ES2247329T3 - Prevencion de muerte celular utilizando segmentos de proteinas fibrilares neurales. - Google Patents

Abstract

Utilización de al menos un segmento de NTP en la producción de una composición para el tratamiento y/o la prevención y/o la inhibición de condiciones asociadas con la muerte celular y/o la necrosis tisular en tejido cerebral de mamífero vivo, donde la composición contiene además un componente que permite al segmento de NTP atravesar la barrera hematoencefálica.

Description

Prevención de muerte celular utilizando segmentos de proteínas fibrilares neurales.

Esta solicitud reivindica prioridad para la Solicitud de Patente Provisional de EE.UU. Nº 60/290.971, titulada: "Method of Preventing Cell Death Using Segment of Neural Thread Proteins".

Antecedentes de la invención 1. Campo de la invención

La presente invención se refiere a métodos para prevenir la muerte celular y a métodos para tratar condiciones que requieran la prevención, la inhibición y/o el alivio de la muerte celular y de la necrosis tisular. La invención incluye la utilización de un segmento de proteínas fibrilares neurales (NTP) o de un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo, en la fabricación de una composición para ser administrada a un mamífero que esté experimentando muerte celular. El segmento puede ser administrado intramuscularmente, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intracerebralmente (intraparenquimalmente), intracerebroventricularmente, intratumoralmente, intralesionalmente, intradérmicamente, intratecalmente, intranasalmente, intraocularmente, intraarterialmente, tópicamente, transdérmicamente, mediante un aerosol, una infusión, una inyección en bolus, un dispositivo de implantación, un sistema de liberación mantenida, etc., solo o conjugado a un vehículo. Alternativamente, el segmento puede ser expresado in vivo mediante la administración de un gen que exprese el segmento, mediante la administración de una vacuna que induzca tal producción o mediante la introducción de células, bacterias o virus que expresen el segmento in vivo, ya sea por modificación genética o de otro modo.

2. Descripción de la técnica relacionada

La Enfermedad de Alzheimer (EA) es un trastorno neurodegenerativo complejo caracterizado por deterioros progresivos de la memoria, el comportamiento, el lenguaje y las habilidades visuoespaciales, terminando finalmente en la muerte. Las patologías características en las regiones vulnerables incluyen depósitos extracelulares de \beta-amiloide, ovillos neurofibrilares intracelulares, pérdida sináptica y una considerable muerte celular neuronal. La investigación de las causas y los tratamientos de la Enfermedad de Alzheimer ha llevado a los investigadores a explorar numerosos caminos. Un número considerable de pruebas ha implicado a alteraciones en la producción o en el procesamiento de la proteína precursora de amiloide (PPA) humana en la etiología de la enfermedad. Sin embargo, una investigación profunda
ha demostrado que la EA es una enfermedad multifactorial con muchas etiologías diferentes, quizá solapantes.

Debido a ello, las personas que están en este campo han llevado a cabo una búsqueda significativa e investigaciones clínicas significativas para estudiar las deficiencias estructurales, los cambios químicos y las anormalidades funcionales en el cerebro y en diferentes poblaciones de células nerviosas. La profundidad de tales investigaciones y estudios está representada por las publicaciones siguientes, que representan solamente un puñado de los numerosos informes en este campo: Neurobiology of Alzheimer's Disease (D. Dawbarn y S.J. Allen, Editores), Bios, Oxford, 1995; Dementia (J. Whitehouse, Ed.), F.A. Davis Company, Philadelphia, 1993; Alzheimer's Disease: Senile Dementia and Related Disorders (Katzman, R. y R.L. Bick, Eds.), Raven Press, New York, 1994, páginas 47-51; Alzheimer's Disease and Related Disorders, Etiology, Pathogenesis and Therapeutics (Iqbol, K. y col., Eds.), Wiley, Chichester, 1999; Alzheimer's Disease: Advances in Clinical and Basic Research (Corain, B., Ed.), Wiley, New York, 1993; Alzheimer's Disease: Clinical and Treatment Perspectives (Cutler, N.R. y col., Eds.), Wiley, Chichester, 1995; Alzheimer Disease: Therapeutic Strategies (Giacobini, E., Becker, R., Eds.), Birkhauser, Boston, 1994; Paykel y col., Arch. Gen. Psychiat., 51:325-332 (1994); Amaducci y col., Neurology, 36:922-931 (1986); McKhann y col., Neurology, 34:939-944 (1984); Heston y col., Arch. Gen. Psychiatry, 38:1085-1090 (1981); Aging of the Brain (Gispen y Traber, editores), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1983, páginas 275-282; Heyman y col., Ann. Neurol., 15:335-341 (1984); Brayne C. y P. Calloway, Lancet, 1:1265-1267 (1988); Roth y col., Br. J. Psychiatry, 149:698-709 (1986); Medical Research Council, Report from the NRC Alzheimer's Disease Workshop, London, Inglaterra, 1987; Morris y col., Neurology, 41:469-478 (1991); y las referencias citadas en cada una de estas publicaciones.

Hasta la fecha, la Enfermedad de Alzheimer es la tercera enfermedad más cara de los Estados Unidos, costando a la sociedad 100 billones de dólares aproximadamente cada año. Es una de las enfermedades más extendidas en la población anciana, y con el envejecimiento de la sociedad llegará a ser incluso más significativa. Los costes asociados con la EA incluyen los costes médicos directos tales como la asistencia médica en hogares de ancianos, costes no médicos directos tales como la asistencia diaria en el hogar y costes indirectos tales como la productividad perdida por parte de los pacientes y cuidadores. El tratamiento médico y la modificación del comportamiento pueden tener beneficios económicos si se reduce la velocidad de la disminución cognitiva, si se retrasa la institucionalización, se reducen las horas de los cuidadores y se mejora la calidad de vida. Evaluaciones farmacoeconómicas han mostrado resultados positivos concernientes al efecto de la terapia farmacológica y de la modificación del comportamiento en el emplazamiento de los hogares de ancianos, la cognición y el tiempo de los cuidadores.

Las proteínas fibrilares neurales (NTP) son una familia de proteínas del cerebro caracterizadas recientemente. Un miembro de esta familia, AD7C-NTP, es una fosfoproteína asociada a la membrana de \sim41 kD que funciona con relación al brote neurítico(de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997); de la Monte y col., Alz. Rep., 2:327-332 (1999); de la Monte, S.M. y Wands, J.R., Journal of Alzheimer's Disease, 3:345-353(2001)). Se ha identificado y descrito el gen que codifica la AD7C-NTP y la secuencia de proteínas pronosticada de la AD7C-NTP (de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)). Además de la especie de \sim41 kD, se han identificado otras especies de proteínas fibrilares neurales (\sim26 kD, \sim21 kD, \sim17 kD y \sim15 kD) y se han asociado con tumores neuroectodérmicos, astrocitomas y glioblastomas y con lesiones debidas a hipoxia, isquemia o infarto cerebral (Xu y col., Cancer Research, 53:3823-3829(1993); de la Monte y col., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996); de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 138:(1-2):26-35 (1996); de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996); de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) y de la Monte y col., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)).

Se han descrito y reivindicado especies de proteínas fibrilares neurales en las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.948.634; 5.948.888 y 5.830.670, todas para "Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease" y en la Patente de EE.UU. Nº 6.071.705 para "Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction". Las descripciones de estas patentes se incorporan específicamente a la presente en su totalidad por referencia. Según se describe en las mismas, la NTP es regulada por incremento y producida durante la muerte celular. De este modo, se describe que las células nerviosas muertas y que están muriendo son sobreproductoras de NTP y, por consiguiente, su presencia indica la muerte de células nerviosas y el comienzo de la Enfermedad de Alzheimer (EA).

Se han identificado otras especies de proteínas fibrilares neurales como otros productos del gen AD7C-NTP (por ejemplo, una proteína de 112 aminoácidos descrita en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso XP_032307 PID g15928971) o como similares a proteínas fibrilares neurales (por ejemplo, una proteína de 106 aminoácidos descrita en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAH14951 PID g15928971, otra proteína de 106 aminoácidos descrita en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso XP_039102 PID g18599339 y una proteína de 61 aminoácidos descrita en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAH02534 PID g12803421).

Existen pruebas convincentes que relacionan la especie de proteína fibrilar neural AD7C-NTP en particular con la EA y su regulación por incremento durante la muerte celular en EA. El ARNm de AD7C-NTP está regulado por incremento en el cerebro de la EA en comparación con los controles; los niveles de proteína AD7C-NTP en el cerebro y en el FCS son más elevados en EA que en los controles; y se encuentra inmunorreactividad de AD7C-NTP en las placas seniles, en los ovillos neurofibrilares (NFT), en las neuronas en degeneración, en las fibras del neuropilo y en los brotes neuríticos distróficos en los cerebros de EA y de Síndrome de Down (Ozturk y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:419-423 (1989); de la Monte y col., J. Clin. Invest., 86(3):1004-13 (1990); de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 113(2):152-64 (1992); de la Monte y col., Ann. Neurol., 32(6):733-42 (1992); de la Monte y col., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996); de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996); de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) y de la Monte y col., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)). La inmunocitoquímica demostró que la proteína AD7C-NTP está localizada en las células, en protuberancias finas dentro del neuropilo, o es extracelular en los cerebros de EA y del Síndrome de Down. (de la Monte y col., Ann. Neurol., 32(6):733-42 (1992)). Dos tipos de células contienen AD7C-NTP: las neuronas y los astrocitos (Id.). Las neuronas afectadas son las de tipo piramidal grande que contienen típicamente los ovillos neurofibrilares bien conocidos en el cerebro de la EA (Id.).

Se han encontrado niveles elevados de proteína AD7C-NTP en FCS y en orina de pacientes con EA, mostrando su precisión como marcador bioquímico de esta devastadora enfermedad (de la Monte y Wands, Front Biosci., 7:989-96 (2002); de la Monte y Wands, Journal of Alzheimer's Disease, 3:345-353 (2001); Munzar y col., Alzheimer's Reports, 4:61-65 (2001); Kahle y col., Neurology, 54:1498-1504 (2000) y Averback, Neurology, 55:1068 (2000); Munzar y col., Alzheimer's Reports, 3:155-159 (2000); de la Monte y col., Alzheimer's Reports, 2:327-332 (1999); Ghanbari y col., J. Clin. Lab. Anal., 12:285-288 (1998); Ghanbari y col., J. Clin. Lab. Anal., 12:223-226 (1998); Ghandari y col., Journal of Contemporary Neurology, 1998; 4A:2-6 (1998) y de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997)).

Se ha relacionado también la sobreexpresión del gen de la AD7C-NTP con el proceso de muerte celular de la Enfermedad de Alzheimer (de la Monte y Wands, J. Neuropatho. and Exp. Neuro., 60:195-207 (2001); de la Monte y Wands, Cell Mol. Life Sci., 58:844-49 (2001). Se ha identificado también AD7C-NTP en tejido cerebral de Síndrome de Down (Wands y col., Publicación de Patente Internacional Nº WO 90/06993; de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 135:118-25 (1996); de la Monte y col., Alz. Rep., 2:327-332 (1999)). Hay cierta evidencia de que la sobreexpresión del gen de la AD7C-NTP puede estar también asociada con el glaucoma de tensión normal (Golubnitschaja-Labudova y col., Curr. Eye Res., 21:867-76 (2000)).

El presente inventor descubrió recientemente que la proteína AD7C-NTP liberada era citotóxica y capaz de causar la muerte celular de otras células del tejido (en comparación con la AD7C-NTP regulada por incremento producida por la propia célula que está muriendo), según está descrito en una Solicitud de Patente de Estados Unidos pendiente titulada "Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins".

Por consiguiente, sería deseable prevenir, inhibir, modular o aliviar la muerte celular y la necrosis tisular asociadas con las proteínas fibrilares neurales, especialmente en el cerebro de la EA.

Se ha descubierto también recientemente que segmentos de NTP podrían ser utilizados en ensayos de unión, en purificación de NTP y como reactivos de diagnóstico sustitutos de NTP, según está descrito en la Solicitud de Patente de Estados Unidos pendiente Nº 09/697.590 y titulada: "Preferred Segments of Neural Thread Protein and Methods of Using the Same".

