DE60205366T2

DE60205366T2 - Prävention des zelltodes durch verwendung der segmente der neurofilamentproteine

Info

Publication number: DE60205366T2
Application number: DE60205366T
Authority: DE
Inventors: A. Paul AVERBACK
Original assignee: Nymox Corp Canada
Current assignee: Nymox Corp Canada
Priority date: 2001-05-16
Filing date: 2002-05-16
Publication date: 2006-05-24
Anticipated expiration: 2022-05-17
Also published as: ATE381342T1; BR0209630A; KR20040008177A; DE60224231D1; US7572450B2; WO2002092115A2; EP1392347A2; US20030004107A1; EP1392347B1; CN1558770A; CA2446945A1; HK1060851A1; DK1392347T3; ATE300951T1; DE60205366D1; ES2247329T3; WO2002092115A3; JP2004529179A

Description

Diese Anmeldung nimmt die Priorität der US-Provisional-Patentanmeldung Nr. 60/290,971 mit dem Titel „Method of Preventing Cell Death Using Segment of Neural Thread Proteins" in Anspruch.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
1. Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Vorbeugung von Zelltod und Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die eine Vorbeugung, Hemmung und/oder Besserung von Zelltod und Gewebenekrose erfordern. Die Erfindung umfasst die Verwendung eines Segments von Neural Thread Proteinen (NTP) oder einem Homologon, Derivat, einer Variante oder einem Mimetikum davon zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Verabreichung bei einem Säuger bei dem Zelltod erfolgt. Das Segment kann intramuskulär, oral, intravenös, intraperitoneal, intrazerebral (intraparenchymal), intrazerebroventikulär, intratumoral, intraläsional, intradermal, intrathekal, intranasal, intraokulär, intraartheriell, topisch, transdermal, über ein Aerosol, eine Infusion, Bolusinjektion, Implantatvorrichtung, ein System zur andauernden Freisetzung, etc. entweder einzeln oder an einen Träger konjugiert verabreicht werden. Alternativ kann das Segment in vivo exprimiert werden, indem ein Gen verabreicht wird, welches das Segment exprimiert, durch Verabreichen eines Vakzins, das eine solche Produktion hervorruft oder durch Einbringen von Zellen, Bakterien oder Viren, welche das Segment in vivo entweder aufgrund genetischer Modifikation oder aufgrund anderer Ursachen exprimieren.
2. Beschreibung des verwandten Fachbereichs
Alzheimer Erkrankung (AD) ist eine komplexe neurodegenerative Störung, die durch fortschreitende Beeinträchtigungen des Gedächtnisses, des Verhaltens, der Sprache und der räumlichen Sehfähigkeiten gekennzeichnet ist und schließlich zum Tod führt. Kennzeichnende Pathologien in den anfälligen Regionen beinhalten extrazelluläre β-Amyloid Ablagerungen, intrazelluläres neurofibrilläres Gewirr, Verlust von Synapsen und erheblichen neuronalen Zelltod. Bei der Forschung nach den Ursachen und Behandlungsmöglichkeiten der Alzheimer Erkrankung haben Forscher zahlreiche Wege beschritten. Beachtliche Anzeichen in der Ätiologie der Erkrankung haben Veränderungen bei der Herstellung oder Verarbeitung des menschlichen Amyloidvorläuferproteins (APP) mit sich gebracht. Die intensive Forschung hat jedoch gezeigt, dass es sich bei AD um eine Erkrankung mit zahlreichen Faktoren handelt, die viele unterschiedliche, möglicherweise überlappende Ätiologien aufweist.
Aufgrund dessen wurde von den Fachleuten eine ausgiebige Forschung und klinische Untersuchungen durchgeführt, um die strukturellen Defizite, chemischen Veränderungen und funktionellen Abweichungen sowohl im Gehirn als auch innerhalb verschiedener Populationen von Nervenzellen zu untersuchen. Der Umfang solcher Untersuchungen und Studien wird durch die folgenden Veröffentlichungen wiedergegeben, welche nur eine Handvoll der unzähligen Berichte auf diesem Gebiet darstellen: Neurobiology of Alzheimer's Disease (D. Dawbarn und S. J. Allen, Herausgeber), Bios, Oxford 1995; Dementia, (J. Whitehouse, Hrsg.), F. A. Davis Company, Philadelphia, 1993; Alzheimer's Disease: Senile Dementia and Related Disorders (Katzman, R, und R. L. Bick, Hrsg.), Raven Press, New York, 1994, Seiten 47–51; Alzheimer's Disease and Related Disorders, Etiology, Pathogenesis and Therapeutics (Iqbol, K., et al., Hrsg.), Wiley, Chichester, 1999; Alzheimer's Disease: Advances in Clinical and Basic Research (Corain, B, Hrsg.), Wiley, New York, 1993; Alzheimer's Disease: Clinical and Treatment Perspectives (Cutler, N. R., et al., Hrsg.), Wiley, Chichester, 1995; Alzheimer's Disease: Therapeutic Strategies (Giacobini, E., Becker, R., Hrsg.), Birkhauser, Boston, 1994; Paykel, et al., Arch. Gen. Psychiat., 51: 325–332 (1994); Amaducci, et al., Neurology, 36: 922–931 (1986); McKhann, et al., Neurology 34: 939–944 (1984), Heston et al., Arch. Gen. Psychiatry 38: 1085–1090 (1981); Aging of the Brain (Gispen und Traber, Hrsg.), Elsevier Science Publishers, Amsterdam, 1983, Seiten 275–282; Heyman et al., Ann. Neurol 15: 335–341 (1984); Brayne C. und P. Calloway, Lancet 1: 1265–1267 (1988); Roth et al., Br. J. Psychiatry 149: 698–709 (1986); Medical Research Council, Report from the NRC Alzheimer's Disease Workshop, London, England, 1987; Morris et al., Neurology 41: 469–478 (1991); sowie die in diesen Veröffentlichungen zitierten Literaturstellen.
Bis heute ist die Alzheimer Erkrankung die drittteuerste Erkrankung in den Vereinigten Staaten, durch welche der Gesellschaft jährlich etwa 100 Milliarden $ an Kosten entstehen. Alzheimer ist eine der häufigsten Erkrankungen der älteren Bevölkerung und sie wird mit dem zunehmenden Alter der Gesellschaft immer bedeutender werden. Kosten, die mit AD im Zusammenhang stehen, beinhalten direkte medizinische Kosten wie beispielsweise Altenheimpflege, direkte nicht-medizinische Kosten wie beispielsweise Heimtagesbetreuung und indirekte Kosten wie beispielsweise ein Produktivitätsverlust des Patienten und des Pflegepersonals. Medizinische Behandlung und Verhaltensänderung können ökonomischen Nutzen bringen, indem die Geschwindigkeit des kognitiven Abbaus verlangsamt wird, die Institutionalisierung verzögert wird, die Stundenzahl des Pflegepersonals verringert wird und die Lebensqualität verbessert wird. Pharmakoökonomische Auswertungen haben positive Ergebnisse gezeigt hinsichtlich der Wirkung der Arzneimitteltherapie und der Verhaltensänderung bei der Unterbringung in Pflegeheimen, Kognition und Zeit des Pflegepersonals.
Neural Thread Proteine (NTP) sind eine Familie von Gehirnproteinen, die vor kurzem charakterisiert wurden. Ein Mitglied dieser Familie, AD7C-NTP, ist ein ~41 kD membranassoziiertes Phosphoprotein mit Funktionen, die mit dem Nervenwachstum im Zusammenhang stehen (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997); de la Monte et al., Alz. Rep. 2: 327–332 (1999); de la Monte SM und Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3: 345–353 (2001)). Das Gen, welches AD7C-NTP kodiert und die vorhergesagte Proteinsequenz für AD7C-NTP sind identifiziert und beschrieben worden (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997)). Zusätzlich zu der ~41 kD-Spezies sind andere Spezien Neuraler Thread Proteine (~26 kD, ~21 kD, ~17 kD und ~15 kD) identifiziert und mit neuroektodermalen Tumoren, Astrozytoma und Glioblastoma sowie mit Verletzung aufgrund von Hypoxie, Ischämie oder Hirninfarkt in Zusammenhang gesetzt worden (Xu et al., Cancer Research 53: 3823–3829 (1993); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10): 1038–50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1–2): 26–35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118–25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997); und de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327–332 (1999)).
Spezien Neuraler Thread Proteine sind beschrieben und in den US-Patenten Nr. 5,948,634; 5,948,888 und 5,830,670 jeweils für „Neural Thread Protein Gene Expression and Detection of Alzheimer's Disease" und in US-Patent Nr. 6,071,705 für „Method of Detecting Neurological Disease or Dysfunction" beansprucht worden. Die Offenbarungen dieser Patente sind hierin speziell vollständig als Referenz inbegriffen. Wie hierin beschrieben wird NTP während des Zelltodes aufreguliert und produziert. Somit überproduzieren tote und sterbende Nervenzellen NTP und dementsprechend zeigt das Vorhandensein von NTP den Tod von Nervenzellen und die Entstehung von Alzheimer Erkrankung (AD) an.
Andere Spezien von Neuralem Thread Protein sind als andere Produkte des AD7C-NTP-Gens identifiziert worden (z.B. ein Protein mit 112 Aminosäuren, das in NCBI Entrez-Protein Database Accession #XP_032307 PID g15928971 beschrieben ist) oder sie wurden als ähnlich zu Neuralen Thread Proteinen identifiziert (z.B. ein 106 Aminosäurenprotein, das in NCBI Entrez-Protein Database Accession #AAH14951 PID g15928971 beschrieben ist, ein weiteres Protein mit 106 Aminosäuren, das in NCBI Entrez-Protein Database Accession #XP_039102 PID g18599339 beschrieben ist und ein Protein mit 61 Aminosäuren, das in NCBI Entrez-Protein Database Accession #AAH02534 PID g12803421 beschrieben ist).
Es liegen überzeugende Beweise dafür vor, dass die AD7C-NTP-Spezies des Neuralen Thread Proteins insbesondere mit AD und dessen Hochregulierung während des Zelltodes bei AD verbunden ist. AD7C-NTP-mRNA wird im Vergleich zu Kontrollen im AD-Gehirn hochreguliert; AD7C-NTP-Proteinmengen im Gehirn und im CSF sind höher bei AD als in Kontrollen; und AD7C-NTP-Immunoreaktivität findet sich bei seniler Plaque, neurofibrillärem Gewirr (NFT), degenerierenden Neuronen, Neuropilusfäden und dystrophischen neurotischen Trieben in Gehirnen mit AD und Down-Syndrom (Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 419–423 (1989); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 86(3): 1004–13 (1990); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 113(2): 152–64 (1992); de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6): 733–42 (1992); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10): 1038–50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1–2): 26–35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118–25 (1996); de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997); und de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327–332 (1999)). Die Immunozytochemie zeigte, dass das AD7C-NTP-Protein in Zellen lokalisiert ist, in feinen Prozessen in dem Neutropilus oder extrazellulär in Gehirnen mit sowohl AD als auch Down-Syndrom, de la Monte et al., Ann. Neurol., 32(6): 733–42 (1992). Zwei Arten von Zellen enthalten AD7C-NTP: Neuronen und Astrozyten (Id.) Die betroffenen Neuronen sind die großen pyramidalen Neuronen, welche typischerweise das im AD-Gehirn bekannte neurofibrilläre Gewirr enthalten (Id.)
Sowohl im CSF als auch im Urin von AD-Patienten sind erhöhte Mengen an AD7C-NTP-Protein gefunden worden, was dessen Genauigkeit als biochemischer Maßstab für diese verheerende Erkrankung zeigt (de la Monte und Wands, Front Biosci 7: 989–96 (2002); de la Monte und Wands, Journal of Alzheimer's Disease 3: 345–353 (2001); Munzar et al., Alzheimer's Reports 4: 61–65 (2001); Kahle et al., Neurology 54: 1498–1504 (2000) und Averback Neurology 55: 1068 (2000); Munzar et al., Alzheimer Reports 3: 155–159 (2000); de la Monte et al., Alzheimer's Reports 2: 327–332 (1999); Ghanbari et al., J Clin Lab Anal 12: 285–288 (1998); Ghanbari et al., J. Clin Lab Anal 12: 223–226 (1998); Ghanbari et al., Journal of Contemporary Neurology 1998; 4A: 2–6 (1998); und de la Monte et al., J Clin Invest 100: 3093–3104.
Die Überexpression des AD7C-NTP-Gens ist auch mit dem Vorgang des Zelltodes bei Alzheimer Erkrankung in Zusammenhang gesetzt worden (de la Monte und Wands, J. Neuropatho. and Exp. Neuro., 60: 195–207 (2001); de la Monte und Wands, Cell Mol Life Sci 58: 844–49 (2001). AD7C-NTP ist auch im Hirngewebe bei Down-Syndrom identifiziert worden (Wands et al., Internationale Patentveröffentlichungsschrift Nr. WO 90/06993; de la Monte et al., J Neurol Sci 135: 118–25 (1996); de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327–332 (1999)). Es gibt Anzeichen dafür, dass eine Überexpression des AD7C-NTP-Gens auch mit Normaldruckglaukoma einhergehen kann (Golubnitschaja-Labudova et al., Curr Eye Res 21: 867–76 (2000)).
Die Erfinder haben vor kurzem entdeckt, dass freigesetztes AD7C-NTP-Protein zytotoxisch war und fähig war, Zelltod anderer Zellen im Gewebe hervorzurufen (im Vergleich zu hochreguliertem AD7C-NTP, das in der sterbenden Zelle selbst produziert wird), wie in der anhängigen US-Patentanmeldung mit dem Titel „Methods of Treating Tumors and Related Conditions Using Neural Thread Proteins" offenbart ist.
Dementsprechend wäre es wünschenswert, Zelltod und Gewebenekrose im Zusammenhang mit Neuralen Thread Proteinen, besonders im AD-Gehirn, vorzubeugen, zu hemmen, zu modulieren oder zu bessern.
Vor kurzem ist auch entdeckt worden, dass Segmente von NTP in Bindungsassays, bei der Reinigung von NTP und als diagnostische Mittel als Ersatz für NTP verwendet werden könnten, die in der anhängigen US-Patentanmeldung Nr. 09/697,590 mit dem Titel „Preferred Segments of Neural Thread Protein and Methods of Using the Same" offenbart ist.
Die vorstehende Beschreibung des verwandten Fachbereichs soll in keiner Weise als Zugeständnis gedacht sein, das irgendwelche der hierin beschriebenen Dokumente einschließlich der anhängigen US-Patentanmeldungen Stand der Technik für die vorliegende Erfindung darstellen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Es besteht ein Bedarf, ein Verfahren zur Vorbeugung, Hemmung, Modulierung und/oder Besserung von Zelltod und Gewebenekrose zu entwickeln. Im Besonderen besteht ein Bedarf, ein Verfahren zu entwickeln, das in der Lage ist, Zelltod und/oder Gewebenekrose im Gehirn vorzubeugen, zu hemmen und/oder zu bessern. Es besteht außerdem ein Bedarf, ein Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder Gewebenekrose verbunden sind, zu entwickeln. Es besteht auch ein Bedarf, ein Verfahren zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen wie beispielsweise AD durch Vorbeugung, Hemmung und/oder Besserung von Zelltod und/oder Gewebenekrose im Hirngewebe lebender Säuger zu entwickeln. Es besteht auch ein Bedarf, ein Verfahren zur Kontrolle, Hemmung, Modulierung oder Besserung von Zelltod und Gewebenekrose in lebendem Gewebe zu entwickeln durch NTP, welches verabreicht wird, um schädliches oder unerwünschtes Gewebe oder zelluläre Elemente wie beispielsweise gutartige oder bösartige Tumore in Menschen zu entfernen oder zu zerstören.
Es ist daher ein Merkmal einer Ausführungsform der Erfindung, die Verwendung wenigstens eines Segments von NTP zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung von und/oder die Vorbeugung und/oder Hemmung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder Gewebenekrose im Hirngewebe lebender Säuger verbunden sind, bereitzustellen, wobei die Zusammensetzung ferner eine Komponente umfasst, welche es ermöglicht, dass das NTP-Segment durch die Blut-Hirn-Schranke gelangt. Dadurch wird ein Verfahren zur Vorbeugung, Hemmung und/oder Besserung von Zelltod und/oder Gewebenekrose ermöglicht. Das Verfahren schließt das Inkontaktbringen des lebenden Gewebes mit wenigstens einem Segment von NTP (oder einem Homologon, Derivat, einer Variante oder einem Mimetikum davon) ein, wobei das Segment in einer Menge vorliegt, die ausreichend ist, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen, zu hemmen, zu vermindern, zu kontrollieren und/oder zu bessern.
Ein Verfahren zur Vorbeugung, Hemmung und/oder Besserung von Zelltod und/oder Gewebenekrose im Hirngewebe lebender Säuger durch Inkontaktbringen des lebenden Säugerhirngewebes mit einer Komponente, die wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) enthält, das in einer ausreichenden Menge vorliegt, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen, zu hemmen und/oder zu bessern, wird ebenfalls ermöglicht. Die Komponente ist in der Lage, durch die Blut-Hirn-Schranke zu gelangen.
Gemäß einem anderen Merkmal einer Ausführungsform der Erfindung wird die Verwendung einer Komponente, welche wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) enthält, zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung neurodegenerativer Erkrankungen bereitgestellt. Die Komponente ist in der Lage, durch die Blut-Hirn-Schranke zu gelangen.
Ein Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder Gewebenekrose verbunden sind, wird ebenfalls ermöglicht, welches das Inkontaktbringen von lebendem Gewebe mit wenigstens einem Segment von NTP (oder einem Homologon, Derivat, einer Variante oder einem Mimetikum davon) umfasst. Das Segment von NTP liegt in einer ausreichenden Menge vor, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen und/oder zu hemmen. Gemäß diesem Verfahren wird wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) einem Säuger verabreicht, der einen Zustand aufweist, der mit Zelltod und/oder Gewebenekrose verbunden ist, und zwar in einer Menge, die ausreichend ist, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen und/oder zu hemmen.
Gemäß einem anderen Merkmal einer Ausführungsform der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) und eine Komponente, welche es ermöglicht, dass das Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) durch die Blut-Hirn-Schranke gelangt, umfasst.
Ein Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder Gewebenekrose verbunden sind, wird ebenfalls ermöglicht, welches die Verabreichung eines Gens bei einem Säuger, der dieses benötigt, umfasst, wodurch das Gen wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) exprimiert und wobei die Verabreichung dazu führt, dass das Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) mit lebendem Gewebe in Kontakt kommt. Das Gen wird auf eine solche Weise verabreicht, dass das Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) in einer ausreichenden Menge vorliegt, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen und/oder zu hemmen.
Ein Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder Gewebenekrose verbunden sind, wird ebenfalls ermöglicht, welches die Verabreichung eines Vakzins bei einem Säuger, der dieses benötigt, umfasst, wobei das Vakzin den Säuger dazu anregt, wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) zu exprimieren oder auf andere Weise zu produzieren und wobei die Verabreichung dazu führt, dass das wenigstens eine Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) mit lebendem Gewebe in Kontakt kommt. Das Vakzin wird auf eine solche Weise verabreicht, dass das wenigstens eine Segment von NTP (oder einem Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) in einer Menge vorliegt, die ausreicht, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen und/oder zu hemmen.
Ein Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder Gewebenekrose verbunden sind, wird ebenfalls ermöglicht, welches das Einbringen oder Verabreichen oder Implantieren von Zellen, Bakterien oder Viren, die dazu in der Lage sind, in vivo wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) zu exprimieren bei einem Säuger, der eine solche Behandlung benötigt, umfasst, wobei die Zellen, Bakterien oder Viren wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) exprimieren, und wobei die Verabreichung dazu führt, dass wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) mit lebendem Gewebe in Kontakt kommt. Die Zellen, Bakterien oder Viren werden auf eine solche Weise eingebracht, verabreicht oder implantiert und in einer solchen Menge, dass wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) in einer ausreichenden Menge vorliegt, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen, zu hemmen und/oder zu bessern.
Diese und andere Merkmale der Erfindung werden für einen Fachmann beim Lesen der folgenden ausführlichen Beschreibung klar ersichtlich. Selbstverständlich stellen die ausführliche Beschreibung und die speziellen Beispiele jedoch nur bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung dar und dienen nur der Veranschaulichung.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 zeigt die vollständige AD7C-NTP-Sequenz und die Position der Harlil-Sequenzen innerhalb der vollständigen AD7C-NTP-Sequenz (de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55: 1038–1050 (1996)).
2 zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des Neural Thread Proteins mit 122 Aminosäuren (Sequenz 40 aus US-Patent Nr. 5,948,634; NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25447).
3 zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des Neural Thread Proteins mit 112 Aminosäuren (NCBI Entrez-Protein Accession #XP_032307).
4 zeigt das in NCBI Entrez-Protein Accession #AAH14951 PID g15928971 aufgeführte Neural Thread Protein mit 106 Aminosäuren.
5 zeigt das in NCBI Entrez-Protein Accession #XP_039102, PID g18599339 aufgeführte Neural Thread Protein mit 106 Aminosäuren.
6 zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des Neural Thread Proteins mit 98 Aminosäuren (Sequenz 30 aus US-Patent Nr. 5,830,670; NCBI Entrez-Protein Accession #AAE13612).
7 zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des Neural Thread Proteins mit 75 Aminosäuren (Sequenz 48 aus US-Patent Nr. 5,948,634; NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25448).
8 zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des Neural Thread Proteins mit 68 Aminosäuren (Sequenz 36 aus US-Patent Nr. 5,948,634; NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25446).
9 zeigt die vollständigen Aminosäuresequenzen des Neural Thread Protein-artigen Proteins mit 61 Aminosäuren (NCBI Entrez-Protein Accession #AAH02534).
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
Die Bezeichnung „AD7C-NTP" bezeichnet das ~41 kD-Protein und das Gen und die Nukleinsäuresequenzen, welche dieses kodieren, die in de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–104 (1997), in den Sequenzen 120 und 121 der US-Patente Nr. 5,948,634; 5,948,888 und 5,830,670 und in NCBI Entrez-Protein Database Accession #AF010144 beschrieben sind.
In dieser Beschreibung betrifft die Bezeichnung „NTP" oder „Neural Thread Protein" Neural Thread Proteine und verwandte Moleküle (einschließlich Pankreas-Thread Proteine) und die Nukleinsäuresequenzen, welche diese Proteine kodieren, und sie schließt die folgenden Proteine und die Nukleinsäuren, welche die Aminosäurensequenzen für diese Proteine kodieren, ein (ist jedoch nicht darauf begrenzt):

