BRPI0618994A2 - tratamento de desordens neurodegenerativas - Google Patents

Abstract

TRATAMENTO DE DESORDENS NEURODEGENERATIVAS. Peptídeos que tem a sequência D-Arg-L-GIu-L-Arg, ou a sequência L-Arg-D-GIu-L-Arg e derivados desses, são descritos. Tais peptideos são úteis no tratamento de desordens neurodegenerativas, e como intensificadores cognitivos. Peptídeos preferidos incluem um grupo protetor.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "TRATAMEN- TO DE DESORDENS NEURODEGENERATIVAS".

CAMPO DA INVENÇÃO

A presente invenção refere-se a um composto que compreende um tripeptídeo, e derivados desse, e ao uso de tal composto no tratamento de desordens neurodegenerativas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

A doença de Alzheimer é uma doença degenerativa do cérebro que é caracterizada por perda progressiva da memória e, subseqüentemen- te, da maioria das outras funções cognitivas em um declínio irreversível ao longo de um período de anos. Ela representa um problema de saúde subs- tancial, particularmente em uma população idosa e atualmente afeta 800.000 pessoas apenas no UK.

Até recentemente, as abordagens terapêuticas para a doença de Alzheimer eram direcionadas para a estabilização da concentração de ace- tilcolina. O uso de inibidores da esterase de acetilcolina resulta em uma me- lhora temporária que não é adequada para parar ou reverter a degeneração. A eficácia desses fármacos foi criticada pela NICE (UK's National Institute for Clinicai Excellence) e há uma necessidade urgente de abordagens mais efi- cazes, baseadas na maior compreensão dos mecanismos bioquímicos sub- jacentes à morte celular neuronal que caracteriza a doença.

Dois efeitos que foram observados ocorrer no cérebro de uma pessoa que sofre de doença de Alzheimer são o acúmulo do lado de fora das células nervosas do cérebro de massas emaranhadas de proteína (pla- cas) e o acúmulo dentro das células cerebrais de uma proteína diferente (e- maranhados neurofibrilares). As proteínas extracelulares são conhecidas por serem agregados de polipeptídeos que tem seqüências de aminoácidos que correspondem às porções beta-amilóides da proteína precursora de amilóide APP. As massas emaranhadas dessas proteínas são conhecidas como pla- cas amilóides. As proteínas intracelulares são conhecidas como proteínas neurofibrilares e tau. Entretanto, não é sabido se um ou ambos o acúmulo extracelular de placas amilóides e o acúmulo intracelular de proteínas neuro- fibrilares são as causas ou sintomas de Alzheimer e doenças neurodegene- rativas relacionadas do tipo Alzheimer.

A família APP consiste em 8 isoformas constituídas por 770, 752, 751, 733, 714, 696, 695 e 677 resíduos de aminoácidos gerados por junção alternativa (veja Selkoe, Annu Rev Neurosci 17, 489-517, 1994). A isoforma presente nos neurônios é conhecida por consistir em 695 resíduos de aminoácidos em uma seqüência conhecida [(veja Kang et al, Nature 325, 733-736 (1987), e Carrodeguas et al, Neuroscience 134, 1285-1300 (2005), cujos conteúdos estão incorporados aqui por referência]. As seqüências de APP-751 de pinto e humana estão comparadas na Figura 1 de Carrodeguas.

APP é uma proteína transmembrana multifuncional e é conheci- da por ter funções importantes no tecido cerebral normal incluindo o cresci- mento neurítico. Regular negativamente a síntese de APP ou bloqueando seu domínio N-terminal extracelular com anticorpos evita a formação da memória de longo prazo em um sistema de modelo animal bem estabelecido para o estudo dos processos moleculares envolvidos na formação da memó- ria, a tarefa de esquiva passiva de primeira passagem em pintinhos jovens (veja Mileusnic et al 2000).

A forma de APP de pintos é conhecida por consistir no mesmo número de resíduos de aminoácidos e por se parecer muito com a forma humana, sendo aproximadamente 95% homóloga a essa. A seqüência de aminoácidos dos aminoácidos de 360 a 460 de APP é idêntica nas formas de APP humana e de pinto (veja Kang et al 1997, Carrodeguas et al 2005, e Barnes et al, J Neurosci, 18 (15) 5869-5880 (1998), cujos conteúdos estão incorporados aqui por referência).

O Pedido de Patente Internacional W002/083729, cujo conteúdo está incorporado aqui por referência, relata que a amnésia induzida em pin- tos pelo bloqueio da síntese ou função de APP ou por injeção de beta- amilóide pode ser impedida pela injeção de um pequeno peptídeo homólogo à parte do domínio de APP que promove o crescimento (resíduos de amino- ácidos de 375 a 392). Relatou-se que um peptídeo particularmente preferido é Arg-Glu-Arg (daqui por diante RER), homólogo aos resíduos 328 a 330 da seqüência de APP humana dada em W002/083729.

A presente invenção está baseada na identificação de um peptí- deo preferido adicional.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Aminoácidos podem existir na forma L de ocorrência natural (de- signados no código de aminoácidos de uma letra pelo uso de letra maiúscu- la) ou na sua forma D isomérica óptica (designados pelo uso da letra minús- cula). Os presentes inventores determinaram que peptídeos da seqüência rER (ou seja, D-Arg-L-Glu-L-Arg) e derivados, são particularmente biologi- camente ativos. Além disso, peptídeos da seqüência ReR (L-Arg-D-Glu-L- Arg) também parecem ser biologicamente ativos embora em um grau menor do que o peptídeo rER.