La descripción precedente de la técnica relacionada no tiene la intención de ser, de ninguna manera, un reconocimiento de que cualquiera de los documentos descritos en la presente, incluyendo las solicitudes de patente de Estados Unidos pendientes, sean de la técnica anterior a la presente invención.

Resumen de la invención

Existe la necesidad de desarrollar un método para prevenir, inhibir, modular y/o aliviar la muerte celular y la necrosis tisular. En particular, existe la necesidad de desarrollar un método capaz de prevenir, inhibir y/o aliviar la muerte celular y/o la necrosis tisular en el cerebro. Existe también la necesidad de desarrollar un método para tratar condiciones asociadas con la muerte celular y/o la necrosis tisular. Existe también la necesidad de desarrollar un método para tratar enfermedades neurodegenerativas tales como la EA mediante la prevención, inhibición y/o alivio de la muerte celular y/o la necrosis tisular en tejido cerebral de mamíferos vivos. Existe también la necesidad de desarrollar un método para controlar, inhibir, modular o aliviar la muerte celular y la necrosis tisular en tejido vivo causadas por NTP administrada para eliminar o destruir elementos tisulares o celulares nocivos o indeseables tales como tumores benignos o malignos en humanos.

Es por tanto una característica de una realización de la invención proporcionar la utilización de al menos un segmento de NTP en la producción de una composición para el tratamiento y/o la prevención y/o la inhibición de condiciones asociadas con la muerte celular y/o con la necrosis tisular en tejido cerebral de mamíferos vivos, donde la composición comprende además un componente que permite al segmento de NTP atravesar la barrera hematoencefálica. Esto posibilita un método para prevenir, inhibir y/o aliviar la muerte celular y/o la necrosis tisular. El método incluye la puesta en contacto del tejido vivo con al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo), mediante lo cual el segmento está presente en una cantidad suficiente para prevenir, inhibir, reducir, controlar y/o aliviar la muerte celular y/o la necrosis tisular.

Se posibilita también un método para prevenir, inhibir y/o aliviar la muerte celular y/o la necrosis tisular en tejido cerebral de mamíferos vivos mediante la puesta en contacto del tejido cerebral de mamífero vivo con un componente que contiene al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo) que está presente en una cantidad suficiente para prevenir, inhibir y/o aliviar la muerte celular y/o la necrosis tisular. El componente es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica.

De acuerdo con otra característica de una realización de la invención, se proporciona la utilización de un componente que contiene al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo) en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas. El componente es capaz de atravesar la barrera hematoencefálica.

Se posibilita también un método para tratar condiciones asociadas con la muerte celular y/o la necrosis tisular que comprende la puesta en contacto de tejido vivo con al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo). El segmento de NTP está presente en una cantidad suficiente para prevenir y/o inhibir la muerte celular y/o la necrosis tisular. De acuerdo con este método, se administra al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo) a un mamífero que tenga una condición asociada con muerte celular y/o necrosis tisular en una cantidad suficiente para prevenir y/o inhibir la muerte celular y/o la necrosis
tisular.

De acuerdo con otra característica de una realización de la invención, se proporciona una composición que contiene al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo) y un componente que permite al segmento de NTP (o al homólogo, derivado, variante o mimético del mismo) atravesar la barrera hematoencefálica.

Se posibilita también un método para tratar condiciones asociadas con la muerte celular y/o la necrosis tisular que comprende la administración de un gen a un mamífero con necesidad de ello, mediante lo cual el gen expresa al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo) y por lo que la administración tiene como resultado la puesta en contacto del segmento de NTP (o de un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo) con el tejido vivo. El gen es administrado de tal manera que el segmento de NTP (o el homólogo, derivado, variante o mimético del mismo) esté presente en una cantidad suficiente para prevenir y/o inhibir la muerte celular y/o la necrosis tisular.

Se posibilita también un método para tratar condiciones asociadas con la muerte celular y/o la necrosis tisular que comprende la administración de una vacuna a un mamífero con necesidad de ello, mediante lo cual la vacuna induce la expresión o la producción de otro modo en el mamífero de al menos un segmento de NTP (o de un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo), y mediante lo cual la administración tiene como resultado la puesta en contacto del al menos un segmento de NTP (o de un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo) con el tejido vivo. La vacuna es administrada de tal manera que el al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo) esté presente en una cantidad suficiente para prevenir y/o inhibir la muerte celular y/o la necrosis tisular.

Se posibilita también un método para tratar condiciones asociadas con la muerte celular y/o la necrosis tisular que comprende la introducción en, o la administración a, o la implantación en, un mamífero con necesidad de ello de células, bacterias o virus que son capaces de expresar in vivo al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo), mediante lo cual las células, bacterias o virus expresan al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo), y mediante lo cual la administración tiene como resultado la puesta en contacto de tejido vivo con al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo). Las células, bacterias o virus son introducidos, administrados o implantados de tal manera y en tal cantidad que al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo) esté presente en una cantidad suficiente para prevenir, inhibir y/o aliviar la muerte celular y/o la necrosis tisular.

Estas y otras características de la invención serán fácilmente obvias para los expertos en la técnica después de la lectura de la descripción detallada siguiente. Debe comprenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos, aunque indican realizaciones preferidas de la invención, se presentan solamente a manera de ilustración.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la secuencia completa de AD7C-NTP y la posición de las secuencias Harlil dentro de la secuencia completa de AD7C-NTP (de la Monte y col., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55:1038-1050 (1996)).

La Figura 2 muestra la secuencia de aminoácidos completa de la proteína fibrilar neural de 122 aminoácidos (Secuencia 40 de la Patente de EE.UU. Nº 5.948.634; NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAE25447).

La Figura 3 muestra la secuencia de aminoácidos completa de la proteína fibrilar neural de 112 aminoácidos (NCBI Entrez-Protein # de Acceso XP_032307).

La Figura 4 muestra la proteína fibrilar neural de 106 aminoácidos enumerada en NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAH14951 PID g15928971.

La Figura 5 muestra la proteína fibrilar neural de 106 aminoácidos enumerada en NCBI Entrez-Protein # de Acceso XP_039102, PID g18599339.

La Figura 6 muestra la secuencia de aminoácidos completa de la proteína fibrilar neural de 98 aminoácidos (Secuencia 30 de la Patente de EE.UU. Nº 5.830.670; NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAE13612).

La Figura 7 muestra la secuencia de aminoácidos completa de la proteína fibrilar neural de 75 aminoácidos (Secuencia 48 de la Patente de EE.UU. Nº 5.948.634; NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAE25448).

La Figura 8 muestra la secuencia de aminoácidos completa de la proteína fibrilar neural de 68 aminoácidos (Secuencia 36 de la Patente de EE.UU. Nº 5.948.634; NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAE25446).

La Figura 9 muestra la secuencia de aminoácidos completa de la proteína similar a la proteína fibrilar neural de 61 aminoácidos (NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAH02534).

Descripción detallada de las realizaciones preferidas

El término "AD7C-NTP" se refiere a la proteína de \sim41 kD y al gen y a las secuencias de ácido nucleico que codifican la misma descritas en de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-104 (1997), en las Secuencias 120 y 121 de las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.948.634, 5.948.888 y 5.830.670 y en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso AF010144.

A lo largo de esta descripción, el término "NTP" o "proteína fibrilar neural" se refiere a proteínas fibrilares neurales y a moléculas relacionadas (incluyendo la proteína fibrilar pancreática) y a las secuencias de ácido nucleico que codifican esas proteínas, e incluye (pero no se limita a) las proteínas y las secuencias de ácido nucleico siguientes que codifican las secuencias de aminoácidos de estas proteínas:

(a)

AD7C-NTP;

(b)

las especies de \sim42,\sim26, \sim21, \sim17, \sim14 y \sim8 kD de proteína fibrilar neural según está descrito en las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.948.634, 5.948.888 , 5.830.670 y 6.071.705 y en de la Monte y col., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):1038-50 (1996); de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 138(1-2):26-35 (1996); de la Monte y col., J. Neurol. Sci., 135(2):118-25 (1996); de la Monte y col., J. Clin. Invest., 100:3093-3104 (1997) y de la Monte y col., Alz. Rep., 2:327-332 (1999);

(c)

proteínas reconocidas específicamente por el anticuerpo monoclonal #2 depositado en la American Type Culture Collection, Manassas, Va., bajo el número de acceso HB-12546 o por el anticuerpo monoclonal #5 depositado en la American Type Culture Collection, Manassas, Va., bajo el número de acceso HB-12545;

(d)

proteínas codificadas por el gen AD7C-NTP;

(e)

la proteína fibrilar neural de 122 aminoácidos descrita en la Secuencia 40 de las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.830.670, 5.948.634 y 5.948.888 y enumerada en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAE25447, PID g10048540, cuya secuencia de aminoácidos está ilustrada en la Figura 2;

(f)

la proteína fibrilar neural de 112 aminoácidos enumerada en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso XP_032307, PID g14725132, cuya secuencia de aminoácidos está ilustrada en la Figura 3;

(g)

una proteína similar a la proteína fibrilar neural de 106 aminoácidos enumerada en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAH14951, PID g15928971, cuya secuencia de aminoácidos está ilustrada en la Figura 4;

(h)

una proteína similar a la proteína fibrilar neural de 106 aminoácidos enumerada en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso XP_039102, PID g18599339, cuya secuencia de aminoácidos está ilustrada en la Figura 5;

(i)

la proteína fibrilar neural de 98 aminoácidos descrita en la Secuencia 30 de las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.830.670, 5.948.634 y 5.948.888 y enumerada en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAE13612, PID g10048538, cuya secuencia de aminoácidos está ilustrada en la Figura 6;

(j)

la proteína fibrilar neural de 75 aminoácidos descrita en la Secuencia 48 de las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.830.670, 5.948.634 y 5.948.888 y enumerada en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAE25448, PID g10048541, cuya secuencia de aminoácidos está ilustrada en la Figura 7;

(k)

la proteína fibrilar neural de 68 aminoácidos descrita en la Secuencia 36 de las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.830.670, 5.948.634 y 5.948.888 y enumerada en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAE25446, PID g10048539, cuya secuencia de aminoácidos está ilustrada en la Figura 8;

(l)

la proteína similar a la proteína fibrilar neural de 61 aminoácidos enumerada en la base de datos NCBI Entrez-Protein # de Acceso AAH02534, PID g12803421, cuya secuencia de aminoácidos está ilustrada en la Figura 9;

(m)

la proteína fibrilar pancreática;

(n)

la proteína fibrilar pancreática neural (nPTP) descrita en la Patente de EE.UU. Nº 6.071.705; y

(o)

proteínas reconocidas específicamente por los anticuerpos producidos por un hibridoma del grupo que consta de HB 9934, HB 9935 y HB 9936 depositados en la American Type Culture Collection.

El término "NTP" incluye también NTP derivadas de tejido de mamífero o producidas utilizando técnicas recombinantes e incluye fragmentos, variantes, derivados y homólogos de NTP.

Los aminoácidos y residuos de aminoácido descritos en la presente pueden ser referidos según el código de una letra o de tres letras aceptado proporcionado en la tabla siguiente. A no ser que se especifique de otro modo, estos aminoácidos o residuos están en la forma estereoisomérica L existente en la naturaleza.

TABLA 1

	Aminoácido	Símbolo de una letra	Símbolo de tres letras
	Alanina	A	Ala
	Arginina	R	Arg
	Asparragina	N	Asn
	Ácido aspártico	D	Asp
	Cisteína	C	Cys
	Glutamina	Q	Gln
	Ácido glutámico	E	Glu
	Glicina	G	Gly
	Histidina	H	His
	Isoleucina	I	Ile
	Leucina	L	Leu
	Lisina	K	Lys
	Metionina	M	Met

TABLA 1 (continuación)

	Aminoácido	Símbolo de una letra	Símbolo de tres letras
	Fenilalanina	F	Phe
	Prolina	P	Pro
	Serina	S	Ser
	Treonina	T	Thr
	Triptófano	W	Trp
	Tirosina	Y	Tyr
	Valina	V	Val

Según se utiliza en la presente, el término "secuencia Harlil" o "péptido Harlil" se refiere a un péptido biológicamente activo que comprende o contiene una o más de las secuencias siguientes:

1.

