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Querverweis auf verwandte Anmeldung:
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Diese
Anmeldung nimmt die Priorität
der am 18. November 2002 eingereichten Anmeldung in den Vereinigten
Staaten mit der Nr. 60/427,682 in Anspruch, auf die hier in ihrer
Gesamtheit Bezug genommen wird.
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Gebiet der Erfindung
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Die
Erfindung betrifft ein paralytisches Peptid für die neuromuskuläre Therapie
und andere Verwendungen, welche die Unterbrechung neuromuskulärer Mechanismen
erfordern.
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Hintergrund der Erfindung
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Spitzmäuse sind
eine sehr altertümliche
Gruppe primitiver Säuger,
die am meisten den Proto-Säugern ähneln. Sie
sind mit Nagetieren, die sich aus einer anderen Gruppe von Säugern entwickelten,
nicht nahe verwandt. Gemäß Dufton
(1992) sind die bekannten giftigen Arten der Spitzmäuse: die
Nördliche
Kurzschwanzspitzmaus (Blarina brevicauda), der Haiti-Schlitzrüssler (Solenodon
paradoxus), die Europäische
Wasserspitzmaus (Neomys fodiens) und die Sumpfspitzmaus (Neomys
anomalous). Eine weitere giftige Spitzmaus ist die Südliche Kurzschwanzspitzmaus
(Blarina carolinensis). Es wurde weiterhin vorgeschlagen, dass der
Kubanische Schlitzrüssler
(Apotogale cubanus) und die Amerikanische Spitzmaus (Sorex cinereus)
giftig sein könnten.
Die Nördliche
Kurzschwanzspitzmaus (Blarina brevicauda) und ihre nah verwandten
Arten verwenden ein paralytisches Gift in ihrem Speichel, um Insekten,
andere invertebraten (Würmer,
Anneliden usw.), nistende Vögel
und kleine Säuger
zu paralysieren, welche sie dann lebend als spätere Nahrung in ihrem Bau aufbewahren
(Martin 1981; George et al. 1986; Dufton 1992).
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Die
Literatur über
Spitzmausgift besteht im Allgemeinen aus sieben Artikeln aus den
1940ern und 1950ern und einer MA-Arbeit aus dem Jahr 1966 [Christenbury
1966]. Diese sind in einem Übersichtsartikel zusammengefasst
[Dufton 1992]. Unter Verwendung eines Roh-Präzipitats von Spitzmaus-Speicheldrüsen mit Ammoniumsulfat
folgerten Ellis und Krayer (1955), dass das aktive Agens vermutlich
ein Protein sei, und aufgrund seines Unvermögens zur Dialyse ein größeres Protein.
Ein wesentlicher Beitrag der Arbeit von Ellis und Krayer bestand
darin, Aktivität
bei Katzen, Hunden, Mäusen,
Ratten, Meerschweinchen und Kaninchen zu zeigen. Christenbury [1966]
zeigte, dass die Präparation
von Ellis und Krayer den Sauerstoffverbrauch von Mäuseniere
und Leberschnitten stoppte. Eine japanische Patentanmeldung (
JP 10-236936 ; 1998) scheint
einen alkoholischen Extrakt aus Speicheldrüsen von zwei Spitzmausarten
(Sorex unguiculatus & Sorex
shinto saevus) als Kalziumkanal-Blocker und dessen Verwendung als
Hypotonikum zu offenbaren. Die Reinheit ist gering – der Extrakt
umfasst alle Verbindungen, die sich in 70% Ethanol lösen würden.
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Es
liegt keine Information über
das verantwortliche aktive Molekül
(die verantwortlichen aktiven Moleküle) in dem unbekannten Verbindungsgemisch
vor.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
paralytische Verbindung des Speichels der Spitzmaus blieb bisher
unbekannt. Die Erfinder isolierten und reinigten eine paralytische
Verbindung auf, welche die in 1A (SEQ
ID NO:1) oder 1B (SEQ ID NO:2) gezeigte Sequenz
aufweist. Während
eine Fraktion mit hohem Molekulargewicht paralytisch wirkt, zeigen
die Erfinder weiterhin, dass das aktive Molekül nicht ein großes Protein
ist, sondern unerwarteterweise ein kleines Peptid, das in einem
großen
Komplex vieler Proteine gebunden ist (3, Spur
1). Die Erfindung betrifft ein Peptid niedrigen Molekulargewichts
(oder optional eine Folge verwandter Peptide), die vorzugsweise
aus den Unterkiefer-Speicheldrüsen
von Spitzmäusen
einer Art wie beispielsweise Blarina als paralytisches Agens isoliert
und aufgereinigt sind. Das gesamte Peptid oder ein Teil davon oder
ein Pro-Peptid als dessen Vorläufer
kann weiterhin über
rekombinante DNA-Methoden oder in vitro oder in vivo-Peptidsynthese hergestellt
werden. Dieses neue paralytische Agens ist brauchbar als neuromuskulärer Blocker.
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Wie
oben erwähnt,
ist der aktive Inhaltsstoff ein in einer ungewöhnlichen und unerwarteten Kombination
mit einem großen
Proteinkomplex isoliertes kleines Peptid. Bekannte Speichelpeptide
von Säugern
(z. B. vasoaktives intestinales Polypeptid & Glucagon-ähnliches Peptid 1 [Pohl & Wank 1998]) wären keine
Verunreinigungen, da sie mit inaktiven Molekülen niedrigen Molekulargewichts
während
des Aufreinigungsprotokolls verworfen würden. Die erfindungsgemäße Präparation
ist von großer
Reinheit und kann aus einer unerwarteten subzellulären Quelle
extrahiert werden.
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Die
Erfinder der vorliegenden Erfindung isolierten und reinigten neue
Proteine aus den Unterkiefer-Speicheldrüsen von Spitzmäusen auf.
Gemäß einer
Ausführungsform
der Erfindung wird ein isoliertes und gereinigtes Spitzmaus-Speichelpeptid
bereitgestellt. In einer spezifischen Ausführungsform weist das isolierte und
gereinigte Spitzmaus-Speichelpeptid die in 1A oder 1B gezeigte
Aminosäuresequenz
auf. Die Erfindung umfasst Verfahren zur Isolierung einer paralytischen
Verbindung aus der Speicheldrüse
von giftigen Spitzmäusen
oder aus Speichel der Spitzmaus, die das Bereitstellen der Drüse oder
des Speichels, die Isolierung der paralytischen Verbindung aus der
Drüse oder
dem Speichel und optional die Aufreinigung der Verbindung umfassen.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch eine pharmazeutische Zusammensetzung
oder eine kosmetische Zusammensetzung bereit, die das isolierte
und aufgereinigte Spitzmaus-Speichelpeptid
umfasst, und die Verwendung des Peptids als pharmazeutische Substanz, neuromuskulären Blocker
oder als Analgetikum. Die Erfindung betrifft noch weiterhin die
Verwendung des isolierten und gereinigten Spitzmaus-Speichelpeptids
zur Behandlung von Migräne,
Myofacialschmerz oder anderen Arten von Schmerz, Muskeltremor, neuromuskulären Erkrankungen, übermäßigem Schwitzen
und Falten.
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Die
Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Vorbeugung oder
zur Behandlung von Migränen, Myofacialschmerz
oder anderen Arten von Schmerz, Muskeltremor, neuromuskulären Erkrankungen
und übermäßigem Schwitzen
in einem Säuger,
welches die Verabreichung eines isolierten und gereinigten Spitzmaus-Speichelpeptids,
beispielsweise in einer pharmazeutischen Zusammensetzung, an den
Säuger
umfasst. Der Säuger
ist vorzugsweise ein Mensch. Die Erfindung betrifft weiterhin ein
Verfahren zur Analgetisierung oder neuromuskulären Blockierung in einem Säuger, wobei
man einem Säuger
eine pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht, welche das isolierte
und gereinigte Spitzmaus-Speichelpeptid umfasst. Die Erfindung betrifft
weiterhin ein Verfahren zur Vorbeugung oder Verringerung von Falten
in einem Säuger,
wobei man dem Säuger
das isolierte und gereinigte Spitzmaus-Speichelpeptid verabreicht,
beispielsweise in einer kosmetischen Zusammensetzung.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des isolierten und gereinigten
Spitzmaus-Speichelpeptids für
die Herstellung von Antikörpern,
einschließlich
polyklonaler Antikörper,
monoklonaler Antikörper
oder funktionaler Fragmente davon. Die Erfindung betrifft weiterhin
die auf diese Weise hergestellten Antikörper.
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Die
Erfindung betrifft weiterhin noch ein Verfahren zur Bestimmung der
Stärke
eines paralytischen Agens durch Verabreichung des paralytischen
Agens an einen Mehlwurm oder ein anderes Insekt; die Bestimmung
der Zeit bis zum Beginn der Paralyse und/oder die Dauer der Paralyse;
wobei die Zeit für
den Beginn der Paralyse umgekehrt proportional zur Stärke des
paralytischen Agens und die Dauer der Paralyse proportional zur
Stärke
des paralytischen Agens ist.
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Weitere
Merkmale und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden aus der
nachfolgenden detaillierten Beschreibung ersichtlich. Während jedoch
die detaillierte Beschreibung und die spezifischen Beispiele bevorzugte
Ausführungsformen
der Erfindung zeigen, dienen sie nur der Veranschaulichung, da für den Fachmann aus
der detaillierten Beschreibung verschiedene Veränderungen und Modifikationen
ersichtlich werden, die im Rahmen und im Schutzumfang der Erfindung
liegen.
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Kurze Beschreibung der Zeichnungen
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Diese
und weitere Merkmale der Erfindung werden in größerem Maße offenkundig werden aus der nachfolgenden
Beschreibung, in der auf die beigefügten Zeichnungen Bezug genommen
wird, in denen Folgendes gezeigt wird:
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1. Aminosäuresequenzen von isoliertem
und gereinigtem Spitzmaus-Speichelprotein: A. (SEQ ID NO:1); B.
(SEQ ID NO:2)
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2.
Größenausschlusschromatographie
eines Extrakts aus der Glandula submaxillaris der Spitzmaus mit
bioaktiven Fraktionen, die durch Schraffierung angezeigt sind.
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3.
SDS-PAGE-Analyse von Extrakt aus der Glandula submaxillaris der
Spitzmaus. Der kleine aktive Bestandteil liegt als Teil eines Komplexes
mit sehr hohem Molekulargewicht vor.
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4.
Erstes HPLC-Elutionsprofil einer aktiven Fraktion.
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5.
Zweites HPLC-Elutionsprofil einer aktiven Fraktion.
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6.
SDS-PAGE-Gel von sowohl bukkalem Speichel- als auch submaxillarem
Homogenisat, das auf Glykoproteine gefärbt ist.
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7.
Coomassie-Färbung
eines SDS-PAGE-Gels von sowohl bukkalem Speichel- als auch submaxillarem
Homogenisat.
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8.