De acordo com um primeiro aspecto da presente invenção, é fornecido um composto que compreende um peptídeo que tem a seqüência rER, ou um peptídeo que tem a seqüência ReR. Um peptídeo particu- larmente preferido tem a seqüência rER. O peptídeo pode compreender um ou mais grupos protetores, preferivelmente um grupo protetor N-terminal. Em uma modalidade preferida, o grupo protetor é um grupo acila, preferivelmen- te um grupo acetila (Ac-0 rER). Outros grupos protetores acila podem terá fórmula

<formula>formula see original document page 4</formula>

onde R representa um grupo alquila de cadeia linear ou rami- ficada, por exemplo, um grupo metila, etila, n-propila, isopropila, n-butila, isobutila, s-butila, t-butila, pentila ou hexila, um grupo cicloalqüila substituído ou não-substituído, por exemplo, um grupo metilcicloexila ou cicloexila, um grupo aralquila substituído ou não-substituído de cadeia linear ou ramificada, por exemplo, um grupo benzila ou um grupo arila substituído ou não substi- tuído, por exemplo, um grupo fenila ou tolila. Exemplos de substituintes nos grupos substituídos mencionados acima são os grupos alquila também men- cionados acima. Outros grupos protetores adequados podem ser usados (por exemplo, Fmoc, Boc, Alloc).

Ac-rER tem a fórmula estrutural <formula>formula see original document page 5</formula>

(Fórmula I)

Em outras modalidades o grupo protetor pode ser um grupo pro- tetor C terminal.

Preferivelmente, o composto consiste essencialmente em um tripeptídeo que tem a seqüência rER, opcionalmente com um grupo protetor.

Alternativamente, o composto pode consistir essencialmente em um tripeptí- deo que tem a seqüência ReR. Entretanto, em certas modalidades o peptí- deo pode incluir resíduos de aminoácidos adicionais. O peptídeo preferivel- mente compreende não mais do que 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, ou 30 aminoáci- dos adicionais. Em modalidades preferidas, o peptídeo pode incluir resíduos adjacentes à seqüência RER encontrada nos resíduos de aminoácido 328- 330 de APP humano como descrito em W002/083729. Resíduos adicionais preferidos particulares são como descrito em W002/083729. Por exemplo, o peptídeo pode consistir ou compreender qualquer uma das seqüências rER, rERM, e rERMS; ou qualquer uma das seqüências ReR, ReRM, e ReRMS. Alternativamente ou além disso, o peptídeo pode incluir aminoácidos adicio- nais não comuns, por exemplo, outros D-aminoácidos ou aminoácidos que não ocorrem naturalmente em mamíferos. O peptídeo pode compreender um tripeptídeo que tem a seqüência rER (ou a seqüência ReR), opcionalmente com um grupo protetor, conjugado a outra seqüência de peptídeo não rela- cionada com APP humano; por exemplo, uma seqüência de imunoglobulina, uma seqüência rótuloa ou semelhantes. O composto pode compreender um tripeptídeo que tem a seqüência rER (ou a seqüência ReR) conjugada com uma molécula não peptídica; por exemplo, um rótulo fluorescente, radioativo ou outro. A invenção também fornece compostos que compreendem um derivado do peptídeo rER ou um derivado do peptídeo ReR. Derivados po- dem incluir sais; aminoácidos modificados, em particular aminoácidos modi- ficados por metilação, amidação, acetilação ou substituição por outros gru- pos químicos. Preferivelmente, as modificações são selecionadas para alte- rar a meia-vida circulante do peptídeo sem afetar adversamente a atividade. Derivados podem incluir miméticos de peptídeo, por exemplo, onde o arca- bouço do peptídeo foi substituído ou trocado. Em certas modalidades, o ar- cabouço do peptídeo pode ser modificado para incluir um grupo metila, dan- do, por exemplo, o peptídeo Ac-rE-(Me)R. Outras modificações podem ser usadas para aumentar a estabilidade do peptídeo ou derivados. Peptídeos ou derivados da presente invenção podem ser rotulados; por exemplo, pela conjugação com um rótulo detectável. Rótulos adequados incluem ouro ou rótulos fluorescentes, rótulos que têm atividade enzimática e semelhantes.

A presente invenção ainda fornece um composto que compre- ende um peptídeo que tem a seqüência rER ou a seqüência ReR ou um de- rivado desses, para uso como um medicamento. Também é fornecido o uso de um composto que compreende um peptídeo que tem a seqüência rER ou a seqüência ReR ou um derivado desses, na preparação de um medicamen- to para tratamento de uma desordem neurodegenerativa. Preferivelmente, a desordem é doença de Alzheimer. A presente invenção ainda fornece o uso de um composto que compreende um peptídeo que tem a seqüência rER ou a seqüência ReR ou um derivado desses na preparação de um medicamen- to para aumentar a função cognitiva.

Aspectos adicionais da presente invenção referem-se a métodos para tratamento de uma doença neurodegenerativa, preferivelmente doença de Alzheimer; ou a métodos para aumentar a função cognitiva. Os métodos compreendem administrar um composto que compreende um peptídeo que tem a seqüência rER, ou a seqüência ReR1 ou um derivado desses, a um indivíduo. Preferivelmente, o indivíduo é ser humano. O peptídeo pode ser administrado de qualquer maneira conveniente; por exemplo, por injeção subcutânea, administração intravenosa, oralmente, transdermicamente, na- salmente, retalmente, parenteralmente ou por administração pulmonar. Ní- veis de dosagem adequados dependerão, entre outros fatores, da natureza e severidade da desordem a ser tratada; idade, peso e sexo do indivíduo; da via de administração; e de potenciais interações com quaisquer outros tra- tamentos que o indivíduo esteja recebendo. Níveis de dosagens preferidos podem estar entre 0,1 a 100 mg de substância ativa por kg de peso corporal do indivíduo; preferivelmente entre 0,5 a 50 mg/kg; e mais preferivelmente entre 1 a 25 mg/kg.

