5 a 50 mg/kg; y más preferentemente de 1 a 25 mg/kg. De acuerdo con otro aspecto de la invención se provee una formulación farmacéutica que contiene un compuesto que contiene un péptido que tiene la secuencia rER, o la secuencia ReR, o un derivado del mismo. La formulación puede comprender un portador farmacéuticamente aceptable. Los sistemas de suministro que pueden usarse con la invención incluyen por ejemplo geles acuosos o no acuosos, cremas, emulsiones múltiples, microemulsiones, liposomas, ungüentos, soluciones acuosas y no acuosas, lociones, aerosoles, bases de hidrocarburos y polvos, y pueden contener excipientes tales como solubilizadores, promotores de permeación (por ejemplo ácidos grasos, ésteres de ácidos graos, alcoholes grasos y aminoácidos) y polímeros hidrofilícos (por ejemplo policarbofilo y polivinilpirrolidona). Una formulación farmacéutica de la invención se encuentra en una forma adecuada para la administración, por ejemplo sistémica,
tópica o administración local, en una célula o en un individuo, incluyendo por ejemplo un humano. Las formas partes, en parte dependen del uso o la ruta de entrada, por ejemplo oral, transdermal o por medio de inyección. Otros factores son conocidos en la técnica e incluyen consideraciones tales como toxicidad y formas que previenen que la composición o la formulación ejerza su efecto. La presente invención también incluye composiciones preparadas para el almacenamiento o administración que incluye el péptido deseado o derivados en un portador o diluyente farmacéuticamente aceptable. Los portadores o diluyentes aceptables para uso terapéutico son bien conocidos en la técnica. Por ejemplo, pueden proporcionarse conservadores, estabilizadores tintes y agentes saborizantes. Estos incluyen benzoato de sodio, acido sórbico y ésteres de ácido p-hidroxibenzóico. Además, pueden utilizarse agentes antioxidantes y de suspensión. Las formulaciones de la invención pueden administrarse en formulaciones de unidad de dosificación que contiene portadores convencionales no tóxico farmacéuticamente aceptables, adyuvantes y/o vehículos. Las formulaciones pueden estar en las formas adecuadas para el uso oral, por ejemplo como tabletas, pastillas, comprimidos, suspensiones acuosas o aceitosas, poderes dispersables o granulados, emulsiones, cápsulas duras o suaves, o jarabes o elixires. Las composiciones pretendidas para el uso oral pueden prepararse de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la manufactura de composiciones farmacéuticas y esas
composiciones pueden contener uno o más agentes endulzantes, agentes saborizantes, agentes colorante so agentes conservadores con el fin de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y de buen sabor. Las tabletas contienen el ingrediente activo mezclado con excipientes no tóxicos farmacéuticamente aceptables que son adecuados para la manufactura de tabletas. Esos excipientes pueden ser por ejemplo diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio o fosfato de sodio; agentes granuladores o desintegrantes, por ejemplo almidón de maíz, o ácido algínico, agentes ligantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico o talco. Las tabletas pueden estar no cubiertas o pueden estar cubiertas por medio de técnicas conocidas. En algunos casos esos recubrimientos pueden prepararse por medio de técnicas conocidas para retardar la desintegración y la absorción en el tracto gastrointestinal y así proporcionar una acción prolongada durante un periodo prolongado de tiempo. Por ejemplo puede usarse un material de retraso en tiempo tal como monoestearato de glicerilo o distearato de glicerilo.
Las formulaciones para el uso oral también pueden presentarse como cápsulas de gelatina dura en donde los ingredientes activos se mezclan con un diluyente sólido inerte, por ejemplo carbonato de calcio, fosfato de calcio o caolín, o como cápsulas de gelatina suaves en donde el ingrediente activo se mezcla con agua o un medio aceitoso por ejemplo aceite de cacahuate, parafina líquida o aceite de oliva.
