WO2000064936A2 - VON INTERFERON α2 ABGELEITETE PEPTID-HOMODIMERE UND PEPTID-HETERODIMERE - Google Patents

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Definitions

  • the present invention relates to homodimers or heterodimers composed of peptide monomers which have the amino acid sequence WDETLLKFYTELYQQL (Monomer I), SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQ (Monomer II) or QGVGVTETPLMKEDSILAV (Monomer III) or variants thereof, where the homodimers or the interferers and the homodimers optionally can trigger a cellular signal.
  • the present invention also relates to medicaments containing these homodimers or heterodimers.
  • the present invention relates to diagnostic compositions or diagnostic methods in which the homodimers or heterodimers according to the invention or antibodies directed against them are used
  • cytokines are endogenous messenger substances that are synthesized by different cells and then secreted.
  • the biological tasks of these cytokines are very diverse, but so far only partially understood. In any case, cytokines mainly have fundamental immunoregulatory effects. Interferons are cytokines that are widely used in tumor therapy.
  • bin Due to the specific receptor they trigger intracellular signals (Uze et al., EMBO J. 4 (1985), 65-70), from which the essential effects of the interferons result: antiviral activity, inhibition of cell division and enhancement of the activity of the NK Cells of the immune system (Doly et al., Cell. Mol.
  • interferon ⁇ 2 consisting of 166 amino acids is mainly used therapeutically because it has the highest affinity for the human interferon receptor.
  • amino acid sequence of interferon ⁇ 2 there are different domains which are responsible for the binding to the receptor and thus for the biological activity. These are the "loops" of amino acids 1-12, 25-38, 70-74 and 103-113 (Raj, J. Biol. Chem. 263 (1988), 8943-8952).
  • cytokines are generally only present in extremely low concentrations in the serum, it is not possible to isolate therapeutically replaceable amounts from this medium. Therefore So far the therapeutically used cytokines have been produced recombinantly, in bacteria or yeast. However, this procedure has a number of serious disadvantages.
  • cytokines require a lot of effort in the "set-up". For example, it must be clarified whether the host cell expresses the protein exactly or in the exact native conformation, which is the best host cell or the best expression vector and under which conditions the protein is not proteolytically degraded. It should be noted here that generally recombinantly produced proteins have a tertiary structure that differs from the native protein and are therefore recognized as "foreign" by the human immune system. The antibodies induced thereby neutralize the protein, for example the cytokine, and thus lead to a loss of its effectiveness.
  • cytokines normally have to be administered in a regular sequence during therapy, it must be ensured that they are absolutely free of contamination, i.e. especially components of the host cell. As a result, complex procedures must be used that have an unfavorable effect on pricing.
  • messenger substances e.g. cytokines
  • cytokines messenger substances
  • these cytokines are not just a have a site for the receptor, but that others - currently. domains not fully understood - that may induce signaling pathways other than those that are intended.
  • this could explain the frequently occurring side effects of the cytokines used to date, which in some cases make treatment with these impossible.
  • the invention is essentially based on the technical problem of providing compounds with a biological activity of interferon cc2 in such a way that the previous disadvantages of the prior art are avoided, i.e. when administered as a medicinal product, fewer side effects, a longer half-life and high biological activity are obtained.
  • One embodiment of the present invention relates to a synthetic homodimer or heterodimer composed of peptide monomers which have the amino acid sequences WDETLLKFYTELYQQL (Monomer I), SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQ (Monomer II) or QGVGVTETPLMKEDSILAV (Monomer III) or H, and the homodellor has an inter and the homodimer at the interferer, and the 2-homodimer is interfering with the homodimer Signal can trigger.
  • dimers according to the invention are based on the knowledge that the peptides have to be used in a dimerized form for a biological effect, since the receptors must also lie together twice in order to be able to trigger the intracellular signals and they have the following advantages: They are over standardized procedures are easy to synthesize and clean and can be directly added to the required tests (e.g. structural examinations, biological tests, preclinical and clinical studies). These peptides represent the minimal structures of each cytokine, which are responsible for its biological effectiveness required are. This ensures the highest specificity and high biological activity combined with the least side effects.
  • the peptides Due to the small size of the peptides, they can be microcapsulated, which results in depot forms with a different duration of action, depending on the pore size of the capsules.
  • the depot form can be applied locally, so that the highest concentration of the active ingredient is guaranteed over a long period of time at the desired location (eg cancer focus).
  • the peptides according to the invention are usually synthesized by known solid-phase synthesis processes, for example as described in Example 1 below.
  • the biological activity (binding to the receptor, triggering of a cellular signal and antiproliferative effect is investigated by methods known to the person skilled in the art, for example according to Lewis, J. Immunol. Methods 185 (1995), 9-17; Grander et al., Eur. J. Cancer 28A (1992), 815-818) or, for example, also according to the methods described in the examples below.
  • the peptides described above are homodimers or heterodimers in which the monomers are linked via their C-terminus or N-termini or the N-terminus of one monomer is linked to the C-terminus of the other monomer is linked.
  • the C-terminus of monomer I is linked to the N- or C-terminus of monomer II, or the N-terminus of monomer I is linked to the N- or C-terminus of monomer II.
  • the desired N-terminal peptide in a side-function-protected form is activated after removal of the protective group (preferably Fmoc) by treatment with, for example, piperidine with a crosslinker, and the product is purified by HPLC.
  • the protective group preferably Fmoc
  • Another previously synthesized monomer is also provided (either at the C- or N-terminus - depending on the desired di er) in a side-function-protected form with a group which only reacts with the N-terminal group of the bound peptide.
  • the dimers which differ significantly in their elution behavior from the monomers, are removed and isolated after removal of the side protecting groups using standard procedures using reverse phase HPLC.
  • the activation groups and crosslinkers can also be selected such that dimerization of free monomers can be carried out directly in solution after removal of the side chain protective groups.
  • the synthesis strategy can be carried out on the HYCHRON anchor as described in the example, so that the side chain protective groups are retained and dimerization can be carried out in aqueous solution.
  • This linkage can be carried out, for example, using the method described in the examples below or other standard methods, it being necessary to ensure that the dimerization takes place in such a way that binding to the receptor pair is still possible effectively.
  • the dimerization can be carried out on a lysine residue as a branch point (Wrighton et al., Nature Biotechnology 15 (1997), 1261-1265).
  • the constituents of the dimers according to the invention are preferably covalently linked to one another via linkers, such as polyethylene glycol, peptide (s), activated benzodiazepines, oxazolones, azalactones, amine imides, diketopiperazines, or (a) monosaccharide (s).
  • the present invention also relates to homodimers or heterodimers which are characterized in that the monomers are compared to the corresponding starting monomers 1, 11 and III, deletions, additions or substitutions of one or more amino acids and / or (a) modified amino acid (s) exhibit.
  • Homo- or heterodimers are obtained which, (a) bind to the interferon ⁇ 2 receptor in a similar or better way than the original forms and / or can trigger a cellular signal, or (b) can still bind to the interferon ⁇ 2 receptor, but have an antagonistic effect, ie after administration, the biologically active form is displaced by this form, which no longer leads to the triggering of a cellular signal after binding to the receptor.
  • Natural amino acids are preferably introduced in the case of the amino acid substitutions or additions, with modified amino acids not being excluded.
  • the preferred modifications include glycosylations with mono- or disaccharides of serine, threonine and asparagine, farnesylation and palmitoylation of cysteine, phosphorylation of threonine, serine and tyrosine, the modifications which affect the central amino acids mostly leading to antagonistic forms.
  • the deletions, additions, substitutions and / or modifications relate to at most 10, preferably at most 7, more preferably at most 3 and most preferably at most 1 amino acid (s) per monomer.
  • the homo- or heterodimers according to the invention which consist of modified monomers, contain, apart from the domain responsible for receptor binding, no further domains which are characteristic of the natural cytokine.
  • the homodimers or heterodimers according to the invention can be present as such, but can also be linked to other further compounds, for example (poly) peptides.
  • These (poly) peptides include, for example, carrier proteins, for example transferrin or albumin, which the body does not recognize as foreign.
  • the homodimers or heterodimers according to the invention can also be fused with other (poly) peptides, for example a leader peptide which enables or supports the penetration of the peptide according to the invention into the cell.
  • a leader peptide is Penetrin from Drosophila.
  • the present invention relates to the above homodimers or hecerodimers, which are further characterized in that one or more amino acids are covalently modified by fatty acids, mono- and / or oligosaccharides.
  • one or more amino acids are covalently modified by fatty acids, mono- and / or oligosaccharides.
  • This can be done by generally known methods, for example during the synthesis of the monomers through the use of amino acids which already carry the above modifications.
  • the modifications can also be made retrospectively. These modifications can, for example, achieve a higher resistance to proteolytic degradation and thus an even longer biological half-life.
  • the present invention further relates to an antibody or a fragment thereof against the dimers according to the invention described above. These antibodies can also be used in diagnostic assays, for example.
  • antibodies can be monoclonal, polyclonal or synthetic antibodies or fragments thereof.
  • fragment means all parts of the monoclonal antibody (e.g. Fab, Fv or "single chain Fv” fragments) which have the same epitope specificity as the complete antibody. The production of such fragments is known to the person skilled in the art.
  • the antibodies according to the invention are preferably monoclonal antibodies.