De acordo com um aspecto adicional da invenção é fornecida uma formulação farmacêutica que compreende um composto que compre- ende um peptídeo que tem a seqüência rER, ou a seqüência ReR, ou um derivado desses. A formulação pode compreender um veículo farmaceuti- camente aceitável. Sistemas de liberação que podem ser usados com a in- venção incluem, por exemplo, géis aquosos e não-aquosos, cremes, emul- sões múltiplas, microemulsões, lipossomas, ungüentos, soluções aquosas e não-aquosas, loções, aerossóis, pós e bases de hidrocarbonetos e podem conter excipientes tais como solubilizantes, intensificadores de permeação (por exemplo, ésteres de ácidos graxos, alcoóis graxos e aminoácidos) e polímeros hidrofílicos (por exemplo, policarbofil e polivinilpirrolidona).

Uma formulação farmacêutica da invenção está em uma forma adequada para administração, por exemplo, administração sistêmica, tópica ou local, em uma célula ou indivíduo, incluindo, por exemplo, um ser huma- no. Formas adequadas, em parte, dependem do uso ou da via de entrada, por exemplo, oral, transdérmica ou por injeção. Outros fatores são conheci- dos na técnica e incluem considerações tais como toxicidade e formas que impedem a composição ou formulação de exercer seu efeito.

A presente invenção também inclui composições preparadas para armazenamento ou administração que incluem o peptídeo desejado ou derivado em um veículo ou diluente farmaceuticamente aceitável. Veículos ou diluentes aceitáveis para uso terapêutico são bem-conhecidos na técnica farmacêutica. Por exemplo, conservantes, estabilizantes, corantes e agentes flavorizantes podem ser fornecidos. Esses incluem benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxíbenzóíco. Além disso, agentes antioxi- dantes e de suspensão podem ser usados.

As formulações da invenção podem ser administradas em formu- lações de unidade de dosagem que contém transportadores, adjuvantes e/ou veículos convencionais não-tóxicos farmaceuticamente aceitáveis. As formulações podem estar em uma forma adequada para uso oral, por exem- plo, como comprimidos, pastilhas, pílulas, suspensões aquosas ou oleosas, pós ou grânulos dispersíveis, emulsão, cápsulas duras ou moles, xaropes ou elixires. As composições pretendidas para uso oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica para a produção de composições farmacêuticas e tais composições podem conter um ou mais de tais agentes adoçantes, agentes flavorizantes, agentes corantes ou agen- tes conservantes a fim de fornecer preparações farmaceuticamente agradá- veis e palatáveis. Os comprimidos podem conter o ingrediente ativo em mis- tura com excipientes não-tóxicos farmaceuticamente aceitáveis·que são a- dequados para a produção de comprimidos.

Esses excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes; tais como carbonato de cálcio, carbonato de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio; agentes de granulação e desintegrantes, por exemplo, amido de milho ou ácido algínico; agentes aglutinantes, tal como amido, ge- latina ou acácia; e agentes lubrificantes, por exemplo estearato de magné- sio, ácido esteárico ou talco. Os comprimidos podem não ter revestimento ou eles podem ser revestidos por técnicas conhecidas. Em alguns casos, tais revestimentos podem ser preparados por técnicas conhecidas para retardar a desintegração e absorção no trato gastrintestinal e, dessa maneira, forne- cer uma ação sustentada durante um longo período. Por exemplo, um mate- rial retardo de tempo tal como monoestearato de glicerila ou diestearato de glicerila pode ser empregado.

Formulações para uso oral também podem ser apresentadas como cápsulas de gelatina dura em que o ingrediente ativo está misturado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulim, ou como cápsulas de gelatina mole em que o ingrediente ativo está misturado com água ou um meio oleoso, por exemplo, óleo de amendoim, parafina líquida ou óleo de oliva.

Suspensões aquosas contêm os materiais ativos em uma mistu- ra com excipientes adequados para a produção de suspensões aquosas.

Tais excipientes são agentes de suspensão, por exemplo, carboximetilcelu- Iose de sódio, metilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma tragacanto e goma acácia; agentes dispersantes ou umectantes podem ser um fosfolipídio de ocorrência natural, por exemplo, lecitina ou produtos de condensação de óxido de etileno com alcoóis alifáti- cos de cadeia longa, por exemplo, heptadecaetilenoxicetanol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de áci- dos graxos e um hexitol tal como monooleato de polioxietileno sorbitol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo, monooleato de polioxi- etileno sorbitano. As suspensões aquosas também podem conter um ou mais conservantes, por exemplo, etila ou n-propila p-hidroxibenzoato, um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes flavorizantes e um ou mais a- gentes adoçantes, tais como sacarose ou sacarina.

Suspensões oleosas podem ser formuladas pela suspensão dos ingredientes ativos em um óleo vegetal, por exemplo, óleo de amendoim, óleo de oliva, óleo de gergelim ou óleo de coco ou em um óleo mineral tal como parafina líquida. As suspensões oleosas podem conter um agente es- pessante, por exemplo, cera de abelhas, parafina dura ou álcool cetílico. A- gentes adoçantes e agentes flavorizantes podem ser adicionados para for- necer preparações orais palatáveis. Essas composições podem ser preser- vadas pela adição de um antioxidante tal como ácido ascórbico.

Pós dispersíveis e grânulos adequados para a preparação de uma suspensão aquosa pela adição de água fornecem o ingrediente ativo em mistura com um agente dispersante ou umectante, agente de suspensão e um ou mais conservantes. Agentes dispersantes ou umectantes ou agentes de suspensão adequados são exemplificados por aqueles mencionados a - cima. Excipientes adicionais, por exemplo, agentes adoçantes, flavorizantes e corantes, também podem estar presentes.