La suspensión acuosa contiene los materiales activos en una mezcla con excipientes adecuados para la manufactura de suspensiones acuosas. Esos excipientes son agentes de suspensión, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, metilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, alginato de sodio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto y goma de acacia; agentes dispersante so humectante puede ser un fosfatido natural, por ejemplo lecitina o productos de condensación de un óxido de alquileno con ácidos grados, por ejemplo estearato de polioxietileno, o productos de condensación de óxido de etileno con alcoholes alifáticos de cadena larga, por ejemplo hetadecaetilenoxicetanol o productos de condensación de óxido de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y un hexitol tal como monooleato de polioxietileno sorbitol, o productos de condensación de sodio de etileno con ésteres parciales derivados de ácidos grasos y anhídridos de hexitol, por ejemplo monooleato de polietileno sorbitano. Las suspensiones acuosas también pueden contener uno o más conservadores, por ejemplo etilo, o p-hidroxibenzoato de n-propilo, uno o más agentes colorantes, uno o más agentes saborizantes, y uno o más agentes endulzantes tales cornos sacarosa o sacarina. Las suspensiones aceitosas pueden formularse al suspender los ingredientes activos en un aceite vegetal, por ejemplo aceite de cacahuate, aceite de oliva, aceite de ajonjolí o aceite e coco, o en un aceite mineral tal como parafina líquida. Las suspensiones aceitosas pueden contener un agente espesante, por ejemplo cera de abejas,
parafina sólida o alcohol cetílico. Agentes endulazante y agentes saborizantes pueden agregarse para proporcionar preparaciones orales de buen sabor. Esas composiciones pueden conservarse por medio de la adición de un anti-oxidante tal como ácido ascórbico. Los polvos y granulados dispersables adecuados para la preparación de una suspensión acuosa por medio de la adición de agua proporciona el ingrediente activo mezclado con un agente dispersante o humectante, el agente de suspensión y uno o más conservadores. Los agentes dispersantes o humectantes o de suspensión se ejemplifican por aquellos ya mencionados antes. También pueden estar presentes otros excipientes por ejemplo agentes endulzantes, saborizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden encontrarse también en la forma de emulsiones aceite en agua. La fase aceitosa puede ser un aceite vegetal o un aceite mineral o mezclas de estos. Los agentes emulsificantes adecuados pueden ser gomas naturales, por ejemplo goma de acacia o goma de tragacanto, fosfatidos naturales por ejemplo lecitina de fríjol de soya y ésteres o ésteres parciales derivados de los ácidos grasos y hexitol, anhídridos, por ejemplo monooleato de sorbitano y productos de condensación de los ésteres parciales con óxido de etileno por ejemplo monooleato de polioxietileno sorbitano. Las emulsiones también pueden contener agentes endulzantes y saborizantes. Los jarabes y elixires puedne formularse con agentes endulazantes, por ejemplo glicerol, propileno glicol, sorbitol, glucosa
o sacarosa. Esas formulaciones también pueden contener un demulsificante, un conservador y agentes saborizantes y colorantes. Las composiciones farmacéuticas pueden estar en la formula de suspensiones acuosas o aceitosas estériles inyectables. Esta suspensión puede formularse de acuerdo con la técnica conocida usando aquellos agentes dispersantes o humectantes y de suspensión que se han mencionado antes. Una preparación inyectable estéril también puede ser una solución o suspensión inyectable estéril en un diluyente o solvente no tóxico parenteralmente aceptable, por ejemplo como solución en 1 ,3-butandiol. Entre los vehículos y solventes aceptables que pueden emplearse se encuentran el agua, la solución de Ringer y la solución isotónica de cloruro de sodio. Además, aceites fijos estériles convencionalmente se emplean como medio solvente o de suspensión. Para este propósito puede emplearse cualquier aceite fijo blando incluyendo mono o diglicéridos. Además de ácidos grasos tales como ácido oléico pueden usarse en la preparación de inyectables. Los compuestos de la invención también pueden administrarse en forma de supositorios, por ejemplo para la administración rectal del fármaco. Esas composiciones pueden prepararse al mezclar el fármaco con un excipiente adecuado no irritante que es sólido a las temperaturas comunes pero líquido a la temperatura rectal y por lo tanto se fundirá en el recto para liberar el fármaco. Esos materiales incluyen manteca de cacao y polietileno glicoles.
