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Diese
Anmeldung nimmt die Priorität
der US-Provisional-Patentanmeldung Nr. 60/290,971 mit dem Titel „Method
of Preventing Cell Death Using Segment of Neural Thread Proteins" in Anspruch.
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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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1. Gebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Vorbeugung von Zelltod
und Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die eine Vorbeugung,
Hemmung und/oder Besserung von Zelltod und Gewebenekrose erfordern.
Die Erfindung umfasst die Verwendung eines Segments von Neural Thread
Proteinen (NTP) oder einem Homologon, Derivat, einer Variante oder
einem Mimetikum davon zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Verabreichung
bei einem Säuger
bei dem Zelltod erfolgt. Das Segment kann intramuskulär, oral, intravenös, intraperitoneal,
intrazerebral (intraparenchymal), intrazerebroventikulär, intratumoral,
intraläsional, intradermal,
intrathekal, intranasal, intraokulär, intraartheriell, topisch,
transdermal, über
ein Aerosol, eine Infusion, Bolusinjektion, Implantatvorrichtung,
ein System zur andauernden Freisetzung, etc. entweder einzeln oder
an einen Träger
konjugiert verabreicht werden. Alternativ kann das Segment in vivo
exprimiert werden, indem ein Gen verabreicht wird, welches das Segment
exprimiert, durch Verabreichen eines Vakzins, das eine solche Produktion
hervorruft oder durch Einbringen von Zellen, Bakterien oder Viren,
welche das Segment in vivo entweder aufgrund genetischer Modifikation
oder aufgrund anderer Ursachen exprimieren.
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2. Beschreibung des verwandten
Fachbereichs
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Alzheimer
Erkrankung (AD) ist eine komplexe neurodegenerative Störung, die
durch fortschreitende Beeinträchtigungen
des Gedächtnisses,
des Verhaltens, der Sprache und der räumlichen Sehfähigkeiten
gekennzeichnet ist und schließlich
zum Tod führt.
Kennzeichnende Pathologien in den anfälligen Regionen beinhalten
extrazelluläre β-Amyloid
Ablagerungen, intrazelluläres
neurofibrilläres
Gewirr, Verlust von Synapsen und erheblichen neuronalen Zelltod.
Bei der Forschung nach den Ursachen und Behandlungsmöglichkeiten der
Alzheimer Erkrankung haben Forscher zahlreiche Wege beschritten.
Beachtliche Anzeichen in der Ätiologie
der Erkrankung haben Veränderungen
bei der Herstellung oder Verarbeitung des menschlichen Amyloidvorläuferproteins
(APP) mit sich gebracht. Die intensive Forschung hat jedoch gezeigt,
dass es sich bei AD um eine Erkrankung mit zahlreichen Faktoren
handelt, die viele unterschiedliche, möglicherweise überlappende Ätiologien
aufweist.
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Aufgrund
dessen wurde von den Fachleuten eine ausgiebige Forschung und klinische
Untersuchungen durchgeführt,
um die strukturellen Defizite, chemischen Veränderungen und funktionellen
Abweichungen sowohl im Gehirn als auch innerhalb verschiedener Populationen
von Nervenzellen zu untersuchen. Der Umfang solcher Untersuchungen
und Studien wird durch die folgenden Veröffentlichungen wiedergegeben,
welche nur eine Handvoll der unzähligen
Berichte auf diesem Gebiet darstellen: Neurobiology of Alzheimer's Disease (D. Dawbarn
und S. J. Allen, Herausgeber), Bios, Oxford 1995; Dementia, (J.
Whitehouse, Hrsg.), F. A. Davis Company, Philadelphia, 1993; Alzheimer's Disease: Senile
Dementia and Related Disorders (Katzman, R, und R. L. Bick, Hrsg.),
Raven Press, New York, 1994, Seiten 47–51; Alzheimer's Disease and Related
Disorders, Etiology, Pathogenesis and Therapeutics (Iqbol, K., et
al., Hrsg.), Wiley, Chichester, 1999; Alzheimer's Disease: Advances in Clinical and
Basic Research (Corain, B, Hrsg.), Wiley, New York, 1993; Alzheimer's Disease: Clinical
and Treatment Perspectives (Cutler, N. R., et al., Hrsg.), Wiley,
Chichester, 1995; Alzheimer's Disease:
Therapeutic Strategies (Giacobini, E., Becker, R., Hrsg.), Birkhauser,
Boston, 1994; Paykel, et al., Arch. Gen. Psychiat., 51: 325–332 (1994);
Amaducci, et al., Neurology, 36: 922–931 (1986); McKhann, et al., Neurology
34: 939–944
(1984), Heston et al., Arch. Gen. Psychiatry 38: 1085–1090 (1981);
Aging of the Brain (Gispen und Traber, Hrsg.), Elsevier Science
Publishers, Amsterdam, 1983, Seiten 275–282; Heyman et al., Ann. Neurol
15: 335–341
(1984); Brayne C. und P. Calloway, Lancet 1: 1265–1267 (1988);
Roth et al., Br. J. Psychiatry 149: 698–709 (1986); Medical Research
Council, Report from the NRC Alzheimer's Disease Workshop, London, England,
1987; Morris et al., Neurology 41: 469–478 (1991); sowie die in diesen
Veröffentlichungen
zitierten Literaturstellen.
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Bis
heute ist die Alzheimer Erkrankung die drittteuerste Erkrankung
in den Vereinigten Staaten, durch welche der Gesellschaft jährlich etwa
100 Milliarden $ an Kosten entstehen. Alzheimer ist eine der häufigsten Erkrankungen
der älteren
Bevölkerung
und sie wird mit dem zunehmenden Alter der Gesellschaft immer bedeutender
werden. Kosten, die mit AD im Zusammenhang stehen, beinhalten direkte
medizinische Kosten wie beispielsweise Altenheimpflege, direkte
nicht-medizinische
Kosten wie beispielsweise Heimtagesbetreuung und indirekte Kosten
wie beispielsweise ein Produktivitätsverlust des Patienten und
des Pflegepersonals. Medizinische Behandlung und Verhaltensänderung
können ökonomischen
Nutzen bringen, indem die Geschwindigkeit des kognitiven Abbaus
verlangsamt wird, die Institutionalisierung verzögert wird, die Stundenzahl
des Pflegepersonals verringert wird und die Lebensqualität verbessert
wird. Pharmakoökonomische
Auswertungen haben positive Ergebnisse gezeigt hinsichtlich der
Wirkung der Arzneimitteltherapie und der Verhaltensänderung
bei der Unterbringung in Pflegeheimen, Kognition und Zeit des Pflegepersonals.
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Neural
Thread Proteine (NTP) sind eine Familie von Gehirnproteinen, die
vor kurzem charakterisiert wurden. Ein Mitglied dieser Familie,
AD7C-NTP, ist ein ~41 kD membranassoziiertes Phosphoprotein mit
Funktionen, die mit dem Nervenwachstum im Zusammenhang stehen (de
la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997); de la Monte et
al., Alz. Rep. 2: 327–332
(1999); de la Monte SM und Wands JR, Journal of Alzheimer's Disease, 3: 345–353 (2001)).
Das Gen, welches AD7C-NTP
kodiert und die vorhergesagte Proteinsequenz für AD7C-NTP sind identifiziert
und beschrieben worden (de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997)).
Zusätzlich
zu der ~41 kD-Spezies sind andere Spezien Neuraler Thread Proteine
(~26 kD, ~21 kD, ~17 kD und ~15 kD) identifiziert und mit neuroektodermalen Tumoren,
Astrozytoma und Glioblastoma sowie mit Verletzung aufgrund von Hypoxie,
Ischämie
oder Hirninfarkt in Zusammenhang gesetzt worden (Xu et al., Cancer
Research 53: 3823–3829
(1993); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10): 1038–50 (1996),
de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1–2): 26–35 (1996); de la Monte et
al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118–25 (1996); de la Monte et
al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997); und de la Monte
et al., Alz. Rep., 2: 327–332
(1999)).
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Spezien
Neuraler Thread Proteine sind beschrieben und in den US-Patenten
Nr. 5,948,634; 5,948,888 und 5,830,670 jeweils für „Neural Thread Protein Gene
Expression and Detection of Alzheimer's Disease" und in US-Patent Nr. 6,071,705 für „Method
of Detecting Neurological Disease or Dysfunction" beansprucht worden. Die Offenbarungen
dieser Patente sind hierin speziell vollständig als Referenz inbegriffen.
Wie hierin beschrieben wird NTP während des Zelltodes aufreguliert
und produziert. Somit überproduzieren
tote und sterbende Nervenzellen NTP und dementsprechend zeigt das
Vorhandensein von NTP den Tod von Nervenzellen und die Entstehung
von Alzheimer Erkrankung (AD) an.
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Andere
Spezien von Neuralem Thread Protein sind als andere Produkte des
AD7C-NTP-Gens identifiziert
worden (z.B. ein Protein mit 112 Aminosäuren, das in NCBI Entrez-Protein
Database Accession #XP_032307 PID g15928971 beschrieben ist) oder
sie wurden als ähnlich
zu Neuralen Thread Proteinen identifiziert (z.B. ein 106 Aminosäurenprotein,
das in NCBI Entrez-Protein Database Accession #AAH14951 PID g15928971
beschrieben ist, ein weiteres Protein mit 106 Aminosäuren, das
in NCBI Entrez-Protein Database Accession #XP_039102 PID g18599339
beschrieben ist und ein Protein mit 61 Aminosäuren, das in NCBI Entrez-Protein
Database Accession #AAH02534 PID g12803421 beschrieben ist).
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Es
liegen überzeugende
Beweise dafür
vor, dass die AD7C-NTP-Spezies des Neuralen Thread Proteins insbesondere
mit AD und dessen Hochregulierung während des Zelltodes bei AD
verbunden ist. AD7C-NTP-mRNA wird im Vergleich zu Kontrollen im
AD-Gehirn hochreguliert; AD7C-NTP-Proteinmengen im Gehirn und im
CSF sind höher
bei AD als in Kontrollen; und AD7C-NTP-Immunoreaktivität findet
sich bei seniler Plaque, neurofibrillärem Gewirr (NFT), degenerierenden
Neuronen, Neuropilusfäden
und dystrophischen neurotischen Trieben in Gehirnen mit AD und Down-Syndrom
(Ozturk et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86: 419–423 (1989);
de la Monte et al., J. Clin. Invest., 86(3): 1004–13 (1990);
de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 113(2): 152–64 (1992); de la Monte et
al., Ann. Neurol., 32(6): 733–42
(1992); de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55(10):
1038–50
(1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1–2): 26–35 (1996);
de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118–25 (1996); de la Monte et
al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997); und de la Monte
et al., Alz. Rep., 2: 327–332
(1999)). Die Immunozytochemie zeigte, dass das AD7C-NTP-Protein in Zellen
lokalisiert ist, in feinen Prozessen in dem Neutropilus oder extrazellulär in Gehirnen
mit sowohl AD als auch Down-Syndrom, de la Monte et al., Ann. Neurol.,
32(6): 733–42
(1992). Zwei Arten von Zellen enthalten AD7C-NTP: Neuronen und Astrozyten
(Id.) Die betroffenen Neuronen sind die großen pyramidalen Neuronen, welche
typischerweise das im AD-Gehirn bekannte neurofibrilläre Gewirr
enthalten (Id.)
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Sowohl
im CSF als auch im Urin von AD-Patienten sind erhöhte Mengen
an AD7C-NTP-Protein
gefunden worden, was dessen Genauigkeit als biochemischer Maßstab für diese
verheerende Erkrankung zeigt (de la Monte und Wands, Front Biosci
7: 989–96
(2002); de la Monte und Wands, Journal of Alzheimer's Disease 3: 345–353 (2001);
Munzar et al., Alzheimer's
Reports 4: 61–65
(2001); Kahle et al., Neurology 54: 1498–1504 (2000) und Averback Neurology
55: 1068 (2000); Munzar et al., Alzheimer Reports 3: 155–159 (2000);
de la Monte et al., Alzheimer's
Reports 2: 327–332
(1999); Ghanbari et al., J Clin Lab Anal 12: 285–288 (1998); Ghanbari et al.,
J. Clin Lab Anal 12: 223–226
(1998); Ghanbari et al., Journal of Contemporary Neurology 1998;
4A: 2–6
(1998); und de la Monte et al., J Clin Invest 100: 3093–3104.
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Die Überexpression
des AD7C-NTP-Gens ist auch mit dem Vorgang des Zelltodes bei Alzheimer
Erkrankung in Zusammenhang gesetzt worden (de la Monte und Wands,
J. Neuropatho. and Exp. Neuro., 60: 195–207 (2001); de la Monte und
Wands, Cell Mol Life Sci 58: 844–49 (2001). AD7C-NTP ist auch
im Hirngewebe bei Down-Syndrom identifiziert worden (Wands et al.,
Internationale Patentveröffentlichungsschrift
Nr. WO 90/06993; de la Monte et al., J Neurol Sci 135: 118–25 (1996);
de la Monte et al., Alz. Rep., 2: 327–332 (1999)). Es gibt Anzeichen
dafür,
dass eine Überexpression
des AD7C-NTP-Gens auch mit Normaldruckglaukoma einhergehen kann
(Golubnitschaja-Labudova et al., Curr Eye Res 21: 867–76 (2000)).
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Die
Erfinder haben vor kurzem entdeckt, dass freigesetztes AD7C-NTP-Protein
zytotoxisch war und fähig
war, Zelltod anderer Zellen im Gewebe hervorzurufen (im Vergleich
zu hochreguliertem AD7C-NTP, das in der sterbenden Zelle selbst
produziert wird), wie in der anhängigen
US-Patentanmeldung mit dem Titel „Methods of Treating Tumors
and Related Conditions Using Neural Thread Proteins" offenbart ist.
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Dementsprechend
wäre es
wünschenswert,
Zelltod und Gewebenekrose im Zusammenhang mit Neuralen Thread Proteinen,
besonders im AD-Gehirn, vorzubeugen, zu hemmen, zu modulieren oder
zu bessern.
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Vor
kurzem ist auch entdeckt worden, dass Segmente von NTP in Bindungsassays,
bei der Reinigung von NTP und als diagnostische Mittel als Ersatz
für NTP
verwendet werden könnten,
die in der anhängigen US-Patentanmeldung
Nr. 09/697,590 mit dem Titel „Preferred
Segments of Neural Thread Protein and Methods of Using the Same" offenbart ist.
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Die
vorstehende Beschreibung des verwandten Fachbereichs soll in keiner
Weise als Zugeständnis gedacht
sein, das irgendwelche der hierin beschriebenen Dokumente einschließlich der
anhängigen
US-Patentanmeldungen Stand der Technik für die vorliegende Erfindung
darstellen.