T H A R L I L; H H A R L C L; M F A R L I L y H H A R L I F, según se describe en la Figura 1;

2.

H H A R L; H A R L; H A R L I; H A R L I L; H H A R L C L; A R L I L; H H A R L I F; T H A R L I L; A R L I; A R L; H A R L C L; A R L C L; A R C L; M F A R L I L; F A R L I L; F A R L I; F A R L; H A R L I F y A R L I F;

3.

L H A R L C L A N F C G R N R V ("NTP-1");

4.

L A R L C L A N F C G N N N V ("NTP-2");

5.

C A R Y R T G H H A R L M ("NTP-3");

6.

H H A R L P L A N F C G ("NTP-4");

7.

R T G H H A R L C L A N F C ("NTP-5");

8.

C E S A R Y R T G H H A R L C ("NTP-6");

9.

D N T H H A R L I L ("NTP-7");

10.

S H H A R L I L ("NTP-8"); y

11.

H A R L M L, H A R L V L y H A K L I L.

El término "secuencia Harlil" o "péptido Harlil", según se utiliza en la presente, incluye también variantes, homólogos, derivados y peptidomiméticos biológicamente activos de las secuencias Harlil o de los péptidos Harlil, e incluye péptidos biológicamente activos que contienen la secuencia de cualquiera de las secuencias enumeradas en los subpárrafos 1 a 11 anteriores con residuos de aminoácido adicionales antes o después de la secuencia Harlil en péptidos adaptadores.

Según se utiliza en la presente, el término "segmento de NTP" se refiere a un fragmento biológicamente activo de una especie de NTP, preferiblemente de AD7C-NTP, e incluye específicamente (pero no se limita a) secuencias Harlil y péptidos Harlil.

El término "biológicamente activo" se refiere a una proteína, péptido, péptido Harlil o segmento de NTP que tiene la capacidad de unirse a NTP o a otras moléculas.

El término "fragmento" se refiere a una proteína o polipéptido que consta de una subsecuencia continua de la secuencia de aminoácidos de una proteína NTP o de un segmento de NTP, e incluye fragmentos existentes en la naturaleza tales como variantes por ayuste y fragmentos resultantes de la actividad proteasa in vivo existente de forma natural. Tal fragmento puede estar truncado en el extremo amino, en el extremo carboxi y/o internamente (tal como por ayuste natural). Tales fragmentos pueden ser preparados con o sin una metionina aminoterminal. El término "fragmento" incluye fragmentos, idénticos o diferentes, de la misma proteína NTP o del mismo segmento de NTP, con una secuencia de aminoácidos contigua en común o no, unidos directamente o a través de un adaptador.

El término "variante" se refiere a una proteína o a un polipéptido en el que están presentes una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con la secuencia de aminoácidos de una proteína NTP o de un segmento de NTP, e incluye variantes alélicas o variantes por ayuste alternativo existentes en la naturaleza de una proteína NTP o de un segmento de NTP. El término "variante" incluye la sustitución de uno o más aminoácidos de una secuencia peptídica por aminoácido(s) similar(es) u homólogo(s) o por aminoácido(s) diferente(s). Existen muchas escalas en las que pueden clasificarse los aminoácidos como similares u homólogos (Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, p. 123-39 (Academic Press, New York, NY 1987)). Las variantes preferidas incluyen sustituciones de alanina en una o más posiciones de aminoácido. Otras sustituciones preferidas incluyen sustituciones conservadoras que tienen poco o ninguno efecto sobre la carga neta total, la polaridad o la hidrofobicidad de la proteína. En la Tabla 2 siguiente se muestran las sustituciones conservadoras.

TABLA 2 Sustituciones de Aminoácidos Conservadoras

	Básicos:	arginina
		lisina
		histidina
	Ácidos:	ácido glutámico
		ácido aspártico
	Polares no cargados:	glutamina
		asparragina
		serina
		treonina
		tirosina
	No polares:	fenilalanina
		triptófano
		cisteína
		glicina
		alanina
		valina
		prolina
		metionina
		leucina
		isoleucina

La Tabla 3 presenta otro esquema de sustituciones de aminoácidos:

TABLA 3

	Residuo Original	Sustituciones
	Ala	gly; ser
	Arg	lys
	Asn	gln; his
	Asp	glu
	Cys	ser
	Gln	asn
	Glu	asp
	Gly	ala; pro
	His	asn; gln
	Ile	leu; val
	Leu	ile; val
	Lys	arg; gln; glu
	Met	leu; tyr; ile
	Phe	met; leu; tyr
	Ser	thr
	Thr	ser
	Trp	tyr
	Tyr	trp; phe
	Val	ile; leu

Otras variantes pueden constar de sustituciones de aminoácidos menos conservadoras, tal como la selección de residuos que difieran más significativamente en su efecto sobre el mantenimiento de (a) la estructura del esqueleto polipeptídico en el área de la sustitución, por ejemplo, como una conformación laminar o helicoidal, (b) la carga o la hidrofobicidad de la molécula en el sitio diana o (c) el volumen de la cadena lateral. Las sustituciones que se espera en general que tengan un efecto más significativo sobre la función son aquéllas en las cuales (a) glicina y/o prolina es sustituida por otro aminoácido o es eliminada o insertada; (b) un residuo hidrofílico, por ejemplo serilo o treonilo, es sustituido por un residuo hidrofóbico, por ejemplo leucilo, isoleucilo, fenilalanilo, valilo o alanilo (o viceversa); (c) un residuo de cisteína es sustituido por cualquier otro residuo (o viceversa); (d) un residuo con una cadena lateral electropositiva, por ejemplo lisilo, arginilo o histidilo, es sustituido por un residuo con una carga electronegativa, por ejemplo glutamilo o aspartilo (o viceversa); o (e) un residuo con una cadena lateral voluminosa, por ejemplo fenilalanina, es sustituido por uno que no tenga tal cadena lateral, por ejemplo glicina (o viceversa). Otras variantes incluyen las diseñadas para generar un nuevo sitio o sitios de glicosilación y/o fosforilación, o las diseñadas para eliminar un sitio o sitios de glicosilación y/o fosforilación existentes. Las variantes incluyen la sustitución de al menos un aminoácido en un sitio de glicosilación, en un sitio de corte proteolítico y/o en un residuo de cisteína. Las variantes incluyen también proteínas NTP o segmentos de NTP con residuos de aminoácidos adicionales antes o después de la secuencia de aminoácidos de la NTP o del segmento de NTP en péptidos adaptadores. Por ejemplo, puede añadirse un residuo de cisteína en el extremo amino y en el extremo carboxi de un segmento de NTP con el fin de permitir la ciclación del segmento de NTP por la formación de un enlace disulfuro. El término "variante" incluye también polipéptidos que tienen la secuencia de aminoácidos de un péptido Harlil con al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales flanqueando el extremo 3' o 5' del péptido Harlil.

El término "derivado" se refiere a una proteína o polipéptido químicamente modificado que ha sido modificado químicamente mediante procesos naturales, tal como procesamiento y otras modificaciones posteriores a la traducción, pero también mediante técnicas de modificación química como, por ejemplo, la adición de una o más moléculas de polietilén glicol, azúcares, fosfatos y/u otras moléculas similares, donde la molécula o moléculas no están ligadas naturalmente a las proteínas NTP o segmentos de NTP de tipo salvaje. Los derivados incluyen sales. Tales modificaciones químicas están bien descritas en los textos básicos y en monografías más detalladas, así como en una literatura de investigación voluminosa, y son bien conocidas por los expertos en el oficio. Se apreciará que el mismo tipo de modificación puede estar presente en el mismo grado o en un grado variable en varios sitios de una proteína o polipéptido dados. Además, una proteína o polipéptido dado puede contener muchos tipos de modificaciones. Las modificaciones pueden acontecer en cualquier lugar de una proteína o polipéptido, incluyendo el esqueleto peptídico, las cadenas laterales de los aminoácidos y los extremos amino o carboxilo. Las modificaciones incluyen, por ejemplo, acetilación, acilación, ribosilación por ADP, amidación, unión covalente de flavina, unión covalente de un resto hemo, unión covalente de un nucleótido o de un derivado de nucleótido, unión covalente de un lípido o un derivado lipídico, unión covalente de fosfatidil inositol, entrecruzamiento, ciclación, formación de enlaces disulfuro, desmetilación, formación de entrecruzamientos covalentes, formación de cisteína, formación de piroglutamato, formilación, carboxilación gamma, glicosilación, formación de anclajes de GPI, hidroxilación, yodación, metilación, miristoilación, oxidación, procesamiento proteolítico, fosforilación, prenilación, racemización, glicosilación, unión de lípidos, sulfatación, carboxilación gamma de residuos de ácido glutámico, hidroxilación y ribosilación por ADP, selenoilación, sulfatación, adición de aminoácidos a proteínas mediada por ARN de transferencia tal como arginilación y ubiquitinación. Ver, por ejemplo, Proteins--Structure And Molecular Properties, 2ª Ed, T.E. Creighton, W.H. Freeman and Company, New York (1993) y Wold, F., "Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects", páginas 1-12 en Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B.C. Johnson, Ed., Academic Press, New York (1983); Seifter y col., Meth. Enzymol., 182:626-646 (1990) y Rattan y col., "Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann. N.Y. Acad. Sci., 663:48-62 (1992). El término "derivados" incluye modificaciones químicas que tienen como resultado el que la proteína o el polipéptido se convierta en ramificado o cíclico, con o sin ramificaciones. Las proteínas o polipéptidos cíclicos, ramificados y circulares ramificados, pueden ser el resultado de procesos naturales posteriores a la traducción y pueden ser también producidos mediante métodos totalmente
sintéticos.

El término "homóloga" se refiere a una proteína que es al menos un 75 por ciento idéntica en su secuencia de aminoácidos a una proteína NTP, a AD7C-NTP o a un segmento de NTP, según sea el caso, determinado mediante métodos estándar que son comúnmente utilizados para comparar la similitud de dos polipéptidos en cuanto a la posición de aminoácidos. El grado de similitud o identidad entre dos proteínas puede ser calculado fácilmente mediante métodos conocidos, incluyendo, pero sin limitarse a, los descritos en Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. y Griffin, H.G., eds., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. y Devereux, J., eds., M. Stockton Press, New York, 1991; y Carillo, H. y Lipman, D., SIAM, J. Applied Math., 48:1073 (1988). Los métodos preferidos para determinar identidad son diseñados para que produzcan la mayor coincidencia entre las secuencias analizadas. Los métodos para determinar identidad y similitud están codificados en programas de ordenador disponibles públicamente.

Los métodos de los programas de ordenador preferidos útiles para determinar la identidad y la similitud entre dos secuencias incluyen, pero no se limitan a, el paquete de programas GCG (Devereux, J. y col., Nucleic Acids Research, 12(1):387 (1984)), BLASTP, BLASTN y FASTA, Atschul, S.F. y col., J. Molec. Biol., 215:403-410 (1990). El programa BLAST X está disponible públicamente en NCBI y en otras fuentes (BLAST Manual, Altschul, S. y col., NCBI NLM NIH, Bethesda, Md., 20894; Altschul, S. y col., J. Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). A manera de ejemplo, utilizando un algoritmo de ordenador tal como GAP (Genetic Computer Group, University of Winconsin, Madison, Wis.), las dos proteínas o polipéptidos para los que se va a determinar el porcentaje de identidad de las secuencias son alineados para determinar la coincidencia óptima de sus aminoácidos respectivos (la "amplitud de la coincidencia" según determina el algoritmo).

Se utilizan junto con el algoritmo una penalización por la apertura de huecos (que se calcula como 3 x (veces) la diagonal media; la "diagonal media" es la media de la diagonal de la matriz de comparación que esté siendo utilizada; la "diagonal" es la puntuación o número asignado a cada aminoácido perfecto por la matriz de comparación particular) y una penalización por la extensión de los huecos (que es normalmente 1/10 veces la penalización por la apertura de huecos), además de una matriz de comparación tal como PAM 250 o BLOSUM 62. El algoritmo puede utilizar también una matriz de comparación estándar (ver Dayhoff y col., en: Atlas of Protein Sequence and Structure, vol. 5, suplemento 3 [1978] para la matriz de comparación PAM 250; ver Henikoff y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915-10919 [1992] para la matriz de comparación BLOSUM 62). Posteriormente se calcula el porcentaje de identidad mediante el algoritmo. Los homólogos tendrán típicamente una o más sustituciones, deleciones y/o inserciones de aminoácidos en comparación con NTP, AD7C-NTP, un segmento de NTP o una secuencia Harlil.