Kapillar-Elektrophoretogramm des isolierten und gereinigten Spitzmaus-Speichelpeptids in
Natriumboratpuffer.
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9.
Kapillar-Elektrophoretogramm des isolierten und gereinigten Spitzmaus-Speichelpeptids.
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10.
Ultraviolettspektrum des isolierten und gereinigten Spitzmaus-Speichelpeptids.
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11.
MALDI-TOF-Massenspektrum des isolierten und gereinigten Spitzmaus-Speichelpeptids.
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12.
Kartierung der Peptidmassen von tryptischen Peptiden des isolierten
und aufgereinigten Spitzmaus-Speichelpeptids.
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13.
Ergebnisse einer MASCOT-Suche der MS/MS-Daten aus der HPLC-ESI-Q-TOF-Analyse.
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14.
Mehlwürmer
unmittelbar nach der Injektion und mit vollständiger Paralyse.
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Detaillierte Beschreibung der Erfindung
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Die
Erfindung umfasst die Isolierung und Reinigung eines paralytischen
Peptidagens aus Spitzmaus-Speicheldrüse oder -Speichel („PS-Peptid” oder Soricidin
genannt). Das Peptid weist vorzugsweise 54 Aminosäuren und
die in 1A (SEQ ID NO:1) oder 1B (SEQ
ID NO:2) gezeigte Sequenz auf. Das Peptid kann aus jeder beliebigen Spitzmaus
mit paralytischer Aktivität
in ihrem Speichel isoliert werden, beispielsweise den Spitzmausarten
Blarina, Neomys und Sorex. Die Erfindung umfasst weiterhin einen
Bioassay unter Verwendung des gewöhnlichen Mehlwurms oder eines
anderen Insekts zur schnellen Beurteilung von paralytischer Bioaktivität. Beispielsweise
zeigt der Bioassay, dass dem Mehlwurm verabreichter paralytischer
Speichel diesen wenigstens sieben Tage lang paralysiert, aber am
Leben erhalten kann. Das Toxin ist sehr stark; in Dosis-Wirkungs-Untersuchungen führt eine
Injektion von 10 Mikrolitern 20% (Gew./Vol.) Drüsenrohextrakte in weniger als
1 Sekunde zu totaler Paralyse, während
bei 10% für
eine totale Paralyse 10 Sekunden benötigt werden. Die Probe von
10 Mikrolitern stellte etwa 8 Mikrogramm an gesamtem löslichem
extrahiertem Protein dar (0,8 mg/mL Extrakt, 0,010 mL davon injiziert
= 0,008 mg = 8 Mikrogramm gesamtes lösliches Protein). Davon stellt
das Peptid (beurteilt anhand der Gelfärbungsdichte) etwa 1/10 des
Proteins im gesamten Extrakt dar (ganz rechte Spur des Gel-Bildes).
Dementsprechend stellt das tatsächlich
injizierte Peptid etwa 0,8 Mikrogramm an Material oder 800 Nanogramm
dar. Unter Verwendung des Bioassays und verschiedener chromatographischer
Methoden isolierten die Erfinder ein Peptid (Peptide) mit einem
Molekulargewicht von etwa 6000 (SDS-PAGE), das paralytische Aktivität aufweist.
Unerwarteterweise liegt der kleine aktive Bestandteil als Teil eines
Multiprotein-Komplexes mit sehr hohem Molekulargewicht vor (2; 3,
Spur 1), wobei das Molekulargewicht des Komplexes etwa 600.000 Dalton
betrug. Es erschien in einer Hohlraumvolumen-Fraktion einer Größenausschlusssäule (Sephadex
G-200), die eine Molekulargewichtsausschlussgrenze von 600.000 Dalton
aufweist. Nach Aufreinigung erscheint der Komplex als eine einzelne
Bande auf dem Gel (3, Spur 2). Die Peptidsequenz
ist über
bekannte Techniken leicht zu erhalten, beispielsweise dem üblichen
sequenziellen Edman-Abbau (P. Edman und G. Begg. 1967, Eur. J. Biochem.
1: 80–91.
H. D. Niall, 1973. Methods Enzymol. 27: 942–1010) und massenspektroskopischer
Sequenzbestimmung.
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Die
Erfindung umfasst dementsprechend ein Verfahren zur Isolierung und
Sequenzierung eines paralytischen Spitzmaus-Peptids durch Isolierung
des Peptids wie in dieser Anmeldung beschrieben und Sequenzierung
des Peptids. Die Sequenz des isolierten und gereinigten Spitzmaus-Speichelpeptids
ist in 1A (SEQ ID NO:1) oder 1B (SEQ
ID NO:2) gezeigt, und die Erfindung umfasst Varianten der hier beschriebenen
Sequenzen. Zwei bevorzugte Verfahren werden für die Isolierung des Proteins
verwendet: i) Größenausschluss-
und Ionenaustauschchromatographie und ii) Zentrifugation durch Membranen
mit bestimmten Molekulargewichtsausschlussgrenzen: vorzugsweise
Centricons von Amicon mit Molekulargewichtsausschlussgrößen von
100.000, 10.000 und 3.000, weitere Verfahren sind ebenfalls brauchbar.
Das erste Verfahren ermöglicht
die Trennung des komplexierten Agens (sehr hochmolekulare Fraktionen),
von wo ein freies Peptid mit einem Molekulargewicht von 6.000 normalerweise
aus der Größenausschlusschromatographiesäule eluieren
würde.
Die Ionenaustauschchromatographie-Protokolle verwendeten einen Anionenaustauscher eines
Natriumphosphatpuffers bei neutralem pH. Das Peptid ist stark an
den Komplex gebunden (es wird durch erhöhte Ionenstärke nicht dissoziiert) und
wird vorzugsweise einer Behandlung mit Natriumdodecylsulfat (SDS)
oder mit wässrigem
Ethanol unterworfen, um es von dem Komplex abzudissoziieren. Jeder
beliebige kurzkettige Alkohol (vorzugsweise C1 bis C6, besonders
bevorzugt C2 oder C3), wie beispielsweise Isopropylalkohol, Propanol
oder Butanol kann anstelle von Ethanol verwendet werden. Es scheint
so zu sein, dass das bioaktive Peptid in der Speicheldrüse in komplexiertem
Zustand gehalten wird, bis es als eine aktive Form in den Speichel
freigesetzt wird. Das Peptidisolat reagiert schwach mit Clellands-Reagens,
was das Vorliegen von Sulfhydrylgruppen und der Aminosäure Cystein
anzeigt, obwohl vernünftigerweise
anzunehmen ist, dass diese als Disulfhydrylbindungen vorliegen.
Die Peptidpräparation
zeigte weiterhin ein Absorptionsvermögen bei 280 nm, was das Vorliegen
von aromatischen Aminosäuren
anzeigt. Die Peptidpräparation
zeigte insbesondere eine schwache Absorption bei 280 nm, jedoch
eine stärkere
Absorption bei 260 nm, was auf Phenylalanin hinweist, jedoch nicht
auf Tyrosin und Tryptophan. 14 zeigt
Mehlwürmer
unmittelbar nach der Injektion und mit totaler Paralyse.
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Das
Peptid kann, wie unten beschrieben, modifiziert werden, um Varianten
des paralytischen Peptids mit unterschiedlicher paralytischer Potenz
herzustellen. Einige Varianten, die über dieses Verfahren entwickelt werden,
werden die Fähigkeit
aufweisen, als kompetitive Inhibitoren (z. B. Gegengifte) hinsichtlich
einer Paralyse zu wirken, die sich in Antwort auf ein erfindungsgemäßes Peptid
entwickelt hat.
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Erfindungsgemäße Peptide
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Durch
die Erfindung wird ein isoliertes PS-Peptid bereitgestellt. Der
Begriff „PS-Peptid" umfasst hier die
in 1A (SEQ ID NO:1) oder 18 (SEQ
ID NO:2) gezeigten Peptide, Homologe, Analoga, Mimetika, Fragmente
oder Derivate des PS-Peptids.
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Gemäß einer
Ausführungsform
besteht das isolierte PS-Peptid aus 54 Aminosäureresten und weist die in 1A (SEQ
ID NO:1) oder 1B (SEQ ID NO:2) gezeigte Sequenz
auf. Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
umfasst das PS-Peptid Sequenzen, die im Wesentlichen identisch zu
den oben angegebenen Peptiden sind oder offensichtliche chemische Äquivalente
davon umfassen. Sie umfasst auch Peptidsequenzen mit zusätzlichen
oder fehlenden Aminosäuren
am Amino- und/oder Carboxy-Terminus der oben angegebenen PS-Peptid-Sequenzen.
Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
umfasst die Erfindung Fusionsproteine, die das PS-Peptid, markierte
PS-Peptide, Analoga, Homologe und Varianten davon umfassen.
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Im
Rahmen der vorliegenden Erfindung kann ein erfindungsgemäßes Peptid
verschiedene strukturelle Formen des primären PS-Peptids umfassen, die
eine biologische Aktivität
beibehalten. Beispielsweise kann ein erfindungsgemäßes Peptid
in der Form saurer oder basischer Salze oder in neutraler Form vorliegen.
Darüber
hinaus können
einzelne Aminosäurereste
durch Oxidation oder Reduktion modifiziert sein.
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Zusätzlich zur
Aminosäuresequenz
voller Länge
kann das erfindungsgemäße Peptid
auch Verkürzungen,
Analoga und Homologe des Peptids und Verkürzungen davon, wie hier beschrieben,
umfassen. Verkürzte Peptide
oder Fragmente können
Peptide von wenigstens 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 oder 50
Aminosäuren oder
mehr Aminosäureresten
der oben angegebenen Sequenz umfassen. Brauchbare Fragmente umfassen weiterhin
beispielsweise 50–54,
45–50,
45–52,
44–55,
42–54,
40–54,
35–45
oder 25–35
Aminosäuren.
Brauchbare Fragmente sind in der Lage, eine Analgetisierung oder
eine neuromuskuläre
Blockierung bereitzustellen. Die Aminosäuren Nr. 42–54, 40–54, 38–54 und 45–54 sind Beispiele für brauchbare
Fragmente.
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Durch
die Erfindung werden weiterhin Polypeptide bereitgestellt, die wenigstens
eine funktionale Domäne
oder wenigstens eine antigene Determinante eines PS-Peptids umfassen.
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Analoga
des erfindungsgemäßen Proteins
und/oder von Verkürzungen
davon, wie hier beschrieben, können,
ohne darauf beschränkt
zu sein, eine Aminosäuresequenz
umfassen, die eine oder mehr Aminosäuresubstitutionen, -insertionen,
-deletionen und/oder -mutationen umfassen. Aminosäuresubstitutionen
können konservierter
oder nicht-konservierter
Natur sein. Konservierte Aminosäuresubstitutionen
umfassen den Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren der
erfindungsgemäßen Peptide
durch Aminosäuren ähnlicher
Ladungs-, Größen- und/oder
Hydrophobizitätscharakteristika.