Composições farmacêuticas da invenção também podem estar na forma de emulsões óleo-em-água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal ou um óleo mineral ou misturas desses. Agentes emulsificantes adequados podem ser gomas de ocorrência natural, por exemplo, goma acácia, ou go- ma tragacanto, fosfatídeos de ocorrência natural, por exemplo, feijão de so- ja, lecitina, e ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos graxos e hexi- tol, anidridos, por exemplo, monooleato de sorbitano, e produtos de conden- sação dos ditos ésteres parciais com óxido de etileno, por exemplo, polioxie- tileno sorbitano. As emulsões também podem contar agentes adoçantes e flavorizantes.

Xaropes e elixires podem ser formulados com agentes adoçan- tes, por exemplo, glicerol, propileno glicol, sorbítol, glicose e sacarose. Tais formulações também podem conter um emoliente, um conservante e agen- tes flavorizantes e corantes. As composições farmacêuticas podem estar na forma de uma suspensão aquosa ou oleaginosa injetável estéril.

Essa suspensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida usando agentes dispersantes ou umectantes e agentes de sus- pensão que foram mencionados acima.

Uma preparação injetável estéril também pode ser uma solução ou suspensão injetável estéril em um diluente ou solvente atóxico parente- ralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,3-butanodiol. En- tre os veículos e solventes aceitáveis que podem ser empregados estão á- gua, solução de Ringer e solução de cloreto de sódio isotônica. Além disso, óleos estéreis, fixos são convencionalmente empregados como um solvente ou meio de suspensão. Para essa finalidade, qualquer óleo fixo brando pode ser empregado incluindo mono- ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, áci- dos graxos tal como ácido oléico encontram uso na preparação de injetáveis.

Os compostos da invenção também podem ser administrados na forma de supositórios, por exemplo, para administração retal do fármaco. Essas composições podem ser preparadas pela mistura do fármaco com um excipiente não irritante adequado que é sólido em temperaturas ambientes, mas líquido na temperatura retal e, portanto irá derreter no reto para liberar o fármaco. Tais materiais incluem manteiga de cacau e polietileno glicóis.

Os peptídeos e derivados da presente invenção também podem ser administrados a um indivíduo em combinação com outros compostos terapêuticos para aumentar o efeito terapêutico geral. O uso de múltiplos compostos para tratar uma indicação pode aumentar os efeitos benéficos enquanto reduz a presença de efeitos colaterais.

De acordo com um aspecto adicional da presente invenção, é fornecido um anticorpo que se liga especificamente a um peptídeo que tem a seqüência de rER, ou um anticorpo que se liga especificamente a um peptí- deo que tem a seqüência de ReR. Por "se liga especificamente" entende-se que o anticorpo se liga ao peptídeo em um nível que é significativamente maior do que qualquer Iigante inespecífico que pode ser observado. Será entendido por um versado na técnica que um anticorpo específico para o peptídeo rER (ou para o peptídeo ReR) pode, apesar disso, ainda se ligar a outros antígenos que têm um epítopo similar. Anticorpos específicos podem ser preparados por imunizar um indivíduo humano com uma preparação que compreende o peptídeo rER (ou o peptídeo ReR) da invenção. O anticorpo da invenção pode ser policlonal ou monoclonal. Os anticorpos da invenção podem compreender anticorpos recombinantes, quiméricos ou humanizados.

A invenção também fornece fragmentos imunologicamente ativos de tais anticorpos, em particular fragmentos F(ab) e F(ab')2-

Anticorpos da invenção podem ser usados para rastrear outros compostos, a fim de identificar potenciais moléculas candidatas que tem ati- vidade similar ao peptídeo rER. Dessa forma, a invenção também fornece um método para identificar um composto que tem atividade útil para o trata- mento de desordens neurodegenerativas, ou útil no aumento da função cog- nitiva, o método compreendendo colocar um composto candidato em contato com um anticorpo específico para um peptídeo que tem a seqüência rER, ou a seqüência ReR, e determinar se o anticorpo se liga ao composto.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

Esses e outros aspectos da presente invenção serão agora des- critos como forma de exemplo apenas e com relação aos desenhos anexos, que mostram:

Figura1 - O efeito de diferentes formas D/L de tripeptídeo como intensificadores de memória sobre memória fraca.

Figura2 - O efeito de Ac-rER sobre a memória em pintinhos com amnésia induzida por Αβ.

Figura3 - O efeito de Ac-rER como intensificador de memória em pintinhos treinados em uma tarefa de treinamento fraca (WT).

Figura4 - Distribuição de Ac-rER rotulado com fluoresceína em cérebro de pinto. O tripeptídeo foi injetado ip e ic.

Figuraõ - Dependência de dose do efeito de Ac-rER em treina- mento fraco.

Figura6 - Estabilidade de Ac-rER

Figura7 - Efeito de Ac-rER sobre amnésia induzida por Anisomi- cina em pintos.

Figura8 - Efeito de Ac-rER sobre amnésia induzida por MK801.

Figura9 - Efeito de Ac-rE(Me)R injetado ic sobre o treinamento fraco (WT).

Figura10- Efeito de Ac-rE(Me)R injetado ip sobre treinamento fraco (WT).

DESCRIÇÃO DETALHADA DOS DESENHOS

Figura 1 - O efeito de diferentes formas D/L de tripeptídeo como in- tensificadores de memória em memória fraca. Pintinhos foram injetados i.c. com diferentes formas D/L de tripeptídeo 60 min antes do treinamento e tes- tados 24 horas após. O grupo de controle recebeu solução salina. A reten- ção foi calculada como o percentual em cada grupo que mostrou esquiva e discriminação. Cada pintinho foi treinado apenas uma vez e as diferenças entre os grupos foram testadas quando ao significado estatístico por teste-G (Sokal, & Rohlf, 1995). Observe que o teste-G reflete as diferenças entre os grupos, e então não há barras de erro sobre as figuras.