  • the antibodies according to the invention can be produced according to standard methods, the homodimers or heterodimers according to the invention serving as an immunogen. Methods for obtaining monoclonal antibodies are known to the person skilled in the art.
  • the invented monoclonal antibodies according to the invention an antibody derived from an animal (for example a mouse), a humanized antibody or a chimeric antibody or a fragment thereof.
  • Chimeric, human antibody-like or humanized antibodies have a reduced potential antigenicity, but their affinity for the target is not reduced.
  • the production of chimeric and humanized antibodies or from human antibodies resembling antibodies has been described (see, eg, Queen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86. (1989), 10029, and Verhoeyan et al., Science 239 (1988), 1534).
  • Humanized immunoglobulins have variable scaffold regions, which essentially come from a human immunoglobulin (with the name acceptor immunoglobulin) and the complementarity of the determining regions, which essentially come from a non-human immunoglobulin (eg from the mouse) (with the name Donor immunoglobulin).
  • the constant region (s), if any, also originate essentially from a human immunoglobulin.
  • humanized (as well as human) antibodies offer a number of advantages over antibodies from mice or other species: (a) the human immune system should not recognize the framework or constant region of the humanized antibody as foreign, and therefore should Antibody response to such an injected antibody is lower than that to a completely foreign mouse antibody " or a partially foreign chimeric antibody; (b) since the effector area of the humanized antibody is human, it interacts better with other parts of the human immune system, and (c) injected humanized antibodies have a half-life that is substantially equivalent to that of naturally occurring human antibodies, which allows smaller and less frequent doses to be administered compared to antibodies of other species ifft is also a hybridoma that produces the monoclonal antibody described above.
  • the present invention relates to the medicaments containing homodimers or heterodimers according to the invention and their use for the treatment of diseases of the immune system, of diseases which are associated with increased cell proliferation, for example cancerous diseases, of infectious or inflammatory processes.
  • cancers include hairline leukemia, metastatic renal cell carcinoma, AIDS-related Kaposi's sarcoma, lymphoma and sarcoma.
  • Certain modified forms of the dimers according to the invention can also have an antagonistic effect.
  • the present invention thus also relates to the medicaments containing homodimers or heterodimers according to the invention and their use for the treatment of diseases which are associated with an increased production of interferon or an increased expression of the interferon receptor, such as, for example, arthritic processes and allergic reactions as well as certain forms of skin diseases, such as psoriasis.
  • diseases which are associated with an increased production of interferon or an increased expression of the interferon receptor, such as, for example, arthritic processes and allergic reactions as well as certain forms of skin diseases, such as psoriasis.
  • the medicament according to the invention is optionally in combination with a suitable pharmaceutical carrier.
  • suitable carriers and the formulation of such medicaments are known to the person skilled in the art.
  • Suitable carriers include, for example, phosphate-buffered saline solutions, water, emulsions, for example oil / water emulsions, wetting agents, sterile solutions, etc.
  • the medicament according to the invention can be in the form of a solution for injection, tablet, ointment, suspension, emulsion, suppository, etc. It can also be administered in the form of depots (microcapsules, zinc salts, liposomes, etc.).
  • the mode of administration of the drug depends, among other things, on the form in which the active ingredient is present, and can be administered orally or parenterally.
  • Methods for parenteral administration include topical, intra-arterial (e.g. directly to a tumor), intramuscular, intramedullary, intrathecal, intraventricular, intravenous, intraperitoneal, transdermal or transmucosal (nasal, vaginal, rectal, sublingual) administration.
  • the appropriate dosage is determined by the attending doctor and depends on various factors, for example on the age, gender, weight of the patient, the type and stage of the disease, the type of administration, etc.
  • the present invention relates to a diagnostic composition which contains the homodimer or heterodimer according to the invention or the antibody according to the invention and can be used for diagnosing diseases which are associated with an altered or too high or too low expressed interferon cc2 receptor or with too high or too low concentration of interferon ⁇ 2.
  • the homodimers or heterodimers according to the invention can be present in generally customary assay formats (similar to the antibodies) for diagnostic detection. This detection includes, for example, (a) obtaining a cell sample from the patient, (b) contacting the cell sample thus obtained with the homo- or. Heterodimer or antibody as a probe under conditions that allow specific binding to the target and (c) detection of binding to the target.
  • the compounds according to the invention can be bound, for example, in the liquid phase or to a solid support and can be labeled in various ways. Suitable markers and marking methods are known to the person skilled in the art. These are also known cell disruption processes which allow interferon ⁇ 2 or the receptor to be brought into specific contact with the antibody or homo- or heterodimer according to the invention.
  • the dimers can be provided with a further linker which is biotinylated (Foxall et al., Anal. Biochem. 231 (1995), 266-373).
  • a further linker which is biotinylated (Foxall et al., Anal. Biochem. 231 (1995), 266-373).
  • Direct labeling of the dimer linker with alkaline phosphatase Ishikawa et al., J. Immunoassay 4 (1983), 209-327) or horseradish peroxidase (Imagawa et al., J. Appl. Biochem. 4 (1982), 41-75), each with subsequent development according to the ELISA or spot blot method (Paffard et al., J. Immunol. Meth. 192, (1996), 133-136).
  • the binding of the dimer can be quantified indirectly via a subsequent incubation with streptavidin-fluorescein isothiocyanate conjugates, for example in a flow cytometer.
  • the present invention relates to a diagnostic kit for carrying out the diagnostic method described above, which contains a dimer according to the invention or the antibody according to the invention or the fragment thereof.
  • the dimer or the antibody or the fragment thereof can be immobilized.
  • Example 1 Solid phase synthesis of WDETLLKFYTELYQQL (Monomer I), SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQ (Monomer II) and QGVGVTETPLMKEDSILAV (Monomer IIP
  • the monomers I-III were prepared according to a standard solid phase synthesis (Seitz et al., Angew. Chem. 107 (1995), 901). The synthesis was carried out on a HYCHRON anchor with an Fmoc-protected amino acid starting from the C-terminus.
  • the carboxyl groups of glutamic acid and aspartic acid were protected in the form of tert-butyl esters.
  • the protecting groups of the side chains of Tyr included tetrahydropyranyl, tert-butyl (Boc) and trityl groups.
  • Tosyl - Tos
  • Boc tert-butyloxycarbonyl
  • the complete monomers were synthesized in this order.
  • the finished monomers were separated from the column by a Palladiu (0) catalyzed allyl transfer, the protective groups on the side chains being retained.
  • the Fmoc group was then replaced by morpholine, the remaining protective groups were removed by treatment with TFA.
  • the dimerization of the monomers I was carried out by dissolving 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG-succinimidyl propionate, MW approx. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml of PBS, pH 7.5, after which a triple molar excess of monomers , dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid, was added. After 3 hours of incubation on ice, lyophilized monomers were again added, so that at the end there was a ratio of 3.5 mol of monomer to 1 mol of PEG. The mixture was incubated on ice for an additional 17 hours. PEG was inactivated by adding 1 M Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 M Tris) (incubation: 1 hour on ice). The mixture was subjected to both analytical and preparative HPLC (see Example 8).
  • PEG-succinimidyl propionate activated bifunctional polyethylene glycol
  • PBS
  • the dimerization of the monomers II was carried out by dissolving 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG-succinimidyl propionate, MW approx. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml of PBS, pH 7.5, after which a triple molar excess of monomers was dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid. After 3 hours of incubation on ice, lyophilized monomers were again added, so that at the end there was a ratio of 3.5 mol of monomer to 1 mol of PEG. The mixture was incubated on ice for an additional 17 hours.
  • PEG-succinimidyl propionate activated bifunctional polyethylene glycol
  • PEG was determined by adding 1 M Tris / HCl, pH 7.5, (final concentration: 50 mM Tris) inactivated (incubation: 1 hour on ice). The mixture was subjected to both analytical and preparative HPLC (see Example 8).
  • the dimerization of the monomers III was carried out by dissolving 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG-succini idylpropionate, MW approx. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH 7.5, after which a triple molar excess of monomers, dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid was added. After 3 hours of incubation on ice, lyophilized monomers were again added, so that at the end there was a ratio of 3.5 mol of monomer to 1 mol of PEG. The mixture was incubated on ice for an additional 17 hours. PEG was inactivated by adding 1 M Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 mM Tris) (incubation: 1 hour on ice). The mixture was subjected to both analytical and preparative HPLC (see Example 8).
  • PEG-succini idylpropionate MW approx. 3400; Sigma
  • the monomers were used in a ratio of 1: 1, and the separation is carried out by reverse phase HPLC.
  • Example 5 Polyethylene glycol dimerization of monomers II and I.
  • the monomers were dimerized by dissolving 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG succinimidyl propionate, MW approx. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml of PBS, pH 7.5, after which a triple molar excess of monomers, dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid was added. After 3 hours of incubation on ice, lyophilized monomers were again added, so that at the end there was a ratio of 3.5 mol of monomer to 1 mol of PEG. The mixture was incubated on ice for an additional 17 hours. PEG was inactivated by adding 1 M Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 mM Tris) (incubation: 1 hour on ice). The mixture was subjected to both analytical and preparative HPLC (see Example 8).
  • the monomers were used in a ratio of 1: 1, and the separation is carried out by reverse phase HPLC.