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ZUSAMMENFASSUNG
DER ERFINDUNG
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Es
besteht ein Bedarf, ein Verfahren zur Vorbeugung, Hemmung, Modulierung
und/oder Besserung von Zelltod und Gewebenekrose zu entwickeln.
Im Besonderen besteht ein Bedarf, ein Verfahren zu entwickeln, das
in der Lage ist, Zelltod und/oder Gewebenekrose im Gehirn vorzubeugen,
zu hemmen und/oder zu bessern. Es besteht außerdem ein Bedarf, ein Verfahren
zur Behandlung von Zuständen,
die mit Zelltod und/oder Gewebenekrose verbunden sind, zu entwickeln.
Es besteht auch ein Bedarf, ein Verfahren zur Behandlung neurodegenerativer
Erkrankungen wie beispielsweise AD durch Vorbeugung, Hemmung und/oder Besserung
von Zelltod und/oder Gewebenekrose im Hirngewebe lebender Säuger zu
entwickeln. Es besteht auch ein Bedarf, ein Verfahren zur Kontrolle,
Hemmung, Modulierung oder Besserung von Zelltod und Gewebenekrose
in lebendem Gewebe zu entwickeln durch NTP, welches verabreicht
wird, um schädliches
oder unerwünschtes
Gewebe oder zelluläre
Elemente wie beispielsweise gutartige oder bösartige Tumore in Menschen
zu entfernen oder zu zerstören.
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Es
ist daher ein Merkmal einer Ausführungsform
der Erfindung, die Verwendung wenigstens eines Segments von NTP
zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung von und/oder
die Vorbeugung und/oder Hemmung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder
Gewebenekrose im Hirngewebe lebender Säuger verbunden sind, bereitzustellen,
wobei die Zusammensetzung ferner eine Komponente umfasst, welche
es ermöglicht,
dass das NTP-Segment durch die Blut-Hirn-Schranke gelangt. Dadurch
wird ein Verfahren zur Vorbeugung, Hemmung und/oder Besserung von
Zelltod und/oder Gewebenekrose ermöglicht. Das Verfahren schließt das Inkontaktbringen
des lebenden Gewebes mit wenigstens einem Segment von NTP (oder
einem Homologon, Derivat, einer Variante oder einem Mimetikum davon)
ein, wobei das Segment in einer Menge vorliegt, die ausreichend
ist, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen, zu hemmen, zu
vermindern, zu kontrollieren und/oder zu bessern.
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Ein
Verfahren zur Vorbeugung, Hemmung und/oder Besserung von Zelltod
und/oder Gewebenekrose im Hirngewebe lebender Säuger durch Inkontaktbringen
des lebenden Säugerhirngewebes
mit einer Komponente, die wenigstens ein Segment von NTP (oder ein
Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) enthält, das
in einer ausreichenden Menge vorliegt, um Zelltod und/oder Gewebenekrose
vorzubeugen, zu hemmen und/oder zu bessern, wird ebenfalls ermöglicht.
Die Komponente ist in der Lage, durch die Blut-Hirn-Schranke zu
gelangen.
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Gemäß einem
anderen Merkmal einer Ausführungsform
der Erfindung wird die Verwendung einer Komponente, welche wenigstens
ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante
oder ein Mimetikum davon) enthält,
zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung neurodegenerativer
Erkrankungen bereitgestellt. Die Komponente ist in der Lage, durch
die Blut-Hirn-Schranke zu gelangen.
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Ein
Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder
Gewebenekrose verbunden sind, wird ebenfalls ermöglicht, welches das Inkontaktbringen
von lebendem Gewebe mit wenigstens einem Segment von NTP (oder einem
Homologon, Derivat, einer Variante oder einem Mimetikum davon) umfasst. Das
Segment von NTP liegt in einer ausreichenden Menge vor, um Zelltod
und/oder Gewebenekrose vorzubeugen und/oder zu hemmen. Gemäß diesem
Verfahren wird wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon,
Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) einem Säuger verabreicht,
der einen Zustand aufweist, der mit Zelltod und/oder Gewebenekrose
verbunden ist, und zwar in einer Menge, die ausreichend ist, um
Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen und/oder zu hemmen.
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Gemäß einem
anderen Merkmal einer Ausführungsform
der Erfindung wird eine Zusammensetzung bereitgestellt, die wenigstens
ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante
oder ein Mimetikum davon) und eine Komponente, welche es ermöglicht,
dass das Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante
oder ein Mimetikum davon) durch die Blut-Hirn-Schranke gelangt, umfasst.
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Ein
Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder
Gewebenekrose verbunden sind, wird ebenfalls ermöglicht, welches die Verabreichung
eines Gens bei einem Säuger,
der dieses benötigt, umfasst,
wodurch das Gen wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon,
Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) exprimiert und
wobei die Verabreichung dazu führt,
dass das Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante
oder ein Mimetikum davon) mit lebendem Gewebe in Kontakt kommt. Das
Gen wird auf eine solche Weise verabreicht, dass das Segment von
NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum
davon) in einer ausreichenden Menge vorliegt, um Zelltod und/oder
Gewebenekrose vorzubeugen und/oder zu hemmen.
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Ein
Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder
Gewebenekrose verbunden sind, wird ebenfalls ermöglicht, welches die Verabreichung
eines Vakzins bei einem Säuger,
der dieses benötigt,
umfasst, wobei das Vakzin den Säuger
dazu anregt, wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon,
Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon) zu exprimieren
oder auf andere Weise zu produzieren und wobei die Verabreichung
dazu führt,
dass das wenigstens eine Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat,
eine Variante oder ein Mimetikum davon) mit lebendem Gewebe in Kontakt
kommt. Das Vakzin wird auf eine solche Weise verabreicht, dass das
wenigstens eine Segment von NTP (oder einem Homologon, Derivat,
eine Variante oder ein Mimetikum davon) in einer Menge vorliegt,
die ausreicht, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen und/oder
zu hemmen.
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Ein
Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder
Gewebenekrose verbunden sind, wird ebenfalls ermöglicht, welches das Einbringen
oder Verabreichen oder Implantieren von Zellen, Bakterien oder Viren,
die dazu in der Lage sind, in vivo wenigstens ein Segment von NTP
(oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum davon)
zu exprimieren bei einem Säuger,
der eine solche Behandlung benötigt,
umfasst, wobei die Zellen, Bakterien oder Viren wenigstens ein Segment
von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine Variante oder ein Mimetikum
davon) exprimieren, und wobei die Verabreichung dazu führt, dass
wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat, eine
Variante oder ein Mimetikum davon) mit lebendem Gewebe in Kontakt
kommt. Die Zellen, Bakterien oder Viren werden auf eine solche Weise
eingebracht, verabreicht oder implantiert und in einer solchen Menge,
dass wenigstens ein Segment von NTP (oder ein Homologon, Derivat,
eine Variante oder ein Mimetikum davon) in einer ausreichenden Menge vorliegt,
um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen, zu hemmen und/oder
zu bessern.
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Diese
und andere Merkmale der Erfindung werden für einen Fachmann beim Lesen
der folgenden ausführlichen
Beschreibung klar ersichtlich. Selbstverständlich stellen die ausführliche
Beschreibung und die speziellen Beispiele jedoch nur bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung dar und dienen nur der Veranschaulichung.
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KURZE BESCHREIBUNG
DER ZEICHNUNGEN
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1 zeigt
die vollständige
AD7C-NTP-Sequenz und die Position der Harlil-Sequenzen innerhalb der vollständigen AD7C-NTP-Sequenz
(de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol., 55: 1038–1050 (1996)).
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2 zeigt
die vollständigen
Aminosäuresequenzen
des Neural Thread Proteins mit 122 Aminosäuren (Sequenz 40 aus US-Patent
Nr. 5,948,634; NCBI Entrez-Protein
Accession #AAE25447).
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3 zeigt
die vollständigen
Aminosäuresequenzen
des Neural Thread Proteins mit 112 Aminosäuren (NCBI Entrez-Protein Accession
#XP_032307).
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4 zeigt
das in NCBI Entrez-Protein Accession #AAH14951 PID g15928971 aufgeführte Neural Thread
Protein mit 106 Aminosäuren.
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5 zeigt
das in NCBI Entrez-Protein Accession #XP_039102, PID g18599339 aufgeführte Neural Thread
Protein mit 106 Aminosäuren.
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6 zeigt
die vollständigen
Aminosäuresequenzen
des Neural Thread Proteins mit 98 Aminosäuren (Sequenz 30 aus US-Patent
Nr. 5,830,670; NCBI Entrez-Protein Accession #AAE13612).
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7 zeigt
die vollständigen
Aminosäuresequenzen
des Neural Thread Proteins mit 75 Aminosäuren (Sequenz 48 aus US-Patent
Nr. 5,948,634; NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25448).
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8 zeigt
die vollständigen
Aminosäuresequenzen
des Neural Thread Proteins mit 68 Aminosäuren (Sequenz 36 aus US-Patent
Nr. 5,948,634; NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25446).
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9 zeigt
die vollständigen
Aminosäuresequenzen
des Neural Thread Protein-artigen
Proteins mit 61 Aminosäuren
(NCBI Entrez-Protein Accession #AAH02534).
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AUSFÜHRLICHE
BESCHREIBUNG BEVORZUGTER AUSFÜHRUNGSFORMEN
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Die
Bezeichnung „AD7C-NTP" bezeichnet das ~41
kD-Protein und das Gen und die Nukleinsäuresequenzen, welche dieses
kodieren, die in de la Monte et al., J. Clin. Invest., 100: 3093–104 (1997),
in den Sequenzen 120 und 121 der US-Patente Nr. 5,948,634; 5,948,888
und 5,830,670 und in NCBI Entrez-Protein Database Accession #AF010144
beschrieben sind.
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In
dieser Beschreibung betrifft die Bezeichnung „NTP" oder „Neural Thread Protein" Neural Thread Proteine
und verwandte Moleküle
(einschließlich
Pankreas-Thread Proteine) und die Nukleinsäuresequenzen, welche diese
Proteine kodieren, und sie schließt die folgenden Proteine und
die Nukleinsäuren,
welche die Aminosäurensequenzen
für diese
Proteine kodieren, ein (ist jedoch nicht darauf begrenzt):
- (a) AD7C-NTP;
- (b) die ~42, ~26, ~21, ~17, ~14, und ~18 kD-Spezies des Neural
Thread Proteins wie in US-Patent Nr. 5,948,634; 5,948,888; 5,830,670
und 6,071,705 und in de la Monte et al., J. Neuropathol. Exp. Neurol.,
55 (10): 1038–50
(1996), de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 138(1–2): 26–35 (1996);
de la Monte et al., J. Neurol. Sci., 135(2): 118–25 (1996), de la Monte et
al., J. Clin. Invest., 100: 3093–3104 (1997) und de la Monte et
al., Alz. Rep. 2: 327–332
(1999) beschrieben;
- (c) Proteine, die spezifisch durch den monoklonalen Antikörper #2,
der bei der American Type Culture Collection, Manassas, Va., unter
der Accession-Nummer HB-12546 hinterlegt ist, oder den monoklonalen
Antikörper
#5, der bei der American Type Culture Collection, Manassas, Va.,
unter der Accession-Nummer HB-12545 hinterlegt ist, erkannt werden;
- (d) Proteine, die durch das AD7C-NTP-Gen kodiert werden;
- (e) das Neural Thread Protein mit 122 Aminosäuren, das in Sequenz 40 der
US-Patente 5,830,670; 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben ist und
in NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25447, PID g10048540 aufgeführt ist,
dessen Aminosäurensequenz
in 2 veranschaulicht ist;
- (f) das Neural Thread Protein mit 112 Aminosäuren, das in NCBI Entrez-Protein
Accession #XP_032307, PID g14725132 aufgeführt ist, dessen Aminosäuresequenz
in 3 veranschaulicht ist;
- (g) ein Neural Thread Protein-artiges Protein mit 106 Aminosäuren, das
in NCBI Entrez-Protein Accession #AAH14951 PID g15928971 aufgeführt ist,
dessen Aminosäuresequenz
in 4 veranschaulicht ist;
- (h) ein Neural Thread Protein-artiges Protein mit 106 Aminosäuren, das
in NCBI Entrez-Protein Accession #XP 039102, PID g18599339 aufgeführt ist,
dessen Aminosäuresequenz
in 5 veranschaulicht ist;
- (i) das Neural Thread Protein mit 98 Aminosäuren, das in Sequenz 30 der
US-Patente Nr. 5,830,670; 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben ist
und in NCBI Entrez-Protein Accession #AAE13612, PID g10048538 aufgeführt ist,
dessen Aminosäuresequenz
in 6 veranschaulicht ist;
- (j) das Neural Thread Protein mit 75 Aminosäuren, das in Sequenz 48 der
US-Patente Nr. 5,830,670; 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben ist
und in NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25448, PID g10048541 aufgeführt ist,
dessen Aminosäuresequenz
in 7 veranschaulicht ist;
- (k) das Neural Thread Protein mit 68 Aminosäuren, das in Sequenz 36 der
US-Patente Nr. 5,830,670; 5,948,634 und 5,948,888 beschrieben ist
und in NCBI Entrez-Protein Accession #AAE25446, PID g10048539 aufgeführt ist,
dessen Aminosäuresequenz
in 8 veranschaulicht ist;
- (l) das Neural Thread Protein-artige Protein mit 61 Aminosäuren, dass
in NCBI Entrez-Protein Accession #AAH02534, PID g12803421 aufgeführt ist,
dessen Aminosäuresequenz
in 9 veranschaulicht ist;
- (m) Pankreas-Thread Protein;
- (n) das neurale Pankreas Thread Protein (nPTP), welches in US-Patent Nr.
6,071,705 beschrieben ist;
- (o) Proteine, die spezifisch durch die Antikörper erkannt werden, die von
einem Hybridom aus der Gruppe bestehend aus HB 9934, HB 9935 und
HB 9936, welche bei der American Type Culture Collection hinterlegt sind,
produziert werden.
-
Die
Bezeichnung „NTP" schließt auch
NTP ein, welches aus Säugergewebe
gewonnen ist oder unter Verwendung rekombinanter Techniken produziert
wurde und sie schließt
Fragmente, Varianten, Derivate und Homologe von NTP ein.
-
Hierin
beschriebene Aminosäuren
und Aminosäurereste
können
gemäß dem in
der folgenden Tabelle bereitgestellten anerkannten Ein- oder Drei-Buchstabencode
bezeichnet werden. Wenn nicht anders angegeben, liegen diese Aminosäuren oder
Reste in der natürlich
auftretenden Form des L-Stereoisomers vor.