Figura 2 - O efeito de Ac-rER sobre a memória em pintinhos com amnésia induzida por Αβ. Os pintinhos foram injetados 2 χ ip, I mg/100 gr de peso corporal, com Ac-rER, 6 hr e 12 hr antes do treinamento. ΑβΙ-42 (2 μg/hemisferio) foi injetado ic 60 min antes do treinamento. Os pintinhos fo- ram testados 24 hr depois. A retenção foi calculada como o percentual em cada grupo que mostrou esquiva e discriminação. Cada pintinho foi treinado e testado apenas uma vez e as diferenças entre os grupos foram testadas quanto ao significado estatístico por teste-G (Sokal, & Rohlf, 1995).

Figura 3 - O efeito de Ac-rER como intensificador de memória em pintinhos treinados em um tarefa de treinamento fraca (WT) de uma se- mana. Os pintinhos foram injetados 2 χ injeções ip, 1 mg/100 gr de peso corporal, 30 min e 6 hr antes do treinamento e testados 24 hr depois. Os grupos de controle receberam Ac-REr. A retenção foi calculada como o per- centual em cada grupo que mostrou esquiva e discriminação. Cada pintinho foi treinado e testado apenas uma vez e as diferenças entre os grupos foram testadas quando ao significado estatístico por teste-G (Sokal, & Rohlf, 1995).

Figura 4 - Distribuição de Ac-rER rotulado com fluoresceína em cérebro de pinto. A Fluoresceína- Ahx- Ahx-rER foi injetada ip (2 mg/100 gr de peso corporal) e ic (8 Mg/hemisfério) 6 hr antes de seccionar os cérebro para análise da distribuição do rER rotulado com fluoresceína. O painel da esquerda mostra a distribuição do rER rotulado com fluoresceína após inje- ção ip. Observe que a distribuição da fluorescência é quase idêntica.

Figura 5 - Dependência de dose do efeito de Ac-rER em treina- mento fraco. Os pintinhos foram injetados ip com doses diferentes de Ac-rER 60 min antes do treinamento e testados 24 hr depois. O grupo de controle recebeu solução salina. A retenção foi calculada como o percentual em cada grupo que mostrou esquiva e discriminação. Cada pintinho foi treinado e tes- tado apenas uma vez e as diferenças entre os grupos foram testadas quan- do ao significado estatístico por teste-G (Sokal, & Rohlf, 1995).

Figura 6 - Estabilidade de Ac-rER. Pintinhos foram injetados ip com 2 mg/1 OOg de peso corporal de Ac-rER 1, 2, 4, 6 e 12 hr antes do trei- namento e testados 24 hr depois. O grupo de controle recebeu solução sali- na. A retenção foi calculada como o percentual em cada grupo que mostrou esquiva e discriminação. Cada pintinho foi treinado e testado apenas uma vez e as diferenças entre os grupos foram testadas quando ao significado estatístico porteste-G (Sokal, & Rohlf1 1995).

Figura 7 - Efeito de Ac-rER sobre a amnésia induzida por Ani- somicina em pintinhos. Os pintinhos foram injetados ic com 8 Mg/hemisfério de Ac-rER 60 min antes do treinamento seguido por injeção ic de Anisomici- na (125 nmol/hemisfério), imediatamente após o treinamento. Os controles foram injetados com solução salina. Os pintinhos foram testados 3 hr após o treinamento. A retenção foi calculada como o percentual em cada grupo que mostrou esquiva e discriminação. Cada pintinho foi treinado e testado ape- nas uma vez e ás diferenças entre os grupos foram testadas quanto ao signi- ficado estatístico porteste-G (Sokal, & Rohlf, 1995).

Figura 8 - Efeito de Ac-rER sobre amnésia induzida por MK801. Os pintinhos foram injetados ic com 8 pg/hemisfério de Ac-rER 60 min antes do treinamento seguido por injeção ip de MK80 1 (0,020 mg/100 gr) antes do treinamento. Os controles foram injetados com solução salina. Os pintinhos foram testados 3 horas depois. A retenção foi calculada como o percentual em cada grupo que mostrou rejeição e discriminação. Cada pintinho foi tes- tado apenas uma vez e as diferenças entre os grupos foram testadas quanto ao significado estatístico por teste-G (Sokal, & Rohlf, 1995).

Figura 9 - Efeito de Ac-rE(Me)R injetado ic Ac-rE(Me)R sobre treinamento fraco (WT). Os pintinhos foram injetados ic com 8 pg/hemisfério de Ac-rE(Me)R 60 min antes do treinamento e testados 24 hr depois. Os controles foram injetados com solução salina. A retenção foi calculada como o percentual em cada grupo que mostrou esquiva e discriminação. Cada pin- tinho foi treinado e testado apenas uma vez e as diferenças entre os grupos foram testadas quando ao significado estatístico por teste-G (Sokal, & Rohlf, 1995).

Figura 10 - Efeito de Ac-rE(Me)R injetado ip sobre treinamento fraco (WT). Pintinhos foram injetados ip com 2 mg/1 OO gr de peso corporal de Ac-rE(Me)R 6 hr antes do treinamento e testados 24 hr depois. Os contro- les foram injetados com solução salina. A retenção foi calculada como o per- centual em cada grupo que mostrou esquiva e discriminação. Cada pintinho foi treinado e testado apenas uma vez e as diferenças entre os grupos foram testadas quanto ao significado estatístico por teste-G (Sokal, & RoMf5 1995).

Materiais e Métodos

Animais e Treinamento

Ovos de Ross Chunky obtidos comercialmente foram incubados e chocados em chocadeiras e mantidos até 16 ± 6 horas de idade. Os pinti- nhos foram colocados em pares em pequenos galinheiros de alumínio. Após um período de equilíbrio por uma hora, os pintinhos foram pré-treinados e treinados essencialmente como descrito por Lossner & Rose (J. Neurochem. 41, 1357-1363 (1983), cujo conteúdo está incorporado aqui por referência).