Los péptidos y los derivados de la presente invención también pueden administrarse a un individuo en combinación con otros compuestos terapéuticos para aumentar el efecto terapéutico general. El uso de múltiples compuestos para tratar una indicación puede aumentar los efectos benéficos mientras que se reduce la presencia de los efectos secundarios. De acuerdo con todavía otro aspecto de la presente invención, se provee un anticuerpo que se elija específicamente a un péptido que tenga la secuencia rER, o un anticuerpo que se elige específicamente a un péptido que tiene la secuencia ReR. Por medio de "se liga específicamente" se implica que el anticuerpo se liga a un péptido a un nivel que es significantemente mayor que el ligado no específico que puede observarse. Se entenderá por aquellos expertos en la técnica que un anticuerpo específico para el péptido rER (o el péptido ReR) puede sin embargo aun ligarse a otros antígenos que tienen un epítope similar. Los anticuerpos específicos pueden prepararse al inmunizar un mamífero en cuestión con una preparación que contenga el péptido rER (o el péptido ReR) de la invención. El anticuerpo de la invención puede ser policlonal o monoclonal. Los anticuerpos de la invención pueden también comprender anticuerpos recombinantes, quiméricos o humanizados. La invención también proporciona fragmentos inmunológicamente activos de esos anticuerpos en particular fragmentos F(a) y F(ab')2. Los anticuerpos de la invención pueden usarse para examinar otros compuestos con el fin de identificar las moléculas candidatas
potenciales que tienen una actividad similar al péptido rER. Así la invención también proporciona un método para identificar un compuesto que tiene actividad útil para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas, o útiles para promover la función cognoscitiva, el método comprende poner en contacto un compuesto candidato con un anticuerpo específico para un péptido que tiene la secuencia rER, o la secuencia ReR, y determinar si el anticuerpo se liga al compuesto. Breve Descripción de los Dibujos Esos y otros aspectos de la presente invención se describirá a manera de ejemplo únicamente y con referencia a los dibujos anexos, en los cuales: La figura 1 muestra el efecto de diferentes formas D/L de tripéptido como promotor de memoria en casos de mala memoria. La figura 2 muestra el efecto de Ac-rER sobre la memoria en pollos con amnesia inducida por ?ß. La figura 3 muestra el efecto de Ac-rER como promotor de memoria en pollos entrenados con una tarea de entrenamiento débil
(WT). La figura 4 muestra la distribución de Ac-rER etiquetada con fluoresceina en el cerebro del pollo. El tripéptido se inyecto ip e ic. La figura 5 muestra la dependencia a la dosis del efecto de Ac-rER en el entrenamiento débil. La figura 6 muestra la estabilidad de Ac-rER. La figura 7 muestra el efecto de Ac-rER sobre la amnesia
inducida con anisomicina en pollos. La figura 8 muestra el efecto de Ac-rER sobre la amnesia inducida por anisomicina en pollos. La figura 9 muestra el efecto de Ac-rE(Me)R inyectado de forma ic sobre el entrenamiento débil (WT). La figura 10 muestra el efecto de Ac-rE(Me)R inyectado de forma ip sobre el entrenamiento débil (WT). Descripción Detallada de la Invención La figura 1 muestra el efecto de diferentes formas D/L de tripéptido como promotor de memoria en casos de mala memoria. Los pollos se inyectaron ic con diferentes formas D/L de tripéptido, se pre-entrenaron 60 minutos y se probaron 24 horas después. El grupo de control recibió solución salina. La retención se calculó como el porcentaje en cada grupo que mostró evitación y discriminación. Cada pollo se entrena y prueba solo una vez y las diferencias entre grupos se estudiaron en lo que respecta al significado estadístico por medio de la prueba G (Sokal y Rolf, 1995). Observar que la prueba G refleja las diferencias entre los grupos y así no hay barras de error en las figuras. La figura 2 muestra el efecto de Ac-rÉR sobre la memoria en los pollos con amnesia inducida ?ß. Los pollos se inyectaron 2x ip, 1 mg/100 g bw, con Ac-rER, 6 y 12 horas antes del entrenamiento. ?ß1-42 (2 pg/hemisferio) se inyectaron ic 60 minutos antes del entrenamiento. Los pollos se probaron 24 horas después. La retención se calculo como el porcentaje en cada grupo que mostró