Wenn nur konservierte Substitutionen vorgenommen werden, sollten
die erhaltenen Analoga funktional äquivalent sein. Nicht-konservierte
Substitutionen umfassen den Austausch einer oder mehrerer Aminosäuren der
Aminosäuresequenz
durch eine oder mehrere Aminosäuren,
die abweichende Ladungs-, Größen- und/oder
Hydrophobizitätscharakteristika
aufweisen.
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In
die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen
können
eine oder mehrere Aminosäureinsertionen eingeführt werden.
Aminosäureinsertionen
können
aus einzelnen Aminosäureresten
oder sequenziellen Aminosäuren
bestehen, die beispielsweise von Aminosäuren mit einer Länge von
2 bis 15 reichen. Beispielsweise können Aminosäureinsertionen verwendet werden,
um Zielsequenzen zu zerstören,
so dass das Peptid nicht länger
aktiv ist. Diese Vorgehensweise kann verwendet werden, um die Aktivität des erfindungsgemäßen Peptids
zu inihibieren.
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Deletionen
können
aus dem Entfernen einer oder mehrerer Aminosäuren, oder diskreter Teile
der Aminosäuresequenz
des PS-Peptids bestehen. Die deletierten Aminosäuren können zusammenhängend oder nicht
zusammenhängend
sein.
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Analoga
eines erfindungsgemäßen Proteins
können
hergestellt werden durch Einführen
von Mutationen in die das Peptid kodierende Nukleotidsequenz. Mutationen
in Nukleotidsequenzen, die für
die Expression von Analoga eines erfindungsgemäßen Proteins konstruiert sind,
müssen
zur Beibehaltung des Leserahmens der kodierenden Sequenzen führen. Darüber hinaus
erzeugen die Mutationen vorzugsweise keine komplementären Regionen,
die unter Bildung sekundärer
mRNA-Strukturen, wie beispielsweise Loops und Haarschleifen, welche
die Translation der mRNA nachteilig beeinflussen könnten, hybridisieren
könnten.
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Mutationen
können
an bestimmten Stellen durch Synthetisieren von Oligonukleotiden
eingeführt
werden, die eine mutierte Sequenz enthalten, welche flankiert ist
von Restriktionsstellen, welche eine Ligation mit Fragmenten der
nativen Sequenz ermöglichen.
Nach der Ligation kodiert die umkonstruierte Sequenz ein Analogon
mit der gewünschten
Aminosäureinsertion,
-substitution oder – deletion.
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Alternativ
können
Oligonukleotid-gerichtete ortsspezifische Mutageneseverfahren verwendet
werden, um ein verändertes
Gen mit bestimmten veränderten
Codons gemäß der erforderlichen
Substitution, Deletion oder Insertion bereitzustellen. Eine Deletion
oder Verkürzung
eines erfindungsgemäßen Peptids
kann weiterhin durch Verwenden geeigneter Restriktionsendonukleaseschnittstellen
benachbart zur gewünschten
Deletion konstruiert werden. Nach der Restriktion können überhängende Enden
aufgefüllt
und die DNA religiert werden. Beispielhafte Methoden zur Durchführung der
oben angegebenen Veränderungen
sind veröffentlicht
in Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Aufl.,
Cold Spring Harbor Laborstory Press, 1989).
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Darüber hinaus
können
Analoga eines erfindungsgemäßen Proteins
hergestellt werden über
chemische Synthese unter Verwendung von Techniken, die in der Proteinchemie
allgemein bekannt sind, beispielsweise die Festphasensynthese (Merrifield,
1964, J. Am. Chem. Assoc. 85: 2149–2154) oder die Synthese in homogener
Lösung
(Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, Hrsg. E. Wansch,
Bd. 15 I und II, Thieme, Stuttgart). Die erfindungsgemäßen Peptide
umfassen auch Peptide mit Sequenzidentität zum PS-Peptid, mutierte PS-Peptide
und/oder Verkürzungen
davon, wie hier beschrieben. Solche Peptide weisen Aminosäuresequenzen
auf, die Nukleinsäuresequenzen
entsprechen, die unter stringenten Hybridisierungsbedingungen (siehe
die Diskussion hier hinsichtlich stringenter Hybridisierungsbedingungen)
mit einer Sonde hybridisieren, die verwendet wird, um ein erfindungsgemäßes Peptid
zu erhalten. Peptide mit Sequenzidentität weisen oft die Regionen auf,
die Charakteristika des Proteins darstellen.
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Peptide
weisen vorzugsweise eine Aminosäuresequenz
mit wenigstens 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, vorzugsweise
80–95%
oder mehr Identität
zu den Aminosäuresequenzen
des PS-Peptids auf. Die Verbindung weist optional eine Reinheit
mit pharmazeutischem Grad auf (z. B. für Aminosäuren bedeutet dies optional
mehr als 99% Reinheit, mit einer einheitlichen kristallinen Struktur,
und einer weißen
Farbe). Besonders bevorzugt wird Sequenzidentität beurteilt durch eine fortgeschrittene
Suche mit dem Programm BLAST Version 2.1 (Parameter wie oben; Altschul,
S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990) „Basic
local alignment search tool." J.
Mol. Biol. 215: 403–410).
BLAST ist eine Serie von Programmen, die online verfügbar sind
unter http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST. Die fortgeschrittene BLAST-Suche (http://www.ncbi.nim.nih.gov/blast/.cgi?Jform
= 1) ist auf Standardparameter eingestellt. (d. h. Matrix BLOSUM62;
Kosten für
das Vorliegen einer Lücke
11; Kosten für
eine Lücke
pro Rest 1; Lambda-Verhältnis 0,85
standardmäßig).
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Die
Erfindung umfasst weiterhin Isoformen der erfindungsgemäßen Peptide.
Eine Isoform enthält
dieselbe Anzahl und Art von Aminosäuren wie ein erfindungsgemäßes Peptid,
jedoch weist die Isoform eine unterschiedliche dreidimensionale
molekulare Struktur auf. Die Isoformen im Rahmen der vorliegenden
Erfindung sind solche, welche die gleichen Eigenschaften wie ein
erfindungsgemäßes Peptid,
wie hier beschrieben, aufweisen.
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Die
vorliegende Erfindung umfasst weiterhin ein erfindungsgemäßes Protein,
das mit einem ausgewählten
Protein, oder einem selektierbaren Markerprotein, unter Herstellung
von Fusionsproteinen konjugiert ist. Beispielsweise kann die cDNA-Sequenz
für das
PS-Peptid in einen
Vektor insertiert werden, der eine Nukleotidsequenz enthält, die
ein weiteres Peptid kodiert (z. B. GST-Glutathion Succinyltransferase).
Das Fusionsprotein wird exprimiert und aus prokaryotischen (z. B.
Bakterien- oder Baculovirus-) oder eukaryotischen Zellen gewonnen.
Das Fusionsprotein kann anschließend über Affinitätschromatographie auf der Grundlage der
Fusionsvektorsequenz aufgereinigt und das PS-Peptid über enzymatische
Spaltung des Fusionsproteins gewonnen werden.
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Ein
alternatives Verfahren zur Herstellung des Proteins besteht in der
Benutzung eines Poly-Histidin-Tags. Die cDNA-Sequenz wird so gestaltet,
dass sie einen Poly-Histidin-Tag
am N-terminalen Ende aufweist. Das Protein wird in prokaryotischen
oder eukaryotischen Zellen exprimiert und anschließend einfach
unter Verwendung einer Nickel-Affinitätssäule isoliert.
Das Poly-Histidin (üblicherweise
6 Histidine) adsorbiert stark an das an die Affinitätssäule gebundene
Nickel, während
nichts anderes stark bindet. Das mit einem „His-Tag" versehene Peptid wird durch Waschen
der Säule
mit Imidazol isoliert.
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Die
erfindungsgemäßen Proteine
(einschließlich
Verkürzungen,
Analoga, usw.) können
unter Verwendung rekombinanter DNA-Methoden hergestellt werden.
Dementsprechend werden erfindungsgemäße Nukleinsäuremoleküle mit einer Sequenz, die ein
erfindungsgemäßes Peptid
kodiert, unter Verwendung bekannter Technologien isoliert und über dem
Fachmann bekannte Vorgehensweisen in einen geeigneten Expressionsvektor
eingebaut, der eine gute Expression des Peptids sicherstellt. Die
cDNA wird vorzugsweise erhalten über Reverse
Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR). Die Technologie wird in Form eines
Kit bereitgestellt. Man isoliert die Boten-RNA, die das Peptid kodiert,
und verwendet anschließend
Reverse Transkriptase, um die gesamte Boten-RNA in einem Gewebeextrakt
in cDNA-Kopien umzuwandeln. Anschließend amplifiziert man die klonierte
DNA über übliche PCR
unter Verwendung eines Primers, der so synthetisiert ist, dass er
einem Segment des Peptids entspricht. Die RACE-Technik ist brauchbar,
um das volle mRNA-Transkript zu erhalten, da es für eine Serie
von Peptiden kodiert, die anschließend gespalten werden, nachdem
ein größeres Protein,
das sie alle enthält,
synthetisiert ist. Expressionsvektoren umfassen, ohne darauf beschränkt zu sein,
Cosmide, Plasmide oder modifizierte Viren (z. B. replikationsdefekte
Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren), solange der
Vektor zur verwendeten Wirtszelle kompatibel ist. Der Begriff „für die Transformation
einer Wirtszelle geeignete Vektoren" bedeutet, dass die Expressionsvektoren
ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül und auf
der Grundlage der für
die Expression zu verwendenden Wirtszellen ausgewählte regulatorische
Sequenzen enthalten, die mit dem Nukleinsäuremolekül operativ verknüpft sind. „Operativ
verknüpft" bedeutet, dass die
Nukleinsäure
mit regulatorischen Sequenzen auf eine Weise verknüpft ist, die
eine Expression der Nukleinsäure
ermöglicht.
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Die
Erfindung umfasst somit einen erfindungsgemäßen rekombinanten Expressionsvektor,
der ein erfindungsgemäßes Nukleinsäuremolekül, oder
ein Fragment davon, und die erforderlichen regulatorischen Sequenzen
für die
Transkription und Translation der insertierten Peptidsequenz enthält. Geeignete
regulatorische Sequenzen sind optional abgeleitet aus einer Vielzahl
von Quellen, einschließlich
bakteriellen, Pilz- oder viralen Genen (siehe beispielsweise die
regulatorischen Sequenzen, die beschrieben sind in Goeddel, Gene
Expression Technology: Methods in Enzymology 185, Academie Press,
San Diego, CA (1990)). Die Auswahl geeigneter regulatorischer Sequenzen
hängt ab
von der ausgewählten
Wirtszelle und kann vom Durchschnittsfachmann auf dem Gebiet auf
einfache Weise bewerkstelligt werden. Beispiele für solche
regulatorischen Sequenzen umfassen: einen transkriptionellen Promotor
und Enhancer oder eine RNA-Polymerase- Bindungssequenz, eine ribosomale Bindungssequenz,
einschließlich
eines Translationsinitiierungssignals. Darüber hinaus können in
Abhängigkeit
von der gewählten
Wirtszelle und dem verwendeten Vektor weitere Sequenzen in den Expressionsvektor
eingebaut sein, beispielsweise ein Replikationsursprung, zusätzliche
DNA-Restriktionsschnittstellen,
Enhancer, und Sequenzen, welche die Induzierbarkeit der Transkription
vermitteln. Es ist weiterhin ersichtlich, dass die erforderlichen
regulatorischen Sequenzen durch die ursprüngliche Verbindung und/oder
deren flankierende Regionen bereitgestellt werden können.