O pré-treinamento envolveu três apresentações de 10 s de uma pequena esfera branca (2 mm de diâmetro) em intervalos de aproximadamente 5 mi- nutos. Os que pintinhos não conseguiram bicar a esfera pelo menos duas vezes em três apresentações (menos do que 5%), não foram usados subse- qüentemente, mas permaneceram nos seus galinheiros durante a duração do experimento. Duas técnicas de treinamento foram usadas: treinamento "forte" e "fraco". Em ambos, 5 a 10 minutos após o último teste de pré- treinamento, os pintinhos foram treinados por uma apresentação de 10 s de um esfera de cromo de 4 mm de diâmetro, que havia sido imersa em meti- lantranilato que tem sabor amargo. Os pintinhos de controle bicaram uma esfera coberta com água ou seca. Na versão "forte" da tarefa, metilantranila- to a 100% foi usado. Na versão "fraca" metilantranilato a 10% foi usado. Os pintinhos bicaram espontaneamente as esferas de treinamento ou de contro- le por 20 s. Os pintinhos que bicaram a esfera amarga evidenciaram uma reação de aversão e normalmente não bicariam uma esfera similar, mas uma esfera seca por algumas horas subseqüentes. Em vários momentos após o treinamento os pintinhos foram testados, por oferecer a eles uma es- fera de cromo seca de 4 mm de diâmetro, seguido 10 minutos depois por uma pequena esfera branca (2 mm de diâmetro), cada por 20 a 30 s. Os a- nimais foram testados por um experimentador cego em relação a qual trata- mento cada pintinho havia recebido. Julga-se que os pintinhos lembraram a tarefa se eles evitam a esfera de cromo no teste, mas bicam a esfera branca (discriminação), e que esqueceram se eles bicam ambas as esferas. A lem- brança é calculada como o percentual do escore de esquiva (percentual de pintinhos que evitaram a esfera de cromo) e como um escore de discrimina- ção (porcentagem de pintinhos que evitaram a de cromo, mas bicaram a es- fera branca). O uso de escore de discriminação garante que os pintinhos podem de fato ver e bicar exatamente a esfera; e por esse motivo a esquiva da esfera de cromo não é devido a fatores inespecíficos tal como falta de coordenação visuo-motora, motivação, atenção, excitação, etc., mas é um ato positivo, demonstrando memória para o estímulo desagradável. Cada pintinho foi treinado e testado apenas uma vez e as diferenças entre os gru- pos testados quanto ao significado estatístico por teste-G descrito por Sokal & Rohlf (Biometry: the Principies and Practice cujo conteúdo está incorpora- do aqui por referência. A validade dessa tarefa de treinamento particular u- sada para avaliar a formação de memória é extensivamente discutida por Andrew (Neural and Behavioural Plasticity: the Use of the Domestic Chick as a Model, Oxford University Press, Oxford, UK (1991)), cujos conteúdos estão incorporados aqui por referência.

Verificou-se que os pintinhos treinados na versão forte da tarefa lembraram a esquiva por pelo menos 48 horas, e mais do que 80% esquiva- ram e discriminaram normalmente o teste em 24 horas. Portanto se agentes que são amnésicos - isto é, fazem com que o pintinho não se lembre - forem administrados, os pintinhos demonstrarão esquecimento por bicar ao invés de evitar a esfera de cromo no teste. Em contraste, verificou-se que os pinti- nhos normalmente lembravam a versão "fraca" da tarefa por apenas algu- mas horas - 6 a 8 horas no total; retenção em 24 horas foi normalmente re- duzida para 20 a 30%. Dessa forma a experiência de aprendizado não está comprometida à memória de longo prazo. Agentes que são intensificadores de memória podem então ser testados. Um agente intensificador de memó- ria, administrado a um pintinho treinado na tarefa de aprendizado fraca, pro- duz um aumento na retenção - esquiva aumentada da esfera de cromo - em 24 horas. Isto é, tais intensificadores de memória ajudam a converter o a- prendizado fraco em forte por permitir a transição de memória de curto em longo prazo.

Injeções de peptídeo

1. Injeções intracranianas (ic): injeções intracranianas bilaterais (8 μς em 2 μI/hemisfério) de peptídeos derivados de APP foram injetadas intracerebralmente em uma região específica do cérebro conhecida por ser necessária para a formação de memória (o hiperestriado ventral intermediá- rio) em diferentes pontos de tempo antes ou após o treinamento usando uma seringa Hamilton de 5pg adaptada com uma conexão de plástico para permi- tir uma penetração de 3 mm. Após o termino da injeção, a agulha foi mantida no lugar por 5 s. A colocação correta foi certificada pelo uso de um suporte de cabeça especialmente projetado descrito por Davis et ai (Physiol. Behav. 22, 177-184 (1979), cujos conteúdos estão incorporados aqui por referência) e foi monitorada visualmente rotineiramente após a morte.

2. Injeções periféricas (ip): Os peptídeos de teste ou outras substâncias foram administrados intraperitonealmente (0,2 ml/pintinho) u- sando uma seringa hipodérmica de 1 ml em vários momentos antes e após o protocolo de treinamento. Após o término da injeção, a agulha foi mantida no lugar por 3 seg. Os pintinhos foram testados em diferentes momentos após o treinamento como descrito acima. O comportamento geral dos pintinhos a- pós as injeções foi observado para detectar quaisquer reações adversas ou inespecíficas às injeções.

Materiais de peptídeos

Os polipeptídeos administrados foram sintetizados usando um sintetizador de peptídeo convencional de uma forma que é bem-conhecida daqueles versados na técnica. Os polipeptídeos sintetizados foram purifica- dos pelo uso de RP-HPLC e a pureza foi ainda confirmada por espectrome- tria de massa (MALDI-TOF), ambas as técnicas sendo bem-conhecidas da- queles versados na técnica. Os polipeptídeos após síntese foram mantidos sob argônio em um estado liofilizado, o argônio impedindo a oxidação de cisteína, metionina e triptofano em particular. Resultados Experimentais

O Pedido de Patente Internacional W002/083729 descreve vá- rios peptídeos derivados de APP. O pequeno peptídeo RER em particular foi mostrado ser eficaz como um intensificador e protetor cognitivo contra perda de memória induzida por amilóide beta. Deseja-se investigar formas mais estáveis do peptídeo que poderiam servir melhor como potenciais agentes terapêuticos.