-
-
Wie
hierin verwendet betrifft die Bezeichnung „Harlil-Sequenz" oder „Harlil-Peptid" ein biologisch aktives
Peptid, welches eine oder mehrere der folgenden Sequenzen umfasst
oder enthält:
- 1. THARLIL; HHARLCL; MFARLIL; HHARLIF, wie
in 1 beschrieben;
- 2. HHARL; HARL; HARLI; HARLIL; HHARLCL; ARLIL; HHARLIF; THARLIL;
ARLI; ARL; HARLCL; ARLCL; ARCL; MFARLIL; FARLIL; FARLI; FARL; HARLIF;
und ARLIF;
- 3. LHARLCLANFCGRNRV („NTP-1");
- 4. LARLCLANFCGNNNV („NTP-2");
- 5. CARYRTGHHARLM („NTP-3");
- 6. HHARLPLANFCG („NTP-4");
- 7. RTGHHARLCLANFC („NTP-5");
- 8. CESARYRTGHHARLC („NTP-6");
- 9. DNTHHARLIL („NTP-7");
- 10. SHHARLIL („NTP-8"); und
- 11. HARLML; HARLVL; und HAKLIL
-
Wie
hierin verwendet schließt
die Bezeichnung „Harlil-Sequenz" oder „Harlil-Peptid" auch biologisch aktive
Varianten, Homologe, Derivate und Peptidmimetika von Harlil-Sequenzen
oder Harlil-Peptiden ein und sie schließt biologisch aktive Peptide
ein, welche die Sequenz beliebiger der in den Unterpunkten 1–11 aufgeführten Sequenzen
mit zusätzlichen
Aminosäureresten
vor oder nach der Harlil-Sequenz an Linkerpeptiden enthalten.
-
Wie
hierin verwendet betrifft die Bezeichnung „Segment von NTP" ein biologisch aktives
Fragment einer Spezies von NTP, bevorzugt AD7C-NTP, und schließt speziell
Harlil-Sequenzen und Harlil-Peptide ein (ist jedoch nicht darauf
begrenzt).
-
Die
Bezeichnung „biologisch
aktiv" betrifft
ein Protein, Peptid, Harlil-Peptid oder Segment von NTP, welches
die Fähigkeit
besitzt, an NTP oder andere Moleküle zu binden.
-
Die
Bezeichnung „Fragment" betrifft ein Protein
oder Polypeptid, das aus einer durchgehenden Untersequenz der Aminosäuresequenz
eines NTP-Proteins oder eines Segments von NTP besteht, und schließt natürlich auftretende
Fragmente wie beispielsweise Splice-Varianten und Fragmente, die
von natürlich
auftretender in vivo-Proteaseaktivität herrühren, ein. Ein solches Fragment
kann am Aminoterminus, Carboxyterminus und/oder internal abgeschnitten
sein (wie beispielsweise durch natürliches Splicing). Solche Fragmente
können
mit oder ohne aminoterminales Methionin hergestellt werden. Die
Bezeichnung „Fragment" schließt Fragmente
ein, ob identisch oder unterschiedlich, von dem selben NTP-Protein
oder Segment von NTP, die eine gemeinsame durchgängige Aminosäuresequenz
aufweisen können
oder nicht, entweder direkt oder durch einen Linker aneinander gebunden.
-
Die
Bezeichnung „Variante" betrifft ein Protein
oder Polypeptid, in welchem ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen,
Deletionen und/oder Insertionen verglichen mit der Aminosäuresequenz
eines NTP-Proteins oder Segments von NTP vorliegen und sie schließt natürlich auftretende
allelische Varianten oder alternative Splicingvarianten eines NTP-Proteins
oder Segments von NTP ein. Die Bezeichnung „Variante" schließt das Ersetzen einer oder
mehrerer Aminosäuren
in einer Peptidsequenz durch eine ähnliche oder homologe Aminosäure(n) oder
unähnliche
Aminosäure(n)
ein. Es gibt viele Einstufungen, nach denen Aminosäuren als ähnlich oder
homolog eingestuft werden können
(Gunnar von Heijne, Sequence Analysis in Molecular Biology, S. 123–39 (Academic
Press, New York, NY 1987). Bevorzugte Varianten beinhalten Alanin-Substitutionen
an einer oder mehreren Aminosäurepositionen.
Andere bevorzugte Substitutionen schließen konservative Substitutionen
ein, die eine geringe oder keine Auswirkung auf die Nettogesamtladung,
Polarität
oder Hydrophobizität
des Proteins aufweisen. Konservative Substitutionen sind in der
folgenden Tabelle 2 aufgelistet. TABELLE
2
| Konservative
Aminosäuresubstitutionen |
Basisch: | Arginin
Lysin Histidin |
Sauer: | Glutaminsäure Asparaginsäure |
Ungeladen
polar: | Glutamin
Asparagin Serin Threonin Tyrosin |
Nicht-polar: | Phenylalanin
Tryptophan Cystein Glyzin Alanin Valin Prolin Methionin Leucin Isoleucin |
-
Tabelle
3 legt ein weiteres Schema der Aminosäuresubstitution dar: TABELLE
3
Ursprünglicher
Rest | Substitutionen |
Ala | gly;
ser |
Arg | lys |
Asn | gln;
his |
Asp | glu |
Cys | ser |
Gln | asn |
Glu | asp |
Gly | ala;
pro |
His | asn;
gln |
Ile | leu;
val |
Leu | ile;
val |
Lys | arg;
gln; glu |
Met | leu;
tyr; ile |
Phe | met;
leu; tyr |
Ser | thr |
Thr | ser |
Trp | tyr |
Tyr | trp;
phe |
Val | ile;
leu |
-
Andere
Varianten können
aus weniger konservativen Aminosäuresubstitutionen
bestehen, wie beispielsweise die Auswahl von Resten, welche sich
deutlicher unterscheiden in ihrer Auswirkung auf den Erhalt (a)
der Struktur des Polypeptidrückgrats
im Bereich der Substitution, beispielsweise als Blatt- oder Helixkonformation,
(b) der Ladung oder Hydrophobizität des Moleküls an der Zielstelle oder (c)
den Raumanspruch der Seitenkette. Die Substitutionen, bei denen
im Allgemeinen davon auszugehen ist, dass sie eine deutlichere Auswirkung
auf die Funktion haben, sind solche, in denen (a) Glyzin und/oder
Prolin durch eine andere Aminosäure
substituiert wird oder deletiert oder insertiert wird; (b) ein hydrophiler
Rest, z.B. Seryl oder Threonyl durch (oder mit) einem hydrophoben
Rest, z.B. Leuzyl, Isoleuzyl, Phenylalanyl, Valyl oder Alanyl substituiert wird;
(c) ein Cysteinrest durch (oder mit) einem beliebigen anderen Rest
substituiert wird; (d) ein Rest mit einer elektropositiven Seitenkette,
z.B. Lysyl, Arginyl oder Histidyl durch (oder mit) einem Rest substituiert
wird, der eine elektronegative Ladung trägt, z.B. Glutamyl oder Aspartyl;
oder (e) ein Rest mit einer sperrigen Seitenkette, z.B. Phenylalanin
durch (oder mit) einem Rest substituiert wird, der keine solche
Seitenkette aufweist, z.B. Glyzin. Andere Varianten beinhalten solche,
die konzipiert sind, um entweder eine neue Glykosylierungs- und/oder
Phosphorylierungsstelle(n) zu erzeugen oder solche, die konzipiert
sind, um eine bestehende Glykosylierungs- und/oder Phosphorylierungsstelle(n)
zu deletieren. Varianten schließen
wenigstens eine Aminosäuresubstitution
an einer Glykosylierunsstelle, einer proteolytischen Spaltungsstelle
und/oder einem Cysteinrest ein. Varianten schließen auch NTP-Proteine oder Segmente
von NTP mit zusätzlichen
Aminosäureresten vor
oder nach der Aminosäuresequenz
des NTP oder des Segments von NTP an Linkerpeptiden ein. Beispielsweise
kann ein Cysteinrest sowohl an den Amino- als auch Carboxyenden
eines Segments von NTP hinzugefügt
werden, um die Zyklisierung des Segments von NTP durch die Bildung
einer Disulfidbindung zu ermöglichen.
Die Bezeichnung „Variante" umfasst auch Polypeptide,
welche die Aminosäuresequenz
eines Harlil-Peptids mit wenigstens einer und bis zu 25 zusätzlichen
Aminosäuren,
welche entweder das 3'-
oder das 5'-Ende des
Harlil-Peptids flankieren, aufweisen.
-
Die
Bezeichnung „Derivat" betrifft ein chemisch
modifiziertes Protein oder Polypeptid, das chemisch entweder durch
natürliche
Prozesse wie beispielsweise Prozessierung und andere posttranslationale
Modifikationen, aber auch durch chemische Modifikationstechniken
wie beispielsweise durch Hinzufügen
eines oder mehrerer Polyethylenglykol-Moleküle, Zucker, Phosphate und/oder
andere solche Moleküle
modifiziert worden ist, wobei das Molekül oder die Moleküle nicht
natürlich
an Wildtyp-NTP-Proteine oder Segmente angebunden sind. Derivate
schließen
Salze ein. Solche chemischen Modifikationen sind in Basistexten
und in ausführlicheren
Monographien sowie in umfangreicher Forschungsliteratur gut beschrieben
und sie sind dem Fachmann gut bekannt. Selbstverständlich kann
dieselbe Art der Modifikation in gleichem oder unterschiedlichem
Ausmaß an
verschiedenen Stellen in einem bestimmten Protein oder Polypeptid
vorliegen. Ein bestimmtes Protein oder Polypeptid kann auch viele
Arten von Modifikationen enthalten. Modifikationen können an
beliebiger Stelle in einem Protein oder Polypeptid auftreten, einschließlich dem
Peptidrückgrat,
den Aminosäureseitenketten und
den Amino- oder Carboxyenden. Modifikationen schließen beispielsweise
Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente
Anbindung von Flavin, kovalente Anbindung einer Hämgruppe,
kovalente Anbindung eines Nukleotids oder Nukleotidderivats, kovalente
Anbindung eines Lipids oder Lipidderivats, kovalente Anbindung von
Phosphatidylinositol, Quervernetzen, Zyklisierung, Disulfidbindungsbildung, Demethylierung,
Bildung kovalenter Quervernetzungen, Bildung von Cystein, Bildung
von Pyroglutamat, Formylierung, Gamma-Carboxylierung, Glykosilierung,
GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristolyierung,
Oxidation, proteolytische Prozessierung, Phosphorilierung, Prenylierung,
Racemisierung, Glykosilierung; Lipidanbindung, Sulphatierung, Gamma-Carboxylierung
von Glutaminsäureresten,
Hydroxylierung und ADP-Ribosylierung, Selenoylierung, Sulfatierung,
Transfer-RNA-vermittelte
Addition von Aminosäuren
an Proteine wie beispielsweise Argininylierung und Ubiquinierung
ein. Siehe beispielsweise Proteins – Structure And Molecular Properties,
zweite Ausgabe, T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New
York (1993) und Wold, F., „Posttranslational
Protein Modifications: Perspectives and Prospects", Seiten 1–12 in Posttranslational
Covalent Modification Of Proteins, B. C. Johnson, Hrsg., Academic
Press, New York (1983); Seifter et al., Meth. Enzymol. 182: 626–646 (1990)
und Rattan et al., „Protein
Synthesis: Posttranslational Modifications and Aging", Ann. N.Y. Acad.
Sci. 663: 48–62
(1992). Die Bezeichnung „Derivate" schließt chemische
Modifikationen ein, die dazu führen,
dass das Protein oder Polypeptid zu einem verzweigten oder zyklischen
Protein oder Polypeptid mit oder ohne Verzweigung wird. Zyklische,
verzweigte und verzweigte zirkuläre
Proteine oder Polypeptide können
von posttranslationalen natürlichen
Prozessen herrühren,
oder sie können
ebenso durch völlig
synthetische Verfahren erzeugt werden.
-
Die
Bezeichnung „Homologon" betrifft ein Protein,
das in seiner Aminosäuresequenz
zu wenigstens 75% zu einem NTP-Protein, AD7C-NTP bzw. einem Segment
von NTP identisch ist, wie mittels Standardverfahren bestimmt, die üblicherweise
verwendet werden, um die Ähnlichkeit
der Position der Aminosäuren
zweier Polypeptide zu vergleichen. Das Ausmaß der Ähnlichkeit oder Identität zwischen
zwei Proteinen kann durch bekannte Verfahren leicht berechnet werden,
einschließlich,
aber nicht begrenzt auf solche Verfahren, die beschrieben sind in
Computational Molecular Biology, Lesk, A. M. Hrsg., Oxford University
Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects,
Smith, D. W., Hrsg., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis
of Sequence Data, Teil I, Griffin, A. M. und Griffin, H. G., Hrsg.
Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology,
von Heinje, G., Academic Press, 1987; Sequence Analysis Primer,
Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg. M Stockton Press, New York,
1991; und Carillo H. und Lipman, D., SIAM, J. Applied Math., 48:
1073 (1988). Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung der Identität sind konzipiert um
die größte Übereinstimmung
zwischen den getesteten Sequenzen zu erhalten. Verfahren zur Bestimmung der
Identität
und Ähnlichkeit
sind in öffentlich
zugänglichen
Computerprogrammen festgeschrieben.
-
Bevorzugte
Computerprogrammverfahren, die zur Bestimmung der Identität und Ähnlichkeit
zwischen zwei Sequenzen nützlich
sind, beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf das GCG-Programmpaket
(Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research, 12(1): 387 (1984)),
BLASTP, BLASTN und FASTA, Atschul, S. F. et al., J. Molec. Biol.,
215: 403–410
(1990). Das BLAST X-Programm ist von NCBI und anderen Bezugsquellen öffentlich
zugängig
(BLAST Manual, Atschul, S. et al., NCBI NLM NIH Bethesda, Md. 20894;
Altschul, S. et al., J. Mol. Bol., 215: 403–410 (1990). Beispielsweise
werden unter Verwendung eines Computeralgorithmus wie beispielsweise
GAP (Genetic Computer Group, University of Wisconsin, Madison, Wis.)
die beiden Proteine oder Polypeptide, für welche die prozentuale Sequenzidentität bestimmt
werden soll, für
eine optimale Übereinstimmung
ihrer entsprechenden Aminosäuren
angeordnet (der „übereinstimmende
Bereich" wird mit
dem Algorithmus ermittelt).
-
Eine
Gap Opening Penalty (die als das 3-fache der durchschnittlichen
Diagonale berechnet wird); die „durchschnittliche Diagonale" ist der Durchschnitt
der Diagonale der verwendeten Vergleichsmatrix; die „Diagonale" ist der Wert oder
die Zahl, die jeder perfekten Aminosäure durch die bestimmte Vergleichsmatrix
zugeordnet wird) und eine Gap Extension Penalty (welche üblicherweise
1/10 der Gap Opening Penalty beträgt) sowie eine Vergleichsmatrix
wie beispielsweise PAM250 oder BLOSUM 62 werden in Verbindung mit
dem Algorithmus verwendet. Eine Standardvergleichsmatrix (siehe
Dayhoff et al. in: Atlas of Protein Sequence and Structure, Band
5, Anhang 3 [1978] für
die PAM250-Vergleichsmatrix; siehe Henikoff et al., Proc. Natl.