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Durch
die Erfindung wird weiterhin ein rekombinanter Expressionsvektor
bereitgestellt, der ein erfindungsgemäßes DNA-Nukleinsäuremolekül umfasst,
welches in einer Antisense-Orientierung in den Expressionsvektor
kloniert ist. Diese Vektoren sind brauchbare experimentelle Systeme,
um die erfindungsgemäßen Peptide
oder deren Varianten zu untersuchen oder um Gegengifte zu testen.
Die Peptide können
für die
Wirtszellen toxisch oder nicht-toxisch sein. Sie sind weiterhin
brauchbar für
die Herstellung großer
Mengen des Peptids. Die Vektoren sind insbesondere brauchbar, da
insektenspezifische biologische Transportagenzien (z. B. Viren)
immobilisierende Agenzien für
gezielt anvisierte Insekten bereitstellen. Viren, die gegen einen
spezifischen Insektenschädling
gerichtet sind, werden so konstruiert, dass sie das für das paralytische
Peptid kodierende Genfragment zusammen mit Expression regulierenden
Sequenzen enthalten. Der Virus würde
auf eine Insektenart abzielen und anschließend, während er sich selbst reproduziert,
auch das Peptid herstellen. Es können
operativ mit der Antisense-Nukleinsäure verknüpfte regulatorische
Sequenzen ausgewählt
werden, welche die kontinuierliche Expression der Antisense-RNA-Moleküle steuern.
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Die
erfindungsgemäßen rekombinanten
Expressionsvektoren können
weiterhin ein selektierbares Markergen enthalten, das die Selektion
der mit einem rekombinanten erfindungsgemäßen Molekül transformierten oder transfizierten
Wirtszellen erleichtert. Beispiele für selektierbare Markergene
sind Gene, die ein Protein wie beispielsweise G418 und Hygromycin
kodieren, welches Resistenz gegenüber bestimmten Wirkstoffen
verleiht, β-Galactosidase, Chloraphenicol-Acetyltransferase
oder Glühwürmchen-Luciferase.
Die Transkription des selektierbaren Markergens wird überwacht über Änderungen
der Konzentration des selektierbaren Markerproteins wie beispielsweise β-Galactosidase,
Chloramphenicol-Acetyltransferase oder Glühwürmchen-Luciferase. Wenn das
selektierbare Markergen ein Protein kodiert, das eine Antibiotika-Resistenz
wie beispielsweise Neomycin-Resistenz
kodiert, können
transformierte Zellen mit G418 selektiert werden. Zellen, in denen
das selektierbare Markergen eingebaut ist, überleben, während die übrigen Zellen sterben. Dies
ermöglicht
die Visualisierung und die Untersuchung auf Expression von erfindungsgemäßen rekombinanten
Expressionsvektoren und insbesondere die Bestimmung der Wirkung
einer Mutation auf die Expression und den Phänotyp. Es ist ersichtlich,
dass selektierbare Marker getrennt von der Nukleinsäure von
Interesse auf einem separaten Vektor eingeführt werden können.
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Die
rekombinanten Expressionsvektoren können weiterhin Gene enthalten,
die einen Fusionsrest kodieren, durch den eine gesteigerte Expression
des rekombinanten Proteins bereitgestellt wird, eine erhöhte Löslichkeit
des rekombinanten Proteins; und der bei der Aufreinigung des rekombinanten
Zielproteins hilft, indem er als Ligand in einer Affinitätsaufreinigung
fungiert. Beispielsweise kann dem rekombinanten Zielprotein eine
proteolytische Spaltstelle hinzugefügt werden, um die Abtrennung
des rekombinanten Proteins vom Fusionsrest nach der Aufreinigung
des Fusionsproteins zu ermöglichen.
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Rekombinante
Expressionsvektoren können
in Wirtszellen eingebracht werden, wodurch eine transformierte Wirtszelle
hergestellt wird. Diese Zellen stellen nützliche experimentelle Systeme
dar. Dementsprechend umfasst die Erfindung eine Wirtszelle, welche
einen erfindungsgemäßen rekombinanten
Expressionsvektor umfasst. Der Begriff „transformierte Wirtszelle" soll prokaryotische
und eukaryotische Zellen umfassen, die mit einem erfindungsgemäßen rekombinanten
Expressionsvektor transformiert oder transfiziert wurden. Prokaryotische
Zellen können
mit Nukleinsäure
beispielsweise über
Elektroporation oder Kalziumchlorid-vermittelte Transformation transformiert
werden. Nukleinsäure
kann in Säugerzellen über herkömmliche
Techniken, wie beispielsweise Co-Präzipitation mit Kalziumphosphat
oder Kalziumchlorid, DEAE-Dextran-vermittelte Transfektion, Lipofektion,
Elektroporation oder Mikroinjektion eingeführt werden. Geeignete Verfahren
zur Transformation und Transfektion von Wirtszellen sind in Sambrook
et al., (Molecular Cloning: A Laborstory Manual, 2. Aufl., Cold
Spring Harbor Laborstory Press (1989)), und weiteren derartigen
Laborhandbüchern
zu finden.
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Geeignete
Wirtszellen umfassen eine große
Vielzahl von prokaryotischen und eukaryotischen Wirtszellen. Beispielsweise
können
die erfindungsgemäßen Peptide
exprimiert werden in Bakterienzellen, wie beispielsweise E. coli,
Pseudomonas, Bacillus subtilis, in Insektenzellen (unter Verwendung
von Baculovirus), Hefezellen oder Säugerzellen. Weitere geeignete
Wirtszellen sind zu finden in Goeddel, Gene Expression Technology:
Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1991).
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Um
ein Beispiel zu geben, kann für
die rekombinante Herstellung von PS-Peptiden beispielsweise E. coli
verwendet werden, wobei das T7 RNA-Polymerase/Promotor-System unter
Verwendung von zwei Plasmiden oder durch Markierung von Plasmid-kodierten
Proteinen verwendet wird, oder über
Expression durch Infektion mit dem M13 Phagen mGPI-2. E. coli-Vektoren
können
auch mit regulatorischen Sequenzen des Phagen Lambda verwendet werden, über Fusionsprotein-Vektoren
(z. B. IacZ und trpE), über
Maltose-Bindungsprotein-Fusionen,
und über
Glutathion-S-Transferase-Fusionsproteine.
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Alternativ
kann ein PS-Peptid in Insektenzellen unter Verwendung von Baculovirus-Vektoren oder in Säugerzellen
unter Verwendung von Vacciniavirus exprimiert werden. Für die Expression
in Säugerzellen
kann die cDNA-Sequenz mit heterologen Promotoren ligiert und in
Zellen eingeführt
werden, beispielsweise COS-Zellen, um eine vorübergehende oder lang anhaltende
Expression zu erzielen. Die stabile Integration des chimären Genkonstrukts
kann in Säugerzellen über biochemische
Selektion aufrecht erhalten werden, beispielsweise über Neomycin
und Mycophenolsäure
(„mycophoenolic
acid").
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Die
PS-DNA-Sequenz kann verändert
werden unter Verwendung von Verfahrensweisen, wie beispielsweise
Verdauen mit Restriktionsenzymen, Auffüllen mit DNA-Polymerase, Deletion über Exonuklease, Verlängerung über terminale
Deoxynukleotid-Transferase,
Ligation von synthetischen oder klonierten DNA-Sequenzen, ortsspezifischer
Sequenzveränderung
unter Verwendung spezifischer Oligonukleotide in Kombination mit
PCR. Beispielsweise können
eins bis fünf
oder fünf
bis zehn Aminosäuren
oder mehr entfernt oder mutiert werden.
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Die
cDNA-Sequenz oder Teile davon, oder ein aus einer cDNA mit einem
Intron und seinem eigenen Promotor bestehendes Minigen wird über herkömmliche
Techniken in eukaryotische Expressionsvektoren eingeführt. Diese
Vektoren ermöglichen
die Transkription der cDNA in eukaryotischen Zellen über die
Bereitstellung regulatorischer Sequenzen, welche die Transkription
der cDNA initiieren und verstärken,
und stellen deren korrektes Spleißen und deren korrekte Polyadenylierung
sicher. Der endogene Promotor des PS-Gens kann ebenfalls verwendet
werden. Unterschiedliche Promotoren innerhalb von Vektoren weisen
unterschiedliche Aktivitäten
auf, wodurch der Grad der Expression der cDNA verändert wird.
Darüber
hinaus können
bestimmte Promotoren auch die Funktion modulieren, wie beispielsweise
der auf Glucocorticoid ansprechende Promotor aus dem Maus-Mamma-Tumorvirus.
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Einige
der aufgeführten
Vektoren enthalten selektierbare Marker oder neo-bakterielle Gene,
welche die Isolierung von Zellen über chemische Selektion ermöglichen.
Stabile Langzeitvektoren können
in Zellen als episomale, frei replizierbare Einheiten über Verwendung
regulatorischer Elemente von Viren aufrecht erhalten werden. Es
können
weiterhin Zelllinien hergestellt werden, bei denen der Vektor in
die genomische DNA integriert ist. Auf diese Weise wird das Genprodukt
auf kontinuierlicher Basis hergestellt.
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Vektoren
werden in Empfängerzellen über verschiedene
Methoden eingeführt,
einschließlich
Kalziumphosphat, Strontiumphosphat, Elektroporation, Lipofektion,
DEAE- Dextran, Mikroinjektion
oder über
Protoplastenfusion. Alternativ kann die cDNA über Infektion unter Verwendung
von viralen Vektoren eingeführt
werden.
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PS-Peiltide
können
weiterhin aus Zellen oder Geweben isoliert werden, einschließlich Säugerzellen oder
Säugergeweben,
in denen das Peptid normalerweise exprimiert wird.
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Das
Protein kann aufgereinigt werden über herkömmliche Aufreinigungsverfahren,
die dem Fachmann bekannt sind, beispielsweise chromatographischen
Verfahren, Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Verfahren
oder Fällung.
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Beispielsweise
kann ein Anti-PS-Antikörper
(wie unten beschrieben) verwendet werden, um ein PS-Peptid zu isolieren,
welches anschließend über Standardverfahren
aufgereinigt wird.
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Die
erfindungsgemäßen Peptide
können
weiterhin über
chemische Synthese hergestellt werden, wobei Techniken verwendet
werden, die in der Proteinchemie allgemein bekannt sind, wie beispielsweise
die Festphasensynthese (Merrifield, 1964, J. Am. Chem. Assoc. 85:
2149–2154)
oder die Synthese in homogener Lösung
(Houbenweyl, 1987, Methods of Organic Chemistry, Hrsg. E. Wansch,
Bd. 15 I und II, Thieme, Stuttgart).