A abordagem padrão de estabilizar peptídeos é proteger a molé- cula N-terminalmente. Isso foi obtido por acilação. Ac-RER foi eficaz como um intensificador cognitivo e em proteger contra amilóide-beta.

Então decidiu-se investigar a bioatividade da forma d-isomérica do peptídeo. D-isôrneros são freqüentemente tóxicos e normalmente não mostram bioatividade similar como as formas-L de ocorrência natural. Foi sintetizada as seguintes formas D/L: D-R-L-E-L-R (rER), L-R- D-E-L-R (ReR)1 L-R-L-E-D-R (REr) e D-R-D-E-D-R (rer) Apenas uma forma, rER, e sua forma acilada Ac-rER, mostraram bioatividade em um nível semelhante ao RER, sendo eficazes como um intensificador cognitivo e protegendo con- tra perda de memória induzida por amilóide beta. A forma ReR do peptídeo mostrou menos bioatividade, mas ainda forneceu um efeito melhorado quando comparado a sem uso de peptídeo, ou com as outras formas do peptídeo.

A Figura 1 mostra o efeito de diferentes formas D/L dos tripeptí- deos sobre a retenção de memória em pintinhos treinados no teste de a - prendizado de aversão fraco. Os pintinhos foram injetados com diferentes formas D/L de tripeptídeo 60 min antes do treinamento e testados 24 depois. O grupo de controle recebeu solução salina. Os dados mostram que Ac- D/L/L (Ac-rER) aumenta a retenção de memória aos níveis observados no pintinho tratado com a forma Ac-L/UU (Ac-RER), enquanto que Ac-L/D/L (Ac-ReR) mostrou efeitos significativos mas menores. Todas as outras for- mas são menos ativas biologicamente.

A Figura 2 mostra o efeito de Ac-rER sobre a memória em pinti- nhos com amnésia induzida por Αβ. Os pintinhos foram injetados com 2 χ injeções ip de Ac-rER, 1 mg/100 gr de peso corporal, 6 hr e 12 hr antes do treinamento. ΑβΙ-42 foi injetado ic 60 min antes do treinamento. ΑβΙ-42 é o domínio de APP que forma placas β amilóides, e é descrito em mais detalhe em Carrodeguas et a/(2005). Os dados mostram que Ac-rER injetado 6 ou 12 horas antes do treinamento restabelece a função cognitiva e evita perda de memória que poderia de outra forma ser o resultado das injeções de Αβ. Isso confirma que Ac-rER protege contra a perda de memória induzida por Αβ, e assim pode ser de benefício no tratamento de déficits cognitivos que ocorrem o envelhecimento e em desordens neurodegenerativas incluindo doença de Alzheimer.

Figura 3 mostra o efeito de Ac-rER como intensificador de me- mória em pintinhos treinados em uma tarefa de treinamento fraca (WT). Os pintinhos foram injetados com 2 χ injeções ip, 1 mg/100 gr de peso corporal, 30 min e 6 hr antes do treinamento. O grupo de controle recebeu Ac-REr. Os resultados mostram que o desempenho sobre o treinamento fraco é aumen- tado significativamente naqueles animais aos quais foi dado Ac-rER.

Importante a partir do ponto de vista de potencial uso terapêuti- co, esses resultados mostram que Ac-rER é eficaz quando injetado periferi- camente. Para provar que isso foi por causa da capacidade de Ac-rER cru- zar a barreira hemato-encefálica e se ligar a sítios similares aos de RER, injetamos Ac-rER rotulado com fluoresceína ip e ic e seis horas depois as seções para análise de fluorescência são cortadas. A Figura 4 compara a ligação de Ac-rER após essas duas vias de injeção. Ac-rER é mais estável do que Ac-RER já que ele pode ser injetado até 12 horas antes do treina- mento, e age como intensificador cognitivo e agente neuroprotetor (Figuras 2 e 3) de forma oposta às 3 horas máximas da forma-L não protegida (como descrito em W002/083729).

A Figura 5 mostra o efeito de diferentes doses de Ac-rER em pintinhos treinados em uma tarefa de aversão fraca. Os dados mostram que uma dose tão baixa quanto 1 mg por 100 g de peso corporal é suficiente pa- ra aumentar a memória em pintinhos treinados em uma tarefa de treinamento fraca. A figura 6 mostra a persistência do efeito de Ac-rER quando ad- ministrado a pintinhos treinados em uma tarefa de treinamento fraca. O pep- tídeo é eficaz quando uma única injeção de 1 -2 mg/100 g de peso corporal é dada até 12 antes do treinamento. Os dados também sugerem que o peptí- deo é mais eficaz quando administrado entre 2 e 6 horas, e preferivelmente 4 horas, antes do treinamento.

Também explorou-se a eficácia de Ac-rER em reverter ou prote- ger contra amnésia induzida por inibidores de síntese de proteína geral (ani- somicina; Figura 7) e bloqueadores de receptores de NMDA (MK801; Figura 8), ambos agentes amnésicos bem-conhecidos. Não é de conhecimento que exista nenhum agente conhecido disponível para reverter os efeitos amnési- cos dessas substâncias. A anisomicina foi administrada ic imediatamente após o treinamento, MK801 foi dado ip 20 min antes do treinamento enquan- to que o Ac-rER foi administrado ic 30 min antes do treinamento em experi- mentos descritos nas Figuras 7 e 8. Os resultados demonstram que Ac-rER evita que qualquer um desses fármacos induza amnésia.