(a) AD7C-NTP;
(b) die ~42, ~26, ~21, ~17, ~14, und ~18 kD-Spezies des Neural Thread Proteins wie in US-Patent Nr. 5,948,634; 5,948,888; 5,830,670 und 6,071,705 und in de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55 (10): 1038–50 (1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1–2): 26–35 (1996); de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118–25 (1996), de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997) und de la Monte et al., Alz. Rep. 2: 327–332 (1999) beschrieben;
(c) Proteine, die spezifisch durch den monoklonalen Antikörper #2, der bei der American Type Culture Collection, Manassas, Va., unter der Accession-Nummer HB-12546 hinterlegt ist, oder den monoklonalen Antikörper #5, der bei der American Type Culture Collection, Manassas, Va., unter der Accession-Nummer HB-12545 hinterlegt ist, erkannt werden;
(d) Proteine, die durch das AD7C-NTP-Gen kodiert werden;
(e) das Neural Thread Protein mit 122 Aminosäuren, das in Sequenz 40 der US-Patente 5,830,670; 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben ist und in NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25447, PID g10048540 aufgeführt ist, dessen Aminosäurensequenz in 2 veranschaulicht ist;
(f) das Neural Thread Protein mit 112 Aminosäuren, das in NCBI Entrez-Protein Accession #XP_032307, PID g14725132 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenz in 3 veranschaulicht ist;
(g) ein Neural Thread Protein-artiges Protein mit 106 Aminosäuren, das in NCBI Entrez-Protein Accession #AAH14951 PID g15928971 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenz in 4 veranschaulicht ist;
(h) ein Neural Thread Protein-artiges Protein mit 106 Aminosäuren, das in NCBI Entrez-Protein Accession #XP 039102, PID g18599339 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenz in 5 veranschaulicht ist;
(i) das Neural Thread Protein mit 98 Aminosäuren, das in Sequenz 30 der US-Patente Nr. 5,830,670; 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben ist und in NCBI Entrez-Protein Accession #AAE13612, PID g10048538 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenz in 6 veranschaulicht ist;
(j) das Neural Thread Protein mit 75 Aminosäuren, das in Sequenz 48 der US-Patente Nr. 5,830,670; 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben ist und in NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25448, PID g10048541 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenz in 7 veranschaulicht ist;
(k) das Neural Thread Protein mit 68 Aminosäuren, das in Sequenz 36 der US-Patente Nr. 5,830,670; 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben ist und in NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25446, PID g10048539 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenz in 8 veranschaulicht ist;
(l) das Neural Thread Protein-artige Protein mit 61 Aminosäuren, dass in NCBI Entrez-Protein Accession #AAH02534, PID g12803421 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenz in 9 veranschaulicht ist;
(m) Pankreas-Thread Protein;
(n) das neurale Pankreas Thread Protein (nPTP), welches in US-Patent Nr. 6,071,705 beschrieben ist;
(o) Proteine, die spezifisch durch die Antikörper erkannt werden, die von einem Hybridom aus der Gruppe bestehend aus HB 9934, HB 9935 und HB 9936, welche bei der American Type Culture Collection hinterlegt sind, produziert werden.