evitación y discriminación. Cada pollo se entrenó y se probó solo una vez con diferentes entre los grupos se probaron para la importancia estadística por medio de la prueba G (Sokal y Rohlf, 1995). La figura 3 muestra el efecto de Ac-rER como promotor de la memoria en pollos entrenados con una tarea de entrenamiento ligero (WT). Los pollos se inyectaron 2 x inyecciones ip, 1 mg/100 g bw, 30 minutos y 6 horas antes del entrenamiento y se probaron durante 24 horas después. Los grupos de control recibieron Ac-REr. La retención se calculó como el porcentaje de cada grupo que presento evitación y discriminación. Cada pollo se entrenó y se probó solo una vez con diferentes entre los grupos se probaron para la importancia estadística por medio de la prueba G (Sokal y Rohlf, 1995). La figura 4 muestra la distribución de la fluoresceina etiquetada con Ac-rER en el cerebro de pollo. La fluoresceina-Ahx-Ahx-rEr se inyecto ip (2 mg/100 g bw) e ic (8 pg/hemisferio) 6 horas antes de seccionar los cerebros para el análisis de la distribución de rER etiquetado con fluoresceina. El panel izquierdo muestra la distribución de rER etiquetado con fluoresceina después de la inyección ic. El panel a la derecha muestra la distribución del rER etiquetado con fluoresceina después de la inyección ip. Notar que la distribución de fluorescencia es casi idéntica. La figura 5 muestra la dependencia a la dosis del efecto de Ac-rER en entrenamiento ligero. Los pollos se inyectaron ip con diferentes dosis de Ac-rER 60 minutos de pre-tratamiento y se probaron después de 24 horas. El grupo de control recibió solución
salina. La retención se calculó como el porcentaje en cada grupo que mostraron evitación y discriminación. Cada pollo se entrenó y se probó solo una vez con diferentes entre los grupos se probaron para la importancia estadística por medio de la prueba G (Sokal y Rohlf, 1995). La figura 6 muestra la estabilidad de Ac-rER. Los pollos se inyectaron ip con 2 mg/100g bw de Ac-rER 1, 2, 4, 6 y 12 horas antes del entrenamiento y se probaron 24 horas después. El grupo de control recibió solución salina. La retención se calculó como el porcentaje en cada grupo que mostraron evitación y discriminación. Cada pollo se entrenó y se probó solo una vez con diferentes entre los grupos se probaron para la importancia estadística por medio de la prueba G (Sokal y Rohlf, 1995). La figura 7 muestra el efecto de Ac-rER sobre la amnesia inducida por anisomicina en pollos. Los pollos se inyectaron ic con 8 pg/hemisferio de Ac-rER 60 minutos antes del entrenamiento seguido por la inyección ic de anisomicina (125 nmol/hemisferio), inmediatamente después del entrenamiento. El grupo de control recibió solución salina. Los pollos fueron examinados 3 horas después del entrenamiento. La retención se calculó como el porcentaje en cada grupo que mostraron evitación y discriminación. Cada pollo se entrenó y se probó solo una vez con diferentes entre los grupos se probaron para la importancia estadística por medio de la prueba G (Sokal y Rohlf, 1995). La figura 8 muestra el efecto de Ac-rER sobre la amnesia