  • the monomers were dimerized by dissolving 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG-succinimidyl propionate, MW approx. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml of PBS, pH 7.5, after which a triple molar excess of monomers, dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid was added. After 3 hours of incubation on ice, lyophilized monomers were again added, so that at the end there was a ratio of 3.5 mol of monomer to 1 mol of PEG. The mixture was incubated on ice for an additional 17 hours. PEG was inactivated by adding 1 M Tris / HCl, pH 7.5 (final concentration: 50 mM Tris) (incubation: 1 hour on ice). The mixture was subjected to both analytical and preparative HPLC (see Example 8).
  • the monomers were used in a ratio of 1: 1, and the separation was carried out by reverse phase HPLC.
  • the monomers were dimerized by dissolving 25 mg of activated bifunctional polyethylene glycol (PEG-succinimidyl propionate, MW approx. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml of PBS, pH 7.5, after which a triple molar excess of monomers, dissolved in 1 ml of 0.1% trifluoroacetic acid was added. After 3 hours of incubation on ice, lyophilized monomers were again added, so that at the end there was a ratio of 3.5 mol of monomer to 1 mol of PEG. The mixture was incubated on ice for a further 17 hours. PEG was inactivated by adding 1 M Tris / HCl, pH 7.5, (final concentration: 50 mM Tris) (incubation: 1 hour on ice). The mixture was subjected to both analytical and preparative HPLC (see Example 8).
  • the monomers were used in a ratio of 1: 1, and the separation is carried out by reverse phase HPLC.
  • the dimer was further purified on a preparative reverse HPLC column (2.2 x 25 cm) on the same HPLC system.
  • the column was equilibrated at a " constant flow rate of 8 ml / min. With distilled water: acetonitrile 80:20 (both contained 0.1% TFA). 20 min. After injection of the sample (6 ml) it was 60 minutes linear gradient was run on 100% acetonitrile / 0.1% TFA. The main peak was collected and lyophilized. A flatter gradient was used for monomer II
  • the dimers were iodinated as described below. 20 ul chloramine T (0.5 mg / ml) were added to 20 ul Na 125 I (2 mCi, Amersham Buchler, Braunschweig), the mixture was 2 min. later mixed to 50 ⁇ l dimer (5 ⁇ g in PBS) and 15 sec. incubated. To terminate the reaction, 30 ⁇ l sodium metabulfite (1 mg / ml in PBS) and after 30 sec. 50 ⁇ l KI (10 mg / ml in PBS) were added. Gelatin (50 ⁇ l, 1 mg / ml.
  • the cells were washed 2 May with 1.5 ml PBS / 10 mM MgCl 2 , 1 mM CaCl 2 , 0.25% gelatin at 4 ° C. This was followed by a washing step with the same buffer, but without gelatin.
  • the washed cells were in 0.5 ml of 1N NaOH at 60 ° C for 30 min. solubilized and the solubilizate was measured in the scintillation counter. The extent of non-specific binding was determined in the presence of a 100-fold higher concentration of interferon ⁇ 2, with labeled homodimer and interferon a.2 being added to the cells simultaneously. The results are shown in Table I.
  • Example 12 Production and detection of an antibody according to the invention
  • the heterodimer prepared in Example 5 was subjected to 18% SDS polyacrylic acid gel electrophoresis. After staining the gel with 4 M sodium acetate, an approximately 7 kB band was cut out of the gel and incubated in phosphate-buffered saline. The dimer is eluted from the gel using an electroeluctor (BioRad) and lyophilized overnight after kB dialysis. The peptide is taken up in a concentration of 5 mg / ml PBS and mixed with the carrier protein albumin in a ratio of 1 mol peptide / p. 02 mol carrier in a total of 2 ml PBS.
  • the rabbit's serum was tested in the immunoblot.
  • a heterodimer according to the invention from Example 4 was subjected to SDS-polyacrylamide gel electrophoresis and transferred to a nitrocellulose filter (cf. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys. Meth. 10, (1984), 203-209).
  • Western blot analysis was performed as in Bock, C.-T. et al. , Virus Genes 8, (1994), 215-229.
  • the nitrocellulose filter was incubated for one hour at 37 ° C. with a first antibody. This antibody was rabbit serum (1: 10,000 in PBS).
  • the nitrocellulose filter was incubated with a second antibody.
  • This antibody was an alkaline phosphatase-coupled goat monoclonal anti-rabbit IgG antibody (Dianova) (1: 5000) in PBS. After 30 minutes of incubation at 37 ° C, several washing steps with PBS followed and then the alkaline phosphatase detection reaction with developer solution (36 ⁇ M 5 'bromo-4-chloro-3-indolylphosphate, 400 ⁇ M nitroblue tetrazolium, 100mm Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl 2 ) at room temperature until bands were visible.
  • Antibodies were extracted from egg yolk and tested in a Western blot. Polyclonal antibodies according to the invention have been detected.

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Abstract

Beschrieben werden Homodimere und Heterodimere aus Peptidmonomeren, die die Aminosäuresequenz WDETLLKFYTELYQQL (Monomer I), SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQ (Monomer II) oder QGVGVTETPLMKEDSILAV (Monomer III) haben oder Varianten davon, wobei die Homodimere oder Heterodimere an den Interferon α2 Rezeptor binden und gegebenenfalls ein zelluläres Signal auslösen können. Diese Dimere eignen sich einerseits zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, von Erkrankungen, die mit einer erhöhten oder erniedrigten Zellproliferation in Zusammenhang stehen, von infektiösen oder entzündlichen Prozessen, andererseits zum Nachweis von Erkrankungen, die beispielsweise mit einem veränderten oder zu hoch bzw. zu niedrig exprimierten Interferon α2 Rezeptor in Verbindung stehen.

Description

Von Interferon α2 abgeleitete Peptid-Homodimere und Peptid-Heterodimere
Die vorliegende Erfindung betrifft Homodimere oder Heterodimere aus Peptid onomeren, die die Aminosäuresequenz WDETLLKFYTELYQQL (Monomer I) , SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQ (Monomer II) oder QGVGVTETPLMKEDSILAV (Monomer III) haben bzw. Varianten davon, wobei die Homodimere oder Heterodimere an den Interferon α2 Rezeptor binden und gegebenenfalls ein zelluläres Signal auslösen können. Die vorliegende Erfindung betrifft darüber hinaus diese Homodimere bzw. Heterodimere enthaltende Arzneimittel. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung diagnostische Zusammensetzungen bzw. Diagnoseverfahren, bei denen die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere oder gegen diese gerichtete Antikörper eingesetzt werdenr
Die Tumortherapie stützt sich bisher im wesentlichen immer noch auf die drei Hauptsäulen: Chirurgie, Chemo- und Radiotherapie. In den letzten Jahren hat sich jedoch die Erkenntnis durchgesetzt, daß eine primäre (d.h. ausschließliche) oder adjuvante (unterstützende) Behandlung mit Cytokinen in vielen Fällen eine Verlängerung der Lebenserwartung bewirkt, oftmals sogar eine vollständige Heilung. Bei den Cytokinen handelt es sich um körpereigene Botenstoffe, die von unterschiedlichen Zellen synthetisiert und anschließend sezerniert werden. Die biologischen Aufgaben dieser Cytokine sind sehr vielfältig, werden jedoch bisher nur zum Teil verstanden. In der Hauptsache besitzen Cytokine jedenfalls fundamentale immunregulatori- sche Wirkungen. In der Tumortherapie breit eingesetzte Cytokine sind die Interferone. Dabei handelt es sich um eine Familie von mindestens 23 unterschiedlichen Varianten bestehend aus 156 - 166 bzw. aus 172 Aminosäuren (aa) , wobei sie ein Molekulargewicht von 19 - 26 kDa aufweisen (Weissman und Weber, Progr. Nucleic Acid Res . Mol. Biol . 33. (1986), 251-300, und Henco et al . , J. Mol. Biol. 185 (1985), 227-260). Durch Bin- d ng an den spezifischen Rezeptor lösen sie intrazelluläre Signale aus (Uze et al . , EMBO J. 4 (1985), 65-70), woraus die wesentlichen Effekte der Interferone resultieren: antivirale Wirkung, Hemmung der Zellteilung und Verstärkung der Aktivität der NK-Zellen des Immunsystems (Doly et al . , Cell. Mol. Life Sei. 54 (1998), 1109-1121). Daraus ergeben sich auch die wesentlichen Anwendungsgebiete für Interferone: Therapie der Haarzeil-Leukämie, des metastasierenden Nierenzellkarzinoms , des AIDS-assoziierten Kaposi-Sarkoms , verschiedener Formen von Lymphomen und Melanomen sowie der Hepatitis.
Innerhalb der Interferon-Familie wird hauptsächlich das aus 166 Aminosäuren bestehende Interferon α2 therapeutisch eingesetzt, da es die höchste Affinität für den humanen Interferon- Rezeptor besitzt. Innerhalb der Aminosäuresequenz von Interferon α2 gibt es verschiedene Domänen, die für die Bindung an den Rezeptor und damit für die biologische Aktivität verantwortlich sind. Dabei handelt es sich um die "loops" der Aminosäuren 1-12, 25-38, 70-74 und 103-113 (Raj , J. Biol. Chem. 263 (1988) , 8943-8952) .