Die Bezeichnung „NTP" schließt auch NTP ein, welches aus Säugergewebe gewonnen ist oder unter Verwendung rekombinanter Techniken produziert wurde und sie schließt Fragmente, Varianten, Derivate und Homologe von NTP ein.
Hierin beschriebene Aminosäuren und Aminosäurereste können gemäß dem in der folgenden Tabelle bereitgestellten anerkannten Ein- oder Drei-Buchstabencode bezeichnet werden. Wenn nicht anders angegeben, liegen diese Aminosäuren oder Reste in der natürlich auftretenden Form des L-Stereoisomers vor.
Tabelle 1
Wie hierin verwendet betrifft die Bezeichnung „Harlil-Sequenz" oder „Harlil-Peptid" ein biologisch aktives Peptid, welches eine oder mehrere der folgenden Sequenzen umfasst oder enthält:

1. THARLIL; HHARLCL; MFARLIL; HHARLIF, wie in 1 beschrieben;
2. HHARL; HARL; HARLI; HARLIL; HHARLCL; ARLIL; HHARLIF; THARLIL; ARLI; ARL; HARLCL; ARLCL; ARCL; MFARLIL; FARLIL; FARLI; FARL; HARLIF; und ARLIF;
3. LHARLCLANFCGRNRV („NTP-1");
4. LARLCLANFCGNNNV („NTP-2");
5. CARYRTGHHARLM („NTP-3");
6. HHARLPLANFCG („NTP-4");
7. RTGHHARLCLANFC („NTP-5");
8. CESARYRTGHHARLC („NTP-6");
9. DNTHHARLIL („NTP-7");
10. SHHARLIL („NTP-8"); und
11. HARLML; HARLVL; und HAKLIL

Wie hierin verwendet schließt die Bezeichnung „Harlil-Sequenz" oder „Harlil-Peptid" auch biologisch aktive Varianten, Homologe, Derivate und Peptidmimetika von Harlil-Sequenzen oder Harlil-Peptiden ein und sie schließt biologisch aktive Peptide ein, welche die Sequenz beliebiger der in den Unterpunkten 1–11 aufgeführten Sequenzen mit zusätzlichen Aminosäureresten vor oder nach der Harlil-Sequenz an Linkerpeptiden enthalten.
Wie hierin verwendet betrifft die Bezeichnung „Segment von NTP" ein biologisch aktives Fragment einer Spezies von NTP, bevorzugt AD7C-NTP, und schließt speziell Harlil-Sequenzen und Harlil-Peptide ein (ist jedoch nicht darauf begrenzt).
Die Bezeichnung „biologisch aktiv" betrifft ein Protein, Peptid, Harlil-Peptid oder Segment von NTP, welches die Fähigkeit besitzt, an NTP oder andere Moleküle zu binden.
Die Bezeichnung „Fragment" betrifft ein Protein oder Polypeptid, das aus einer durchgehenden Untersequenz der Aminosäuresequenz eines NTP-Proteins oder eines Segments von NTP besteht, und schließt natürlich auftretende Fragmente wie beispielsweise Splice-Varianten und Fragmente, die von natürlich auftretender in vivo-Proteaseaktivität herrühren, ein. Ein solches Fragment kann am Aminoterminus, Carboxyterminus und/oder internal abgeschnitten sein (wie beispielsweise durch natürliches Splicing). Solche Fragmente können mit oder ohne aminoterminales Methionin hergestellt werden. Die Bezeichnung „Fragment" schließt Fragmente ein, ob identisch oder unterschiedlich, von dem selben NTP-Protein oder Segment von NTP, die eine gemeinsame durchgängige Aminosäuresequenz aufweisen können oder nicht, entweder direkt oder durch einen Linker aneinander gebunden.

Die Bezeichnung „Variante" betrifft ein Protein oder Polypeptid, in welchem ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Deletionen und/oder Insertionen verglichen mit der Aminosäuresequenz eines NTP-Proteins oder Segments von NTP vorliegen und sie schließt natürlich auftretende allelische Varianten oder alternative Splicingvarianten eines NTP-Proteins oder Segments von NTP ein. Die Bezeichnung „Variante" schließt das Ersetzen einer oder mehrerer Aminosäuren in einer Peptidsequenz durch eine ähnliche oder homologe Aminosäure(n) oder unähnliche Aminosäure(n) ein. Es gibt viele Einstufungen, nach denen Aminosäuren als ähnlich oder homolog eingestuft werden können (Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, S. 123–39 (Academic Press, New York, NY 1987). Bevorzugte Varianten beinhalten Alanin-Substitutionen an einer oder mehreren Aminosäurepositionen. Andere bevorzugte Substitutionen schließen konservative Substitutionen ein, die eine geringe oder keine Auswirkung auf die Nettogesamtladung, Polarität oder Hydrophobizität des Proteins aufweisen. Konservative Substitutionen sind in der folgenden Tabelle 2 aufgelistet. TABELLE 2

	Konservative Aminosäuresubstitutionen
Basisch:	Arginin Lysin Histidin
Sauer:	Glutaminsäure Asparaginsäure
Ungeladen polar:	Glutamin Asparagin Serin Threonin Tyrosin
Nicht-polar:	Phenylalanin Tryptophan Cystein Glyzin Alanin Valin Prolin Methionin Leucin Isoleucin

Tabelle 3 legt ein weiteres Schema der Aminosäuresubstitution dar: TABELLE 3

Ursprünglicher Rest	Substitutionen
Ala	gly; ser
Arg	lys
Asn	gln; his
Asp	glu
Cys	ser
Gln	asn
Glu	asp
Gly	ala; pro
His	asn; gln
Ile	leu; val
Leu	ile; val
Lys	arg; gln; glu
Met	leu; tyr; ile
Phe	met; leu; tyr
Ser	thr
Thr	ser
Trp	tyr
Tyr	trp; phe
Val	ile; leu

Andere Varianten können aus weniger konservativen Aminosäuresubstitutionen bestehen, wie beispielsweise die Auswahl von Resten, welche sich deutlicher unterscheiden in ihrer Auswirkung auf den Erhalt (a) der Struktur des Polypeptidrückgrats im Bereich der Substitution, beispielsweise als Blatt- oder Helixkonformation, (b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle oder (c) den Raumanspruch der Seitenkette. Die Substitutionen, bei denen im Allgemeinen davon auszugehen ist, dass sie eine deutlichere Auswirkung auf die Funktion haben, sind solche, in denen (a) Glyzin und/oder Prolin durch eine andere Aminosäure substituiert wird oder deletiert oder insertiert wird; (b) ein hydrophiler Rest, z.B. Seryl oder Threonyl durch (oder mit) einem hydrophoben Rest, z.B. Leuzyl, Isoleuzyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl substituiert wird; (c) ein Cysteinrest durch (oder mit) einem beliebigen anderen Rest substituiert wird; (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette, z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl durch (oder mit) einem Rest substituiert wird, der eine elektronegative Ladung trägt, z.B. Glutamyl oder Aspartyl; oder (e) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin durch (oder mit) einem Rest substituiert wird, der keine solche Seitenkette aufweist, z.B. Glyzin. Andere Varianten beinhalten solche, die konzipiert sind, um entweder eine neue Glykosylierungs- und/oder Phosphorylierungsstelle(n) zu erzeugen oder solche, die konzipiert sind, um eine bestehende Glykosylierungs- und/oder Phosphorylierungsstelle(n) zu deletieren. Varianten schließen wenigstens eine Aminosäuresubstitution an einer Glykosylierunsstelle, einer proteolytischen Spaltungsstelle und/oder einem Cysteinrest ein. Varianten schließen auch NTP-Proteine oder Segmente von NTP mit zusätzlichen Aminosäureresten vor oder nach der Aminosäuresequenz des NTP oder des Segments von NTP an Linkerpeptiden ein. Beispielsweise kann ein Cysteinrest sowohl an den Amino- als auch Carboxyenden eines Segments von NTP hinzugefügt werden, um die Zyklisierung des Segments von NTP durch die Bildung einer Disulfidbindung zu ermöglichen. Die Bezeichnung „Variante" umfasst auch Polypeptide, welche die Aminosäuresequenz eines Harlil-Peptids mit wenigstens einer und bis zu 25 zusätzlichen Aminosäuren, welche entweder das 3'- oder das 5'-Ende des Harlil-Peptids flankieren, aufweisen.
Die Bezeichnung „Derivat" betrifft ein chemisch modifiziertes Protein oder Polypeptid, das chemisch entweder durch natürliche Prozesse wie beispielsweise Prozessierung und andere posttranslationale Modifikationen, aber auch durch chemische Modifikationstechniken wie beispielsweise durch Hinzufügen eines oder mehrerer Polyethylenglykol-Moleküle, Zucker, Phosphate und/oder andere solche Moleküle modifiziert worden ist, wobei das Molekül oder die Moleküle nicht natürlich an Wildtyp-NTP-Proteine oder Segmente angebunden sind. Derivate schließen Salze ein. Solche chemischen Modifikationen sind in Basistexten und in ausführlicheren Monographien sowie in umfangreicher Forschungsliteratur gut beschrieben und sie sind dem Fachmann gut bekannt. Selbstverständlich kann dieselbe Art der Modifikation in gleichem oder unterschiedlichem Ausmaß an verschiedenen Stellen in einem bestimmten Protein oder Polypeptid vorliegen. Ein bestimmtes Protein oder Polypeptid kann auch viele Arten von Modifikationen enthalten. Modifikationen können an beliebiger Stelle in einem Protein oder Polypeptid auftreten, einschließlich dem Peptidrückgrat, den Aminosäureseitenketten und den Amino- oder Carboxyenden. Modifikationen schließen beispielsweise Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Anbindung von Flavin, kovalente Anbindung einer Hämgruppe, kovalente Anbindung eines Nukleotids oder Nukleotidderivats, kovalente Anbindung eines Lipids oder Lipidderivats, kovalente Anbindung von Phosphatidylinositol, Quervernetzen, Zyklisierung, Disulfidbindungsbildung, Demethylierung, Bildung kovalenter Quervernetzungen, Bildung von Cystein, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, Gamma-Carboxylierung, Glykosilierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristolyierung, Oxidation, proteolytische Prozessierung, Phosphorilierung, Prenylierung, Racemisierung, Glykosilierung; Lipidanbindung, Sulphatierung, Gamma-Carboxylierung von Glutaminsäureresten, Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung, Selenoylierung, Sulfatierung, Transfer-RNA-vermittelte Addition von Aminosäuren an Proteine wie beispielsweise Argininylierung und Ubiquinierung ein. Siehe beispielsweise Proteins – Structure And Molecular Properties, zweite Ausgabe, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York (1993) und Wold, F., „Posttranslational Protein Modifications: Perspectives and Prospects", Seiten 1–12 in Posttranslational Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Hrsg., Academic Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626–646 (1990) und Rattan et al., „Protein Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann. N.Y. Acad. Sci. 663: 48–62 (1992). Die Bezeichnung „Derivate" schließt chemische Modifikationen ein, die dazu führen, dass das Protein oder Polypeptid zu einem verzweigten oder zyklischen Protein oder Polypeptid mit oder ohne Verzweigung wird. Zyklische, verzweigte und verzweigte zirkuläre Proteine oder Polypeptide können von posttranslationalen natürlichen Prozessen herrühren, oder sie können ebenso durch völlig synthetische Verfahren erzeugt werden.
Die Bezeichnung „Homologon" betrifft ein Protein, das in seiner Aminosäuresequenz zu wenigstens 75% zu einem NTP-Protein, AD7C-NTP bzw. einem Segment von NTP identisch ist, wie mittels Standardverfahren bestimmt, die üblicherweise verwendet werden, um die Ähnlichkeit der Position der Aminosäuren zweier Polypeptide zu vergleichen. Das Ausmaß der Ähnlichkeit oder Identität zwischen zwei Proteinen kann durch bekannte Verfahren leicht berechnet werden, einschließlich, aber nicht begrenzt auf solche Verfahren, die beschrieben sind in Computational Molecular Biology, Lesk, A. M. Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D. W., Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Teil I, Griffin, A. M. und Griffin, H. G., Hrsg. Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg. M Stockton Press, New York, 1991; und Carillo H. und Lipman, D., SIAM, J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität sind konzipiert um die größte Übereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen zu erhalten. Verfahren zur Bestimmung der Identität und Ähnlichkeit sind in öffentlich zugänglichen Computerprogrammen festgeschrieben.
Bevorzugte Computerprogrammverfahren, die zur Bestimmung der Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen nützlich sind, beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf das GCG-Programmpaket (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN und FASTA, Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol., 215: 403–410 (1990). Das BLAST X-Programm ist von NCBI und anderen Bezugsquellen öffentlich zugängig (BLAST Manual, Atschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894; Altschul, S. et al., J. Mol. Bol., 215: 403–410 (1990). Beispielsweise werden unter Verwendung eines Computeralgorithmus wie beispielsweise GAP (Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.) die beiden Proteine oder Polypeptide, für welche die prozentuale Sequenzidentität bestimmt werden soll, für eine optimale Übereinstimmung ihrer entsprechenden Aminosäuren angeordnet (der „übereinstimmende Bereich" wird mit dem Algorithmus ermittelt).
Eine Gap Opening Penalty (die als das 3-fache der durchschnittlichen Diagonale berechnet wird); die „durchschnittliche Diagonale" ist der Durchschnitt der Diagonale der verwendeten Vergleichsmatrix; die „Diagonale" ist der Wert oder die Zahl, die jeder perfekten Aminosäure durch die bestimmte Vergleichsmatrix zugeordnet wird) und eine Gap Extension Penalty (welche üblicherweise 1/10 der Gap Opening Penalty beträgt) sowie eine Vergleichsmatrix wie beispielsweise PAM250 oder BLOSUM 62 werden in Verbindung mit dem Algorithmus verwendet. Eine Standardvergleichsmatrix (siehe Dayhoff et al. in: Atlas of Protein Sequence and Structure, Band 5, Anhang 3 [1978] für die PAM250-Vergleichsmatrix; siehe Henikoff et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 89: 10915–10919 [1992] für die BLOSUM 62-Vergleichsmatrix) kann ebenfalls durch den Algorithmus verwendet werden. Die prozentuale Identität wird dann durch den Algorithmus berechnet. Homologe werden typischerweise ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen, Deletionen und/oder Insertionen im Vergleich zu NTP, AD7C-NTP, einem Segment von NTP oder der Harlil-Sequenz aufweisen.
Die Bezeichnung „Peptidmimetikum" oder „mimetisch" betrifft biologisch aktive Verbindungen, welche die biologische Aktivität eines Peptids oder eines Proteins nachahmen, bei denen es sich von der chemischen Art her nicht mehr um Peptide handelt das heißt sie enthalten keinerlei Peptidbindungen mehr (das heißt Amidbindungen zwischen Aminosäuren). Hier wird die Bezeichnung Peptidmimetikum im weiteren Sinn verwendet, um Moleküle einzuschließen, die in ihrer Natur nicht mehr vollständig peptidisch sind, wie beispielsweise Pseudopeptide, Semipeptide und Peptoide. Beispiele für Peptidmimetika in diesem breiteren Sinn (wenn ein Teil eines Peptids durch eine Struktur ohne Peptidbindungen ersetzt wird) werden im Folgenden beschrieben. Erfindungsgemäße Peptidmimetika stellen, ob teilweise oder vollständig nicht-peptidisch, eine räumliche Anordnung reaktiver chemischer Gruppen dar, die der dreidimensionalen Anordnung aktiver Gruppen in dem Antikörper, Antikörperderivat oder Antikörperfragment, auf dem das Peptidmimetikum beruht, stark ähneln. Als Ergebnis dieser ähnlichen Geometrie der aktiven Stellen weist das Peptidmimetikum Auswirkungen auf biologische Systeme auf, die zu der biologischen Aktivität des Peptids ähnlich sind.
Die erfindungsgemäßen Peptidmimetika sind vorzugsweise sowohl in ihrer dreidimensionalen Form als auch ihrer biologischen Aktivität im Wesentlichen ähnlich zu den hierin beschriebenen Segmenten von NTP. Beispiele für Verfahren zur strukturellen Modifikation eines Peptids, die im Fachbereich bekannt sind, um ein Peptidmimetikum zu erzeugen, schließen die Inversion chiraler Zentren des Rückgrats ein, was zu D-Aminosäurereststrukturen führt, die insbesondere am N-Terminus zu einer erhöhten Stabilität gegenüber proteolytischem Abbau führt, ohne dass die Aktivität beeinträchtigt wird. Ein Beispiel ist in der Veröffentlichung „Tritriated D-ala¹-Peptide T Binding", Smith C. S. et al., Drug Development Res., 15, S. 371–379 (1988) angegeben. Ein zweites Verfahren ist die Veränderung der zyklischen Struktur für die Stabilität, wie beispielsweise N zu C Interkettenimide und Laktame (Ede et al., in Smith and Revier (Hrsg.) „Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), S. 268–270). Ein Beispiel hierfür sind Thymopentin-artige Verbindungen mit festgelegter Konformation wie beispielsweise solche, die in US-Patent Nr. 4,457,489 (1985), Goldstein, G. of al. offenbart sind.
Ein drittes Verfahren besteht darin, Peptidbindungen in den Segmenten von NTP durch Pseudopeptidbindungen zu ersetzen, welche Resistenz gegenüber Proteolyse verleihen.
Es sind mehrere Pseudopeptidbindungen beschrieben worden, die im Allgemeinen die Peptidstruktur und die biologische Aktivität nicht beeinträchtigen. Ein Beispiel für diesen Ansatz stellt die Substitution retroinverser Pseudopeptidbindungen dar („Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al. in Rivier, J. E., und Marshall, G. R. (Hrsg.) „Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), S. 722–773) und Dalpozzo, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41: 561–566). Gemäß dieser Modifikation können die Aminosäuresequenzen der Peptide identisch zu den oben beschriebenen Sequenzen eines Segments von NTP sein, mit der Ausnahme, dass ein oder mehrere der Peptidbindungen durch eine retroinverso Pseudopeptidbindung ersetzt sind. Bevorzugt wird die Peptidbindung, die am nähsten zu dem N-Terminus gelegen ist, substituiert, da eine solche Substitution Resistenz gegen Proteolyse durch Exopeptidasen, die am N-Terminus wirken, verleiht. Weitere Modifikationen können auch durchgeführt werden durch Ersetzen chemischer Gruppen der Aminosäuren mit anderen chemischen Gruppen mit ähnlicher Struktur. Eine weitere geeignete Pseudopeptidbindung, die dafür bekannt ist, die Stabilität gegenüber enzymatischer Spaltung zu erhöhen, ohne oder nur mit geringem Verlust an biologischer Aktivität, ist die reduzierte isostere Pseudopeptidbindung (Couder, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41: 181–184).
Die Aminosäuresequenzen dieser Peptide können somit identisch zu den Sequenzen eines Segments von NTP oder der Harlil-Sequenz sein, mit der Ausnahme, dass ein oder mehrere der Peptidbindungen durch eine isostere Pseudopeptidbindung ersetzt sind. Bevorzugt wird die Peptidbindung, die dem N-Terminus am nächsten liegt, substituiert, da eine solche Substitution Resistenz gegenüber Proteolyse durch Exopeptidasen, die am N-Terminus wirken, verleiht. Die Synthese von Peptiden mit einer oder mehreren reduzierten isosteren Pseudopeptidbindungen ist im Fachbereich bekannt (Couder, et al. (1993), oben zitiert). Andere Beispiele beinhalten die Einfügung von Ketomethylen- oder Methylsulfidbindungen, um Peptidbindungen zu ersetzen.
Peptoidderivate von Segmenten von NTP oder der Harlil-Sequenz stellen eine weitere Klasse von Peptidmimetika dar, die wichtige strukturelle Determinanten für die biologische Aktivität beibehalten, aber dennoch die Peptidbindungen eliminieren und dadurch Resistenz gegenüber Proteolyse verleihen (Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 9367–9371). Peptoide sind Oligomere N-substituierter Glyzine. Es sind mehrere N-Alkyl-Gruppen beschrieben worden, die jeweils der Seitenkette einer natürlichen Aminosäure entsprechen (Simon, et al. (1992), oben zitiert). Einige oder alle der Aminosäuren des Segments von NTP oder der Harlil-Sequenz können mit dem N-substituierten Glyzin, das der ersetzten Aminosäure entspricht, ersetzt werden.
Die Bezeichnung „Peptidmimetikum" oder „mimetisch" beinhaltet auch revers-D- Peptide und Enantiomere wie im Folgenden definiert.
Die Bezeichnung „revers-D-Peptid" betrifft ein biologisch aktives Protein oder Peptid, das aus D-Aminosäuren besteht, die in umgekehrter Richtung im Vergleich zur L-Aminosäuresequenz eines Segments von NTP oder der Harlil-Sequenz angeordnet sind. So wird der carboxyterminale Rest eines L-Aminosäuresegments von NTP zum Aminoterminus für das D-Aminosäurepeptid usw. Beispielsweise wird das AD7C-NTP-Fragment, HARLIL, zu L_dI_dL_dR_dA_dH_d, wobei A_d, H_d, I_d, L_d und R_d die den L-Aminosäuren A, H, I, L und R entsprechenden D-Aminosäuren darstellen.
Die Bezeichnung „Enantiomer" betrifft ein biologisch aktives Protein oder Peptid, bei dem ein oder mehrere der L-Aminosäurereste in der Aminosäuresequenz eines Segments von NTP mit dem/den entsprechenden D-Aminosäurerest(en) ersetzt sind.
In dieser Beschreibung betrifft die Bezeichnung „neurodegenerative Erkrankung":