Finalmente, exploramos a eficácia de Ac-rE(Me)R no treinamen- to fraco (Figura9 e 10). A substituição da ponte de hidrogênio dentro da es- trutura principal de peptídeo com o grupo N-metila deveria aumentar ainda mais a estabilidade do tripeptídeo D/L. Ac-r-E- (Me)R foi administrado ic ou ip 6 hr antes do treinamento conforme descrito na Figura 4 e os pintinhos foram testados 24 hr depois. As Figuras 9 (administração ic) e 10 (adminis- tração ip) comparam o efeito de Ac-rER após duas vias de injeção e mos- tram que o análogo metilado do Ac-rER, Ac-rE(Me)R é tolerado mesmo que não aja ponte de hidrogênio no Ac-r-E- (Me)R e que esta molécula aumenta a memória em ambas as condições experimentais.

Conclusão

Esses resultados demonstram que Ac-rER e Ac-ReR fornecem um efeito benéfico para aumentar a cognição e o aprendizado em animais normais, assim como, evitando amnésia induzida. A ação de Ac-rER contra amnésia induzida por Αβ sugere que o peptídeo será eficaz em reduzir os déficits cognitivos associados com o envelhecimento e neurodegeneração, e assim como um agente terapêutico para o tratamento de doença de Alzhei- mer. Não há forma de prever o efeito aumentado surpreendente do peptídeo rER antecipadamente a partir da atividade conhecida do peptídeo RER origi- nal, e a descoberta das formas do peptídeo que são ativas em comparação com as inativas fornece informação valiosa sobre as configurações estéricas da molécula que são necessárias para se ligar aos seus supostos receptores sobre a membrana neuronal.

Será compreendido que o antecedente é apenas para fins ilus- trativos, e que várias modificações podem ser feitas aos agentes descritos aqui sem se afastar do escopo da invenção. Em particular, peptídeos e pep- tidomiméticos mais longos que incorporam a seqüência de rER ou ReR po- dem ser usados. Modificações adicionais podem ser feitas ao peptídeo rER ou R e R, por exemplo, para aumentar a estabilidade ou biodisponibilidade.

Uma tal modificação é a incorporação de grupos metila na estrutura principal peptídica. Os peptídeos podem incorporar resíduos de aminoácidos adicio- nais, preferivelmente da proteína APP humana, e preferivelmente também da região da proteína APP adjacente ao motivo de RER. Alternativamente, ou além disso, resíduos de aminoácido de outras proteínas podem ser incor- porados, assim como moléculas não-peptídicas.

Claims (21)

1. Método para aumentar a função cognitiva em um indivíduo normal, que compreende administrar um composto que compreende um peptídeo que tem a seqüência rER (D-Arg-L-GIu-L-Arg), ou a seqüência ReR (L-Arg-D-GIu-Arg) a um indivíduo.

2. Método para aumentar a memória em um indivíduo normal, que compreende administrar um composto que compreende um peptídeo que tem a seqüência rER (D-Arg-L-GIu-L-Arg), ou a seqüência ReR (L-Arg- D-Glu-Arg) a um indivíduo.

3. Uso de um composto que compreende um peptídeo que tem a seqüência rER, ou a seqüência ReR, na preparação de um medicamento para o tratamento de memória debilitada.

4. Uso de acordo com a reivindicação 3, em que a memória de- bilitada é amnésia.

5. Método para identificar um composto que tem atividade útil para o tratamento de memória debilitada ou útil no aumento da função cogni- tiva, o método compreendendo colocar um composto candidato em contato com um anticorpo específico para um peptídeo que tem a seqüência rER, ou com um anticorpo específico para um peptídeo que tem a seqüência ReR, e determinar se o anticorpo se liga ao composto.

6. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 5, ou o uso como definido na reivindicação 3 ou 4, em que o peptídeo tem a seqüência rER.

7. Método de acordo com a reivindicação 1, 2 ou 5, ou o uso como definido na reivindicação 3 ou 4, em que o peptídeo compreende um ou mais grupos protetores.

8. Método ou uso de acordo com a reivindicação 7, em que o grupo protetor é um grupo protetor N-terminal.

9. Método ou uso de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o grupo protetor é um grupo acila.

10. Método ou uso de acordo com a reivindicação 9 em que o grupo protetor é um grupo acetila.

11. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores ém que o peptídeo é Ac-rER.

12. Método ou uso de aordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, em que o peptídeo tem a fórmula estrutural. (Fórmula I)

13. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindica- ções anteriores, em que o peptídeo consiste essencialmente em um tripeptí- deo que tem a seqüência rER, opcionalmente com um grupo protetor.

14. Método ou uso de qualquer uma das reivindicações 1 a 10 em que o peptídeo compreende resíduos de aminoácido adicionais.

15. Método ou uso de acordo com a reivindicação 14, em que o peptídeo inclui resíduos adjacentes a seqüência RER encontrada nos resí- duos de aminoácido 328-330 de APP humano.

16. Método ou uso de acordo com a reivindicação 14 ou 15 em que o peptídeo consiste em ou compreende qualquer uma das seqüências rER, rERM e rERMS.

17. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 14 a 16, em que o peptídeo compreende aminoácidos não-comuns adi- cionais.

18. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 14 a 16 em que o peptídeo compreende um tripeptídeo que tem a se- qüência rER, opcionalmente com um grupo protetor, conjugado a outra se- qüência de peptídeo não relacionada a APP humano.

19. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 12 ou 13 a 16, em que o peptídeo é conjugado a uma molécula não-peptídica.

20. Método ou uso de acordo com qualquer uma das reivindica- ções 1 a 10 ou 13 a 19 em que a estrutura principal peptídica foi substituída ou trocada.

21. Método ou uso de acordo com a reivindicação 20, em que a estrutura principal peptídica inclui um grupo metila.