inducida por MK801. Los pollos se inyectaron ic con 8 pg/hemisferio de Ac-rER 60 minutos antes del entrenamiento seguido por la inyección ip de MK80 1(0.20 mg/100 g) previos al tratamiento. El grupo de control recibió solución salina. Los pollos fueron examinados 3 horas después del entrenamiento. La retención se calculó como el porcentaje en cada grupo que mostraron evitación y discriminación. Cada pollo se entrenó y se probó solo una vez con diferentes entre los grupos se probaron para la importancia estadística por medio de la prueba G (Sokal y Rohlf, 1995). La figura 9 muestra el efecto de Ac-rER(Me)R inyectado ic sobre el entrenamiento (WT). Los pollos se inyectaron ic con 8 pg/hemisferio de Ac-rE(Me)R 60 minutos antes del entrenamiento y se examinaron 24 horas después. El grupo de control recibió solución salina. La retención se calculó como el porcentaje en cada grupo que mostraron evitación y discriminación. Cada pollo se entrenó y se probó solo una vez con diferentes entre los grupos se probaron para la importancia estadística por medio de la prueba G (Sokal y Rohlf, 1995). La figura 10 muestra el efecto de de Ac-rER(Me)R inyectado ic sobre el entrenamiento (WT). Los pollos se inyectaron ip con 2 pg/g bw de Ac-rE(Me)R 6 horas antes del entrenamiento y se examinaron 24 horas después. El grupo de control recibió solución salina. La retención se calculó como el porcentaje en cada grupo que mostraron evitación y discriminación. Cada pollo se entrenó y se probó solo una vez con diferentes entre los grupos se probaron para
la importancia estadística por medio de la prueba G (Sokal y Rohlf, 1995). Materiales y métodos Animales y entrenamiento Pollos Ross Chunky obtenidos comercialmente se incubaron y se maduraron en incubadoras y se mantuvieron hasta una edad de 16 + 6 horas de edad. Los pollos se colocaron en pares en jaulas de aluminio pequeñas. Después de un periodo de equilibro de una hora, los pollos se pre-entrenaron y se entrenaron esencialmente tal como lo describe Lossner and Rose (J. Neurochem. 41, 1357-1363 (1983), cuyo contenido se incorpora como referencia). El pre-entrenamiento incluye tres presentaciones de 10 s de un pequeña esfera blanca (2 mm de diámetro), aproximadamente con intervalos de 5 minutos. Los pollos que no picaron la esfera cuando menos dos veces en tres presentaciones (menos del 5%) no se usaron subsecuentemente, pero permanecieron en sus jaulas durante el experimento. Se usaron dos técnicas de entrenamiento: el entrenamiento "fuerte" y el "débil". En ambos, 5 a 10 minutos después de la última prueba de entrenamiento, los pollos se entrenaron durante una presentación durante 10 s de una esfera cromada de 4 mm de diámetro, que había sido sumergida en metilantranilato de sabor amargo. Los pollos de control picaron en una esfera recubierta con agua o seca. En la versión "fuerte de la tarea", se uso metilantranilato al 100%. En la versión "débil, se uso 10% de metilantranilato. Los pollos picaron espontáneamente en las esferas de entrenamiento o control en el
transcurso de 20 s. Los pollos que picaron en la esfera amarga evidenciaron una reacción de disgusto, y normalmente no picarían en una esfera similar sino solo en la seca durante algunas horas después. En diferentes momentos después del entrenamiento se examinaron los pollos, ofreciéndoles una esfera cromada seca de 4 mm de diámetro, 10 minutos después siguió una esfera blanca pequeña (2 mm de diámetro), cada una durante 20 a 30 segundos. Los animales fueron examinados por una persona que no sabía que tratamiento había recibido cada pollo. Los pollos se consideran que recuerdan la tarea si evitan la esfera cromada en la prueba pero pican sobre la esfera blanca (discriminan) y que la han olvidado si pican en ambas esferas. El recuerdo se calcula como un porcentaje de la calificación de evitación (porcentaje de pollos que evitan la esfera cromada) y la calificación de discriminación (porcentaje de pollos que evitan la esfera cromada pero qué pican la esfera blanca). El uso de la calificación de discriminación asegura que los pollos de hecho pueden ver y pican precisamente sobre la esfera; y por lo tanto la evitación de la esfera cromada no se debe a factores no específicos tales como falta de coordinación visual-motora, motivación, atención, excitación, etc. pero como un acto positivo, demostrando memoria de un estimulo desagradable. Cada pollo se entreno y se examinó solo una vez y las diferencias entre lo s grupos probados por su importancia estadística por medio de la prueba g como lo describe Sokal y Rohlf biometry: the Principies and Practice of Statistics in Biological Research (2a edición), W H Freeman,