El término "peptidomimético" o "mimético" se refiere a compuestos biológicamente activos que remedan la actividad biológica de un péptido o de una proteína pero que no son ya peptídicos por naturaleza química, esto es, que ya no contienen ningún enlace peptídico (esto es, enlaces amida entre los aminoácidos). En la presente, el término "peptidomimético" es utilizado en un sentido más amplio para incluir moléculas que ya no son completamente peptídicas por naturaleza, tales como pseudopéptidos, semipéptidos y peptoides. Ejemplos de peptidomiméticos en este sentido más amplio (en los que parte de un péptido es sustituido por una estructura que carece de enlaces peptídicos) se describen posteriormente. Los peptidomiméticos de acuerdo con esta invención, ya sean completamente o parcialmente no peptídicos, proporcionan una disposición espacial de restos químicos reactivos que se asemeja estrechamente a la disposición tridimensional de los grupos activos del anticuerpo, el derivado de anticuerpo o el fragmento de anticuerpo en el que está basado el peptidomimético. Como resultado de esta geometría del sitio activo similar, el peptidomimético tiene efectos sobre sistemas biológicos que son similares a la actividad biológica del péptido.

Los peptidomiméticos de esta invención son preferiblemente sustancialmente similares en forma tridimensional y en actividad biológica a los segmentos de NTP descritos en la presente. Ejemplos de métodos para modificar estructuralmente un péptido conocidos en la técnica para crear un peptidomimético incluyen la inversión de centros quirales del esqueleto que dan lugar a estructuras de residuos de D-aminoácidos que pueden conducir, particularmente en el extremo N, a una estabilidad incrementada a la degradación proteolítica sin afectar de manera adversa a la actividad. Se presenta un ejemplo en el artículo "Tritiated D-ala^{1}-Peptide T Binding", Smith, C.S. y col., Drug Development Res., 15, pp. 371-379 (1988). Un segundo método es alterar la estructura cíclica para obtener estabilidad, tal como imidas y lactamas entre cadenas N a C (Ede y col., en Smith y Rivier (eds.) "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), pp. 268-270). Un ejemplo de esto se da en los compuestos similares a timopentina comformacionalmente restringidos, tales como los descritos en la Patente de EE.UU. Nº 4.457.489 (1985), Goldstein, G. y col. Un tercer método es sustituir enlaces peptídicos en el segmento de NTP por enlaces pseudopeptídicos que confieren resistencia a la proteolisis.

Se han descrito varios enlaces pseudopeptídicos que, en general, no afectan a la estructura peptídica ni a la actividad biológica. Un ejemplo de este abordaje es la sustitución de enlaces pseudopeptídicos retroinversos ("Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. y col. en Rivier, J.E. y Marshall, G.R. (eds) "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), pp. 722-773) y Dalpozzo y col. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:561-566). De acuerdo con esta modificación, las secuencias de aminoácidos de los péptidos pueden ser idénticas a las secuencias de un segmento de NTP descrito anteriormente, excepto en que uno o más de los enlaces peptídicos están sustituidos por un enlace pseudopeptídico retroinverso. Preferiblemente, se sustituye en enlace peptídico más N-terminal, ya que tal sustitución conferirá resistencia a la proteolisis por exopeptidasas que actúan en el extremo N. Pueden realizarse también modificaciones adicionales sustituyendo grupos químicos de los aminoácidos por otros grupos químicos de estructura similar. Otro enlace pseudopeptídico adecuado, que se sabe que incrementa la estabilidad al corte enzimático con poca o ninguna pérdida de la actividad biológica, es el enlace pseudopeptídico isostérico reducido (Couder y col. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41:181-184).

Por tanto, las secuencias de aminoácidos de estos péptidos pueden ser idénticas a las secuencias de un segmento de NTP o de una secuencia Harlil, excepto en que uno o más de los enlaces peptídicos están sustituidos por un enlace pseudopeptídico isostérico. Preferiblemente es sustituido el enlace peptídico más N-terminal, ya que tal sustitución conferirá resistencia a la proteolisis por exopeptidasas que actúan en el extremo N. La síntesis de péptidos con uno o más enlaces pseudopeptídicos isostéricos reducidos es conocida en la técnica (Couder y col. (1993), citado anteriormente). Otros ejemplos incluyen la introducción de enlaces cetometileno o metilsulfuro para sustituir a los enlaces peptídicos.

Los derivados peptoides de segmentos de NTP o de una secuencia Harlil representan otra clase de peptidomiméticos que conservan los determinantes estructurales importantes para la actividad biológica, eliminando también los enlaces peptídicos, confiriendo de este modo resistencia a la proteolisis (Simon y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:9367-9371). Los peptoides son oligómeros de glicinas N-sustituidas. Se han descrito varios grupos N-alquilo, correspondiendo cada uno de ellos a la cadena lateral de un aminoácido natural (Simon y col. (1992), citado anteriormente). Algunos o todos los aminoácidos del segmento de NTP o secuencia Harlil pueden ser sustituidos por la glicina N-sustituida correspondiente al aminoácido sustituido.

El término "peptidomimético" o "mimético" incluye también péptidos D inversos y enantiómeros según se define a continuación.

El término "péptido D inverso" se refiere a una proteína o péptido biológicamente activo que consta de D-aminoácidos dispuestos en orden inverso en comparación con la secuencia de L-aminoácidos de un segmento de NTP o de una secuencia Harlil. Por tanto, el residuo carboxi terminal de un segmento de L-aminoácidos de NTP se convierte en el residuo amino terminal del péptido de D-aminoácidos y así sucesivamente. Por ejemplo, el fragmento de AD7C-NTP, HARLIL, se convierte en L_{d}I_{d}L_{d}R_{d}A_{d}H_{d}, donde A_{d}, H_{d}, I_{d}, L_{d} y R_{d} son los D-aminoácidos correspondientes a los L-aminoácidos A, H, I, L y R, respectivamente.

El término "enantiómero" se refiere a una proteína o péptido biológicamente activo en el que uno o más residuos de L-aminoácidos de la secuencia de aminoácidos de un segmento de NTP están sustituidos por el(los) residuo(s) de D-aminoácido(s) correspondiente(s).

A lo largo de toda esta descripción, el término "trastorno neurodegenerativo" se refiere a:

1.

condiciones patológicas caracterizadas por uno o más de los signos siguientes: atrofia cerebral, pérdida celular, ovillos neurofibrilares, placas amiloides y/o la presencia de NTP en el tejido y/o los fluidos corporales;

2.

el grupo de enfermedades de Alzheimer, a saber, la Enfermedad de Alzheimer (demencia presenil, demencia senil); la Enfermedad de Alzheimer asociada con el Síndrome de Down; la Enfermedad de Alzheimer familiar; la enfermedad de Alzheimer genética debida a mutaciones tales como Presenilina 1, Presenilina 2 y otras; la Enfermedad de Alzheimer asociada con otras enfermedades del sistema nervioso central tales como la Enfermedad de Parkinson, la Enfermedad de los Cuerpos de Lewy y enfermedades cerebrovasculares;

3.

angiopatía congofílica (asociada o no asociada con Enfermedad de Alzheimer, familiar o no familiar);

4.

condiciones patológicas caracterizadas por el depósito de fibrillas anormales ("fibrillas de amiloide") y/o molécula(s) precursora(s) de amiloide o no precursora(s) de amiloide no fibrilar(es) relacionada(s);

5.

condiciones patológicas caracterizadas por el depósito anormal de tau, incluyendo demencia frontotemporal, parálisis supranuclear progresiva (PSP), degeneración ganglionar corticobasal (CBD) y condiciones relacionadas con mutaciones del gen tau; y/o

6.

otros trastornos y enfermedades tales como los descritos en la Patente de EE.UU. Nº 6.001.331.

A lo largo de toda esta descripción, las expresiones "placas de amiloide" y "fibrillas de amiloide" indican placas seniles, placas neuríticas, placas de amiloide, estrellas de amiloide, centros de amiloide, placas primitivas, placas clásicas, placas quemadas, placas difusas, placas sombreadas, ovillos neurofibrilares, fibrillas de amiloide, filamentos helicoidales pareados y similares.

A lo largo de toda esta descripción, el término "mamífero" se refiere a todos los mamíferos e indica preferiblemente ovejas, vacas, perros, gatos, simios, monos, ratones, ratas y humanos y, más preferiblemente, indica un humano.

A lo largo de esta descripción, las expresiones "segmento de NTP", "secuencia Harlil" y "péptido Harlil" son utilizadas indistintamente. Debe comprenderse que cuando se utilice "segmento de NTP", "secuencia Harlil" o "péptido Harlil", la invención incluye homólogos, variantes, derivados y peptidomiméticos adecuados de los mismos.

A lo largo de toda esta descripción, la expresión "tejido que contiene NTP" indica un tejido que contiene toda o una porción de NTP, tejido en comunicación celular con NTP que puede por otra parte contenerla o no contenerla, tejido que ha sido puesto en contacto con NTP pero que ya no la contiene en su forma original, y tejido que puede estar en algún punto de tiempo en contacto con NTP.

La presente invención está dirigida a métodos para prevenir la muerte celular y/o la necrosis tisular. Aunque la NTP se conoce y ha sido descrita en la literatura, no se sabía hasta ahora que la NTP era una causa de muerte celular de células distintas de las células que producen NTP. Aunque sin intención de ligarse a ninguna teoría, el presente inventor cree que la presencia de NTP en tejido vivo no es sólo una indicación de la muerte de ciertas células nerviosas, según se informó previamente, sino que también es tóxica en la medida en que produce la muerte de células de otros tejidos vivos. El presente inventor cree que AD7C-NTP en particular, presente en el tejido cerebral de mamíferos vivos, es un marcador de la Enfermedad de Alzheimer (EA) y exacerba la EA produciendo la muerte celular y/o la necrosis tisular en el tejido vivo en el que existe.

Por consiguiente, se cree que cuando un mamífero resulta afectado de EA, la muerte de células nerviosas regula por incremento el gen que produce preferiblemente AD7C-NTP, produciendo de este modo AD7C-NTP en ese lugar. La AD7C-NTP así producida comienza entonces a destruir otro tejido vivo (por ejemplo, otras células nerviosas, células gliales, etc.) en las proximidades de la misma, exacerbando de este modo el progreso de la enfermedad. El inventor cree por tanto que la neutralización del efecto de, por ejemplo, AD7C-NTP, ayudará a prevenir, inhibir y/o aliviar la muerte celular y/o la necrosis tisular en el tejido vivo que contenga, por ejemplo, AD7C-NTP. Fue sorprendente encontrar que segmentos de NTP podían unirse a la AD7C-NTP y prevenir, inhibir y/o aliviar la muerte celular y/o la necrosis tisular en tejido vivo que contenía AD7C-NTP.

La NTP es conocida y está descrita en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.948.634, 5.948,888, 5.830.670 y 6.071.705. Métodos para producir NTP recombinantemente o de otro modo están descritos en los documentos anteriormente mencionados. Se describe también en estos documentos la producción de anticuerpos contra NTP a fin de que pueda diagnosticarse la EA y otros trastornos y enfermedades asociados. Será evidente para los expertos en la técnica que pueden utilizarse homólogos, derivados, miméticos y variantes de NTP, así como NTP de diversos orígenes (por ejemplo, natural, pancreática, purificada, sintetizada o procedente de diferentes sistemas de expresión in vitro, etc.) para producir cualquiera de los segmentos útiles en la presente invención.