Vielfach reicht die Verabreichung einer kurzen Interferon- Domäne, die mit dem Rezeptor interagiert, völlig aus, um die gewünschten zellulären Effekte (z.B. antiproliferative oder immunstimulatorische Wirkung) zu erzielen. Allerdings ist bisher für Interferon α2 nur eine Untersuchung (Danilkovitch et al . , Hybridoma 16, (1997), 69-75) mit einem synthetisierten Peptid durchgeführt worden, das einem Teilbereich von Interferon α2 entspricht, wobei dieses Peptid allerdings als Monomer und nur in in vitro Tests eingesetzt wurde. Darüber hinaus entsprach die Aminosäuresequenz dieses Peptids einem Teil des C-Terminus (aal24-144) . Man konnte leider nicht die gewünschten Ergebnisse erhalten.
Da Cytokine allgemein nur in äußerst geringen Konzentrationen im Serum vorkommen, ist eine Isolierung therapeutisch ersetzbarer Mengen aus diesem Medium nicht möglich. Daher wurden bisher die therapeutisch eingesetzten Cytokine rekombinant , in Bakterien oder Hefe, hergestellt. Diese Vorgehensweise weist jedoch eine Reihe von gravierenden Nachteilen auf.
(1) Die rekombinate Herstellung von Cytokinen erfordert einen hohen Aufwand beim "set-up" . So muß beispielsweise geklärt werden, ob die Wirtszelle das Protein genau bzw. in der exakten nativen Konformation exprimiert, welches überhaupt die beste Wirtszelle bzw. der beste Expressionsvektor ist und unter welchen Bedingungen das Protein nicht proteolytisch abgebaut wird. Hier ist festzuhalten, daß allgemein rekombinant hergestellte Proteine eine vom nativen Protein abweichende Tertiärstruktur aufweisen und deswegen vom menschlichen Immunsystem als "fremd" erkannt werden. Die dadurch induzierten Antikörper neutralisieren das Protein, beispielsweise das Cytokin, und führen so zu einem Verlust von dessen Wirksamkeit.
(2) Die Isolierung und Reinigung rekombinanter Proteine gestaltet sich schwierig, da sich prinzipiell immer die gleichen, für jedes neue Produkt spezifischen Fragen stellen, nämlich wie kann verhindert werden, wie das Protein proteolytisch abgebaut wird und/oder nach der Isolierung ausfällt. Allgemein zeigen rekombinant hergestellte Proteine eine auffällige Labilität gegenüber Proteasen. Dies erfordert eine häufige und/oder hochdosierte Verabreichung, die einerseits den Patienten sehr belastet, andererseits aber auch die Therapie sehr kostspielig gestaltet.
(3) Da die Cytokine normalerweise bei der Therapie in regelmäßiger Folge verabreicht werden müssen, muß gewährleistet sein, daß sie absolut frei von Kontaminationen, d.h. vor allem von Bestandteilen der Wirtszelle, sind. Dadurch müssen komplexe Verfahren eingesetzt werden, die sich ungünstig auf die Preisgestaltung auswirken.
(4) Inzwischen hat sich weitgehend die Erkenntnis durchgesetzt, daß Botenstoffe (z.B. Cytokine) nicht nur eine Bin- dungsstelle für den Rezeptor besitzen, sondern daß weitere - z.Zt. noch nicht vollständig verstandene - Domänen vorhanden sind, die möglicherweise andere Signalwege induzieren können als die, die eigentlich beabsichtigt sind. Damit könnten unter anderem auch die häufig auftretenden Nebenwirkungen der bisher eingesetzten Cytokinen erklärt werden, die teilweise eine Behandlung mit diesen unmöglich machen.
Somit liegt der Erfindung im wesentlichen das technische Problem zugrunde, Verbindungen mit einer biologischen Aktivität von Interferon cc2 in einer Weise bereitzustellen, daß die bisherigen Nachteile des Stands der Technik vermieden werden, d.h. bei Verabreichung als Arzneimittel geringere Nebenwirkungen, eine höhere Halbwertszeit und hohe biologische Aktivität erhalten werden.
Die Lösung dieses technischen Problems wurde durch die Bereitstellung der in den Patentansprüchen gekennzeichneten Aus- führungsformen erreicht.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein synthetisches Homodimer oder Heterodimer aus Peptidmonomeren, die die Aminosäuresequenzen WDETLLKFYTELYQQL (Monomer I) , SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQ (Monomer II) oder QGVGVTETPLMKEDSILAV (Monomer III) haben, wobei das Homodimer oder Heterodimer an den Interferon 2 Rezeptor binden und ein zelluläres Signal auslösen kann. Diese erfindungsgemäßen Dimere basieren auf der Erkenntnis, daß für eine biologische Wirkung der Einsatz der Peptide in dimerisierter Form erfolgen muß, da auch die Rezeptoren zweifach zusammenliegen müssen, um zur Auslösung der intrazellulären Signale fähig zu sein und sie weisen folgende Vorteile auf: Sie sind über standardisierte Verfahren einfach zu synthetisieren und zu reinigen und können unmittelbar den erforderlichen Tests (z.B. strukturelle Untersuchungen, biologische Tests, präklinische und klinische Studien) zugeführt werden. Diese Peptide stellen die minimalen Strukturen des jeweiligen Cytokins dar, die für seine biologische Wirksamkeit erforderlich sind. Dadurch ist höchste Spezifität und hohe biologische Aktivität in Verbindung mit geringsten Nebenwirkungen gewährleistet. Aufgrund der geringen Größe der Peptide können sie mikrokapsuliert werden, wodurch sich Depotformen mit unterschiedlich langer Wirkunsdauer - abhängig von der jeweiligen Porengröße der Kapseln - ergeben. Die Depotform kann lokal appliziert werden, sodaß an der gewünschten Stelle (z.B. Krebsherd) die höchste Konzentration des Wirkstoffs über einen langen Zeitraum gewährleistet ist.
Die Synthese der erfindungsgemäßen Peptide erfolgt üblicherweise nach bekannten Festphasen-Syntheseverfahren, beispielsweise wie nachstehend in Beispiel 1 beschrieben. Die Untersuchung der biologischen Aktivität (Bindung an den Rezeptor, Auslösung eines zellulären Signals und antiproliferative Wirkung erfolgt nach dem Fachmann bekannten Verfahren, z.B. gemäß Lewis, J. Immunol. Methods 185 (1995), 9-17; Grander et al . , Eur. J. Cancer 28A (1992), 815-818) oder beispielsweise auch gemäß den in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren.
In einer bevorzugten erfindungsgemäßen Ausführungsform handelt es sich bei den vorstehend beschriebenen Peptiden um Homodimere oder Heterodimere, bei denen die Monomere über ihre C-Ter- mini oder N-Termini verknüpft sind oder der N-Terminus eines Monomers mit dem C-Terminus des anderen Monomers verknüpft ist. Vorzugsweise ist der C-Terminus von Monomer I mit dem N- oder C-Terminus von Monomer II, oder der N-Terminus von Monomer I mit dem N- oder C-Terminus von Monomer II verknüpft. Dabei wird beispielhaft das gewünschte N-terminale Peptid in Seitenfunktion-geschützter Form nach Entfernen der Schutzgruppe (bevorzugt Fmoc) durch Behandlung mit z.B. Piperidin mit einem Crosslinker aktiviert und das Produkt über HPLC gereinigt. Ein anderes zuvor synthetisiertes Monomer wird ebenfalls (entweder am C- oder N-Terminus - je nach gewünschtem Di er) in Seitenfunktion-geschützter Form mit einer Gruppe versehen, die ausschließlich mit der N-terminalen Gruppe des gebundenen Peptids reagiert. Nach Zugeben dieses Monomers zum aktivierten Monomer werden die Dimere, die sich im Elutions- verhalten deutlich von den Monomeren unterscheiden, nach Entfernen der Seitenschutzgruppen nach Standardverfahren über Umkehrphasen-HPLC gereinigt und isoliert. Falls es die Amino- säurenzusammensetzung zuläßt, können die Aktivierungsgruppen und Crosslinker auch so ausgewählt werden, daß eine Dimerisierung an freien Monomeren nach Entfernen der Seitenketten- Schutzgruppen direkt in Lösung durchgeführt werden kann. Alternativ kann die Synthesestrategie wie im Beispiel beschrieben am HYCHRON-Anker durchgeführt werden, sodaß die Seitenketten-Schutzgruppen erhalten bleiben und eine Dimerisierung in wässriger Lösung durchgeführt werden kann.
Diese Verknüpfung kann beispielsweise mittels dem in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren oder anderen Standardverfahren durchgeführt werden, wobei darauf geachtet werden muß, daß die Dimerisierung so erfolgt, daß eine Bindung an das Rezeptorpaar noch wirksam möglich ist. So kann z.B. die Dimerisierung an einem Lysin-Rest als Verzweigungspunkt durchgeführt werden (Wrighton et al . , Nature Biotechnology 15 (1997), 1261-1265). Vorzugsweise sind die Bestandteile der erfindungsgemäßen Dimere über Linker, wie Polyäthelnglykol , Peptid (e), aktivierte Benzodiazepine, Oxazolone, Azalactone, Aminimide, Diketopiperazine, oder (ein) Monosaccharid(e) , kovalent miteinander verknüpft. Die entsprechend durchzuführenden chemischen Reaktionen sind dem auf diesem Gebiet arbeitenden Fachmann bekannt (Hermannson, Bioconjugate Techni- ques (1996) Acade ic Press, San Diego; Peeters et al . , J. Im unol. Methods 120 (1989), 133-144; Imman et al .. Bioconjugate Chem. 2 (1991), 458-463).