Acad. Sci USA, 89: 10915–10919
[1992] für
die BLOSUM 62-Vergleichsmatrix)
kann ebenfalls durch den Algorithmus verwendet werden. Die prozentuale
Identität
wird dann durch den Algorithmus berechnet. Homologe werden typischerweise
ein oder mehrere Aminosäuresubstitutionen,
Deletionen und/oder Insertionen im Vergleich zu NTP, AD7C-NTP, einem
Segment von NTP oder der Harlil-Sequenz aufweisen.
-
Die
Bezeichnung „Peptidmimetikum" oder „mimetisch" betrifft biologisch
aktive Verbindungen, welche die biologische Aktivität eines
Peptids oder eines Proteins nachahmen, bei denen es sich von der
chemischen Art her nicht mehr um Peptide handelt das heißt sie enthalten
keinerlei Peptidbindungen mehr (das heißt Amidbindungen zwischen Aminosäuren). Hier
wird die Bezeichnung Peptidmimetikum im weiteren Sinn verwendet, um
Moleküle
einzuschließen,
die in ihrer Natur nicht mehr vollständig peptidisch sind, wie beispielsweise
Pseudopeptide, Semipeptide und Peptoide. Beispiele für Peptidmimetika
in diesem breiteren Sinn (wenn ein Teil eines Peptids durch eine
Struktur ohne Peptidbindungen ersetzt wird) werden im Folgenden
beschrieben. Erfindungsgemäße Peptidmimetika
stellen, ob teilweise oder vollständig nicht-peptidisch, eine räumliche Anordnung reaktiver
chemischer Gruppen dar, die der dreidimensionalen Anordnung aktiver
Gruppen in dem Antikörper,
Antikörperderivat oder
Antikörperfragment,
auf dem das Peptidmimetikum beruht, stark ähneln. Als Ergebnis dieser ähnlichen
Geometrie der aktiven Stellen weist das Peptidmimetikum Auswirkungen
auf biologische Systeme auf, die zu der biologischen Aktivität des Peptids ähnlich sind.
-
Die
erfindungsgemäßen Peptidmimetika
sind vorzugsweise sowohl in ihrer dreidimensionalen Form als auch
ihrer biologischen Aktivität
im Wesentlichen ähnlich
zu den hierin beschriebenen Segmenten von NTP. Beispiele für Verfahren
zur strukturellen Modifikation eines Peptids, die im Fachbereich
bekannt sind, um ein Peptidmimetikum zu erzeugen, schließen die
Inversion chiraler Zentren des Rückgrats
ein, was zu D-Aminosäurereststrukturen
führt,
die insbesondere am N-Terminus
zu einer erhöhten
Stabilität
gegenüber
proteolytischem Abbau führt,
ohne dass die Aktivität
beeinträchtigt
wird. Ein Beispiel ist in der Veröffentlichung „Tritriated
D-ala1-Peptide T Binding", Smith C. S. et al., Drug Development
Res., 15, S. 371–379
(1988) angegeben. Ein zweites Verfahren ist die Veränderung
der zyklischen Struktur für
die Stabilität,
wie beispielsweise N zu C Interkettenimide und Laktame (Ede et al.,
in Smith and Revier (Hrsg.) „Peptides:
Chemistry and Biology", Escom,
Leiden (1991), S. 268–270).
Ein Beispiel hierfür
sind Thymopentin-artige Verbindungen mit festgelegter Konformation
wie beispielsweise solche, die in US-Patent Nr. 4,457,489 (1985), Goldstein,
G. of al. offenbart sind.
-
Ein
drittes Verfahren besteht darin, Peptidbindungen in den Segmenten
von NTP durch Pseudopeptidbindungen zu ersetzen, welche Resistenz
gegenüber
Proteolyse verleihen.
-
Es
sind mehrere Pseudopeptidbindungen beschrieben worden, die im Allgemeinen
die Peptidstruktur und die biologische Aktivität nicht beeinträchtigen.
Ein Beispiel für
diesen Ansatz stellt die Substitution retroinverser Pseudopeptidbindungen
dar („Biologically
active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto A. et al. in Rivier, J. E.,
und Marshall, G. R. (Hrsg.) „Peptides,
Chemistry, Structure and Biology",
Escom, Leiden (1990), S. 722–773)
und Dalpozzo, et al. (1993), Int. J. Peptide Protein Res., 41: 561–566). Gemäß dieser
Modifikation können
die Aminosäuresequenzen
der Peptide identisch zu den oben beschriebenen Sequenzen eines
Segments von NTP sein, mit der Ausnahme, dass ein oder mehrere der
Peptidbindungen durch eine retroinverso Pseudopeptidbindung ersetzt
sind. Bevorzugt wird die Peptidbindung, die am nähsten zu dem N-Terminus gelegen
ist, substituiert, da eine solche Substitution Resistenz gegen Proteolyse
durch Exopeptidasen, die am N-Terminus wirken, verleiht. Weitere
Modifikationen können
auch durchgeführt
werden durch Ersetzen chemischer Gruppen der Aminosäuren mit
anderen chemischen Gruppen mit ähnlicher
Struktur. Eine weitere geeignete Pseudopeptidbindung, die dafür bekannt
ist, die Stabilität
gegenüber
enzymatischer Spaltung zu erhöhen, ohne
oder nur mit geringem Verlust an biologischer Aktivität, ist die
reduzierte isostere Pseudopeptidbindung (Couder, et al. (1993),
Int. J. Peptide Protein Res., 41: 181–184).
-
Die
Aminosäuresequenzen
dieser Peptide können
somit identisch zu den Sequenzen eines Segments von NTP oder der
Harlil-Sequenz sein, mit der Ausnahme, dass ein oder mehrere der
Peptidbindungen durch eine isostere Pseudopeptidbindung ersetzt
sind. Bevorzugt wird die Peptidbindung, die dem N-Terminus am nächsten liegt,
substituiert, da eine solche Substitution Resistenz gegenüber Proteolyse
durch Exopeptidasen, die am N-Terminus wirken, verleiht. Die Synthese
von Peptiden mit einer oder mehreren reduzierten isosteren Pseudopeptidbindungen
ist im Fachbereich bekannt (Couder, et al. (1993), oben zitiert).
Andere Beispiele beinhalten die Einfügung von Ketomethylen- oder
Methylsulfidbindungen, um Peptidbindungen zu ersetzen.
-
Peptoidderivate
von Segmenten von NTP oder der Harlil-Sequenz stellen eine weitere
Klasse von Peptidmimetika dar, die wichtige strukturelle Determinanten
für die
biologische Aktivität
beibehalten, aber dennoch die Peptidbindungen eliminieren und dadurch
Resistenz gegenüber
Proteolyse verleihen (Simon et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 89: 9367–9371).
Peptoide sind Oligomere N-substituierter Glyzine. Es sind mehrere
N-Alkyl-Gruppen beschrieben worden, die jeweils der Seitenkette
einer natürlichen
Aminosäure
entsprechen (Simon, et al. (1992), oben zitiert). Einige oder alle
der Aminosäuren
des Segments von NTP oder der Harlil-Sequenz können mit dem N-substituierten
Glyzin, das der ersetzten Aminosäure
entspricht, ersetzt werden.
-
Die
Bezeichnung „Peptidmimetikum" oder „mimetisch" beinhaltet auch
revers-D- Peptide
und Enantiomere wie im Folgenden definiert.
-
Die
Bezeichnung „revers-D-Peptid" betrifft ein biologisch
aktives Protein oder Peptid, das aus D-Aminosäuren besteht, die in umgekehrter
Richtung im Vergleich zur L-Aminosäuresequenz
eines Segments von NTP oder der Harlil-Sequenz angeordnet sind.
So wird der carboxyterminale Rest eines L-Aminosäuresegments von NTP zum Aminoterminus
für das
D-Aminosäurepeptid
usw. Beispielsweise wird das AD7C-NTP-Fragment, HARLIL, zu LdIdLdRdAdHd, wobei Ad, Hd, Id,
Ld und Rd die den
L-Aminosäuren A,
H, I, L und R entsprechenden D-Aminosäuren darstellen.
-
Die
Bezeichnung „Enantiomer" betrifft ein biologisch
aktives Protein oder Peptid, bei dem ein oder mehrere der L-Aminosäurereste
in der Aminosäuresequenz
eines Segments von NTP mit dem/den entsprechenden D-Aminosäurerest(en)
ersetzt sind.
-
In
dieser Beschreibung betrifft die Bezeichnung „neurodegenerative Erkrankung":
- 1.
pathologische Zustände,
die durch eines oder mehrere der folgenden Anzeichen charakterisiert
sind: Gehirnatrophie, Zellverlust, neurofibrilläres Gewirr, amyloider Plaque,
und/oder die Anwesenheit von NTP in Gewebe und/oder Körperflüssigkeit;
- 2. die Gruppe der Alzheimer-Erkrankungen, nämlich Alzheimer-Erkrankung
(präsenile
Demenz, senile Demenz); Alzheimer-Erkrankung verbunden mit Down-Syndrom;
familiäre
Alzheimer-Erkrankung, genetische Alzheimer-Erkrankung aufgrund von Mutationen wie
beispielsweise Presenilin 1, Presenilin 2 und anderen; Alzheimer-Erkrankung
verbunden mit anderen Erkrankungen des zentralen Nervensystems wie
beispielsweise Parkinsons-Erkrankung,
Lewy Body Disease und zerebrovaskulären Erkrankungen;
- 3. kongophile Angiopathie (verbunden oder nicht verbunden mit
Alzheimer-Erkrankung,
familiär
oder nicht familiär);
- 4. pathologische Zustände,
die durch die Ablagerung abnormaler Fibrillen gekennzeichnet sind
(„amyloide Fibrillen") und/oder verwandter,
nicht fibrillärer
Amyloidvorläufer
oder Nicht-Vorläufermolekül(e);
- 5. pathologische Zustände,
die durch die abnormale Ablagerung von Tau gekennzeichnet sind,
einschließlich
frontotemperaler Demenz, progressiver supranuklearer Palsie (PSP),
kortikobasaler ganglischer Degeneration (CBD) und Zuständen, die
Mutationen des Tau-Gens betreffen und/oder
- 6. andere Erkrankungen und Störungen, wie solche die in US-Patent
Nr. 6,001,331 offenbart sind.
-
In
dieser Beschreibung bezeichnen die Ausdrücke „amyloide Plaque" und „amyloide
Fibrillen" senile Plaque,
neuritische Plaque, amyloide Plaque, Amyloidsterne, Amyloidzentren,
primitive Plaque, klassische Plaque, Bumout-Plaque, diffuse Plaque,
Schattenplaque, neurofibrilläres
Gewirr, amyloide Fibrillen, gepaarte helikale Filamente und dergleichen.
-
In
dieser Beschreibung bezeichnet die Bezeichnung „Säuger" sämtliche
Säuger
und bevorzugt Schafe, Kühe,
Hunde, Katzen, Menschenaffen, Affen, Mäuse, Ratten und Menschen und
am meisten bevorzugt einen Menschen.
-
In
dieser Beschreibung werden die Ausdrücke „Segment von NTP", „Harlil-Sequenz" und „Harlil-Peptid" austauschbar verwendet.
Wann immer „Segment
von NTP", „Harlil-Sequenz" oder „Harlil-Peptid" verwendet wird,
so umfasst die Erfindung selbstverständlich geeignete Homologe,
Varianten, Derivate und peptidische Mimetika davon.
-
In
dieser Beschreibung bezeichnet der Ausdruck „Gewebe, welches NTP enthält" Gewebe, das das gesamte
oder einen Teil von NTP enthält,
Gewebe in zellulärer
Verbindung mit NTP, das es auf andere Weise enthalten kann oder
nicht, Gewebe, das mit NTP in Kontakt stand, aber dieses nicht mehr
in seiner ursprünglichen
Form enthält
und Gewebe, das zu irgendeinem Zeitpunkt in Kontakt mit NTP kommen
kann.
-
Die
vorliegende Erfindung ist auf Verfahren zur Vorbeugung von Zelltod
und/oder Gewebenekrose gerichtet. Obwohl NTP bekannt war und in
der Literatur beschrieben wurde, war bislang nicht bekannt, dass
NTP eine Ursache von Zelltod anderer Zellen als der NTP-produzierenden
Zellen darstellt. Ohne an irgendeine Theorie gebunden sein zu wollen,
nehmen die Erfinder an, dass das Vorhandensein von NTP in lebendem
Gewebe nicht nur ein Anzeichen von Nervenzelltod wie bisher berichtet
darstellt, sondern auch insofern toxisch ist, als es den Zelltod
anderen lebenden Gewebes hervorruft. Die Erfinder nehmen an, dass
AD7C-NTP, welches insbesondere im Hirngewebe lebender Säuger vorliegt,
ein Marker für
Alzheimer-Erkrankung
(AD) darstellt und AD verschlimmert, indem es Zelltod und/oder Gewebenekrose
in dem lebenden Gewebe, in welchem es vorliegt, hervorruft.
-
Dementsprechend
wird angenommen, dass, wenn ein Säuger an AD erkrankt, das Gen,
welches bevorzugt AD7C-NTP produziert, durch Nervenzelltod hochreguliert
wird, wodurch an dieser Stelle AD7C-NTP produziert wird. Das so
produzierte AD7C-NTP
beginnt dann, anderes lebendes Gewebe zu zerstören (z.B. andere Nervenzellen,
Glialzellen, etc.) in dessen Umgebung, wodurch das Fortschreiten
der Erkrankung verschlimmert wird. Der Erfinder nimmt daher an,
dass die Neutralisierung der Wirkung von beispielsweise AD7C-NTP
dazu beiträgt,
Zelltod und/oder Gewebenekrose in lebendem Gewebe, das beispielsweise AD7C-NTP
enthält,
vorzubeugen, zu hemmen und/oder zu bessern. Es wurde überraschenderweise
gefunden, dass Segmente von NTP das AD7C-NTP binden können und
Zelltod und/oder Gewebenekrose in lebendem Gewebe, das AD7C-NTP
enthält,
vorbeugen, hemmen und/oder bessern können.