La presente invención está dirigida a la utilización de al menos un segmento de NTP en la fabricación de una composición para el tratamiento y/o la prevención y/o la inhibición de condiciones asociadas con la muerte celular y/o la necrosis tisular en tejido vivo, donde la composición contiene además un componente que permite al segmento de NTP atravesar la barrera hematoencefálica y donde el tejido vivo es tejido cerebral de mamífero. Un método para prevenir y/o inhibir la muerte celular y/o la necrosis tisular incluye la puesta en contacto de un tejido vivo con al menos un segmento de NTP, mediante lo cual el segmento está presente en una cantidad suficiente para prevenir y/o inhibir la muerte celular y/o la necrosis tisular. El segmento de NTP es preferiblemente una subsecuencia de AD7C-NTP y, más preferiblemente, contiene al menos una de las secuencias de repetición de AD7C-NTP
siguientes:

(a) 45-51	T H A R L I L
(b) 90-96	H H A R L C L
(c) 263-269	M F A R L I L
(d) 291-297	H H A R L I F

Ver la Figura 1.

La invención incluye péptidos que tienen la secuencia de cualquiera de las regiones (a), (b), (c), (d) u homólogos, derivados, variantes y miméticos de las mismas (incluyendo pero sin limitarse a "H A R L M L"). Los péptidos Harlil pueden tener también residuos de aminoácido adicionales antes o después de la secuencia Harlil en péptidos adaptadores. Los residuos de aminoácido adicionales en péptidos adaptadores pueden ser los encontrados en la secuencia de NTP antes y después de la secuencia Harlil. Por ejemplo, los residuos de aminoácido G I T G M C T están presentes antes del residuo 46 y los residuos de aminoácido Y F F L V están presentes después del aminoácido 51 de la secuencia de NTP. Por tanto, un péptido Harlil útil como segmento de NTP en la presente invención puede incluir el péptido de NTP G I T G M C T H A R L I L Y F F L V. Para los péptidos Harlil enumerados en (b), (c) y (d), los residuos de aminoácido adicionales son preferiblemente los que flanquean a la secuencia Harlil en la secuencia de NTP. Preferiblemente, el péptido Harlil que tiene residuos de aminoácido adicionales no excede de 25 residuos de aminoácido totales de longitud.

La secuencia de repetición Harlil tiene preferiblemente la característica excepcional de unirse a NTP. Esta capacidad para unirse a NTP sugiere que la secuencia de repetición Harlil es útil para prevenir, inhibir o aliviar la muerte celular y/o la necrosis tisular en tejido vivo que contiene NTP.

Los péptidos de secuencia Harlil y sus homólogos, derivados, variantes y peptidomiméticos pueden ser utilizados como parejas de unión por afinidad de NTP y de otras moléculas para el tratamiento de condiciones asociadas con la muerte celular y/o la necrosis tisular. Se prevén también métodos para tratar condiciones asociadas con la muerte celular y/o la necrosis tisular así como composiciones que contengan péptidos Harlil o sus homólogos, derivados, variantes y peptidomiméticos que sean capaces de atravesar la barrera hematoencefálica.

Los péptidos Harlil y homólogos, derivados y variantes de los mismos pueden ser producidos utilizando técnicas convencionales de síntesis peptídica. Pueden desarrollarse miméticos de los péptidos Harlil utilizando técnicas de química combinatoria.

Pueden producirse ácidos nucleicos correspondientes a los péptidos Harlil utilizando, por ejemplo, (a) métodos recombinantes estándar, (b) técnicas sintéticas o (c) combinaciones de los mismos.

Las secuencias Harlil se unen a AD7C-NTP y a otras moléculas. Ver la Solicitud de Patente de Estados Unidos pendiente Nº de Serie 09/697.590 y titulada: "Preferred Segments of Neural Thread Protein and Methods of Using the Same".

Esta invención incluye el sorprendente descubrimiento de que una secuencia Harlil que puede unirse AD7C-NTP puede prevenir o inhibir la muerte celular y/o la necrosis tisular en tejido vivo que contenga AD7C-NTP.

Hay pruebas de que AD7C-NTP participa en la cascada neurodegenerativa. La capacidad para interrumpir o desviar la cascada eligiendo como objetivo la AD7C-NTP ofrece una oportunidad terapéutica. Por ejemplo, puede ser posible intervenir terapéuticamente utilizando la capacidad de los péptidos Harlil para interaccionar con los sitios de unión de AD7C-NTP, bloqueando de este modo los sitios reactivos potenciales en AD7C-NTP.

Alternativamente, los péptidos Harlil de la invención pueden ser útiles para vectorizar fármacos hacia las células que expresen la secuencia Harlil, o para crear genes o vacunas que induzcan la expresión de la secuencia Harlil in vivo.

Aunque no se conoce todavía el mecanismo real mediante el cual opera la secuencia Harlil, el presente inventor ha encontrado que la administración de una secuencia Harlil a tejido vivo que contenga AD7C-NTP previene y/o inhibe y/o alivia la muerte celular y la necrosis tisular que de lo contrario tendría lugar en ausencia de la secuencia Harlil.

Es posible que los sitios "HARLIL" interaccionen con otras proteínas del cerebro y pueden desempeñar un papel en la funcionalidad de AD7C-NTP y/o de otras NTP o de otras moléculas.

Métodos para producir y detectar tales secuencias Harlil, o sus homólogos o análogos funcionales, están descritos en la Solicitud de Patente de Estados Unidos copendiente Nº de Serie 09/697.590, titulada: "Preferred Segments of Neural Thread Protein and Methods of Using the Same".

Los segmentos peptídicos de NTP que son particularmente útiles en el contexto de la presente invención son los descritos anteriormente que incluyen al menos una porción de la secuencia de aminoácidos HARLIL de AD7C-NTP. Las secuencias Harlil útiles incluyen aquellas secuencias de aminoácidos seleccionadas de la lista siguiente:

(a)

H H A R L;

(b)

H A R L;

(c)

H A R L I;

(d)

H A R L I L;

(e)

H H A R L C L;

(f)

A R L I L;

(g)

H H A R L I F;

(h)

T H A R L I L;

(i)

A R L I;

(j)

A R L;

(k)

H A R L C L;

(l)

A R L C L;

(m)

A R C L;

(n)

M F A R L I L;

(o)

F A R L I L;

(p)

F A R L I;

(q)

F A R L;

(r)

H A R L I F;

(s)

A R L I F;

y homólogos, variantes, derivados y miméticos de las mismas.

Pueden utilizarse en la presente invención como segmento de NTP varios péptidos seleccionados de la lista anterior y homólogos, variantes, derivados y miméticos de los mismos. Por ejemplo, el péptido puede tener la secuencia de aminoácidos A R L I y contener al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales flanqueando el extremo 3' o 5' del péptido. El péptido puede tener también la secuencia de aminoácidos H A L R y contener al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales flanqueando el extremo 3' o 5' del péptido. Además, el péptido puede tener la secuencia de aminoácidos F A R L y contener al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales flanqueando el extremo 3' o 5' del péptido. El péptido puede ser también seleccionado de uno que tenga la secuencia de aminoácidos ARL y contener al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales flanqueando el extremo 3' o 5' del péptido. Otros péptidos adicionales útiles en la presente invención incluyen los que tienen la secuencia de aminoácidos A R L C y que contienen al menos uno y hasta 25 aminoácidos adicionales flanqueando el extremo 3' o 5' del péptido. Finalmente, el segmento de NTP puede ser un polímero de una secuencia peptídica Harlil que contenga al menos dos repeticiones del péptido.

Es incluso más preferido en la presente invención que las secuencias Harlil sean péptidos con las secuencias de aminoácidos siguientes:

1.	(NTP-1)	L H A R L C L A N F C G R N R V
2.	(NTP-2)	L A R L C L A N F C G N N N V
3.	(NTP-3)	C A R Y R T G H H A R L M
4.	(NTP-4)	H H A R L P L A N F C G
5.	(NTP-5)	R T G H H A R L C L A N F C
6.	(NTP-6)	C E S A R Y R T G H H A R L C
7.	(NTP-7)	D N T H H A R L I L
8.	(NTP-8)	S H H A R L I L

Las secuencias anteriores pueden ser conjugadas a proteínas transportadoras a través de una cisteína. De este modo, los péptidos NTP-1 y NTP-2 producían resultados de conjugados mixtos debido a la presencia de más de un residuo de cisteína. Por tanto, para los péptidos NTP-5 y NTP-6, se bloqueó la cisteína secundaria con Acetamido Metil (C_{3}H_{6}NO) (ACM).

La posición de las secuencias identificadas en AD7C-NTP puede verse en la Figura 1. Aunque todos los análogos de Harlil mostraban cierta reactividad, los análogos de Harlil particularmente preferidos son los seleccionados de entre NTP-1, NTP-3 y NTP-7. Debe señalarse que en el análogo de Harlil NTP-1, el primer aminoácido "L" puede ser sustituido por Lisina o "K".

Las secuencias Harlil, o segmentos de NTP, son preferiblemente puestas en contacto con el tejido vivo que contiene NTP. Es adecuado cualquier tejido vivo que contenga NTP, que fue puesto en contacto con NTP y en el que no exista ya NTP o no exista en su forma original, o el que pudiera contener NTP en algún punto de tiempo. Preferiblemente, el tejido es tejido seleccionado de tejido de mamífero.

Se posibilita un método para tratar condiciones causadas por la necrosis de tejido vivo que contenga NTP. En este contexto, la necrosis de tejido vivo y la muerte celular indican muerte celular y/o necrosis tisular de células distintas de las células que están muriendo y que producen la NTP. En el método, se administra un segmento de NTP o una secuencia Harlil a un mamífero que padezca de tal condición. La secuencia Harlil es administrada en una cantidad y durante un periodo de tiempo suficientes para prevenir y/o inhibir la necrosis del tejido vivo.

Los expertos en la técnica apreciarán que en lugar de administrar directamente la secuencia Harlil, la secuencia Harlil o el homólogo, variante, derivado o mimético de la misma, pueden ser producidos o expresados por el mamífero a través de expresión génica (por ejemplo, mediante terapia génica) o a través de una vacuna. Los técnicos expertos son capaces de crear, aislar y purificar genes o vacunas adecuados útiles para inducir la expresión de una secuencia Harlil, o
de homólogos, derivados, variantes o miméticos de la misma, utilizando las directrices proporcionadas en la presente.

Por ejemplo, la terapia génica ha llamado enormemente la atención como método para tratar varias enfermedades de mamífero e incrementar la producción de proteínas específicas o de otros productos celulares. La terapia génica se lleva a cabo de forma general introduciendo un material genético exógeno en las células de un paciente mamífero. El material genético introducido puede ser diseñado para sustituir a un gen anormal (defectuoso) del paciente mamífero ("terapia de sustitución de genes"), o puede ser diseñado para la expresión de la proteína codificada o de otro producto terapéutico sin sustituir a ningún gen defectuoso ("aumento de genes"). Como muchos trastornos médicos congénitos y adquiridos son el resultado de la producción inadecuada de varios productos génicos, la terapia génica proporciona un medio para tratar estas enfermedades mediante la expresión transitoria o estable de un ácido nucleico exógeno que codifica el producto terapéutico.

La terapia génica puede ser llevada a cabo por transformación directa de las células diana del sujeto mamífero (terapia génica in vivo) o por la transformación de células in vitro y la implantación posterior de las células transformadas en el sujeto mamífero (terapia génica ex vivo). La terapia génica in vivo es particularmente preferida para ser utilizada en la presente invención. Además de reparar las células somáticas, es generalmente conocido que la terapia génica in vivo puede ser también utilizada para tratamiento sistémico, un área en la que la terapia génica tiene muchas aplicaciones. El tratamiento sistémico implica la transfección de las células diana con el ADN de interés, la expresión de la proteína codificada en esa célula y la capacidad de la célula transformada para secretar posteriormente a la sangre la proteína producida.

Se han desarrollado una variedad de métodos para realizar la transformación in vivo, incluyendo medios mecánicos (por ejemplo, la inyección directa del ácido nucleico en las células diana o el bombardeo de partículas), virus recombinantes, liposomas y endocitosis mediada por receptores (RME) (para revisiones, ver Chang y col., 1994, Gastroenterol., 106:1076-84; Morsy y col., 1993, JAMA, 270:2338-45 y Ledley, 1992, Pediatr. Gastroenterol. Nutr., 14:328-37).

Métodos adecuados para desarrollar y administrar genes y vacunas adecuados para inducir la expresión in vivo de las secuencias Harlil o segmentos de NTP, u homólogos, variantes, derivados o miméticos de los mismos, están descritos en, por ejemplo, las Patentes de EE.UU. N^{os} 6.210.919 y 6.225.290.