Nueva York (1981)), cuyo contenido se incorpora como referencia. La validez de esta tarea de entrenamiento particular usada para determinar la formación de memoria se discute extensamente por Andrew (Neural and Behavioural Plasticity: the Use of the Domestic Chick as a Model, Oxford University Press, Oxford, UK (1991)), cuyo contenido se incorpora como referencia. Los pollos entrenados con la versión fuerte de la tarea se encontró que recuerdan la evitación durante cuando menos 48 horas, y más del 80% se encontraron que normalmente evitan y discriminan en la prueba a las 24 horas. Por lo tanto si se administran agentes que son amnésicos, esto es provocan que el pollo no recuerde, los pollos demostraran que han olvidado al picar en vez de evitar la esfera cromada durante la prueba. En contraste, los pollos se encontró que normalmente recuerdan la versión "débil " de la tarea solo durante lagunas horas, algunos 6 a 8 horas en total; la retención a las 24 horas se redujo normalmente a aproximadamente 20 a 30%. Así la experiencia de aprendizaje no se reduce a la memoria a largo plazo. Los agentes que son promotores de la memoria pueden así examinarse. Un agente promotor de la memoria, administrado a un pollo entrenado con la esfera cromada, a las 24 horas. Esto es esos promotores de memoria ayudan a convertir el aprendizaje débil a fuerte al permitir la transición de una memoria a corto plazo a una memoria a largo plazo. Inyecciones de péptidos 1. Inyecciones intracraneales (ic): inyecciones intracraneales
bilaterales (8 en 2 µ? /hemisferio) de péptidos derivados de APP se inyectaron intracerebralmente en una región específica del cerebro que se sabe se requiere para la formación de memoria (el hiperestriatum ventral intermedio) en diferentes puntos de tiempo antes y después del entrenamiento usando una jeringa Hamilton de 5 pg provista con un manguito de plástico para permitir la penetración de 3 mm. Después de completar la inyección la aguja se mantuvo en su lugar durante 5 s. La colocación correcta se aseguro usando un soporte especialmente diseñado por Davis et al (Physiol. Behav. 22, 177-184 (1979), cuyo contenido se incorpora como referencia) y se monitoreo visualmente post-mortem. 2. Inyecciones periféricas (ip): Los péptidos de prueba otra sustancias se administraron intraperitonalmente (0.2 ml/pollo) usando una jeringa hipodérmica de 1 mi en diferentes momentos después del entrenamiento tal como se describe antes. El comportamiento general de los pollos después de las inyecciones se observo para detectar cualquier reacción potencial no específica o adversa a las inyecciones. Materiales péptidos Los polipéptidos administrados se sinterizaron usando un sintetizador de péptidos convencional de la manera conocida en la técnica. Los polipéptidos se purificaron por medio del uso de RP-HOLC y la pureza se verifico por medio de. espectrometría de masas (MALDI-TOF), ambas técnicas son bien conocidas para los expertos en la técnica. Los polipéptidos después de la síntesis se mantuvo