-
NTP
ist bekannt und beispielsweise in den US-Patenten Nr. 5,948,634;
5,948,888, 5,830,670 und 6,071,705 beschrieben. Verfahren zur rekombinanten
oder anderen Herstellung von NTP sind in den vorstehenden Dokumenten
offenbart. Die Erzeugung von Antikörpern gegen NTP zur Diagnostik
von AD und anderen verbundenen Störungen und Erkrankungen ist
ebenfalls in diesen Dokumenten offenbart. Für einen Fachmann ist es offensichtlich,
dass NTP Homologe, Derivate, Mimetika und Varianten sowie NTP aus
unterschiedlichen Quellen (z.B. natürlich, pankreatisch, gereinigt,
synthetisiert oder aus anderen in vitro-Expressionssystemen, etc.) verwendet
werden können,
um die in der vorliegenden Erfindung nützlichen Segmente herzustellen.
-
Die
vorliegende Erfindung richtet sich auf die Verwendung wenigstens
eines Segments von NTP zur Herstellung einer Zusammensetzung für die Behandlung
und/oder die Vorbeugung und/oder Hemmung von Zuständen, die
mit Zelltod und/oder Gewebenekrose in lebendem Gewebe im Zusammenhang
stehen, wobei die Zusammensetzung ferner eine Komponente umfasst,
die es ermöglicht,
dass das Segment von NTP durch die Blut-Hirn-Schranke gelangt und
wobei das lebende Gewebe Säugerhirngewebe
ist. Ein Verfahren zur Vorbeugung und/oder Hemmung von Zelltod und/oder
Gewebenekrose schließt
das Inkontaktbringen von lebendem Gewebe mit wenigstens einem Segment
von NTP ein, wobei das Segment in einer Menge vorliegt, die ausreichend
ist, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen und/oder zu hemmen.
Das Segment von NTP ist bevorzugt eine Untersequenz von AD7C-NTP
und am meisten bevorzugt enthält
es wenigstens eine der folgenden Repeatsequenzen von AD7C-NTP:
(a)
45–51 | THARLIL |
(b)
90–96 | HHARLCL |
(c)
263–269 | MFARLIL |
(d)
291–297 | HHARLIF |
Siehe
1.
-
Die
Erfindung umfasst Peptide, welche die Sequenz irgendeiner der Regionen
(a), (b), (c), (d) aufweisen oder Homologe, Derivate, Varianten
und Mimetika von diesen (einschließlich, aber nicht begrenzt
auf „H A
R L M L"). Die Harlil-Peptide
können
auch zusätzliche
Aminosäurereste
vor oder nach der Harlil-Sequenz an Linkerpeptiden aufweisen. Die
zusätzlichen
Aminosäurereste
oder Linkerpeptide können
solche sein, die in der NTP-Sequenz vor und nach der Harlil-Sequenz
auftreten. Beispielsweise treten die Aminosäurereste G I T G M C T vor
Rest 46 auf und die Aminosäurereste
Y F F L V treten nach Aminosäure
51 in der NTP-Sequenz auf. Somit kann ein Harlil-Peptid, das als
Segment von NTP in der vorliegenden Erfindung nützlich ist, das NTP-Peptid
G I T G M C T N A R L I L Y F F L V enthalten. Für die in (b), (c) und (d) aufgeführten Harlil-Peptide sind
die zusätzlichen
Aminosäurereste
bevorzugt diejenigen, welche die Harlil-Sequenz in der NTP-Sequenz flankieren.
Bevorzugt übersteigt
die Länge
der Sequenz des Harlil-Peptids, das zusätzliche Aminosäurereste aufweist,
nicht 25 Aminosäurereste
insgesamt.
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Die
Harlilrepeatsequenz besitzt bevorzugt das einzigartige Merkmal,
an NTP zu binden. Diese Fähigkeit,
an NTP zu binden, lässt
vermuten, dass die Harlilrepeatsequenz dazu nützlich ist, Zelltod und/oder
Gewebenekrose in lebendem Gewebe, das NTP enthält, vorzubeugen, zu hemmen
oder zu bessern.
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Harlil-Sequenzpeptide
und deren Homologe, Derivate, Varianten und Peptidmimetika können als
Affinitätsbindungspartner
für NTP
und andere Moleküle
zur Behandlung von Zuständen,
die mit Zelltod und oder Gewebenekrose verbunden sind, verwendet
werden. Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die mit Zelltod und/oder
Gewebenekrose verbunden sind, sowie Zusammensetzungen, welche Harlil-Peptide
oder deren Homologe, Derivate, Varianten und Peptidmimetika enthalten,
die in der Lage sind, durch die Blut-Hirn-Schranke zu gelangen,
sind ebenfalls vorgesehen.
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Harlil-Peptide
und Homologe, Derivate und Varianten davon können unter Verwendung herkömmlicher Peptidsynthesetechniken
hergestellt werden. Mimetika für
Harlil-Peptide können
unter Verwendung kombinatorischer chemischer Techniken entwickelt
werden.
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Nukleinsäuren, welche
Harlil-Peptiden entsprechen, können
beispielsweise unter Verwendung von (a) rekombinanten Standardverfahren,
(b) synthetischen Techniken oder (c) Kombinationen davon hergestellt
werden.
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Harlil-Sequenzen
binden an AD7C-NTP und andere Moleküle. Siehe anhängige US-Patentanmeldung Seriennummer
09/697,590 mit dem Titel „Preferred
Segments of Neural Thread Protein and Methods of Using the Same."
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Diese
Erfindung beinhaltet die überraschende
Entdeckung, dass eine Harlil-Sequenz,
die an AD7C-NTP binden kann, Zelltod und/oder Gewebenekrose in lebendem
Gewebe, das AD7C-NTP enthält,
vorbeugen oder hemmen kann.
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Es
gibt Anzeichen dafür,
dass AD7C-NTP an der neurogenerativen Kaskade beteiligt ist. Die
Fähigkeit, die
Kaskade zu unterbrechen oder umzuleiten, indem AD7C-NTP als Ziel
dient, bietet eine Möglichkeit
für die Therapie.
Beispielsweise kann es möglich
sein, durch Verwendung der Fähigkeit
des Harlil-Peptids mit AD7C-NTP- Bindungsstellen
zu wechselwirken, therapeutisch einzugreifen und somit mögliche reaktive
Stellen an AD7C-NTP zu blockieren.
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Alternativ
können
die Harlil-Peptide der Erfindung als zielsteuernde Arzneistoffe
für Zellen,
die die Harlil-Sequenz exprimieren, nützlich sein oder zur Erzeugung
von Genen oder Vakzinen, welche die Expression der Harlil-Sequenz
in vivo induzieren.
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Obwohl
der tatsächliche
Mechanismus, über
den die Harlil-Sequenz funktioniert, noch nicht bekannt ist, hat
der Erfinder herausgefunden, dass die Verabreichung einer Harlil-Sequenz
an lebendem Gewebe, das AD7C-NTP enthält, Zelltod und/oder Gewebenekrose,
die ansonsten in Abwesenheit der Harlil-Sequenz auftritt, vorbeugt
und/oder hemmt und/oder bessert.
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Es
ist möglich,
dass die „HARLIL"-Stellen mit anderen
Hirnproteinen wechselwirken und dass sie in der Funktionalität von AD7C-NTP
und/oder anderem NTP oder anderen Molekülen eine Rolle spielen können.
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Verfahren
zur Herstellung und Detektion solcher Harlil-Sequenzen oder von
deren funktionellen Homologen oder Analogen sind in den ebenfalls
anhängigen
US-Patentanmeldungen
Seriennr. 09/697,590 mit dem Titel „Preferred Segments of Neural
Thread Protein and Methods of Using the Same" beschrieben.
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Die
Peptidsegmente von NTP, welche im Zusammenhang der vorliegenden
Erfindung besonders nützlich
sind, sind solche, die oben beschrieben wurden, welche wenigstens
einen Teil der Harlilaminosäuresequenz
von AD7C-NTP enthalten. Nützliche
Harlil-Sequenzen beinhalten solche Aminosäuresequenzen, die aus der folgenden
Liste ausgewählt
sind:
- (a) HHARL;
- (b) HARL;
- (c) HARLI;
- (d) HARLIL;
- (e) HHARLCL;
- (f) ARLIL;
- (g) HHARLIF;
- (h) THARLIL;
- (i) ARLI;
- (j) ARL;
- (k) HARLCL;
- (l) ARLCL;
- (m) ARCL;
- (n) MFARLIL;
- (o) FARLIL;
- (p) FARLI;
- (q) FARL;
- (r) NARLIF;
- (s) ARLIF;
und Homologe, Varianten, Derivate und Mimetika
davon.
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Verschiedene
aus der obigen Liste ausgewählte
Peptide und Homologe, Varianten, Derivate und Mimetika davon können in
der vorliegenden Erfindung als Segment von NTP verwendet werden.
Beispielsweise kann das Peptid die Aminosäuresequenz A R L I aufweisen
und wenigstens eine bis zu 25 zusätzliche Aminosäuren umfassen,
die entweder das 3'-
oder das 5'-Ende
des Peptids flankieren. Das Peptid kann auch die Aminosäuresequenz
N A R L aufweisen, und wenigstens eine bis zu 25 zusätzliche
Aminosäuren
umfassen, die entweder das 3'-
oder das 5'-Ende
des Peptids flankieren. Außerdem
kann das Peptid die Aminosäuresequenz
F A R L aufweisen, und wenigstens eine bis zu 25 zusätzliche
Aminosäuren
umfassen, die entweder das 3'-
oder das 5'-Ende
des Peptids flankieren. Das Peptid kann auch aus einem Peptid ausgewählt werden, das
die Aminosäuresequenz
A R L aufweist und wenigstens eine bis zu 25 zusätzliche Aminosäuren umfasst, die
entweder das 3'- oder das 5'-Ende des Peptids
flankieren. Noch ein weiteres nützliches
Peptid in der vorliegenden Erfindung beinhaltet solche, die die
Aminosäuresequenz
A R L C aufweisen und wenigstens eine bis zu 25 zusätzliche
Aminosäuren
umfasst, die entweder das 3'-
oder das 5'-Ende
des Peptids flankieren. Schließlich
kann das Segment von NTP ein Polymer aus einer Harlil-Peptidsequenz
darstellen, das wenigstens zwei Wiederholungen des Peptids umfasst.
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In
der vorliegenden Erfindung ist noch weiter bevorzugt, dass die Harlil-Sequenzen
Peptide mit den folgenden Aminosäuresequenzen
sind.
1.
(NTP-1) | LHARLCLANFCGRNRV |
2.
(NTP-2) | LARLCLANFCGNNNV |
3.
(NTP-3) | CARYRTGHHARLM |
4.
(NTP-4) | HHARLPLANFCG |
5.
(NTP-5) | RTGHHARLCLANFC |
6.
(NTP-6) | CESARYRTGHHARLC |
7.
(NTP-7) | DNTHHARLIL |
8.
(NTP-8) | SHHARLIL |
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Die
obigen Sequenzen können
durch ein Cystein an Trägerproteine
konjugiert sein. So ergibt sich durch das Vorliegen von mehr als
einem Cysteinrest ein gemischtes Konjugat bei den Peptiden NTP-1
und NTP-2. Daher wurde für
die Peptide NTP-5 und NTP-6 das zweite Cystein mit Acetamidomethyl (C3H6NO)(ACM) blockiert.
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Die
Stelle der identifizierten Sequenzen in dem AD7C-NTP ist aus 1 ersichtlich.
Obwohl alle der gezeigten Harlilanaloge eine gewisse Reaktivität zeigen,
sind bevorzugte Harlilanaloga solche, die ausgewählt sind aus NTP-1, NTP-3 und
NTP-7. Es sollte angemerkt werden, dass in dem Harlilanalogon NTP-1
die erste Aminosäure „L" durch Lysin oder „K" ersetzt sein kann.
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Die
Harlil-Sequenzen oder Segmente von NTP werden bevorzugt mit lebendem
Gewebe in Kontakt gebracht, das NTP enthält. Jegliches lebendes Gewebe,
das NTP enthält,
das mit NTP in Kontakt stand und das kein NTP mehr enthält oder
das nicht mehr in seiner ursprünglichen
Form vorliegt oder das zu irgendeinem Zeitpunkt NTP enthalten könnte, ist
geeignet. Bevorzugt handelt es sich bei dem Gewebe um Gewebe, das aus
Säugergewebe
ausgewählt
ist.
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Ein
Verfahren zur Behandlung von Zuständen, die durch Nekrose von
lebendem Gewebe, welches NTP enthält, verursacht werden, wird
ermöglicht.
In diesem Zusammenhang bedeutet die Nekrose von lebendem Gewebe
und Zelltod Zelltod und/oder Gewebenekrose von anderen Zellen als
den sterbenden Zellen, welche das NTP produzieren. In dem Verfahren
wird einem Säuger,
der an einem solchen Zustand leidet, ein Segment von NTP oder eine
Harlil-Sequenz verabreicht. Die Harlil-Sequenz wird in einer Menge
und für
einen Zeitraum verabreicht, der ausreichend ist, um die Nekrose
des lebenden Gewebes vorzubeugen und/oder zu hemmen.
-
Ein
Fachmann wird erkennen, dass anstelle einer direkten Verabreichung
der Harlil-Sequenz
die Harlil-Sequenz oder ein Homologon, eine Variante, ein Derivat
oder ein Mimetikum davon durch den Säuger durch Genexpression (z.B.
Gentherapie oder durch ein Vakzin) produziert oder exprimiert werden
kann. Fachleute sind dazu in der Lage, geeignete Gene oder Vakzine,
die dazu nützlich
sind, die Expression einer Harlil-Sequenz, oder von Homologen, Derivaten,
Varianten oder Mimetika davon hervorzurufen, unter Verwendung der hierin
bereitgestellten Anleitung zu erzeugen, zu isolieren und zu reinigen.
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Beispielsweise
hat die Gentherapie große
Aufmerksamkeit auf sich gezogen als ein Verfahren zur Behandlung
verschiedener Säugererkrankungen
und zur Steigerung der Produktion spezifischer Proteine oder anderer
zellulärer
Produkte. Gentherapie wird im Allgemeinen durch Einbringen von exogenem
genetischem Material in die Zellen eines Säugerpatienten bewerkstelligt.
Das eingebrachte genetische Material kann so konzipiert sein, dass
ein abnormales (defektes) Gen des Säugerpatienten ersetzt wird
(„Genersetzungstherapie") oder es kann für die Expression
des kodierten Proteins oder eines anderen therapeutischen Produkts konzipiert
sein ohne dass irgendein defektes Gen ersetzt wird („Gensteigerung"). Da viele kongenitale
und erworbene medizinische Erkrankungen von einer unzureichenden
Produktion verschiedener Genprodukte herrühren, stellt die Gentherapie
ein Mittel bereit, um diese Erkrankungen entweder durch transiente
oder stabile Expression exogener Nukleinsäuren, die das therapeutische
Produkt kodieren, bereit.