Cualquier condición asociada con la muerte y la necrosis celular puede ser tratada de acuerdo con la presente invención. Preferiblemente, la condición es seleccionada de una enfermedad neurodegenerativa tal como EA, Enfermedad de Pick, Enfermedad de los Cuerpos de Lewy o la Enfermedad de Parkinson, o de derrame cerebral, tumor cerebral y otras enfermedades cerebrales, o glaucoma.

El método incluye la puesta en contacto del tejido vivo con al menos un segmento de NTP (o un homólogo, derivado, variante o mimético del mismo) en una cantidad suficiente para prevenir la muerte celular y/o la necrosis tisular. Los métodos para administrar el segmento de NTP incluyen la administración del segmento de NTP intramuscularmente, oralmente, intravenosamente, intraperitonealmente, intracerebralmente (intraparenquimalmente), intracerebroventricularmente, intratumoralmente, intralesionalmente, intradérmicamente, intratecalmente, intranasalmente, intraocularmente, intraarterialmente, tópicamente, transdérmicamente, a través de un aerosol, infusión, inyección en bolus, dispositivo de implantación, sistema de liberación mantenida, etc., sólo o conjugado a un transportador. Además, el segmento de NTP puede ser expresado o producido in vivo mediante la administración de un gen que exprese la proteína, mediante la administración de una vacuna que induzca tal producción o por la introducción de células, bacterias o virus que expresen el segmento in vivo, según se describió anteriormente.

El tratamiento de las enfermedades del sistema nervioso o de otras enfermedades relacionadas con el cerebro, puede ser llevado a cabo mediante la administración de fármacos que afecten a la función o disfunción del sistema nervioso en animales o pacientes. Típicamente, tales fármacos son administrados mediante aplicación periférica, ya sea por vía oral o por vía sistémica. Aunque algunos fármacos son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica (bbb), otros no atraviesan eficazmente la bbb o no la atraviesan de ninguna manera y son sólo eficaces cuando son administrados directamente al cerebro. El término "barrera hematoencefálica" o "bbb", según se utiliza en la presente, se refiere a la bbb propiamente dicha así como a la barrera hematoespinal. La barrera hematoencefálica, que consta del endotelio de los vasos cerebrales, la membrana basal y células neurogliares, actúa limitando la penetración de sustancias en el cerebro. Algunas veces la estructura de la bbb es subdividida en dos componentes: la barrera endotelial o capilar y la barrera ependimal. Banks, W.A, Kastin, A.J., Barrera, "Delivering peptides to the central nervous system: Dilemmas and strategies", Pharm. Res., 8:1345-1350 (1991).

La naturaleza de la penetración de la sustancia a través de la bbb no ha sido aún determinada, pero se sabe que muchos de los reguladores de la función cerebral tales como citoquinas, transferrina, encefalinas y endorfinas pueden atravesar la bbb desde los vasos sanguíneos al cerebro. Raeissi, S., Audus, J., "In vitro characterization of blood-brain barrier permeability to delta sleep-inducing peptide", J. Pharm. Phy., 41:848-852 (1989); Zlokovich, B., Susie, V.T., Davson, H. Begley, D.J. Jankov, R.M., Mitrivic, B.M., Lipovac, M.N., "Saturable mechanism for delta sleep-inducing peptide (DSIP) at the blood-brain barrier of the vascularly perfused guinea pig brain", Peptides, 10:249-254 (1989); y Zlokovich, B., "In vivo approaches for studying peptide interaction at the blood-brain barrier", J. Control. Rel., 13:185-201 (1990). Sin embargo, muchas sustancias que pueden afectar al Sistema Nervioso Central (o SNC) tales como adenosina, \beta-endorfina, análogos sintéticos de péptidos endógenos, Houghten, R.A. Swann, R.W., Li, C.H., "\beta-Endorphin: Stability, cleareance behaviour and entry into the central nervous system after intravenous injection of the tritiated peptide in rats and rabbits", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4588-4591 (1980); Levin, E.R., Frank, H.J.K., Weber, M.A., Ismail, M., Mills, M., "Studies on penetration of the blood-brain barrier by atrial natriuretic factor", Biochem. Biophys. Res. Commun., 147:1226-1231 (1987); Sakane, T., Tanaka, C., Yamamoto, A., Hashida, M., Sesaki, H., Ueda, H., Takagi, H., "The effect of polysorbate 80 on brain uptake and analgesic effect of D-kyoto", Int. J. Pharm., 57:77-83 (1989), así como algunos aminoácidos excitatorios e inhibidores y factores tróficos, penetran poco o no penetran en absoluto a través de la bbb. Actualmente, los fármacos que no penetran la bbb o que penetran poco a través de la bbb, pueden ser administrados únicamente mediante infusión directa en el SNC o por implantación de polímeros de liberación controlada. (Ver, por ejemplo, Patente de EE.UU. Nº 4.883.666, Sabel
y col.).

Una forma de superar alguna de las limitaciones de la terapia farmacológica tradicional es incrementar la cantidad relativa de fármaco que atraviesa la bbb. Se cree que si se puede incrementar la cantidad de fármaco que atraviesa la bbb a la vez que se reduce la dosis periférica de un fármaco o de una sustancia para diagnóstico dados, los efectos colaterales periféricos del fármaco serán también menos graves, mientras que se mantiene al mismo tiempo el efecto deseado en el cerebro. Se han descrito varios procedimientos eficaces para incrementar la penetración de fármacos a través de la bbb.

Un procedimiento ha sido alterar la función de la propia bbb. Por ejemplo, agentes osmóticos cuando son administrados periféricamente (tal como mediante inyección intravenosa), tienen como resultado la apertura de la bbb. Además, algunos fármacos que actúan sobre el SNC pueden cambiar la permeabilidad de la bbb para otras sustancias; se ha descrito que las arecolinas colinomiméticas, por ejemplo, inducen cambios en la penetración de fármacos a través de la bbb, Saija, A., Princi, P., De Pasquale, R., Costa, G., "Arecoline but not haloperidol produces changes in the permeability of the blood-brain barrier in the rat", J. Pharm. Pha., 42:135-138 (1990).

Otros fármacos que pueden ser administrados con el fin de alterar la permeabilidad de la bbb están descritos en las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.059.415 y 5.124.146, ambas otorgadas a E.A. Neuwelt. La bradiquinina es un fármaco específico con tales efectos (Patente de EE.UU. Nº 5.112.596, otorgada a Malfroy-Camine). Otro método comprende la administración de péptidos permeabilizantes tales como A-7 o análogos conformacionales del mismo (WO 92/18529, una solicitud de J.W. Kozarich y col.). Un método relativamente invasivo ha sido propuesto por A. Tomasz y E. Toumanen (WO 91/16064), quienes administran inyecciones parenterales de paredes celulares purificadas o de fragmentos de paredes celulares de eubacterias tales como Streptococcus pneumoniae para abrir la bbb.

La Patente de EE.UU. Nº 5.260.210, otorgada a L.L. Rubin y col., describe un método mediante el cual se incrementa la permeabilidad de la barrera hematoencefálica por la administración de un agente que reduce o interfiere con las concentraciones de AMP cíclico o que incrementa las concentraciones de GMP cíclico.

Otro procedimiento es la modificación de las propias moléculas de fármaco. Por ejemplo, macromoléculas tales como proteínas no pasan en absoluto la bbb, o pasan con dificultad o con alteraciones que impactan de manera adversa sobre la eficacia de las proteínas. Por ejemplo, se puede aislar primeramente el sitio activo de la macromolécula, esto es, la porción de la molécula que desencadena el acontecimiento biológicamente deseable, y utilizar luego únicamente este sitio activo. Como el tamaño es uno de los factores que determinan la permeabilidad de la bbb, el tamaño reducido puede ser utilizado de manera que la molécula más pequeña pueda ahora pasar a través de la bbb. Otras modificaciones de las macromoléculas para intentar atravesar la bbb incluyen la glicación de las proteínas, incrementando de este modo su permeabilidad a través de la bbb, o la formación de un profármaco. La Patente de EE.UU. Nº 5.260.308, otorgada a J.F. Podusio y G.L. Curran, discute la glicación de proteínas, mientras que la Patente de EE.UU. Nº 4.933.324 y WO 89/07938, ambas sobre solicitudes de V.E. Shashoua, describen la formación de un profármaco. Estos profármacos son formados a partir de un transportador ácido graso y un fármaco neuroactivo que es incapaz de atravesar la bbb por sí mismo. Un sistema similar está descrito en WO 89/07938.

Otro procedimiento más es la implantación de polímeros de liberación controlada que liberan el ingrediente activo desde un sistema de matrices directamente al tejido nervioso. Si embargo, este procedimiento es invasivo y requiere una intervención quirúrgica si es implantado directamente en el cerebro o en la médula espinal (ver Sabel y col., Patente de EE.UU. Nº 4.883.666; y Sabel y col., Solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/407.930). Se conoce también la administración de composiciones directamente en porciones internas del cerebro, según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.800.390. Estos métodos permiten la administración de preparaciones sólidas y preparaciones semisólidas de liberación mantenida directamente en el tejido cerebral.

Para superar estas limitaciones, se ha intentado otro procedimiento en el que se utilizan sistemas transportadores de fármacos tales como liposomas, fantasmas de eritrocitos, conjugados de anticuerpo y conjugados de anticuerpos monoclonales. Uno de los principales problemas de la administración vectorizada de fármacos es la rápida opsonización y la rápida captación de los transportadores inyectados por el sistema reticuloendotelial (SRE), especialmente por los macrófagos del hígado y del bazo. Este obstáculo puede ser parcialmente superado en el caso de los liposomas mediante la incorporación de los denominados lípidos "sigilosos", tales como fosfatidilinositol, monosialogangliósido o sulfogalactosilceramida.

Las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.182.107 y 5.154.924, ambas otorgadas a P.M. Friden, describen un método para conjugar un fármaco con un anticuerpo en el que el anticuerpo es reactivo con un receptor de transferrina. Los receptores de transferrina están situados en las células endoteliales de los capilares cerebrales, que de este modo pueden transportar un fármaco tal como el factor de crecimiento nervioso a través de la bbb. La Patente de EE.UU. Nº 5.004.697 (otorgada a Pardridge) mejora tal método de conjugación de anticuerpos proporcionando anticuerpos cationizados con un punto isoléctrico específico (ver también WO 89/01343 de Pardridge).

Otro abordaje es la creación de péptidos quiméricos a los que se conjugan los agentes activos (Patente de EE.UU. Nº 4.801.575, otorgada también a Pardridge). Tal sistema se discute además también en la Patente de EE.UU. Nº 4.902.505, otorgada a Pardridge y Schimmel, en la que el péptido quimérico, tal como una histona, es capaz de atravesar la bbb por transcitosis.

Las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.187.158 y 5.017.566, ambas otorgadas a N.S. Bodor, describen un método de administración de fármacos específicos para el cerebro en el que un fármaco que actúa de manera central es administrado con la forma lipoidal biooxidable reducida de un vehículo de una reacción redox dihidropiridina-sal de piridina, tal como dopamina (Ver también la Patente de EE.UU. Nº 4.880.816, otorgada también a Bodor).

Un procedimiento bastante invasivo se lleva a cabo para administrar material genético al cerebro. Esto se realiza, por ejemplo, mediante la ruptura química de la bbb y la utilización posterior de virus para administrar genes a través de la bbb. (Ver, Patente de EE.UU. Nº 4.866.042, otorgada a E.A. Neuwelt). En este caso, se incorpora un material genético corrector a un virus y el virus es inyectado posteriormente en la corriente sanguínea.

Finalmente, otro sistema transportador más para administrar fármacos a través de la bbb es la utilización de liposomas, según está descrito por F.D. Collins y R.C. Thompson (WO 91/04014). En este caso, los liposomas son dirigidos hacia sistemas de transporte específicos endógenos del cerebro que transportan ligandos específicos a través de la bbb.

Otro procedimiento está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 6.117.454, para Kreuter y col. La materia objeto de la patente de Kreuter incluye un método, una composición y un sistema de vectorización de fármacos que utiliza nanopartículas revestidas de surfactante como transportadores de fármacos (o moléculas de vectorización) para un amplio rango de fármacos, con el fin de incrementar la penetración de fármacos o de agentes de diagnóstico a través de la bbb.