1. pathologische Zustände, die durch eines oder mehrere der folgenden Anzeichen charakterisiert sind: Gehirnatrophie, Zellverlust, neurofibrilläres Gewirr, amyloider Plaque, und/oder die Anwesenheit von NTP in Gewebe und/oder Körperflüssigkeit;
2. die Gruppe der Alzheimer-Erkrankungen, nämlich Alzheimer-Erkrankung (präsenile Demenz, senile Demenz); Alzheimer-Erkrankung verbunden mit Down-Syndrom; familiäre Alzheimer-Erkrankung, genetische Alzheimer-Erkrankung aufgrund von Mutationen wie beispielsweise Presenilin 1, Presenilin 2 und anderen; Alzheimer-Erkrankung verbunden mit anderen Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie beispielsweise Parkinsons-Erkrankung, Lewy Body Disease und zerebrovaskulären Erkrankungen;
3. kongophile Angiopathie (verbunden oder nicht verbunden mit Alzheimer-Erkrankung, familiär oder nicht familiär);
4. pathologische Zustände, die durch die Ablagerung abnormaler Fibrillen gekennzeichnet sind („amyloide Fibrillen") und/oder verwandter, nicht fibrillärer Amyloidvorläufer oder Nicht-Vorläufermolekül(e);
5. pathologische Zustände, die durch die abnormale Ablagerung von Tau gekennzeichnet sind, einschließlich frontotemperaler Demenz, progressiver supranuklearer Palsie (PSP), kortikobasaler ganglischer Degeneration (CBD) und Zuständen, die Mutationen des Tau-Gens betreffen und/oder
6. andere Erkrankungen und Störungen, wie solche die in US-Patent Nr. 6,001,331 offenbart sind.

In dieser Beschreibung bezeichnen die Ausdrücke „amyloide Plaque" und „amyloide Fibrillen" senile Plaque, neuritische Plaque, amyloide Plaque, Amyloidsterne, Amyloidzentren, primitive Plaque, klassische Plaque, Bumout-Plaque, diffuse Plaque, Schattenplaque, neurofibrilläres Gewirr, amyloide Fibrillen, gepaarte helikale Filamente und dergleichen.
In dieser Beschreibung bezeichnet die Bezeichnung „Säuger" sämtliche Säuger und bevorzugt Schafe, Kühe, Hunde, Katzen, Menschenaffen, Affen, Mäuse, Ratten und Menschen und am meisten bevorzugt einen Menschen.
In dieser Beschreibung werden die Ausdrücke „Segment von NTP", „Harlil-Sequenz" und „Harlil-Peptid" austauschbar verwendet. Wann immer „Segment von NTP", „Harlil-Sequenz" oder „Harlil-Peptid" verwendet wird, so umfasst die Erfindung selbstverständlich geeignete Homologe, Varianten, Derivate und peptidische Mimetika davon.
In dieser Beschreibung bezeichnet der Ausdruck „Gewebe, welches NTP enthält" Gewebe, das das gesamte oder einen Teil von NTP enthält, Gewebe in zellulärer Verbindung mit NTP, das es auf andere Weise enthalten kann oder nicht, Gewebe, das mit NTP in Kontakt stand, aber dieses nicht mehr in seiner ursprünglichen Form enthält und Gewebe, das zu irgendeinem Zeitpunkt in Kontakt mit NTP kommen kann.
Die vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zur Vorbeugung von Zelltod und/oder Gewebenekrose gerichtet. Obwohl NTP bekannt war und in der Literatur beschrieben wurde, war bislang nicht bekannt, dass NTP eine Ursache von Zelltod anderer Zellen als der NTP-produzierenden Zellen darstellt. Ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen, nehmen die Erfinder an, dass das Vorhandensein von NTP in lebendem Gewebe nicht nur ein Anzeichen von Nervenzelltod wie bisher berichtet darstellt, sondern auch insofern toxisch ist, als es den Zelltod anderen lebenden Gewebes hervorruft. Die Erfinder nehmen an, dass AD7C-NTP, welches insbesondere im Hirngewebe lebender Säuger vorliegt, ein Marker für Alzheimer-Erkrankung (AD) darstellt und AD verschlimmert, indem es Zelltod und/oder Gewebenekrose in dem lebenden Gewebe, in welchem es vorliegt, hervorruft.
Dementsprechend wird angenommen, dass, wenn ein Säuger an AD erkrankt, das Gen, welches bevorzugt AD7C-NTP produziert, durch Nervenzelltod hochreguliert wird, wodurch an dieser Stelle AD7C-NTP produziert wird. Das so produzierte AD7C-NTP beginnt dann, anderes lebendes Gewebe zu zerstören (z.B. andere Nervenzellen, Glialzellen, etc.) in dessen Umgebung, wodurch das Fortschreiten der Erkrankung verschlimmert wird. Der Erfinder nimmt daher an, dass die Neutralisierung der Wirkung von beispielsweise AD7C-NTP dazu beiträgt, Zelltod und/oder Gewebenekrose in lebendem Gewebe, das beispielsweise AD7C-NTP enthält, vorzubeugen, zu hemmen und/oder zu bessern. Es wurde überraschenderweise gefunden, dass Segmente von NTP das AD7C-NTP binden können und Zelltod und/oder Gewebenekrose in lebendem Gewebe, das AD7C-NTP enthält, vorbeugen, hemmen und/oder bessern können.
NTP ist bekannt und beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5,948,634; 5,948,888, 5,830,670 und 6,071,705 beschrieben. Verfahren zur rekombinanten oder anderen Herstellung von NTP sind in den vorstehenden Dokumenten offenbart. Die Erzeugung von Antikörpern gegen NTP zur Diagnostik von AD und anderen verbundenen Störungen und Erkrankungen ist ebenfalls in diesen Dokumenten offenbart. Für einen Fachmann ist es offensichtlich, dass NTP Homologe, Derivate, Mimetika und Varianten sowie NTP aus unterschiedlichen Quellen (z.B. natürlich, pankreatisch, gereinigt, synthetisiert oder aus anderen in vitro-Expressionssystemen, etc.) verwendet werden können, um die in der vorliegenden Erfindung nützlichen Segmente herzustellen.
Die vorliegende Erfindung richtet sich auf die Verwendung wenigstens eines Segments von NTP zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung und/oder die Vorbeugung und/oder Hemmung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder Gewebenekrose in lebendem Gewebe im Zusammenhang stehen, wobei die Zusammensetzung ferner eine Komponente umfasst, die es ermöglicht, dass das Segment von NTP durch die Blut-Hirn-Schranke gelangt und wobei das lebende Gewebe Säugerhirngewebe ist. Ein Verfahren zur Vorbeugung und/oder Hemmung von Zelltod und/oder Gewebenekrose schließt das Inkontaktbringen von lebendem Gewebe mit wenigstens einem Segment von NTP ein, wobei das Segment in einer Menge vorliegt, die ausreichend ist, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen und/oder zu hemmen. Das Segment von NTP ist bevorzugt eine Untersequenz von AD7C-NTP und am meisten bevorzugt enthält es wenigstens eine der folgenden Repeatsequenzen von AD7C-NTP:

(a) 45–51 THARLIL

(b) 90–96 HHARLCL

(c) 263–269 MFARLIL

(d) 291–297 HHARLIF

Siehe 1.
Die Erfindung umfasst Peptide, welche die Sequenz irgendeiner der Regionen (a), (b), (c), (d) aufweisen oder Homologe, Derivate, Varianten und Mimetika von diesen (einschließlich, aber nicht begrenzt auf „H A R L M L"). Die Harlil-Peptide können auch zusätzliche Aminosäurereste vor oder nach der Harlil-Sequenz an Linkerpeptiden aufweisen. Die zusätzlichen Aminosäurereste oder Linkerpeptide können solche sein, die in der NTP-Sequenz vor und nach der Harlil-Sequenz auftreten. Beispielsweise treten die Aminosäurereste G I T G M C T vor Rest 46 auf und die Aminosäurereste Y F F L V treten nach Aminosäure 51 in der NTP-Sequenz auf. Somit kann ein Harlil-Peptid, das als Segment von NTP in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, das NTP-Peptid G I T G M C T N A R L I L Y F F L V enthalten. Für die in (b), (c) und (d) aufgeführten Harlil-Peptide sind die zusätzlichen Aminosäurereste bevorzugt diejenigen, welche die Harlil-Sequenz in der NTP-Sequenz flankieren. Bevorzugt übersteigt die Länge der Sequenz des Harlil-Peptids, das zusätzliche Aminosäurereste aufweist, nicht 25 Aminosäurereste insgesamt.
Die Harlilrepeatsequenz besitzt bevorzugt das einzigartige Merkmal, an NTP zu binden. Diese Fähigkeit, an NTP zu binden, lässt vermuten, dass die Harlilrepeatsequenz dazu nützlich ist, Zelltod und/oder Gewebenekrose in lebendem Gewebe, das NTP enthält, vorzubeugen, zu hemmen oder zu bessern.
Harlil-Sequenzpeptide und deren Homologe, Derivate, Varianten und Peptidmimetika können als Affinitätsbindungspartner für NTP und andere Moleküle zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und oder Gewebenekrose verbunden sind, verwendet werden. Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder Gewebenekrose verbunden sind, sowie Zusammensetzungen, welche Harlil-Peptide oder deren Homologe, Derivate, Varianten und Peptidmimetika enthalten, die in der Lage sind, durch die Blut-Hirn-Schranke zu gelangen, sind ebenfalls vorgesehen.
Harlil-Peptide und Homologe, Derivate und Varianten davon können unter Verwendung herkömmlicher Peptidsynthesetechniken hergestellt werden. Mimetika für Harlil-Peptide können unter Verwendung kombinatorischer chemischer Techniken entwickelt werden.
Nukleinsäuren, welche Harlil-Peptiden entsprechen, können beispielsweise unter Verwendung von (a) rekombinanten Standardverfahren, (b) synthetischen Techniken oder (c) Kombinationen davon hergestellt werden.
Harlil-Sequenzen binden an AD7C-NTP und andere Moleküle. Siehe anhängige US-Patentanmeldung Seriennummer 09/697,590 mit dem Titel „Preferred Segments of Neural Thread Protein and Methods of Using the Same."
Diese Erfindung beinhaltet die überraschende Entdeckung, dass eine Harlil-Sequenz, die an AD7C-NTP binden kann, Zelltod und/oder Gewebenekrose in lebendem Gewebe, das AD7C-NTP enthält, vorbeugen oder hemmen kann.
Es gibt Anzeichen dafür, dass AD7C-NTP an der neurogenerativen Kaskade beteiligt ist. Die Fähigkeit, die Kaskade zu unterbrechen oder umzuleiten, indem AD7C-NTP als Ziel dient, bietet eine Möglichkeit für die Therapie. Beispielsweise kann es möglich sein, durch Verwendung der Fähigkeit des Harlil-Peptids mit AD7C-NTP- Bindungsstellen zu wechselwirken, therapeutisch einzugreifen und somit mögliche reaktive Stellen an AD7C-NTP zu blockieren.
Alternativ können die Harlil-Peptide der Erfindung als zielsteuernde Arzneistoffe für Zellen, die die Harlil-Sequenz exprimieren, nützlich sein oder zur Erzeugung von Genen oder Vakzinen, welche die Expression der Harlil-Sequenz in vivo induzieren.
Obwohl der tatsächliche Mechanismus, über den die Harlil-Sequenz funktioniert, noch nicht bekannt ist, hat der Erfinder herausgefunden, dass die Verabreichung einer Harlil-Sequenz an lebendem Gewebe, das AD7C-NTP enthält, Zelltod und/oder Gewebenekrose, die ansonsten in Abwesenheit der Harlil-Sequenz auftritt, vorbeugt und/oder hemmt und/oder bessert.
Es ist möglich, dass die „HARLIL"-Stellen mit anderen Hirnproteinen wechselwirken und dass sie in der Funktionalität von AD7C-NTP und/oder anderem NTP oder anderen Molekülen eine Rolle spielen können.
Verfahren zur Herstellung und Detektion solcher Harlil-Sequenzen oder von deren funktionellen Homologen oder Analogen sind in den ebenfalls anhängigen US-Patentanmeldungen Seriennr. 09/697,590 mit dem Titel „Preferred Segments of Neural Thread Protein and Methods of Using the Same" beschrieben.
Die Peptidsegmente von NTP, welche im Zusammenhang der vorliegenden Erfindung besonders nützlich sind, sind solche, die oben beschrieben wurden, welche wenigstens einen Teil der Harlilaminosäuresequenz von AD7C-NTP enthalten. Nützliche Harlil-Sequenzen beinhalten solche Aminosäuresequenzen, die aus der folgenden Liste ausgewählt sind:

(a) HHARL;
(b) HARL;
(c) HARLI;
(d) HARLIL;
(e) HHARLCL;
(f) ARLIL;
(g) HHARLIF;
(h) THARLIL;
(i) ARLI;
(j) ARL;
(k) HARLCL;
(l) ARLCL;
(m) ARCL;
(n) MFARLIL;
(o) FARLIL;
(p) FARLI;
(q) FARL;
(r) NARLIF;
(s) ARLIF;

Verschiedene aus der obigen Liste ausgewählte Peptide und Homologe, Varianten, Derivate und Mimetika davon können in der vorliegenden Erfindung als Segment von NTP verwendet werden. Beispielsweise kann das Peptid die Aminosäuresequenz A R L I aufweisen und wenigstens eine bis zu 25 zusätzliche Aminosäuren umfassen, die entweder das 3'- oder das 5'-Ende des Peptids flankieren. Das Peptid kann auch die Aminosäuresequenz N A R L aufweisen, und wenigstens eine bis zu 25 zusätzliche Aminosäuren umfassen, die entweder das 3'- oder das 5'-Ende des Peptids flankieren. Außerdem kann das Peptid die Aminosäuresequenz F A R L aufweisen, und wenigstens eine bis zu 25 zusätzliche Aminosäuren umfassen, die entweder das 3'- oder das 5'-Ende des Peptids flankieren. Das Peptid kann auch aus einem Peptid ausgewählt werden, das die Aminosäuresequenz A R L aufweist und wenigstens eine bis zu 25 zusätzliche Aminosäuren umfasst, die entweder das 3'- oder das 5'-Ende des Peptids flankieren. Noch ein weiteres nützliches Peptid in der vorliegenden Erfindung beinhaltet solche, die die Aminosäuresequenz A R L C aufweisen und wenigstens eine bis zu 25 zusätzliche Aminosäuren umfasst, die entweder das 3'- oder das 5'-Ende des Peptids flankieren. Schließlich kann das Segment von NTP ein Polymer aus einer Harlil-Peptidsequenz darstellen, das wenigstens zwei Wiederholungen des Peptids umfasst.

In der vorliegenden Erfindung ist noch weiter bevorzugt, dass die Harlil-Sequenzen Peptide mit den folgenden Aminosäuresequenzen sind.

1. (NTP-1)	LHARLCLANFCGRNRV
2. (NTP-2)	LARLCLANFCGNNNV
3. (NTP-3)	CARYRTGHHARLM
4. (NTP-4)	HHARLPLANFCG
5. (NTP-5)	RTGHHARLCLANFC
6. (NTP-6)	CESARYRTGHHARLC
7. (NTP-7)	DNTHHARLIL
8. (NTP-8)	SHHARLIL