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Peptidmimetika
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Die
vorliegende Erfindung umfasst weiterhin Peptidmimetika von PS. „Peptidmimetika" sind Strukturen,
die als Ersatz für
Peptide bei Wechselwirkungen zwischen Molekülen dienen (siehe Morgan et
al (1989), Ann. Reports Med. Chem. 24: 243–252 als Übersichtsartikel). Peptidmimetika
umfassen synthetische Strukturen, die optional Aminosäuren und/oder
Peptidbindungen enthalten, jedoch die strukturellen und funktionalen Eigenschaften
eines Peptids, oder eines Verstärkers
oder Inhibitors gemäß der vorliegenden
Erfindung beibehalten. Peptidmimetika umfassen weiterhin Peptoide,
Oligopeptoide (Simon et al. (1972) Proc. Natl. Acad., Sei USA 89:
9367); und Peptid-Bibliotheken, welche Peptide einer gewählten Länge enthalten,
welche alle möglichen
Sequenzen von Aminosäuren
enthalten, die einem erfindungsgemäßen Peptid entsprechen.
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Peptidmimetika
sind entworfen auf der Grundlage von Informationen, die erhalten
werden durch systematischen Austausch von L-Aminosäuren durch
D-Aminosäuren,
durch Austausch von Seitenketten durch Gruppen mit unterschiedlichen
elektronischen Eigenschaften, und durch systematischen Austausch
von Peptidbindungen durch Ersatz mit Amidbindungen. Lokale Konformationseinschränkungen
können
ebenfalls eingeführt
werden, um Konformationserfordernisse für die Aktivität eines
Kandidaten-Peptidmimetikums zu bestimmen. Die Mimetika können isosterische
Amidbindungen oder D-Aminosäuren
umfassen, um reverse Umkehrkonformationen zu stabilisieren oder
zu fördern
und um zur Stabilisierung des Moleküls beizutragen. Zyklische Aminosäure-Analoga
können
verwendet werden, um Aminosäurereste
auf bestimmte Konformationszustände
einzuschränken.
Die Mimetika können
weiterhin Nachahmer von Sekundärstrukturen
von inhibitorischen Peptiden umfassen. Diese Strukturen können die
dreidimensionale Orientierung von Aminosäureresten in den bekannten
Sekundärkonformationen
von Proteinen modellieren. Weiterhin können Peptoide verwendet werden,
die Oligomere von N-substituierten Aminosäuren darstellen, und als Motive
für die
Erzeugung chemisch unterschiedlicher Bibliotheken neuer Moleküle verwendet
werden können.
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Erfindungsgemäße Peptide
sind weiterhin brauchbar für
die Identifizierung von Leitverbindungen für die Entwicklung von Wirkstoffen.
Die Struktur der hier beschriebenen Peptide kann auf einfache Weise über eine
Reihe von Verfahren, wie beispielsweise NMR und Röntgenkristallographie
bestimmt werden. Ein Vergleich der Strukturen von Peptiden mit ähnlicher
Sequenz, aber unterschiedlichen biologischen Aktivitäten, die sie
in Zielmolekülen
hervorrufen, kann Informationen über
den Zusammenhang zwischen Struktur und Aktivität beim Ziel liefern. Informationen,
die aus der Untersuchung der Struktur-Aktivititäts-Zusammenhänge erhalten werden, können dafür verwendet
werden, um entweder modifizierte Peptide oder andere kleine Moleküle oder Leitverbindungen
zu entwerfen, die hinsichtlich der vorhergesagten Eigenschaften
im Zusammenhang mit dem Zielmolekül getestet werden können. Die
Aktivität
der Leitverbindungen wird unter Verwendung von Assays, die den hier
beschriebenen ähneln,
untersucht. Informationen über
Struktur-Aktivitäts-Zusammenhänge werden
aus Co-Kristallisierungsuntersuchungen erhalten. in diesen Untersuchungen
wird ein Peptid mit einer gewünschten
Aktivität
in Assoziierung mit einem Zielmolekül kristallisiert, und die Röntgenstruktur
des Komplexes wird bestimmt. Die Struktur wird dann optional mit
der Struktur des Zielmoleküls
in seinem nativen Zustand verglichen, und die Information aus einem
solchen Vergleich ist brauchbar, um Verbindungen mit erwartungsgemäßen Eigenschaften
zu entwerfen.
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Therapeutische und kosmetische Verfahren
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Das
paralytische Agens ist brauchbar für den Markt in Bezug auf neuromuskuläre Störungen einschließlich der
in weitem Umfang publizierten kosmetischen Anwendungen für neuromuskuläre Blocker.
(Für eine
Diskussion zur Verwendung von Botox für die Immobilisierung von Gesichtsmuskeln
und die Behandlung von Falten siehe: Fagien, S. 1999. Plast Reconstr
Surg 103: 701–713;
Carruthers, J, & Carrthers,
A. 1998. Dermatol Surg 24: 1244–1247).
Therapeutische Anwendungen von neuromuskulären Blockern, wie beispielsweise
Linderung von Migräne,
Myofacialschmerz und anderer Schmerztypen (d. h. analgetische Aktivität), kamen in
jüngerer
Zeit zu den bestehenden medizinischen Verwendungen hinzu, welche
Muskeltremor und neuromuskuläre
Erkrankungen umfassen.
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Es
tauchen stetig neue Anwendungen auf, einschließlich der kosmetischen Anwendung
bei der Verringerung von Falten und, in jüngerer Zeit, der Behandlung
von übermäßigem Schwitzen
(auch als Hyperhidrose bezeichnet; Blaheta, HJ, Vollert, B, Zuder,
D, & Rassner,
G. 2002. Dermatol. Surg. 28: 666–671; Naumann, M & Hamm, H. 2002.
Br. J. Surg. 89: 259–261).
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Dementsprechend
wird durch die vorliegende Erfindung gemäß einer Ausführungsform
ein Verfahren zur Blockierung neuronaler Aktivität bereitgestellt, wobei man
eine wirksame Menge an PS-Peptid, wie beispielsweise SEQ ID NO:1
oder SEQ ID NO:2 oder die weiteren in dieser Anmeldung beschriebenen
Verbindungen einem Tier, das deren bedarf, verabreicht. Durch die
vorliegende Erfindung wird weiterhin die Verwendung einer wirksamen
Menge eines PS-Peptids als neuromuskulärer Blocker bereitgestellt.
Durch die vorliegende Erfindung wird weiterhin die Verwendung einer
wirksamen Menge eines PS-Peptids
bei der Herstellung eines Medikaments zur Blockierung neuronaler
Aktivität
oder zur Analgetisierung bereitgestellt.
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Gemäß einer
weiteren Ausführungsform
der Erfindung wird ein Verfahren zur Wundheilung bereitgestellt,
wobei man eine wirksame Menge an PS-Peptid einem Tier verabreicht,
das dessen bedarf. Durch die vorliegende Erfindung wird weiterhin
die Verwendung des PS-Peptids bei der Wundheilung bereitgestellt,
beispielsweise um eine Analgetisierung zu bewirken. Beispielsweise
kann das PS-Peptid in Verbände
eingebettet werden oder das PS-Peptid enthaltende Gele können auf
einen Verband aufgetragen werden, um als lang anhaltendes lokales
Analgetikum für
Wunden zu fungieren.
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Der
Begriff „Substanz,
die neuromuskuläre
Aktivität
blockieren kann" umfasst
hier alle hier beschriebenen erfindungsgemäßen Peptide, die eine neuromuskuläre Aktivität zeitweilig
oder dauernd blockieren, einschließlich, jedoch ohne darauf beschränkt zu sein,
Schmerzrezeptoren (z. B. einen Nociceptor, der ein peripheres Nervenorgan
oder einen Mechanismus für
die Wahrnehmung und Übertragung
schmerzhafter oder verletzender Reize darstellt).
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Der
Begriff „wirksame
Menge" bedeutet
hier eine Menge, die wirksam ist und dies bei Dosierungen und über Zeiträume, die
nötig sind,
um das gewünschte
Ergebnis zu erzielen (z. B. Blockierung neuromuskulärer Aktivität).
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Der
Begriff „Tier" umfasst hier alle
Angehörigen
des Tierreiches und bezieht sich vorzugsweise auf Säuger, wie
beispielsweise den Menschen. Die Verabreichung eines PS-Peptids oder einer
Substanz an ein Tier umfasst sowohl Verabreichungen in vivo als
auch ex vivo.
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Der
Begriff „eine
Zelle" bedeutet
hier eine einzelne Zelle sowie auch eine Vielzahl oder eine Population von
Zellen. Die Verabreichung eines PS-Peptids oder einer Substanz an
eine Zelle umfasst sowohl Verabreichungen in vitro als auch in vivo.
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Der
Begriff „neuromuskuläre Aktivität blockieren" bedeutet hier, dass
die Substanz zu einer Verringerung der neuromuskulären Aktivität im Vergleich
mit der neuromuskulären
Aktivität
bei Fehlen der Substanz führen
kann.
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Die
Blockierung von neuromuskulärer
Aktivität
ist brauchbar für
ein Analgetikum bei der Behandlung von Erkrankungen wie beispielsweise
Migräne,
Tremor, neuromuskulärer
Erkrankung, übermäßigem Schwitzen
und Falten. Dementsprechend betrifft die vorliegende Erfindung gemäß einer
spezifischen Ausführungsform
ein Verfahren zur Behandlung der zuvor genannten Erkrankungen, wobei
man eine wirksame Menge einer PS-Substanz einem Tier verabreicht,
das deren bedarf. Durch die vorliegende Erfindung wird weiterhin
die Verwendung einer wirksamen Menge einer Substanz bereitgestellt,
die neuromuskuläre
Aktivität
blockieren oder zu Analgetisierung führen kann. Durch die vorliegende
Erfindung wird weiterhin die Verwendung einer wirksamen Menge einer
PS-Substanz, die neuromuskuläre
Funktion inhibieren kann, für
die Herstellung eines Medikaments zur Behandlung der zuvor genannten
Erkrankungen bereitgestellt.
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Wie
dem Fachmann allgemein bekannt ist, bedeutet „behandeln" oder „Behandlung" hier einen Ansatz,
um nützliche
oder erwünschte
Ergebnisse, einschließlich
klinischer Ergebnisse, zu erhalten. Ohne darauf beschränkt zu sein,
können
nützliche
oder erwünschte
klinische Ergebnisse die Linderung oder Erleichterung eines oder
mehrerer Symptome oder Zustände,
die Verringerung des Ausmaßes
einer Erkrankung, den stabilisierten (d. h. sich nicht verschlechternden)
Zustand einer Erkrankung oder einer Störung, das Verhindern der Ausbreitung
einer Erkrankung oder einer Störung,
die Verzögerung
oder Verlangsamung des Verlaufs einer Erkrankung oder einer Störung, die
Verbesserung oder Palliation der Erkrankung oder des Störungszustands, und
die Remission (unabhängig
davon, ob teilweise oder vollständig),
unabhängig
davon, ob nachweisbar oder nicht nachweisbar, umfassen. „Behandlung" kann weiterhin eine
Verlängerung
des Überlebens
im Vergleich mit der erwarteten Überlebensdauer
ohne Erhalt der Behandlung bedeuten.