Die vorliegende Erfindung betrifft außerdem Homodimere oder Heterodimere, die dadurch gekennzeichnet sind, daß die Mono e- re gegenüber den entsprechenden Ausgangmonomeren 1,11 und III Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure (n) aufweisen. Dabei werden Homo- bzw. Heterodimere erhal- ten, die (a) im Vergleich zu den ursprünglichen Formen ähnlich oder besser an den Interferon α2 Rezeptor binden und/oder ein zelluläres Signal auslösen können, oder (b) an den Interferon α2 Rezeptor zwar noch binden können, jedoch eine antagonistische Wirkung aufweisen, d.h. nach Verabreichung wird die biologisch aktive Form durch diese Form, die nicht mehr zur Auslösung eines zellulären Signals nach Bindung an den Rezeptor führt, verdrängt. Inwieweit diese veränderten Homo- bzw. Heterodimere die gewünschten biologischen Eigenschaften aufweisen, kann mittels der in den nachstehenden Beispielen beschriebenen Verfahren bzw. den vorstehend beschriebenen Verfahren untersucht werden. Vorzugsweise werden bei den Aminsosäuresubstitu- tionen bzw. Additionen natürliche Aminosäuren eingeführt, wobei modifizierte Aminosäuren nicht ausgeschlossen sind. Zu den bevorzugten Modifikationen zählen Glykosylierungen mit Mono- oder Disacchariden von Serin, Threonin und Asparagin, Farnesylierung und Palmitoylierung von Cystein, Phosphorylie- rung von Threonin, Serin und Tyrosin, wobei die Modifikationen, die die zentralen Aminosäuren betreffen, meist zu antagonistischen Formen führen. Bei den vorstehend beschriebenen veränderten erfindungsgemäßen Homodimeren bzw. Heterodimeren betreffen die Deletionen, Additionen, Substitutionen und/oder Modifikationen höchstens 10, vorzugsweise höchstens 7, stärker bevorzugt höchstens 3 und am meisten bevorzugt höchstens 1 Aminosäure (n) pro Monomer. Die erfindungsgemäßen, aus veränderten Monomeren bestehenden Homo- bzw. Heterodimere enthalten neben der für die Rezeptorbindung verantwortlichen Domäne keine weiteren Domänen, wie sie für das natürliche Cytokin charakteristisch sind.
Die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere können als solche vorliegen, aber auch mit anderen weiteren Verbindungen, beispielsweise (Poly)peptiden verknüpft sein. Zu diesen (Po- ly)peptiden zählen beispielsweise Trägerproteine, z.B. Trans- ferrin oder Albumin, die vom Körper nicht als fremd erkannt werden. Die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere können auch noch mit anderen (Poly)peptiden fusioniert sein, beispielsweise einem Leaderpeptid, das das Eindringen des erfindungsgemäßen Peptids in die Zelle ermöglicht oder unterstützt. Ein Beispiel für ein solches Leaderpeptid ist Penetra- tin von Drosophila.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die vorstehenden Homodimere oder Hecerodimere, die weiter dadurch gekennzeichnet sind, daß eine oder mehrere Aminosäuren durch Fettsäuren, Mono- und/oder Oligosaccharide kovalent modifiziert sind. Dies kann durch allgemein bekannte Verfahren erfolgen, beispielsweise während der Synthese der Monomere durch den Einsatz von Aminosäuren, die bereits die vorstehenden Modifikationen tragen. Die Modifizierungen können aber auch nachträglich erfolgen. Durch diese Modifizierungen kann beispielsweise eine höhere Resistenz gegenüber einem proteolytischen Abbau und damit eine noch höhere biologische Halbwertszeit erreicht werden.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung einen Antikörper oder ein Fragment davon gegen die vorstehend beschriebenen erfindungsgemäßen Dimere. Diese Antikörper können beispielsweise auch in diagnostischen Assays verwendet werden.
Diese Antikörper können monoclonale, polyclonale oder synthetische Antikörper sein oder Fragmente davon. In diesem Zusammenhang bedeutet der Begriff "Fragment" alle Teile des monoclonalen Antikörpers (z.B. Fab- , Fv- oder "Single chain Fv" -Fragmente) , welche die gleiche Epitopspezifität wie der vollständige Antikörper aufweisen. Die Herstellung solcher Fragmente ist dem Fachmann bekannt. Vorzugsweise handelt es sich bei den erfindungsgemäßen Antikörpern um monoclonale Antikörper. Die erfindungsgemäßen Antikörper können gemäß Standardverfahren hergestellt werden, wobei die erfindungsgemäßen Homodimere oder Heterodimere als Immunogen dienen. Verfahren zur Gewinnung monoclonaler Antikörper sind dem Fachmann bekann .
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist der erfin- dungsgemäße monoclonale Antikörper ein aus einem Tier (z.B. Maus) stammender Antikörper, ein humanisierter Antikörper oder ein chimärer Antikörper oder ein Fragment davon. Chimäre, menschlichen Antikörper ähnelnde oder humanisierte Antikörper besitzen eine herabgesetzte potentielle Antigenität, jedoch ist ihre Affinität gegenüber dem Ziel nicht herabgesetzt. Die Herstellung von Chimären und humanisierten Antikörpern bzw. von den menschlichen Antikörpern ähnelnden Antikörpern wurde ausführlich beschrieben (siehe beispielsweise Queen et al . , Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86. (1989), 10029, und Verhoeyan et al . , Science 239 (1988), 1534). Humanisierte Immunglobuline weisen variable Grundgerüstbereiche auf, die im wesentlichen von einem humanen Immunglobulin stammen (mit der Bezeichnung Akzeptor-Immunglobulin) und die Komplementarität der determinierenden Bereiche, die im wesentlichen von einem nicht- menschlichen Immunglobulin (z.B. von der Maus) stammen (mit der Bezeichnung Donor-Immunglobulin) . Die (der) konstante (n) Bereich(e) stammt (stammen), falls vorhanden, auch im wesentlichen von einem menschlichen Immunglobulin. Bei der Verabreichung an menschliche Patienten bieten humanisierte (sowie die menschlichen) Antikörper eine Reihe von Vorteilen gegenüber Antikörpern von Mäusen oder anderen Spezies: (a) das menschliche Immunsystem sollte das Grundgerüst oder den konstanten Bereich des humanisierten Antikörpers nicht als fremd erkennen und daher sollte die Antikörperantwort gegen einen solchen injizierten Antikörper geringer ausfallen als gegen einen vollständig fremden Maus-Antikörper"oder einen partiell fremden Chimären Antikörper; (b) da der Effektorbereich des humanisierten Antikörpers menschlich ist, interagiert er besser mit anderen Teilen des menschlichen Immunsystems, und (c) injizierte humanisierte Antikörper weisen eine Halbwertszeit auf, die im wesentlichen zu der von natürlich vorkommenden menschlichen Antikörpern äquivalent ist, was es erlaubt, kleinere und weniger häufige Dosen im Vergleich zu Antikörpern anderer Spezies zu verabreichen. Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Hybridom, das den vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper erzeugt. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere enthaltende Arzneimittel bzw. deren Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Zellprolife- ration in Zusammenhang stehen, beispielsweise Krebserkran- kungen, von infektiösen oder entzündlichen Prozessen. Zu diesen Krebserkrankungen zählen beispielsweise Haarzeil-Leukämie, metastasierendes Nierenzellkarzinom, AIDS-assoziiertes Kaposi- Sarkom, ein Lymphom und Sarkom. Bestimmte modifizierte Formen der erfindunggemäßen Dimere können auch eine antagonistische Wirkung auweisen. Somit betrifft die vorliegende Erfindung auch die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere enthaltende Arzneimittel bzw. deren Verwendung zur Behandlung von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Produktion von Interferon bzw. einer erhöhten Expression des Interferon-Rezeptors in Zusammenhang stehen, wie z.B. arthritische Prozesse, allergische Reaktionen sowie bestimmte Formen von Hauterkrankungen, wie z.B. Psoriasis.
Das erfindungsgemäße Arzneimittel liegt gegebenenfalls in Kombination mit einem geeigneten pharmazeutischen Träger vor. Geeignete Träger und die Formulierung derartiger Arzneimittel sind dem Fachmann bekannt. Zu geeigneten Trägern zählen beispielsweise Phosphat-gepufferte Kochsalzlösungen, Wasser, Emulsionen, beispielsweise Öl/Wasser-Emulsionen, Netzmittel, sterile Lösungen etc. Das erfindungsgemäße Arzneimittel kann in Form einer Injektionslösung, Tablette, Salbe, Suspension, Emulsion, eines Zäpfchens etc. vorliegen. Es kann auch in Form von Depots (Mikrokapseln, Zinksalze, Liposomen etc.) verabreicht werden. Die Art der Verabreichung des Arzneimittels hängt unter anderen davon ab, in welcher Form der Wirkstoff vorliegt, sie kann oral oder parenteral erfolgen. Zu den Verfahren für die parenterale Verabreichung gehören die topische, intra-arterielle (z.B. direkt zu einem Tumor) , intramuskuläre, intramedulläre, intrathekale, intraventrikuläre, intravenöse, intraperitoneale, transdermale oder transmukosale (nasal, vaginal, rektal, sublingual) Verabreichung. Die geeignete Dosierung wird von dem behandelnden Arzt bestimmt und hängt von verschiedenen Faktoren ab, beispielsweise von dem Alter, dem Geschlecht, dem Gewicht des Patienten, der Art und dem Stadium der Erkrankung, der Art der Verabreichung etc.