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Gentherapie
kann entweder durch direkte Transformation von Zielzellen in dem
Säugersubjekt
(in vivo-Gentherapie) oder durch Transformation von Zellen in vitro
und anschließende
Implantation der transformierten Zellen in das Säugersubjekt (ex vivo-Gentherapie)
bewerkstelligt werden. Die in vivo-Gentherapie ist insbesondere
für die
Verwendung in der vorliegenden Erfindung bevorzugt. Zusätzlich zur Reparatur
somatischer Zellen ist es allgemein bekannt, dass die in vivo-Gentherapie
auch zur systemischen Behandlung verwendet werden kann, einem Gebiet,
auf dem die Gentherapie zahlreiche Anwendungen besitzt. Systemische Behandlung
schließt
die Transfektion von Zielzellen mit der DNA von Interesse, Expression
des kodierten Proteins in der Zelle und die Fähigkeit der transformierten
Zelle, anschließend
das hergestellte Protein ins Blut zu sekretieren, ein.
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Es
ist eine Vielzahl von Verfahren entwickelt worden, um eine in vivo-Transformation
zu bewerkstelligen, einschließlich
mechanischer Mittel (z.B. direkte Injektion der Nukleinsäure in Zielzellen
oder Partikelbeschuss), rekombinante Viren, Liposomen und Rezeptor-vermittelte
Endozytose (RME) (für
einen Überblick
siehe Chang et al. 1994 Gasfroenterol. 106: 1076–84; Morsy et al. 1993 JAMA
270: 2338–45;
und Ledley 1992 J. Pediatr. Gastroenterol. Nutr. 14: 328–37).
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Geeignete
Verfahren zur Entwicklung und Verabreichung von Genen und Vakzinen,
die dazu geeignet sind, eine in vivo-Expression der Harlil-Sequenzen
oder der Segmente von NTP oder Homologen, Varianten, Derivaten oder
Mimetika davon hervorzurufen, sind beispielsweise in US-Patent Nr.
6,210,919 und 6,225,290 offenbart.
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Jegliche
Zustände,
die mit Zelltod und Nekrose verbunden sind, können gemäß der vorliegenden Erfindung
behandelt werden. Bevorzugt ist der Zustand ausgewählt aus
einer neurodegenerativen Erkrankung wie beispielsweise AD, Picks-Erkrankung,
Lewy Body-Erkrankung oder Parkinson-Erkrankung oder aus Hirnschlag,
Hirntumor und anderen Hirnerkrankungen oder Glaukoma.
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Das
Verfahren beinhaltet das Inkontaktbringen von lebendem Gewebe mit
wenigstens einem Segment von NTP (oder einem Homologon, Derivat,
einer Variante oder einem Mimetikum davon) in einer ausreichenden
Menge, um Zelltod und/oder Gewebenekrose vorzubeugen. Verfahren
zur Verabreichung des Segments von NTP beinhalten die intramuskuläre, orale,
intravenöse,
intraperitoneale, intrazerebrale (intraparenchymale), intrazerebroventrikuläre, intratumorale,
intraläsionale,
intradermale, intrathekale, intranasale, intraokuläre, intraarterielle,
topische, transdermale, über
ein Aerosol, Infusion Bolusinjektion, Implantationsvorrichtung,
System zur andauernden Freisetzung etc. entweder allein oder an
einen Träger
konjugiert, Verabreichung des Segments von NTP. Außerdem kann
das Segment von NTP in vivo exprimiert oder produziert werden durch Verabreichung
eines Gens, das das Protein exprimiert, durch Verabreichung eines
Vakzins, das eine solche Produktion hervorruft oder durch Einbringen
von Zellen, Bakterien oder Viren, welche das Segment in vivo exprimieren,
wie oben beschrieben.
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Die
Behandlung von Erkrankungen des Nervensystems oder von anderen Gehirnbezogenen
Erkrankungen kann durch Verabreichung von Arzneistoffen, welche
die Funktion des Nervensystems oder die Dysfunktion in Tieren oder
Patienten beeinflussen, erzielt werden. Typischerweise werden solche
Arzneistoffe durch periphere Applikation entweder auf oralem oder
systemischem Weg verabreicht. Während
manche Arzneistoffe in der Lage sind, durch die Blut-Hirn-Schranke (bbb) zu
gelangen, passieren andere die bbb nicht effizient oder überhaupt
nicht, und sie sind nur dann wirksam, wenn sie direkt in das Gehirn
abgegeben werden. Die Bezeichnung „Blut-Hirn-Schranke" oder „bbb" wie hierin verwendet,
betrifft die bbb selbst sowie die Blutspinale Schranke. Die Blut-Hirn-Schranke,
welche aus dem Endothelium der Gehirngefäße, der Basalmembran und Neuroglialzellen
besteht, dient dazu, das Eindringen von Substanzen in das Gehirn
zu begrenzen. Manchmal ist die Struktur der bbb in zwei Komponenten
unterteilt: Die endotheliale oder kapillare Schranke und die ependymale
Schranke. Banks, W. A., Kastin, A. J., Barrera, „Delivering peptides to the
central nervous system: Dilemmas and strategies," Pharm. Res. 8: 1345–1350 (1991).
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Die
Art des Eindringens von Substanzen durch die bbb ist bislang noch
nicht bestimmt worden, es ist jedoch bekannt, dass viele der Regulatoren
der Gehirnfunktion, wie beispielsweise Zytokine, Transferrin, Enzephaline
und Endorphine durch die bbb aus den Blutgefäßen in das Gehirn passieren
können.
Raeissi, S., Audus, J., „In
vitro characterization of blood-barrier permeability to delta sleep-inducing
peptide." J. Pharm. Phy.
41: 848–852
(1989); Zlokovich, B., Susie, V. T., Davson, H., Begley, D. J.,
Jankov, R. M., Mitrivic, B. M., Lipovac, M. N., „Saturable mechanism for delta
sleep-inducing peptide (DSIP) at the blood-brain barrier of the vascularly
perfused guinea pig brain." Peptides
10: 249–254
(1989); und Zlokovich, B., In vitro approaches for studying peptide
interaction at the blood-brain barrier." J. Control. Rel. 13: 185–201 (1990).
Viele Substanzen, welche das zentrale Nervensystem (oder ZNS) beeinflussen
können,
wie beispielsweise Adenosin, β-Endorphin, synthetische
Analoga endogener Peptide Houghten, R. A. Swann, R. W., Li, C. H., „β-Endorphin:
Stability, clearance behaviour and entry into the central nervous
system after intravenous injection of the tritiated peptide in rats
and rabbits." Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 77: 4588–4591
(1980); Levin, E. R., Frank, H. J. K., Weber, M. A., Ismail, M.,
Mills M., „Studies
on penetration of the blood-brain barrier by atrial natriuretic
factor." Biochem. Biophys.
Res. Commun. 147: 1226–1231
(1987); Sakane, T., Tanaka, C., Yamamoto, A., Hashida, M., Sesaki, H.,
Ueda, H., Takagi, H., „The
effect of polysorbate 80 on brain uptake and analgesic effect of
D-kyoto." Int. J. Pharm.
57: 77–83
(1989) sowie einige anregende und hemmende Aminosäuren und
trophische Faktoren, dringen jedoch kaum oder überhaupt nicht durch die bbb.
Gegenwärtig
können
Arzneistoffe ohne bbb-Durchdringung oder mit geringer bbb-Durchdringung
nur durch direkte ZNS-Infusion oder durch Implantation von Polymeren
mit kontrollierter Freisetzung verabreicht werden (siehe z.B. US-Patent Nr. 4,883,666,
Sabel et al.).
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Eine
Möglichkeit,
manche der Einschränkungen
der traditionellen Arzneistofftherapie zu überwinden ist es, die relative
Menge des Arzneistoffs, der die bbb passiert, zu erhöhen. Man
nimmt an, dass, wenn es möglich
ist, die Menge des Arzneistoffs, der durch die bbb gelangt, zu erhöhen und
gleichzeitig die periphere Dosis eines verabreichten Arzneistoffs
oder einer diagnostischen Substanz zu verringern, auch die peripheren Nebenwirkungen
des Arzneistoffs weniger gravierend sind, während gleichzeitig die gewünschte Wirkung
im Gehirn beibehalten wird. Es sind zahlreiche Ansätze beschrieben
worden, die das Durchdringen von Arzneistoffen durch die bbb erhöhen.
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Ein
Ansatz war es, die Funktion der bbb selbst zu verändern. Beispielsweise
führen
osmotische Mittel bei peripheraler Verabreichung (wie beispielsweise
durch intravenöse
Injektion) zu einer Öffnung
der bbb. Außerdem
können
manche Arzneistoffe, welche auf das ZNS wirken, die Durchlässigkeit
der bbb für
andere Substanzen verändern;
beispielsweise ist über
cholinomimetische Arekoline berichtet worden, dass sie Veränderungen
der Arzneistoffdurchdringung durch die bbb hervorrufen. Saija, A.,
Princi, P., De Pasquale, R., Costa, G., „Arecoline but not haloperidol
produces changes in the permeability of the blood-brain barrier
in the rat." J. Pharm.
Pha. 42: 135–138
(1990).
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Andere
Arzneistoffe, welche verabreicht werden können, um die Durchlässigkeit
der bbb zu verändern, sind
in US-Patent Nr. 5,059,415 und 5,124,146 von E. A. Neuwelt offenbart.
Bradykinin ist ein spezifischer Arzneistoff mit solchen Effekten
(US-Patent Nr. 5,112,596 von Malfroy-Camine). Ein weiteres Verfahren
umfasst die Verabreichung von durchlässigmachenden Peptiden wie
beispielsweise A-7 oder konformationellen Analoga davon (WO 92/18529,
eine Anmeldung von J. W. Kozarich et al.). Ein relativ invasives
Verfahren ist von A. Tomasz und E. Tuomanen (WO 91/16064) vorgeschlagen
worden, die eine parenterale Injektion von gereinigter Zellwand
oder Zellwandfragmenten von Eubakterien wie beispielsweise Streptococcus
pneumoniae verabreichen, um die bbb zu öffnen.
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US-Patent
Nr. 5,260,210 von L. L. Rubin et al. offenbart ein Verfahren, bei
dem die Durchlässigkeit
der Blut-Hirn-Schranke erhöht
wird durch Verabreichen eines Mittels, welches zyklische AMP-Konzentrationen verringert
oder störend
auf diese einwirkt, oder welches die Konzentrationen an zyklischem
GMP erhöht.
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Die
Modifikation der Arzneistoffmoleküle selbst stellt einen weiteren
Ansatz dar. Beispielsweise passieren Makromoleküle wie beispielsweise Proteine
die bbb überhaupt
nicht oder sie passieren die bbb mit Schwierigkeiten oder durchlaufen
dabei Veränderungen,
durch welche die Wirksamkeit der Proteine nachteilig beeinträchtigt wird.
Es ist beispielsweise möglich,
zunächst
die aktive Stelle des Makromoleküls
zu isolieren, d.h. den Anteil des Moleküls, der das biologisch wünschenswerte
Ereignis auslöst,
und dann nur diese wirksame Stelle zu verwenden. Da die Größe einer
der Faktoren ist, der ein Durchdringen der bbb erlaubt, kann die verringerte
Größe eingesetzt
werden, so dass das kleinere Molekül nun die bbb passiert. Andere
Modifikationen an Makromolekülen,
um ein Passieren der bbb zu erreichen, beinhalten die Glykosylierung
der Proteine, wodurch deren Durchdringen durch die bbb verbessert
wird, oder die Bildung eines Arzneistoffvorläufers. US-Patent Nr. 5,260,308
von J. F. Podusio und G. L. Curran diskutiert das Glykosylieren
von Proteinen während
US-Patent Nr. 4,933,324 und WO 89/07938, jeweils von V. E. Shashoua,
die Bildung eines Arzneistoffvorläufers offenbaren. Diese Arzneistoffvorläufer werden
aus einem Fettsäureträger und
einem neuroaktiven Arzneistoff, der selbst nicht durch die bbb gelangen
kann, gebildet. Ein ähnliches
System ist in WO 89/07938 offenbart.
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Noch
einen weiteren Ansatz stellt die Implantation von Polymeren zur
kontrollierten Freisetzung dar, welche den aktiven Bestandteil aus
einem Matrixsystem direkt in das Nervengewebe freisetzen. Dieser
Ansatz ist jedoch invasiv und erfordert einen chirurgischen Eingriff,
wenn eine direkte Implantation in das Gehirn oder das Rückenmark
erfolgt (siehe Sabel et al. US-Patent Nr. 4,883,666; und Sabel et
al., US-Patentanmeldung Seriennummer 07/407,930). Es ist auch bekannt,
Zusammensetzungen direkt in innere Teile des Gehirns zu verabreichen,
wie es in US-Patent Nr. 5,800,390 offenbart ist. Diese Verfahren
ermöglichen
die Verabreichung einer andauernden Freisetzung von festen Präparationen
und halbfesten Präparationen
direkt in das Hirngewebe.
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Um
diese Einschränkungen
zu überwinden,
ist ein weiterer Ansatz ausprobiert worden, in welchem Arzneistoffträgersysteme
wie beispielsweise Liposome, Erythrozytenghosts, Antikörperkonjugate
und Konjugate monoklonaler Antikörper
verwendet werden. Eines der Hauptprobleme bei der zielgesteuerten
Arzneistoffzufuhr ist die rasche Opsonisierung und die Aufnahme
injizierter Träger
durch das Retikuloendothelialsystem (RES), besonders durch die Makrophagen
in der Leber und Milz. Dieses Hindernis kann teilweise im Fall von
Liposomen überwunden
werden durch Aufnahme sogenannter „verdeckter" Lipide wie beispielsweise Phosphatidylinositol,
Monosialogangliosid oder Sulfogalaktosylceramid.
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Die
US-Patente Nr. 5,182,107 und 5,154,924, jeweils von P. M. Friden,
lehren ein Verfahren zur Konjugation eines Arzneistoffs mit einem
Antikörper,
wobei der Antikörper
gegenüber
einem Transferrinrezeptor reaktiv ist. Transferrinrezeptoren befinden
sich an kapillaren Endothelialzellen des Gehirns, welche so einen Arzneistoff
wie beispielsweise einen Nervenwachstumsfaktor über die bbb transportieren
können.
US-Patent Nr. 5,004,697 (von Pardridge) verbessert ein solches Antikörper-konjugiertes
Verfahren, indem kationisch gemachte Antikörper mit einem speziellen isoelektrischen
Punkt bereitgestellt werden (siehe auch WO 89/01343 von Pardridge).
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Einen
weiteren Ansatz stellt die Erzeugung chimärer Peptide dar, an welche
Wirkstoffe konjugiert sind (US-Patent Nr. 4,801,575, ebenfalls von
Pardridge). Ein solches System ist ferner auch in US-Patent Nr. 4,902,505
von Pardridge und Schimmel diskutiert, wobei das chimäre Peptid
wie beispielsweise Histon dazu in der Lage ist, die bbb durch Transzytose
zu überschreiten.