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Pharmazeutische und kosmetische Zusammensetzungen
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Die
PS-Peptide und die PS-Peptide kodierenden Nukleinsäuren werden
optional in eine pharmazeutische Zusammensetzung zur Verabreichung
an Individuen in einer biologisch verträglichen Form formuliert, die für eine Verabreichung
in vivo geeignet ist. „Biologisch
kompatible Form, die zur Verabreichung in vivo geeignet ist" bedeutet eine Form
der zu verabreichenden Substanz, bei der die therapeutischen Wirkungen
im Vergleich mit jeglichen toxischen Wirkungen überwiegen. Die Substanzen können lebenden
Organismen, einschließlich Menschen
und Tieren, verabreicht werden.
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Die
Verabreichung einer therapeutisch aktiven Menge einer erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzung
ist definiert als eine wirksame Menge, bei Dosierungen und Zeiträumen, die
erforderlich sind, um das erwünschte
Ergebnis zu erzielen. Beispielsweise kann eine therapeutisch aktive
Menge einer Substanz in Abhängigkeit
von Faktoren, wie beispielsweise dem Erkrankungszustand, dem Alter,
dem Geschlecht und dem Gewicht des Individuums, und der Fähigkeit
der Substanz, eine gewünschte
Antwort in dem Individuum hervorzurufen, variieren. Dosierungspläne können angepasst
werden, um die optimale therapeutische Antwort zu liefern. Beispielsweise
können
mehrere unterteilte Dosen täglich
verabreicht werden, oder die Dosis kann, wie durch die Erfordernisse
der therapeutischen Situation angezeigt, proportional verringert
werden.
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Das
erfindungsgemäße Polypeptid
wird vorzugsweise kombiniert mit weiteren Bestandteilen, wie beispielsweise
einem Träger,
in einer Zusammensetzung, wie beispielsweise einer pharmazeutischen
Zusammensetzung, oder einer kosmetischen Zusammensetzung. Die Zusammensetzungen
sind brauchbar, wenn sie bei Verfahren der medizinischen Behandlung,
der Vorbeugung, oder der Diagnose einer Erkrankung, einer Störung oder
eines abnormalen physischen Zustands verwendet werden. Beispielsweise
kann eine Verabreichung als neuromuskulärer Blocker erfolgen. Sie sind
brauchbar für
die Behandlung von Migräne,
Myofacialschmerz oder anderer Arten von Schmerz (analgetische Funktion),
Muskeltremor und neuromuskulären
Erkrankungen, übermäßigem Schwitzen
und Falten. Sie sind weiterhin brauchbar für die Wundheilung über ihre Wirkung
als lokale Analgetika.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen können Menschen oder Tieren über eine
Vielzahl von Verfahren verabreicht werden, die, ohne darauf beschränkt zu sein,
topische Verabreichung, orale Verabreichung, Aerosolverabreichung,
intratracheale Instillation, intraperitoneale Injektion in die Cerebrospinalflüssigkeit,
intravenöse
Injektion und subkutane Injektion umfassen. Die zu verabreichenden
Dosierungen hängen
ab von den Bedürfnissen
des Patienten, der erwünschten
Wirkung und der gewählten
Verabreichungsroute. Beispielsweise können die pharmazeutischen Zusammensetzungen
auf einer Bandage vorliegen, die für die Wundheilung durch ihre
Wirkung als Analgetikum verwendet wird. Nukleinsäuremoleküle und Polypeptide können unter
Verwendung von in vivo-Transportvehikeln, wie beispielsweise Liposomen,
in Zellen eingeführt
werden. Sie können
weiterhin in diese Zellen unter Verwendung physikalischer Techniken,
wie beispielsweise Mikroinjektion und Elektroporation, oder chemischer
Verfahren, wie beispielsweise Co-Präzipitation oder unter Verwendung
von Liposomen, in Zellen eingeführt
werden.
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Die
pharmazeutischen Zusammensetzungen werden über bekannte Verfahren für die Herstellung
von pharmazeutisch akzeptablen Zusammensetzungen, die Patienten
verabreicht werden können,
und auf solche Weise hergestellt, dass eine wirksame Menge des Nukleinsäuremoleküls oder
Polypeptids in einem Gemisch mit einem pharmazeutisch akzeptablen
Vehikel kombiniert wird. Geeignete Vehikel sind beispielsweise beschrieben
in Remington's Pharmaceutical
Sciences (Remington's
Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Esston, Pa., USA)
oder dem Handbook of Pharmaceutical Additives (zusammengestellt
von Michael und Irene Ash, Gower Publishing Limited, Aldershot,
England (1995)). Auf dieser Grundlage umfassen die Zusammensetzungen,
wenngleich nicht ausschließlich,
Lösungen
der Substanzen in Assoziierung mit einem oder mehreren pharmazeutisch
akzeptablen Vehikeln oder Verdünnungsmitteln,
und können
in gepufferten Lösungen
mit einem geeigneten pH enthalten sein und/oder können isoosmotisch
zu physiologischen Flüssigkeiten
sein. in diesem Zusammenhang kann auf das
US-Patent Nr. 5,843,546 verwiesen
werden.
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Auf
dieser Grundlage umfassen die pharmazeutischen Zusammensetzungen
optional eine aktive Verbindung oder Substanz, beispielsweise ein
Peptid oder ein Nukleinsäuremolekül, zusammen
mit einem oder mehreren pharmazeutisch akzeptablen Vehikeln oder
Verdünnungsmitteln,
und sind enthalten in gepufferten Lösungen mit einem geeigneten
pH und sind isoosmotisch zu den physiologischen Flüssigkeiten.
Die Verfahren für
das Vereinigen der aktiven Moleküle
mit den Vehikeln oder deren Vereinigen mit Verdünnungsmitteln sind dem Fachmann
auf dem Gebiet allgemein bekannt. Die Zusammensetzung umfasst optional
ein Agens für
den gezielten Transport der aktiven Verbindung zu bestimmten Stellen
innerhalb des Gewebes.
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Herstellung von Antikörpern
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Antikörper gegen
das Peptid sind brauchbar für
die Identifizierung von Rezeptoren und finden Anwendung bei der
Entwicklung von diagnostischen Tests. Einige neuromuskuläre Zustände beruhen
auf einer Fehlfunktion des Ziels des Peptids. Der Nachweis der Ziel-Rezeptormoleküle und die
Bestimmung von deren Dichte auf der Oberfläche der Zelle, oder deren Lokalisierung
auf der Oberfläche
der Zelle ist für
die Diagnostik brauchbar. Dies kann erfolgen über Antikörperbehandlung nach Peptidverabreichung
und anschließenden
sekundären
Nachweis der Antikörper/Peptid-Komplexe wie im allgemeinen
ELISA-Protokoll. Jedes beliebige Verfahren zur Markierung des Peptids,
das die Rezeptordichte/-lokalisierung aufzeigen würde, wäre brauchbar (z.
B. radiaktiv markiertes Peptid oder fluoreszenzmarkiertes Peptid.
Sobald das Peptid und dessen Rezeptor dahingehend charakterisiert
sind, wie die Wirkung hervorgerufen wird, werden das PS-Peptid oder
Varianten verwendet, um zu testen, wie das Ziel in weiteren Geweben
oder Tieren oder Menschen wirkt. Ein varianter (variantes)/beschädigter (beschädigtes)
Rezeptor/Ziel für
das PS-Peptid oder die Variante würden nicht auf eine Weise wirken,
die identisch ist zu der beim charakterisierten „normalen" Ziel. Die Erfindung umfasst einen isolierten
Antikörper,
der mit einem erfindungsgemäßen Polypeptid
immunreaktiv ist. Antikörper
werden vorzugsweise gegen Epitope der Sequenz erzeugt. Der Antikörper kann
mit einem nachweisbaren Marker markiert sein oder unmarkiert sein.
Der Antikörper
ist vorzugsweise ein monoklonaler Antikörper oder ein polyklonaler
Antikörper.
Solche Antikörper
werden verwendet, um Organismen zu screenen. Die Antikörper sind
weiterhin wertvoll für
die Immunaufreinigung von Polypeptiden aus Rohextrakten. Beispielsweise
kann man eine biologische Probe mit dem Antikörper unter Bedingungen in Kontakt
bringen, welche die Bildung eines immunologischen Komplexes zwischen
dem Antikörper
und einem von dem Antikörper
erkannten Polypeptid ermöglichen,
und das Vorliegen oder Fehlen des immunologischen Komplexes nachweisen,
wodurch das Vorliegen des erfindungsgemäßen Peptids oder eines ähnlichen
Peptids in der Probe nachgewiesen wird. Die Erfindung umfasst weiterhin
Zusammensetzungen, die vorzugsweise den Antikörper, ein für die Bildung eines immunologischen
Komplexes zwischen dem Antikörper
und einem von dem Antikörper
erkannten Polypeptid geeignetes Medium und ein Reagens umfassen,
das in der Lage ist, den immunologischen Komplex zur Bestätigung des
Vorliegens des erfindungsgemäßen Peptids
oder eines ähnlichen
Polypeptids geeigneten Reagens nachzuweisen.
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Um
das erfindungsgemäße Peptid
zu erkennen, können
Antikörper
gegen eine Reihe einzigartiger Epitope über das ganze Molekül hinweg
erzeugt werden.
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Monoklonale
und polyklonale Antikörper
werden gemäß der Beschreibung
in dieser Anmeldung und dem Fachmann bekannter Techniken hergestellt.
Für Beispiele
von Verfahren zur Herstellung und Verwendungen von monoklonalen
Antikörpern
siehe die
US-Patente Nr. 5,688,681 ,
5,688,657 ,
5,683,693 ,
5,667,781 ,
5,665,356 ,
5,591,628 ,
5,510,241 ,
5,503,987 ,
5,501,988 ,
5,500,345 und
5,496,705 , auf die in ihrer Gesamtheit Bezug
genommen wird. Beispiele für
die Herstellung und Verwendungen von polyklonalen Antikörpern sind
in den
US-Patenten Nr. 5,512,282 ,
4,828,985 ,
5,225,331 und
5,124,147 offenbart, auf die in ihrer
Gesamtheit Bezug genommen wird.