Ferner betrifft die vorliegende Erfindung eine diagnostische Zusammensetzung, die das erfindungsgemäße Homodimer oder Heterodimer enthält oder den erfindungsgemäßen Antikörper und zur Diagnose von Erkrankungen verwendet werden kann, die mit einem veränderten oder zu hoch bzw. zu niedrig exprimierten Interferon cc2 Rezeptor in Zusammenhang stehen bzw. mit einer zu hohen oder geringen Konzentration von Interferon α2. Dabei können die erfindungsgemäßen Homodimere bzw. Heterodimere in allgemein üblichen Assayformaten (ähnlich den Antikörpern) zum diagnostischen Nachweis vorliegen. Dieser Nachweis beinhaltet beispielsweise (a) die Gewinnung einer Zellprobe von dem Patienten, (b) das Inkontaktbringen der so erhaltenen Zellprobe mit dem erfindungsgemäßen Homo- bz . Heterodimer oder Antikörper als Sonde unter Bedingungen, die die spezifische Bindung an das Ziel erlauben, und (c) den Nachweis der Bindung an das Ziel. Dieser Nachweis kann unter Anwendung von dem Fachmann bekannten Standardtechniken durchgeführt werden. Dabei können die erfindungsgemäßen Verbindungen beispielsweise in Flüssigphase oder an einen festen Träger gebunden werden und auf verschiedene Art und Weise markiert sein. Geeignete Marker und Markierungsverfahren sind dem Fachmann bekannt. Diesem sind auch Zellaufschlußverfahren bekannt, die es erlauben, daß Interferon α2 bzw. der Rezeptor mit dem erfindungsgemäßen Antikörper oder Homo- bzw. Heterodimer in spezifischen Kontakt gebracht werden kann.
Zur Bestimmung der Rezeptor-Zahl können die Dimere mit einem weiteren Linker versehen werden, der biotinyliert ist (Foxall et al., Anal. Biochem. 231 (1995), 266-373). Es kann auch eine direkte Markierung des Dimer-Linkers mit alkalischer Phospha- tase (Ishikawa et al . , J. Immunoassay 4 (1983), 209-327) oder Meerrettich-Peroxidase (Imagawa et al . , J. Appl . Biochem. 4 (1982), 41-75) erfolgen, jeweils mit nachfolgender Entwicklung gemäß ELISA- oder spot-blot-Verfahren (Paffard et al . , J. Immunol. Meth. 192, (1996), 133-136). Nach Inkubation der zu untersuchenden Zellen (z.B. Zellen des Immunsystems nach Isolierung aus dem Patientenblut) mit diesem Kons rukt kann die Bindung des Dimers indirekt über eine nachfolgende Inkubation mit Streptavidin-Fluoresceinisothiocyanat-Konjugaten quantifiziert werden, z.B. in einem Durchflußzytometer .
Schließlich betrifft die vorliegende Erfindung einen diagnostischen Kit zur Durchführung des vorstehend beschriebenen Diagnoseverfahrens, der ein erfindungsmäßes Dimer oder den erfindungsgemäßen Antikörper oder das Fragment davon enthält. Je nach Ausgestaltung des diagnostischen Kits können das Dimer bzw. der Antikörper oder das Fragment davon immobilisiert sein.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.
Beispiel 1: Festphasensvnthese von WDETLLKFYTELYQQL (Monomer I) , SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQ (Monomer II) und QGVGVTETPLMKEDSILAV (Monomer IIP
Die Monomere I-III wurden nach einer Standard-Festphasensyn- these hergestellt (Seitz et al . , Angew. Chem. 107 (1995), 901). Die Synthese erfolgte an einem HYCHRON-Anker mit einer Fmoc-geschützten Aminosäure mit Start über den C-Terminus. Die Carboxylgruppen von Glutaminsäure und Asparaginsäure wurden in Form von tert-butyl-Estern geschützt. Die Schutzgruppen der Seitenketten von Tyr beinhalteten tetrahydropyranyl- , tert- butyl(Boc)- und trityl-Gruppen. Die Seitenketten-Schutzgruppen von Serin und Threonin beinhalteten Acetyl-, Benzoyl- und Benzloxycarbonyl-Gruppen (=Cbz) . Die Schutzgruppen für die Seitenkette von Arginin beinhaltete beinhalteten Cbz , Mesity- len-2-sulfonyl (=Mts) oder tert-butyloxycarbonyl (=Boc) . Die Seitenkette von Lysin wurde durch Tosyl-(=Tos) oder Boc geschützt. Nach Entfernen der -Amino-Schutzgruppe und entsprechenden Waschschritten, gefolgt von Aktivierung der Carbox- ylgruppe der nächsten Aminosäure wurde diese an die vorhergehende Aminosäure gekuppelt. In dieser Reihenfolge wurden die kompletten Monomere synthetisiert. Die fertigen Monomere wurde durch einen Palladiu ( 0 ) katalysierten Allyl-Transfer von der Säule gelöst, wobei die Schutzgruppen an den Seitenketten erhalten blieben. Anschließend wurde die Fmoc-Gruppe durch Morpholin abgelöst, die restlichen Schutzgruppen wurden durch Behandlung mit TFA abgespalten.
Beispiel 2 : Polyäthylenqlvkol-Dimerisierunσ von Monomer I
Die Dimerisierung der Monomere I erfolgte durch Lösen von 25 mg von aktiviertem bifunktionellern Polyäthylenlykol (PEG-Suc- cinimidylpropionat , MW ca. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH-Wert 7,5, wonach ein dreifacher molarer Überschuß an Monomeren, gelöst in 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure, zugegeben wurde. Nach 3 Stunden Inkubation auf Eis wurden nochmals ly- ophilisierte Monomere zugegeben, so daß zum Schluß ein Verhältnis von 3,5 Mol Monomer zu 1 Mol PEG vorlag. Das Gemisch wurde weitere 17 Stunden auf Eis inkubiert. PEG wurde durch Zugabe von 1 M Tris/HCl, pH-Wert 7,5, (Endkonzentration: 50 M Tris) inaktiviert (Inkubation: 1 Stunde auf Eis) . Das Gemisch wurde sowohl einer analytischen als auch präparativen HPLC unterzogen (siehe Beispiel 8).
Beispiel 3 : Polyäthylenglykol-Dimerisierung von Monomer II
Die Dimerisierung der Monomere II erfolgte durch Lösen von 25 mg von aktiviertem bifunktionellem Polyäthylenglykol (PEG- Succinimidylpropionat, MW ca. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH-Wert 7,5, wonach ein dreifacher molarer Überschuß an Monomeren, gelöst in 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure, zugegeben wurde. Nach 3 Stunden Inkubation auf Eis wurden nochmals lyophilisierte Monomere zugegeben, so daß zum Schluß ein Verhältnis von 3,5 Mol Monomer zu 1 Mol PEG vorlag. Das Gemisch wurde weitere 17 Stunden auf Eis inkubiert. PEG wurde durch Zugabe von 1 M Tris/HCl, pH-Wert 7,5, (Endkonzentration: 50 mM Tris) inaktiviert (Inkubation: 1 Stunde auf Eis). Das Gemisch wurde sowohl einer analytischen als auch präparativen HPLC unterzogen (siehe Beispiel 8) .
Beispiel 4: Polväthylenglykol-Dimerisierunσ von Monomer III
Die Dimerisierung der Monomere III erfolgte durch Lösen von 25 mg von aktiviertem bifunktionellem Polyäthylenglykcl (PEG- Succini idylpropionat , MW ca. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH-Wert 7,5, wonach ein dreifacher molarer Überschuß an Monomeren, gelöst in 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure, zugegeben wurde. Nach 3 Stunden Inkubation auf Eis wurden nochmals lyophilisierte Monomere zugegeben, so daß zum Schluß ein Verhältnis von 3,5 Mol Monomer zu 1 Mol PEG vorlag. Das Gemisch wurde weitere 17 Stunden auf Eis inkubiert. PEG wurde durch Zugabe von 1 M Tris/HCl, pH-Wert 7,5, (Endkonzentration: 50 mM Tris) inaktiviert (Inkubation: 1 Stunde auf Eis). Das Gemisch wurde sowohl einer analytischen als auch präparativen HPLC unterzogen (siehe Beispiel 8).
Die Monomere wurden im Verhältnis 1:1 eingesetzt, die Abtrennung erfolgt über Umkehrphasen-HPLC .
Beispiel 5 : Polväthylenqlykol-Dimerisierunq der Monomere II und I
Die Dimerisierung der Monomere erfolgte durch Lösen von 25 mg von aktiviertem bifunktionellem Polyäthylenglykol (PEG-Succi- nimidylpropionat , MW ca. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH-Wert 7,5, wonach ein dreifacher molarer Überschuß an Monomeren, gelöst in 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure, zugegeben wurde. Nach 3 Stunden Inkubation auf Eis wurden nochmals lyophilisierte Monomere zugegeben, so daß zum Schluß ein Verhältnis von 3,5 Mol Monomer zu 1 Mol PEG vorlag. Das Gemisch wurde weitere 17 Stunden auf Eis inkubiert. PEG wurde durch Zugabe von 1 M Tris/HCl, pH-Wert 7,5, (Endkonzentration: 50 mM Tris) inaktiviert (Inkubation: 1 Stunde auf Eis). Das Gemisch wurde sowohl einer analytischen als auch präparativen HPLC unterzogen (siehe Beispiel 8).