bajo argón en un estado liofilizado el argón previne la oxidación de la cisterna, metionina y triptofano en particular. Resultados Experimentales La solicitud de patente internacional WO02/083729 describe un número de péptidos derivados de APP. El péptido pequeño RER en articular ha mostrado ser efectivo como promotor cognoscitivo y protector contra la pérdida de memoria inducida por amiloide beta. Deseamos investigar formas más estables de péptido que podrían servir mejor como agentes terapéuticos potenciales. El método estándar para estabilizar los péptidos es proteger la molécula en la términal N. Esto se logro por medio de acilación. El Ac-RER fue efectivo como promotor cognoscitivo y en la protección contra amiloide beta. Cuando decidimos investigar la bioactividad del de la forma d-isomérica del péptido. Los isómeros D frecuentemente son tóxicos y normalmente no muestran bioactividad similar a las formas L naturales. Sintetizamos las siguientes formas D/L: D-R-L-E-L-R (rER), L-R- D-E-L-R (ReR), L-R-L-E-D-R (REr) y D-R-D-E-D-R (rer) solo una, rER, y su forma acilada Ac-rER, mostraron bio-actividad en un grado similar al RER, siendo activo como promotor cognoscitivo y protector contra la pérdida de memoria inducida por el amiloide beta. La forma ReR del péptido mostró menor bio-actividad, pero aun proporcionar un efecto mejorado cuando se compara con cero péptido, o con las otras formas del péptido. La figura 1 muestra el efecto de diferentes formas D/L de los
tripéptidos sobre la retención de la memoria en pollos entrenados en la tarea de aprendizaje débil. Los pollos se inyectaron ic con diferentes formas D/L del tripeptido 50 minutos de pre-entrenamiento y se examinaron 24 horas después. El grupo de control recibió solución salina. Los datos muestran que Ac-D/L/L (Ac-rER) mejoran la retención a los niveles observados en los pollos tratados con la forma Ac-L/L/L/ (Ac-RER), mientras que Ac-L/D/L (Ac-ReR) mostró significantemente menos efectos. Todas las otras formas son menos biológicamente activos. La figura 2 muestra el efecto de Ac-rR sobre la memoria en pollos con amnesia inducida por ?ß. Los pollos se inyectaron con Ac-rER 2 x inyecciones ip, 1 mg/100 g br, 6 horas y 12 horas de entrenamiento previo. ?ß1-42 se inyectaron ic 50 minutos previamente al entrenamiento. ?ß1-42 es el dominio de APP que forma placas de amiloide ß, y se describe en más detalle por Carrodeagus et al (2005). Los datos muestran que Ac-eER inyectados ya sea 6 o 12 horas antes del entrenamiento restaura la función cognoscitiva y previene la pérdida de memoria que de otra manera sería el resultado de las inyecciones ?ß. Esto confirma que Ac-rEr protege contra la perdida de memoria inducida por ?ß, y así puede ser beneficioso en el tratamiento de déficit cognoscitivos que corran durante el envejecimiento y en trastornos neurodegenerativos incluyendo la enfermedad de Alzheimer. La figura 3 muestra el efecto de Ac-rER como promotor de memoria en pollos entrenados con una tarea de entrenamiento débil
(WT). Los pollos se inyectaron con 2 x inyecciones ip, 1 mg/100 g bw, 30 minutos y 6 horas de entrenamiento previo. El grupo de control recibió Ac-REr. Los resultados muestran que el desempeño en la tarea de entrenamiento débil se mejora significantemente en aquellos animales que recibieron Ac-rEr. Desde el punto de vista del potencial uso terapéutico es importante que esos resultados muestran que Ac-rER es efectivo cuando se inyecta periféricamente. Para probar que esto se debe a la estabilidad de Ac-rER para cursar la barrera sangre-cerebro y ligarse a sitios similares como RER, inyectamos ip e ic Ac-rER etiquetado con fluoresceina y seis horas después se cortaron secciones para el análisis por fluorescencia, la figura 4 compara el enlace de Ac-rER siguiendo esas dos rutas de inyección. Ac-Rer es más estable que Ac-RER ya que puede ser inyectado hasta 12 horas antes del entrenamiento y actuar como promotor cognoscitivo y agente neuroprotector (figuras 2 y 3) contrariamente a las 3 horas máximas de la forma L no protegida (como se describe En WO02/083729). La figura 5 muestra el efecto de dosis diferentes de Ac-rER en pollos entrenados con la tarea de aversión débil. Los datos muestran que una dosis trabaja como 1 mg por 100 g de peso corporal es suficiente para mejorar la memoria en pollos entrenados en tareas de entrenamiento débiles. La figura 6 muestra la persistencia del efecto de Ac-rER cuando se administra a pollos entrenados en una tarea de