-
Der
Begriff „Antikörper" umfasst hier Fragmente
davon, die ebenfalls spezifisch mit einem PS-Peptid oder Fragmenten
davon reagieren. Antikörper
können
unter Verwendung herkömmlicher
Techniken fragmentiert werden und die Fragmente hinsichtlich ihrer Brauchbarkeit
auf dieselbe Weise wie oben beschrieben gescreent werden. Beispielsweise
können
F(ab')2-Fragmente
durch Antikörperbehandlung
mit Pepsin erzeugt werden. Das erhaltene F(ab')2-Fragment kann behandelt werden, um
die Sulfidbrücken
zu reduzieren, wodurch Fab'-Fragmente
hergestellt werden.
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Chimäre Antikörperderivate,
d. h. Antikörpermoleküle, die
eine nicht-humane, tierische variable Region und eine humane konstante
Region vereinigen, liegen ebenfalls im Schutzumfang der Erfindung.
Chimäre Antikörpermoleküle umfassen
beispielsweise die Antigen-Bindungsdomäne eines Antikörpers einer
Maus, Ratte oder einer anderen Art, zusammen mit humanen konstanten
Regionen. Herkömmliche
Verfahren sind brauchbar für
die Erzeugung von chimären
Antikörpern,
welche die variable Immunglobulin-Region enthalten, welche die erfindungsgemäßen PS-Peptid-Antigene
erkennt (siehe beispielsweise Morrison et al., Proc. Natl Acad.
Sci. USA 81, 6851 (1985); Takeda et al., Nature 314, 452 (1985),
Cabilly et al.,
US-Patent Nr.
4,816,567 ; Boss et al.,
US-Patent
Nr. 4,816,397 ; Tanaguchi et al., europäische Patentoffenlegungsschrift
EP 171 496 ;
europäische
Patentoffenlegungsschrift 0 173 494 , Patent im Vereinigten
Königreich
GB 21770968 ). Man nimmt an,
dass chimäre
Antikörper
in einem menschlichen Individuum weniger immunogen sein würden als
der entsprechende nicht-chimäre
Antikörper.
-
Monoklonale
oder chimäre
Antikörper,
die spezifisch mit einem erfindungsgemäßen Protein, wie hier beschrieben,
reagieren, können
weiterhin humanisiert werden, indem Chimären von humanen konstanten
Regionen hergestellt werden, bei denen Teile der variablen Regionen,
insbesondere die konservierten Framework-Regionen der Antigen-Bindungsdomäne, humanen
Ursprungs sind und nur die hypervariablen Regionen nicht-humanen Ursprungs
sind. Solche Immunglobulinmoleküle
werden über
dem Fachmann bekannte Techniken hergestellt (z. B. Teng et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 7308–7312 (1983); Kozbor et al.,
Immunology Today, 4, 7279 (1983); Olsson et al., Meth. Enzymol.,
92, 3–16
(1982)) und PCT-Offenlegungsschrift
WO 92/06193 oder
EP 0 239 400 ). Humanisierte
Antikörper
können
auch kommerziell hergestellt werden (Scotgen Limited, 2 Holly Road,
Twickenham, Middlesex, Großbritannien).
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Spezifische
Antikörper,
oder Antikörper-Fragmente,
wie beispielsweise, ohne darauf beschränkt zu sein, Einzelketten Fv-monoklonale
Antikörper,
die mit den erfindungsgemäßen Peptiden
reagieren, können weiterhin
erzeugt werden, indem Expressionsbibliotheken, die Immunglobulingene
oder Teile davon kodieren, welche in Bakterien mit von den Nukleinsäuremolekülen von
PS-Peptiden hergestellten Peptiden exprimiert werden, gescreent
werden. Beispielsweise können
vollständige
Fab-Fragmente, VH-Regionen und FV-Regionen unter Verwendung von
Phagen-Expressionsbibliotheken in Bakterien exprimiert werden (siehe
beispielsweise Ward et al., Nature 341, 544–546: (1989); Huse et al.,
Science 246, 1275–1281
(1989); und McCafferty et al. Nature 348, 552–554 (1990)). Alternativ kann
eine SCID-hu-Maus, beispielsweise das von Genpharm entwickelte Modell,
zur Herstellung von Antikörpern
oder Fragmenten davon verwendet werden.
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Die
Erfindung umfasst weiterhin Verfahren zur Verwendung der Antikörper, beispielsweise
beim Nachweis von Rezeptoren, die an das erfindungsgemäße Peptid
binden. Beispielsweise umfasst die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis
des Vorliegens eines erfindungsgemäßen Peptids über: a)
Inkontaktbringen einer Probe, die ein oder mehrere Peptide enthält, mit
einem erfindungsgemäßen Antikörper unter
Bedingungen, die geeignet sind für
die Bindung des Antikörpers
an Peptide, mit denen er spezifisch reagiert; b) Abtrennen nicht-gebundender
Peptide vom Antikörper;
und c) Nachweisen des Antikörpers,
der an eines oder mehrere der Peptide in der Probe gebunden bleibt.
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Hilfsmittel für die Forschung
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Das
Peptid und dessen Derivate sind brauchbar in Forschungsprotokollen
zur Untersuchung der neuromuskulären
Verbindung und von Ionenkanälen.
Durch die Fähigkeit
zur selektiven Veränderung
bestimmter Ionenkanäle
oder Klassen von Ionenkanälen
wird ein weiteres Hilfsmittel bereitgestellt, mit dem die neuromuskuläre Verbindung
auf vorhersagbare Weise gestört
werden kann. Dadurch wird die Rolle empfänglicher Peptid-Ziele in neuromuskulären Funktionen
und Prozessen identifiziert.
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Beispiele
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Die
folgenden Beispiele stellen veranschaulichende Ausführungsformen
dar und beschränken
den Umfang der Erfindung nicht.
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Beispiel 1: Isolierung und Aufreinigung
des Spitzmaus-Speichelpeptids aus der Glandula submaxillaris der Spitzmaus
(Blarina brevicauda)
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Gewebeaufarbeitung
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Die
linken und rechten Unterkiefer-Speicheldrüsen (die von einem Gesamtgewicht
zwischen 100 und 200 mg reichen) werden freigelegt und in flüssigen Stickstoff
gegeben, um damit ein Schockgefrieren durchzuführen. Das Gewebe wird in flüssigem Stickstoff
zermalmt und pulverisiert. Das Gewebepulver wird schnell in einen
gewogenen Behälter überführt und
das Gewicht des überführten Gewebepulvers
bestimmt. Anschließend
wird das Gewebe in 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,0, homogenisiert,
um ein 20% Gewicht-zu-Volumen-Homogenisat
(2 g/100 mL) bereitzustellen. Das Homogenisat wird 15 Minuten mit
12.000 × g
bei 4°C zentrifugiert,
um die Zelltrümmer
zu pelletieren. Der Überstand
wird entfernt.
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Wenn
die Drüsen
nicht sofort verwendet werden sollen, werden sie in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bis zur Verarbeitung bei –80°C oder niedrigeren Temperaturen
gelagert.
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Isolierung des Peptids
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Die
Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung des Spitzmaus-Speichelproteins
umfassen: i) Größenausschluss-
und Ionenaustauschchromatographie (siehe 2 und 3)
und ii) Zentrifugation bei bestimmten Molekulargewichtsausschlussgrößen: vorzugsweise
Centricons von Amicon mit Molekulargewichtausschlussgrößen von
100.000, 10.000 und 3.000. Das erste Verfahren ermöglicht die
Abtrennung des komplexierten aktiven Agens (Fraktionen mit sehr
hohem Molekulargewicht), aus dem ein freies Peptid mit einem Molekulargewicht
von 6.000 normalerweise aus der Größenausschlusschromatographie-Säule eluieren würde. Die
Protokolle für
die Ionenaustauschchromatographie verwendeten einen Anionenaustauscher
eines Natriumphosphatpuffers, bei neutralem pH. Das Peptid ist fest
an den Komplex gebunden (erhöhte
Ionenstärke führt nicht
zu dessen Dissoziierung) und wird vorzugsweise einer Behandlung
mit Natriumdodecylsulfat (SDS) oder mit wässrigem Ethanol ausgesetzt,
um es vom Komplex zu dissoziieren. Jeder beliebige kurzkettige Alkohol
(vorzugsweise C1 bis C6, besonders bevorzugt C2 oder C3) wie beispielsweise
Isopropylalkohol, Propanol oder Butanol kann anstelle von Ethanol
verwendet werden. 20-minütiges
Erwärmen
des Rohextrakts bei 40°C
erhöht
die Menge des isolierbaren Peptids. Scheinbar ist es so, dass das
bioaktive Peptid in komplexiertem Zustand in der Speicheldrüse gehalten
wird, bis es als aktive Form in den Speichel freigesetzt wird. Das Peptidisolat
reagiert schwach mit Clellands-Reagens, was das Vorliegen von Sulfhydrylgruppen
und der Aminosäure
Cystein anzeigt, obwohl vernünftigerweise
anzunehmen ist, dass diese in Disulfhydrylbindungen vorliegen. Die
Peptid-Präparation
zeigte weiterhin eine schwache Extinktion bei 280 nm und eine starke
Extinktion bei 260 nm, was das Vorliegen von Phenylalanin, nicht
jedoch von Tryptophan und Tyrosin anzeigt.
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Das
Größenausschlussverfahren
kann weiterhin einen Fällungsschritt
der löslichen
Proteine mit kaltem Aceton (–20°C oder –80°C; 10:1 Vol./Vol.
Aceton:Homogenisat) umfassen, der auch die Proteine mit höherem Molekulargewicht
fällt.
Dieser Aceton-Fällungsschritt
kann vor oder nach einer Größenfraktionierung
erfolgen. Das Aceton-Präzipitat
wird schnell an der Luft getrocknet und ist über einen langen Zeitraum aktiv
(Ellis S & Krayer
O (1955) J Pharm Exper Therapeutics 114: 127–137). Das Präzipitat
(~50 mg) wird in etwa 1 mL 25 mM Kaliumphosphatpuffer gelöst und sofort über HPLC
isoliert oder vor der HPLC-Isolierung zunächst bei 40°C inkubiert.
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Isolierung über Hochdruckflüssigkeitschromatographie
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Ein
Weg zur Isolierung des Peptids nach erneuter Lösung des Aceton-Präzipitats
besteht in Reverse-Phase-HPLC. Eine Phenomex Jupiter C-18-Säule, 250 × 4,6 mm,
5 u bei 20–25°C und eine
Gradientenelution von 10% (Vol./Vol.) Acetonitril: 90% (Vol./Vol.)
Wasser bis 60% Acetonitril: 40% Wasser werden über einen Zeitraum von 30 Minuten
und bei einer Fließgeschwindigkeit
von 1,0 mL/min verwendet. Alle Lösungsmittel
enthalten 0,1% (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure (TFA). Dies führt zu dem
in 4 gezeigten Elutionsprofil.
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Die
aktive Fraktion dieses ersten HPLC-Ansatzes ist der Peak, der bei
etwa 14,7 Minuten eluiert. Dieser Peak wird gesammelt (siehe 4,
Balken auf der „Zeitachse"). Dieses Material
wird über
Nacht lyophilisiert, um Lösungsmittel
und TFA zu entfernen.