Die obigen Sequenzen können durch ein Cystein an Trägerproteine konjugiert sein. So ergibt sich durch das Vorliegen von mehr als einem Cysteinrest ein gemischtes Konjugat bei den Peptiden NTP-1 und NTP-2. Daher wurde für die Peptide NTP-5 und NTP-6 das zweite Cystein mit Acetamidomethyl (C₃H₆NO)(ACM) blockiert.
Die Stelle der identifizierten Sequenzen in dem AD7C-NTP ist aus 1 ersichtlich. Obwohl alle der gezeigten Harlilanaloge eine gewisse Reaktivität zeigen, sind bevorzugte Harlilanaloga solche, die ausgewählt sind aus NTP-1, NTP-3 und NTP-7. Es sollte angemerkt werden, dass in dem Harlilanalogon NTP-1 die erste Aminosäure „L" durch Lysin oder „K" ersetzt sein kann.
Die Harlil-Sequenzen oder Segmente von NTP werden bevorzugt mit lebendem Gewebe in Kontakt gebracht, das NTP enthält. Jegliches lebendes Gewebe, das NTP enthält, das mit NTP in Kontakt stand und das kein NTP mehr enthält oder das nicht mehr in seiner ursprünglichen Form vorliegt oder das zu irgendeinem Zeitpunkt NTP enthalten könnte, ist geeignet. Bevorzugt handelt es sich bei dem Gewebe um Gewebe, das aus Säugergewebe ausgewählt ist.
Ein Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die durch Nekrose von lebendem Gewebe, welches NTP enthält, verursacht werden, wird ermöglicht. In diesem Zusammenhang bedeutet die Nekrose von lebendem Gewebe und Zelltod Zelltod und/oder Gewebenekrose von anderen Zellen als den sterbenden Zellen, welche das NTP produzieren. In dem Verfahren wird einem Säuger, der an einem solchen Zustand leidet, ein Segment von NTP oder eine Harlil-Sequenz verabreicht. Die Harlil-Sequenz wird in einer Menge und für einen Zeitraum verabreicht, der ausreichend ist, um die Nekrose des lebenden Gewebes vorzubeugen und/oder zu hemmen.
Ein Fachmann wird erkennen, dass anstelle einer direkten Verabreichung der Harlil-Sequenz die Harlil-Sequenz oder ein Homologon, eine Variante, ein Derivat oder ein Mimetikum davon durch den Säuger durch Genexpression (z.B. Gentherapie oder durch ein Vakzin) produziert oder exprimiert werden kann. Fachleute sind dazu in der Lage, geeignete Gene oder Vakzine, die dazu nützlich sind, die Expression einer Harlil-Sequenz, oder von Homologen, Derivaten, Varianten oder Mimetika davon hervorzurufen, unter Verwendung der hierin bereitgestellten Anleitung zu erzeugen, zu isolieren und zu reinigen.
Beispielsweise hat die Gentherapie große Aufmerksamkeit auf sich gezogen als ein Verfahren zur Behandlung verschiedener Säugererkrankungen und zur Steigerung der Produktion spezifischer Proteine oder anderer zellulärer Produkte. Gentherapie wird im Allgemeinen durch Einbringen von exogenem genetischem Material in die Zellen eines Säugerpatienten bewerkstelligt. Das eingebrachte genetische Material kann so konzipiert sein, dass ein abnormales (defektes) Gen des Säugerpatienten ersetzt wird („Genersetzungstherapie") oder es kann für die Expression des kodierten Proteins oder eines anderen therapeutischen Produkts konzipiert sein ohne dass irgendein defektes Gen ersetzt wird („Gensteigerung"). Da viele kongenitale und erworbene medizinische Erkrankungen von einer unzureichenden Produktion verschiedener Genprodukte herrühren, stellt die Gentherapie ein Mittel bereit, um diese Erkrankungen entweder durch transiente oder stabile Expression exogener Nukleinsäuren, die das therapeutische Produkt kodieren, bereit.
Gentherapie kann entweder durch direkte Transformation von Zielzellen in dem Säugersubjekt (in vivo-Gentherapie) oder durch Transformation von Zellen in vitro und anschließende Implantation der transformierten Zellen in das Säugersubjekt (ex vivo-Gentherapie) bewerkstelligt werden. Die in vivo-Gentherapie ist insbesondere für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Zusätzlich zur Reparatur somatischer Zellen ist es allgemein bekannt, dass die in vivo-Gentherapie auch zur systemischen Behandlung verwendet werden kann, einem Gebiet, auf dem die Gentherapie zahlreiche Anwendungen besitzt. Systemische Behandlung schließt die Transfektion von Zielzellen mit der DNA von Interesse, Expression des kodierten Proteins in der Zelle und die Fähigkeit der transformierten Zelle, anschließend das hergestellte Protein ins Blut zu sekretieren, ein.
Es ist eine Vielzahl von Verfahren entwickelt worden, um eine in vivo-Transformation zu bewerkstelligen, einschließlich mechanischer Mittel (z.B. direkte Injektion der Nukleinsäure in Zielzellen oder Partikelbeschuss), rekombinante Viren, Liposomen und Rezeptor-vermittelte Endozytose (RME) (für einen Überblick siehe Chang et al. 1994 Gasfroenterol. 106: 1076–84; Morsy et al. 1993 JAMA 270: 2338–45; und Ledley 1992 J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 14: 328–37).
Geeignete Verfahren zur Entwicklung und Verabreichung von Genen und Vakzinen, die dazu geeignet sind, eine in vivo-Expression der Harlil-Sequenzen oder der Segmente von NTP oder Homologen, Varianten, Derivaten oder Mimetika davon hervorzurufen, sind beispielsweise in US-Patent Nr. 6,210,919 und 6,225,290 offenbart.
Jegliche Zustände, die mit Zelltod und Nekrose verbunden sind, können gemäß der vorliegenden Erfindung behandelt werden. Bevorzugt ist der Zustand ausgewählt aus einer neurodegenerativen Erkrankung wie beispielsweise AD, Picks-Erkrankung, Lewy Body-Erkrankung oder Parkinson-Erkrankung oder aus Hirnschlag, Hirntumor und anderen Hirnerkrankungen oder Glaukoma.
Das Verfahren beinhaltet das Inkontaktbringen von lebendem Gewebe mit wenigstens einem Segment von NTP (oder einem Homologon, Derivat, einer Variante oder einem Mimetikum davon) in einer ausreichenden Menge, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen. Verfahren zur Verabreichung des Segments von NTP beinhalten die intramuskuläre, orale, intravenöse, intraperitoneale, intrazerebrale (intraparenchymale), intrazerebroventrikuläre, intratumorale, intraläsionale, intradermale, intrathekale, intranasale, intraokuläre, intraarterielle, topische, transdermale, über ein Aerosol, Infusion Bolusinjektion, Implantationsvorrichtung, System zur andauernden Freisetzung etc. entweder allein oder an einen Träger konjugiert, Verabreichung des Segments von NTP. Außerdem kann das Segment von NTP in vivo exprimiert oder produziert werden durch Verabreichung eines Gens, das das Protein exprimiert, durch Verabreichung eines Vakzins, das eine solche Produktion hervorruft oder durch Einbringen von Zellen, Bakterien oder Viren, welche das Segment in vivo exprimieren, wie oben beschrieben.
Die Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems oder von anderen Gehirnbezogenen Erkrankungen kann durch Verabreichung von Arzneistoffen, welche die Funktion des Nervensystems oder die Dysfunktion in Tieren oder Patienten beeinflussen, erzielt werden. Typischerweise werden solche Arzneistoffe durch periphere Applikation entweder auf oralem oder systemischem Weg verabreicht. Während manche Arzneistoffe in der Lage sind, durch die Blut-Hirn-Schranke (bbb) zu gelangen, passieren andere die bbb nicht effizient oder überhaupt nicht, und sie sind nur dann wirksam, wenn sie direkt in das Gehirn abgegeben werden. Die Bezeichnung „Blut-Hirn-Schranke" oder „bbb" wie hierin verwendet, betrifft die bbb selbst sowie die Blutspinale Schranke. Die Blut-Hirn-Schranke, welche aus dem Endothelium der Gehirngefäße, der Basalmembran und Neuroglialzellen besteht, dient dazu, das Eindringen von Substanzen in das Gehirn zu begrenzen. Manchmal ist die Struktur der bbb in zwei Komponenten unterteilt: Die endotheliale oder kapillare Schranke und die ependymale Schranke. Banks, W. A., Kastin, A. J., Barrera, „Delivering peptides to the central nervous system: Dilemmas and strategies," Pharm. Res. 8: 1345–1350 (1991).
Die Art des Eindringens von Substanzen durch die bbb ist bislang noch nicht bestimmt worden, es ist jedoch bekannt, dass viele der Regulatoren der Gehirnfunktion, wie beispielsweise Zytokine, Transferrin, Enzephaline und Endorphine durch die bbb aus den Blutgefäßen in das Gehirn passieren können. Raeissi, S., Audus, J., „In vitro characterization of blood-barrier permeability to delta sleep-inducing peptide." J. Pharm. Phy. 41: 848–852 (1989); Zlokovich, B., Susie, V. T., Davson, H., Begley, D. J., Jankov, R. M., Mitrivic, B. M., Lipovac, M. N., „Saturable mechanism for delta sleep-inducing peptide (DSIP) at the blood-brain barrier of the vascularly perfused guinea pig brain." Peptides 10: 249–254 (1989); und Zlokovich, B., In vitro approaches for studying peptide interaction at the blood-brain barrier." J. Control. Rel. 13: 185–201 (1990). Viele Substanzen, welche das zentrale Nervensystem (oder ZNS) beeinflussen können, wie beispielsweise Adenosin, β-Endorphin, synthetische Analoga endogener Peptide Houghten, R. A. Swann, R. W., Li, C. H., „β-Endorphin: Stability, clearance behaviour and entry into the central nervous system after intravenous injection of the tritiated peptide in rats and rabbits." Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77: 4588–4591 (1980); Levin, E. R., Frank, H. J. K., Weber, M. A., Ismail, M., Mills M., „Studies on penetration of the blood-brain barrier by atrial natriuretic factor." Biochem. Biophys. Res. Commun. 147: 1226–1231 (1987); Sakane, T., Tanaka, C., Yamamoto, A., Hashida, M., Sesaki, H., Ueda, H., Takagi, H., „The effect of polysorbate 80 on brain uptake and analgesic effect of D-kyoto." Int. J. Pharm. 57: 77–83 (1989) sowie einige anregende und hemmende Aminosäuren und trophische Faktoren, dringen jedoch kaum oder überhaupt nicht durch die bbb. Gegenwärtig können Arzneistoffe ohne bbb-Durchdringung oder mit geringer bbb-Durchdringung nur durch direkte ZNS-Infusion oder durch Implantation von Polymeren mit kontrollierter Freisetzung verabreicht werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 4,883,666, Sabel et al.).
Eine Möglichkeit, manche der Einschränkungen der traditionellen Arzneistofftherapie zu überwinden ist es, die relative Menge des Arzneistoffs, der die bbb passiert, zu erhöhen. Man nimmt an, dass, wenn es möglich ist, die Menge des Arzneistoffs, der durch die bbb gelangt, zu erhöhen und gleichzeitig die periphere Dosis eines verabreichten Arzneistoffs oder einer diagnostischen Substanz zu verringern, auch die peripheren Nebenwirkungen des Arzneistoffs weniger gravierend sind, während gleichzeitig die gewünschte Wirkung im Gehirn beibehalten wird. Es sind zahlreiche Ansätze beschrieben worden, die das Durchdringen von Arzneistoffen durch die bbb erhöhen.
Ein Ansatz war es, die Funktion der bbb selbst zu verändern. Beispielsweise führen osmotische Mittel bei peripheraler Verabreichung (wie beispielsweise durch intravenöse Injektion) zu einer Öffnung der bbb. Außerdem können manche Arzneistoffe, welche auf das ZNS wirken, die Durchlässigkeit der bbb für andere Substanzen verändern; beispielsweise ist über cholinomimetische Arekoline berichtet worden, dass sie Veränderungen der Arzneistoffdurchdringung durch die bbb hervorrufen. Saija, A., Princi, P., De Pasquale, R., Costa, G., „Arecoline but not haloperidol produces changes in the permeability of the blood-brain barrier in the rat." J. Pharm. Pha. 42: 135–138 (1990).
Andere Arzneistoffe, welche verabreicht werden können, um die Durchlässigkeit der bbb zu verändern, sind in US-Patent Nr. 5,059,415 und 5,124,146 von E. A. Neuwelt offenbart. Bradykinin ist ein spezifischer Arzneistoff mit solchen Effekten (US-Patent Nr. 5,112,596 von Malfroy-Camine). Ein weiteres Verfahren umfasst die Verabreichung von durchlässigmachenden Peptiden wie beispielsweise A-7 oder konformationellen Analoga davon (WO 92/18529, eine Anmeldung von J. W. Kozarich et al.). Ein relativ invasives Verfahren ist von A. Tomasz und E. Tuomanen (WO 91/16064) vorgeschlagen worden, die eine parenterale Injektion von gereinigter Zellwand oder Zellwandfragmenten von Eubakterien wie beispielsweise Streptococcus pneumoniae verabreichen, um die bbb zu öffnen.
US-Patent Nr. 5,260,210 von L. L. Rubin et al. offenbart ein Verfahren, bei dem die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke erhöht wird durch Verabreichen eines Mittels, welches zyklische AMP-Konzentrationen verringert oder störend auf diese einwirkt, oder welches die Konzentrationen an zyklischem GMP erhöht.
Die Modifikation der Arzneistoffmoleküle selbst stellt einen weiteren Ansatz dar. Beispielsweise passieren Makromoleküle wie beispielsweise Proteine die bbb überhaupt nicht oder sie passieren die bbb mit Schwierigkeiten oder durchlaufen dabei Veränderungen, durch welche die Wirksamkeit der Proteine nachteilig beeinträchtigt wird. Es ist beispielsweise möglich, zunächst die aktive Stelle des Makromoleküls zu isolieren, d.h. den Anteil des Moleküls, der das biologisch wünschenswerte Ereignis auslöst, und dann nur diese wirksame Stelle zu verwenden. Da die Größe einer der Faktoren ist, der ein Durchdringen der bbb erlaubt, kann die verringerte Größe eingesetzt werden, so dass das kleinere Molekül nun die bbb passiert. Andere Modifikationen an Makromolekülen, um ein Passieren der bbb zu erreichen, beinhalten die Glykosylierung der Proteine, wodurch deren Durchdringen durch die bbb verbessert wird, oder die Bildung eines Arzneistoffvorläufers. US-Patent Nr. 5,260,308 von J. F. Podusio und G. L. Curran diskutiert das Glykosylieren von Proteinen während US-Patent Nr. 4,933,324 und WO 89/07938, jeweils von V. E. Shashoua, die Bildung eines Arzneistoffvorläufers offenbaren. Diese Arzneistoffvorläufer werden aus einem Fettsäureträger und einem neuroaktiven Arzneistoff, der selbst nicht durch die bbb gelangen kann, gebildet. Ein ähnliches System ist in WO 89/07938 offenbart.
Noch einen weiteren Ansatz stellt die Implantation von Polymeren zur kontrollierten Freisetzung dar, welche den aktiven Bestandteil aus einem Matrixsystem direkt in das Nervengewebe freisetzen. Dieser Ansatz ist jedoch invasiv und erfordert einen chirurgischen Eingriff, wenn eine direkte Implantation in das Gehirn oder das Rückenmark erfolgt (siehe Sabel et al. US-Patent Nr. 4,883,666; und Sabel et al., US-Patentanmeldung Seriennummer 07/407,930). Es ist auch bekannt, Zusammensetzungen direkt in innere Teile des Gehirns zu verabreichen, wie es in US-Patent Nr. 5,800,390 offenbart ist. Diese Verfahren ermöglichen die Verabreichung einer andauernden Freisetzung von festen Präparationen und halbfesten Präparationen direkt in das Hirngewebe.
Um diese Einschränkungen zu überwinden, ist ein weiterer Ansatz ausprobiert worden, in welchem Arzneistoffträgersysteme wie beispielsweise Liposome, Erythrozytenghosts, Antikörperkonjugate und Konjugate monoklonaler Antikörper verwendet werden. Eines der Hauptprobleme bei der zielgesteuerten Arzneistoffzufuhr ist die rasche Opsonisierung und die Aufnahme injizierter Träger durch das Retikuloendothelialsystem (RES), besonders durch die Makrophagen in der Leber und Milz. Dieses Hindernis kann teilweise im Fall von Liposomen überwunden werden durch Aufnahme sogenannter „verdeckter" Lipide wie beispielsweise Phosphatidylinositol, Monosialogangliosid oder Sulfogalaktosylceramid.
Die US-Patente Nr. 5,182,107 und 5,154,924, jeweils von P. M. Friden, lehren ein Verfahren zur Konjugation eines Arzneistoffs mit einem Antikörper, wobei der Antikörper gegenüber einem Transferrinrezeptor reaktiv ist. Transferrinrezeptoren befinden sich an kapillaren Endothelialzellen des Gehirns, welche so einen Arzneistoff wie beispielsweise einen Nervenwachstumsfaktor über die bbb transportieren können. US-Patent Nr. 5,004,697 (von Pardridge) verbessert ein solches Antikörper-konjugiertes Verfahren, indem kationisch gemachte Antikörper mit einem speziellen isoelektrischen Punkt bereitgestellt werden (siehe auch WO 89/01343 von Pardridge).
Einen weiteren Ansatz stellt die Erzeugung chimärer Peptide dar, an welche Wirkstoffe konjugiert sind (US-Patent Nr. 4,801,575, ebenfalls von Pardridge). Ein solches System ist ferner auch in US-Patent Nr. 4,902,505 von Pardridge und Schimmel diskutiert, wobei das chimäre Peptid wie beispielsweise Histon dazu in der Lage ist, die bbb durch Transzytose zu überschreiten.
Die US-Patente Nr. 5,187,158 und 5,017,566, jeweils von N. S. Bodor, offenbaren ein gehirnspezifisches Arzneistoffzufuhrverfahren, bei dem ein zentral wirkender Arzneistoff mit der reduzierten biooxidierbaren Lipoidform eines Dihydropyridin-Reaktions Pyridinsalz-Redoxträgers wie beispielsweise Dopamin abgegeben wird (siehe auch US-Patent Nr. 4,880,816, ebenfalls von Bodor).
Ein ziemlich invasiver Ansatz wird unternommen, um genetisches Material in das Gehirn zuzuführen. Dies wird beispielsweise durch chemisches Zerstören der bbb durchgeführt und anschließend werden Viren verwendet, um Gene über die bbb zuzuführen (siehe US-Patent Nr. 4,866,042, von E. A. Neuwelt). Hier ist ein korrektives genetisches Material in einem Virus enthalten und das Virus wird dann in die Blutbahn injiziert.
Schließlich ist die Verwendung von Liposomen, wie von F. D. Collins und R. C. Thompson (WO 91/04014) offenbart, noch ein weiteres Trägersystem um Arzneistoffe über die bbb zuzuführen. Hier werden Liposome auf spezifische endogene Gehirntransportsysteme gerichtet, welche spezifische Liganden über die bbb transportieren.