enfrenamiento débil. El péptido es efectivo cunado se suministra una única inyección de 1-2 mg/100 g bw cuando mucho 12 horas antes del entrenamiento. Los datos también sugieren que el péptido es el más efectivo cunado se administra entre 2 y 6 horas, y preferentemente 4 horas antes del entrenamiento. También hemos explorado la efectividad de A-rER en la inversión o la protección contra la amnesia inducida por los inhibidores de síntesis de proteína generales (anisomicina; figura 7) y los bloqueadores de los receptores NMDA (MK801; figura 9) ambos agentes amnésicos bien conocidos. Según nuestro conocimiento no hay un agente conocido disponible para invertir los efectos amnésicos de esas sustancias. La anisomicina se administro ic inmediatamente después del entrenamiento, MK801 se administro ip 20 minutos después del entrenamiento previo mientras que Ac-rER se administro ic 30 minutos antes del entrenamiento en experimentos descritos en las figuras 7 y 8. Los resultados demuestran que Ac-rER previenen que cualquiera de esos fármacos inducen la amnesia. Finalmente, también hemos explorado la efectividad de Ac-rE(Me) R en el entrenamiento débil (figuras 9 y 10). El reemplazo del enlace de hidrógeno dentro de la estructura de péptido con el grupo N-metilo debe mejorar aún más la estabilidad del tripéptido D/L. Ac-r-E(Me)R se administro ic o ip 6 horas antes del entrenamiento como se describe en la figura 4 y los pollos fueron examinados 24 horas después. Las figuras 9 (administración ic) y 10 (administración ip) comprar el efecto de Ac-rER después de dos rutas de inyección y
mostró que el análogo de Ac-eER, Ac-rE(Me)R se tolera aun cuando no hay enlace de hidrógeno en el Ac-r-E-(Me)R y que esta molécula mejor a la memoria en ambas condiciones experimentales. Conclusión Estos resultados demuestran que Ac-rER y Ac-ReR proporcionan un efecto benéfico para mejorar el conocimiento y el aprendizaje en animales normales, así como prevenir la amnesia inducida. La acción de Ac-rER contra amnesia inducida ?ß sugiere que el péptidos es efectivo en la reducción de los déficit cognoscitivos asociados con el envejecimiento y la neurodegeneración, y como agente terapéutico para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer. No hay forma de predecir el sorprendente efecto mejorado del péptido rER por adelantado a partir de la actividad conocida del péptido RER original, y descubrimiento de las formas de péptido que son activos comparados con los inactivos proporcionaron información valiosa acerca de las configuraciones estéricas de la molécula que se requieren para ligarse a los sitios receptores putativos en la membrana neuronal. Se entenderá que lo anterior tiene solo propósitos ilustrativos, y que pueden realizarse varias modificaciones a los agentes aquí descritos sin salirse del alcance de la invención. En particular pueden usarse péptidos más largos y peptidomiméticos que incorporen la secuencia rER o ReR, por ejemplo para mejorar la estabilidad o la biodisponibilidad. Una modificación de ese tipo es la incorporación de grupos metilos en la estructura de péptido. Los
péptidos pueden incorporar residuos aminoácidos adicionales preferentemente a partir de proteína humana APP, y preferentemente también de la región de la proteína APP adyacente al patrón RER. Alternativamente o en adición los residuos aminoácidos de otras proteínas pueden incorporarse como pueden ser molécula son peptídicas.