Otro procedimiento es la administración de fármacos intranasalmente, permitiendo un acceso directo al cerebro y evadiendo la corriente sanguínea. Esto se ha realizado con éxito en un modelo experimental para tres neuropéptidos, melanocortina, vasopresina e insulina: Born, J. Y col., "Sniffing neuropeptides: a transnasal approach to the human brain", Nature Neuroscience, Anticipo de publicación "online": 6 de Mayo de 2002, DOI:10.1038/nn849.

Las formas de dosificación sólidas para administración oral incluyen cápsulas, tabletas, píldoras, polvos y gránulos. En tales formas de dosificación sólidas, el compuesto activo está normalmente mezclado con al menos uno de los siguientes: (a) uno o más excipientes (o vehículos) inertes tales como citrato de sodio o fosfato dicálcico; (b) agentes de carga o expansores, tales como almidones, lactosa, sacarosa, glucosa, manitol y ácido silícico; (c) aglutinantes tales como carboximetilcelulosa, alginatos, gelatina, polivinilpirrolidona, sacarosa y acacia; (d) humectantes tales como glicerol; (e) agentes desintegrantes tales como agar-agar, carbonato de calcio, almidón de patata o de tapioca, ácido algínico, ciertos silicatos complejos y carbonato de sodio; (f) retardadores de la disolución tales como parafina; (g) aceleradores de la absorción tales como compuestos de amonio cuaternario; (h) agentes humidificadores tales como acetil alcohol y monoestearato de glicerol; (i) adsorbentes tales como caolín y bentonita y (j) lubricantes tales como talco, estearato de calcio, estearato de magnesio, polietilén glicoles sólidos, lauril sulfato de sodio o mezclas de los mismos. Para cápsulas, tabletas y píldoras las formas de dosificación pueden contener también agentes tamponantes.

Las formas de dosificación líquidas para administración oral incluyen emulsiones, soluciones, suspensiones, jarabes y elixires farmacéuticamente aceptables. Además de los compuestos activos secuencias Harlil, las formas de dosificación líquidas pueden contener diluyentes inertes comúnmente utilizados en la técnica, tales como agua u otros solventes, agentes solubilizantes y emulsionantes. Ejemplos de emulsionantes son alcohol etílico, alcohol isopropílico, carbonato de etilo, acetato de etilo, alcohol bencílico, benzoato de bencilo, propilénglicol, 1,3-butilénglicol, dimetilformamida, aceites tales como aceite de algodón, aceite de cacahuete, aceite de germen de maíz, aceite de oliva, aceite de ricino y aceite de sésamo, glicerol, alcohol tetrahidrofurfurílico, polietilénglicoles, ésteres de ácidos grasos de sorbitán o mezclas de estas sustancias, y similares. Además de tales diluyentes inertes, la composición puede incluir también adyuvantes tales como agentes humidificadores, agentes emulsionantes y agentes de suspensión, agentes edulcorantes, aromatizantes y perfumantes.

Otro método para administrar el segmento de NTP es por vía transdérmica o transcutánea. Un ejemplo de tal realización es la utilización de un parche. En particular, un parche puede ser preparado con una suspensión fina del segmento de NTP en, por ejemplo, dimetilsulfóxido (DMSO) o en una mezcla de DMSO con aceite de algodón y la puesta en contacto con la piel del mamífero lejos del lugar de tratamiento. La composición puede estar presente dentro de un saco cutáneo. Otros medios o mezclas de los mismos con otros solventes y soportes sólidos funcionarían igualmente bien. El parche puede contener el segmento de NTP en forma de una solución o una suspensión. El parche puede ser aplicado posteriormente a la piel del paciente, por ejemplo, por medio de la inserción del mismo en un saco de piel del paciente formado plegando la piel y sujetándola por medio de puntos de sutura, clips y otros dispositivos de sujeción. Este saco debe ser empleado de tal manera que se asegure el contacto continuo con la piel sin la interferencia del mamífero. Además de la utilización de un saco cutáneo, puede utilizarse cualquier dispositivo que asegure la colocación firme del parche en contacto con la piel. Por ejemplo, podría utilizarse un vendaje adhesivo para mantener el parche en su lugar sobre la piel.

Los niveles reales de dosificación de los ingredientes activos en las composiciones de la invención, pueden variarse para obtener una composición que contenga un segmento de NTP que sea eficaz para obtener la respuesta terapéutica inhibidora de la necrosis tisular deseada para una composición y un método de administración particulares. El nivel de dosificación seleccionado depende por tanto del efecto terapéutico deseado, de la vía de administración, de la duración deseada del tratamiento y de otros factores.

Con los mamíferos, incluyendo humanos, las cantidades eficaces pueden ser administradas sobre la base del área de la superficie corporal. La interrelación de dosis para animales de varios tamaños, de varias especies y humanos (basada en los mg/m^{2} de superficie corporal) está descrita por E.J. Freireich y col., Cancer Chemother. Rep., 50(4):219 (1966). El área de la superficie corporal puede ser determinada aproximadamente a partir de la altura y del peso del individuo (ver, por ejemplo, Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y., pp. 537-538 (1970)).

La dosis diaria total del segmento de NTP que es administrada a un huésped puede ser en una sola dosis o en dosis divididas. Las composiciones de unidad de dosificación pueden contener cantidades de tales submúltiplos de la misma, ya que pueden ser utilizadas para completar la dosis diaria. Se comprenderá, sin embargo, que el nivel de dosis específico para un paciente particular dependerá de una variedad de factores, incluyendo el peso corporal, la salud general, el sexo, la dieta, la hora y la vía de administración, la potencia del fármaco administrado, las velocidades de absorción
y excreción, la combinación con otros fármacos y la gravedad de la enfermedad particular que esté siendo tratada.

Las composiciones que contienen el segmento de NTP de la presente invención contienen preferiblemente un componente que permite al segmento de NTP atravesar la barrera hematoencefálica para tratar tejido cerebral vivo. Puede utilizarse cualquiera de la variedad de componentes anteriormente descritos para hacer que los segmentos sean capaces de atravesar la barrera hematoencefálica. Por ejemplo, los segmentos de NTP pueden ser suficientemente pequeños para atravesar la barrera hematoencefálica. En este caso no se requeriría ningún componente adicional.

Los segmentos de NTP de la misma pueden ser glicados para incrementar la permeabilidad de la bbb, según se describe en la Patente de EE.UU. Nº 5.260.308, o formados en un profármaco según se describe en la Patente de EE.UU. Nº 4.933.324 y WO 89/07938. Estos profármacos se forman preferiblemente a partir de un transportador ácido graso y un segmento de NTP que es incapaz de pasar por sí mismo a través de la bbb.

Un procedimiento alternativo es la implantación de polímeros de liberación controlada que liberan los segmentos de NTP desde un sistema de matrices directamente al tejido nervioso (ver Sabel y col., Patente de EE.UU. Nº 4.883.666; y Sabel y col., solicitud de Patente de EE.UU. Nº de Serie 07/407.930). Es también posible utilizar sistemas transportadores de fármacos tales como liposomas, fantasmas de eritrocitos, conjugados de anticuerpos y conjugados de anticuerpos monoclonales. De acuerdo con esta realización de la invención, pueden utilizarse los denominados lípidos "sigilosos", tales como fosfatidilinositol, monosialogangliósido o sulfogalactosilceramida, para formar los liposomas que contienen los anticuerpos y conjugados de anticuerpos anteriormente mencionados.

Los segmentos de NTP pueden ser conjugados con un anticuerpo que sea reactivo con un receptor de transferrina, según se describe en las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.182.107 y 5.154.924. Los receptores de transferrina están situados en las células endoteliales de los capilares del cerebro, que transportan así un fármaco, tal como el factor de crecimiento nervioso, o segmentos de NTP, a través de la bbb. El conjugado segmento de NTP-anticuerpo anteriormente descrito puede ser intensificado adicionalmente proporcionando anticuerpos cationizados con un punto isoeléctrico específico, según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 5.004.697 y en WO 89/01343.

Otra realización de la invención incluye la creación de péptidos quiméricos a los que se conjugan los segmentos de NTP activos, según se describe en la Patente de EE.UU. Nº 4.801.575. El péptido quimérico es preferiblemente una histona, que es capaz de atravesar la bbb mediante transcitosis, según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 4.902.505. Una realización adicional de la invención incluye la provisión de segmentos los de NTP junto con la forma lipoidal biooxidable reducida de un vehículo de una reacción redox dihidropiridina-sal de piridina tal como dopamina, según está descrito en las Patentes de EE.UU. N^{os} 4.880.816, 5.187.158 y 5.017.566.

Puede emplearse también otro procedimiento para administrar los segmentos de NTP al cerebro. Esto puede ser realizado rompiendo químicamente la bbb y utilizando posteriormente virus para administrar los segmentos de NTP a través de la bbb, según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 4.866.042. En este caso, se prefiere que un material genético corrector sea incorporado a un virus y el virus sea inyectado posteriormente en la corriente sanguínea. Otro sistema transportador más que puede ser utilizado para administrar los segmentos de NTP a través de la bbb es la utilización de liposomas, según está descrito por F.D. Collins y R.C. Thompson (WO 91/04014). En este caso, los liposomas son dirigidos preferiblemente hacia sistemas de transporte cerebrales endógenos específicos que transportan ligandos específicos a través de la bbb. Pueden utilizarse también nanopartículas revestidas con surfactante como transportadores de fármacos (o moléculas vectorizantes) para los segmentos de NTP de la invención con el fin de incrementar la penetración de los mismos a través de la bbb, según está descrito en la Patente de EE.UU. Nº 6.117.454.

Otro procedimiento es la utilización de la oxidasa de L-aminoácidos con el fin de reducir el nivel plasmático de los segmentos de NTP para permitir el transporte de los segmentos de NTP a través de la bbb. Tal procedimiento está descrito con más detalle en la Patente de EE.UU. Nº 5.695.751.

Otro procedimiento es administrar localmente las composiciones que contienen los segmentos de NTP. Dispositivos útiles para administrar composiciones a una porción interna del cerebro están descritos en, por ejemplo, la Patente de EE.UU. Nº 5.800.390.

Preparaciones sólidas y preparaciones semisólidas de liberación mantenida pueden ser administradas directamente al tejido cerebral. Tal administración puede ser llevada a cabo insertando un miembro similar a una aguja de tal dispositivo intracerebral que está opcionalmente implantado en la cabeza de manera que un extremo distal de la guía esté colocado en el lugar de administración.

Una composición preferida de la presente invención para ser administrada a un mamífero que padezca de una condición asociada con muerte celular y/o necrosis tisular, contiene los segmentos de NTP y un componente que permite a los segmentos de NTP atravesar la bbb. Otras composiciones preferidas de la presente invención incluyen un gen que expresa los segmentos de NTP y un componente que permite al gen atravesar la bbb. Una composición preferida adicional de la presente invención incluye una vacuna que induce la expresión de los segmentos de NTP y un componente que permite a la vacuna atravesar la bbb.

En la presente invención se prefiere que la cantidad de los segmentos de NTP que entra en contacto con el tejido vivo sea una cantidad suficiente para inhibir, prevenir y/o aliviar la muerte celular y/o la necrosis tisular. La cantidad específica puede ser determinada por los expertos en la técnica, utilizando las directrices proporcionadas en la presente. Se prefiere que sean administrados suficientes segmentos de NTP para reducir la muerte celular o la necrosis tisular en más de un 50%, cuando se compara con un control en el que no está presente ningún segmento de NTP y la muerte celular procede incontroladamente. Más preferiblemente, los segmentos de NTP son administrados para reducir la muerte celular o la necrosis tisular en más de un 60%, incluso más preferiblemente en más de un 70% y muy preferiblemente en más de un 75%, cuando se compara con un control en el que no está presente ningún segmento de NTP y la muerte celular o la necrosis tisular proceden incontroladamente.