Ein weiterer Ansatz ist in US-Patent Nr. 6,117,454 von Kreuter et al. offenbart. Der Gegenstand des Patents von Kreuter beinhaltet ein Verfahren, eine Zusammensetzung und ein Arzneistoffzielsteuerungssystem unter Verwendung eines oberfächenaktiven Mittels, das mit Nanopartikeln beschichtet ist, als Arzneistoffträger (oder Zielsteuerungsmolekül) für einen breiten Bereich von Arzneistoffen, um das Durchdringen von Arzneistoffen oder diagnostischen Mitteln durch die bbb zu verbessern.
Ein weiterer Ansatz ist es, die Arzneistoffe intranasal zu verabreichen, um einen direkten Zugang zu dem Gehirn zu ermöglichen und die Blutbahn zu umgehen. Dies wurde in einem expenmentellen Modell für drei Neuropeptide, Melanocortin, Vasopressin und Insulin erfolgreich durchgeführt: Bom J et al. „Sniffing neuropeptides: a transnasal approach to the human brain" Nature Neuroscience Advance Onlineveröffentlichung: 6. Mai 2002, DOI:10.1038/nn849.
Feste Dosierungsformen für die orale Verabreichung beinhalten Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver und Granulate. In solchen festen Dosierungsformen ist der aktive Bestandteil üblicherweise mit wenigstens einer der folgenden Komponenten vermischt: (a) ein oder mehrere inerte Hilfsstoffe (oder Träger) wie beispielsweise Natriumzitrat oder Dikalziumphosphat; (b) Füllstoffe oder Streckmittel wie beispielsweise Stärke, Laktose, Saccharose, Glukose, Mannitol und Kieselsäure; (c) Bindemittel wie beispielsweise Carboxymethylzellulose, Alginate, Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und Akazie; (d) Befeuchtungsmittel wie beispielsweise Glyzerin; (e) Desintegrationsmittel wie beispielsweise Agar-Agar, Kalziumkarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmte komplexe Silikate und Natriumkarbonat; (f) Abbindeverzögerer wie beispielsweise Paraffin; (g) Absorptionsbeschleuniger wie beispielsweise quaternäre Ammoniumverbindungen; (h) Benetzungsmittel wie beispielsweise Acetylalkohol und Glyzerinmonostearat; (i) Adsorbentien wie beispielsweise Kaolin und Bentonit; und (j) Gleitmittel wie beispielsweise Talk, Kalziumstearat, Magnesiumstearat, feste Polyethylenglykole, Natriumlaurylsulfat oder Gemische davon. Für Kapseln, Tabletten und Pillen können die Dosierungsformen auch Puffermittel umfassen.
Flüssige Dosierungsformen für eine orale Verabreichung beinhalten pharmazeutisch annehmbare Emulsionen, Lösungen, Suspensionen, Sirups und Elixiere. Zusätzlich zu den Verbindungen mit der aktiven Harlil-Sequenz können die flüssigen Dosierungsformen inerte Verdünner, die im Fachbereich üblicherweise verwendet werden, wie beispielsweise Wasser oder andere Lösungsmittel, Solubilisierungsmittel und Emulgatoren umfassen. Beispiele für Emulgatoren sind Ethylalkohol, Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat, Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Dimethylformamid, Öle wie beispielsweise Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Kastoröl und Sesamöl, Glyzerin, Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykole, Fettsäureester von Sorbitan oder Gemische dieser Substanzen und dergleichen. Neben solchen inerten Verdünnungsmitteln kann die Zusammensetzung auch Hilfsstoffe wie beispielsweise Benetzungsmittel, Emulgiermittel und Suspendiermittel, Süßstoffe, Geschmacksstoffe und Duftstoffe enthalten.
Ein weiteres Verfahren zur Verabreichung des Segments von NTP ist durch einen transdermalen oder transkutanen Weg. Ein Beispiel für eine solche Ausführungsform ist die Verwendung eines Patchs. Ein Patch kann insbesondere mit einer feinen Suspension eines Segments von NTP in beispielsweise Dimethylsulfoxid (DMSO) oder in einem Gemisch von DMSO mit Baumwollsamenöl hergestellt werden und mit der Haut der Säuger abseits der Behandlungsstelle in Kontakt gebracht werden. Die Zusammensetzung kann in einem Hautbeutel vorliegen. Andere Medien oder Gemische davon mit anderen Lösungsmitteln und festen Trägem würden ebenso gut funktionieren. Der Patch kann das Segment von NTC in Form einer Lösung oder einer Suspension enthalten. Der Patch kann dann auf der Haut des Patienten aufgebracht werden, beispielsweise indem er in eine Hauttasche des Patienten eingefügt wird, die gebildet wird, indem die Haut gefaltet und mit Stichen, Clips oder anderen Haltevorrichtungen zusammengehalten wird. Diese Tasche sollte auf eine solche Weise verwendet werden, dass ein kontinuierlicher Kontakt mit der Haut ohne Beeinträchtigung des Säugers sichergestellt wird. Abgesehen von der Verwendung einer Hauttasche kann eine beliebige Vorrichtung verwendet werden, welche die stabile Anbringung des Patchs in Kontakt mit der Haut sicherstellt. Beispielsweise könnte eine Haftbandage verwendet werden, um den Patch auf der Haut in Position zu halten.
Tatsächliche Dosierungsmengen der wirksamen Bestandteile in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können variiert werden, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die ein Segment von NTP enthält, die wirksam ist um eine gewünschte Gewebenekrose-hemmende therapeutische Antwort für eine bestimmte Zusammensetzung und ein bestimmtes Verabreichungsverfahren zu erhalten. Die ausgewählte Dosierungsmenge hängt daher von dem gewünschten therapeutischen Effekt, der Verabreichungsweise, der gewünschten Behandlungsdauer und anderen Faktoren ab.
Bei Säugern, einschließlich Menschen, können die wirksamen Mengen auf Grundlage der Körperoberfläche verabreicht werden. Der Zusammenhang der Dosierungen für Tiere verschiedener Größen, Spezien und für Menschen (bezogen auf mg/M² der Körperoberfläche) ist von E. J. Freireich et al., Cancer Chemother. Rep., 50: (4): 219 (1966) beschrieben worden. Die Körperoberfläche kann in etwa aus der Höhe und dem Gewicht eines Individuums berechnet werden (siehe z.B. Scientific Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y. Seiten 537–538 (1970)).
Die Tagesdosis des NTP-Segments, das einem Wirt verabreicht wird, kann in Form einer Einzeldosis oder in unterteilten Dosierungen verabreicht werden. Dosierungseinheitszusammensetzungen können solche Mengen entsprechender Bruchteile davon enthalten, dass die Tagesdosis erreicht wird. Selbstverständlich hängt jedoch die spezielle Dosismenge für einen bestimmten Patienten von einer Vielfalt an Faktoren einschließlich dem Körpergewicht, dem Allgemeinzustand, dem Geschlecht, der Ernährung, Zeit und Art und Weise der Verabreichung, Wirkkraft des verabreichten Arzneistoffs, Absorptions- und Exkretionsraten, Kombination mit anderen Arzneistoffen und der Schwere der bestimmten behandelten Krankheit ab.
Die NTP-Segment-haltigen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung enthalten bevorzugt eine Komponente, welche es ermöglicht, dass das Segment von NTP durch die Blut-Hirn-Schranke gelangt, um lebendes Hirngewebe zu behandeln. Eine beliebige der Vielfalt der oben beschriebenen Komponenten kann verwendet werden, um die Segmente in die Lage zu versetzen, die Blut-Hirn-Schranke zu durchqueren. Beispielsweise können die Segmente von NTP klein genug sein, um die Blut-Hirn-Schranke zu durchqueren. In diesem Fall werden keine zusätzlichen Komponenten benötigt.
Die Segmente von NTP können glykosiliert sein, um die Durchlässigkeit durch die bbb zu steigern, wie in US-Patent Nr. 5,260,308 offenbart, oder sie können zu einem Arzneistoffvorläufer umgeformt werden, wie in US-Patent Nr. 4,933,324 und WO 89/07938 offenbart. Diese Arzneistoffvorläufer werden bevorzugt aus einem Fettsäureträger und einem Segment von NTP, das selbst nicht in der Lage ist, durch die bbb zu gelangen, gebildet.
Ein alternativer Ansatz ist die Implantation von Polymeren für die kontrollierte Freisetzung, welche die Segmente von NTP aus einem Matrixsystem direkt in das Nervengewebe freisetzen (siehe Sabel et al., US-Patent Nr. 4,883,666 und Sabel et al., US-Patentanmeldung Seriennummer 07/407,930). Es ist auch möglich, Arzneistoffträgersysteme wie beispielsweise Liposome, Erythrozytenghosts, Antikörperkonjugate und Konjugate monoklonaler Antikörper zu verwenden. Gemäß dieser Ausführungsform der Erfindung können sogenannte „versteckte" Lipide wie beispielsweise Phosphatidylinositol, Monosialogangliosid oder Sulfogalaktosylceramid verwendet werden, um die Liposome, welche die zuvor erwähnten Antikörper und Antikörperkonjugate enthalten, zu bilden.
Die Segmente von NTP können mit einem Antikörper konjugiert sein, der gegenüber einem Transferrinrezeptor reaktiv ist, wie in US-Patenten Nr. 5,182,107 und 5,154,924 offenbart. Transferrinrezeptoren befinden sich an kapillaren Endothelialzellen des Gehirns, welche so einen Arzneistoff wie beispielsweise einen Nervenwachstumsfaktor oder Segmente von NTP über die bbb transportieren. Das oben beschriebene Konjugat aus NTP-Segment und Antikörper kann weiter verbessert werden, indem kationisierte Antikörper mit einem spezifischen isoelektrischen Punkt bereitgestellt werden, wie in US-Patent Nr. 5,004,697 und WO 89/01343 offenbart.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung umfasst die Erzeugung chimärer Peptide, an welche die aktiven Segmente von NTP konjugiert sind, wie in US-Patent Nr. 4,801,575 offenbart. Bei dem chimären Peptid handelt es sich bevorzugt um Histon, welches in der Lage ist, durch Transzytose durch die bbb zu gelangen, wie in US-Patent Nr. 4,902,505 offenbart. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung beinhaltet die Bereitstellung der Segmente von NTP zusammen mit der reduzierten, biooxidierbaren Lipoidform eines Dihydropyridin-Reaktions Pyridinsalz-Redoxträgers wie beispielsweise Dopamin, wie in den US-Patenten Nr. 4,880,816; 5,187,158 und 5,017,566 offenbart.
Außerdem kann ein weiterer Ansatz unternommen werden, um die Segmente von NTP zu dem Gehirn zuzuführen. Dies kann durchgeführt werden, indem die bbb chemisch zerstört wird und anschließend Viren verwendet werden, um die Segmente von NTP über die bbb zuzuführen, wie in US-Patent Nr. 4,866,042 offenbart. Hier ist es bevorzugt, dass ein korrektives genetisches Material in einem Virus eingefügt ist und das Virus dann in die Blutbahn injiziert wird. Noch ein weiteres Trägersystem, das verwendet werden kann, um die Segmente von NTP über die bbb zuzuführen, ist die Verwendung von Liposomen wie von F. D. Collins und R. C. Thompson offenbart (WO 91/04014). Hier werden Liposome bevorzugt auf spezifische endogene Gehirntransportsysteme gerichtet, welche spezifische Liganden über die bbb transportieren. Oberflächenaktive Mittel, die mit Nanopartikeln beschichtet sind, können ebenfalls als Arzneistoffträger (oder als Zielssteuerungsmolekül) für die erfindungsgemäßen Segmente von NTP verwendet werden, um deren Durchdringung durch die bbb zu verbessern, wie in US-Patent Nr. 6,117,454 offenbart.
Ein weiterer Ansatz ist es, L-Aminosäureoxidase zu verwenden, um den Plasmawert der Segmente von NTP zu verringern, um einen Transport der Segmente von NTP über die bbb zu ermöglichen. Ein solcher Ansatz ist ausführlicher in US-Patent Nr. 5,695,751 beschrieben.
Ein weiterer Ansatz ist es, Zusammensetzungen zu verabreichen, welche die Segmente von NTP lokal umfassen. Vorrichtungen, die dazu nützlich sind, Zusammensetzungen zu einem innen gelegenen Teil des Gehirns zu verabreichen, sind beispielsweise in US-Patent Nr. 5,800,390 beschrieben.
Andauernde Freisetzungspräparationen, feste Präparationen und halbfeste Präparationen können dem Gehirngewebe direkt verabreicht werden. Eine solche Verabreichung kann bewerkstelligt werden, indem ein nadelartiges Teil einer solchen Intrazerebralvorrichtung gegebenenfalls so in den Kopf implantiert wird, dass ein distales Ende des Führers sich an der Stelle der Verabreichung befindet.
Eine bevorzugte Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung für die Verabreichung bei einem Säuger, der an einem Zustand leidet, der mit Zelltod und/oder Gewebenekrose verbunden ist, beinhaltet die Segmente von NTP und eine Komponente, welche es den Segmenten von NTP ermöglicht, die bbb zu durchqueren. Andere bevorzugte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen ein Gen ein, welches die Segmente von NTP exprimiert und eine Komponente, welches es dem Gen ermöglicht, die bbb zu durchqueren. Eine weitere bevorzugte Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung schließt ein Vakzin ein, welches die Expression des Segments von NTP induziert, sowie eine Komponente, welche es dem Vakzin ermöglicht, die bbb zu durchqueren.
In der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die Menge der Segmente von NTP, welche mit dem lebenden Gewebe in Kontakt kommen, eine Menge ist, die ausreicht, um Zelltod und/oder Gewebenekrose zu hemmen, vorzubeugen und/oder zu bessern. Die spezifische Menge kann von einem Fachmann unter Verwendung der hierin bereitgestellten Anleitung ermittelt werden. Es ist bevorzugt, dass genügend Segmente von NTP verabreicht werden, um Zelltod oder Gewebenekrose um mehr als 50% im Vergleich zu einer Kontrolle, bei der kein Segment von NTP vorliegt und Zelltod unkontrolliert erfolgt, zu verringern. Weiter bevorzugt werden die Segmente von NTP verabreicht, um Zelltod oder Gewebenekrose um mehr als 60%, noch weiter bevorzugt um mehr als 70% und am meisten bevorzugt um mehr als 75% zu verringern, im Vergleich zu einer Kontrolle, bei der kein Segment von NTP vorliegt und Zelltod oder Gewebenekrose unkontrolliert abläuft.
Eine solche Menge hängt unveränderlich von der bestimmten Gewebeart, den verwendeten NTP-Segmenten sowie von der Menge an NTP oder einem anderen molekularen Ziel ab. Unter Verwendung der in beliebigen der zuvor genannten US-Patente Nr. 5,948,634; 5,948,888; 5,830,670 und 6,071,705 offenbarten Verfahren ist es möglich, die relative Menge an NTP oder einem anderen vorliegenden molekularen Ziel abzuschätzen und dann eine Reihe von in vitro-Experimenten durchzuführen, wobei Säugergewebe verwendet wird, das aus verschiedenen Quellen erhalten wird, wie beispielsweise beliebige solcher, die in den zuvor genannten US-Patenten offenbart sind, die Menge am NTP oder eines anderen molekularen Ziels in dem Gewebe zu bestimmen und dann die entsprechende Menge an NTP-Segmenten zu bestimmen, die erforderlich ist, um das erforderliche Ausmaß an Prävention von Zelltod oder Gewebenekrose (d.h. bevorzugt mehr als 60% im Vergleich zu einer Kontrolle) zu erreichen. Fachleute sind dazu in der Lage, diese Experimente unter Verwendung von Techniken, die im Fachbereich bekannt sind sowie unter Verwendung der hierin bereitgestellten Anleitung durchzuführen.
Die Menge an NTP-Segmenten, welche dem Säuger verabreicht werden sollen, kann leicht auf Grundlage des Körpergewichts des Säugers und der erwarteten Zufuhrmenge zu dem Gewebe bestimmt werden. Die Menge an NTP-Segmenten, von denen auszugehen ist, dass sie zu dem Gehirngewebe eines Säugers zugeführt werden, hängt von dem bestimmten Mechanismus ab, der eingesetzt wird, um die NTP-Segmente in die Lage zu versetzen, die bbb zu überschreiten. Dasselbe trifft für die Verabreichung von Genen, welche die NTP-Segmente exprimieren oder für die Verabreichung von Vakzinen, welche die Expression oder Produktion der Segmente von NTP hervorrufen, zu. Auch hier sind Fachleute dazu in der Lage, die entsprechende Dosis des Gens, Vakzins, der NTP-Segmente, welche einem Säuger verabreicht werden sollen unter Verwendung der in den zuvor genannten Patenten beschriebenen Techniken und unter Verwendung der dort und hierin bereitgestellten Anleitungen, zu bestimmen.
Die folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung zu veranschaulichen. Es sollte jedoch nicht so verstanden werden, dass die Erfindung durch die speziellen in diesen Beispielen beschriebenen Bedingungen oder Einzelheiten begrenzt sind.
Beispiel 1
Dieses Beispiel demonstriert den Zelltod in lebendem Gewebe (in vivo) aufgrund des Vorliegens von AD7C-NTP.
AD7C-NTP wurde gemäß der in beliebigen der US-Patente Nr. 5,948,634; 5,948,888; 5,830,670 und 6,071,705 dargelegten Vorgehensweisen erhalten.
In acht normale Ratten wurde in die Haut und subkutan jeweils in drei unterschiedliche Foci gereinigtes rekombinantes AD7C-NTP in Saline mit Konzentrationen von 0,1–1,0 μg/mL über Plastikspritzen durch 26 Gauge Nadeln aus rostfreiem Stahl injiziert.
Die Tiere wurden 24 Stunden lang beobachtet und nach 24 Stunden schmerzfrei getötet. Die 24 einzelnen Infiltrationsfoci wurden herausgeschnitten, in 10%-igem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und durch histopathologische Standardverfahren angefärbt und untersucht.
In ähnliche Gruppen von Kontrollratten wurde (1) Rinderserumalbumin in Saline, (2) normales humanes Serum und (3) physiologische Saline injiziert und diese Ratten wurden wie oben untersucht und getötet, wobei die herausgeschnittenen Injektionsfoci wie oben behandelt wurden.
Die Injektion von AD7C-NTP erzeugte in allen Beispielen an den Injektionsstellen eine akute Gewebenekrose. Die Nekrose ist in Muskelgewebe, subkutanem Bindegewebe und Dermis an den Stellen, in welche das AD7C-NTP injiziert wurde, erkennbar. Nach 24 Stunden erscheinen die Zellen blass, geschrumpft und nekrotisch und es liegt eine Infiltration von inflammatorischen Zellen vor. Die Nekrose korreliert mit den Injektionsbereichen und scheint sich nicht weit über die Injektionsstelle hinaus auszudehnen.
Kontrollen zeigten keinerlei Anzeichen für Nekrose oder Zellverlust. Kontrollinjektionen wiesen eine geringe bis minimale akute Entzündung und fokale Mikrohämorrhagen durch die Nadeln auf.
Beispiel 2
Der Zweck dieses Beispiels war es, verschiedene Harlil-Sequenzen des AD7C-NTP Neuralen Threat Proteins zu identifizieren und deren Reaktivität mit AD7C-NTP zu bestimmen.