Die Monomere wurden im Verhältnis 1:1 eingesetzt, die Antren- nung erfolgt über Umkehrphasen-HPLC .
Beispiel 6: Polväthylenqlykol-Dimerisierunσ der Monomere III und I
Die Dimerisierung der Monomere erfolgte durch Lösen von 25 mg von aktiviertem bifunktionellem Polyäthylenglykol (PEG-succi- nimidylpropionat , MW ca. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH-Wert 7,5, wonach ein dreifacher molarer Überschuß an Monomeren, gelöst in 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure, zugegeben wurde. Nach 3 Stunden Inkubation auf Eis wurden nochmals ly- ophilisierte Monomere zugegeben, so daß zum Schluß ein Verhältnis von 3,5 Mol Monomer zu 1 Mol PEG vorlag. Das Gemisch wurde weitere 17 Stunden auf Eis inkubiert. PEG wurde durch Zugabe von 1 M Tris/HCl, pH-Wert 7,5, (Endkonzentration: 50 mM Tris) inaktiviert (Inkubation: 1 Stunde auf Eis). Das Gemisch wurde sowohl einer analytischen als auch präparativen HPLC unterzogen (siehe Beispiel 8) ._
Die Monomere wurden im Verhältnis 1:1 eingesetzt, die Abtrennung erfolgte über Umkehrphasen-HPLC.
Beispiel 7: Polväthylenqlykol-Dimerisierunq der Monomere III und II
Die Dimerisierung der Monomere erfolgte durch Lösen von 25 mg von aktiviertem bifunktionellem Polyäthylenglykol (PEG-succi- nimidylpropionat , MW ca. 3400; Sigma, Taufkirchen) in 4 ml PBS, pH-Wert 7,5, wonach ein dreifacher molarer Überschuß an Monomeren, gelöst in 1 ml 0,1% Trifluoressigsäure, zugegeben wurde. Nach 3 Stunden Inkubation auf Eis wurden nochmals ly- ophilisierte Monomere zugegeben, so daß zum Schluß ein Verhältnis von 3,5 Mol Monomer zu 1 Mol PEG vorlag. Das Gemisch wurde weitere 17 Stunden auf Eis inkubiert. PEG wurde durch Zugabe von 1 M Tris/HCl, pH-Wert 7,5, (Ξndkonzentration: 50 mM Tris) inaktiviert (Inkubation: 1 Stunde auf Eis). Das Gemisch wurde sowohl einer analytischen als auch präparativen HPLC unterzogen (siehe Beispiel 8).
Die Monomere wurden im Verhältnis 1:1 eingesetzt, die Abtrennung erfolgt über Umkehrphasen-HPLC.
Beispiel 8 : Analytische und präparative HPLC
Die Bildung der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Dimere wurde durch analytische Umkehrphasen-HPLC überprüft. Die Analyse wurde mittels einer Vydac-C18 Protein-Peptid-Säule
(0,46 x 25 cm) (The Separation Group) einem BioRad HPLC-System und einem Zweiwellenlängen-Detektor von Perkin-Elmer durchgeführt. Die Säule wurde mit 0,1% TFA in dest. Wasser äquili- briert, und 10 min. nach Injektion der Probe (in der Regel 6 ml) wurde ein 45-minütiger linearer Gradient (0-100) von Ace- tonitril mit 0,1% TFA gefahren. Die Flußrate wurde kontinuierlich bei 1 ml /min. gehalten. Unter diesen Bedingungen erschien der Quervernetzer im Durchfluß. Das Reaktionsprodukt eluierte nach 37 min. , während das unkonjugierte Monomer bereits nach 32 min. eluiert wurde und damit klar vom Dimer abgetrennt werden konnte . Das Dimer wurde auf einer präparativen Umkehr- HPLC-Säule (2,2 x 25 cm) am gleichen HPLC-System weiter aufgereinigt. Die Säule wurde mit einer "konstanten Flußrate von 8 ml/min. mit dest. Wasser :Acetonitril 80:20 (beide enthielten 0,1% TFA) äquilibriert . 20 min. nach Injektion der Probe ( 6 ml) wurde ein 60-minütiger linearer Gradient auf 100% Acetoni- tril/0,1% TFA gefahren. Der Hauptpeak wurde gesammelt und lyophilisiert . Für das Monomer II wurde ein flacherer Gradient
(20-80% Acetonitril/0, 1% TFA über 60%) gefahren, um so eine bessere Abtrennung zu erreichen. Die isolierten Dimere und die nativen Monomere wurden in Bindungsstudien (siehe Beispiel 10) und Proliferationstests (siehe Beispiel 11) eingesetzt. Beispiel 9 : Radioaktive Markierung der Dimere
Die Dimere wurden wie nachstehend beschrieben iodiert. 20 μl Chloramin T (0,5 mg/ml) wurden zu 20 μl Na125I (2 mCi, Amersham Buchler, Braunschweig) gegeben, das Gemisch wurde 2 min. später zu 50 μl Dimer (5 μg in PBS) zugemischt und 15 sec . inkubiert. Zur Beendigung der Reaktion wurden 30 μl Natrium-meta- bisulfit (1 mg/ml in PBS) und nach 30 sec. 50 μl KI (10 mg/ml in PBS) zugegeben. Als Carrier wurde Gelatine (50 μl , 1 mg/ml. In dest. Wasser) zugegeben und die Lösung sofort auf eine Bio- Sil SEC 125-5 Säule (BioRad, 10 ml) aufgetragen, die mit 0,25% Gelatine/0, 02% Natriumazid in PBS äquilibriert war. Die Fraktionen, die das radioaktive Produkt enthielten, wurden vereinigt und auf der Umkehrphasen-HPLC-Säule wie in Beispiel 8 beschrieben weiter aufgereinigt und isoliert. Die gereinigten Dimere wiesen eine spezifische Radioaktivität von 50-100 μCi/μg auf, ergaben in der Tricin-SDS-PAGE eine einzelne Bande und die Radioaktivität konnte zu 95-100% mit dem Chloroform/Methanol-Verfahren (Wessel et al . , Anal. Biochem. 138 (1984), 141-143) gefällt werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß das radioaktiv markierte Produkt aus einem reinen Dimer bestand und daß die Radioaktivität ausschließlich dem Dimer zuzuschreiben war.
Beispiel 10: Zellbindunqsstudien
Diese Studien geben Aufschluß darüber, ob die erfindungsgemäßen Dimere spezifisch an Zellen binden, die den Interferon α- Rezeptor exprimieren. In diesem Beispiel wurde das aus den Monomeren II bestehende Homodimer aus Beispiel 3 verwendet. 200 μl exponentielle wachsende Daudi-Zellen (1 x 105 Zellen/ml) wurden einen Tag vor dem Experiment in RPMI 1640-Medium mit 15% FCS in Platten mit 24 Vertiefungen ausgesät. Da die Zellen eine mittlere Teilungsrate von 21 Stunden aufweisen, wurde das Experiment mit exponentielle wachsenden Zellen in einer Zelldichte von ca . 4 x 104 durchgeführt. Die Bindungsstudien wurden in zweifachen Ansätzen in 200 μl Kulturmedium durchgeführt, das zusätzlich mit 25 mM HEPES , pH-Wert 7,3, gepuffert war. Die Inkubation mit den iodierten Dimeren erfolgte mit Sätti- gungskonzentrationen für 4 Stunden bei 4°C. Nach der Inkubationszeit wurden die Zellen 2mai mit 1.5 ml PBS/10 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0.25% Gelatine bei 4°C gewaschen. Danach folgte ein Waschschritt mit dem gleichen Buffer, jedoch ohne Gelatine. Die gewaschenen Zellen wurden in 0.5 ml 1 N NaOH bei 60°C für 30 min. solubilisiert und das Solubilisat wurde im Szintilla- tionszähler gemessen. Das Ausmaß der unspezifischen Bindung wurde in Gegenwart einer lOOfach höheren Konzentration von Interferon α2 bestimmt, wobei markiertes Homodimer und Interferon a.2 gleichzeitig zu den Zellen gegeben wurden. Die Ergebnisse sind in Tabelle I gezeigt.
Tabelle I Testsubstaπz : Relative anriproliferaπve Wirkung (%)
Interferon cC 1 0°
SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQ ! / i [SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGι Q]2 j 102 i
Beispiel 11: Proliferationsstudien
Diese Studien sollten zeigen, ob die erfindungsgemäßen Dimere ähnlich wie natives Interferon α2 antiproliferative Wirkung besitzen. Sie wurden wiederum an Daudi-Zellen durchgeführt und beispielhaft hier beschrieben für das aus den Monomeren II bestehende Homodimer aus Beispiel 3. I x 104 Zellen wurden in 200 μl RPMI 1640 mit 15% FCS in Microtiterplatten ausgesät. Nach 24 Stunden wurde das Homodimer in 10er Verdünnungen von 10"4 - 10"7 zugegeben und die Zellzahl nach 72 Stunden in einem Coulter-Counter bestimmt. Die Werte sind in Tabelle II als Prozent der Aktivität dargestellt, wobei die ID50 von Interferon α2 (10~7 M) als 100% gesetzt wurde.