Tal cantidad dependerá invariablemente del tipo particular de tejido, de los segmentos de NTP utilizados, así como de la cantidad de NTP o de otra diana molecular. Mediante la utilización de los métodos descritos en cualquiera de las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.948.634, 5.948.888, 5.830.670 y 6.071.705 anteriormente mencionadas, puede calcularse la cantidad relativa de NTP o de otras dianas moleculares presentes, y llevar a cabo posteriormente una serie de experimentos in vitro utilizando tejido de mamífero obtenido de varias fuentes, tales como cualquiera de las descritas en las Patentes de EE.UU. anteriormente mencionadas, determinando la cantidad de NTP o de otra diana molecular en el tejido, y determinando posteriormente la cantidad requerida de segmentos de NTP que se precisa para obtener el grado requerido de prevención de la muerte celular o de la necrosis tisular (esto es, preferiblemente más de un 60% cuando se compara con un control). Los técnicos expertos son capaces de llevar a cabo estos experimentos utilizando técnicas conocidas en el oficio, además de utilizar las directrices proporcionadas en la presente.

La cantidad de segmentos de NTP a administrar al mamífero puede ser luego fácilmente determinada sobre la base del peso corporal del mamífero y de la cantidad de suministro al tejido esperada. La cantidad de segmentos de NTP que se espera que sea administrada al tejido cerebral de un mamífero dependerá del mecanismo particular que se emplee para hacer que los segmentos de NTP sean capaces de atravesar la bbb. Se cree que lo mismo es válido para la administración de genes que expresan los segmentos de NTP o para la administración de vacunas que inducen la expresión o la producción de los segmentos de NTP. Una vez más, los expertos en la técnica son capaces de determinar la dosis apropiada del gen, de la vacuna o de los segmentos de NTP que van a ser administrados a un mamífero utilizando las técnicas descritas en las patentes anteriormente mencionadas proporcionadas en las mismas y en la presente.

Los ejemplos siguientes se proporcionan para ilustrar la presente invención. Debe comprenderse, sin embargo, que la invención no está limitada a las condiciones o detalles específicos descritos en estos ejemplos.

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Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra la muerte celular en tejido vivo (in vivo) debida a la presencia de AD7C-NTP.

La AD7C-NTP fue obtenida de acuerdo con los procedimientos esquematizados en cualquiera de las Patentes de EE.UU. N^{os} 5.948.634, 5.948.888, 5.830.670 y 6.071.705.

Ocho ratas normales fueron inyectadas en la piel y subcutáneamente, cada una en tres focos diferentes, con AD7C-NTP recombinante purificada en solución salina a concentraciones de 0,1-1,0 \mug/ml, administrada con jeringas de plástico a través de agujas de acero inoxidable de calibre 26.

Los animales fueron observados durante 24 horas y sacrificados de forma indolora a las 24 horas. Los 24 focos individuales de infiltración fueron cortados, fijados en formalina al 10%, incluidos en parafina y teñidos y examinados mediante métodos estándar de histopatología.

Grupos similares de ratas control fueron inyectados con (1) seroalbúmina bovina en solución salina, (2) suero humano normal y (3) solución salina fisiológica, y examinados y sacrificados igual que anteriormente, tratando los focos de inyección escindidos igual que anteriormente.

La inyección de AD7C-NTP produjo en todos los ejemplos necrosis aguda del tejido en los lugares de inyección. La necrosis era evidente en el tejido muscular, en el tejido conectivo subcutáneo y en la dermis de los lugares en los que se inyectó AD7C-NTP. A las 24 horas, las células aparecían pálidas, contraídas y necróticas, y había infiltración de células inflamatorias. La necrosis se correlacionaba con las áreas de inyección y no parecía propagarse mucho más allá del lugar de inyección.

Los controles no presentaban evidencia de necrosis o de pérdida celular. Las inyecciones control presentaban una inflamación aguda de leve a mínima y microhemorragias focales derivadas de las agujas.

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Ejemplo 2

La finalidad de este ejemplo era identificar varias secuencias Harlil de la proteína fibrilar neural AD7C-NTP y determinar su reactividad con AD7C-NTP.

Se sintetizaron las siguientes secuencias Harlil (Synpep, Dublin, CA) y se conjugaron a IgG de conejo activada con maleimida (Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) y se determinó su inmunorreactividad con NTP. Se añadió un adaptador que era una repetición de la secuencia de proteínas que está presente antes y después de la secuencia 90-96 H H A R L C L de la AD7C-NTP.

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1.	(NTP-1)	L H A R L C L A N F C G R N R V
2.	(NTP-2)	L A R L C L A N F C G N N N V
3.	(NTP-3)	C A R Y R T G H H A R L M
4.	(NTP-4)	H H A R L P L A N F C G
5.	(NTP-5)	R T G H H A R L C L A N F C
6.	(NTP-6)	C E S A R Y R T G H H A R L C
7.	(NTP-7)	D N T H H A R L I L
8.	(NTP-8)	S H H A R L I L

La conjugación a proteínas transportadoras se realizó a través de una cisteína. De este modo, los péptidos NTP-1 y NTP-2 producían resultados de conjugados mixtos porque había más de un residuo de cisteína. Por tanto, para los péptidos NTP-5 y NTP-6, se bloqueó la cisteína secundaria con Acetamido Metil (C_{3}H_{6}NO) (ACM).

La posición de las secuencias identificadas dentro de la secuencia de AD7C-NTP puede observarse en la Fig. 1. Según se mencionó anteriormente, homólogos, derivados, miméticos y variantes de los péptidos Harlil están también incluidos dentro del ámbito de la invención. Para la construcción de los péptidos homólogos de este ejemplo, se utilizaron aminoácidos homólogos. Los criterios de sustitución utilizados fueron carga y/o tamaño. De este modo, la elección de sustituir cisteína por metionina en el péptido 3 de NTP se basó en la similitud global entre estos dos aminoácidos y en el deseo de eliminar una cisteína reactiva de este tramo de aminoácidos particular. La elección de sustituir cisteína por prolina fue un intento para ver si esta sustitución remedaría la forma conformacional del péptido cuando estaba en la proteína y la cisteína estaba en un enlace disulfuro.

Otros cambios conocidos por las personas con experiencia en la técnica para influir sobre, o estudiar, las interacciones de afinidad incluyen, pero no se limitan a, por ejemplo, el intercambio de leucina con otros aminoácidos hidrofóbicos tales como isoleucina, valina, alanina o glicina; el intercambio de aminoácidos ácidos o de aminoácidos básicos; el intercambio de histidina con fenilalanina para determinar el efecto de la carga frente al espacial; el intercambio de asparragina con aspártico, o de glutamina con glutámico, para evaluar el efecto de la carga frente al espacial; y el intercambio de serina con treonina, treonina con cisteína, aspártico con glutámico, arginina con lisina o histidina y tirosina con triptófano o fenilalanina. Los cambios introducidos en las secuencias flanqueantes se realizaron para hacer que el péptido fuera menos básico o hidrofóbico.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra la prevención y/o inhibición de necrosis de tejido vivo (in vivo) por la administración de un segmento de NTP o de un homólogo, variante, mimético o derivado del mismo que une la NTP a tejido que contiene NTP.

La AD7C-NTP fue obtenida según se describió anteriormente en el Ejemplo 1.

Se utilizaron en este ejemplo las secuencias Harlil NTP-1, NTP-3 y NTP-7 preparadas de acuerdo con el Ejemplo 2 anterior.

Se incubaron muestras de AD7C-NTP recombinante de 100 ng/ml-10 \mug/ml a temperatura ambiente, de 5 minutos a una hora, con las secuencias Harlil anteriormente mencionadas y posteriormente se inyectaron a ratas según se describió en el Ejemplo 1.

Alternativamente, se preparó una solución de la secuencia Harlil en concentraciones que variaban de 1 microgramo/ml a 1 miligramo/ml. Se prepararon también soluciones que contenían la AD7C-NTP recombinante según se describió anteriormente, sin la adición de la secuencia Harlil. Los animales fueron inyectados con 100 microlitros aproximadamente de la solución de AD7C-NTP y con 100 microlitros aproximadamente de la solución de
Harlil.

Los animales fueron observados durante 24 horas y sacrificados de forma indolora a las 24 horas. Los 24 focos de infiltración individuales fueron cortados, fijados en formalina al 10%, incluidos en parafina y teñidos y examinados mediante métodos estándar de histopatología.

Grupos similares de ratas control fueron inyectados con (1) AD7C-NTP sola según se describió en el Ejemplo 1, (2) seroalbúmina bovina en solución salina, (3) suero humano normal y (4) solución salina fisiológica, y se examinaron y sacrificaron igual que anteriormente, tratándose los focos de inyección escindidos igual que anteriormente.

Las inyecciones control de AD7C-NTP sola produjeron necrosis tisular, según se describió en el Ejemplo 1. Las inyecciones control de seroalbúmina bovina (BSA), suero humano normal y solución salina fisiológica no mostraron ninguna de ellas evidencia de necrosis o de pérdida celular. Las inyecciones control anteriores presentaban una inflamación aguda de leve a mínima y microhemorragias focales derivadas de las agujas.

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Las muestras de AD7C-NTP que fueron inyectadas junto con cada una de las secuencias Harlil NTP-1, NTP-3 y NTP-7, mostraban más de un 95% de reducción de la necrosis tisular cuando se compararon con las muestras control inyectadas con AD7C-NTP sola. Hubo nódulos focales ocasionales de focos de células inflamatorias con la formación de micronódulos que parecían ser posiblemente agregaciones de AD7C-NTP y de la secuencia Harlil. La lesión tisular total fue reducida >95% por la administración del segmento de NTP (o secuencia Harlil), cuando se comparó con los controles que fueron inyectados únicamente con AD7C-NTP.

Claims (6)

1. \global\parskip0.910000\baselineskip

   1. Utilización de al menos un segmento de NTP en la producción de una composición para el tratamiento y/o la prevención y/o la inhibición de condiciones asociadas con la muerte celular y/o la necrosis tisular en tejido cerebral de mamífero vivo, donde la composición contiene además un componente que permite al segmento de NTP atravesar la barrera hematoencefálica.
2. 2. La utilización de acuerdo con la reivindicación 1, en la que al menos un segmento de NTP contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de:

   a)

   THARLIL; HHARLCL; MFARLIL; HHARLIF;

   b)

   HHARL; HARL; HARLI; HARLIL; HHARLCL; ARLIL; HHARLIF; THARLIL; ARLI; ARL; HARLCL; ARLCL; ARCL; MFARLIL; FARLIL; FARLI; FARL; HARLIF; ARLIF;

   c)

   LHARLCLANFCGRNRV;

   d)

   LARLCLANFCGNNNV;

   e)

   CARYRTGHHARLM;

   f)

   HHARLPLANFCG;

   g)

   RTGHHARLCLANFC;

   h)

   CESARYRTGHHARLC;

   i)

   DNTHHARLIL;

   j)

   SHHARLIL; y

   k)

   HARLML, HARLVL y HAKLIL

   y variantes, homólogos, derivados y miméticos de las mismas.
3. 3. La utilización de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en la que la condición es un trastorno neurodegerativo.
4. 4. La utilización de acuerdo con la reivindicación 3, en la que el trastorno neurodegerativo es la Enfermedad de Alzheimer.
5. 5. Una composición para tratar condiciones asociadas con la muerte celular y/o la necrosis tisular, que comprende un segmento de NTP y un componente que permite al segmento de NTP atravesar la barrera hematoencefálica.
6. 6. La composición de la reivindicación 5, en la que al menos un segmento de NTP contiene una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consta de:

   a)

   THARLIL; HHARLCL; MFARLIL; HHARLIF;

   b)

   HHARL; HARL; HARLI; HARLIL; HHARLCL; ARLIL; HHARLIF; THARLIL; ARLI; ARL; HARLCL; ARLCL; ARCL; MFARLIL; FARLIL; FARLI; FARL; HARLIF; ARLIF;

   c)

   LHARLCLANFCGRNRV;

   d)

   LARLCLANFCGNNNV;

   e)

   CARYRTGHHARLM;

   f)

   HHARLPLANFCG;

   g)

   RTGHHARLCLANFC;

   h)

   CESARYRTGHHARLC;

   i)

   DNTHHARLIL;

   j)

   SHHARLIL; y

   k)

   HARLML, HARLVL y HAKLIL

   y variantes, homólogos, derivados y miméticos de las mismas.