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Die
US-Patente Nr. 5,187,158 und 5,017,566, jeweils von N. S. Bodor,
offenbaren ein gehirnspezifisches Arzneistoffzufuhrverfahren, bei
dem ein zentral wirkender Arzneistoff mit der reduzierten biooxidierbaren Lipoidform
eines Dihydropyridin-Reaktions
Pyridinsalz-Redoxträgers
wie beispielsweise Dopamin abgegeben wird (siehe auch US-Patent
Nr. 4,880,816, ebenfalls von Bodor).
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Ein
ziemlich invasiver Ansatz wird unternommen, um genetisches Material
in das Gehirn zuzuführen. Dies
wird beispielsweise durch chemisches Zerstören der bbb durchgeführt und
anschließend
werden Viren verwendet, um Gene über
die bbb zuzuführen
(siehe US-Patent Nr. 4,866,042, von E. A. Neuwelt). Hier ist ein korrektives
genetisches Material in einem Virus enthalten und das Virus wird
dann in die Blutbahn injiziert.
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Schließlich ist
die Verwendung von Liposomen, wie von F. D. Collins und R. C. Thompson
(WO 91/04014) offenbart, noch ein weiteres Trägersystem um Arzneistoffe über die
bbb zuzuführen.
Hier werden Liposome auf spezifische endogene Gehirntransportsysteme
gerichtet, welche spezifische Liganden über die bbb transportieren.
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Ein
weiterer Ansatz ist in US-Patent Nr. 6,117,454 von Kreuter et al.
offenbart. Der Gegenstand des Patents von Kreuter beinhaltet ein
Verfahren, eine Zusammensetzung und ein Arzneistoffzielsteuerungssystem
unter Verwendung eines oberfächenaktiven
Mittels, das mit Nanopartikeln beschichtet ist, als Arzneistoffträger (oder
Zielsteuerungsmolekül)
für einen
breiten Bereich von Arzneistoffen, um das Durchdringen von Arzneistoffen
oder diagnostischen Mitteln durch die bbb zu verbessern.
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Ein
weiterer Ansatz ist es, die Arzneistoffe intranasal zu verabreichen,
um einen direkten Zugang zu dem Gehirn zu ermöglichen und die Blutbahn zu
umgehen. Dies wurde in einem expenmentellen Modell für drei Neuropeptide,
Melanocortin, Vasopressin und Insulin erfolgreich durchgeführt: Bom
J et al. „Sniffing
neuropeptides: a transnasal approach to the human brain" Nature Neuroscience
Advance Onlineveröffentlichung: 6.
Mai 2002, DOI:10.1038/nn849.
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Feste
Dosierungsformen für
die orale Verabreichung beinhalten Kapseln, Tabletten, Pillen, Pulver
und Granulate. In solchen festen Dosierungsformen ist der aktive
Bestandteil üblicherweise
mit wenigstens einer der folgenden Komponenten vermischt: (a) ein
oder mehrere inerte Hilfsstoffe (oder Träger) wie beispielsweise Natriumzitrat
oder Dikalziumphosphat; (b) Füllstoffe
oder Streckmittel wie beispielsweise Stärke, Laktose, Saccharose, Glukose,
Mannitol und Kieselsäure;
(c) Bindemittel wie beispielsweise Carboxymethylzellulose, Alginate,
Gelatine, Polyvinylpyrrolidon, Saccharose und Akazie; (d) Befeuchtungsmittel
wie beispielsweise Glyzerin; (e) Desintegrationsmittel wie beispielsweise
Agar-Agar, Kalziumkarbonat, Kartoffel- oder Tapiokastärke, Alginsäure, bestimmte
komplexe Silikate und Natriumkarbonat; (f) Abbindeverzögerer wie
beispielsweise Paraffin; (g) Absorptionsbeschleuniger wie beispielsweise
quaternäre
Ammoniumverbindungen; (h) Benetzungsmittel wie beispielsweise Acetylalkohol
und Glyzerinmonostearat; (i) Adsorbentien wie beispielsweise Kaolin
und Bentonit; und (j) Gleitmittel wie beispielsweise Talk, Kalziumstearat,
Magnesiumstearat, feste Polyethylenglykole, Natriumlaurylsulfat
oder Gemische davon. Für
Kapseln, Tabletten und Pillen können
die Dosierungsformen auch Puffermittel umfassen.
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Flüssige Dosierungsformen
für eine
orale Verabreichung beinhalten pharmazeutisch annehmbare Emulsionen,
Lösungen,
Suspensionen, Sirups und Elixiere. Zusätzlich zu den Verbindungen
mit der aktiven Harlil-Sequenz können
die flüssigen
Dosierungsformen inerte Verdünner,
die im Fachbereich üblicherweise verwendet
werden, wie beispielsweise Wasser oder andere Lösungsmittel, Solubilisierungsmittel
und Emulgatoren umfassen. Beispiele für Emulgatoren sind Ethylalkohol,
Isopropylalkohol, Ethylcarbonat, Ethylacetat, Benzylalkohol, Benzylbenzoat,
Propylenglykol, 1,3-Butylenglykol, Dimethylformamid, Öle wie beispielsweise Baumwollsamenöl, Erdnussöl, Maiskeimöl, Olivenöl, Kastoröl und Sesamöl, Glyzerin,
Tetrahydrofurfurylalkohol, Polyethylenglykole, Fettsäureester
von Sorbitan oder Gemische dieser Substanzen und dergleichen. Neben
solchen inerten Verdünnungsmitteln
kann die Zusammensetzung auch Hilfsstoffe wie beispielsweise Benetzungsmittel,
Emulgiermittel und Suspendiermittel, Süßstoffe, Geschmacksstoffe und
Duftstoffe enthalten.
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Ein
weiteres Verfahren zur Verabreichung des Segments von NTP ist durch
einen transdermalen oder transkutanen Weg. Ein Beispiel für eine solche
Ausführungsform
ist die Verwendung eines Patchs. Ein Patch kann insbesondere mit
einer feinen Suspension eines Segments von NTP in beispielsweise
Dimethylsulfoxid (DMSO) oder in einem Gemisch von DMSO mit Baumwollsamenöl hergestellt
werden und mit der Haut der Säuger
abseits der Behandlungsstelle in Kontakt gebracht werden. Die Zusammensetzung
kann in einem Hautbeutel vorliegen. Andere Medien oder Gemische
davon mit anderen Lösungsmitteln
und festen Trägem würden ebenso
gut funktionieren. Der Patch kann das Segment von NTC in Form einer
Lösung
oder einer Suspension enthalten. Der Patch kann dann auf der Haut
des Patienten aufgebracht werden, beispielsweise indem er in eine
Hauttasche des Patienten eingefügt
wird, die gebildet wird, indem die Haut gefaltet und mit Stichen, Clips
oder anderen Haltevorrichtungen zusammengehalten wird. Diese Tasche
sollte auf eine solche Weise verwendet werden, dass ein kontinuierlicher
Kontakt mit der Haut ohne Beeinträchtigung des Säugers sichergestellt
wird. Abgesehen von der Verwendung einer Hauttasche kann eine beliebige
Vorrichtung verwendet werden, welche die stabile Anbringung des
Patchs in Kontakt mit der Haut sicherstellt. Beispielsweise könnte eine
Haftbandage verwendet werden, um den Patch auf der Haut in Position
zu halten.
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Tatsächliche
Dosierungsmengen der wirksamen Bestandteile in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen
können
variiert werden, um eine Zusammensetzung zu erhalten, die ein Segment
von NTP enthält, die
wirksam ist um eine gewünschte
Gewebenekrose-hemmende therapeutische Antwort für eine bestimmte Zusammensetzung
und ein bestimmtes Verabreichungsverfahren zu erhalten. Die ausgewählte Dosierungsmenge
hängt daher
von dem gewünschten therapeutischen
Effekt, der Verabreichungsweise, der gewünschten Behandlungsdauer und
anderen Faktoren ab.
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Bei
Säugern,
einschließlich
Menschen, können
die wirksamen Mengen auf Grundlage der Körperoberfläche verabreicht werden. Der
Zusammenhang der Dosierungen für
Tiere verschiedener Größen, Spezien und
für Menschen
(bezogen auf mg/M2 der Körperoberfläche) ist von E. J. Freireich
et al., Cancer Chemother. Rep., 50: (4): 219 (1966) beschrieben
worden. Die Körperoberfläche kann
in etwa aus der Höhe
und dem Gewicht eines Individuums berechnet werden (siehe z.B. Scientific
Tables, Geigy Pharmaceuticals, Ardsley, N.Y. Seiten 537–538 (1970)).
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Die
Tagesdosis des NTP-Segments, das einem Wirt verabreicht wird, kann
in Form einer Einzeldosis oder in unterteilten Dosierungen verabreicht
werden. Dosierungseinheitszusammensetzungen können solche Mengen entsprechender
Bruchteile davon enthalten, dass die Tagesdosis erreicht wird. Selbstverständlich hängt jedoch
die spezielle Dosismenge für
einen bestimmten Patienten von einer Vielfalt an Faktoren einschließlich dem
Körpergewicht,
dem Allgemeinzustand, dem Geschlecht, der Ernährung, Zeit und Art und Weise
der Verabreichung, Wirkkraft des verabreichten Arzneistoffs, Absorptions-
und Exkretionsraten, Kombination mit anderen Arzneistoffen und der
Schwere der bestimmten behandelten Krankheit ab.
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Die
NTP-Segment-haltigen Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung
enthalten bevorzugt eine Komponente, welche es ermöglicht,
dass das Segment von NTP durch die Blut-Hirn-Schranke gelangt, um
lebendes Hirngewebe zu behandeln. Eine beliebige der Vielfalt der
oben beschriebenen Komponenten kann verwendet werden, um die Segmente
in die Lage zu versetzen, die Blut-Hirn-Schranke zu durchqueren. Beispielsweise
können
die Segmente von NTP klein genug sein, um die Blut-Hirn-Schranke
zu durchqueren. In diesem Fall werden keine zusätzlichen Komponenten benötigt.
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Die
Segmente von NTP können
glykosiliert sein, um die Durchlässigkeit
durch die bbb zu steigern, wie in US-Patent Nr. 5,260,308 offenbart,
oder sie können
zu einem Arzneistoffvorläufer
umgeformt werden, wie in US-Patent Nr. 4,933,324 und WO 89/07938
offenbart. Diese Arzneistoffvorläufer
werden bevorzugt aus einem Fettsäureträger und
einem Segment von NTP, das selbst nicht in der Lage ist, durch die
bbb zu gelangen, gebildet.
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Ein
alternativer Ansatz ist die Implantation von Polymeren für die kontrollierte
Freisetzung, welche die Segmente von NTP aus einem Matrixsystem
direkt in das Nervengewebe freisetzen (siehe Sabel et al., US-Patent
Nr. 4,883,666 und Sabel et al., US-Patentanmeldung Seriennummer
07/407,930). Es ist auch möglich, Arzneistoffträgersysteme
wie beispielsweise Liposome, Erythrozytenghosts, Antikörperkonjugate
und Konjugate monoklonaler Antikörper
zu verwenden. Gemäß dieser
Ausführungsform
der Erfindung können
sogenannte „versteckte" Lipide wie beispielsweise
Phosphatidylinositol, Monosialogangliosid oder Sulfogalaktosylceramid
verwendet werden, um die Liposome, welche die zuvor erwähnten Antikörper und
Antikörperkonjugate
enthalten, zu bilden.
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Die
Segmente von NTP können
mit einem Antikörper
konjugiert sein, der gegenüber
einem Transferrinrezeptor reaktiv ist, wie in US-Patenten Nr. 5,182,107
und 5,154,924 offenbart. Transferrinrezeptoren befinden sich an
kapillaren Endothelialzellen des Gehirns, welche so einen Arzneistoff
wie beispielsweise einen Nervenwachstumsfaktor oder Segmente von
NTP über
die bbb transportieren. Das oben beschriebene Konjugat aus NTP-Segment
und Antikörper
kann weiter verbessert werden, indem kationisierte Antikörper mit
einem spezifischen isoelektrischen Punkt bereitgestellt werden,
wie in US-Patent Nr. 5,004,697 und WO 89/01343 offenbart.
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Eine
weitere Ausführungsform
der Erfindung umfasst die Erzeugung chimärer Peptide, an welche die aktiven
Segmente von NTP konjugiert sind, wie in US-Patent Nr. 4,801,575
offenbart. Bei dem chimären
Peptid handelt es sich bevorzugt um Histon, welches in der Lage
ist, durch Transzytose durch die bbb zu gelangen, wie in US-Patent
Nr. 4,902,505 offenbart. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung beinhaltet
die Bereitstellung der Segmente von NTP zusammen mit der reduzierten,
biooxidierbaren Lipoidform eines Dihydropyridin-Reaktions Pyridinsalz-Redoxträgers wie
beispielsweise Dopamin, wie in den US-Patenten Nr. 4,880,816; 5,187,158
und 5,017,566 offenbart.
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Außerdem kann
ein weiterer Ansatz unternommen werden, um die Segmente von NTP
zu dem Gehirn zuzuführen.
Dies kann durchgeführt
werden, indem die bbb chemisch zerstört wird und anschließend Viren verwendet
werden, um die Segmente von NTP über
die bbb zuzuführen,
wie in US-Patent Nr. 4,866,042 offenbart. Hier ist es bevorzugt,
dass ein korrektives genetisches Material in einem Virus eingefügt ist und
das Virus dann in die Blutbahn injiziert wird. Noch ein weiteres
Trägersystem,
das verwendet werden kann, um die Segmente von NTP über die
bbb zuzuführen,
ist die Verwendung von Liposomen wie von F. D. Collins und R. C. Thompson
offenbart (WO 91/04014). Hier werden Liposome bevorzugt auf spezifische
endogene Gehirntransportsysteme gerichtet, welche spezifische Liganden über die
bbb transportieren. Oberflächenaktive
Mittel, die mit Nanopartikeln beschichtet sind, können ebenfalls
als Arzneistoffträger
(oder als Zielssteuerungsmolekül) für die erfindungsgemäßen Segmente
von NTP verwendet werden, um deren Durchdringung durch die bbb zu verbessern,
wie in US-Patent Nr. 6,117,454 offenbart.
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Ein
weiterer Ansatz ist es, L-Aminosäureoxidase
zu verwenden, um den Plasmawert der Segmente von NTP zu verringern,
um einen Transport der Segmente von NTP über die bbb zu ermöglichen.
Ein solcher Ansatz ist ausführlicher
in US-Patent Nr. 5,695,751 beschrieben.