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Der
Rückstand,
der das Hauptpeptid von Interesse und 2 bis 3 untergeordnete weitere
Proteine enthält,
wird in einem minimalen Volumen von 25 mM Natriumphosphatpuffer
gelöst.
Das gelöste
Peptid wird mit einem weiteren HPLC-Protokoll gereinigt. Eine Phenomex
Jupiter C-18-Säule,
250 × 4,6
mm, 5 u bei 20–25°C und eine
Gradientenelution von 10% (Vol./Vol.) Acetonitril: 90% (Vol./Vol.)
Wasser bis 60% Acetonitril: 40% Wasser wird über einen Zeitraum von 40 Minuten
und einer Fließgeschwindigkeit
von 2,3 mL/min verwendet. Alle Lösungsmittel
enthalten 0,1% (Vol./Vol.) Trifluoressigsäure (TFA). Dies führt zu dem
in Fig. HPLC 02 gezeigten Elutionsprofil, wobei das Peptid bei 13,76
min eluiert: Das über
dem massiven Balken auf der „Zeitachse" gezeigte gesammelte
Eluat stellt reines Peptid dar. Dieses Material wird lyophilisiert,
wodurch die Lösungsmittel
und die TFA entfernt werden. Dieses Material ist bei Beurteilung über HPLC
(5), über
SDS-PAGE (6 und 7) und über CE (8 und 9)
reines Peptid.
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Kapillarelektrophorese
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Mit
gereinigtem Spitzmaus-Speichelpeptid (gelöst in 25 mM Kaliumphosphatpuffer,
pH 7,0) wurde eine Kapillarelektrophorese durchgeführt, wobei
ein Beckman Coulter P/ACE Kapillarelektrophoresesystem in einer 60
cm Quarzglassäule
(75 µm
Innendurchmesser, 375 µm
Außendurchmesser),
die auf 25°C
thermostatisiert war, mit Natriumboratpuffer (1 molar, Laufpuffer)
verwendet wurde. Das Spannungsprotokoll bestand aus einer 0,17-minütigen Rampe
auf 30.000 Volt für
20 Minuten bei normaler Polarität.
Der Injektionsdruck betrug 0,5 Pfund pro Quadratzoll („0,5 pounds
per square inch") über 10,0
Sekunden, wodurch ein Probenvolumen von ungefähr 5 nL (Nanoliter) geliefert
wurde.
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8 zeigt
das Elektrophoretogramm des aufgereinigten Peptids im Puffer und
wies eine Elutionszeit von 2,67 Minuten aus. 9 zeigt
einen identischen Elektrophoreselauf des 25 mM Kaliumphosphatpuffers. Dieser
Peak zeigte ein identisches UV-Spektrum im Vergleich mit dem, das
mit einem Standard-Spektrophotometer erhalten wurde (siehe unten).
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Elektronisches Spektrum
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Aufgereinigtes
Peptid wurde in 50 mM Kaliumphosphat, pH 7,0, gelöst und dessen
Ultraviolett-Spektrum wurde gemessen (10). Das
Spektrum zeigte keine Absorption im Bereich von 280 nm und zeigte
somit an, dass die Aminosäuren
Tryptophan und Tyrosin in dem Peptid nicht vorlagen. Das bei etwa
260 nm liegende Zentrum der Schulter zeigte das Vorliegen der Aminosäure Phenylalanin
an, während
die geringe Absorption anzeigte, dass nur eine geringe Menge der
Aminosäure
in dem Peptid vorlag. Dies stand im Einklang mit der nachfolgenden
Aminosäuresequenzierung
des Peptids, da kein Tryptophan oder Tyrosin und nur ein Phenylalaninrest
nachgewiesen wurde.
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Posttranslationelle Modifizierung
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Viele
Speichelproteine werden posttranslational über Glykosylierung („glycation") modifiziert, jedoch ist
das isolierte und gereinigte Spitzmaus-Speichelpeptid kein über einen
solchen Prozess erzeugtes Glykoprotein. Spitzmaus-Speichelpeptid
weist keine kovalent mit dessen Struktur verknüpfte Kohlenhydrate auf.
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SDS-PAGE
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6 zeigt
ein SDS-PAGE(15% Acrylamid)-Gei von sowohl bukkalem Speichel (Mundspülung) als auch
submaxillarem Homogenisat zusammen mit internen Standards eines
nicht-glykosylierten und eines glykosylierten Proteins. 7 zeigt
eine Proteinfärbung
(Coomassie), nachdem die Glykofärbung
abgeschlossen war und das gleiche Gel mit Coomassie erneut gefärbt wurde.
Speichelpeptid der Spitzmaus erscheint als der mobilste der proteinartigen
Bestandteile (unterste gefärbte,
diffuse Bande) und reagierte nicht positiv auf die Glykofärbung so
wie anderen Proteine in diesen biologischen Flüssigkeiten mit höherem Molekulargewicht.
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Beispiel 2: Aminosäuresequenz
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Mit
dem aufgereinigten Peptid wurde unter Verwendung des sequenziellen
Edman-Abbaus eine
N-terminale Sequenzierung durchgeführt (1B). Um
C-terminale Aminosäuren
zu erhalten, wurde Massenspektroskopie/Massenspektroskopie (ms/ms)
durchgeführt
(1A). Beide Sequenzen stellen brauchbare Peptide dar.
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Molekularion des gereinigten Peptids
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Die
Molekularmasse des isolierten und gereinigten Spitzmaus-Speicheipeptids
(Bruker Reflex III, MALDI-TOF, linearer Modus, HCCA-Matrix, Zweischichtenmethode)
lieferte ein molekulares Kation (MH+) von 5805,8 Dalton und somit
eine Molekülmasse
(M) von 5804,8 Dalton. (Siehe 11)
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Peptidmassenkarte aus Trypsinverdau
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Der
Trypsinverdau und die anschließende
Kartierung der Peptidmassen über
MALDI-TOF lieferte
das in 12 gezeigte Massenspektrogramm.
Diese Massenkarte aus dem Verdau ist absolut eindeutig für isoliertes
und aufgereinigtes Spitzmaus-Speichelpeptid. Unter Verwendung der
MASCOT-Suche gab es keine Übereinstimmungen
mit dieser Massenkarte in einer öffentlichen
Datenbank (13) (Perkins et al. 1999. Electrophoresis,
20(18) 3551–3567).
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Theoretische isoelektrische Punkte und
Masse
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Der
theoretische isoelektrische Punkt und die Masse des isolierten und
aufgereinigten Spitzmaus-Speichelproteins können berechnet werden. Der
theoretische isoelektrische Punkt liegt bei 4,60. Seine theoretische
Masse beträgt
5754,51 Da, wobei aufgrund der Bildung einer Disulfidbindung eine
Reduktion um 6 Masseneinheiten auf 5.748,5 Da erfolgen würde. Die
Masseabweichung des in der Massenspektrometrie bestimmten Molekularions
beträgt
(5804,8–5748,5)
56,3 Da und kann somit 3 integrale Wassermoleküle (3 × 18 = 54) darstellen. Wenn
der Histidinrest protoniert ist, würde dies eine weitere Masseneinheit
darstellen, die zu einer Massendiskrepanz von 1 Masseneinheit führen würde.
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Beispiel 3: Bioassay
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Die
Erfindung umfasst einen Bioassay, der zeigt, dass paralytischer
Speichel, der einem Mehlwurm verabreicht wird, diesen für wenigstens
7 Tage am Leben erhalten kann.
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14 zeigt
Mehlwürmer
unmittelbar nach der Injektion und mit vollständiger Paralyse.
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Andere
Insekten sind für
diesen Bioassay ebenfalls brauchbar.
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Beispiel 4: Toxizität
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Tabelle
1 zeigt die Toxizität
von allgemeinem Rohextrakt (10 Mikroliter pro 100 mg Wurmmasse).
Tabelle 2 zeigt die Toxizität
der Präparation
während
der Aufreinigungsprozedur (5 Mikroliter Injektion pro 100 Milligramm
Wurm).
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Wenngleich
die vorliegende Erfindung mit Bezug auf das beschrieben wurde, was
gegenwärtig
als die bevorzugten Beispiele angesehen wird, ist die Erfindung
nicht auf diese offenbarten Beispiele beschränkt. Die Erfindung umfasst
im Gegenteil verschiedene Modifizierungen und äquivalente Anordnungen, die
im Rahmen und Schutzumfang der beigefügten Ansprüche liegen.
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Toxizitätsuntersuchungen
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Tabelle 1 Toxizität von allgemeinem Rohextrakt
(10 Mikroliter pro 100 mg Wurmmasse)
| Homogenisat-Konzentration* | Zahl
injizierter Würmer | Zahl
paralysierter Würmer | Durchschnittliche Zeitdauer
bis zur Paralyse | Kommentar |
| 20% | 5 | 5 | < 1 Sekunde | Sofortige
Paralyse |
| 10% | 6 | 6 | 10
Sekunden | |
| 5% | 9 | 6 | 7
sec | nicht
paralysiert, extrem mühsame Bewegung |
| 1% | 5 | 2 | 53
sec | mühsame Bewegung |
| 20%
(5 min gekocht) | 5 | 0 | unzutreffend | Keine
Symptome |
- * entsprechend 2 g in 100 mL homogenisiertem
Gewebe
Tabelle 2 Toxizität der Präparation während der Aufreinigungsprozedur
(5 Mikroliter Injektion pro 100 Milligramm Wurm) | Injizierte
Probe | Zahl
injizierter Würmer | Zahl
paralysierter Würmer | Durchschnittliche Zeitdauer
bis zur ersten festgestellten Wirkung | Proteinmenge
in der Injektion |
| 20% | 5 | 5 | < 1 sec | 65 µg |
| Aceton-Präzipitat mit
hohem Molekulargewicht | 5 | 4 | < 3 sec | 55 µg |
| Erwärmter Überstand | 5 | 5 | ~5
sec | 45 µg |
| Aufgereinigtes Peptid | 6 | 5 | 10
sec | 0,8 µg |
| Kochsalzlösung | 5 | 0 | unzutreffend | 0 µg |
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Literaturnachweise
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- Christenburg PA (1966) MA Thesis. A study of the ecology
of Blarina brevicauda in North Carolina and of the effect of shrew
toxin an the liver and kidneys of mice. Wake Forest College, Winston-Salem,
NC, USA
- Daisuke K & Kaoru
Y (1997) Sagami Chemical Research Center, Japanisches Patentamt
Veröffentlichungsnummer
10-236963 (Datum der Offenlegung der Anmeldung: 08.09.1998)
- Dufton M (1982) Pharmac. Ther. 53: 199–215
- Ellis S & Krayer
O (1995) J Pharm Exper Therapeutics 114: 127–137
- Eng J (1993) USPTO-Anmeldungsnummer 066480
- George S et al. (1986) Am. Soc. Mammal. 261: 1–9
- Martin I (1981) J. Mamm. 62: 189–192
- Pohl M & Wank
SA (1998) J Biol Chem 273: 9778–9784
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