ERSATZBLATT (REGEL28) Tabelle II
Xestsubstaπz j Bindung (% maximale Bindung)
Interteron ,_ 100
SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQ
[SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQ]: 98
Beispiel 12 : Herstellung und Nachweis eines erfindunqs- qemäßen Antikörpers
Das in Beispiel 5 hergestellte Heterodimer wurde einer 18 % SDS-Polyacryla id-Gelelektrophorese unterzogen. Nach Anfärbung des Gels mit 4 M Natriumacetat wurde eine ca. 7 kB Bande aus dem Gel herausgeschnitten und in Phosphat gepufferter Kochsalzlösung inkubiert. Das Dimer wird mittels eines Elektroelu- tors (BioRad) aus dem Gel eluiert und nach einer kB-Dialyse über Nacht lyophilisiert . Das Peptid wird in einer Konzentration von 5 mg/ml PBS aufgenommen und mit dem Trägerprotein Albumin in einem Verhältnis 1 mol Peptid/p,02 mol Carrier in insgesamt 2 ml PBS gemischt. Zu dem Gemisch werden 2 ml Glu- tardialdehyd (0,2% in PBS) unter kontinuierlichem Rühren zugetropft und 1 Stunde bei Zimmertemperatur inkubiert. Anschließend wird das Gemisch 48 Stunden mit 12-stündigem Pufferwechsel in einem 20 kB-Dialyseschlauch gegen PBS dialysiert und anschließend gefriergetrocknet. Die Tiere werden mit dem Gemisch bestehend aus Dimer-BSA-Komplexen, BSA.-BSA-Komplexen sowie Dimer-Komplexen mit 100 μg (Kaninchen und Huhn) bzw. mit 30 μg (Maus) immunisiert:
ERSATZBLÄTT (REGEL 26) Immunisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Kaninchen
Pro Immunisierung wurden lOOμg Gel-gereinigtes Heterodimer in 0,7 ml PBS und 0,7 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund 's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0: 1. Immunisierung (komplettes Freund ' s Adjuvans) Tag 14: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund ' s Adjuvans; icFA)
Tag 28 3. Immunisierung (icFA) Tag 56 4. Immunisierung (icFA) Tag 80 Ausbluten
Das Serum des Kaninchens wurde im Immunoblot getestet. Hierzu wurde ein erfindungsgemäßes Heterodimer von Beispiel 4 einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unterzogen und auf ein Nitrocellulosefilter übertragen (vgl. Khyse-Andersen, J., J. Biochem. Biophys . Meth. 10, (1984), 203-209). Die Western Blot-Analyse wurde wie in Bock, C.-T. et al . , Virus Genes 8, (1994), 215-229, beschrieben, durchgeführt. Hierzu wurde das Nitrocellulosefilter eine Stunde bei 37°C mit einem ersten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war das Serum des Kaninchens (1:10000 in PBS) . Nach mehreren Waschschritten mit PBS wurde das Nitrocellulosefilter mit einem zweiten Antikörper inkubiert. Dieser Antikörper war ein mit alkalischer Phosphatase gekoppelter monoklonaler Ziege Anti-Kaninchen-IgG- Antikörper (Dianova) (1:5000) in PBS. Nach 30-minütiger Inkubation bei 37°C folgten mehrere Waschschritte mit PBS und anschließend die alkalische Phosphatase-Nachweisreaktion mit Entwicklerlösung (36μM 5' Bromo-4-chloro-3-indolylphosphat , 400μM Nitroblau-tetrazolium, lOOmM Tris-HCl, pH 9.5, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2) bei Raumtemperatur, bis Banden sichtbar waren .
Es zeigte sich, daß erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper hergestellt werden können. I munisierungsprotokoll für polyklonale Antikörper im Huhn
Pro Immunisierung wurden lOOμg Gel-gereinigtes Heterodimer in 0,8 ml PBS und 0,8 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund 's Adjuvans eingesetzt.
Tag 0. 1. Immunisierung (komplettes Freund ' s Adjuvans) Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund ' s Adjuvans; icFA) Tag 50: 3. Immunisierung (icFA)
Aus Eigelb wurden Antikörper extrahiert und im Western Blot getestet. Es wurden erfindungsgemäße, polyklonale Antikörper nachgewiesen.
Immunisierungsprotokoll für monoklonale Antikörper der Maus
Pro Immunisierung wurden 30μg Gel-gereinigtes Heterodimer in 0,25 ml PBS und 0,25 ml komplettem bzw. inkomplettem Freund 's Adjuvans eingesetzt; bei der 4. Immunisierung war das Fusions- protein in 0,5 ml (ohne Adjuvans) gelöst.
Tag 0. 1. Immunisierung (komplettes Freund ' s Adjuvans) Tag 28: 2. Immunisierung (inkomplettes Freund' s Adjuvans; icFA) Tag 56: 3. Immunisierung (icFA) Tag 84: 4. Immunisierung (PBS) Tag 87: Fusion
Überstände von Hybridomen wurden im Western Blot getestet. Erfindungsgemäße, monoklonale Antikörper wurden nachgewiesen.

Claims

Patentansprüche
1. Synthetisches Homodimer oder Heterodimer aus Peptidmono- meren, die die Aminosäuresequenz WDETLLKFYTELYQQL (Monomer I), SLFSCLKDRHDFGFPQEEFGNQ (Monomer II) oder QGVGVTETPLMKEDSILAV (Monomer III) haben bzw. Varianten davon, wobei das Homodimer oder Heterodimer an den Interferon α2 Rezeptor bindet.
2. Homodimer oder Heterodimer nach Anspruch 1, wobei die Monomere über ihre C-Termini oder N-Termini verknüpft sind oder der N-Terminus eines Monomers mit dem C-Terminus des anderen Monomers verknüpft ist.
3. Heterodimer nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß der C-Terminus von Monomer I mit dem N- oder C-Terminus von Monomer II, oder der N-Terminus von Monome " I mit dem N- oder C-Terminus von Monomer II verknüpft ist.
4. Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis
3, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomere über Polyäthylenglykol, Peptid(e), aktivierte Benzodiazepine, Oxazolone, Azalactone, Aminimide, Diketopiperazine, oder (ein) Monosaccharid(e) kovalent miteinander verknüpft sind.
5. Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis
4, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomere Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure (n) aufweisen, wobei die Homodimere oder Heterodimere im Vergleich zu den ursprünglichen Formen ähnlich oder besser (a) an den Interferon α2 Rezeptor binden und/oder (b) ein zelluläres Signal auslösen können.
6. Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Monomere Deletionen, Additionen oder Substitutionen von einer oder mehreren Aminosäuren und/oder (eine) modifizierte Aminosäure (n) aufweisen, wobei die Homodimere oder Heterodimere an den Interferon α2 Rezeptor binden können, jedoch eine antagonistische Wirkung aufweisen.
7. Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß eine oder mehrere Aminosäuren durch Fettsäuren, Mono- und/oder Oligosaccharide kovalent modifiziert sind.
8. Antikörper oder Fragment davon, der (das) an das Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 7 spezifisch bindet.
9. Antikörper nach Anspruch 8, der ein monoclonaler Antikörper ist oder ein Fragment davon.
10. Verfahren zur Herstellung des in den Ansprüchen 1 bis 7 definierten Homodimers oder Heterodimers, eine Festpha- sensynthese der Monomere und anschließende Dimerisierung umfassend.
11. Verwendung des Homodimers oder Heterodimers nach einem der Ansprüche 1 bis 5 und 7, oder des nach dem Verfahren nach Anspruch 10 hergestellten"Homodimers oder Heterodimers zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems, von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Zellprolifera- tion in Zusammenhang stehen, von infektiösen oder entzündlichen Prozessen.
12. Verwendung nach Anspruch 11, wobei es sich bei der Erkrankung um eine Krebserkrankung handelt.
13. Verwendung nach Anspruch 12, wobei die Krebserkrankung Haarzeil-Leukämie, metastasierendes Nierenzellkarzinom, AIDS-assoziiertes Kaposi-Sarkom, ein Lymphom oder Sarkom ist .
14. Verwendung des Homodimers oder Heterodimers nach einem der Ansprüche 1 bis 4, 6 und 7, oder des nach dem Verfahren nach Anspruch 10 hergestellten Homodimers oder Heterodimers zur Behandlung von Erkrankungen des Immunsystems oder von Erkrankungen, die mit einer erhöhten Synthese von Interferon oder einer erhöhten Expression des Interferon-Rezeptors in Zusammenhang stehen.
15. Verwendung des Homodimers oder Heterodimers nach einem der Ansprüche 1 bis 7 oder des nach dem Verfahren nach Anspruch 10 hergestellten Homodimers oder Heterodimers oder des Antikörpers nach Anspruch 8 oder 9 oder des Fragments davon zur Diagnose von Erkrankungen, die mit einem veränderten oder zu hoch bzw. zu niedrig exprimierten Interferon 2 Rezeptor bzw. einer zu hohen oder zu niedrigen Konzentration von Interferon α2 in Zusammenhang stehen.
16. Kit zur Durchführung des in Anspruch 15 definierten Diagnoseverfahrens, das Homodimer oder Heterodimer nach einem der Ansprüche 1 bis 7, das nach dem Verfahren nach Anspruch 10 hergestellte Homodimer oder Heterodimer oder den Antikörper nach Anspruch 8 oder 9 oder das Fragment davon enthaltend.
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