Die folgenden Harlil-Sequenzen wurden synthetisiert (Synpep, Dublin CA) und an Maleimid-aktiviertes Kaninchen-IgG (Jackson Immunoresearch, West Grove PA) konjugiert und auf ihre NTP-Immunoreaktivität hin untersucht. Ein Linker wurde hinzugefügt, der eine Wiederholung der vor und nach der 90–96 H H A R L C L- Sequenz von AD7C-NTP auftretenden Proteinsequenz war.

Die Konjugation an Trägerproteine erfolgte über ein Cystein. Somit ergibt sich ein durch die Peptide NTP-1 und NTP-2 erzeugtes Gemisch des Konjugats, da mehr als ein Cysteinrest vorliegt. Daher wurde für die Peptide NTP-5 und NTP-6 das zweite Cystein mit Acetamdiomethyl (C₃H₆NO)(ACM) blockiert.
Die Position der identifizierten Sequenzen in der AD7C-NTP-Sequenz ist in 1 ersichtlich. Wie oben erwähnt, sind auch Homologe, Derivate, Mimetika und Varianten der Harlil-Peptide im Rahmen der Erfindung inbegriffen. Für die Erzeugung der homologen Peptide dieses Beispiels wurden homologe Aminosäuren verwendet. Die verwendeten Substitutionskriterien waren Ladung und/oder Größe. Somit beruhte die Auswahl, Methionin in NTP-Peptid 3 gegen Cystein auszutauschen, auf einer insgesamten Ähnlichkeit dieser beiden Aminosäuren und dem Erfordernis, ein reaktives Cystein aus diesem bestimmten Aminosäurestrang zu entfernen. Die Wahl, Prolin gegen Cystein auszutauschen, war ein Versuch, zu sehen, ob dadurch die konformationelle Form des Peptids nachgeahmt wird, wenn es in dem Protein vorliegt und das Cystein in einer Disulfidverknüpfung vorliegt.
Weitere Veränderungen, die Fachleuten bekannt sind, um Affinitätswechselwirkungen zu beeinflussen oder zu untersuchen, beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf, beispielsweise Austausch von Leucin durch andere hydrophobe Aminosäuren wie beispielsweise Isoleucin, Valin, Alanin oder Glyzin; Austausch saurer Aminosäuren oder basischer Aminosäuren; Austausch von Histidin durch Phenylalanin, um die Auswirkung von Ladung gegenüber Raumbedarf zu bestimmen; Austausch von Asparagin durch Aspartat, oder Glutamin durch Glutamat, um die Auswirkung von Ladung gegenüber Raumbedarf abzuschätzen; und Austausch von Serin durch Threonin, Threonin durch Cystein, Aspartat durch Glutamat, Arginin durch Lysin oder Histidin, und Tyrosin durch Tryptophan oder Phenylalanin. Die in die flankierenden Sequenzen eingebrachten Veränderungen wurden durchgeführt, um das Peptid weniger basisch oder hydrophob zu machen.
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt die Prävention und/oder Hemmung von Nekrose von lebendem Gewebe (in vivo) durch Verabreichung eines Segments von NTP oder eines Homologons, einer Variante, eines Mimetikums oder Derivats davon, welches NTP bindet, zu Gewebe, das NTP enthält.
AD7C-NTP wurde wie oben in Beispiel 1 beschrieben erhalten. Die Harlil-Sequenzen NTP-1, NTP-3 und NTP-7 wurden gemäß obigem Beispiel 2 hergestellt und in diesem Beispiel verwendet.
Rekombinante Proben von AD7C-NTP mit 100 ng/mL–10 μg/mL wurden bei Raumtemperatur für 5 Minuten für eine Stunde mit den zuvor genannten Harlil-Sequenzen inkubiert und anschließend in Ratten, wie in Beispiel 1 beschrieben, injiziert.
Alternativ wurde eine Lösung der Harlil-Sequenz in Konzentrationen im Bereich von 1 Mikrogramm/mL bis 1 Milligramm/mL hergestellt. Lösungen, welche das rekombinante AD7C-NTP enthalten, wurden ebenfalls wie oben beschrieben hergestellt, wobei die Harlil-Sequenz nicht hinzugefügt wurde. Den Tieren wurden etwa 100 Mikroliter der AD7C-NTP-Lösung und zusätzlich etwa 100 Mikroliter der Harlil-Sequenz injiziert.
Die Tiere wurden für 24 Stunden beobachtet und nach 24 Stunden schmerzfrei getötet. Die 24 einzelnen Infiltrationsfoci wurden herausgeschnitten, in 10%-igem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und angefärbt und mittels histopathologischer Standardverfahren untersucht.
In ähnlichen Gruppen von Kontrollratten wurde (1) AD7C-NTP allein wie in Beispiel 1 beschrieben, (2) Rinderserumalbumin in Saline, (3) normales humanes Serum und (4) physiologische Saline injiziert und die Ratten wurden wie oben untersucht und getötet, wobei die herausgeschnittenen Injektionsfoci wie oben behandelt wurden.
Die Kontrollinjektionen von AD7C-NTP allein erzeugten wie in Beispiel 1 beschrieben Gewebenekrose. Kontrollinjektionen von Rinderserumalbumin (BSA), normalem humanem Serum und physiologischer Saline zeigten jeweils keinerlei Anzeichen für Nekrose oder Zellverlust. Die obigen Kontrollinjektionen wiesen geringe bis minimale akute Entzündung und fokale Mikrohämorrhagen von den Nadeln auf.
Die AD7C-NTP-Proben, welche zusammen mit jeder der Harlil-Sequenzen NTP-1, NTP-3 und NTP-7 injiziert wurden, zeigten eine über 95%-ige Verringerung der Gewebenekrose im Vergleich zu den Kontrollproben, in welche AD7C-NTP allein injiziert wurde. Es lagen gelegentliche fokale Knoten inflammatorischer Zellfoci mit einer Mikroknotenbildung vor, bei denen es sich möglicherweise um die Aggregation von AD7C-NTP und der Harlil-Sequenz handelt. Die Gewebeverletzung wurde durch die Verabreichung des Segments von NTP (oder der Harlil-Sequenz) insgesamt um > 95% verringert im Vergleich zu Kontrollen, in welche nur AD7C-NTP injiziert wurde.

Claims

Verwendung von wenigstens einem Segment von NTP bei der Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung von und/oder die Vorbeugung und/oder Hemmung von Zuständen die im Zusammenhang stehen mit Zelltod und/oder Gewebenekrose im Hirngewebe von lebenden Säugern, wobei die Zusammensetzung weiterhin eine Komponente umfasst, die es ermöglicht, dass das Segment von NTP durch die Blut-Hirn-Schranke gelangt.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei wenigstens ein Segment von NTP eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: a) THARLIL; HHARLCL; MFARLIL; HHARLIF; b) HHARL; HARL; HARLI; HARLIL; HHARLCL; ARLIL; HHARLIF; THARLIL; ARLI; ARL; HARLCL; ARLCL; ARCL; MFARLIL; FARLIL; FARLI; FARL; HARLIF; ARLIF; c) LHARLCLANFCGRNRV; d) LARLCLANFCGNNNV; e) CARYRTGHHARLM; f) HHARLPLANFCG; g) RTGHHARLCLANFC; h) CESARYRTGHHARLC; i) DNTHHARLIL; j) SHHARLIL; und k) HARLML; HARLVL; und HAKLIL und Varianten, Homologen, Derivaten und Mimetika davon.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Zustand eine neurodegenerative Störung ist.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei die neurodegenerative Störung Alzheimer-Erkrankung ist.
Zusammensetzung zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder Gewebenekrose im Zusammenhang stehen, umfassend ein Segment von NTP und eine Komponente, die es ermöglicht, dass das Segment von NTP durch die Blut-Hirn-Schranke gelangt.
Zusammensetzung nach Anspruch 5, wobei wenigstens ein Segment von NTP eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) THARLIL; HHARLCL; MFARLIL; HHARLIF; b) HHARL; HARL; HARLI; HARLIL; HHARLCL; ARLIL; HHARLIF; THARLIL; ARLI; ARL; HARLCL; ARLCL; ARCL; MFARLIL; FARLIL; FARLI; FARL; HARLIF; ARLIF; c) LHARLCLANFCGRNRV; d) LARLCLANFCGNNNV; e) CARYRTGHHARLM; f) HHARLPLANFCG; g) RTGHHARLCLANFC; h) CESARYRTGHHARLC; i) DNTHHARLIL; r) SHHARLIL; und s) HARLML; HARLVL; und HAKLIL und Varianten, Homologen, Derivaten und Mimetika davon.