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Ein
weiterer Ansatz ist es, Zusammensetzungen zu verabreichen, welche
die Segmente von NTP lokal umfassen. Vorrichtungen, die dazu nützlich sind,
Zusammensetzungen zu einem innen gelegenen Teil des Gehirns zu verabreichen,
sind beispielsweise in US-Patent Nr. 5,800,390 beschrieben.
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Andauernde
Freisetzungspräparationen,
feste Präparationen
und halbfeste Präparationen
können dem
Gehirngewebe direkt verabreicht werden. Eine solche Verabreichung
kann bewerkstelligt werden, indem ein nadelartiges Teil einer solchen
Intrazerebralvorrichtung gegebenenfalls so in den Kopf implantiert
wird, dass ein distales Ende des Führers sich an der Stelle der
Verabreichung befindet.
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Eine
bevorzugte Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung für die Verabreichung
bei einem Säuger,
der an einem Zustand leidet, der mit Zelltod und/oder Gewebenekrose
verbunden ist, beinhaltet die Segmente von NTP und eine Komponente,
welche es den Segmenten von NTP ermöglicht, die bbb zu durchqueren.
Andere bevorzugte Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung schließen ein
Gen ein, welches die Segmente von NTP exprimiert und eine Komponente,
welches es dem Gen ermöglicht,
die bbb zu durchqueren. Eine weitere bevorzugte Zusammensetzung
der vorliegenden Erfindung schließt ein Vakzin ein, welches die
Expression des Segments von NTP induziert, sowie eine Komponente,
welche es dem Vakzin ermöglicht, die
bbb zu durchqueren.
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In
der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, dass die Menge der
Segmente von NTP, welche mit dem lebenden Gewebe in Kontakt kommen,
eine Menge ist, die ausreicht, um Zelltod und/oder Gewebenekrose
zu hemmen, vorzubeugen und/oder zu bessern. Die spezifische Menge
kann von einem Fachmann unter Verwendung der hierin bereitgestellten
Anleitung ermittelt werden. Es ist bevorzugt, dass genügend Segmente von
NTP verabreicht werden, um Zelltod oder Gewebenekrose um mehr als
50% im Vergleich zu einer Kontrolle, bei der kein Segment von NTP
vorliegt und Zelltod unkontrolliert erfolgt, zu verringern. Weiter
bevorzugt werden die Segmente von NTP verabreicht, um Zelltod oder
Gewebenekrose um mehr als 60%, noch weiter bevorzugt um mehr als
70% und am meisten bevorzugt um mehr als 75% zu verringern, im Vergleich
zu einer Kontrolle, bei der kein Segment von NTP vorliegt und Zelltod
oder Gewebenekrose unkontrolliert abläuft.
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Eine
solche Menge hängt
unveränderlich
von der bestimmten Gewebeart, den verwendeten NTP-Segmenten sowie
von der Menge an NTP oder einem anderen molekularen Ziel ab. Unter
Verwendung der in beliebigen der zuvor genannten US-Patente Nr. 5,948,634;
5,948,888; 5,830,670 und 6,071,705 offenbarten Verfahren ist es
möglich,
die relative Menge an NTP oder einem anderen vorliegenden molekularen
Ziel abzuschätzen
und dann eine Reihe von in vitro-Experimenten durchzuführen, wobei
Säugergewebe
verwendet wird, das aus verschiedenen Quellen erhalten wird, wie
beispielsweise beliebige solcher, die in den zuvor genannten US-Patenten
offenbart sind, die Menge am NTP oder eines anderen molekularen
Ziels in dem Gewebe zu bestimmen und dann die entsprechende Menge
an NTP-Segmenten zu bestimmen, die erforderlich ist, um das erforderliche
Ausmaß an
Prävention
von Zelltod oder Gewebenekrose (d.h. bevorzugt mehr als 60% im Vergleich
zu einer Kontrolle) zu erreichen. Fachleute sind dazu in der Lage,
diese Experimente unter Verwendung von Techniken, die im Fachbereich
bekannt sind sowie unter Verwendung der hierin bereitgestellten Anleitung
durchzuführen.
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Die
Menge an NTP-Segmenten, welche dem Säuger verabreicht werden sollen,
kann leicht auf Grundlage des Körpergewichts
des Säugers
und der erwarteten Zufuhrmenge zu dem Gewebe bestimmt werden. Die
Menge an NTP-Segmenten, von denen auszugehen ist, dass sie zu dem
Gehirngewebe eines Säugers zugeführt werden,
hängt von
dem bestimmten Mechanismus ab, der eingesetzt wird, um die NTP-Segmente in
die Lage zu versetzen, die bbb zu überschreiten. Dasselbe trifft
für die
Verabreichung von Genen, welche die NTP-Segmente exprimieren oder
für die
Verabreichung von Vakzinen, welche die Expression oder Produktion
der Segmente von NTP hervorrufen, zu. Auch hier sind Fachleute dazu
in der Lage, die entsprechende Dosis des Gens, Vakzins, der NTP-Segmente,
welche einem Säuger
verabreicht werden sollen unter Verwendung der in den zuvor genannten
Patenten beschriebenen Techniken und unter Verwendung der dort und
hierin bereitgestellten Anleitungen, zu bestimmen.
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Die
folgenden Beispiele werden bereitgestellt, um die vorliegende Erfindung
zu veranschaulichen. Es sollte jedoch nicht so verstanden werden,
dass die Erfindung durch die speziellen in diesen Beispielen beschriebenen
Bedingungen oder Einzelheiten begrenzt sind.
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Beispiel 1
-
Dieses
Beispiel demonstriert den Zelltod in lebendem Gewebe (in vivo) aufgrund
des Vorliegens von AD7C-NTP.
-
AD7C-NTP
wurde gemäß der in
beliebigen der US-Patente Nr. 5,948,634; 5,948,888; 5,830,670 und 6,071,705
dargelegten Vorgehensweisen erhalten.
-
In
acht normale Ratten wurde in die Haut und subkutan jeweils in drei
unterschiedliche Foci gereinigtes rekombinantes AD7C-NTP in Saline
mit Konzentrationen von 0,1–1,0 μg/mL über Plastikspritzen
durch 26 Gauge Nadeln aus rostfreiem Stahl injiziert.
-
Die
Tiere wurden 24 Stunden lang beobachtet und nach 24 Stunden schmerzfrei
getötet.
Die 24 einzelnen Infiltrationsfoci wurden herausgeschnitten, in
10%-igem Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und durch histopathologische
Standardverfahren angefärbt
und untersucht.
-
In ähnliche
Gruppen von Kontrollratten wurde (1) Rinderserumalbumin in Saline,
(2) normales humanes Serum und (3) physiologische Saline injiziert
und diese Ratten wurden wie oben untersucht und getötet, wobei
die herausgeschnittenen Injektionsfoci wie oben behandelt wurden.
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Die
Injektion von AD7C-NTP erzeugte in allen Beispielen an den Injektionsstellen
eine akute Gewebenekrose. Die Nekrose ist in Muskelgewebe, subkutanem
Bindegewebe und Dermis an den Stellen, in welche das AD7C-NTP injiziert
wurde, erkennbar. Nach 24 Stunden erscheinen die Zellen blass, geschrumpft
und nekrotisch und es liegt eine Infiltration von inflammatorischen
Zellen vor. Die Nekrose korreliert mit den Injektionsbereichen und
scheint sich nicht weit über
die Injektionsstelle hinaus auszudehnen.
-
Kontrollen
zeigten keinerlei Anzeichen für
Nekrose oder Zellverlust. Kontrollinjektionen wiesen eine geringe
bis minimale akute Entzündung
und fokale Mikrohämorrhagen
durch die Nadeln auf.
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Beispiel 2
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Der
Zweck dieses Beispiels war es, verschiedene Harlil-Sequenzen des
AD7C-NTP Neuralen Threat Proteins zu identifizieren und deren Reaktivität mit AD7C-NTP
zu bestimmen.
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Die
folgenden Harlil-Sequenzen wurden synthetisiert (Synpep, Dublin
CA) und an Maleimid-aktiviertes Kaninchen-IgG (Jackson Immunoresearch,
West Grove PA) konjugiert und auf ihre NTP-Immunoreaktivität hin untersucht.
Ein Linker wurde hinzugefügt,
der eine Wiederholung der vor und nach der 90–96 H H A R L C L- Sequenz von AD7C-NTP
auftretenden Proteinsequenz war.
1.
(NTP-1) | LHARLCLANFCGRNRV |
2.
(NTP-2) | LARLCLANFCGNNNV |
3.
(NTP-3) | CARYRTGHHARLM |
4.
(NTP-4) | HHARLPLANFCG |
5.
(NTP-5) | RTGHHARLCLANFC |
6.
(NTP-6) | CESARYRTGHHARLC |
7.
(NTP-7) | DNTHHARLIL |
8.
(NTP-8) | SHHARLIL |
-
Die
Konjugation an Trägerproteine
erfolgte über
ein Cystein. Somit ergibt sich ein durch die Peptide NTP-1 und NTP-2
erzeugtes Gemisch des Konjugats, da mehr als ein Cysteinrest vorliegt.
Daher wurde für
die Peptide NTP-5 und NTP-6 das zweite Cystein mit Acetamdiomethyl
(C3H6NO)(ACM) blockiert.
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Die
Position der identifizierten Sequenzen in der AD7C-NTP-Sequenz ist
in 1 ersichtlich. Wie oben erwähnt, sind auch Homologe, Derivate,
Mimetika und Varianten der Harlil-Peptide im Rahmen der Erfindung
inbegriffen. Für
die Erzeugung der homologen Peptide dieses Beispiels wurden homologe
Aminosäuren
verwendet. Die verwendeten Substitutionskriterien waren Ladung und/oder
Größe. Somit
beruhte die Auswahl, Methionin in NTP-Peptid 3 gegen Cystein auszutauschen,
auf einer insgesamten Ähnlichkeit
dieser beiden Aminosäuren
und dem Erfordernis, ein reaktives Cystein aus diesem bestimmten
Aminosäurestrang
zu entfernen. Die Wahl, Prolin gegen Cystein auszutauschen, war
ein Versuch, zu sehen, ob dadurch die konformationelle Form des
Peptids nachgeahmt wird, wenn es in dem Protein vorliegt und das
Cystein in einer Disulfidverknüpfung
vorliegt.
-
Weitere
Veränderungen,
die Fachleuten bekannt sind, um Affinitätswechselwirkungen zu beeinflussen oder
zu untersuchen, beinhalten, sind jedoch nicht begrenzt auf, beispielsweise
Austausch von Leucin durch andere hydrophobe Aminosäuren wie
beispielsweise Isoleucin, Valin, Alanin oder Glyzin; Austausch saurer Aminosäuren oder
basischer Aminosäuren;
Austausch von Histidin durch Phenylalanin, um die Auswirkung von
Ladung gegenüber
Raumbedarf zu bestimmen; Austausch von Asparagin durch Aspartat,
oder Glutamin durch Glutamat, um die Auswirkung von Ladung gegenüber Raumbedarf
abzuschätzen;
und Austausch von Serin durch Threonin, Threonin durch Cystein,
Aspartat durch Glutamat, Arginin durch Lysin oder Histidin, und Tyrosin
durch Tryptophan oder Phenylalanin. Die in die flankierenden Sequenzen
eingebrachten Veränderungen
wurden durchgeführt,
um das Peptid weniger basisch oder hydrophob zu machen.
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Beispiel 3
-
Dieses
Beispiel zeigt die Prävention
und/oder Hemmung von Nekrose von lebendem Gewebe (in vivo) durch
Verabreichung eines Segments von NTP oder eines Homologons, einer
Variante, eines Mimetikums oder Derivats davon, welches NTP bindet,
zu Gewebe, das NTP enthält.
-
AD7C-NTP
wurde wie oben in Beispiel 1 beschrieben erhalten. Die Harlil-Sequenzen
NTP-1, NTP-3 und NTP-7 wurden gemäß obigem Beispiel 2 hergestellt
und in diesem Beispiel verwendet.
-
Rekombinante
Proben von AD7C-NTP mit 100 ng/mL–10 μg/mL wurden bei Raumtemperatur
für 5 Minuten
für eine
Stunde mit den zuvor genannten Harlil-Sequenzen inkubiert und anschließend in
Ratten, wie in Beispiel 1 beschrieben, injiziert.
-
Alternativ
wurde eine Lösung
der Harlil-Sequenz in Konzentrationen im Bereich von 1 Mikrogramm/mL bis
1 Milligramm/mL hergestellt. Lösungen,
welche das rekombinante AD7C-NTP enthalten, wurden ebenfalls wie
oben beschrieben hergestellt, wobei die Harlil-Sequenz nicht hinzugefügt wurde.
Den Tieren wurden etwa 100 Mikroliter der AD7C-NTP-Lösung und
zusätzlich
etwa 100 Mikroliter der Harlil-Sequenz injiziert.
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Die
Tiere wurden für
24 Stunden beobachtet und nach 24 Stunden schmerzfrei getötet. Die
24 einzelnen Infiltrationsfoci wurden herausgeschnitten, in 10%-igem
Formalin fixiert, in Paraffin eingebettet und angefärbt und
mittels histopathologischer Standardverfahren untersucht.
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In ähnlichen
Gruppen von Kontrollratten wurde (1) AD7C-NTP allein wie in Beispiel
1 beschrieben, (2) Rinderserumalbumin in Saline, (3) normales humanes
Serum und (4) physiologische Saline injiziert und die Ratten wurden
wie oben untersucht und getötet,
wobei die herausgeschnittenen Injektionsfoci wie oben behandelt
wurden.
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Die
Kontrollinjektionen von AD7C-NTP allein erzeugten wie in Beispiel
1 beschrieben Gewebenekrose. Kontrollinjektionen von Rinderserumalbumin
(BSA), normalem humanem Serum und physiologischer Saline zeigten
jeweils keinerlei Anzeichen für
Nekrose oder Zellverlust. Die obigen Kontrollinjektionen wiesen
geringe bis minimale akute Entzündung
und fokale Mikrohämorrhagen
von den Nadeln auf.
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Die
AD7C-NTP-Proben, welche zusammen mit jeder der Harlil-Sequenzen
NTP-1, NTP-3 und NTP-7 injiziert wurden, zeigten eine über 95%-ige
Verringerung der Gewebenekrose im Vergleich zu den Kontrollproben,
in welche AD7C-NTP allein injiziert wurde. Es lagen gelegentliche
fokale Knoten inflammatorischer Zellfoci mit einer Mikroknotenbildung
vor, bei denen es sich möglicherweise
um die Aggregation von AD7C-NTP und der Harlil-Sequenz handelt.
Die Gewebeverletzung wurde durch die Verabreichung des Segments
von NTP (oder der Harlil-Sequenz) insgesamt um > 95% verringert im Vergleich zu Kontrollen,
in welche nur AD7C-NTP injiziert wurde.